KR20120029549A

KR20120029549A - 신속한 결과 및 향상된 감도를 갖는 측방 유동 면역 분석 디바이스

Info

Publication number: KR20120029549A
Application number: KR1020100091400A
Authority: KR
Inventors: 안범주
Original assignee: 주식회사 인포피아
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2012-03-27

Abstract

본 발명은 감도가 향상된 측방 유동 면역 분석 디바이스에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전혈 시료 내의 분석물을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스로서, 분석물을 포함하는 전혈 시료가 가해지는 샘플 패드; 포어 크기에 의해 적혈구를 분리하는 적혈구 분리패드; 분석물에 특이적으로 결합하며 1차 표지자가 접합되어 있는 제 1 바인더를 포함하는 접합체가 확산 가능하게 제공되어 있는 접합 패드; 및 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 제 2 바인더가 고정화된 탐지부를 포함하는 멤브레인이 순서대로 배치되어 있으며, 상기 샘플 패드, 상기 적혈구 분리 패드 및 상기 접합 패드의 평균 포어크기를 각각 P1, P2 및 P3라고 할 때, P1 > P2 > P3의 관계가 성립되는 것을 특징으로 하는 측방 유동 면역 분석 디바이스에 관한 것이다.
본 발명에 의한 측방 유동 면역 분석 디바이스는 샘플 패드, 적혈구 분리 패드 및 접합 패드의 포어 크기가 순차적으로 작아짐에 따라 테스트 속도가 신속하고 적혈구의 분리가 우수하여 신호 민감도가 증가하며, 접합 패드의 작은 포어 크기에 의해 시료의 흐름이 지연되고 이에 따라 결합 반응 시간이 증가하여 신호 강도가 향상된다.

Description

신속한 결과 및 향상된 감도를 갖는 측방 유동 면역 분석 디바이스{Lateral flow assay device with rapid result and improved sensitivity}

본 발명은 전혈(whole blood) 시료 내 분석물을 정량 또는 정성적으로 측정하기 위한 감도가 향상된 측방 유동 면역 분석 디바이스에 관한 것으로, 해당 시료를 신속하게 흡수하고 적혈구의 분리가 우수하며 접합 패드에 의해 시료의 흐름이 지연되어 목표 분석물의 결합 반응 시간이 증가하여 신속한 테스트 결과를 확인할 수 있으며 신호 감도가 향상된 측방 유동 면역 분석 디바이스에 관한 것이다.

혈액 또는 뇨와 같은 생검물에 함유된 미량의 물질을 정성 분석 또는 정량 분석함으로써 이루어지는 진단 방법과 진단 기구의 개발이 진행되고 있다. 1950년대 방사선 동위 원소를 이용한 방사능면역분석법(RIA)이 처음으로 도입된 이래 효소면역분석법(ELISA)이 70년대와 80년대에 개발되고 발전되었다. 현재 ELISA 면역분석법은 가장 많이 사용되고 있는 방법 중 하나이며 의학이나 생명과학의 연구에서 필수적인 도구가 되었다.

그러나, RIA나 ELISA를 포함하는 전형적인 면역진단법은 대개 시료 당 한 종류의 분석물을 복잡한 다단계과정을 거쳐 고가의 분석기기를 사용하여 정량화 한다. 따라서, 이러한 시설이나 설비가 갖추어 지지 않은 소규모의 병원, 응급실, 가정 등에서 사용하기 용이하지 않다. 이러한 약점을 보완하기 위하여 고안된 진단 제품이 면역크로마토그라피 방법을 이용한 간편한 진단 키트이다.

면역크로마토그라피 분석법의 대표적인 타입으로 측방유동 분석법(lateral flow assay)을 들 수 있다. 이 측방유동 분석 타입의 키트 구조를 살펴보면 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 접합패드 또는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 멤브레인(주로, 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다.

탐지용 항체는 표시를 위하여 예를 들면 콜로이드성 금입자에 결합되어 있다. 금 입자 대신 라텍스 비드(latex bead) 또는 탄소입자를 사용하기도 한다. 측방유동 분석용 진단 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안되어 있다. 즉, 액체 시료 속에 들어 있는 분석물은 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출패드(또는 접합패드)에 비고정적으로 코팅되어 있는 탐지용 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막(멤브레인)에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개 막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정 면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 금 입자의 양으로 판단한다.

이와 같은 측방 유동 분석법은 임신 진단, 암 진단, 미생물 탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있으나 판단이 육안으로 이루어지는 까닭에 정확한 양을 확인하기 어려운 문제가 따른다. 특히, 판단이 컷오프 값(cut-off value) 부근에서 이루어져야 할 경우에는 정확하게 진단하기가 용이하지 않다.

종래의 측방 유동 정량 검정 스트립들은 문헌에 공지되어 있거나 실제로 시중에 시판되고 있는 제품 모두를 포함해서 감도가 낮아 대체로 분석물을 정량하기 보다는 단순히 정성을 위한 수단으로 이용되고 있는 실정이다. 따라서, 보다 고감도로 정량화가 가능한 분석법이 요구되고 있다.

나아가, 전혈 내에 함유되어 있는 적혈구는 측방 유동에 의한 면역 분석에 있어서 여러 가지 불이익을 제공한다. 특히 적혈구는 면역 분석 디바이스에서 반응이 일어나기에 필요한 유체 흐름을 방해하며, 나아가 적혈구의 색으로 인해서 컨트롤 라인 주위에서 백그라운드 효과를 발생시키며 이로써 탐지부의 감도를 떨어뜨린다.

상기와 같이 전혈 샘플 내의 혈장으로부터 적혈구를 분리하기 위한 기술은 예를 들어 (i) 전혈 샘플을 응집된 적혈구를 제거하기 위해 하나 이상의 특이적 결합 쌍 구성원이 결합된 고체 흡수성 요소를 통해 혼합물을 여과시키는 적혈구 결합제와 배합시키는 기술, (ii) 도입된 응집제를 갖거나 갖지 않는 유리 미세섬유 필터를 통해 전혈을 통과시키는 기술, (iii) 적혈구가 통과되는 것을 방지하고 무수 시험 스트립 상에서 시그날의 검출 또는 가시화를 방해하지 못하도록 다당류 물질의 차단 또는 배제 층을 사용하는 기술, 및 (iv) 혈장이 아니라 적혈구가 결합하는 다가 양이온 표면을 갖는 고분자를 사용하는 기술 등이 포함된다.

그러나, 보다 용이하고 효율적으로 적혈구를 분리하고 감도를 높일 수 있는 측방 유동 분석 장치가 요구된다.

이에 본 발명의 한 측면은 신속한 테스트 시간과 함께 적혈구의 분리가 우수하고 목표 분석물의 결합 반응 시간이 증가하여 신호 감도가 향상된 측방 유동 면역 분석 디바이스를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 전혈 시료(whole blood sample) 내의 분석물(analyte)을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스(lateral flow immunoassay device)로서, 분석물을 포함하는 전혈 시료가 가해지는 샘플 패드; 포어(pore) 크기에 의해 적혈구를 분리하는 적혈구 분리패드; 분석물에 특이적으로 결합하며 1차 표지자(label)가 접합되어 있는(conjugated) 제 1 바인더를 포함하는 접합체가 확산 가능하게 제공되어 있는 접합 패드; 및 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 제 2 바인더가 고정화된 탐지부(detection site)를 포함하는 멤브레인이 순서대로 배치되어 있으며, 상기 샘플 패드, 상기 적혈구 분리 패드 및 상기 접합 패드의 평균 포어크기를 각각 P1, P2 및 P3라고 할 때, P1 > P2 > P3의 관계가 성립되는 것을 특징으로 하는 측방 유동 면역 분석 디바이스가 제공된다.

상기 샘플 패드는 다가 양이온을 포함하여 전혈 시료로부터 적혈구를 화학적으로 분리하는 것이 바람직하다.

상기 샘플 패드의 포어의 평균 직경은 8 ㎛ 초과 15 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.

상기 적혈구 분리 패드의 포어의 평균 직경은 6 내지 8 ㎛인 것이 바람직하다.

상기 접합 패드의 포어의 평균 직경은 2 내지 6㎛ 미만인 것이 바람직하다.

상기 유동 면역 분석 디바이스는 상기 1차 표지자와 결합하여 신호를 증폭시키는 2차 표지자를 추가로 함유하는 제 2 접합패드를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 표지자는 금 나노입자, 발색 효소 또는 형광 물질인 것이 바람직하다.

상기 분석물은 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 합텐(hapten), 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 제 1 바인더 및 상기 제 2 바인더는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질 및 호르몬-수용체로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 멤브레인은 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 측방 유동 면역 분석 디바이스는 전혈 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 측방 유동 면역 분석 디바이스는 샘플 패드, 적혈구 분리 패드 및 접합 패드의 평균 포어 크기가 순차적으로 작아짐에 따라 시료가 신속하게 흡수되고, 적혈구의 분리가 우수하여 신호 민감도가 증가하며, 접합 패드의 평균 포어 크기를 보다 상류에 있는 샘플 패드와 적혈구 분리 패드보다 작게 하여서 시료의 흐름을 지연시키고 이에 따라 목표 분석물의 결합 반응 시간을 증가시켜서 탐지부에서의 신호 강도가 향상된다.

도 1은 본 발명의 예시적인 측방 유동 면역 분석 디바이스를 구성하는 각 패드를 도시한 것이다.
도 2는 조립된 본 발명의 예시적인 측방 유동 면역 분석 디바이스를 도시한 것이다.
도 3은 베이스 부재(15)를 포함하여 형성된 본 발명의 측방 유동 면역 분석 디바이스를 도시한 것이다.

본 발명에 의하면, 샘플 패드의 신속한 시료 흡수와 함께, 적혈구의 분리가 우수하여 분석물에 대한 신호 민감도가 증가되고, 접합 패드에서의 시료의 흐름이 지연됨에 따라 목표 분석물의 결합 반응 시간이 증가하여 신호 강도가 향상되는 측방 유동 면역 분석 디바이스가 제공된다.

본 발명의 측방 유동 면역 분석 디바이스에 사용될 수 있는 목표 분석물은 예를 들어 항원(antigen) 및 적혈구 등을 함유하고 있는 전혈 샘플이며, 본 명세서에서 사용된 용어 "분석물"은 하나 이상의 에피토프(epitope) 또는 부착 부위(binding site) 또는 리간드(ligand)를 갖는, 검출 또는 측정되는 화합물 또는 조성물을 의미한다.

분석물에는 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩타이드, 미생물, 아미노산, 항원 단백질, 핵산(DNA 및 RNA), DNA-결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물 또는 상기 물질 중 어느 하나의 대사물 또는 이에 대한 항체가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니며, 특정한 항원성 물질, 합텐(hapten), 항체, 거대분자 및 이의 배합물, 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker) 등도 포함한다.

도 1은 본 발명의 측방 유동 면역 분석 디바이스를 구성하는 각 패드를 도시한 것으로 분석물을 포함하는 전혈 시료(whole blood sample)가 가해지는 샘플 패드(10), 포어(pore) 크기에 의해 적혈구를 분리하는 적혈구 분리패드(11), 분석물(analyte)에 특이적으로 결합하며, 1차 표지자(label)와 결합된 제 1 바인더로 구성되는 접합체를 포함하는 접합 패드(12), 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 제 2 바인더가 고정화 된 탐지부(detection site)(20) 및 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)(21)를 포함하는 멤브레인(13), 및 전혈 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드(14)를 포함한다.

도 2는 이들이 조립된 구조를 나타내며, 도 3은 상기와 같은 본 발명의 측방 유동 면역 분석 디바이스 스트립 하부에 베이스 부재(15)를 추가로 포함하는 구조를 도시한 것이다.

이 때, 바인더는 분석물에 특이적으로 결합하여 표지자에 의해 분석물을 정성 또는 정량적으로 확인가능하게 하는 것으로서, 제 1 바인더가 분석물의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우 제 2 바인더는 이와 다른 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 제 1 바인더 및 상기 제 2 바인더는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질 및 호르몬-수용체로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

측방 유동에 의한 면역 분석에 있어서 전혈 내에 함유되어 있는 적혈구는 여러 가지 불이익을 제공한다. 특히 적혈구는 면역 분석 디바이스에서 반응이 일어나는데 필요한 유체의 흐름을 방해하며, 나아가 적혈구의 색으로 인해서 멤브레인(13)의 탐지부(20) 주위에서 백그라운드 효과를 발생시키며 이로써 탐지부의 감도를 떨어뜨린다.

이와 관련하여, 본 발명의 측방 유동 면역 분석 디바이스는 상기 샘플 패드(10), 적혈구 분리 패드(11) 및 접합 패드(12)의 포어 크기가 순차적으로 작아지는 것을 특징으로 하며, 즉 상기 샘플 패드, 상기 적혈구 분리 패드 및 상기 접합 패드의 평균 포어크기를 각각 P1, P2 및 P3라고 할 때, P1 > P2 > P3의 관계가 성립한다. 이러한 구조에 의해 샘플 패드는 신속하게 시료를 흡수하고 이어서 적혈구 분리 패드에서 적혈구가 물리적으로 분리되게 하는 구성을 취하고 있다.

적혈구 분리패드(11)는 적혈구를 분리하기에 적절한 평균 포어(pore) 크기를 가지는데, 즉, 일반적으로 적혈구의 평균 직경은 6 내지 8 ㎛ 정도이므로, 상기 적혈구 분리 패드(11)의 평균 포어 직경은 약 8 ㎛ 이하, 바람직하게는 6 ㎛ 이하인 것이 바람직하나, 적혈구를 물리적으로 분리하기에 적절한 범위이면 특히 제한되지 않는다. 다만, 적혈구 분리 패드의 평균 포어 직경이 8 ㎛를 초과하는 경우 적혈구를 효율적으로 분리할 수 없게 되며, 적혈구 분리 패드의 평균 포어 직경이 너무 작아지는 경우에는 시료의 흐름에 영향을 줄 수 있어서 테스트 시간이 과도하게 연장될 수 있다. 따라서, 상기 적혈구 분리 패드(11)의 평균 포어 직경은 가장 바람직하게는 6 내지 8 ㎛ 정도이다.

한편, 상기 적혈구 분리 패드(11)의 상류 측에 배치되는 샘플 패드(10)는 분석 대상인 전혈 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 다공성(porosity)을 갖는 물질로 구성될 수 있으며, 이러한 물질로서는 섬유성 종이, 종이와 같은 셀룰로즈 물질로 된 미세 포어멤브레인, 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트와 같은 셀룰로즈 유도체, 니트로셀룰로즈, 유리 섬유, 천연 발생 면(cotton), 나이론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있지만 이로만 한정되는 것은 아니다.

상기 샘플 패드(10)의 평균 포어 직경은 8 ㎛ 초과 15 ㎛ 이하인 것이 바람직하나, 8 ㎛ 를 초과하는 것이면 특히 제한되지 않는다. 샘플 패드(10)의 평균 포어 직경이 8 ㎛ 이하인 경우 시료가 신속하게 흡수되지 않게 되며, 15 ㎛를 초과하는 경우 샘플 등에 포함된 이물질 등이 걸러지지 않을 수 있다.

한편, 상기 샘플 패드(10)는 다가 양이온을 포함하여 전혈 시료로부터 적혈구를 화학적으로 분리할 수 있도록 구성되는 것이 바람직하다.

상기 다가 양이온은 폴리-L-리신 하이드로브로마이드, 폴리-L-아르기닌 하이드로클로라이드, 폴리-L-히스티딘, 폴리(리신, 알라닌) 3:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 2:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 1:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 트립토판) 1:4 하이드로브로마이드 및 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 상기와 같은 다가 양이온 용액에 샘플 패드를 침지 후 건조하여 다가 양이온을 포함하는 샘플 패드를 제조할 수 있으며, 다만 이에 제한되지 않고 기술 분야에 알려진 어떠한 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 접합 패드(12)는 적혈구 분리 패드(11)에 접촉되게 배치되며, 접합 패드 역시 다공성을 가지고 있어서 샘플 패드(10)로부터 혈액을 수용하게 된다. 이때 혈액은 샘플 패드(10) 및 적혈구 분리 패드(11)에 의해 화학적 및 물리적으로 적혈구가 분리된 혈액이다. 또한, 상기 접합 패드(12)는 분석물(analyte)에 특이적으로 결합하며, 바람직하게는 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하고 1차 표지자(label)와 결합된 제 1 항체로 구성되는 접합체를 포함하고 있다. 따라서, 상기 접합 패드(12)에서 분석물과 접합체가 결합하여 제 1 면역 결합체(first immuno-complex)가 형성된다.

즉, 본 명세서에서 "접합체(cojugate)"는 항체와 같은 특이적인 부착 성분에 결합된 검출 가능한 표지 물질(label)을 의미하며, 특이적인 부착 성분과 표지 물질(label) 간의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있고, 핵산 하이브리드화(nucleic acid hybridization)가 포함될 수 있다. 상기와 같은 표지 물질은 시험 시료 내 분석물의 양과 직접 또는 간접적으로 관련된 검출 가능한 신호가 생성되게 한다.

한편, 본 발명의 접합패드(12)의 포어의 직경은 평균 2 내지 6 ㎛ 미만인 것이 바람직하며, 포어의 평균 직경이 2 ㎛ 미만인 경우에는 시료의 흐름이 과도하게 느려지거나 흐름이 막히는 문제가 있으며, 6 ㎛ 이상인 경우 시료의 흐름 지연을 수행할 수 없는 문제가 있다. 즉, 본 발명의 접합패드(12)는 시료의 흐름을 지연하여 반응 시간을 적절히 연장하는 역할을 하는 것을 특징으로 한다.

샘플 패드(10)에 유입된 시료의 분석에 있어서 실제로 분석물들 모두가 접합 패드(12) 내에서 표지자(label)와 결합된 제 1 항체와 부착되는 것은 아니며, 여전히 결합하지 않은 분석물들이 존재하게 된다. 따라서, 보다 높은 감도의 분석을 위해 상기와 같이 아직 결합되지 않은 분석물과 접합체의 결합량을 증가시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 이를 위해 적혈구 분리 패드(11)에 후속하여 배치되는 접합패드(12)의 평균 포어 직경을 상류 2 개의 패드의 평균 포어 직경보다 더 작게 하여, 구체적으로 2 내지 6 ㎛ 미만으로 하여 혈액의 확산 흐름을 지연시키도록 구성한다. 이렇게 포어 직경이 제한된 접합 패드에 의해 시료의 흐름이 지연되어 접합체와 분석물의 결합을 위한 반응 시간이 길어지게 되어 제 1 면역 결합체의 형성이 증가하게 된다. 따라서, 이후의 탐지부(20)에서의 면역 반응 신호 강도가 커지게 되어서 더욱 정확한 측정 결과를 얻을 수 있게 되며, 최종 테스트 품질 및 정확도가 개선될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 표지 물질은 금 나노입자, 발색 효소 또는 형광 물질일 수 있으며, 금 나노 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 금 나노 입자는 통상적으로 적색을 띠며, 대략 510 내지 540 nm의 흡광 계수를 갖는다.

한편, 상기 접합체 내에 포함된 특이적인 부착 성분인 바인더는 분석물에 특이적으로 부착되도록 선택되며, 대표적으로는 항체를 의미하나 이에 제한되는 것은 아니고, 면역 반응에 있어서 항원, 항체, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질 및 호르몬-수용체 또는 이들의 복합체 등일 수 있다. 예를 들어 항체가 사용되는 경우에는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 단백질(recombinant protein) 또는 키메라 항체(chimeric antibody) 등으로부터 선택될 수 있다.

상기 멤브레인(membrane)(13)은 니트로셀룰로스(Nitrocellulose) 성분의 입자가 도포된 재질로서 180 sec/cm 의 횡흐름(lateral flow) 유속으로 항원 항체간의 충분한 반응시간을 유지시킬 수 있어 액체 시료의 유동성을 확보할 수 있는 재질이라면 특히 제한되지 아니하며, 멤브레인은 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체가 고정화 되어 있는 탐지부(detection site)(20)를 포함하며, 이에 대한 대조군으로서 오류로 인한 반응 유무를 파악하기 위한 컨트롤부(control site)(21)를 추가로 포함할 수도 있다. 탐지부는 테스트 결과의 판독을 위해 결과를 보여주는 부분이다. 컨트롤부는 금나노입자 접합체와 포획 항체의 오류 확인을 위해 구성되며 이동성을 가진 물질들이 탐지부/컨트롤부까지 오류없이 반응이 제대로 진행되었는지 여부를 확인하기 위한 것이다.

본 발명의 측방 유동 면역 분석 디바이스는 흡수 패드(absorbing pad)(14)를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 모세관 현상에 의해 반응 후 남은 잔여물을 충분히 흡수할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않는다.

본 발명에 의한 면역크로마토그래피 신호 증폭 방법의 기작을 보다 자세히 살펴보면, 전혈 샘플이 샘플 패드(10)에 유입되면, 적혈구 분리 패드(11)에서 포어 크기에 의해 적혈구가 물리적으로 분리되며, 이 때 접합 패드(12)에 의해 흐름이 지연되어 반응 시간을 충분하게 형성한다. 접합 패드(12)에는 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 제 1 표지 물질에 결합되어 있는 1차 접합체가 함유되어 있어서 유입된 분석물과 특이적으로 결합하고, 상기 1차 접합체가 결합된 분석물은 스트립을 따라 흐르다가 멤브레인(13)의 탐지부에서 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체와 결합하여 샌드위치 결합을 형성한다.

한편, 본 발명의 유동 면역 분석 디바이스는 상기 1차 표지자와 추가적으로 결합하여 신호를 증폭시키는 2차 표지자를 함유할 수 있으며, 이 경우 상술한 흐름에 후속적으로 상기 1차 접합체에 특이적으로 결합할 수 있는 추가의 제 3 항체가 제 2 표지 물질에 결합되어 있는 2차 접합체가 포함된 추가의 접합 패드를 포함하여 면역크로마토그래피의 신호가 증폭되도록 할 수 있다.

나아가, 본 발명의 유동 면역 분석 디바이스는 전혈 샘플 내 다수의 분석물을 분석하기 위해 구성될 수 있으며, 이 경우 다른 분석물에 특이적으로 부착되는 제 4 항체와 표지자가 서로 접합되어 확산 가능하게 부착된 다른 추가의 접합체가 접합체 패드 내에 함유될 수 있으며, 이 경우 상기 멤브레인(13)은 추가로 배치된 제 2 탐지부를 더 포함하고, 상기 제 2 탐지부에는 상기 추가의 분석물에 특이적으로 부착되는 제 5 항체가 고정화될 수 있다.

한편, 상기 분석물은 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 합텐(hapten), 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

또한, 상기 제 1 바인더, 상기 제 2 바인더는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 및 호르몬-수용체로부터 선택된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 이들 실시예는 본 발명의 예시를 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 측방 유동 면역 분석 디바이스의 제조

1. 접합체의 합성

금 나노입자 콜로이드 용액(BBInternational, 10 nm) 1 mL에 0.1 mL의 0.1 M 의 붕산 완충액(Borate buffer) (pH 8.5)를 넣고, 1 mg/mL의 제 1항체 10 uL 를 넣어 30분간 반응시켜 제 1접합체를 제조하였다. 상기 제 1 항체로는 트로포닌 I대한 면역 분석 시 4T21, 560 (HyTest)를 사용할 수 있고, 미오글로빈에 대한 면역 분석에 M012607(Fitzgerald)를 사용할 수 있다.

2. 측방 유동 면역 분석 디바이스의 제조

플라스틱 베이스 부재(Millipore)에 니트로셀룰로스 멤브레인(Millipore, 180 sec Nitrocellulose)과 흡수 패드(Millipore)를 붙인 후, 디스펜서(Dispenser) 시스템(Zeta Co.)을 사용하여 PBS에 녹인 포획항체(제 2항체) 1 mg/mL 용액과, 대조구로서 PBS에 녹인 염소 항-마우스(Goat anti-mouse) IgG 항체(Sigma, M8642) 1 mg/mL 용액을 각각 6 cm/sec 속도로 멤브레인에 선을 그어 각각 탐지선(detection site)과 컨트롤선(control line)을 형성하였다. 상기 멤브레인을 건조시킨 후, 절단기에 넣어 3 mm 간격으로 절단하였다.

상기 포획 항체인 제 2항체는 트로포닌 I에 대한 면역 분석을 위해 트로포닌 포획항체(Hytest)를 사용할 수 있고, 미오글로빈에 대한 면역 분석을 위해 미오글로빈 포획항체 M09983110(Fitzgerald)를 사용할 수 있다.

샘플 패드(Millipore 사) 는 0.5% 트윈(Tween) 20, 5% 수크로스, 5% 덱스트란 0.05% 아지드화 나트륨(sodium azide) 수용액에 담지 후 건조하여 10 X 3 mm 정도로 절단하였으며, 포어 크기는 직경이 10 ㎛ 인 것을 사용하였다.

적혈구 분리 패드는 GFC (Millipore사)를 사용하였으며, 포어 크기는 직경이 7 ㎛ 인 것을 사용하였다.

접합 패드는 GFC (Millipore사)를 5 X 3 mm로 절단하여 상기 1.에서 접합체를 5 μL 도포하여 건조하였으며, 포어 크기는 직경이 4 ㎛ 인 것을 사용하였다.

상기의 멤브레인 및 흡수 패드가 조립된 상기 플라스틱 패드에 접합 패드, 샘플 패드 및 적혈구 분리 패드를 도 3과 유사하게 조립하였다.

비교예 1: 동일한 큰 포어 사이즈의 측방 유동 면역 분석 디바이스의 제조

접합 패드, 샘플 패드 및 적혈구 분리 패드의 평균 포어(pore) 크기를 10 ㎛ 로 동일하게 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 측방 유동 면역 분석 디바이스를 제조하였다.

그 결과 테스트 측정 속도는 상기 실시예 1보다 빨랐지만, 적혈구 분리 능력이 떨어지고 접합 패드에서 제 1 차 면역 결합체 생성량이 작아 탐지부에서의 신호 강도가 작은 것을 확인할 수 있었다.

비교예 2: 동일한 작은 포어 사이즈의 측방 유동 면역 분석 디바이스의 제조

접합 패드, 샘플 패드 및 적혈구 분리 패드의 포어(pore) 크기를 4 ㎛ 로 동일하게 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 측방 유동 면역 분석 디바이스를 제조하였다.

그 결과 샘플 패드에서 시료가 잘 흡수되지 않았고, 또한 시료 측정 속도가 느려지는 것을 확인할 수 있었다.

비교예 3: 포어 사이즈를 다르게 배치한 측방 유동 면역 분석 디바이스의 제조

샘플 패드, 적혈구 분리 패드 및 접합 패드의 포어(pore) 크기 각각 4 ㎛, 7㎛ , 10㎛ 으로 순차적으로 크게 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 측방 유동 면역 분석 디바이스를 제조하였다.

그 결과, 이 경우에는 샘플 패드에서 시료가 잘 흡수되지 않을 뿐만 아니라 접합 패드에서 제 1 차 면역체 생성량이 작아 탐지부에서의 신호가 강도도 낮은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1: 측방 유동 면역 분석 디바이스의 감도 확인

전혈 100 μl 피펫을 각각 실시예 1, 비교예 1 내지 3의 샘플 패드에 도입한 후에 신호가 탐지부에 나타나는 시간 및 분석 민감도를 측정하였다.

실시예 1의 경우 2분 50초 후에 검출 가능한 신호가 탐지부에 나타났으며, 0.5ng/mL의 분석 민감도를 나타내었다.

한편, 비교예 1의 경우 1분 40초 후에 검출 가능한 신호가 탐지부에 나타났으며, 2.0ng/mL의 분석 민감도를 나타내었다.

비교예 2의 경우 5분 후에 검출 가능한 신호가 탐지부에 나타났으며, 0.7ng/mL의 분석 민감도를 나타내었다.

비교예 3의 경우 3분 30초후에 검출 가능한 신호가 탐지부에 나타났으며, 1.5 ng/mL의 분석 민감도를 나타내었다.

상기와 같은 결과에 비추어, 본 발명의 측방 유동 면역 분석 디바이스에 의하면, 테스트 시간이 빠름과 동시에, 적혈구의 분리가 우수하고 목표물의 결합 반응 시간이 증가하여 신호 민감도가 향상되는 것을 확인할 수 있다.

10: 샘플패드 20: 탐지부
11: 적혈구 분리 패드 21: 컨트롤부
12: 접합패드
13: 멤브레인
14: 흡수패드
15: 베이스 부재

Claims

전혈 시료(whole blood sample) 내의 분석물(analyte)을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스(lateral flow immunoassay device)로서,
분석물을 포함하는 전혈 시료가 가해지는 샘플 패드;
포어(pore) 크기에 의해 적혈구를 분리하는 적혈구 분리패드;
분석물에 특이적으로 결합하며 1차 표지자(label)가 접합되어 있는(conjugated) 제 1 바인더를 포함하는 접합체가 확산 가능하게 제공되어 있는 접합 패드; 및
상기 분석물에 특이적으로 결합하는 제 2 바인더가 고정화된 탐지부(detection site)를 포함하는 멤브레인이 순서대로 배치되어 있으며,
상기 샘플 패드, 상기 적혈구 분리 패드 및 상기 접합 패드의 평균 포어크기를 각각 P1, P2 및 P3라고 할 때, P1 > P2 > P3의 관계가 성립되는 것을 특징으로 하는 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 샘플 패드는 다가 양이온을 포함하여 전혈 시료로부터 적혈구를 화학적으로 분리하는 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 샘플 패드의 포어의 평균 직경은 8 ㎛ 초과 15 ㎛ 이하인 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 적혈구 분리 패드의 포어의 평균 직경은 6 내지 8 ㎛인 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 접합 패드의 포어의 평균 직경은 2 내지 6㎛ 미만인 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 유동 면역 분석 디바이스는 상기 1차 표지자와 결합하여 신호를 증폭시키는 2차 표지자를 추가로 함유하는 제 2 접합패드를 포함하는 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 표지자는 금 나노입자, 발색 효소 또는 형광 물질인 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 분석물은 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 합텐(hapten), 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 제 1 바인더 및 상기 제 2 바인더는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질 및 호르몬-수용체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 상기 멤브레인은 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 추가로 포함하는 측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1항에 있어서, 전혈 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 추가로 포함하는 측방 유동 면역 분석 디바이스.