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KR20110128922A - 인간 ｉｌ-１３에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 분자 - Google Patents

인간 ｉｌ-１３에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 분자 Download PDF

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KR20110128922A
KR20110128922A KR1020117023891A KR20117023891A KR20110128922A KR 20110128922 A KR20110128922 A KR 20110128922A KR 1020117023891 A KR1020117023891 A KR 1020117023891A KR 20117023891 A KR20117023891 A KR 20117023891A KR 20110128922 A KR20110128922 A KR 20110128922A
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알라스테어 데이비드 그리피스 로슨
다니엘 존 라이트우드
로저 토마스 팔프라만
브라이언 존 스미스
케리 루이스 타이슨
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유씨비 파마, 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 인간 IL-13의 항원 결정기에 대해 특이성을 갖는 항체 분자, 상기 항체 분자의 치료적 용도, 및 상기 항체 분자를 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

인간 ＩＬ-１３에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 분자{ANTIBODY MOLECULES HAVING BINDING SPECIFICITY FOR HUMAN IL-13}
본 발명은 IL-13 항체 및 이의 단편, 예를 들어, 결합 단편, 이를 포함하는 조성물, 및 특별히 천식, 알레르기, COPD, 섬유증 및/또는 암을 포함하는 다양한 질병의 예방 및/또는 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
IL-13은 IL-4와 25% 서열 동일성을 공유하는 짧은 사슬의 사이토카인이다. 이는 잔기 33-36 및 87-90에 걸쳐 있는 2개의 β-가닥과 함께 잔기 10-21(헬릭스 A), 43-52(헬릭스 B), 61-69(헬릭스 C), 및 92-110(헬릭스 D)에 걸쳐 있는 4개의 헬릭스의 2차 구조를 형성하는, 약 132개의 아미노산을 포함한다. IL-13의 용액 구조는 설명되었고, 이는 IL-4와 함께 관찰된 예측 업-업-다운-다운(up-up-down-down) 4개의 헬릭스 다발 형태를 나타내었다(Eisenmesser 2001).
인간 IL-13은 활성화된 T 세포로부터 클로닝된 17-kDa 당단백질(Zurawski and de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26)이고, 이는 Th2 계통의 활성화된 T 세포에 의해 생성되나, Th0 및 Th1 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 여러 비-T 세포 집단, 예를 들어, 비만 세포가 또한 IL-13을 생성한다(Zurawski and de Vries 1994 Immunol loday 13 19-26).
IL-13의 기능은 하기를 포함한다:
● 인간 B 세포에서 IgE로의 면역글로불린 이소타입(isotype) 스위칭(Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 3730-4) 및
● 인간 및 마우스 둘 모두에서의 염증성 사이토카인 생성 억제(de Waal Malefyt, Figdor et al. 1993 J Immunol 151 6370-81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 151 7151-60).
IL-13은 이의 세포 표면 수용체, IL-13R알파1 및 IL-13R알파2에 결합한다. IL-13R알파1은 IL-13과 낮은 친화성(KD -10nM)으로 상호작용한 후, IL-4Ra를 보충시켜, 높은 친화성(KD ~ 0.4 nM)의 신호전달 이종이합체 수용체 복합체를 형성한다(Aman, Tayebi et al. 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton, Zhang et al. 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 497-501).
IL-4R/IL-13R알파1 복합체는 많은 세포 유형, 예를 들어, B 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 호산구, 호염기구, 섬유모세포, 내피 세포, 기도 상피 세포, 및 기도 평활근 세포에서 발현된다(Graber, Gretener et al. 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata, Husain et al. 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu et al. 2001 Cytokine 13 75-84).
IL-13R알파1/IL-4R 수용체 복합체의 라이게이션은 신호전달인자 및 전사 활성인자(STAT6) 및 인슐린 수용체 기질-2(IRS-2) 경로를 포함하는 다양한 신호전달 경로의 활성화를 발생시킨다(Wang, Michieli et al. 1995 Blood 864218-27; Takeda, Kamanaka et al. 1996 J Immunol 157 3220-2).
IL-13R알파2 사슬 단독은 IL-13에 대해 높은 친화성(KD ~ 0.25-0.4 nM)을 가지며, IL-13 결합을 음성적으로 조절하는 디코이(decoy) 수용체(Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 161 2317-24), 및 대식세포 및 가능하게는 다른 세포 유형에서 AP-Ⅰ 경로를 통해 TGF-b 합성 및 섬유화를 유도하는 신호전달 수용체(Fichtner-Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106) 둘 모두로 작용한다.
천식에 대한 전임상 동물 모델에서 수행된 여러 연구는 IL-13이 천식에서 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 IL-13 녹아웃(knockout) 마우스에서의 천식에 대한 내성 뿐만 아니라 다양한 마우스 모델에서의 IL-13 길항제(가용성 IL-13 수용체, 항-IL-13 mAb 등)를 이용한 천식 표현형의 억제를 포함한다(SeIa 1999 Harefuah 137 317-9; Wills-Karp and Chiaramonte 2003 Curr Opin PuIm Med 9 21-7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90). 다수의 연구는 마우스 및 기니아 피그 폐로의 재조합 IL-13의 약리학적 투여가 기도 점액 과다분비, 호산구증가증 및 AHR을 유도하는 것을 나타내었다(Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Kibe, Inoue et al. 2003 Am J Respir Crit Care Med 167 50-6; Vargaftig and Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig and Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9).
IL-13의 이러한 효과는 IL-13의 항시성 또는 유도성 발현으로 트랜스제닉 마우스 시스템에서 재현된다(Zhu, Homer et al. 1999 J Clin Invest 103 779-88; Zhu, Lee et al. 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70; Lanone, Zheng et al. 2002 J Clin Invest 110463-74). IL-13의 만성 트랜스제닉 과다발현은 또한 상피하 섬유증 및 폐기종을 유도한다. IL-13(및 IL-4) 신호전달 분자 STAT6이 결핍된 마우스는 알레르겐 유도성 AHR 및 점액 과다생성이 발달하는데 실패한다(Kuperman, Huang et al. 2002 Nat Med 8 885-9). 가용성 IL-13 수용체 융합 단백질(sDL-13R알파2Fc)을 이용한 연구는 실험 알레르겐 난알부민(OVA) 유도성 기도 질병에서 상기 사이토카인의 중추적 역할을 입증하였다(Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Taube, Duez et al. 2002 J Immunol 169 6482-9).
항-IL-13 처리의 효능이 또한 뮤린 만성 천식 모델에서 입증되었다. 점액 과다 분비 및 AHR의 특징을 나타내는 것 외에, 이러한 만성 천식 모델은 보다 급성 모델에서 결핍되는 인간 질병의 여러 특징을 나타내었다. 이는 콜라겐 침착에서의 증가로 측정시 상피간 공간에 위치된 폐 조직의 호산구증가증 뿐만 아니라 평활근 섬유증을 포함한다. 전체 4주 동안 주당 1회로 OVA 감작화 마우스에서 OVA를 이용한 반복된 에어로졸 공격으로 만성 천식 모델이 유도된다. OVA 공격의 최종 2주 동안(36일로부터, 효능 판독은 연구 53일에 평가됨) 투여된 항-IL-13 항체는 AHR, 폐 염증, 배상세포 과다형성, 점액 과다분비, 및 기도 섬유증을 현저히 억제하였다(Yang, Li et al. 2005 J Pharmacol Exp Ther).
IL-13 길항제의 치료 효과가 또한 천식의 영장류 모델에서 AHR을 억제하는 것으로 입증되었다(American Thoracic Society, San Diego 2005).
IL-13은 질병의 중증도와 관련이 있는 천식 환자의 폐에서 IL-13 mRNA 및 단백질의 상승된 수준이 검출된 바에 따라 인간 천식의 발병기전과 관련이 있다(Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94). 또한, 상승된 IL-13 수준을 발생시키는 인간 IL-13 유전적 다형태가 확인되었고, 이는 천식 및 아토피와 관련이 있고(Heinzmann, Mao et al. 2000 Hum Mol Genet 9 549-59; Hoerauf, Kruse et al. 2002 Microbes Infect 4 37-42; Vercelli 2002 Curr Opin Allergy Clin Immunol 2 389-93; Heinzmann, Jerkic et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112 735-9; Chen, Ericksen et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 553-60; Vladich, Brazille et al. 2005 J Clin Invest), 상승된 IL-13 수준이 천식 환자의 폐에서 검출되었다(Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al. 2002 J Allergy Clin Immunol 109 980-7; Berry, Parker et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 1106-9). 보다 높은 혈장 IL-13 수준을 야기시키는 IL-13에서 다형성을 갖는 개체가 아토프 및 천식에 대해 증가된 위험성을 가짐에 따라 IL-13과 천식 사이의 유전적 연관성이 또한 입증되었다(Wills-Karp 2000 Respir Res 1 19-23).
다양한 인간 장애에서의 인간 IL-13의 역할로 인해, IL-13 활성을 억제하거나 중화시키는 치료 방법이 설계되었다. 특히, IL-13에 결합하여 이를 중화시키는 항체가 IL-13 활성을 억제하기 위한 수단으로 연구되었다. 그러나, IL-13, 특히 인간 IL-13에 결합할 수 있는 적합하고/하거나 개선된 항체가 당 분야에 필요하다. 특히, 항체는 인간 IL-13을 중화시킬 수 있다. 본 발명은 인간 IL-13에 결합할 수 있고, 높은 친화성으로 결합할 수 있고, 인간 IL-13에 결합하여 이를 중화시킬 수 있는 결합 단백질, CDR 이식된 항체, 인간화된 항체, 및 이의 단편의 신규한 패밀리를 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 IL-13 특이적 항체 및 이의 단편, 예를 들어, IL-13 결합 단편, 특히 중화 항체 및 단편에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 하기를 도시한다:
중쇄로부터의 CDR 1, 2, 3(CDR H) 및 경쇄로부터의 CDR 1, 2, 3(CDR L)의 각각에 대한 아미노산 서열
래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열, 및
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
도 2는 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열
래트 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열
래트 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄에 대한 아미노산 서열
도 3은 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄에 대한 DNA 서열
래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
도 4는 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열
래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열
도 5는 하기를 도시한다:
래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열
도 6은 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열
도 7은 하기를 도시한다:
인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열
인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열
도 8은 하기를 도시한다:
인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열
도 9는 하기를 도시한다:
인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열
인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열
도 10은 하기를 도시한다:
인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열
인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열
도 11은 하기를 도시한다:
인간 VK 1 2-1-(1)02 JK4 수용체 프레임워크 및 VH2 3-1 2-26 JH4 수용체 프레임워크에 대한 아미노산 및 DNA 서열
도 12는 하기를 도시한다:
래트에 대한 경쇄, 수용체 프레임워크 및 인간화된 경쇄 및 또한 중쇄의 정렬. CDR은 굵은 글씨이며 밑줄이 있다. 공여체 잔기 G49 및 R71은 굵은 글씨의 이탤릭체이며, 강조되어 있다.
도 13. 알레르겐 공격 24시간 후에 측정된 BAL 에오탁신(eotaxin)-3에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다, 그룹 당 n=4-8.
도 14. 알레르겐 공격 24시간 후에 측정된 BAL 호산구에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 연구의 스크리닝 단계에서 측정된 BAL 호산구 수에 대해 표준화된다. 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-8.
도 15. 알레르겐 공격 15분 후까지 측정된 피크 기도 내성에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다, 그룹 당 n=4-8.
도 16. 알레르겐 공격 24시간 후에 측정된 기도 내성에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 알레르겐 노출 전에 측정된 기도 내성에 대해 표준화된다. 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-8.
항체 가변 도메인에서의 잔기는 통상적으로 케이뱃 등(Kabat et al.)에 의해 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 이러한 시스템은 문헌[Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(이후, "Kabat et al. (supra)"")]에 기재되어 있다. 이러한 넘버링 시스템이 달리 지정된 경우를 제외하고는 본 명세서에서 사용된다.
케이뱃 잔기 지정은 항상 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 항상 직접적으로 일치하지는 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR) 여부에 상관 없이 염기성 가변 도메인 구조의 구조적 성분의 생략 또는 이로의 삽입에 해당하는 엄격한 케이뱃 넘버링에서 보다 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 케이뱃 넘버링은 "표준" 케이뱃 넘버링된 서열과의 항체의 서열에서의 상동성 잔기의 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치된다. 그러나, 초티아(Chothia)(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1에 해당하는 루프는 잔기 26으로부터 잔기 32에 걸쳐 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 'CDR-H1'은 케이뱃 넘버링 시스템 및 초티아의 위상 루프 정의의 조합에 의해 기재된 바와 같이 잔기 26 내지 35를 포함한다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 케이뱃 넘버링 시스템에 따라 잔기 24 내지 34(CDR-L1), 잔기 50 내지 56(CDR-L2) 및 잔기 89 내지 97(CDR-L3)에 위치된다.
일 구체예에서, 항체는 길항 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 '길항 항체'는, 예를 들어, IL-13 수용체로의 IL-13의 결합을 차단하거나 실질적으로 감소시켜 수용체의 활성화를 억제함으로써, IL-13의 생물학적 신호전달 활성을 억제하고/하거나 중화시킬 수 있는 항체를 기술한다.
본 발명에서 사용되는 항체는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 수득될 수 있다. IL-13을 함유하는 융합 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 (재조합적으로) 발현하는 세포를 포함하는 IL-13 폴리펩티드가 IL-13을 특이적으로 인지하는 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. IL-13 폴리펩티드는 '성숙한' 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체일 수 있다. IL-13 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전 공학처리된 숙주 세포로부터 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있거나, 이들은 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. 본 출원에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 이들은 달리 상술되지 않는 경우 상호교환적으로 사용된다. IL-13 폴리펩티드는 일부 예에서 친화성 태그(tag)에 융합된 융합 단백질과 같은 보다 큰 단백질의 일부일 수 있다.
IL-13 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 널리 공지되고 통상적인 프로토콜, 예를 들어, 문헌[Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986]을 이용하여 동물, 바람직하게는 비-인간 동물에 폴리펩티드에 투여함으로써 수득될 수 있고, 여기서 동물의 면역화가 필요하다. 많은 온혈 동물, 예를 들어, 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 전체 항체 및 이의 기능적으로 활성인 단편 또는 유도체를 포함하고, 이는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 전체 인간 항체 또는 키메라 항체일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
모노클로날 항체는 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체는 또한, 예를 들어 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481]; WO92/02551호; WO2004/051268호 및 국제 특허 공보 WO2004/106377호에 기재된 방법에 의해 특정 항체의 생성을 위해 선택된 단일한 림프구로부터 발생된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일한 림프구 항체 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
항체를 위한 스크리닝은 IL-13으로의 결합을 측정하기 위한 검정 및/또는 IL-13의 이의 수용체 중 하나 이상으로의 결합을 차단하는 능력을 측정하기 위한 검정을 이용하여 수행될 수 있다. 결합 검정의 예는, 예를 들어, 플레이트 상에 고정되는 IL-13의 융합 단백질을 이용하고, IL-13에 결합된 항-IL-13 항체를 검출하기 위한 컨쥬게이션된 이차 항체를 이용하는 ELISA이다. 차단 검정의 예는 IL-13R로의 IL-13 리간드 단백질 결합을 차단하는 것을 측정하는 유세포분석 기반의 검정이다. IL-13R로의 IL-13 리간드 단백질 결합의 양을 검출하는데 형광 표지된 이차 항체가 사용된다.
인간화된 항체(CDR 이식된 항체를 포함함)는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들어, US 5,585,089호; WO91/09967호 참조). 전체 CDR이 아닌 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있음이 인지될 것이다(예를 들어, Kashmiri et al, 2005, Methods, 36, 25-34 참조). 인간화된 항체는 임의로 CDR이 유래되는 비-인간 종으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
키메라 항체는 2개의 상이한 종으로부터 유래되는 성분으로 구성되며, 이는 상기 성분이 유래되는 종의 특징을 보유하도록 구성된다. 일반적으로, 키메라 항체는 한 종, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 유사한 종으로부터의 가변 영역, 및 또 다른 종, 예를 들어, 인간으로부터의 불변 영역을 포함할 것이다.
본 발명에 사용되는 항체는 또한 당 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있고, 이는 문헌[Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280)] 및 WO 90/02809호; WO 91/10737호; WO 92/01047호; WO 92/18619호; WO 93/11236호; WO 95/15982호; WO 95/20401호; 및 US 5,698,426호; 5,223,409호; 5,403,484호; 5,580,717호; 5,427,908호; 5,750,753호; 5,821,047호; 5,571,698호; 5,427,908호; 5,516,637호; 5,780,225호; 5,658,727호; 5,733,743호 및 5,969,108호에 기재된 것을 포함한다.
완전한 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재시)은 모두 인간 기원의 항체이거나, 반드시 동일 항체로부터가 아닌 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일한 항체이다. 완전한 인간 항체의 예는, EP 0546073호, US 5,545,806호, US 5,569,825호, US 5,625,126호, US 5,633,425호, US 5,661,016호, US 5,770,429호, EP 0438474호 및 EP 0463151호에서 전반적인 용어로 기재된 바와 같이, 예를 들어, 상기 기재된 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체, 및 뮤린 면역글로불린 가변 및 임의로 불변 영역 유전자가 이의 인간 대응물로 대체된 마우스에 의해 생성된 항체를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대해 특이성을 지니며 중쇄를 포함하는 길항 항체로서, 상기 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 관하여 도 1, 서열 목록 번호:1에 제공된 서열을 지니는 CDR, CDR-H2에 관하여 서열 목록 번호:2에 제공된 서열을 지니는 CDR 및/또는 CDR-H3에 관하여 서열 목록 번호:3에 제공된 서열을 지니는 CDR 중 하나 이상을 포함하는 길항 항체를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대해 특이성을 지니며 중쇄를 포함하는 길항 항체로서, 상기 중쇄의 가변 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 둘 이상이 CDR-H1에 관하여 서열 목록 번호:1에 제공된 서열, CDR-H2에 관하여 서열 목록 번호:2에 제공된 서열 및 CDR-H3에 관하여 서열 목록 번호:3에 제공된 서열로부터 선택되는 길항 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-H1은 서열 목록 번호:1에 제공된 서열을 지니고 CDR-H2는 서열 목록 번호:2에 제공된 서열을 지닌다. 대안적으로, 항체는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-H1은 서열 목록 번호:1에 제공된 서열을 지니고 CDR-H3은 서열 목록 번호:3에 제공된 서열을 지니거나, 항체는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-H2는 서열 목록 번호:2에 제공된 서열을 지니고 CDR-H3은 서열 목록 번호:3에 제공된 서열을 지닌다. 불확실성을 배제하기 위해, 모든 순열(permutation)이 포함됨을 이해하여야 한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대해 특이성을 지니며 중쇄를 포함하는 길항 항체로서, 상기 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 관하여 서열 목록 번호:1에 제공된 서열, CDR-H2에 관하여 서열 목록 번호:2에 제공된 서열 및 CDR-H3에 관하여 서열 목록 번호:3에 제공된 서열을 포함하는 길항 항체를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대해 특이성을 지니며 경쇄를 포함하는 길항 항체로서, 상기 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 관하여 도 1, 서열 목록 번호:4에 제공된 서열을 지니는 CDR, CDR-L2에 관하여 서열 목록 번호:5에 제공된 서열을 지니는 CDR 및/또는 CDR-L3에 관하여 서열 목록 번호:6에 제공된 서열을 지니는 CDR 중 하나 이상을 포함하는 길항 항체를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대해 특이성을 지니며 경쇄를 포함하는 길항 항체로서, 상기 경쇄의 가변 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 둘 이상이 CDR-L1에 관하여 서열 목록 번호:4에 제공된 서열, CDR-L2에 관하여 서열 목록 번호:5에 제공된 서열 및 CDR-L3에 관하여 서열 목록 번호:6에 제공된 서열로부터 선택되는 길항 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-L1은 서열 목록 번호:4에 제공된 서열을 지니고 CDR-L2는 서열 목록 번호:5에 제공된 서열을 지닌다. 대안적으로, 항체는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-L1은 서열 목록 번호:4에 제공된 서열을 지니고 CDR-L3은 서열 목록 번호:6에 제공된 서열을 지니거나, 항체는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-L2는 서열 목록 번호:5에 제공된 서열을 지니고 CDR-L3은 서열 목록 번호:6에 제공된 서열을 지닌다. 불확실성을 배제하기 위해, 모든 순열이 포함됨을 이해하여야 한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대해 특이성을 지니며 경쇄를 포함하는 길항 항체로서, 상기 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 관하여 서열 목록 번호:4에 제공된 서열, CDR-L2에 관하여 서열 목록 번호:5에 제공된 서열 및 CDR-L3에 관하여 서열 목록 번호:6에 제공된 서열을 포함하는 길항 항체를 제공한다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 상보성 경쇄 또는 상보성 중쇄를 각각 포함할 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 관하여 서열 목록 번호:1에 제공되는 서열, CDR-H2에 관하여 서열 목록 번호:2에 제공되는 서열 및/또는 CDR-H3에 관하여 서열 목록 번호:3에 제공되는 서열을 포함하는 중쇄, 및 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 관하여 서열 목록 번호:4에 제공되는 서열, CDR-L2에 관하여 서열 목록 번호:5에 제공되는 서열 및 CDR-L3에 관하여 서열 목록 번호:6에 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
IL-13에 결합하고, IL-13 활성을 중화시키는 항체의 능력을 현저히 변경시키지 않으면서 본 발명에 의해 제공되는 CDR에 1개 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과는, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 특히 IL-13 결합 및 IL-13/IL-13 수용체 상호작용의 억제를 결정하기 위한 실시예에 예시된 방법을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있다.
따라서, 본 발명은 CDRH-1(서열 목록 번호:1), CDRH-2(서열 목록 번호:2), CDRH-3(서열 목록 번호:3), CDRL-1(서열 목록 번호:4), CDRL-2(서열 목록 번호:5) 및 CDRL-3(서열 목록 번호:6)로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 인간 IL-13에 대한 특이성을 갖는 항체를 제공하며, 여기서 상기 CDR의 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어, 하기 본원에 정의되는 바와 같은 유사한 아미노산으로 대체된다.
일 구체예에서, 본 발명은 CDRH-1(서열 목록 번호:1), CDRH-2(서열 목록 번호:2 또는 서열 목록 번호:20), CDRH-3(서열 목록 번호:3), CDRL-1(서열 목록 번호:4), CDRL-2(서열 목록 번호:5) 및 CDRL-3(서열 목록 번호:6)을 포함하는 인간 IL-13에 대한 특이성을 갖는 항체를 제공하며, 예를 들어, 여기서 상기 CDR의 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어, 하기 본원에 정의되는 바와 같은 유사한 아미노산으로 대체된다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, 여기서 CDRH-1의 서열이 서열 목록 번호:1에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRH-2가 서열 목록 번호:2에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRH-3이 서열 목록 번호:3에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, 여기서 CDRH-1의 서열이 서열 목록 번호:1에 제공된 서열과 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRH-2가 서열 목록 번호:2에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRH-3가 서열 목록 번호:3에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 중쇄를 포함한다.
본원에서 사용된 "동일성"은 정렬된 서열 중의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열간에 동일함을 나타낸다. 본원에서 사용된 "유사성"은 정렬된 서열 중의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열간에 유사한 유형임을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린으로 치환될 수 있다. 종종 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 하기와 같으나 이로 제한되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 지니는 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 지니는 아미노산);
- 아스파테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 지니는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 지니는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황-함유 측쇄를 지니는 아미노산).
동일성 및 유사성 정도는 용이하게 산출될 수 있고(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991), BLAST™ 소프트웨어가 NCBI로부터 이용가능하다(Altschul, S.F. et al ., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al, 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al ., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, 여기서 CDRL-1의 서열이 서열 목록 번호:4에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRL-2가 서열 목록 번호:5에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRL-3이 서열 목록 번호:6에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 경쇄를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, 여기서 CDRL-1의 서열이 서열 목록 번호:4에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRL-2가 서열 목록 번호:5에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니고/지니거나, CDRL-3가 서열 목록 번호:6에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 경쇄를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 항체는 모노클로날 항체이다.
일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 항체는 키메라 항체이다.
일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 항체는 서열 목록 번호:1, 2, 3, 4, 5, 6에 제공된 CDR 중 1개 이상 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-이식된 항체이다. 본원에서 사용된 용어 'CDR-이식된 항체 분자'는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용체 항체(예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/경쇄 가변 영역 프레임워크로 이식된 공여체 항체(예를 들어, 뮤린 또는 래트 모노클로날 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(요망되는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR을 포함함)을 함유하는 항체 분자를 의미한다. 개관을 위해 문헌[Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조하라. 일 구체예에서, 전체 CDR이 옮겨진다기 보다, 상기 본원에 기재된 CDR 중 임의의 하나로부터의 특이성 결정 잔기의 1종 이상만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다(참조, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34]). 일 구체예에서, 상기 본원에 기재된 CDR 중 1종 이상으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다. 또 다른 구체예에서, 상기 본원에 기재된 CDR 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식되는 경우, 임의의 적합한 수용체 가변 영역 프레임워크 서열이 CDR이 유래되는 공여체 항체의 부류/유형을 고려하여 이용될 수 있고, 이는 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 CDR-이식된 항체가 인간 수용체 프레임워크 영역 뿐만 아니라 상기 기재된 CDR 또는 특이성 결정 잔기 중 하나 이상을 포함하는 가변 도메인을 지닌다. 따라서, 가변 도메인이 인간 수용체 프레임워크 영역 및 비-인간 공여체 CDR을 포함하는 중화 CDR-이식된 항체가 제공된다.
본 발명에 이용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(Kabat et al., 상술함). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 이용될 수 있고, REI는 경쇄에 이용될 수 있으며, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 이용될 수 있다. 대안적으로, 인간 점라인(germline) 서열을 이용할 수 있으며; 이러한 서열은 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 이용가능하다.
본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 수용체 중쇄 및 경쇄가 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 요망되는 경우 상이한 사슬로부터 유래된 프레임워크 영역을 지니는 혼성(composite) 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 CDR-이식된 항체의 중쇄에 대해 적합한 프레임워크 영역은 JH4(서열 목록 번호:41)와 함께 인간 서브-그룹 VH2 서열 3-1 2-26으로부터 유래된다. 따라서, 하나 이상의 비-인간 공여체 CDR을 포함하는 중화 CDR-이식된 항체가 제공되며, 여기서 중쇄 프레임워크 영역은 JH4와 함께 인간 서브그룹 VH2 서열 3-1 2-26으로부터 유래된다. 인간 JH4의 서열은 다음과 같다: (YFDY)WGQGTLVTVS(서열 목록 번호:43). YFDY 모티프는 CDR-H3의 일부이며 프레임워크 4의 일부는 아니다(Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).
본 발명의 CDR-이식된 항체의 경쇄에 대해 적합한 프레임워크 영역은 JK4(서열 목록 번호:39)와 함께 인간 점라인 서브-그룹 VK1 서열 2-1 1-02로부터 유래된다. 따라서, 하나 이상의 비-인간 공여체 CDR을 포함하는 중화 CDR-이식된 항체가 제공되며, 여기서 경쇄 프레임워크 영역은 JK4와 함께 인간 서브그룹 서열 2-1 1-02로부터 유래된다. JK4의 서열은 다음과 같다: (LT)FGGGTKVEIK(서열 목록 번호:44). LT 모티프는 CDR-L3의 일부이며 프레임워크 4의 일부는 아니다(Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).
일 구체예에서, 경쇄 및/또는 중쇄 프레임워크는 서열 목록 번호:39 내지 42에 제시된 서열로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 프레임워크 영역이 수용체 항체의 프레임워크 영역과 정확히 동일한 서열일 필요는 없다. 예를 들어, 통상적이지 않은 잔기는 그 수용체 사슬 부류 또는 유형에 대해 보다 빈번하게-발생하는 잔기로 변경될 수 있다. 대안적으로, 수용체 프레임워크 영역에서 선택된 잔기를 변경하여 이것이 공여체 항체의 동일한 위치에서 발견되는 잔기와 일치하도록 할 수 있다(참조, Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). 이러한 변경은 공여체 항체의 친화성을 회복하는데 필요한 최소 한도를 유지하여야 한다. 변경될 필요가 있는 수용체 프레임워크 영역의 잔기를 선택하는 프로토콜은 WO 91/09967호에 개시되어 있다.
적합하게는, 본 발명의 CDR-이식된 항체 분자에서, 수용체 중쇄가 JH4와 함께 인간 VH2 서열 3-12-26을 지니는 경우, 중쇄의 수용체 프레임워크 영역은 하나 이상의 공여체 CDR 이외에 49 및 71번 위치(케이뱃 등에 준함(상술함)) 중 하나 이상에 공여체 잔기를 포함한다(도 12 참조).
따라서, 중쇄의 가변 도메인의 위치 49 및 71의 하나 이상의 잔기가 공여체 잔기인 CDR-이식된 항체가 제공된다.
공여체 잔기는 공여체 항체, 즉 CDR이 최초로 유래된 항체로부터의 잔기이다. 바람직하게는, 잔기는 위치 49 및 71에 각각 글리신 및 아르기닌이다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 가변 도메인은 서열 목록 번호:31에 제공된 서열을 포함한다.
IL-13에 결합하여 IL-13 활성을 중화시키는 항체의 능력을 유의하게 변경시킴이 없이 본 발명에 의해 제공된 항체 가변 도메인에 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과는, 예를 들어, IL-13 결합 및/또는 리간드/수용체 차단을 결정하기 위해 실시예에 기재된 방법을 이용함으로써 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:31에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:31에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄의 가변 도메인은 서열 목록 번호:23에 제공된 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:23에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:23에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:31에 제공된 서열을 포함하는 중쇄, 및 경쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:23에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄의 가변 도메인은 서열 목록 번호:31에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하고, 경쇄의 가변 도메인은 서열 목록 번호:23에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함한다. 적합하게는, 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:31에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄, 및 경쇄의 가변 도메인이 서열 목록 번호:23에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, 이는 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 및 상기 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217 참조). 이러한 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181 참조). 본 발명에 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO 2005/003169호, WO 2005/003170호 및 WO 2005/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편, 및 국제 특허 출원 WO2009/040562호에 기재된 Fab-dAb 단편을 포함한다. 다가 항체는 다수의 특이성을 포함할 수 있거나, 단일특이성일 수 있다(예를 들어, WO 92/22853호 및 WO 05/113605호 참조).
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재하는 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 특히 필요할 수 있는 이펙터(effector) 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료용이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때, 특히 IgG1 및 IgG3 이소형의 인간 IgG 불변 영역 도메인을 이용할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료용이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때, 예를 들어, 단순히 IL-13 활성을 차단하고자 할 때, IgG2 및 IgG4 이소형을 이용할 수 있다. 상기 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 또한 사용될 수 있음이 인지될 것이다. 예를 들어, 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기재된 대로 241번 위치의 세린이 프롤린으로 변경된 IgG4 분자를 이용할 수 있다. 항체가 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있음이 또한 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 종종 항체를 발현하는데 사용되는 숙주 세포주 뿐만 아니라 배양 조건에 좌우된다. 이러한 변형은 당화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파테이트 이성화 및 아스파라긴 탈아미드화에서 변형을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기(예를 들어, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995에 기재됨). 그러나, 본 발명의 Ab652 구체예의 중쇄 또는 경쇄에서 C-말단 리신은 없다.
일 구체예에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다인 CL 도메인을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 중쇄 불변 영역이 변형된 힌지 영역을 포함하는 인간 IL-13에 대한 특이성을 갖는 길항 항체이다. 따라서, 본 발명은 중쇄가 서열 목록 번호:35에 제공된 서열을 포함하거나 이로 구성되는 항체를 제공한다.
하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이 IL-13에 결합하여 IL-13 활성을 중화시키는 항체의 능력을 유의하게 변경시키지 않고 본 발명에 의해 제공된 항체 가변 및/또는 불변 도메인에 대해 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과가 IL-13 결합 및 IL-13/IL-13 수용체 상호작용의 차단을 결정하기 위해, 예를 들어, 본원에 기재된 방법, 특히 실시예에 예시된 방법을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체는 중쇄를 포함하며, 상기 중쇄는 서열 목록 번호:35에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게는, 항체는 중쇄를 포함하며, 상기 중쇄는 서열 목록 번호:35에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 분자는 서열 목록 번호:27에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체는 경쇄를 포함하며, 상기 경쇄는 서열 목록 번호:27에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체는 경쇄를 포함하며, 상기 경쇄는 서열 목록 번호:27에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 중쇄가 서열 목록 번호:35에 제공된 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 경쇄가 서열 목록 번호:27에 제공된 서열을 포함하거나 이로 구성되는 항체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체는 서열 목록 번호:35에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 목록 번호:27에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일반적으로, 항체는 서열 목록 번호:35에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 목록 번호:27에 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
생물학적 분자, 예를 들어, 항체 또는 단편은 산성 및/또는 염기성 작용기를 함유함으로써 분자에 알짜 양성 또는 음성 전하를 제공한다. 전체 "관찰된" 전하의 양은 존재물의 절대 아미노산 서열, 3D 구조에서의 하전된 기의 국소적 환경, 및 분자의 환경적 조건에 좌우될 것이다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 표면이 알짜 전기 전하를 갖지 않는 pH이다. 일 구체예에서, 본 발명의 개시에 따른 항체 또는 단편은 7 이상의 등전점(pI)을 갖는다. 일 구체예에서, 항체 또는 단편은 8 이상, 예를 들어, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 또는 9의 등전점을 갖는다. 일 구체예에서, 항체의 pI는 8이다.
본 발명의 IL-13 항체 및 단편은 적절한 등전점을 갖도록 공학처리될 수 있다. 이는 더욱 강한 특성, 특히 적합한 용해도 및/또는 안정성 프로파일을 갖는 항체 및/또는 단편을 발생시킬 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 본래 확인된 항체의 등전점과 상이한 등전점을 갖도록 공학처리된 인간화된 IL-13 항체를 제공한다. 항체는, 예를 들어, 산성 아미노산 잔기를 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 대체시키는 것과 같이 아미노산 잔기를 대체시킴으로써 공학처리될 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기가 첨가될 수 있거나, 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 대안적으로, 분자가 허용될 수 없는 높은 pI 값을 갖는 경우, 필요시 pH를 낮추기 위해 산성 잔기가 도입될 수 있다. 공학처리된 항체 또는 단편의 pI는, 예를 들어, 8 이상, 예를 들어, 8.5 또는 9일 수 있다. pI를 조절하는 경우, 항체 또는 단편의 요망되는 활성을 보유하도록 주의해야 하는 것이 중요하다. 따라서, 일 구체예에서, 공학처리된 항체 또는 단편은 "변형되지 않은" 항체 또는 단편과 동일하거나 실질적으로 동일한 활성을 갖는다.
** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html과 같은 프로그램이 항체 또는 단편의 등전점을 예측하기 위해 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 분무에 의한 흡입 전달용에 적합화된다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체의 물리적 특성, 예를 들어, 결합 친화성 및 효능은 분무에 의해 실질적으로 변경되지 않는다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 매우 안정적이다. 항체 안정성의 한 척도는 융해 온도(Tm)이다. 융해 온도는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 써모플루오르(Thermofluor)(Ericsson et al, Analytical Biochemistry 357 (2006) 289-298) 또는 DSC(시차주사열량계)를 이용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 의해 제공된 항체는 높은 융해 온도(Tm), 통상적으로 75℃의 높은 온도를 갖는다. 일 예에서, 본 발명의 항체는 75℃ 이상의 Tm을 갖는다. 일 예에서, 본 발명의 항체는 80℃ 이상의 Tm을 갖는다. 일 예에서, 본 발명의 항체는 83℃ 이상의 Tm을 갖는다.
본 발명에 의해 제공된 항체, 특히 중쇄 서열(서열 목록 번호:35) 및/또는 경쇄 서열(서열 목록 번호:27)을 포함하는 항체에 의해 결합되는 인간 IL-13의 특정 영역 또는 에피토프가 또한 본 발명에 의해 제공된다.
이러한 특정 영역 또는 에피토프 및 인간 IL-13 폴리펩티드의 특정 영역 또는 에피토프 및 인간 IL-17A/F 이종이합체의 특정 영역 또는 에피토프가 본 발명에 의해 제공되는 항체 중 임의의 하나와 조합하여 당 분야에 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑(mapping) 방법에 의해 동정될 수 있다. 상기 방법의 예로는 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합될 수 있는 최소 단편을 이용하여 본 발명의 항체로의 결합을 위해 IL-13으로부터 유래된 다양한 길이의 펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. IL-13 펩티드는 합성에 의해서나 적절한 IL-13 폴리펩티드의 단백질분해 소화에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합되는 펩티드는, 예를 들어 질량 분광 분석에 의해 동정될 수 있다. 또 다른 예에서, NMR 분광기 또는 X-선 결정학을 이용하여, 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프를 동정할 수 있다. 일단 동정되면, 본 발명의 항체에 결합되는 에피토프 단편을, 요망되는 경우, 동일한 에피토프에 결합되는 추가의 길항 항체를 수득하기 위한 면역원으로서 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 결합을 교차 차단(cross-block)하는 항체, 특히 중쇄 서열(서열 목록 번호:31) 및 경쇄 서열(서열 목록 번호:27)을 포함하는 항체는 IL-13 활성을 길항시키는데 있어서 유사하게 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 13에 대한 상기 기재된 항체 중 임의의 하나의 결합을 교차 차단하고/거나 상기 항체 중 임의의 하나에 의해 IL-13 결합으로부터 교차 차단되는, 인간 IL-13에 대한 특이성을 갖는 길항 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 이러한 항체는 상기 본원에 기재된 항체로서 동일한 에피토프에 결합된다. 또 다른 구체예에서, 교차 차단 중화 항체는 상기 본원에 기재된 항체에 의해 결합된 에피토프와 근사하고(border)/거나 중복되는 에피토프에 결합된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 본 양태의 교차 차단 중화 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프 또는 상기 에피토프와 근사하고/거나 중복되는 에피토프에 결합되지 않는다.
교차 차단 항체는 인간 IL-13에 대한 교차 차단 항체의 결합이 본 발명의 항체의 결합을 억제하거나 역으로 억제하는, 예를 들어 경쟁 ELISA 또는 BIAcore 검정과 같은 당 분야의 임의의 적합한 방법을 이용하여 동정될 수 있다.
일 구체예에서, 중쇄가 서열 목록 번호:35에 제시된 서열을 포함하고, 경쇄가 서열 목록 번호:27에 제시된 서열을 포함하는 항체의 인간 IL-13으로의 결합을 교차 차단하는, 인간 IL-13에 대한 특이성을 갖는 길항 항체가 제공된다. 일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 교차 차단 항체는 서열 목록 번호:35에 제시된 중쇄 서열 및 서열 목록 번호:27에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체의 결합을 80% 초과, 예를 들어, 85% 초과, 예를 들어, 90% 초과, 특히 95% 초과까지 억제한다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 본 양태에 따른 길항 항체는 서열 목록 번호:35에 제시된 중쇄 서열 및 서열 목록 번호:27에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체에 의해 인간 IL-13으로의 결합으로부터 교차 차단될 수 있다. 따라서, 서열 목록 번호:35에 제시된 중쇄 서열 및 서열목록 27에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체에 의해 인간 IL-13 결합으로부터 교차 차단되는 인간 IL-13에 대한 특이성을 갖는 길항 항체 분자가 또한 제공된다. 일 구체예에서, 본 발명의 상기 양태에 의해 제공되는 길항 항체는 서열 목록 번호:35에 제시된 중쇄 서열 및 서열 목록 번호:27에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체에 의해 80% 초과, 예를 들어, 85% 초과, 예를 들어, 90% 초과, 특히 95% 초과까지 인간 IL-13 결합으로부터 억제된다.
일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 완전한 인간 항체이다. 일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 교차 차단 항체는 인간화된 항체이다. 일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 교차 차단 항체는 100pM 이상의 인간 IL-13에 대한 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 50pM 이상의 인간 IL-13에 대한 친화성을 갖는다.
일 구체예에서, 교차 차단 항체는 7 이상, 예를 들어, 8 이상, 예를 들어, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0의 등전점을 갖는다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 높은 결합 친화성, 특히 피코몰의 친화성을 갖는다. 친화성은 분리된 천연 또는 재조합 IL-13을 이용하는 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 BIAcore를 포함하는 표면 플라즈몬 공명을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 일 예에서, 친화성은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 재조합 인간 IL-13을 이용하여 측정된다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 100pM 이상의 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 50pM 이상의 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 40pM 이상의 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 30pM 이상의 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 20pM 이상의 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 완전한 인간 항체이거나 인간화된 항체이며, 이는 약 100pM 이상의 결합 친화성을 갖는다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 완전한 인간 항체이거나 인간화된 항체이며, 이는 30pM 이상의 결합 친화성을 갖는다.
본 발명에 의해 제공되는 항체의 친화성이 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 변경될 수 있음이 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이고, 이는 IL-13에 대해 개선된 친화성을 지닌다. 이러한 변이체는 CDR를 돌연변이시키는 것(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링(shuffling)(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), E. 콜리(E.coli)의 돌연변이유발 균주의 이용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링 (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 유성(sexual) PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는 다수의 친화성 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. 문헌[Vaughan et al. (상술함)]에 이러한 친화성 성숙 방법이 논의되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 IL-13과 IL-13 수용체 사이의 상호작용을 차단하고, 특히 본 발명의 항체 분자는 IL-13과 IL-13Rα1 사이의 상호작용 및 IL-13과 IL-13Rα2 사이의 상호작용을 차단한다. 상기 상호작용을 차단하는 항체의 능력을 결정하기에 적합한 다수의 검정이 본원의 실시예에 기재되어 있다. 일 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대한 친화성을 갖는 중화 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 검정에 사용되는 인간 IL-13 수용체는 천연 인간 IL-13Rα1 또는 천연 인간 IL-13Rα2이다. 일 구체예에서, 검정에 사용되는 인간 IL-13 수용체는 재조합 인간 IL-13Rα1 또는 재조합 인간 IL-13Rα2이다. 일 구체예에서, 검정에 사용되는 인간 IL-13은 재조합 인간 IL-13이다. 일 구체예에서, 중화 항체는 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체 또는 이의 단편이다.
요망되는 경우, 본 발명에 사용되는 항체는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 컨주게이션될 수 있다. 이펙터 분자가 단일 이펙터 분자를 포함하거나, 결합되어 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 부분을 형성하는 둘 이상의 상기 분자를 포함할 수 있음이 인지될 것이다. 이펙터 분자에 결합된 항체 단편을 수득하는 것이 요망되는 경우, 이는 항체 단편을 직접 또는 커플링제에 의해 이펙터 분자에 결합시키는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 공정에 의해 제조될 수 있다. 상기 이펙터 분자를 항체에 컨주게이션하는 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다(참조, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). 특정 화학적 공정으로는, 예를 들어 WO 93/06231호, WO 92/22583호, WO 89/00195호, WO 89/01476호 및 WO03031581호에 기재된 것들이 있다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 결합은, 예를 들어 WO 86/01533호 및 EP0392745호에 기재된 재조합 DNA 공정을 이용하여 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 이펙터 분자는, 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성 요오다이드, 방사성 동위원소, 킬레이트 금속, 나노입자 및 리포터 그룹, 예를 들어 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광학에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예로는 세포에 유해한(예를 들어, 치사시키는) 임의의 작용제를 포함하는 세포독소 또는 세포독성제가 있을 수 있다. 예로는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탠시노이드, 스폰기스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스텔린, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 있다.
이펙터 분자는 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 두오카르마이신), 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)도 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다른 이펙터 분자는 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188과 같은 킬레이트 방사성핵종; 또는 이로 제한되지 않는 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민과 같은 약물을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심 효소로는 단백질분해 효소, 히드롤라아제(hydrolase), 리아제(lyase), 이소머라제, 트랜스퍼라제가 있으나 이에 제한되지 않는다. 관심 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드로는 면역글로불린, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 단백질, 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린이 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 이펙터 분자는, 예를 들어 진단에서 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보조 분자족(prosthetic groups), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영법에 이용됨), 및 비방사성 상자성 금속 이온이 있다. 진단용 항체에 컨주게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참조하라. 적합한 효소로는 호스라디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제가 있고; 적합한 보조 분자족에는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴이 있으며; 적합한 형광 물질에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린이 있고; 적합한 발광 물질로는 루미놀이 있으며; 적합한 생체발광물질에는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린이 있고; 적합한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc가 있다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/거나, 항체의 면역원성을 감소시키고/거나, 상피 장벽을 지나 면역계로의 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 WO05/117984호에 기재된 것들과 같은 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물이 있다.
이펙터 분자가 중합체일 때, 이는 일반적으로 합성 또는 천연 발생 중합체일 수 있으며, 예를 들어 치환되거나 치환되지 않은 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지되거나 분지되지 않은 다당류, 예를 들어 호모-다당류 또는 헤테로-다당류이다.
상기 언급된 합성 중합체에 제공될 수 있는 특정 치환기에는 하나 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시기가 있다.
합성 중합체의 특정 예로는 치환되거나 치환되지 않은 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜)과 같은 치환되거나 치환되지 않은 폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체가 있다.
특정한 천연 발생 중합체로는 락토오스, 아밀로오스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체가 있다.
본원에서 사용되는 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 말레이미드 등과 같은 티올-선택적 반응성기를 포함하도록 의도된다. 반응성기는 중합체에 직접 결합되거나 링커 세그먼트를 통해 결합될 수 있다. 일부 경우에 상기 기의 잔기가 항체 단편과 중합체 사이의 결합기(linking group)로서 생성물의 일부를 형성할 것임이 인지될 것이다.
중합체의 크기는 요망에 따라 다양할 수 있으나, 일반적으로 평균 분자량이 500Da 내지 50000Da, 예를 들어, 5000 내지 40000Da, 예를 들어, 20000 내지 40000Da의 범위일 것이다. 중합체 크기는 특히 종양과 같은 특정 조직에 국소화시키는 능력 또는 순환되는 반감기를 연장시키는 능력과 같은 생성물의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다(개관을 위해, 문헌[Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환을 중지하고 조직으로 침투할 때, 예를 들어 약 5000Da의 분자량을 지니는 저분자량의 중합체를 이용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 여전히 순환중인 적용의 경우에, 예를 들어 20000Da 내지 40000Da 범위의 분자량을 지니는 고분자량의 중합체를 이용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체, 및 특히 분자량의 범위가 약 15000Da 내지 약 40000Da인 것이다.
일 예에서, 본 발명에 사용되는 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 부분에 부착된다. 구체적인 일 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 항체 단편에 위치한 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 유리 아미노기, 이미노기, 티올기, 히드록실기 또는 카르복실기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 천연 발생할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편으로 공학처리될 수 있다(참조, 예를 들어 US 5,219,996호; US 5,667,425호; WO98/25971호). 일 예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편이고, 여기서 변형은 이의 중쇄의 C-말단부에 이펙터 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산의 첨가이다. 바람직하게는, 첨가된 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지(hinge) 영역을 형성한다. 둘 이상의 PEG 분자를 부착시키기 위해 다수의 부위가 이용될 수 있다.
적합하게는, PEG 분자가 항체 단편에 위치한 하나 이상의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유적으로 결합될 수 있다. 변형된 항체 단편에 부착된 각 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 결합될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 이황화 결합, 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올기가 부착점(point of attachment)으로서 이용되는 경우, 적합하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어 말레이미드 및 시스테인 유도체와 같은 티올 선택적인 유도체가 이용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기재된 중합체-변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로 이용될 수 있다. 활성화된 중합체는 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드와 같이 α-할로카르복실산 또는 에스테르와 같은 티올 반응성기를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 입수할 수 있거나(예를 들어, Nektar, 이전에는 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA), 시판되는 출발 물질로부터 통상의 화학적 공정을 이용하여 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자는 2OK 메톡시-PEG-아민(Nektar, 이전에는 Shearwater; Rapp Polymere; and SunBio로부터 수득할 수 있음) 및 M-PEG-SPA(Nektar, 이전에는 Shearwater로부터 수득할 수 있음)를 포함한다.
일 구체예에서, 항체는, 예를 들어 EP 0948544호 또는 EP 1090037호에 기재된 방법에 따라 PEG화된, 즉 공유적으로 결합된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))을 지니는 변형된 Fab 단편 또는 diFab이다[참조 "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. 일 예에서, PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 일 예에서, PEG 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역 내의 단일 티올기에 공유적으로 결합된 말레이미드기를 지닌다. 리신 잔기는 말레이미드기에 공유적으로 결합될 수 있고, 리신 잔기 상에서 아민기의 각각에 분자량이 약 20,000Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 따라서 대략 40,000Da일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-13에 대해 특이성을 지니는 길항 항체 분자를 제공하고, 이는 서열 목록 번호:35에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 목록 번호:27에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 지니고, 이펙터 분자가 부착되는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 이의 중쇄의 C-말단부에 지니는 변형된 Fab' 단편이다. 적합하게는 이펙터 분자는 PEG이고, 이는(WO98/25971호 및 WO2004072116호, 또는 WO2007/003898호)에 기재된 방법을 이용하여 부착된다. 에펙터 분자는 국제 특허 출원 WO2005/003169호, WO2005/003170호 및 WO2005/003171호에 기재된 방법을 이용하여 항체 단편에 부착될 수 있다.
일 구체예에서, 항체 또는 단편은 이펙터 분자에 부착되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)을 엔코딩하는 분리된 DNA 서열을 제공한다. 적합하게는, DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 엔코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은, 예를 들어 화학적 프로세싱, cDNA, 유전체 DNA 또는 이들의 임의의 조합에 의해 생성된 합성 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 엔코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 요망에 따라 결정된 DNA 서열로부터 합성될 수 있거나 상응하는 아미노산 서열에 기초하여 합성될 수 있다.
수용체 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA는 당업자에게 널리 이용될 수 있고 이들의 공지된 아미노산 서열에 기초하여 용이하게 합성될 수 있다.
분자생물학의 표준 기술을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 요망되는 DNA 서열은 올리고누클레오티드 합성 기술을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술이 적합하게 이용될 수 있다.
적합한 서열의 예가 본원에 제공된다. 뮤린 신호 펩티드 MEWSWVFLFF LSVTTGVHS(서열 목록 번호:45)와 같은 중쇄에 대한 적합한 신호 펩티드가 여기서 엔코딩될 수 있다. 분해되어 본 발명의 길항 항체 분자를 발생시키는 뮤린 신호 펩티드 MSVPTQVLGL LLLWLTDARC(서열 목록 번호:46)와 같은 경쇄에 대해 적합한 신호 펩티드가 여기서 엔코딩될 수 있다. 본 발명은 또한 서열 목록 번호:32, 34 또는 36 또는 38을 포함하는 본 발명의 항체의 중쇄를 엔코딩하는 분리된 DNA 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 목록 번호:24, 26, 28 또는 30을 포함하는 본 발명의 항체의 경쇄를 엔코딩하는 분리된 DNA 서열을 제공한다.
벡터를 구성할 수 있는 일반적인 방법으로 트랜스펙션(transfection) 방법 및 배양 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조하라.
또한, 본 발명의 항체를 엔코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 본 발명의 항체 분자를 엔코딩하는 DNA 서열의 발현에 시용할 수 있다. 세균, 예를 들어 E. 콜리 및 다른 미생물 시스템을 이용할 수 있거나, 진핵, 예를 들어 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템을 이용할 수도 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포가 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 본 발명의 항체 분자를 엔코딩하는 DNA로부터 단백질을 발현시키기에 적합한 조건하에 배양하고, 항체 분자를 분리시키는 것을 포함하여, 본 발명에 따른 항체 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
항체 분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있고, 이 경우 숙주 세포를 트랜스펙션하는데 이용하기에 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열만을 필요로 한다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함하는 생성물을 제조하기 위해, 세포주를 두 개의 벡터로 트랜스펙션시킬 수 있는데, 첫 번째 벡터는 경쇄 폴리펩티드를 엔코딩하고 두 번째 벡터는 중쇄 폴리펩티드를 엔코딩한다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 개시에 따른 항체 및 단편은 숙주 동물로부터 우수한 수준으로 발현된다. 따라서, 항체 및/또는 단편의 특성이 상업적 처리에 적합하고 도움이 되는 것으로 보인다.
본 발명의 항체가 병리 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하기 때문에, 본 발명은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자를 포함하는 약학적 조성물 또는 진단용 조성물을 제공한다. 따라서, 약제를 제조하기 위한 본 발명의 항체의 용도가 제공된다. 조성물은 보통은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 살균된 약학적 조성물의 일부로서 일반적으로 적용될 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자를 첨가하고 혼합시키는 것을 포함하여, 약학적 또는 진단용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
항체 분자는 약학적 또는 진단용 조성물에서 유일한 활성 성분일 수 있거나 다른 항체 성분, 예를 들어 항-TNF, 항-IL-1β, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비-항체 성분, 예를 들어 크산틴을 포함하는 다른 활성 성분을 동반할 수 있다. 다른 적합한 활성 성분은 내성을 유도할 수 있는 항체, 예를 들어, 항-CD3 또는 항-CD4 항체를 포함한다.
한 추가 구체예에서, 본 발명의 개시에 따른 항체, 단편 또는 조성물은 추가의 약학적 활성제, 예를 들어, 코르티코스테로이드(예를 들어, 플루티카손 프로피오네이트) 및/또는 베타-2-효능제(예를 들어, 살부타몰, 살메테롤 또는 포르모테롤) 또는 세포 성장 및 증식의 억제제(예를 들어, 라파마이신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트) 또는 대안적으로 CD28 및/또는 CD40 억제제와 조합하여 사용된다. 일 구체예에서, 억제제는 소분자이다. 또 다른 구체예에서, 억제제는 표적에 특이적인 항체이다.
약학적 조성물은 적합하게는 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 표적 질병 또는 질환을 치료, 경감 또는 예방하는데 필요한 치료제의 양, 또는 검출할 수 있는 치료 또는 예방 효과를 나타내는 양을 의미한다. 임의의 항체에 대하여, 치료적 유효량은 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서, 세포 배양 검정 또는 동물 모델에서 초기에 산정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적합한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데에도 이용될 수 있다. 이러한 정보는 이후 인간에게 투여하기 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하는데 이용될 수 있다.
인간 피검체에 대한 정확한 치료적 유효량은 질병 상태의 중증도, 피검체의 일반적인 건강 상태, 피검체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합물(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응에 의존적일 것이다. 이러한 양은 관례적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 이는 임상의의 판단하에 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 ㎎/kg 내지 50 ㎎/kg일 것이고, 예를 들어, 0.1 ㎎/kg 내지 20 ㎎/kg이다. 대안적으로, 용량은 하루 당 1 내지 500 ㎎, 예를 들어, 하루 당 10 내지 100, 200, 300 또는 400 ㎎일 수 있다. 약학적 조성물은 용량 당 소정량의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 함께(예를 들어, 동시에, 차례로 또는 별도로) 투여될 수 있다.
투여되는 본 발명의 항체 분자의 용량은 치료하려는 질병의 특성, 존재하는 염증의 정도 및 항체 분자가 예방용인지 현재의 질병을 치료하기 위해 이용되는 것인지의 여부에 의존적이다.
투여 빈도는 항체 분자의 반감기 및 이의 효과의 지속기간에 의존적일 것이다. 항체 분자가 짧은 반감기를 지니는 경우(예를 들어, 2 내지 10시간), 매일 1회 이상 투여될 필요가 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴 반감기를 지니는 경우(예를 들어, 2 내지 15일), 매일 1회, 1주에 1회, 또는 매 1개월 또는 2개월에 1회 투여를 제공하는 것만이 필요할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 조성물을 투여받는 개체에게 해로운 항체의 생성을 자체적으로 유도하지 않고 유독하지 않아야 한다. 적합한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 천천히 대사되는 큰 거대분자일 수 있다.
약학적으로 허용되는 염, 예를 들어 광산염, 예를 들어 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
치료용 조성물 중의 약학적으로 허용되는 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체들은 약학적 조성물이 환자에 의해 섭취되는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 한다.
적합한 투여 형태는 주사 또는 주입, 예를 들어 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입과 같이 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 것일 때, 이것은 오일 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적합한 살균 액체와 재구성되는 건조 형태일 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 피검체에게 직접 투여될 수 있다. 치료하려는 피검체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 구체예에서, 조성물이 인간 피검체에게 투여되기 위해 적합화되는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, 본 발명의 개시에 따른 제형에서, 최종 제형의 pH는 항체 또는 단편의 등전점의 값과 유사하지 않고, 예를 들어, 제형의 pH가 7인 경우, 8-9 또는 이 이상의 pI가 적합할 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 이는 궁극적으로 개선된 안정성을 갖는 최종 제형을 제공할 수 있으며, 예를 들어, 항체 또는 단편은 용액으로 유지된다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous)(예를 들어, WO98/20734호 참조), 피하, 복막내, 비내, 창자, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(hypospray)도 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 치료용 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능하게 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 흡입 또는 국소적으로 피하에 투여된다.
조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복막내, 정맥내 또는 근내에 의해 달성될 수 있거나, 조직의 사이질 공간으로 전달될 수 있다. 조성물은 관심 특정 조직으로 투여될 수도 있다. 투여 치료는 단일 투여 스케줄 또는 다수 투여 스케줄일 수 있다.
조성물 중의 활성 성분이 항체 분자임이 인지될 것이다. 이와 같이, 이것은 위장관에서의 분해에 민감할 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용한 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하나 일단 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출시키는 작용제를 함유할 필요가 있다.
약학적으로 허용되는 담체의 면밀한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]을 이용할 수 있다.
일 구체예에서, 제형은 흡입을 포함하는 국소 투여용 제형으로 제공된다.
적합한 흡입 제조물은 흡입용 분말, 추진 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진 가스를 함유하지 않는 흡입용 용액(예를 들어, 분무 용액 또는 현탁액)을 포함하다. 활성 물질을 함유하는 본 발명의 개시에 따른 흡입용 분말은 상기 언급된 활성 물질 단독으로 구성될 수 있거나, 상기 언급된 활성 물질과 생리학적으로 허용되는 부형제의 혼합물로 구성될 수 있다.
이러한 흡입용 분말은 단당류(예를 들어, 글루코오스 또는 아라비노오스), 이당류(예를 들어, 락토오스, 당류, 말토오스), 올리고당류 및 다당류(예를 들어, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 상기와 다른 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적합하게 사용되나, 락토오스 또는 글루코오스, 특히 이의 수화물 형태가 배타적이지 않게 사용된다.
폐에서의 침착용 입자는 10 마이크론 미만, 예를 들어, 1-9 마이크론, 예를 들어, 0.1 내지 5 ㎛, 특히 1 내지 5 ㎛의 입자 크기를 필요로 한다. 활성 물질(예를 들어, 항체 또는 단편)의 입자 크기가 가장 중요하다.
흡입용 에어로졸을 제조하기 위해 사용될 수 있는 추진 가스가 당 분야에 공지되어 있다. 적합한 추진 가스가 탄화수소, 예를 들어, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로히드로카본, 예를 들어, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄의 염소화 및/또는 플루오르화 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진 가스가 단독으로 사용되거나, 이의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진 가스는 TG11, TG12, TG134a 및 TG227로부터 선택된 할로겐화된 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화된 탄화수소 중 TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판)이 특히 적합하다.
흡입용 에어로졸을 함유하는 추진 가스는 또한 다른 성분, 예를 들어, 공용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH를 조정하기 위한 수단을 함유할 수 있다. 모든 이러한 성분은 당 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 흡입용 에어로졸을 함유하는 추진 가스는 5 중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은, 예를 들어, 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 물질을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여는 또한, 예를 들어, 분무기, 예를 들어, 압축기에 연결된 분무기와 같은 장치를 이용하여 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의해 이루어질 수 있다(예를 들어, Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.에 의해 제조된 Pari Master(R) 압축기에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 분무기).
일 구체예에서, 제형은 분무에 의한 전달을 위한 단위 용량을 함유하는 별개의 앰풀로 제공된다.
일 구체예에서, 항체는 재구성을 위한 동결건조된 형태, 또는 대안적으로 현탁액 제형으로 공급된다.
본 발명의 항체는 용매 중에 분산된 형태, 예를 들어, 용액 또는 현탁액 형태로 전달될 수 있다. 이는 적절한 생리학적 용액, 예를 들어, 생리학적 염수, 약리학적으로 허용되는 용매 또는 완충 용액에 현탁될 수 있다. 당 분야에 공지된 완충 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하기 위해 1 ㎖의 물 당 0.05 ㎎ 내지 0.15 ㎎의 에데트산 나트륨(disodium edetate), 8.0 ㎎ 내지 9.0 ㎎의 NaCl, 0.15 ㎎ 내지 0.25 ㎎의 폴리소르베이트, 0.25 ㎎ 내지 0.30 ㎎의 무수 시트르산, 및 0.45 ㎎ 내지 0.55 ㎎의 시트르산 나트륨을 함유할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 현탁액은, 예를 들어, 동결건조된 항체로부터 제조될 수 있다.
치료 현탁액 또는 용액 제형은 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 완충액(예를 들어, 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 비카보네이트 완충액), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포솜 또는 생분해성 미세구에 캡슐화될 수 있다. 제형은 일반적으로 멸균 제조 방법을 이용하여 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이는 제형에 사용되는 완충 용매 용액의 여과, 멸균 완충 용매 용액 중에서의 항체의 무균 현탁액, 및 당업자에게 친숙한 방법에 의한 멸균 용기로의 제형의 분배에 의한 생성 및 멸균을 포함할 수 있다.
본 발명의 개시에 따른 분무용 제형은, 예를 들어, 호일 덮개에 패킹된 단일 용량 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이얼)로 제공될 수 있다. 각각의 바이얼은 일정 부피, 예를 들어, 2 ㎖의 용매/용액 완충액 중에 단위 용량을 함유한다.
본 발명의 개시의 항체는 분무를 통한 전달에 적합한 것으로 생각된다.
본 발명의 항체는 유전자 치료요법을 이용하여 투여될 수 있음이 예견된다. 이를 달성하기 위하여, 적합한 DNA 성분의 조절 하에 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 환자에게 도입시켜 항체 사슬을 DNA 서열로부터 발현시키고 동일반응계내에서(in situ) 어셈블링시킨다.
본 발명은 또한 염증 질병, 예를 들어, 급성 또는 만성 염증 질병의 조절에 사용하기 위한 항체 분자(또는 이를 포함하는 조성물)를 제공한다. 적합하게는, 항체 분자(또는 이를 포함하는 조성물)는 염증 과정을 감소시키거나 염증 과정을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 예를 들어, 반응 부근/위치로 보충되는 활성화된 T 세포, 특히 부적절한 염증 면역 반응과 관련된 활성화된 T 세포의 생체내 감소가 제공된다.
본원에서 사용되는 활성화된 T 세포의 감소는 치료 전 또는 치료가 없는 경우에 비해 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 이 이상의 퍼센트의 감소일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 항체, 단편 또는 조성물을 이용한 치료는 T 세포(비활성화된 T 세포)의 환자의 전체 수준을 감소시킴이 없이 활성화된 T 세포의 수준의 감소를 가능케 할 수 있다. 이는 부작용이 거의 없을 수 있고, 가능하게는 환자에서 T 세포 고갈을 방지할 수 있다.
본 발명은 또한 IL-13에 의해 매개되거나, IL-13의 증가된 수준과 관련된 병리 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항체 분자를 제공한다.
병리 질환 또는 장애는, 예를 들어, 감염(바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충), 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 예를 들어, 류머티스 관절염, 천식, 예를 들어, 중증 천식, 만성 폐쇄폐병(COPD), 골반 염증 질병, 알츠하이머병, 염증성 장질병, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병, 복강 질환, 담낭 질병, 모소동(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 혈관염, 외과적 유착, 뇌졸중, 타입 Ｉ 당뇨병, 라임병, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 신경계 및 말초 신경계의 면역 매개 염증 장애, 예를 들어, 다발경화증, 루푸스(예를 들어, 전신홍반루푸스) 및 길랑-바레 증후군, 아토피 피부염, 자가면역 간염, 섬유화 폐포염, 그레이브스병, IgA 신장병증, 특발성 혈소판감소성 자반병, 메니에르병, 천포창, 원발성 담즙성 간경변증, 사르코이드증, 피부경화증, 베게너 육아종증, 다른 자가면역 장애, 췌장염, 외상(수술), 이식편대숙주병, 이식 거부, 심장병, 예를 들어, 허혈 질병, 예를 들어, 심근경색증 뿐만 아니라 죽상경화증, 혈관내 응고, 골흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염 및 저염산증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 동통, 특히 염증과 관련된 동통의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체 분자를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 염증의 치료에 대한 내성, 특히 염증의 치료에 대한 폐 내성을 감소시킨다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는, 예를 들어, 치료 전의 수준과 비교하여 기관지 조직에서 IL-13 단백질 수준을 감소시킨다. 감소는 5, 10, 20, 30, 40% 또는 이 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는, 예를 들어, 치료 전의 수준과 비교하여 비세척액 및/또는 기관지 폐포액에서 IL-13 단백질 수준을 감소시킨다. 감소는 5, 10, 20, 30, 40% 또는 이 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는, 예를 들어, 치료 전의 수준에 비해 호산구 유입을 감소시킨다. 감소는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6주 또는 이 이상 치료되는 경우에 5, 10, 20, 30, 40% 또는 이 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는, 예를 들어, 배상세포 과다증식, 예를 들어, 만성 배상세포 과다증식의 치료에서 배상세포의 부적절한 수준을 감소시키는데 적합하다. 감소는 1 , 2, 3, 4, 5, 6주 또는 이 이상 동안의 치료 후에 관찰될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 치료 전의 수준에 비해 호기 산화질소(FeNO)의 수준을 감소시키는데 적합하다. 호기 산화질소는 폐 염증에 대한 위험 인자 또는 마커로 생각된다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 염증 반응과 관련된 부적절한 콜라겐 침착, 특히 기관지주위 콜라겐 침착의 예방에 적합하다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 염증 반응과 관련된 부적절한 혈관형성을 방지하는데 적합하다.
따라서, 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 및 이를 이용한 치료 방법이 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 본 발명에 따른 항체는 또한 명세서에 기재된 단편 및 유도체를 의미한다.
본 발명은 IL-13에 의해 매개되거나 IL-13의 증가된 수준과 관련된, 예를 들어, 본원에 기재된 병리 장애를 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 항체 분자, 단편 또는 조성물의 용도를 추가로 제공하며, 특히 상기 병리 장애는 류머티스 관절염, 천식 또는 COPD이다.
본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 의학적 적응증을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 항체 분자, 단편 또는 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명의 항체 분자, 단편 또는 조성물은 인간 또는 동물 체내에서 IL-13의 효과를 감소시키는 것이 요망되는 임의의 요법에 사용될 수 있다. IL-13은 체내에서 순환될 수 있거나, 신체의 특정 부위, 예를 들어, 염증 부위에 요망되지 않는 높은 수준으로 위치되어 존재할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자 또는 이를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 염증 질병의 조절에 사용된다.
본 발명은 또한 IL-13에 의해 매개되는 장애를 갖거나, 이의 위험이 있는 인간 또는 동물 피검체를 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 유효량의 본 발명의 항체 분자 또는 이를 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 항체 분자는 흡입에 의해 투여된다.
일 구체예에서, 장애는 상기 제공된 의학적 적응증 중 임의의 적응증으로부터 선택된다. 일 예에서, 장애는 천식 장애, 아토피 장애, 만성 폐쇄폐병(COPD), 기도 염증과 관련된 질환, 호산구증가증, 섬유증 및 과도한 점액 생성, 염증 질환, 자가면역 질환, 종양 또는 암, 바이러스 감염 및 보호 타입 1 면역 반응 발현의 억제로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 항체(특히, 본 발명에 따른 항체 또는 단편)를 정제하는 방법이 제공된다.
일 구체예에서, 불순물이 컬럼에 보유되고, 항체가 결합되지 않은 분획으로 유지되도록 하는 비-결합 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 항체(특히, 본 발명에 따른 항체 또는 단편)를 정제하는 방법이 제공된다. 상기 단계는, 예를 들어, pH 약 6-8에서 수행될 수 있다.
상기 방법은, 예를 들어, 약 4 내지 5의 pH에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 최초 포획 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 불순물과 관련된 생성물 및 방법이 생성 스트림으로부터 적절하게 해결되는 것을 보장하는 추가 크로마토그래피 단계(들)을 추가로 포함할 수 있다.
정제 방법은 또한 하나 이상의 초여과 단계, 예를 들어 농축 및 정용여과(diafiltration)를 포함할 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 정제된 IL-13 항체 또는 단편, 예를 들어, 인간화된 항체 또는 단편, 특히 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 정제된 형태의 본 발명에 따른 항체 또는 단편이 제공된다. 말하자면, 본 발명에 따른 항체는 일반적으로 포유동물 세포에서 제조될 것이며, 이에 따라 내독소 함량은 일반적으로 문제가 되지 않는다. 사실, 내독소 함량은, 항체가 박테리아 세포에서 제조되는 경우에 더욱 고려대상이다.
상기에서 사용되는 정제된 형태는 90% 이상의 순도, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w 또는 이 이상의 순도를 의미한다.
실질적으로 내독소를 함유하지 않는 것은 항체 생성물 ㎎ 당 1 EU 이하의 내독소 함량, 예를 들어, 생성물 ㎎ 당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 일반적으로 의미한다.
실질적으로 숙주 세포 단백질 또는 DNA를 함유하지 않는 것은 항체 생성물의 ㎎ 당 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량 400 ㎍ 이하, 예를 들어, 100 ㎍/㎎ 이하, 특히 적절한 경우 20 ㎍/㎎을 의미한다.
본 발명의 항체 분자는 또한 진단, 예를 들어, IL-13과 관련된 질병 상태의 생체내 진단 및 영상화에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 특성을 시험하기 위한 적합한 생체내 검정은 만성 집먼지 진드기 모델, 메타콜린에 대한 과민성 및/또는 알레르기 폐 염증의 난알부민 모델을 포함한다.
본 명세서에서 "포함하는"은 함께 포함하는 것을 의미하는 것이다.
기술적으로 적절한 본 발명의 구체예는 조합될 수 있다.
구체예는 특정한 특징/요소를 포함하는 것으로 본원에 기재된다. 개시는 또한 상기 특징/요소로 구성되거나 본질적으로 이를 포함하는 별개의 구체예로 확대된다.
본 발명은 하기와 같이 수반되는 도면을 참조로 하는 하기 실시예에서 단지 예시로서 추가로 기재된다:
도 1은 하기를 도시한다:
중쇄로부터의 CDR 1, 2, 3(CDR H) 및 경쇄로부터의 CDR 1, 2, 3(CDR L)의 각각에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:1-6)
래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:7)
래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:8), 및
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:9)
도 2는 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:10)
래트 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:11)
래트 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:12)
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:13)
도 3은 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 경쇄에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:14)
래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:15)
래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:16)
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:17)
도 4는 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:18)
래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:19)
도 5는 하기를 도시한다:
래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:20)
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:21)
도 6은 하기를 도시한다:
신호 서열을 갖는 래트 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:22)
도 7은 하기를 도시한다:
인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:23)
인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:24)
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:25)
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:26)
인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:27)
도 8은 하기를 도시한다:
인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:28)
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:29)
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 경쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:30)
도 9는 하기를 도시한다:
인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:31)
인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:32)
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:33)
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 중쇄 가변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:34)
인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:35)
도 10은 하기를 도시한다:
인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:36)
신호 서열을 갖는 인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 아미노산 서열(서열 목록 번호:37)
인간화된 항체 중쇄 가변 및 불변 영역에 대한 DNA 서열(서열 목록 번호:38)
도 11은 하기를 도시한다:
인간 VK 1 2-1-(1)02 JK4 수용체 프레임워크(서열 목록 번호:39 및 서열 목록 번호:40) 및 VH2 3-1 2-26 JH4 수용체 프레임워크(서열 목록 번호:41 및 서열 목록 번호:42)에 대한 아미노산 및 DNA 서열
도 12는 하기를 도시한다:
래트에 대한 경쇄, 수용체 프레임워크 및 인간화된 경쇄 및 또한 중쇄의 정렬. CDR은 굵은 글씨이며 밑줄이 있다. 공여체 잔기 G49 및 R71은 굵은 글씨의 이탤릭체이며, 강조되어 있다.
도 13. 천식의 비-인간 영장류 모델에서의 알레르겐 공격 24시간 후에 측정된 BAL 에오탁신-3에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다, 그룹 당 n=4-8.
도 14. 천식의 비-인간 영장류 모델에서의 알레르겐 공격 24시간 후에 측정된 BAL 호산구에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 연구의 스크리닝 단계에서 측정된 BAL 호산구 수에 대해 표준화된다. 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-8.
도 15. 천식의 비-인간 영장류 모델에서의 알레르겐 공격 15분 후까지 측정된 피크 기도 내성에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다, 그룹 당 n=4-8.
도 16. 천식의 비-인간 영장류 모델에서의 알레르겐 공격 24시간 후에 측정된 기도 내성에 대한 Ab652의 효과. 데이터는 알레르겐 노출 전에 측정된 기도 내성에 대해 표준화된다. 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-8.
실시예
1. 치료 항체 생성/선택
래트를 정제된 인간 IL-13(Peprotech) 또는 인간 IL-13을 발현하는 래트 섬유모세포(배양 상층액 중에 약 1 ㎍/㎖를 발현함), 또는 일부 경우에 상기 둘의 조합물로 면역화시켰다. 3 내지 6회의 주사 후, 동물을 희생시키고, PBMC, 비장, 골수 및 림프절을 수거하였다. 혈청을 ELISA에서 인간 IL-13으로의 결합, 및 HEK-293 STAT-6 리포터 세포 검정(HEK-Blue assay, Invivogen)에서 hIL-13을 중화시키는 능력에 대해 모니터하였다.
SLAM 배양물(B 세포 배양물)을 문헌[Zubler et al. (J. Immunol. 1985)]에 기재된 것과 유사한 방법으로 제조하였다. 간단히, 면역화된 동물로부터의 500 내지 5000개의 비장세포 또는 PBMC를 37℃ 및 5% CO2의 대기에서 7일 동안 10% FCS(PAA laboratories ltd), 2% HEPES(Sigma Aldrich), 1% L-글루타민(Gibco BRL), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco BRL), 0.1% β-머캅토에탄올(Gibco BRL), 3% 활성화 토끼 비장세포 배양 상층액 및 감마-방사선 조사된 EL-4-B5 뮤린 가슴샘종 세포(5×10^4/웰)가 보충된 200 ㎕/웰의 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)를 갖는 100개의 96-웰 플레이트의 배치(batch)에서 배양하였다. B 세포 배양 상층액을 스크리닝 검정에서 시험하였고, 양성 상층액을 마스터플레이트에 통합시켰다. 배양된 B 세포를 FCS 중의 100 ㎕ 10% DMSO 중에서 -80℃에서 동결시켰다.
SLAM 배양 상층액을 먼저 FMAT에서 비드 기반 검정으로 hIL-13으로 결합하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 이는 스트렙타비딘 비드에 코팅된 비오티닐화된 인간 IL-13 및 염소 항-래트 Fc-Cy5 컨쥬게이트를 이용하는 동질 검정이었다. 이후, 이러한 검정으로부터의 양성을 HEK-293 IL-13R-STAT-6 리포터 세포 검정(HEK-Blue assay, Invivogen)으로 공급하여 중화제(neutraliser)를 확인하였다. 이후, 중화 상층액을 Biacore에서 프로파일링하여 오프-레이트(off-rate)를 측정하고, 또한 중화 작용 방식을 특성규명하였다. 중화를 bin 1 또는 bin 2로 분류하였다. bin 1은 인간 IL-13에 결합하고, IL-13Rα1의 결합을 방지하여, 결과로서 또한 IL-4R을 결합으로부터 차단하는 항체이다. bin 2는 IL-13Rα1으로의 결합을 허용하나, 복합체로의 IL-4R의 보충은 방지하는 방식으로 hIL-13에 결합하는 항체이다. 본 발명자는 bin 1을 통해 작용하는 항체를 선택하였다.
전체 27 x 100-플레이트의 SLAM 실험으로부터의 일차 FMAT 스크린에서 약 7500개의 IL-13 특이적 양성을 확인하였다. 800개의 웰이 HEK-블루 검정에서 중화를 나타내었다. 170개의 웰이 요망되는 Biacore 프로파일, 즉, 5x 10-4 s-1 미만의 오프-레이트를 갖는 bin 1 항체를 가졌다. 이러한 170개의 웰로부터 가변 영역 클로닝을 시도하였고, 160개가 성공적으로 형광 유전자좌를 발생시켰다. 100개의 웰이 역전사 (RT)-PCR 후에 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 쌍을 발생시켰다. 이러한 V-영역 유전자를 마우스 IgG1 전장 항체로 클로닝시켰고, HEK-293 일시적 발현 시스템에서 재발현시켰다. 서열 분석은 항-인간 IL-13 항체의 27개의 독특한 패밀리가 존재한 것을 나타내었다. 이후, 이러한 재조합 항체를 세포 기반 검정에서 재조합 hIL-13(E. 콜리(E.coli) 유래 및 포유동물 유래), 재조합 변이체 hIL-13(R130Q)(E. 콜리 유래), 천연 야생형 및 변이체 hIL-13(인간 공여체 유래) 및 시노몰구스(cynomolgus) IL-13(포유동물 유래)을 차단하는 능력에 대해 다시 시험하였다. 재조합 항체를 또한 Biacore에서 변이체 인간 IL-13(R130Q) 및 시노몰구스 IL-13에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 이러한 특성규명 후, 5개의 항체 패밀리가 본 발명자의 기준, 즉 효능에 있어서의 최소 감소(drop-off) 및 모든 인간 및 시노몰구스 IL-13 제조물에 대해 친화성을 갖는 100 pM 이하의 항체를 충촉하였다.
모든 5개의 패밀리의 인간화를 수행하였다. 인간화된 이식물에서의 중화 효능, 친화성 및 공여체 함량에 기초하여, 인간화된 CA154_652(하기 참조)를 추가 진행을 위해 선택하였다.
1.1 인간화
래트 항체 V-영역으로부터의 CDR(서열 목록 번호:7 및 15)(서열 1 내지 6으로 본원에 기재된 CDR)을 인간 점라인 항체 V-영역 프레임워크로 이식하여 본원에 예시된 인간화된 항체(Ab652)를 제조하였다. 래트 항체(공여체) V-영역 서열과 인간 점라인 항체(수용체) V-영역 서열의 정렬이, 지정된 인간화 서열과 함께 도 12에 제시되어 있다. 공여체로부터 수용체 서열로 이식된 CDR은, 조합된 초티아/케이뱃 규정(Adair et al. (1991) Humanised antibodies WO 91/09967호 참조)이 사용된 CDR-H1을 제외하고는 케이뱃에 의해 규정된 바와 같다(Kabat et al. Sequence of proteins of immunological interest (1987). Bethesda MD, National Institutes of Health, US). 인간 V-영역 VH2 3-12-26 + JH4 J-영역(V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)을 중쇄 CDR에 대한 수용체로 선택하였다. 중쇄 프레임워크 잔기는, 공여체 잔기 글리신(G49) 및 아르기닌(R71)이 각각 보존된 잔기 49 및 71(케이뱃 넘버링)을 제외하고는 모두 인간 점라인 유전자로부터 유래된다. 이러한 두개의 공여체 잔기의 보존은 인간화된 항체의 완전한 활성에 필수적이었다. 인간 V-영역 VK1 2-1-(1) 02 + JK4 J-영역(V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)을 경쇄 CDR에 대한 수용체로 선택하였다. 경쇄 프레임워크 잔기는 모두 인간 점라인 유전자로부터 유래된다.
최초 V-영역 서열을 엔코딩하는 유전자를 설계하였고, Entelechon GmbH사의 의한 자동화 합성 방법에 의해 작제하였다. 올리고누클레오티드 특이적 돌연변이유발에 의해 VH 유전자를 변형시킴으로써 중쇄의 다수의 상이한 변이체를 생성시켰다. gL1 유전자 서열을 인간 카파 사슬 불변 영역(Km3 동종이형)을 엔코딩하는 DNA를 함유하는 UCB-Celltech 인간 경쇄 발현 벡터 pKH10.1로 클로닝시켰다 - 서열 목록 번호:26 및 서열 목록 번호:30 참조. 8개의 이식된 VH 유전자(gH1 내지 gH8)를 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 엔코딩하는 DNA와 함께 힌지 안정화 돌연변이 S241P를 함유하는 UCB-Celltech 인간 감마-4 중쇄 발현 벡터 pVhγ4P FL로 클로닝시켰다(Angal et al, Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8). gH2 VH 유전자를 효능 및 생물리학적 특성(하기 본원에 기재됨)에 대한 최적 중쇄 이식물로 선택하였고, 이를 이후 인간 감마-1 CH1 도메인(G1m17 동종이형)을 엔코딩하는 DNA(서열 목록 번호:38)를 함유하는 UCB-Celltech 인간 감마-1 Fab 벡터 pVhγ1F3에 서브클로닝시켰다. 생성된 중쇄 플라스미드와 경쇄 플라스미드의 CHO-L761h 세포로의 공동 트랜스펙션은 필요한 Fab 포맷의 인간화된 항체의 발현을 발생시켰다. 이러한 항체는 본원에서 Ab652로 언급(Ab652 Fab로도 언급됨)된다.
항체 Ab652를 발현하는 안정적인 세포주의 발생을 촉진시키기 위해, 중쇄 및 경쇄 발현 카세트를 엔코딩하는 DNA 및 글루타민 신세타제(synthetase)(GS) 선택 마커를 함유하는 단일 플라스미드를 생성시켰다. GS 유전자는 GS 억제제 메티오닌 설폭시민이 보충된 배지에서의 성장을 가능케 함으로써 재조합 CHO 세포의 선택을 가능케 한다(Bebbington et al., Biotechnol. 1992, 10(2): 169-175).
1.2 결합 친화성 측정
BIAcore 기술은 표지 필요 없이 실시간으로 생체분자 사이의 결합을 모니터한다. 리간드로 언급되는 상호작용물 중 하나가 고정된 표면에 직접 고정되거나 포획되고, 분석물로 언급되는 나머지 하나가 포획된 표면 상에 액체로 유동한다. 분석물이 리간드에 결합하여 표면 상에 복합체를 형성함에 따라 센서가 센서 표면 상의 질량의 변화를 검출한다. 이는 회합 과정에 해당한다. 분석물이 완충액에 의해 대체되는 경우에 리간드로부터 분석물의 분리가 모니터된다. 친화성 BIAcore 검정에서, 리간드는 Ab652이고, 분석물은 인간 IL-13이다.
1.3 수용체 교차 차단 검정
Biacore 수용체 교차 차단 검정은 항 IL-13 Fab의 포획을 필요로 하며, 이후 IL-13(첫번째 분석물)이 포획된 리간드 상에 유동하여 센서 표면에 안정적인 복합체가 형성된다. 두번째 분석물(제조합 가용성 IL-13 수용체)가 이후 상기 안정적인 복합체 상에 유동된다. 안정적인 복합체로의 두번째 분석물의 결합의 양이 모니터된다. 두번째 분석물이 안정적인 항체:IL-13 복합체로 결합하는 것을 허용치 않는 항 IL-13 항체는 부위 1 경쟁자로 분류된다. 두번째 분석물이 안정적인 항체:IL-13 복합체로 결합하는 것을 허용하는 항 IL-13 항체는 부위 2 경쟁자로 분류된다.
재료
기계
Biacore ® 3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden
센서 칩
CM5(연구 등급) 카탈로그 번호: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Sweden.
칩을 4℃에 저장하였다.
아민 커플링 키트
카탈로그 번호: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Sweden.
에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC). 증류수에서 75 ㎎/㎖로 제조하고, -70℃에서 200 ㎕ 분취량으로 저장하였다.
N-히드록시숙신이미드(NHS). 증류수에서 11.5 ㎎/㎖로 제조하고, -70℃에서 200 ㎕ 분취량으로 저장하였다.
1M 에탄올아민 히드로클로라이드-NaOH pH 8.5. -70℃에서 200 ㎕ 분취량으로 저장하였다.
완충액
런닝(running) 완충액: HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20). 카탈로그 번호: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Sweden. 완충액을 4℃에서 저장하였다.
고정 완충액: 아세테이트 5.0(10mM 아세트산나트륨 pH 5.0). 카탈로그 번호: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Sweden. 완충액을 4℃에서 저장하였다.
리간드 포획
Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특정물(specific). Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, USA) 카탈로그 번호: 109-006-097. 시약을 4℃에서 저장하였다.
리간드
Ab652(2.51, 21.7 및 3.86 ㎎/㎖ Fab), 4℃에서 저장하였다.
항-hIL-13 mIgG(R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. 카탈로그 번호 MAB-213, Lot number RL04).
분석물
재조합 인간 IL-13(0.2 ㎎/㎖, D. Lightwood; R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. 카탈로그 번호 213-IL-050), -70℃에서 저장하고, 각 검정에 대해 1회 해동하였다.
재조합 인간 IL-13 수용체 1 hFc(R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. 카탈로그 번호 146-IL-100). -70℃에서 저장하고, 각 검정에 대해 1회 해동하였다.
재조합 인간 IL-13 수용체 2 hFc(R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. 카탈로그 번호 614-IL-100). -70℃에서 저장하고, 각 검정에 대해 1회 해동하였다.
재생 용액
11.6M 스톡 용액(BDH, Poole, England. 카탈로그 번호: 101254H)으로부터 증류수를 이용한 희석에 의해 40 mM HCl을 제조하였다.
50 mM 스톡 용액으로부터 증류수를 이용한 희석에 의해 5 mM NaOH를 제조하였다. 카탈로그 번호: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Sweden.
중요 장비
Biacore 3000 바이오센서, GE Healthcare Ltd, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA. 본 기계는 제조업체의 프로토콜에 따라 유지된다.
1.4 Ab652 결합 친화성 측정
검정 포맷은 고정된 항-인간 F(ab')2에 의한 Ab652의 포획, 및 이후 포획된 표면 상에서의 인간 hIL-13의 적정이었다. BIAcore 3000(BIAcore AB)을 이용하여 BIA(생체분자 상호작용 분석)을 수행하였다. Affinipure F(ab')2 단편, 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특정물(specific)(Jackson ImmunoResearch)을 아민 커플링 화학을 통해
Figure pct00001
4000 반응 단위(response units, RUs)의 포획 수준으로 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 상기 절차로부터 F(ab')2 단편을 생략하여 유사한 방식으로 블랭크 표면을 제조하였다. 10 ㎕/분의 유속과 함께 런닝 완충액으로 HBS-EP 완충액(10mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, BIAcore AB)을 사용하였다. 충분한 IL-13 결합이 가능하나, 또한 대량 수송시 제한된 결합 효과를 최소화하는 것을 가능케 하기 위해, 고정된 항-인간 IgG-F(ab')2에 의한 포획에 대해 ~0.2 ㎍/㎖의 Ab652 Fab의 10 ㎕ 주입을 이용하였다. 인간 IL-13을 30 ㎕/분의 유속에서 다양한 농도(10nM 내지 0.31nM)로 포획된 Ab652 상에서 적정하였다. 10 ㎕/분의 유속에서의 40 mM HCl의 10 ㎕ 주입, 및 이후 5 mM NaOH의 5 ㎕ 주입에 의해 표면을 재생시켰다.
표준 절차에 따라 BIAevaluation 소프트웨어(버전 3.2)를 이용하여 백그라운드 공제 결합 곡선을 분석하였다. 적당한 알고리즘으로부터 동역학 파라미터를 결정하였다.
표 1
Figure pct00002
1.5 IL -13 수용체 교차 차단 연구
BIAcore 수용체 교차 차단 검정은 항 IL-13 Fab의 포획, 및 이후 센서 표면 상에 안정적인 복합체를 형성하는 포획 리간드 상에서 유동되는 IL-13(첫번째 분석물)을 필요로 한다. 두번째 분석물(재조합 가용성 IL-13 수용체)이 이후 상기 안정적인 복합체 상에서 유동된다. 안정적인 복합체로의 두번째 분석물의 결합의 양이 이후에 모니터된다. 두번째 분석물이 안정적인 항체:IL-13 복합체로 결합하는 것을 허용치 않는 항 IL-13 항체는 축(Axis) 1 경쟁자로 분류된다. 두번째 분석물이 안정적인 항체:IL-13 복합체로 결합하는 것을 허용하는 항 IL-13 항체는 축 2 경쟁자로 분류된다.
모든 실험을 25℃에서 Biacore 3000 바이오센서를 이용하여 수행하였다. HBS-EP 완충액을 10 ㎕/분(분)의 유속과 함께 런닝 완충액으로 사용하였다. 동일 센서 표면을 친화성 결정에서 기재된 바와 같이 사용하였다.
염소 F(ab')2 IgG, 항-인간 F(ab')2-단편 특이적 센서 표면에 의한 포획에 대해 ~0.2 ㎍/㎖의 항 인간 IL-13 Fab의 10 ㎕ 주입을 이용하였다. 0.2 ㎍/㎖의 항 인간 IL-13 Fab는 충분한 항-인간 IL-13 결합을 발생시켰다. 25 nM의 인간 IL-13을 포획된 항체 상에 주입한 후, 즉시 100 nM의 가용성 인간 IL-13 수용체를 10 ㎕/분의 유속으로 100 nM로 주입하였다. 40 mM HCl의 2회의 30 ㎕ 주입 후, 30㎕/분의 유속으로 5 mM NaOH의 5 ㎕ 주입에 의해 표면을 재생시켰다.
표준 절차에 따라 제조업체에 의해 제공된 BIAevaluation 소프트웨어(버전 3.2)를 이용하여 백그라운드 공제 결합 곡선을 분석하였다.
표 2: Biacore 차단 개요
Figure pct00003
IL-13은 두 수용체(IL-13Rα1 및 IL-13Rα2) 중 하나와 상호작용하여 복합체를 형성한다. hIL-13/hIL-13α1 복합체만 신호를 발생시킨다. 따라서, IL-13 의존성 신호전달을 억제하는 항-IL-13 항체는 hIL-13α1과의 상호작용을 차단함으로써 상기 효과를 매개할 수 있다. 인간 IL-13에서의 Ab652의 상호작용 부위가 BIAcore 검정에서 결정되어야 했다. Ab652가 고정된 항-인간 F(ab')2 표면에 의해 포획되었고, 이후 차례로 hIL-13이 Ab652에 의해 포획되었다. 포획된 IL-13/항체 복합체로의 가용성 IL-13Rα1의 결합을 평가하였다. hIL-13Rα1 대신 hIL-13Rα2로 상기 검정을 반복하였다. Ab652에 의해 제시된 IL-13은 IL-13 수용체 중 어디에도 결합할 수 없었으나, 시판되는 대조군 항-IL-13 항체(mAb 213)는 가용성 IL-13 수용체에 IL-13을 제시할 수 있었다. 결론적으로, Ab652는 둘 모두의 hIL-13 수용체 서브유닛으로의 IL-13 결합을 억제하며, 이를 축 1 경쟁자로 규정하였다.
표 3: hIL -13에 대한 정제된 Ab652 Fab 의 친화성
Figure pct00004
hIL-13에 대한 Ab652의 친화성을 3개의 별개의 검정으로 Biacore 검정으로 결정하였다. 친화성은 9-24pM 범위였고, 평균 13.4(+4.8)pM이었다.
1.6 세포 기반 효능
IL-13을 중화시키는 Ab652 Fab의 시험관내 효능을 HEK-BLUE™ STAT-6 검정(Invivogen)을 이용하여 연구하였다. 이러한 검정은 인간 STAT-6을 안정적으로 발현하고, 4개의 STAT-6 결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 조절하에서 분비성 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 포함한다. Ab652의 중화 효능(IC50)을 다양한 유형의 인간 IL-13을 이용하여 평가하였으며, 상기 다양한 유형의 인간 IL-13은 이러한 검정에서 250 pg/㎖로 사용되었다. 박테리아(E. 콜리) 및 포유동물(래트 섬유모세포) 숙주 세포로부터 생성된 재조합 야생형 인간 IL-13에 대해 중화 효능을 평가하였다. 천연 야생형 IL-13 및 인간 T-림프구로부터 생성된 변이체 R130Q 인간 IL-13, 및 포유동물 세포로부터 생성된 재조합 시노몰구스 원숭이 IL-13에 대해 중화 효능을 평가하였다. R130Q hIL-13은 정제하지 않았고, 농도는 hIL-13 ELISA로 결정하였다. 시노몰구스 IL-13은 정제하지 않았고, 검정에서 250 pg/㎖의 hIL-13와 동등한 반응을 발생시키는 농도로 사용하였다. 또한, CA154_652.g2 Fab의 중화 효능을 PARI eFLOW® 메시(mesh) 분무기를 이용한 분무 후에 측정하였다. 표 4: HEK Blue 검정에서의 IL-13의 다수의 형태에 대한 Ab652 Fab의 IC50 값. 기능적 친화성 결정을 위해, 고정된 농도의 Ab652의 존재하에서 IL-13 적정을 수행하였다. 쉴드-플롯(Schild-plot) 분석을 데이터에 적용시켜 재조합 인간 야생형 IL-13 및 재조합 시노몰구스 원숭이 IL-13의 중화에 대한 KD 값을 결정하였다. 표 5: HEK Blue 검정에서의 IL-13의 다수의 형태에 대한 Ab652 Fab의 IC50 및 KD 값.
표 4
Figure pct00005
표 5
Figure pct00006
전체적으로, 이러한 데이터는 Ab652 Fab가 박테리아 및 포유동물 공급원으로부터 생성된 재조합 및 천연 인간 IL-13을 중화시키는데 있어서 유사하게 효능이 있음을 나타낸다. 이러한 검정에서 시노몰구스 IL-13에 대한 CA154_652.g2의 효능은 래트 섬유모세포로부터 또한 생성된 인간 IL-13에 대해서 보다 3배 이내로 낮다. CA154_652.g2의 효능은 PARI eFLOW® 분무기를 이용한 분무 후에 변경되지 않는다.
1.7 Ab652 의 물리적 특성
상기 기재된 바와 같이, 8개의 상이한 항체 이식된 가변 영역을 선택된 래트 항체로부터의 CDR을 이용하여 생성시켰다(서열 목록 번호:1-6, 도 1). 상기 8개의 이식물로부터의 Ab652(gL1gH2)의 선택은 상기 기재된 바와 같이 효능 및 생물리학적 특징을 기초로 하였다.
시험된 모든 이식된 가변 영역에 대해 생성된 데이터를 기초로 하여, 항체 652를 하기와 같은 이유로 선택하였다:
● hIL-13 및 변이체 IL-13에 대해 가장 높은 친화성을 유지함
● 가장 높은 융해 온도, Tm(보다 높은 안정성의 지표)을 가짐
● 가장 큰 pH 안정성(원편광이색성(Circular Dichroism)에 의함), 즉, 낮은 pH에서 교란이 거의 없음을 나타냄
● 진탕시 또는 분무시에 응집이 없음
대조적으로, 시험된 다른 이식물 중 일부는 결합 친화성의 감소, 불량한 pH 안정성 및 진탕 및/또는 분무시의 응집을 나타내었다.
1.7.1 분무의 영향
Ab652가 분무에 적합한 지 결정하기 위해, PARI eFLOW® 분무기를 사용하였다. 50 mM 아세트산나트륨/125mM 염화나트륨, pH5 중 Ab652 용액의 2.5 ㎖의 부피를 주위 온도(약 21℃)에서 분무시키고, 냉각 수집 튜브에서 분무물질을 응축시켜 수거하였다. 이후의 분석은 명백한 분해가 없음을 나타내었다. PBS, pH 7 중의 용액을 이용하여 상기 연구를 또한 반복하였다. IgG4의 양성 대조군을 포함시켰고, 이는 분무 동안에 응집되는 것으로 밝혀졌다. 특히 응집된 물질이 존재하는지 검출하기 위해 크기 배제, SDS-PAGE, 동적 광 산란 및 리간드 결합에 의해 분무된 샘플의 분석을 수행하였다. 상기 기술 중 어느 기술에서도 명백한 변화가 없었으며, 이는 Ab652가 분무 동안 손상에 대해 내성이 있음을 나타낸다.
1.7.2 Ab652 의 물리적 특성의 요약
pI(등전점) 8 (2회 결정의 평균)
열 안정성 Tm 84℃
항체가 교반/진탕 또는 분무에 적용되는 경우에 Ab652의 응집이 관찰되지 않았다.
2. 천식의 비-인간 영장류 모델에서의 Ab652 의 효과
목표
본 연구의 목표는 천식의 비-인간 영장류 모델에서의 Ab652의 효능을 평가하는 것이다. 일차 종점은 기관지 폐포 세척(BAL) 세포 수, 케모카인 수준, 및 폐 내성(RL)에 의해 평가시 초기 및 후기 폐 기능 변화에 대한 효과를 포함하였다.
방법
Ab652를 메시 분무기를 이용하여 전달하였다. 연구 시설에서 사용되는 통상적인 환기기 파라미터 및 관류 구성을 이용하여 호흡 모의 연구를 수행하였다. 호흡 모의 연구 결과는 분무기에서의 물질 충전 중 40.4%가 기관내관 수준으로 전달되는 것을 나타내었다.
과거 폐 기능 값 및 BAL 호산구 수를 기초로 하여 연구 동물을 선택하였다. 스크리닝 기간에서, 동물의 아스카리스 수움(Ascaris suum, A. suum)에 대한 일반적인(미처리) 반응을 특성규명하기 위해 처리 그룹에 대한 지정 전에 동물을 아스카리스 수움 항원 공격하였다. 이러한 스크리닝 기간 후, 동물을 BAL 세포 수 및 스크리닝 기간으로부터의 폐 기능 데이터를 기초로 하여 용량 그룹으로 지정하였다. 처리 기간에서, 동물에 0.1, 1, 10 및 60 ㎎/동물/일의 분무기 내 용량 수준의 분무 비히클(PBS) 또는 분무 Ab652를 투여하였다. -2, -1, 1, 2 및 3일에 분무기를 통해 용량을 투여하였다. 1 및 2일에, A. 수움 공격 약 30분 전에 처리 투여가 발생하였다.
공격 절차는 둘 모두의 기간에 대해 동일하였다. 각각의 동물을 1 및 2일에 공격하였고, 각각의 항원 공격 후 15분 이상, 및 각각의 알레르겐 공격 24시간 후에 폐 기능 값(RL)을 기록하였다. 폐 염증의 정도를 평가하기 위해 전체 세포 수, 형태 및 차별적 수의 평가를 위해 첫번째 공격 전, 및 두번째 공격 약 24시간 후에 BAL 유체를 수거하였다. BAL 상층액의 샘플을 수거하고, 케모카인 농도의 결정을 위해 분석하였다.
결과
분무 Ab652는 낮은 ㎎/일일 용량에서 BAL 에오탁신-3의 증가를 현저히 억제하였다(도 13). 분무 Ab652는 스크리닝 기간과 처리 기간 사이에 측정된 BAL 호산구에서 용량 의존적 증가 억제를 야기하였다(도 14). 분무 Ab652는 처리 기간에서 아스카리스 공격 후 15분 까지 측정된 2일째의 피크 초기 단계 반응을 현저히 용량 의존적으로 억제하였다(도 15). 분무 Ab652는 2일째의 알레르겐 공격 24시간 후에 측정된 후기 단계 반응을 현저히 용량 의존적으로 억제하였다(도 16).
결론
시노몰구스 원숭이에서 천식의 아스카리스 모델에서 분무 Ab652로 생성된 데이터는 IL-13 유도성 알레르기 폐 염증이 기도에 에어로졸로 직접 전달된 항-IL-13 Fab 단편을 중화시킴으로써 약리학적 조절에 민감한 것을 나타낸다. Ab652는 현저히 효능이 있었고, 이는 낮은 ㎎/일일 용량에서 효능을 나타낸다.
본 발명은 단지 예시로서 기재되며, 이로 제한하고자 함이 아니며, 하기 청구의 범위 내에서 세부의 변형이 이루어질 수 있음이 물론 이해될 것이다. 본 발명의 각각의 구체예의 바람직한 특징은 다른 구체예 각각에 대해서도 준용된다. 본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 간행물은, 각각의 개별적 간행물이 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 포함되는 것이 확실히 개별적으로 지정된 것과 마찬가지로 참조로서 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma S.A. Gozzard, Neil Lawson, Alastair Lightwood, Daniel Palframan, Roger Smith, Bryan Tyson, Kerry <120> Antibody molecules having specificity for human IL-13 <130> G0086-WO01 <150> GB 0904214.4 <151> 2009-03-11 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 <400> 1 Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr His Val Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 <400> 2 Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser Val Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 <400> 3 Asp Gly Thr Ile Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 <400> 4 Leu Ala Ser Glu Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 <400> 5 His Thr Ser Arg Leu Gln Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 <400> 6 Gln Gln Gly Tyr Arg Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> 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tgtggaggtg attgcaagcc ttgtatatgt acaggctcag aagtatcatc tgtcttcatc 780 ttccccccaa agcccaaaga tgtgctcacc atcactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840 gtggtagaca ttagccagga cgatcccgag gtccatttca gctggtttgt agatgacgtg 900 gaagtccaca cagctcagac tcgaccacca gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960 gtcagtgaac tccccatcct gcaccaggac tggctcaatg gcaggacgtt cagatgcaag 1020 gtcaccagtg cagctttccc atcccccatc gagaaaacca tctccaaacc cgaaggcaga 1080 acacaagttc cgcatgtata caccatgtca cctaccaagg aagagatgac ccagaatgaa 1140 gtcagtatca cctgcatggt aaaaggcttc tatcccccag acatttatgt ggagtggcag 1200 atgaacgggc agccacagga aaactacaag aacactccac ctacgatgga cacagatggg 1260 agttacttcc tctacagcaa gctcaatgtg aagaaggaaa aatggcagca gggaaacacg 1320 ttcacgtgtt ctgtgctgca tgaaggcctg cacaaccacc atactgagaa gagtctctcc 1380 cactctccgg gtaaa 1395 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 VL <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Arg Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ab652 VL <400> 24 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc tggctagcga ggacatctcc aactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggtaaagcgc cgaaactgct gatctatcac acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct 180 cgtttctctg gttccggttc tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca 240 gaagacttcg cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac cttcggtggt 300 ggtaccaaag ttgaaatcaa a 321 <210> 25 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 VL with signal sequence <400> 25 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala 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ttccgctgac cttcggtggt 360 ggtaccaaag ttgaaatcaa a 381 <210> 27 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 light chain (variable and constant) <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Arg Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu 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gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 29 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 light chain (variable and constant) with signal sequence <400> 29 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Asp 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr 100 105 110 Arg Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 30 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ab652 light chain (variable and constant) with signal sequence <400> 30 atgtctgtcc ccacccaagt cctcggactc ctgctactct ggcttacaga tgccagatgc 60 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 120 attacctgtc tggctagcga ggacatctcc aactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg 180 ggtaaagcgc cgaaactgct gatctatcac acttcccgtc tgcaggacgg tgttccgtct 240 cgtttctctg gttccggttc tggtacggac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagcca 300 gaagacttcg cgacttacta ctgccagcag ggttaccgtt ttccgctgac cttcggtggt 360 ggtaccaaag ttgaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 702 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 VH <400> 31 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 His Val Gln Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Thr Ile Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 32 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ab652 VH <400> 32 caggtgaccc tgaaagaatc tggtccggtt ctggtgaaac caacggaaac cctgactctg 60 acgtgcaccg tttctggttt ctctctgacc aactaccacg ttcagtggat tcgtcagccg 120 ccgggtaaag cgctggaatg gctgggtgtt atgtggagcg acggtgacac cagcttcaac 180 tctgtgctga aatctcgcct gaccatctcc cgtgatactt ccaaatccca ggttgtgctg 240 accatgacga acatggaccc ggtagatact gcaacctact actgtgcacg tgatggcact 300 atcgcggcta tggattactt cgactattgg ggtcagggta ccctggttac cgtctcg 357 <210> 33 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 VH with signal sequence <400> 33 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Asn Tyr His Val Gln Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser 65 70 75 80 Val Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr Ile Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135 <210> 34 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ab 652 VH with signal sequence <400> 34 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggagt ccattctcag 60 gtgaccctga aagaatctgg tccggttctg gtgaaaccaa cggaaaccct gactctgacg 120 tgcaccgttt ctggtttctc tctgaccaac taccacgttc agtggattcg tcagccgccg 180 ggtaaagcgc tggaatggct gggtgttatg tggagcgacg gtgacaccag cttcaactct 240 gtgctgaaat ctcgcctgac catctcccgt gatacttcca aatcccaggt tgtgctgacc 300 atgacgaaca tggacccggt agatactgca acctactact gtgcacgtga tggcactatc 360 gcggctatgg attacttcga ctattggggt cagggtaccc tggttaccgt ctcg 414 <210> 35 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 heavy chain (variable and constant) <400> 35 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 His Val Gln Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Thr Ile Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 36 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ab652 heavy chain (variable and constant) <400> 36 caggtgaccc tgaaagaatc tggtccggtt ctggtgaaac caacggaaac cctgactctg 60 acgtgcaccg tttctggttt ctctctgacc aactaccacg ttcagtggat tcgtcagccg 120 ccgggtaaag cgctggaatg gctgggtgtt atgtggagcg acggtgacac cagcttcaac 180 tctgtgctga aatctcgcct gaccatctcc cgtgatactt ccaaatccca ggttgtgctg 240 accatgacga acatggaccc ggtagatact gcaacctact actgtgcacg tgatggcact 300 atcgcggcta tggattactt cgactattgg ggtcagggta ccctggttac cgtctcgagc 360 gcttctacaa agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgt 669 <210> 37 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ab652 heavy chain (variable and constant) with signal sequence <400> 37 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys 20 25 30 Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Asn Tyr His Val Gln Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Met Trp Ser Asp Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser 65 70 75 80 Val Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr Ile Ala Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys <210> 38 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ab652 heavy chain (variable and constant) with signal sequence <400> 38 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggagt ccattctcag 60 gtgaccctga aagaatctgg tccggttctg gtgaaaccaa cggaaaccct gactctgacg 120 tgcaccgttt ctggtttctc tctgaccaac taccacgttc agtggattcg tcagccgccg 180 ggtaaagcgc tggaatggct gggtgttatg tggagcgacg gtgacaccag cttcaactct 240 gtgctgaaat ctcgcctgac catctcccgt gatacttcca aatcccaggt tgtgctgacc 300 atgacgaaca tggacccggt agatactgca acctactact gtgcacgtga tggcactatc 360 gcggctatgg attacttcga ctattggggt cagggtaccc tggttaccgt ctcgagcgct 420 tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgt 726 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human VK1 2-1-(1) 02 JK4 acceptor framework <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Human VK1 2-1-(1) O2 JK4 acceptor framework <400> 40 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 41 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human VH2 3-1 2-26 JH4 acceptor framework <400> 41 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala 20 25 30 Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser <210> 42 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Human VH2 3-1 2-26 JH4 acceptor framework <400> 42 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aatgctagaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgaatga cgaaaaatcc 180 tacagcacat ctctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aagccaggtg 240 gtccttacca tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacggata 300 tactttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cc 342 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> JH4 <400> 43 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> JK4 <400> 44 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain signal peptide <400> 45 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain signal peptide <400> 46 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys 20

Claims (28)

  1. 중쇄를 포함하는 인간 IL-13에 결합하는 길항 항체로서, 상기 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 목록 번호:1에 제공된 서열을 갖는 CDR, CDR-H2에 대해 서열 목록 번호:2에 제공된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-H3에 대해 서열 목록 번호:3에 제공된 서열을 갖는 CDR 중 하나 이상을 포함하는 길항 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 목록 번호:1에 제공된 서열, CDR-H2에 대해 서열 목록 번호:2에 제공된 서열, 및 CDR-H3에 대해 서열 목록 번호:3에 제공된 서열을 포함하는 길항 항체.
  3. 경쇄를 포함하는 인간 IL-13에 결합하는 길항 항체로서, 상기 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 목록 번호:4에 제공된 서열을 갖는 CDR, CDR-L2에 대해 서열 목록 번호:5에 제공된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-L3에 대해 서열 목록 번호:6에 제공된 서열을 갖는 CDR 중 하나 이상을 포함하는 길항 항체.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 경쇄를 추가로 포함하는 길항 항체로서, 상기 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 목록 번호:4에 제공된 서열을 갖는 CDR, CDR-L2에 대해 서열 목록 번호:5에 제공된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-L3에 대해 서열 목록 번호:6에 제공된 서열을 갖는 CDR 중 하나 이상을 포함하는 길항 항체.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 목록 번호:4에 제공된 서열, CDR-L2에 대해 서열 목록 번호:5에 제공된 서열, 및 CDR-L3에 대해 서열 목록 번호:6에 제공된 서열을 포함하는 길항 항체.
  6. 인간 IL-13에 결합하는 길항 항체로서, 중쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, CDRH-1의 서열이 서열 목록 번호:1에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRH-2의 서열이 서열 목록 번호:2에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRH-3의 서열이 서열 목록 번호:3에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 길항 항체.
  7. 제 6항에 있어서, 경쇄를 추가로 포함하고, 상기 경쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, CDRL-1의 서열이 서열 목록 번호:4에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRL-2의 서열이 서열 목록 번호:5에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRL-3의 서열이 서열 목록 번호:6에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 길항 항체.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄가 서열 목록 번호:31에 제공된 서열을 포함하는 항체.
  9. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄가 서열 목록 번호:23에 제공된 서열을 포함하는 항체.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자가 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편, 예를 들어, Fab, 변형된 Fab', Fab', F(ab')2, Fv, VH, VL 또는 scFv 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 중화 항체 분자.
  11. 서열 목록 번호:31에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 목록 번호:23에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는, 인간 IL-13에 결합하는 길항 항체.
  12. 경쇄의 가변 도메인이 제 11항의 항체의 경쇄 가변 도메인과 80% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, 중쇄의 가변 도메인이 제 11항의 항체의 중쇄 가변 도메인과 80% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는, 인간 IL-13에 결합하는 길항 항체.
  13. 서열 목록 번호:35에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 목록 번호:27에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는, 인간 IL-13에 결합하는 길항 항체.
  14. 중쇄 및 경쇄가 제 13항의 항체의 상응하는 중쇄 및 경쇄와 80% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는, 인간 IL-13에 결합하는 중화 항체.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 중화 항체 분자로서, 이에 부착된 이펙터(effector) 또는 리포터 분자를 갖는 중화 항체 분자.
  16. 30 pM 이상의 분리된 인간 IL-13에 대한 결합 친화성을 갖는 길항 항체.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 엔코딩하는 분리된 DNA 서열.
  18. 제 17항에 따른 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 벡터가 서열 목록 번호:36 및 서열 목록 번호:28에 제공된 서열을 포함하는 벡터.
  20. 제 19항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제 20항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 분리시키는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 항체를 생성하는 방법.
  22. 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 조합된, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 다른 활성 성분을 추가로 포함하는 제 22항에 따른 약학적 조성물.
  24. IL-13에 의해 매개되거나, IL-13의 증가된 수준과 관련된 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제 22항 또는 제 23항에 따른 약학적 조성물.
  25. IL-13에 의해 매개되거나, IL-13의 증가된 수준과 관련된 병리학적 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  26. 흡입에 의해 유효량의 항-IL-13 항체 Fab 또는 Fab' 단편을 인간 피검체에 투여하는 것을 포함하여, IL-13에 의해 매개되는 병리학적 장애를 갖거나, 상기 병리학적 장애의 위험이 있는 인간 피검체를 치료하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 항체 Fab 또는 Fab' 단편이 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 항체인 방법.
  28. 제 24항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병리학적 장애가 천식 장애, 아토피 장애, 만성 폐쇄폐병(COPD), 기도 염증과 관련된 질환, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생성, 염증 질환, 자가면역 질환, 종양 또는 암, 바이러스 감염 및 보호 유형 1 면역 반응 발현 억제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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