KR20110035213A

KR20110035213A - 단일세포의 신호분석방법

Info

Publication number: KR20110035213A
Application number: KR1020090092836A
Authority: KR
Inventors: 박상현
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-04-06

Abstract

본 발명은 단일세포의 신호분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단일세포 신호분석용 형광 포유동물 세포(Jurkat)를 제조하는 단계; 및 상기 형광 포유동물 세포(Jurkat)의 단일 세포로부터 신호 반응으로 단일세포를 분석하는 단계를 포함하는, 단일세포의 신호분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 단일세포의 신호분석 방법을 이용하면 실시간 반응분석을 통하여 세포의 신호 조절 기작을 이해할 수 있다.

신호분석, 형광 단백질, 나노환경, 형광 포유동물 세포(Jurkat)

Description

단일세포의 신호분석방법{Cell Signaling Analysis Method of Single-Cell}

본 발명은 단일세포의 신호분석방법에 관한 것이다.

살아있는 단일세포의 분리, 포획, 분석 및 진단 기능이 모두 작은 칩 속에 집적된 휴대용 나노기반 플랫폼 기기가 개발되고, 질병에 대한 개체별 특이성은 DNA나 단백질 분석 수준에 더하여, 해당 개체의 (살아있는) 단일세포 및 세포군 앙상블에 대한 분석을 통해 직접적인 상관관계가 성립될 수 있으며, 이는 의료 현장에서 신속 정확한 개인 맞춤형 건강 상태의 진단이 가능하므로 이로 인해 인간의 수명을 연장하여 국민 보건 상태가 크게 향상됨을 기대 할 수 있다(M. C. Park, J.Y. Hur, K. W. Kwon, S.-H. Park and K. Y. Suh. Pumpless, selective docking of yeast cells inside a microfluidic channel induced by receding meniscus. Lab Chip (2006), 6:988-994).

생체 내의 세포는 끊임없이 외부환경으로부터 다양한 자극을 받는다. 변화 하는 환경 자극에 대해 정확하게 이를 감지하고 그에 대응하는 세포반응을 제어하는 것은 생명현상을 유지하는 데에 있어 가장 중요한 생체 기작이다. 이러한 자극의 감지 그리고 상응하는 생체반응의 제어는 단백질 상호작용 네트워크로 구성된 수많은 신호전달 경로를 통해 이루어진다. 생체 신호전달계의 특징은 그 다양성과 선택적 특이성이다. 특정 자극은 항상 그에 상응하는 특정 생체반응을 일으키며, 이러한 신호전달체계의 선택적 특이성은 수많은 단백질 상호작용의 유기적 연결에 의해 유지된다(도 1 참조)(S.-H. Park, A. Zarrinpar and W. A. Lim. Rewiring MAP kinase pathways using alternative scaffold assembly mechanisms. Science (2003), 299: 1061-1064 ; A. Zarrinpar, S.-H. Park and W. A. Lim. Optimization of specificity in a cellular protein interaction network by negative selection. Nature (2003), 426: 676-680). 따라서 신호전달의 오작동은 많은 경우 암 등의 질병 현상으로 나타나게 된다. 이러한 중요성에 비추어 세포 신호 전달 조절 기작의 이해는 매우 중요하나, 현재 이에 대한 이해는 부족한 현실이다.

대부분의 생물학 연구에 사용되는 세포군 대상 연구방법론의 경우 세포군내의 개별 세포가 균일한 세포반응을 일으킨다는 가정 하에 데이터의 분석이 이루어 진다. 하지만 실제로 개별세포가 균일한 반응을 일으키지 않을 경우, 평균 측정값에 기반을 둔 결과분석은 오류를 초래할 수 있다(도 3 참조). 이러한 오류는 세포군의 용혈처리 과정에서 각 세포의 세포질이 섞임으로써 개별세포의 차별성이 합산되는 현상에 기인한다. 실제 개별세포가 균일한 반응을 일으키는 지의 여부는 여러 기술적인 문제로 인해 실험적으로 증명된 경우가 지극히 미미하다.

이에, 본 발명자들은 나노바이오기술을 이용하여 세포군내 개별세포의 신호전달이 차별성을 가지는지를 단일세포 수준에서 통합적 규명하고자 노력하던 중, 나노기술, 세포 생물학 및 분자 생물학적 연구 기법을 이용하여 개별세포에서 신호 전달의 활성, signal adaption 등의 flux(도 2 참조)를 시간별로 관찰하고 신호 전달의 제어 및 조절 기작을 다각적으로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 microwell 구조물을 이용한 단일세포 분석을 통하여 MAP kinase 신호 전달계를 모델로 외부 자극에 의한 세포 신호전달 네트워크의 stochasticity를 제공하는 것이다.

본 발명은 ⅰ) 단일세포 신호분석용 형광 포유동물 세포(Jurkat)를 제조하는 단계; 및 ⅱ) 상기 형광 포유동물 세포(Jurkat)의 단일 세포로부터 신호 반응으로 단일세포를 분석하는 단계를 포함하는, 단일세포의 신호분석방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 단일세포의 신호분석방법에 있어서, 상기 형광 포유동물 세 포(Jurkat)의 제조단계 이후에 추가적으로, 상기 형광 포유동물 세포(Jurkat)를 이용한 세포포획을 위한 나노환경을 구축하는 단계; 및 상기 나노환경으로부터 단일 세포를 포획하는 단계;를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 나노환경의 구축은 마이크로 유체역학에 기반을 둔 microwell을 이용하는 것이 보다 바람직하며, 상기 microwell의 이용은 광식각(photolithography) 공정으로 제작된 음각의 실리콘 웨이퍼 마스터 위에 PDMS(polydimethyl siloxane) 고분자를 경화시켜 양각의 PDMS stamp를 제작하고, glass coverslip 위에 생체적합 UV 경화성 고분자를 코팅하고 양각의 PDMS stamp를 이 고분자와 접촉시킨 후 UV로 경화시켜 음각의 고분자 microwell 구조를 glass coverslip 위에 형성하는 것이 더더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 단일세포의 신호분석방법에 있어서, 상기 신호 반응의 단일 세포 분석은 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하는 것이 바람직하고, 상기 신호 반응의 단일세포 분석은 PMA를 처리하고, 형광 단백질의 밝기 정도를 측정하여 분석하는 것이 가장 바람직하다.

세포군으로부터 단일세포를 분리하고, 생체 내의 환경(in vivo environment)과 유사하게 설계된 표면에 단일 세포 수준으로 포획하며, 나아가 고립된 단일세포에 기계적 응력, 다양한 신호전달계를 자극할 수 있는 화학물질을 공급하여 단일 세포의 분비물, 모양변화, 형광 등을 제어, 측정할 수 있는 나노환경 시스템의 구축은 단일세포 연구를 통한 병리의 규명과 치료법 발굴에 필수적이다(도 4 참조).

본 발명은 포유동물 세포인 Jurkat의 세포증식 반응을 매개하는 ERK MAP kinase pathway를 모델로 하여 개별세포에서 신호 전달의 flux를 실시간으로 관찰하고 신호 전달의 제어 및 조절 기작을 다각적으로 규명한다.

MAP kinase 신호전달계는 효모로부터 인간에 이르기까지 대부분의 진핵 생명계에서 잘 보존되어 있다. 특히, ERK MAP kinase 신호 전달계는 세포의 성장, 분화, 증식에 깊이 관여하는 pathway로 엄격하게 조절되고 있다. 포유동물 세포인 Jurkat의 ERK MAP kinase 신호 전달계는 MAP kinase kinase kinase(MAPKKK)인 Raf, MAP kinase kinase(MAPKK)인 MEK, MAP kinase(MAPK)인 ERK로 구성되어 있다. 이들의 신호전달은 세포 표면의 수용체로부터 순차적으로 인산화가 일어나고, Raf, MEK, ERK 역시 순차적으로 인산화 되어, 인산화된 ERK가 하위의 전사인자들을 활성화시켜, 세포 표면의 신호가 핵까지 전달된다고 알려져 있다(도 5 참조).

본 발명자들은 신호전달 activator 단백질 및 report 형광 단백질을 발현하는 포유동물 세포(Jurkat), 특히 단일세포 신호분석용 형광 포유동물 세포(Jurkat)를 제조하였다. 구체적으로, activator 단백질 및 형광단백질과 항생제 내성 유전자(selection marker)를 코딩하는 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드를 포유동물 세포(Jurkat)의 염색체에 삽입하였다. 그 결과, 외부자극에 의해 세포내 신호전달이 개시되면 activator 단백질이 인산화 되고, 이 인산화된 activator 단백질이 reporter 형광 단백질의 전사를 활성화시켜, 형광 단백질이 발현된다. 발현된 형광은 형광 현미경을 이용하여 육안으로 관찰할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 신개념의 정밀한 나노환경을 구축하고 단일세포를 초미세유체망 기술을 이용해 나노환경 플랫폼 내부로 포획하여(도 7 및 도 8 참조), 여러 가지 신호전달에 의한 생체신호반응을 살아있는 단일세포를 대상으로 고속, 실시간 측정하였다. 상기 방법은 기존의 DEP, sedimentation, hydrodynamic focusing, optical tweezer 방법 등에 비하여 대면적에 높은 확률로 포획할 수 있고 세포에 가해지는 충격을 최소화(non-invasive) 할 수 있다. 아울러, 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하였다(도 9 참조).

본 발명자들은 대면적에 단일 세포를 포획할 수 있는 마이크로유체역학 플랫폼을 제조하고, 이를 통하여 90% 이상의 확률로 대면적에 세포를 포획하고 단일세포 수준으로 분석하였다. 먼저 세포에 포유 동물 세포 Jurkat의 세포 증식 반응을 매개하는 PMA를 처리한 후, 3시간 뒤에 상기의 PMA 처리된 세포를 마이크로 유체역학 플랫폼에 포획한 뒤 세포 반응을 10시간이 지난 다음 분석하였다(도 10 참조).

본 발명자들은 신개념의 정밀한 나노환경을 구축하고 단일세포를 초미세유체망 기술을 이용해 나노환경 플랫폼 내부로 포획하였다. 본 발명자들은 여러 가지 신호전달에 의한 생체신호반응을 살아있는 단일세포를 대상으로 고속, 실시간 측정하였다. 즉, 마이크로 채널에서 유체가 가지고 있는 표면 장력을 제어하여 세포를 단일 세포 수준으로 원하는 위치에 포획하였다(도 8 참조). 또한, 본 발명자들은 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 20분 간격으로 time-course 분석하 여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하였다(도 9 참조). 또한, 본 발명자들은 대면적에 단일 세포를 포획할 수 있는 마이크로유체역학 플랫폼을 제조하고, 이를 통하여 90% 이상의 확률로 대면적에 세포를 포획하고 단일세포 수준으로 분석하였다(도 10 참조).

본 발명의 단일세포의 실시간 반응분석을 통하여 신호 flux 기전, 역학을 이해할 수 있으며, 신호전달의 활성, 적응, stochasticity를 규명한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 신호전달 activator 단백질 및 report(형광) 단백질 발현 포유동물 세포(단일세포 신호분석용 형광 포유동물 세포)의 제조

본 발명자들은 신개념의 단일세포 분석을 통하여 포유동물 세포 Jurkat의 ERK MAP kinase pathway를 모델로 하여 생물학적 현상의 관찰시 필연적으로 수반되는 ensemble average problem을 규명하고 세포군내 개별세포의 신호전달이 차별성을 가지는지를 규명하였다.

이를 위하여, 본 발명자들은 먼저 포유동물 세포 Jurkat의 ERK MAP kinase pathway의 readout을 위해 activator 단백질 및 형광단백질을 코딩하는 각각의 플라스미드를 포유동물 세포 Jurkat의 염색체에 삽입하였다(도 6).

구체적으로, Gal4 UAS-TATA promoter-형광단백질과 puromycin 내성 유전자(selection marker)를 코딩하는 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pFR-Luc, pEGFP-N1, pCDNA3.1(+)-puro는 타인이 제조한 것을 받아 이용하였다.

벡터인 pFR-Luc를 제한효소인 Sac I 과 Pac I 으로 37℃에서 2시간 동안 자른다. EGFP 유전자는 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 pEGFP-N1 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호 1로 기재되는 sense 프라이머 5'-aaagagctcaattctgcagtcgacggtac-3'와 서열번호 2로 기재되는 antisense 프라이머 5'-tttttaattaattacttgtacagctcgtcca-3'로 PCR을 수행하여 증폭하였다. PCR 온도와 시간 조건은 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분이며 30번 사이클을 수행하였다. 이 PCR 산물을 제한효소인 Sac I 과 Pac I으로 37℃에서 2시간 동안 자르고, 이를 벡터와 ligase 효소를 이용 상온에서 15분 처리하여 pFR-EGFP 플라스미드를 제작하였다.

그 후, 상기의 pFR-EGFP 플라스미드를 주형으로 하고 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 서열번호 3으로 기재되는 sense primer 5'-aaaagatctttctaattgtggtttgtccaa-3'와 서열번호 4로 기재되는 antisense 프라이머 5'-aaagaattcttacttgtacagctcgtcca-3' 로 PCR를 수행하여 증폭하였다. PCR 온도와 시간 조건은 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분이며 30번 사이클을 수행하였다. 이 PCR 산물을 제한 효소인 Bgl Ⅱ와 EcoR I으로 37℃에서 2시간 동안 절단하였다. 벡터인 PCDNA3.1(+)-puro 역시 제한 효소인 Bgl Ⅱ와 EcoR I으로 37℃에서 2시간 동안 절단하였다. 상기의 절단된 벡터와 PCR 산물을 ligase 효소를 이용 25℃에서 15분 처리하여 PCDNA3.1(+)-Gal4 UAS-TATA promoter-EGFP-puro 플라스미드를 제작하였다.

pFA2-Elk1 플라스미드 10 ㎍을 electroporation을 통해 포유동물 세포 Jurkat에 주입하여 세포를 형질전환시켰다. Electroporation 조건은 1400 V, 30 ms, 1회이다. 안정적으로 형질전환된 세포를 선별하기 위해 G418이 600 ㎍/㎖의 농도로 처리된 배양액에서 약 2주간 배양하였다. 이때 살아남은 세포에 상기의 제작된 플라스미드 PCDNA3.1(+)-Gal4 UAS-TATA promoter-EGFP-puro 10 ㎍을 상기의 electroporation 조건으로 주입하여 형질전환시켰다. 안정적으로 형질전환된 세포를 선별하기 위해 G418이 600 ㎍/㎖, puromycin이 0.5 ㎍/㎖로 처리된 배양액에서 1주간 배양하였다. 이때 살아남은 세포에 PMA를 처리하고, 15시간 뒤 형광을 발하는 세포를 FACS를 이용하여 sorting하였다. Sorting된 세포를 96 well plate의 한 well에 0.5개의 세포가 들어가도록 희석하여 96 well plate에서 배양하였다. 약 2주 뒤, 96 well plate의 각 well에서 배양된 세포에 PMA를 처리하여 15시간 뒤, 형광을 발하는 세포를 선택하여 이 세포들을 계속 배양하였다.

<실시예 2> 세포포획을 위한 나노환경 구축

본 발명자들은 신개념의 정밀한 나노환경을 구축하고 단일세포를 초미세유체 망 기술을 이용해 나노환경 플랫폼 내부로 포획하였다.

구체적으로, 살아있는 세포를 단일세포 수준으로 포획하기 위해서는 세포의 크기에 맞는 마이크로웰 구조를 세포의 생존에 적합한 환경으로 제작하여야 한다. 이를 위하여, 먼저 나노 리터 용량을 가지는 마이크로웰 구조를 형성하기 위해서 모세관 성형(capillary molding) 공정을 이용하였다. 상기 공정에서는 먼저 광식각(photolithography) 공정으로 제작된 음각의 실리콘 웨이퍼마스터 위에 PDMS(polydimethyl siloxane) 고분자를 경화시켜 양각의 PDMS stamp를 제작하였다. 다음 glass coverslip 위에 생체적합 UV 경화성 고분자를 코팅하고 양각의 PDMS stamp를 이 고분자와 접촉시킨 후 UV로 경화시켜 음각의 고분자 마이크로웰 구조를lass coverslip 위에 형성하였다.

<실시예 3> 단일 세포 포획

본 발명자들은 여러 가지 신호전달에 의한 생체신호반응을 살아있는 단일세포를 대상으로 고속, 실시간 측정하고자 하였다. 구체적으로, 마이크로 채널에서 유체가 가지고 있는 표면 장력을 제어하여 세포를 단일 세포 수준으로 원하는 위치에 포획하였다. 도 8에 제시한 바와 같이, 90% 이상의 확률로 마이크로 우물 안에 세포가 포획이 되는 것을 알 수 있다. 상기 방법은 기존의 DEP, sedimentation, hydrodynamic focusing,optical tweezer 방법 등에 비하여 대면적에 높은 확률로 포획할 수 있고 세포에 가해지는 충격을 최소화(non-invasive) 할 수 있다.

<실시예 4> 신호 반응의 단일세포 분석

본 발명자들은 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 20분 간격으로time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하였다. 구체적으로, 세포에 PMA를 처리한 후 microwell에 포획하여 이때 reporter 유전자에서 발현되는 형광 단백질을 형광현미경(automated fluorescence microscopy)을 이용 실시간으로 관찰하고 CCD 카메라로 촬영하였다. 촬영한 이미지를 이미지 분석 컴퓨터 프로그램을 사용하여 단일세포에서 발현된 형광단백질의 밝기 정도를 측정 분석하였다. 각 형광 단백질의 발현양을 기반으로 하여 다양한 농도의 환경 자극과 여러 시간대에서의 신호 반응을 정량적으로 분석하여 신호반응의 stochasticity 여부 그리고 각 단일 세포들이 주어진 자극에 대하여 균질적인 반응을 나타내는 지의 여부를 확인하였다. 이를 기반으로 단일 세포 수준에서 특정 신호반응에 대하여 균일한 반응을 나타내는 지의 여부를 확인하고 실제 ensemble average problem이 존재하는지의 여부를 확인하였다. 도 9는 단일세포의 신호 반응을 분석하기 위한 개략적인 흐름도를 도시한 것이다.

<실시예 5> 세포포획 및 분석

본 발명자들은 대면적에 단일 세포를 포획할 수 있는 마이크로유체역학 플랫폼을 제조하고, 이를 통하여 90% 이상의 확률로 대면적에 세포를 포획하고 단일세포 수준으로 분석하였다. 먼저 세포에 PMA를 처리하고 포획하여 세포반응을 10시간이 지난 다음 분석하였다(도 10).

도 10에 기재된 바와 같이, 형광의 세기가 세포마다 다르며 이는 곧 세포의 반응이 단일세포 수준에서 매우 비균일하다는 것을 알려준다. 본 발명자들은 이것이 세포의 본질적인 문제인지 외부의 배양 및 포획 조건에서 기인하는 것인지 좀 더 보강된 연구가 필요하다.

도 1은 신호전달 단백질의 생화학적 네트워크를 사용한 세포신호전달을 나타낸 도식도이고,

도 2는 신호 반응의 동력학적 모델이고,

도 3은 Ensemble average problem; 실제 단일 세포수준에서 heterogeneous population을 갖는 경우 bulk population을 대상으로 한 연구에서의 readout은 각 population의 real response의 평균을 readout으로 측정한 것이고,

도 4는 단일세포 제어 및 분석에 중요한 나노환경 변수들이고,

도 5는 포유동물 세포인 Jurkat의 ERK MAP kinase pathway이고,

도 6은 단일세포 신호분석용 형광 포유동물 세포(Jurkat) 제작과정을 나타낸 모식도이고,

도 7은 마이크로웰 구조를 가지는 나노 환경 플랫폼 제작 과정이고,

도 8은 포유동물 세포 Jurkat을 지름 24 ㎛, 깊이 12 ㎛의 microwell에 단일 세포 단위로 포획한 사진이고

도 9는 단일세포 신호 반응 분석 흐름도이고,

도 10은 단일세포 수준의 세포 포획 및 분석예이다.

<110> Seoul National University industry Foundation <120> Cell Signaling Analysis Method of Single-Cell <130> 2009p-9-202 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEGFP-N1 sense primer <400> 1 aaagagctca attctgcagt cgacggtac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEGFP-N1 antisense primer <400> 2 tttttaatta attacttgta cagctcgtcc a 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFR-EGFP sense primer <400> 3 aaaagatctt tctaattgtg gtttgtccaa 30 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFR-EGFP antisense primer <400> 4 aaagaattct tacttgtaca gctcgtcca 29

Claims

ⅰ) 단일세포 신호분석용 형광 포유동물 세포(Jurkat)를 제조하는 단계; 및

ⅱ) 상기 형광 포유동물 세포(Jurkat)의 단일 세포로부터 신호 반응으로 단일세포를 분석하는 단계를 포함하는, 단일세포의 신호분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 형광 포유동물 세포(Jurkat)의 제조단계 이후에 추가적으로,

상기 형광 포유동물 세포(Jurkat)를 이용한 세포포획을 위한 나노환경을 구축하는 단계; 및

상기 나노환경으로부터 단일 세포를 포획하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 2항에 있어서, 상기 나노환경의 구축은 마이크로 유체역학에 기반을 둔 microwell을 이용하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 3항에 있어서, 상기 microwell의 이용은 광식각(photolithography) 공정 으로 제작된 음각의 실리콘 웨이퍼 마스터 위에 PDMS(polydimethyl siloxane) 고분자를 경화시켜 양각의 PDMS stamp를 제작하고, glass coverslip 위에 생체적합 UV 경화성 고분자를 코팅하고 양각의 PDMS stamp를 이 고분자와 접촉시킨 후 UV로 경화시켜 음각의 고분자 microwell 구조를 glass coverslip 위에 형성하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 신호 반응의 단일세포 분석은 살아있는 단일세포들의 신호반응을 정량적으로 time-course 분석하여 세포 신호반응의 stochasticity 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.
제 5항에 있어서, 상기 신호 반응의 단일세포 분석은 PMA를 처리하고, 형광 단백질의 밝기 정도를 측정하여 분석하는 것을 특징으로 하는 단일세포의 신호분석방법.