KR20110005806A - 인간 인터페론 α 서브타입 α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 인터페론 α 서브타입 α8(이하, IFN α8) 및 그 변이 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 제공하는 것, 이 항체를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제공하는 것, 이 항체에 의한 IFN α8 및 그 변이 단백질의 검출 방법을 제공하는 것, 이 항체에 의한 IFN α8 및 그 변이 단백질의 정제 방법을 제공하는 것, 이 항체를 유효 성분으로 하는 IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제를 제공하는 것을 과제로 한다. IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적인 단일클론 항체, 이 항체를 산생할 수 있는 하이브리도마, 이 항체를 사용한 면역 반응에 의한 IFN α8 및 그 변이 단백질의 검출 방법, 이 항체를 사용한 IFN α8 혹은 그 변이 단백질의 정제 방법, 및 이 항체를 유효 성분으로 하는 IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제를 제공함으로써 해결한다.
Description
본 발명은 인간 인터페론 α(이하, 인터페론을 「IFN」이라고 약기할 경우가 있다.)에 대한 신규의 단일클론 항체에 관한 것이며, 상세하게는, 인간 IFN α 서브타입 α8(이하, 인간 IFN α 서브타입 α8을 「IFN α8」이라고 약기한다.) 및 그 변이 단백질에 특이적인 단일클론 항체에 관한 것이다.
IFN은, 바이러스에 감염된 세포가 산생하는 바이러스 증식 억제 인자로서 발견되었다. 현재, IFN에는, 수용체가 다른 α/β, γ, λ의 3가지 타입이 알려져 있고, 인간 IFN α에는, 적어도 13종류 이상의 서브타입의 존재가 알려져 있다. 인간 IFN α는, 대장균으로 생산한 재조합형 제제나, 말초혈 백혈구나 배양주화된 림프아구(芽球)성 세포를 센다이 바이러스(HVJ) 등으로 자극해서 유발한 천연형 제제가, 신장암 등의 악성 신생물이나, B형 및 C형 간염의 치료제로서 널리 임상 응용되고 있다. 또한, IFN의 면역 조절 작용, 알레르기 질환, 당뇨병 등의 자기면역 질환이나, 바이러스 감염에 기인하는 질환에 대한 관여도 연구되고 있어, 생체 내에서의 동태에도 관심이 모아지고 있다. IFN의 활성 측정에는, 배양 세포를 사용한 항바이러스 활성에 근거하는 생물학적 검정(bioassay)이 이용되고 있다. 생물학적 검정은, IFN의 생리활성을 가장 잘 반영하지만, 측정에 시간이 걸리는데다가, 검정에 사용하는 세포의 생리기능에 영향을 주는 인자의 영향을 받기 쉬운 것 등이 알려져 있다. 또한, 백혈구나 림프아구를 바이러스 등으로 자극하면 복수의 타입이나 서브타입을 포함하는 천연형의 IFN이 산생되기(예를 들면, 야나이 와이.(Yanai Y.) 등, 『Journal of interferon & cytokine research)』, 제21권, 제10호, 제835 내지 841페이지(2001년)를 참조) 때문에, 이러한 각각의 서브타입의 활성을 직접 측정하는 것이나 그 기능을 해석하는 것은 지극히 곤란했다.
인간 IFN α의 정량(定量)이나 정제(精製)를 위해서, 수많은 항인간 IFN α 단일클론 항체가 조제되고 있다(예를 들면, 일본국 특공평 6-11235호 공보, 일본국 특표 2004-533217호 공보, 일본국 특개 2007-63177호 공보를 참조). 또한, 인간 IFN α 서브타입 α4(이하, 인간 IFN α 서브타입 α4를 「IFN α4」라고 약기한다.)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체(『Molecular Immunology』, 제29권, 제3호, 제391-399페이지(1992년)를 참조)가 조제되어, 마우스 유래의 단일클론 항체를 이용한 인간 IFN α를 특이적으로 정량할 수 있는 키트도 판매되고 있지만(예를 들면, 주식회사 JIMRO 판매, 상품명 「인간 IFN α 측정 키트」), IFN α 서브타입을 특이적으로 식별할 수는 없다.
한편, IFN α8에는, 3종류의 분자종의 존재가 알려져 있으며, 각각 IFN α8a, IFN α8b 및, IFN α8c라고 불리고 있다(예를 들면, 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿을 참조). IFN α8은, 인간 IFN α 서브타입 α2a나 인간 IFN α 서브타입 α2b 등의 기존의 의약 성분보다 우수한 생리활성을 가지고 있어서, IFN α8이나 그 변이 단백질을 유효 성분으로 하는 감수성 질환 치료제가 제안되고 있다(예를 들면, 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿 및 일본국 특표평 9-509955호 공보를 참조). 또한, 인간 IFN α의 서브타입에 따라서는, 다른 서브타입의 co-agonist(증강제)로서 작용할 가능성도 지적되고 있고(일본국 특표평 9-509955호 공보), 비활성(比活性)이 다른 IFN α8 변이 단백질도 존재하므로(국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿), 이러한 인간 IFN α 서브타입이나 그 변이 단백질의 생리적인 기능을 연구하거나, 의약용의 제제로서 개발하는데 있어서, 그 생리활성이나 혈중 동태를 조사해서 비교할 경우, 생물학적 검정과 같이 다른 생리학적인 인자의 영향을 받지 않고, 그 단백질량을 특이적으로, 또한, 정확하게, 고감도로 정량할 수 있는 검정계(系)가 필요하게 된다. 또한, 단일클론 항체는 특정한 항원 결정기(決定基)(에피토프)를 인식할 수 있지만, 그 특이성이나 친화성에는 차이가 있기 때문에, IFN α8 특이적이고, 또한, 고감도의 검정계의 구축에는, 거기에 적합한 단일클론 항체를 개발할 필요가 있다. 또한, IFN α8 혹은 그 변이 단백질을, 의약용도로 사용하기 위해서는, 그 IFN α8이나 그 변이 단백질을 특이적으로, 또한, 대량으로 정제할 필요가 있으므로, IFN α8이나 그 변이 단백질 이외의 IFN이나 이들 이외의 단백질의 비특이적 흡착이 적고, 또한, 그 단일클론 항체를 이용해서 조제한 항체 칼럼으로부터의 IFN α8 혹은 그 변이 단백질의 용출이 용이한 항체 칼럼의 조제에 적합한 단일클론 항체를 개발할 필요가 있다.
본 발명은, IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 제공하는 것을 제1과제로 한다.
본 발명은, 이와 같은 단일클론 항체를 산생할 수 있는 하이브리도마(hybridoma)를 제공하는 것을 제2과제로 한다.
본 발명은, 이와 같은 단일클론 항체에 의한 IFN α8 및 그 변이 단백질의 검출 방법을 제공하는 것을 제3과제로 한다.
본 발명은, 이와 같은 단일클론 항체에 의한 IFN α8 및 그 변이 단백질의 정제 방법을 제공하는 것을 제4과제로 한다.
본 발명은, 이와 같은 단일클론 항체를 유효 성분으로 하는, 각종 바이러스성 질환, 자기면역 질환, 당뇨병, 마른 버짐, 만성 관절 류머티즘, 다발성 경화증, 베체트병, 재생불량 빈혈, 신장염, 전신성 에리테마토데스 및/또는 후천성을 포함하는 면역 부전증의 치료제를 제공하는 것을 제5과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서, IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 인식하는 신규 단일클론 항체에 대해서 예의 연구하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명이 요지로 하는 바는, IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 인식하는 신규 단일클론 항체를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 검출하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 의하면, 협잡물을 함유하는 피험시료로부터 IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 정제하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 의하면, IFN α8이 관여하는, 알레르기증, 면역 부전증 혹은 자기면역 질환 등 각종 질환의 치료제가 제공된다.
본 발명의 단일클론 항체는, IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적으로 결합하고, 이 이외의 IFN의 타입이나 서브타입에는 실질적으로 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명의 단일클론 항체는, 피험시료 중의 IFN α8 및 그 변이 단백질과만 면역반응을 나타내므로, 피험시료 중의 IFN α8 및 그 변이 단백질을, 특이적으로, 또한, 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있는 이점을 가진다. 또한, IFN α8 및 그 변이 단백질과 협잡물질을 함유하는 혼합물로부터, IFN α8 및 그 변이 단백질을 고순도로, 효율적으로 채취할 수 있다는 이점을 가진다.
도 1은 IFN류를, 각각의 단백질량이 10ng/레인이 되도록 충전해서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실행하고, 겔에 포함되는 IFN류를 니트로셀룰로오스 막에 옮겨서, 본 발명의 단일클론 항체(α8#139mAb)를 반응시킨 웨스턴 블로팅의 일례를 나타내는 설명도.
도 2는 본 발명의 단일클론 항체 α8#139mAb를 고상(固相) 항체로 하고, α8Y36-2mAb를 표지 항체로 해서 사용한, 샌드위치법에 의한 효소 면역 검정(enzyme immunoassay)에 의해 구한 rIFN α8의 검량선의 일례를 나타내는 설명도.
도 2는 본 발명의 단일클론 항체 α8#139mAb를 고상(固相) 항체로 하고, α8Y36-2mAb를 표지 항체로 해서 사용한, 샌드위치법에 의한 효소 면역 검정(enzyme immunoassay)에 의해 구한 rIFN α8의 검량선의 일례를 나타내는 설명도.
본 발명에서 말하는 IFN α8은, 예를 들면 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿에 기재된 IFN α8의 아미노산 서열을 가지는 기지의 폴리펩티드를 말하며, 아미노 말단(이하, 「N말단」이라고 말한다.)이 시스테인으로 시작되는 165 또는 166개의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 가지는 3종류의 폴리펩티드를 말한다. 이 폴리펩티드는 IFN α8a, IFN α8b 및, IFN α8c라고 불리는 경우가 있으며(예를 들면, 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿 참조), 본 명세서에서는 이들을 총칭해서 IFN α8이라고 할 경우가 있다. 이 폴리펩티드의 출처, 유래를 막론하고, 천연형이어도 좋고, 재조합형이어도 좋으며, 화학적으로 합성한 것이어도 좋다.
본 발명에서 말하는 IFN α8의 변이 단백질은, IFN α8의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 구성하는 1개 또는 2개 이상 수 개(數箇) 이하의 아미노산을, 다른 아미노산으로 치환한 폴리펩티드를 말하며, 적어도 후술하는, 하이브리도마 mAb-IFN α8#139(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11081, 이하 「α8#139」라고 약기한다.) 및 mAb-IFN α8Y36-2(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11082, 이하 「α8Y36-2」라고 약기한다.)가 산생하는 단일클론 항체에 의해 인식되는 항원 결정 부위를 가지는 폴리펩티드로써, IFN α8의 아미노산 서열에 있어서의 N말단 및/또는 카르복시 말단(이하, 「C말단」이라고 한다.)에 아미노산이 1개 또는 2개 이상 수 개 이하 부가한 것 및, 그 폴리펩티드 내, 그 N말단 및/또는 C말단의 아미노산이 1개 또는 2개 이상 수 개 이하 결실한 것을 포함한다. 구체적으로는, 본 출원인이 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿에서 개시한, IFN α8의 아미노산 서열의 N말단으로부터 145번째의 아르기닌 잔기(殘基)를 로이신 잔기, 이소로이신 잔기 또는 발린 잔기로, 146번째의 알라닌 잔기를 아스파라긴 잔기 또는 세린 잔기로, 혹은, 149번째의 메티오닌 잔기를 티로신 잔기로 치환한 폴리펩티드나, 이들 펩티드의 아미노산 서열의 N말단으로부터 31번째 및 134번째의 리신 잔기의 어느 하나를 보유하고, 다른 리신 잔기의 전부가 다른 아미노산 잔기로 변환된 것 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서 말하는 단일클론 항체는, 전술한 IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적인 단일클론 항체 전반을 포함하는 것으로 해서 그 출처·유래, 클래스, 이소 타입 등은 불문한다.
본 발명의 단일클론 항체는, IFN α8 또는 그 변이 단백질 혹은 이들의 항원성 프래그먼트(fragment)를 항원으로서 이용함으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 이와 같은 항원으로 면역 감작(感作)해 둔 포유동물로부터 채취한 항체 산생 세포와 무한 증식 가능한 포유동물 유래의 세포의 하이브리도마를 제작하여, 이것으로부터 본 발명의 단일클론 항체를 산생할 수 있는 하이브리도마의 클론을 선택하고, 이것을 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다.
항원이 될 수 있는 IFN α8 및 그 변이 단백질은, 그 유래나 제법에 제한은 없으며, 예를 들면, BALL-1세포 등의 림프아구성 세포에 HVJ 등의 바이러스를 첨가함으로써 유도되는 IFN α8이어도 좋고, 유전자 재조합 기술이나 화학적 합성법에 의해 조제되는 IFN α8 혹은 그 변이 단백질이어도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 야나이 와이.(Yanai Y.) 등, 『Journal of Interferon & Cytokine Research』, 제21권, 제10호, 제835 내지 841페이지(2001년)에 기재된 방법에 의해, BALL-1세포 유래의 IFN α8을 조제해도 좋고, 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿에 기재된 방법에 의해, IFN α8 또는 그 변이 단백질을 조제할 수도 있다. 그것들은, 통상, 완전 정제 또는 부분 정제한 상태에서 사용된다. 항원성 프래그먼트를 얻기 위해서는, 이들 완전 정제품 또는 부분 정제품을 화학적 또는 효소적으로 분해하거나, 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿 등에 개시된 IFN α8a, IFN α8b 혹은 IFN α8c의 아미노산 서열에 근거하여 목적으로 하는 펩티드를 합성하면 좋다.
면역 감작은 통상적인 방법에 따르면 좋은데, 예를 들면, 상기의 IFN α8, 그 변이 단백질 혹은 이들의 프래그먼트를 단독 또는 적당히 보조제(adjuvant)와 함께 포유동물의 정맥, 피내(皮內), 피하 또는 복강 내에 투여하여, 일정 기간 사육한다. 포유동물에 특히 한정은 없으며, 소망의 항체 산생 세포를 얻을 수 있는 한, 종류, 크기, 자웅은 불문한다. 보통은 래트, 마우스, 햄스터 등의 설치류가 이용되며, 후술하는 무한 증식 가능한 포유동물 유래의 세포와의 적합성도 감안하면서, 최적의 것이 선택된다. 포유동물의 종류나 크기에도 따르지만, 항원의 접종량은, 통상, 총 접종량을 약 5 내지 500㎍/마리로 해서 이것을 약 1 내지 2주일의 간격을 두고 2 내지 5회로 나누어서 접종한다. 그리고 최종접종으로부터 3 내지 5일 후에 비장을 적출하고, 분산해서 항체 산생 세포로서의 비장 세포를 얻는다.
이어서, 이와 같이 하여 얻어진 항체 산생 세포와 무한 증식 가능한 포유동물 유래의 세포를 융합시켜서, 목적하는 하이브리도마를 함유하는 융합 세포를 얻는다. 무한 증식 가능한 포유동물 유래의 세포에는, 통상, P3-NS1-Ag4-1세포(ATCC TIB18), P3-X63-Ag8세포(ATCC TIB9) 및 SP2/O-Ag14세포(ATCC CRL1581), Y3Ag 1.2.3(ATCC CRL1631) 등의 마우스나 래트의 골수종 유래 세포주, 또는 이들의 변이주가 이용된다. 세포 융합은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스를 비롯한 융합 촉진제나 전기 펄스에 의한 방법이 이용되고, 일례를 들면, 융합 촉진제를 함유하는 융합 배지에 항체 산생 세포와 무한 증식 가능한 포유류 유래의 세포를 약 1:1 내지 1:10의 비율로 부유시켜, 이 상태로, 약 30 내지 40℃로 약 1 내지 5분간 배양한다. 융합 배지에는, 예를 들면, MEM 배지, RPMI1640 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 비롯한 통상의 일반적인 것을 이용하면 좋고, 소 혈청 등의 혈청류는 제외해 두는 것이 바람직하다.
목적으로 하는 하이브리도마를 선택하기 위해서는, 우선, 상기한 바와 같이 해서 얻은 융합 세포를 HAT 배지 등의 선택용 배지에 옮기고, 약 30 내지 40℃로 약 3일 내지 3주일 배양해서 하이브리도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이어서, 하이브리도마를 통상적인 방법에 의해 배양하고, 배양물 중에 분비된 항체에 대해서, IFN α8 및 그 변이 단백질과의 반응성을 시험한다. 시험에는, 효소 면역 검정, 방사 면역 검정(radioimmuno assay) 및 생물학적 검정 등의 항체를 검출하기 위한 관용의 방법이 이용되고, 예를 들면, 도미야마 사쿠지(富山朔二)·안도 다미에(安東民衛) 편(編) 『단일클론 항체 실험 매뉴얼』, 고단샤(講談社) 사이언티픽 발행, 제105 내지 152페이지(1991년)에는 이를 위한 방법이 여러 가지 상술되어 있다. IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적인 항체를 산생하는 하이브리도마는, 한계 희석법 등에 의해, 즉시 클로닝(cloning)되어, 단일 클론화된 본 발명에 의한 하이브리도마를 얻는다.
본 발명의 단일클론 항체는, 이와 같은 하이브리도마를 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양에는, 포유동물 유래의 세포를 배양하기 위한 관용의 방법이 이용되며, 예를 들면, 생체 외의 배양 배지에서 배양할 때에는, 그 배양물로부터, 반면, 인간 이외의 온혈동물에게 이식하여, 생체 내에서 배양할 때에는, 그 복수(腹水) 및/또는 혈액으로부터 단일클론 항체를 채취한다. 후술하는 α8#139(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11081) 및 α8Y36-2(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11082)가 산생하는 단일클론 항IFN α8 항체는, 이들 항체를 IFN α8 및 그 변이 단백질의 검출에 사용했을 때, 비특이적 반응이 낮아, 미량의 IFN α8을 특이적으로 또한, 양호한 감도로 검출할 수 있다. 또한, 이러한 하이브리도마는, 단일클론 항체의 산생 능력이 높고, 게다가, 생체 내외에서의 배양이 용이하다는 특징이 있다. 배양물, 복수 혹은 혈액으로부터 단일클론 항체를 채취하기 위해서는, 항체 일반을 정제하기 위한 이 분야에서의 관용의 방법이 이용된다. 각각의 방법으로서는, 예를 들면, 염석(鹽析), 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있고, 이들은 필요에 따라서 조합해서 적용된다. 정제한 단일클론 항체는, 그 후, 농축, 건조하여, 용도에 따라서 액상 또는 고상으로 한다.
또한, 본 발명의 단일클론 항체는, 예를 들면, 서열표에 있어서의 서열번호 3 또는 4와, 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 중쇄(重鎖) 및 경쇄(輕鎖) 가변영역을 코딩하는 DNA, 혹은, 서열번호 12 또는 13과, 14로 표시되는 염기서열을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 각각, 중쇄 및 경쇄의 정상역영을 코딩하는 기지의 DNA(예를 들면, 일본국 특개 2007-252372호 공보 참조)와 각각 연결한 유전자를, PCR법, 또는, 화학 합성에 의해 합성하고, 정법(定法)에 의해, 그 유전자의 발현을 가능하게 하는 공지의 발현 벡터(pcDNA 3.1(Invitrogen사 판매) 등에 이식하여 형질 전환체를 조제하고, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)나 대장균 등의 숙주 중에서 발현시킴으로써 항체를 산생하고, 이러한 배양액으로부터, Protein A 칼럼 등을 이용해서 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다.
이러한 방법으로 산생된 항체는, 후술하는 목적으로, 항체 전체를 그대로 사용해도 좋고, IFN α8 및 그 변이 단백질에 결합 능력을 가지는 한, 이 항체의 항원 인식 부위를 포함하는 Fv, scFv, Fab, F(ab'), Fab' 등의 단편으로 해서 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체는, IFN α8 및/또는 그 변이 단백질의 검출을 필요로 하는 여러 분야에 광범위한 용도를 가진다. 즉, 본 발명의 단일클론 항체에 방사 면역 검정, 효소 면역 검정, 형광 면역 검정 등의 표지 면역 검정을 적용할 때에는, 피험시료 중의 IFN α8 및/또는 그 변이 단백질을, 특이적으로, 신속하고, 정확하게 정성 분석 또는 정량 분석할 수 있다. 이와 같은 분석에 있어서, 본 발명의 단일클론 항체는, 예를 들면, 방사성 물질, 효소 및/또는 형광물질에 의해 표지해서 이용된다. 본 발명의 단일클론 항체는, IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적으로 반응하므로, 그 면역반응을, 이들 표지물질을 지표로 측정하면, 피험시료 중의 극히 미량의 IFN α8 및 그 변이 단백질을 양호한 정밀도로 검출할 수 있다. 표지 면역 검정은, 생물학적 검정에 비하여, 한번에 수많은 피험시료를 분석할 수 있는데다가, 분석에 필요로 하는 시간과 노동력이 적게 들고, 게다가, 분석이 고정밀도라는 특징이 있다. 따라서, 본 발명에 의한 검출 방법은, IFN α8 및/또는 그 변이 단백질을 제조할 때의 공정관리나 제품의 품질관리, 또 IFN α8이 관여하는 질환의 임상진단 등에 매우 유용하다. 또한, 본 발명은 단일클론 항체의 표지나 표지 검정 그 자체에 관련된 것이 아니므로 상세한 설명은 생략하지만, 예를 들면, P. Tijssen 저, 이시카와 에이지(石川榮治) 역(譯) 『효소 면역 검정』, 1989년, 도쿄 화학동인 발행, 제196 내지 348페이지 등에는 이를 위한 방법이 여러 가지 상술되어 있다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는, IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이므로, 이러한 단일클론 항체를, 효소 항체법의 고상 항체 및/또는 표지 항체로서 사용함으로써, IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 검출할 수 있다. 그 중에서도, 본 발명의 단일클론 항체를 샌드위치법에 의한 효소 항체법에 있어서, 고상 항체 및 표지 항체로서 사용하여, IFN α8 및 그 변이 단백질의 검출에 적용했을 때에는, 이 단백질을 50 내지 2,000pg/㎖의 범위에서 검출 가능하고, 또한, IFN α8 이외의 다른 인간 IFN α 서브타입을 실질적으로 검출하지 않는, 고감도의 검정계를 구축할 수 있다. 이 목적, 특히, 샌드위치법에 의한 고감도의 효소 항체법에 적합한 단일클론 항체로서, 예를 들면, 후술하는 α8#139(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11081) 및 α8Y36-2(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11082)의 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체를 예시할 수 있다. 이 2종류의 단일클론 항체를 고상 항체 및 표지 항체로서 사용할 경우에는, IFN α8 이외의 인간 IFN α 서브타입을, 그 농도가 2,000pg/㎖에서도 검출하지 않고, 또한, 비특이적인 흡착에 의한 반응도 거의 보이지 않으므로, IFN α8 및 그 변이 단백질을 고감도로, 또한, 정확하게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일클론 항체는, 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography)에 의한 IFN α8 및 그 변이 단백질의 정제에도 매우 유용하다. 이와 같은 정제 방법은, 본 발명의 단일클론 항체를 이 IFN α8 및 그 변이 단백질과 이 단백질 이외의 협잡 단백질을 비롯한 협잡물질과의 혼합물에 접촉시켜서 단일클론 항체에 이 단백질만을 흡착시키는 공정과, 흡착한 단백질을 단일클론 항체로부터 탈착시키는 공정을 포함해서 이루어지며, 양 공정은, 통상, 수성 매체 중에서 실행된다. 본 발명의 단일클론 항체는, 통상, 겔 형상의 수(水)불용성 담체에 결합한 상태에서 이용되고, 그 수불용성 담체를 원통관 등에 칼럼 형상으로 충전하고, 이것에, 예를 들면, 림프아구성 세포주 BALL-1을 HVJ로 자극해서 제조한 IFN α를 함유하는 배양 상청, IFN α8 혹은 그 변이 단백질의 산생 능력을 가지는 형질 전환체의 배양액 또는 그들의 부분 정제품을 통액하면, 실질적으로 이 단백질만이 수불용성 담체상(上)의 단일클론 항체에 흡착한다. 흡착한 단백질은, 단일클론 항체 주위의 수소 이온 농도를 변경함으로써, 용이하게 탈착시킬 수 있고, 예를 들면, IgG의 클래스에 속하는 단일클론 항체를 이용할 경우는 산성측의 pH, 통상, pH 2 내지 3으로, 한편, IgM의 클래스에 속하는 단일클론 항체를 이용할 경우는 알칼리측의 pH, 통상, pH 10 내지 11로 용출시킬 수 있다. 이 목적에 적합한 단일클론 항체로서, 예를 들면, 상기 α8#139 및 α8Y36-2가 산생하는 단일클론 항체를 예시할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일클론 항체는, 상기와 같은 재조합 기술 등을 이용하여, CHO 세포나 대장균으로 발현시켜서, 키메라 항체, 인간화 항체나 인간 항체를 조제하고, 또, 이러한 항체의 항원 인식 부위를 가지는 Fv, 단쇄(短鎖) 항체(scFv), Fab, F(ab'), Fab' 단편, 디아바디(diabodies) 및 미니바디(minibodies) 등의 단편을 조제하여, IFN α8이, 발증이나 악화에 관여하는 각종 바이러스성 질환, 알레르기증, 아토피증, 자기면역 질환, 당뇨병, 마른 버짐, 만성 관절 류머티즘, 다발성 경화증, 베체트병, 재생불량 빈혈, 신장염, 전신성 에리테마토데스 및/또는 후천성을 포함하는 면역 부전증 등의 각종 질환의 치료제의 유효 성분으로서도 유리하게 사용할 수 있다. 이 치료제의 유효 성분으로서 사용 가능한 단일클론 항체로서, 구체적으로는, 상기의 하이브리도마 α8#139 및 α8Y36-2가 산생하는 단일클론 항체를 예시할 수 있고, 특히, IFN α8 활성을 중화할 수 있는 α8#139가 산생하는 항체가 바람직하다. 또한, 후술하는 하이브리도마 α8#S56-1이 산생하는 항체도, IFN α8 활성을 중화할 수 있으므로 유리하게 이용할 수 있다. 이 경우, 단일클론 항체 단독의 제제로 할 수도 있지만, 통상, 제제학적으로 허용되는 첨가제를 1종 또는 2종 이상 첨가한 제제의 형태가 바람직하고, 해당 질환의 치료에 사용되는 다른 유효 성분을 추가로 배합하는 것도 마음대로이다. 이러한 제제는 통상, 피내, 피하, 근육 내, 정맥 내, 복강 내 등에 투여하면 좋고, 그때의 투여량은, 대상으로 하는 질환에 대하여 치료 효과를 발휘하는 양을 적당히 선택하면 좋은데, 통상은, 성인 1일(日)당, 본 발명의 단일클론 항체를 0.001mg 내지 2,000mg, 바람직하게는 0.01 내지 1,000mg, 더욱 바람직하게는, 0.1mg 내지 1,000mg을, 1회 내지 복수 회로 나누어서 투여하면 좋다.
상기, 면역 검정, IFN α8 또는 그 변이 단백질 정제나 IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 질환 치료제로서 바람직한 본 발명의 단일클론 항체에 대해서 더욱 구체적으로 설명하면, 본 발명의 소망의 목적을 달성할 수 있는 단일클론 항체이면, 그 유래나 아미노산 서열은 불문하고, 특히, α8#139 및 α8Y36-2의 하이브리도마가 산생하는 항체가 바람직하다. 그 아미노산 서열에 대해서 말하면, 중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 21 내지 23으로 표시되는 아미노산 서열의 1종 이상을 포함하고, 및/또는, 경쇄 가변영역에 서열번호 24 내지 26으로 표시되는 아미노산 서열의 1종 이상을 포함하는 항체, 혹은, 중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 27 내지 29로 표시되는 아미노산 서열의 1종 이상을 포함하고, 및/또는, 경쇄 가변영역에 서열번호 30 내지 32로 표시되는 아미노산 서열의 1종 이상을 포함하는 항체가 바람직하다. 또한, 중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 21 내지 23으로 표시되는 모든 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변영역에 서열번호 24 내지 26으로 표시되는 모든 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는, 중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 27 내지 29로 표시되는 모든 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변영역에 서열번호 30 내지 32로 표시되는 모든 아미노산 서열을 포함하는 항체가 더욱 바람직하고, 중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는, 중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 18 또는 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체가 더욱 바람직하다. 특히, 중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체는, IFN α8에 대한 중화 활성을 가져서, 활성과의 상관(相關)이 높으므로 바람직하다.
이러한 항체는, 그대로, 그 부분 서열을 이용하여, 혹은, 그 아미노산들의 1 내지 100개 정도를, 결실, 부가, 치환하는 등으로 해서 재조합체를 조제하여, 인간 IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 인식하는, IFN α8의 정량·정성, IFN α8 정제, 또한, IFN α8이 관여하는 질환치료, 임상진단 등의 각각의 용도에 적합한 키메라 항체, 인간화 항체, 혹은, 인간 항체를, 공지의 방법(예를 들면, 일본국 특개 2004-533217호 공보나 일본국 특개 2007-252372호 공보)에 의해 조제하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 보통, 아미노산의 결실, 부가, 치환은, 수 개의 범위가 바람직한데, 1 내지 5개가 바람직하고, 1 내지 3개가 바람직하며, 1 또는 2개가 특히 바람직하다. 이러한, 결실, 부가, 치환은, 항체의 특이성을 규정하는 초(超)가변 부위에 도입해도 좋지만, 통상은, 그 이외의 부위가 바람직하다.
이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명은, 이들 실시예에만 한정되는 것이 아니다. 또한, 이하의 실시예에서 사용한 IFN α8을 포함하는 재조합형(이하, 재조합형을 「r」이라고 약기할 경우가 있다)의 인간 IFN α 서브타입 및 IFN α8의 변이 단백질은, 모두, 주식회사 하야시바라 생물화학연구소에서, 대장균을 이용해서 조제한 것을 사용했다(야나이 와이.(Yanai Y.) 등, 『Journal of Interferon & Cytokine Research』, 제21권, 제10호, 제835 내지 841페이지(2001년) 및 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿을 참조). rIFN α8은 IFN α8b의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 사용했다(국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿을 참조). 또한, 천연형(이하, 천연형을 「n」이라고 약기할 경우가 있다.)의 인간 IFN α 서브타입 α2b(이하, 「IFN α2」라고 약기한다.), nIFN α8, 마우스 IFN α/β 및 래트 IFN α는, 주식회사 하야시바라 생물화학연구소에서 조제한 것을 사용했다(야나이 와이.(Yanai Y.) 등, 『Journal of Interferon & Cytokine Research』, 제21권, 제10호, 제835 내지 841페이지(2001년)를 참조). 인간 IFN β(이하, 인간 IFN β를 「IFN β」라고 약기한다.), 컨센서스(consensus) IFN(이하, 「Con IFN」이라고 약기할 경우가 있다.)은, 각각, 모치다 제약 주식회사 및 아스텔라스 제약 주식회사 판매의 제품을 각각 구입해서 사용했다. 인간 IFN γ(이하, 인간 IFN γ를 「IFN γ」라고 약기한다.) 및 인간 종양괴사인자(인간 TNF α, 이하, 인간 TNF α를 「TNF α」라고 약기한다.)는 코스모 바이오 주식회사의 제품을 구입해서 사용했다.
또한, 이하의 실시예에서 사용한 IFN류 및 사이토카인(표 5에 표시되는 비활성(比活性)은, 안정화 등의 목적으로 첨가한 단백질 성분을 함유하지 않는다)은, 후술하는 표 5에 정리해서 나타낸다. 또한, 이하, 인간 IFN α의 서브타입 α1, α5, α6 및 α10을, 각각 IFN α1, IFN α5, IFN α6 및 IFN α10이라고 약기한다. 또한, 이하의 실시예에서는, IFN α8의 변이체로서, 야나이 와이.(Yanai Y.) 등, 『Journal of Interferon & Cytokine Research』, 제21권, 제10호, 제835 내지 841페이지(2001년)의 실험 1-1 내지 1-3에서 개시한 변이체 No. 2 및 No. 3, 즉, 166의 아미노산 잔기로 이루어지는 IFN α8b의 아미노산 서열의 N말단의 시스테인 잔기로부터 145번째의 아르기닌 잔기를 이소로이신 잔기로, 146번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 149번째의 메티오닌 잔기를 티로신 잔기로 치환한 IFN α8의 변이 단백질(이하, 「IFN α8-MUT2」라고 약기한다.), 및, IFN α8b의 아미노산 서열의 N말단의 시스테인 잔기로부터 145번째의 아르기닌 잔기를 로이신 잔기로, 146번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 149번째의 메티오닌 잔기를 티로신 잔기로 치환한 IFN α8의 변이 단백질(이하, 「IFN α8-MUT3」이라고 약기한다.)을 사용했다.
실시예 1
<마우스 항IFN α8 항체 산생 하이브리도마의 조제>
<항원>
항원으로서, 국제공개 제WO 2006/051805호 팸플릿에 기재된 방법에 의해 조제한 IFN α8b의 아미노산 서열을 가지는 rIFN α8(대장균 유래, 단백질 농도 510㎍/㎖, 1.27×108IU/㎖)을 사용했다. 또한 IFN의 역가(力價)(국제 단위: IU)는, FL세포의 신드비스 바이러스(Sindbis virus)에 의한 세포 변성의 억제 작용을 지표로 하는 생물학적 검정으로 측정했다. 측정에는, 국제 표준품(Ga23-901-532)을 사용해서 검정한 자사 표준품(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 조제)을 사용했다.
<면역 방법>
항원(10㎍/마리)과 프로인트의 완전 항원보강제(주식회사 디프코(DIFCO) 판매)를 혼합하여, 에멀션을 작성하고, 마우스(BALB/c, 9주령, 암컷, 주식회사 일본 찰스리버 판매)에, 복강 내에 면역했다. 2회째 이후는 프로인트의 불완전 항원보강제(주식회사 디프코(DIFCO) 판매)로 변경하여, 복강 내에 2주 간격으로 총 3회 면역했다.
<세포 융합>
최후의 면역 후, 7일째에 꼬리 정맥으로부터 부분 채혈하여 항체값을 확인했다. 항체값의 상승이 나타난 개체에 대해서, 세포 융합을 실행하기 3일 전에, 최종 면역으로서, 보조제를 함유하지 않는 항원 10㎍을 정맥 내에 투여(이하, 「정주(靜注)」라고 한다.)했다. 이 정주를 실행해서 3일째의 마우스의 비장을, 통상적인 방법에 의해 채취하고, 분산하여 비장 세포를 얻었다. 이 비장 세포와 신주(新株)인 마우스 SP2/O-Ag14세포(ATCC CRL1581)를 37℃로 예온해 둔 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2)에 각각 세포 밀도 2.5×105개/㎖ 및 5×104개/㎖가 되도록 부유시켜, 원심분리 후, 침전부를 채취했다. 이 침전에 평균 분자량 1,500돌턴의 50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜을 함유하는, 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2) 1㎖를 1분간 적하(滴下)해서 첨가하여, 37℃로 1분간 배양한 후, 전량이 50㎖가 될 때까지 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2)를 적하해서 첨가하여, 원심분리 후, 침전부를 채취했다. 이 침전을 HAT 배지에 부유시켜, 96웰 마이크로 플레이트에 200㎕/웰씩 나누어 붓고, 37℃로 2주간 배양해서 하이브리도마를 선택했다. 세포 융합은, 1회에 1마리의 마우스로부터 얻은 비장 세포를 사용하여, 동일한 방법으로 3회 실시했다. 하이브리도마가 증식한 각 웰의 배양 상청(이하, 「하이브리도마의 배양 상청」이라고 한다.)을 채취하고, 후술하는 직접법에 의한 효소 면역 검정에 제공하여, rIFN α8에 반응성을 나타내는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선별했다. 계속해서, 이 하이브리도마를, 통상적인 방법에 따라서 한계 희석을 반복해서 적용하고, rIFN α8에 친화성을 나타내는 단일클론 항체를 안정하게 산생하는 하이브리도마의 클론 α8#44, α8#59, α8#98, α8#139, α8#145를 얻었다. 또한, 하이브리도마 α8#139, 즉, mAb-IFN α8#139에 대해서는, 2008년 2월 15일자로, 일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1 중앙 제6소재의 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-11081로서 수탁되었다. 이러한 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체는, IFN α8 및 그 변이 단백질의 정성이나 정량을 위한 면역 검정용이나 이들 단백질의 정제용 항체로서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체는, 그대로, 혹은, 재조합 기술 등을 이용하여, 키메라 항체, 인간화 항체나 인간 항체를 조제하여, IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제의 유효 성분으로도 사용할 수 있다.
<직접법에 의한 항IFN α8 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝>
항원으로서 사용한 rIFN α8을, 그 단백질 농도를 2㎍/㎖로 희석하여, 50㎕/웰(rIFN α8의 단백질량: 100ng/50㎕/웰)로, 코발런트 NH 모듈(NUNC사 판매)에 첨가하여, 비스 술포숙신이미딜 수버레이트를 이용해서 흡착시켜서 고상으로 했다. 각 웰에 첨가한 rIFN α8을 함유하는 용액을 제거하고, 1% BSA 함유 PBS로 블로킹 처리 후, 처리액을 제거했다. 이 각 웰에, 상기의 하이브리도마의 배양 상청을 첨가하여, 실온에서 2시간 진탕했다. 이 배양 상청을 제거 후, 0.05% 트윈을 함유하는 PBS로 세정하고, 퍼옥시다아제(이하, 「HRP」라고 약기한다.) 표지한 토끼 항마우스 면역 글로블린(다코 사이토메이션(DAKO Cytomation)사 판매)을 첨가했다. 이 표지 항체를 함유하는 용액을 제거 후, 0.05% 트윈을 함유하는 PBS로 세정하고, 0.5mg/㎖의 o-페닐렌디아민(이하, 「o-PD」라고 약기한다.)과 0.03%의 과산화수소를 함유하는 0.1M의 인산 나트륨-시트르산 완충액(pH 5.0)을 첨가하여, 발색 반응을 실행하고, 2N H2SO4을 100㎕/웰 첨가해서 반응을 정지하고, 멀티플레이트 리더(multiplate reader)로 흡광도(OD: A490/650nm)를 측정하여, rIFN α8에 반응성을 나타내는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선별했다.
실시예 2
<래트 항IFN α8 항체 산생 하이브리도마의 조제>
10주령 BN래트의 복강 내에 실시예 1에서 사용한 rIFN α8을 항원으로 해서, 완전 프로인트 항원보강제에 혼화하여, 그 단백질량이 20㎍/마리의 비율로 복강 내에 면역했다. 그 후, 2주일 걸러 동일한 양의 항원을 불완전 항원보강제에 혼합해서 2회 접종하고, 최후의 투여로부터 1주일 후에, 보조제를 함유하지 않는 항원을, 동일한 양 추가로 정주했다. 그 3일 후에 비장을 적출하고, 분산하여 비장 세포를 얻었다. 이 비장 세포와 래트 골수종 유래의 Y3Ag 1.2.3세포(ATCC CRL1631)를 37℃로 예온해 둔 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2)에 각각 세포 밀도 2.5×105개/㎖ 및 5×104개/㎖가 되도록 부유시켜, 원심분리 후, 침전부를 채취했다. 이 침전에 평균 분자량 1,500돌턴의 50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜을 함유하는, 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2) 1㎖를 1분간 적하해서 첨가하고, 37℃로 1분간 배양한 후, 전량이 50㎖가 될 때까지 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2)를 적하해서 첨가하고, 원심분리 후, 침전부를 채취했다. 이 침전을 HAT 배지에 부유시켜, 96웰 마이크로플레이트에 200㎕/웰씩 나누어 붓고, 37℃로 2주간 배양해서 하이브리도마를 선택했다. 각 웰에 있어서의 배양 상청 중에 분비된 항체에 대해서, 후술하는 샌드위치법에 의한 효소 면역 검정에 의해 조사하여, rIFN α8에 반응성을 나타내는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선별했다. 계속해서, 이 하이브리도마에 통상적인 방법에 따라서 한계 희석을 반복해서 적용하고, 본 발명의 단일클론 항체를 안정하게 산생하는 하이브리도마의 클론 α8#Y19-1 및 α8Y36-2를 얻었다. 또한, 하이브리도마 α8Y36-2, 즉, mAb-IFN α8Y36-2에 대해서는, 2008년 2월 15일자로, 일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1 중앙 제6소재의 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-11082로서 수탁되었다. 이 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체는, IFN α8 및 그 변이 단백질의 정성이나 정량을 위한 면역 검정용이나 이들 단백질의 정제용 항체로서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체는, 그대로, 혹은, 재조합 기술 등을 이용하여, 키메라 항체, 인간화 항체나 인간 항체를 조제하여, IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제의 유효 성분으로도 사용할 수 있다.
<샌드위치법에 의한 항IFN α8 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝>
면역 플레이트(NUNC사 판매)를, 토끼 항래트 면역 글로블린(다코 사이토메이션(DAKO Cytomation)사 판매)으로 코팅하고, 하이브리도마의 배양 상청을 첨가해서, 실온에서 1∼2시간 진탕하고, 배양 상청을 제거하여, 0.05% 트윈을 함유하는 PBS로 3회 세정해서, rIFN α8을 5ng/50㎕/웰 첨가하고, 추가로 HRP 표지한 토끼 다클론 항IFN α항체(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 조제)를, 50ng/50㎕/웰 첨가했다. 실시예 1과 마찬가지로, 발색 반응을 실행하고, 멀티플레이트 리더로 흡광도(OD: A490nm/650nm)를 측정하여, rIFN α8에 반응성을 나타내는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선별했다.
실시예 3
<래트-마우스 항IFN α8 항체 산생 헤테로 하이브리도마의 조제>
10주령 BN래트의 복강 내에, 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 rIFN α8 단백질을 완전 프로인트 항원보강제에 혼화하여, 단백질량이 20㎍/마리의 비율로 복강 내에 면역했다. 그 후, 2주일 걸러 동일한 양을 2회 추가 면역하고, 최후의 면역으로부터 1주일 후에 동일한 양을 추가로 정주했다. 그 3일 후에 비장을 적출하고, 분산하여 비장 세포를 얻었다. 이 비장 세포와 마우스 골수종 유래의 SP2/O-Ag14세포(ATCC CRL1581)를 37℃로 예온해 둔 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2)에 각각 세포 밀도 2.5×105개/㎖ 및 5×104개/㎖가 되도록 부유시켜, 원심분리 후, 침전 부분을 채취했다. 이 침전에 평균 분자량 1,500돌턴의 50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜을 함유하는, 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2) 1㎖를 1분간 적하해서 첨가하고, 37℃로 1분간 배양한 후, 전량이 50㎖가 될 때까지 혈청을 함유하지 않는 RPMI1640 배지(pH 7.2)를 적하해서 첨가하고, 원심분리 후, 침전부를 채취했다. 이 침전을 HAT 배지에 부유시켜, 96웰 마이크로플레이트에 200㎕/웰씩 나누어 붓고, 37℃로 2주일 배양해서 하이브리도마를 선택했다. 각 웰에 있어서의 배양 상청 중에 분비된 항체에 대해서, 실시예 1 또는 실시예 2와 동일한 방법으로 IFN α8과의 반응성을 효소 면역 검정에 의해 조사하여, rIFN α8에 반응성을 나타내는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선별했다. 계속해서, 이 하이브리도마에, 통상적인 방법에 따라서 한계 희석을 반복해서 적용하고, 본 발명의 단일클론 항체를 안정하게 산생하는 하이브리도마의 클론 α8#S18-1 및 α8#S56-1을 얻었다. 이러한 단일클론 항체는, IFN α8 및 그 변이 단백질의 정성이나 정량을 위한 면역 검정용이나 이들 단백질의 정제용 항체로서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체는, 그대로, 혹은, 재조합 기술 등을 이용하여, 키메라 항체, 인간화 항체나 인간 항체를 조제하여, IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제의 유효 성분으로서도 사용할 수 있다.
실시예 4
<단일클론 항체의 조제>
<마우스 항IFN α8 단일클론 항체의 조제>
실시예 1의 방법에 의해 얻은 하이브리도마의 클론 α8#44, α8#59, α8#98, α8#139(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11081) 및 α8#145를, 각각 세포 밀도 약 1×106개/㎖가 되도록 무혈청 배지(인비트로젠(Invitrogen)사 판매, 상품명 「하이브리도마-SFM 컴플리트 DMP」) 또는 10%(v/v) 소 태아혈청(FCS)을 첨가한 RPMI1640 배지에 부유시켜, 배양 규모를 확대하면서, 5%(v/v) CO2 인큐베이터 중에서 37℃로 배양했다. 소기의 세포 밀도에 달한 시점에서, 하이브리도마를, 미리, 프리스탄(pristane)을 0.5㎖/마리 복강 내 주사해 둔 8주령의 BALB/c 마우스의 복강 내에, 각각 1×107개/마리 주사 접종하고, 통상의 방법으로 10일간 사육했다. 마우스로부터 복수를 채취하고, PBS로 3배 희석한 후, 황산암모늄을 50% 포화가 되도록 첨가하여, 4℃로 24시간 정치하고, 원심분리 후, 침전부를 채취했다. 침전을 PBS로 투석하고, 통상적인 방법에 의해, 프로테인 G 결합 세파로오스 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스사 판매, 상품명 「프로테인 G 세파로오스 4FF칼럼」)에 제공하여, IgG 획분을 정제했다. 이하, 하이브리도마의 클론 α8#44, α8#59, α8#98, α8#139(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11081), α8#145가 산생하는 항IFN α8 항체를, 각각 α8#44mAb, α8#59mAb, α8#98mAb, α8#139mAb, α8#145mAb라고 부른다.
<래트 혹은 래트-마우스 항IFN α8 단일클론 항체의 조제>
실시예 2에서 얻은 하이브리도마 α8#Y19-1 및 α8Y36-2(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11082), 실시예 3에서 얻은 하이브리도마 α8#S18-1 및 α8#S56-1을, 각각, 세포 밀도 약 1×106개/㎖가 되도록 무혈청 배지(인비트로젠(Invitrogen)사 판매, 상품명 「하이브리도마-SFM 컴플리트 DMP」) 또는 10%(v/v) 소 태아혈청(FCS)을 첨가한 RPMI1640 배지에 부유시켜, 배양 규모를 확대하면서, 5%(v/v) CO2 인큐베이터 중에서 37℃로 소정량의 배양 규모가 될 때까지 배양했다. 이 배양 상청을 회수하고, 농축하여, 통상적인 방법에 의해, 프로테인 G-세파로오스 4FF칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스사 판매)에 제공하여, 각각의 하이브리도마가 산생한 IgG 획분을 정제했다. 이하, 하이브리도마 α8#Y19-1, α8Y36-2(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11082), 하이브리도마 α8#S18-1 및 α8#S56-1이 산생하는 항IFN α8 항체를, 각각 α8#Y19-1mAb, α8Y36-2mAb, α8#S18-1mAb 및 α8#S56-1mAb라고 부른다.
<단일클론 항체의 특징>
이 9종류의 항체의 이소 타입을, 각 하이브리도마를 무혈청 배지로 배양한 배양 상청을 사용하여, 시판의 효소 면역 검정 키트(Zymed사 판매, 상품명 「Rat MonoAB ID kit」 또는 「Mouse MonoAB ID kit」)에 의해 결정한 결과를 표 1에 나타낸다. 또한, 이 9종류의 단일클론 항체의, 표 1 또는 2에 나타내는 IFN류 및 TNF α에 대한 반응성을, 후술하는 웨스턴 블로팅 분석에 의해 확인한 결과를 표 1 및 표 2에 함께 나타낸다. 또한, 대표적인 웨스턴 블로팅의 결과로서, 도 1에 나타내는 IFN α류를 사용하여, α8#139의 배양 상청을 이용했을 때의 웨스턴 블로팅의 패턴을 도 1에 나타낸다. 또한, 이러한 하이브리도마의 배양 상청과, 표 3에 나타내는 IFN류 또는 IFN α8의 변이체를 30 내지 70IU/㎖로 희석한 용액을 등량(等量) 혼합하여, 그 항바이러스 활성이 중화되는가(활성이 감소한다)의 여부를, FL세포에 대한 신드비스 바이러스의 세포 변성을 지표로 하는 항바이러스 활성 측정에 의해 확인했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 또한 웨스턴 블로팅은, IFN류 혹은 TNF 단백질의 밴드가 염색되었을 경우를 반응성 있음(+), 염색되지 않을 경우를 반응성 없음(-)으로 판정했다. 또한, 중화 활성은, 실질적으로 항바이러스 활성이 측정되지 않을 경우를 중화 활성 있음(+), 그 이외의 경우를 중화 활성 없음(-)으로 판정했다.
<웨스턴 블로팅 분석>
10%(w/v) SDS 수용액 0.5㎖ 및 글리세롤 1㎖로 이루어지는 혼합액에 실시예 1에서 항원으로서 사용한 rIFN α8 혹은 nIFN α2를 첨가하여, 37℃로 1시간 배양한 후, 각각의 단백질량이 10 또는 100ng/레인이 되도록 충전해서, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동했다. IFN류의 단백질의 분자량에 상당하는 약 20 내지 29킬로돌턴(이하, 「KDa」라고 약기한다.)의 범위의 겔에 함유되는 단백질을, 통상적인 방법에 의해, 니트로셀룰로오스 막에 옮기고, 비특이적인 반응을 억제하기 위해서 블로킹 용액(다이니폰 스미토모 제약사 판매, 상품명 「블록 에이스」)에 침지했다. 이 블로킹 처리한 니트로셀룰로오스 막을, 프로테인 G 세파로오스를 이용해서 정제한 9종류의 단일클론 항체 중 어느 하나를 2㎍/㎖ 함유하는 용액에, 실온에서 1시간 침지한 후, 0.05%(v/v) 트윈 20을 함유하는 50mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 세정해서 과잉 항체를 제외했다. 니트로셀룰로오스 막을, HRP 표지한 항마우스 면역 글로블린 또는 항래트 면역 글로블린(모두 다코 사이토메이션(DAKO Cytomation)사 판매) 용액에, 실온에서 1시간 침지했다. 이 막을 0.05%(v/v) 트윈 20을 함유하는 50mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 30분간 세정 후, 발색 반응은, 시판의 웨스턴 블로팅 검출 키트(GE 헬스케어 바이오사이언스사 판매, 상품명 「ECL western blotting detection reagent and Hyperfilm ECL」)를 이용해서 실행했다. 또한 분자량 마커에는, 시판의 SDS-PAGE용 분자량 마커(바이오라드사 판매, 상품명 「프레스테인 SDS-PAGE 스탠더드 브로드 레인지」, 구성: 미오신(204KDa), β-갈락토시다아제(120KDa), BSA(100KDa), 오브알부민(52KDa), 탄산무수화 효소(37KDa), 대두 트립신 억제제(29KDa), 라이소자임(20KDa) 및 아프로티닌(aprotinin)(7KDa)을 이용했다.
표 1로부터 명확한 바와 같이, 실시예 1 내지 3에서 얻은 단일클론 항체는 모두 IgG 클래스(경쇄는 κ)의 항체였다. 또한, 표 1 및 2로부터 명확한 바와 같이, 이러한 항체는, rIFN α8, nIFN α8 및 2종류의 IFN α8 변이 단백질과만 반응하고, 그 밖의 인간 IFN α 서브타입, IFN β, IFN γ, Con IFN, 마우스 IFN α/β, 래트 IFN α 및 TNF α와 반응하지 않아, 이러한 항체가 IFN α8 및 그 변이체를 특이적으로 인식하는 항체인 것이 밝혀졌다. 또한, 도 1로부터 명확한 바와 같이, 웨스턴 블로팅 분석에서는, 분자량이 20 내지 29KDa에 보이는 nIFN α8 및 rIFN α8 단백질의 밴드만이 발색하고, 다른 IFN α의 단백질의 밴드는 염색되어 있지 않으므로, α8#139mAb는, nIFN α8 및 rIFN α8 단백질 특이적으로 반응하는 것이 밝혀졌다. 또한, α8#139mAb의 nIFN α8과 rIFN α8에 대한 반응성을 비교하면, 블로팅에는, 등(等)질량의 nIFN α8과 rIFN α8의 단백질을 사용했음에도 불구하고, nIFN α8쪽이 강하게 염색되어 있으므로, 이 단일클론 항체는 재조합형보다도 천연형의 IFN α8에 대한 반응성이 강하다고 판단했다. 또한, 구체적인 웨스턴 블로팅의 패턴은 나타내지 않지만, 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 다른 8개의 하이브리도마가 산생하는 항체는, 모두 천연형, 재조합형의 IFN α8 및 IFN α8 변이 단백질과만 반응하고, 다른 IFN류나 TNF α에는 반응하지 않았다. 또한, 천연형과 재조합형 IFN α에 대한 반응성도, α8#139mAb와 동일한 패턴을 나타냈다. 또한, 표 3으로부터 명확한 바와 같이, IFN α8의 항바이러스 활성에 대한 중화 활성은, α8#139mAb 및 α8#S56-1mAb에서만 보였다. 또한, α8#139mAb 및 α8#S56-1mAb의 경우도, nIFN α2, IFN β 및 IFN γ의 항바이러스 활성에 대한 중화 활성은 보이지 않았으므로, 이 2종류의 단일클론 항체가 가지는 중화 활성은 IFN α8 특이적인 것이 밝혀졌다.
실시예 5
<IFN α8에 대한 효소 면역 검정계의 구축>
실시예 4의 방법에 의해 조제한 9종류의 단일클론 항체를 사용하여, IFN α8을 특이적으로 정량할 수 있는 효소 면역 검정계의 구축에 적합한 항체의 스크리닝을 아래와 같이 실행했다.
<항체>
실시예 4에서 조제한 9종류의 단일클론 항체, 토끼 다클론 항IFN α항체(이하, 「polyIFN α」라고 약기한다.) 및 마우스 단일클론 항IFN α항체(이하, 「mAbIFN α14」라고 약기한다.)(모두, 주식회사 하야시바라 생물화학연구소 조제)를 사용했다. 또한, polyIFN α 및 mAbIFN α14는, IFN α8 및 그 이외의 인간 IFN α 서브타입과의 반응성을 가지고 있다.
<퍼옥시다아제 표지 항체의 조제>
통상적인 방법에 따라서, 상기 11종류의 항체를, 과(過)요오드산화법에 의해 HRP 표지했다. 즉, HRP(로슈(Roche)사 판매) 10mg을 증류수 2㎖에 용해하고, 0.1M 과요오드산 나트륨 125㎕를 첨가하여 차광 하에서, 실온에서 15분간 정치했다. 그 후, 에틸렌글리콜 100㎕를 첨가 후, 차광 하에서, 실온에서 5분간, 1mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.2)에 대하여 투석한 후, HRP가 15mg/㎖ 이상이 되도록 농축했다. 이 농축한 HRP 8mg과, 미리 20mg/㎖ 이상으로 농축한 상기 11종류의 항체의 어느 하나의 10mg을 혼합하고, 물을 첨가해서 전량을 850㎕로 한 후, 0.1M 탄산수소 나트륨 완충액(pH 9.5) 150㎕를 첨가하여, pH를 약 9.3으로 조정하고, 차광 하에서, 4℃로 2시간 정치했다. 그 후, 4mg/㎖ 수소화 붕소 나트륨을 100㎕ 첨가하여, 차광 하에서, 실온에서, 3시간 정치 후, 겔 여과용 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스사 판매, 상품명 「Sephacryl S-300HR」)에 의한 겔 여과로, HRP 표지 항체 획분을 회수했다. 회수한 획분에, 소 혈청 알부민(이하, 「BSA」라고 약기한다.)을 1%가 되도록 용해하고, 막 여과(공극 크기가 0.22㎛)하여, HRP 표지 항체(이하, 「표지 항체」라고 한다.)를 조제했다.
<효소 면역 검정의 방법>
상기 HRP 표지한 11종류의 항체와, 그 표지에 사용한 11종류의 미표지 항체(이하, 「미표지 항체」라고 한다.)를 고상 항체로서 사용하여, 샌드위치법에 의한 121가지의 조합에 의한 효소 면역 검정으로, rIFN 단백질의 정량이 가능한가의 여부를 시험했다. 즉, 11종류의 미표지 항체를, 각각 항체 농도가 20㎍/㎖가 되도록 PBS로 희석하고, 그 각각을 면역 플레이트에 50㎕/웰 첨가하여, 실온에서 2시간 정치 후, 용액을 제거하고, 1% BSA를 함유하는 PBS를 첨가해서, 4℃로 하룻밤, 블로킹 처리를 실행했다. 블로킹 후, 1% BSA를 함유하는 PBS를 제거하고, rIFN α8을, 5% FCS, 1% BSA, 1M NaCl을 함유하는 PBS로 69pg/㎖∼60ng/㎖로 희석한 것의 어느 하나를, 50㎕/웰 첨가했다. 실온에서 2시간 진탕 후, 각 웰을, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세정했다. 세정에 사용한 PBS를 제거 후, 상기 11종류의 표지 항체를, 각각 5% FCS, 1% BSA, 0.15M NaCl 및 0.1% CHAPS를 함유하는 PBS로 1㎍/㎖가 되도록 희석해서, 각각을, 11종류의 미표지 항체를 고상으로 사용한 웰에, 50㎕/웰 첨가하여, 실온에서 2시간 진탕했다. 이 표지 항체를 함유하는 용액을 제거 후, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세정 후, 0.5mg/㎖의 o-페닐렌디아민(o-PD)과 0.03% H2O2를 함유하는 0.1M 인산 시트르산 완충액(pH 5.0)을 100㎕/웰 첨가해서 발색시키고, 2N H2SO4을 100㎕/웰 첨가해서 반응을 정지하여, 멀티플레이트 리더로 흡광도(OD: A490/650nm)를 측정했다. 대조로서, rIFN α8을 함유하지 않는, 5% FCS, 1% BSA, 1M NaCl을 함유하는 PBS를 첨가했을 경우의 흡광도를 마찬가지로 측정했다. 또한, 측정은 1시료에 대해서 3웰을 사용하여, 그 평균을 구했다. 또한, 측정한 흡광도에 근거한 검량선의 회귀 분석에 의한 직선성을 판정하는 상관 계수(r값)가 0.997 이상의 범위가 되는 rIFN α8 단백질의 최소 농도와, 대조의 웰을 측정했을 때의 흡광도(OD)에, 그 측정값의 표준 편차값을 3배한 값을 더한 값과, rIFN α8 단백질 최소 농도의 측정값으로부터 그 측정값의 표준 편차값을 3배한 값을 뺀 값을 비교하여, 수치가 큰 쪽에 상당하는 rIFN α8 단백질 농도를, 시험한 효소 면역 검정에 의한 rIFN α8 단백질의 검출 하한 농도로 했다.
<IFN α2와의 교차 반응성의 확인>
상기 효소 면역 검정의 방법에 있어서, rIFN α8 대신에 rIFN α2를 사용한 이외는, 완전히 동일한 방법으로, 효소 면역 검정을 실행했다. rIFN α2의 농도에 의존한 흡광도의 상승이 나타났을 경우를 교차 반응 있음(「유(有)」), 나타나지 않았을 경우를 교차 반응 없음(「무(無)」)이라고 판정했다.
<측정 결과>
11종류의 미표지 항체(고상)와 11종류의 표지 항체에 의한 121가지 조합의 효소 면역 검정 중, rIFN α8의 농도에 의존한 흡광도(OD)의 상승이 나타나고, 또한, IFN α8을 함유하지 않는 용액(5% FCS, 1% BSA, 1M NaCl)의 흡광도(OD)가 비교적 낮았던(OD가 0.4 이하), 14가지 조합만을 표 4에 나타낸다. 또한, 표 4에 나타내는 항체의 조합에서, rIFN α8 대신에, IFN α2를 사용했을 경우에 rIFN α2의 농도에 의존한 흡광도(OD)의 상승이 나타나는가의 여부(IFN α2와의 교차 반응의 유무)도 확인하여, 그 결과를 함께 표 4에 나타낸다. 또한, 상기 방법에 의해 구한, 14류의 조합에 의한 면역 검정의 검출 하한 농도(pg/㎖)를 표 4에 함께 나타낸다.
표 4에 나타내는 고상 항체와 표지 항체의 14종류의 조합에서, 효소 면역 검정을 실행했을 경우에, rIFN α8의 농도에 의존한 흡광도의 상승이 나타났다. 고상 항체로서 α8#139mAb 또는 α8Y36-2mAb를 사용한 조합에서, 검출 하한 농도가 69 또는 206pg/㎖가 되었다. 또한, polyIFN α와 α8#S56-1의 조합에서는, rIFN α2에 대한 교차 반응이 나타났다. 효소 검정은, IFN α8에 특이적이고, 또한, 검출 감도가 높고, 측정 정밀도도 높은 것이 요구되므로, IFN α2와 교차 반응이 「무」이고, rIFN α8의 검출 하한 농도가 낮고, 또한, 검량선의 경사가 크다(대조와 IFN α8 농도 50ng/㎖의 흡광도 차이가 크다)는 요건을 만족하는 조합으로서는, 고상 항체로 α8#139mAb를 사용하고, 표지 항체로서 α8Y36-2mAb 또는 mAbIFN α14를 사용하는 조합과, 고상 항체로서 α8Y36-2mAb를 사용하고, 표지 항체로서 polyIFN α를 사용했을 경우가 고려된다. 이러한 결과는, 고상 항체로서 IFN α8을 특이적으로 인식하는 α8#139m 또는 Abα8Y36-2mAb를 사용함으로써, 고감도의 IFN α8을 특이적으로 검출하는 검정계를 구축할 수 있다는 것을 말하고 있다. 그러나, 표지 항체로서 mAbIFN α14 또는 polyIFN α를 사용하면, 이러한 항체는 IFN α8 이외의 IFN α 서브타입과 반응할 가능성이 있으므로, IFN α8 서브타입 특이적인 효소 면역 검정계로서는, 고상 항체로서 α8#139mAb를 사용하고, 표지 항체로서 α8Y36-2mAb를 사용하는 조합이 특히 바람직하다고 판단했다.
실시예 6
<IFN α8 서브타입 특이적인 효소 면역 검정계에 의한 IFN α8의 검출 범위>
실시예 5에서 IFN α8의 특이적인 검출에 사용 가능하다고 판단한, 고상 항체로서 α8#139mAb를 사용하고, 표지 항체로서 α8Y36-2mAb를 사용하는 효소 면역 검정을, 후술하는 방법으로 실행하여, rIFN α8의 검량선을 작성한 결과를 도 2에 나타낸다. 또한, 이 검량선에 근거하여 산출한 이 효소 검정계에 의한 IFN α8 단백질의 검출 하한 농도를, 실시예 5에 기재한 방법에 근거하여 산출해서 표 5에 함께 나타낸다. 또한, 이 검량선의 직선성을 나타내는 상관 계수(r값)가 0.997 이상의 범위의 최대의 OD값에 상당하는 rIFN α8 단백질 농도를 구하여, 이 효소 면역 검정에 의한 rIFN α8 단백질의 검출 상한 농도로 해서 표 5에 함께 나타낸다.
<IFN α8 서브타입 특이적인 효소 면역 검정의 특이성의 확인>
상기의 고상 항체로서 α8#139mAb를 사용하고, 표지 항체로서 α8Y36-2mAb를 사용하는 효소 면역 검정계가 IFN α8 이외의 IFN류나 사이토카인 단백질을 검출하지 않는 것을 확인하기 위해서, 표 5에 나타내는 단백질 농도의 IFN류 및 사이토카인류를 이 효소 면역 검정계에 제공했을 때의 흡광도의 측정 결과를 표 5에 함께 나타낸다.
<효소 면역 검정의 방법>
고상 항체로서 α8#139mAb를, 20㎍/㎖로 PBS로 희석하여, 면역 플레이트(NUNC사 판매)에 100㎕/웰로 나누어 부었다. 실온에서 3시간 정치 후, 고상 용액을 버리고, 1% BSA를 함유하는 PBS를 250㎕/웰 첨가하여, 4℃로 하룻밤 정치해서 블로킹을 실행했다. 1% BSA를 함유하는 PBS를 제거 후, 표준품으로서, 2.5% FCS, 0.5% BSA 및 0.5M NaCl을 함유하는 PBS로, rIFN α8을 10 내지 2,000pg/㎖로 희석한 용액을 조제했다. 또한, 표 5에 나타내는 IFN류 또는 사이토카인류를 피험시료로 해서, rIFN α8의 희석에 사용한 것과 동일한 FCS, BSA 및 NaCl을 함유하는 PBS로 10ng/㎖로 희석한 용액의 어느 하나를, 100㎕/웰 첨가해서 실온에서, 3시간 진탕했다. 그 후, 표준품 용액 혹은 피험시료를 함유하는 용액을 제거 후, 0.05% 트윈 20 함유 PBS로 3회 세정했다. 세정액을 제거 후, 5% FCS, 1% BSA, 0.15M NaCl 및 0.1% CHAPS를 함유하는 PBS로 1㎍/㎖로 희석한 HRP 표지한 α8Y36-2mAb를, 100㎕/웰 첨가하여, 실온에서 2시간 진탕 후, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세정했다. 세정액을 제거 후, 0.5mg/㎖의 o-PD와 0.03% H2O2를 함유하는 0.1M 인산 시트르산 완충액(pH 5.0)을 100㎕/웰 첨가해서 발색시킨 후, 2N H2SO4을 100㎕/웰 첨가해서 발색 반응을 정지시켜서, 멀티플레이트 리더로 흡광도(OD: A490/650nm)를 측정했다. 또한, 측정은 1시료에 대해서 3웰을 사용하여, 그 평균을 구했다.
도 2로부터 명확한 바와 같이, 상기 조건에 따라서, 고상 항체로 α8#139mAb를 사용하고, 표지 항체로서 α8Y36-2mAb를 사용한 효소 면역 검정의 경우, rIFN α8이 0.05 내지 2ng/㎖(50 내지 2,000pg/㎖)의 범위에서, 그 단백질량에 비례한 흡광도에 직선적인 상승이 나타났다. 이 결과는, 이 효소 면역 검정계를 사용함으로써, 적어도 약 50 내지 2,000pg/㎖ 농도의 이 단백질을 양호한 정밀도로 검출할 수 있다는 것을 말하고 있다. 또한, 표 5로부터 명확한 바와 같이, 이 효소 면역 검정계에 의해, nIFN α8, rIFN α8 및 그 변이체 이외의 IFN α 서브타입, IFN β, IFN γ, Con IFN, 래트 IFN α, 마우스 IFN α/β, TNF α의 어느 하나를, IFN α8의 검출 하한 농도의 200배량(검출 상한 농도의 5배량)에 상당하는 10ng/㎖ 함유하는 용액을 측정해도, 그 흡광도는, 이러한 단백질을 용해한 완충액만일 경우와 차이는 보이지 않았다. 이 결과는, 이 효소 면역 검정이, IFN α8 및 그 변이체 이외의 IFN류나 사이토카인과의 교차성은 없어, IFN α8 및 그 변이체에 특이적인 효소 면역 검정계를 확립할 수 있었다는 것을 말하고 있다.
실시예 7
<방사 면역 검정에 의한 rIFN α8 단백질의 검출>
통상적인 방법에 따라서, 실시예 4의 방법에 의해 얻은 α8#139mAb를 통상적인 방법에 의해 방사 면역 검정용 폴리스티렌 비드에 흡착시켜, 2%(w/v) BSA를 함유하는 PBS 중에서, 4℃로 하룻밤 정치해서 고상 항체 비드를 조제했다.
시험관에 이 고상 항체 비드를 1개씩 넣고, 실시예 1에서 사용한 rIFN α8을 0.5%(w/v) BSA를 함유하는 PBS에 의해 적당한 농도로 희석해서 0.2㎖씩 첨가하고, 4℃로 4시간 정치했다. 고상 항체 비드를 0.05%(v/v) 트윈 20과 0.5%(w/v) BSA를 함유하는 PBS로 세정한 후, 실시예 4의 방법에 의해 얻은 α8Y36-2mAb를 통상적인 방법에 의해 125I 표지하여 0.2㎖(1×105cpm)씩 첨가해서, 4℃로 하룻밤 정치했다. 과잉의 표지 항체를 제거하고, 0.05%(v/v) 트윈 20과 0.5%(w/v) BSA를 함유하는 PBS로 세정한 후, 감마 카운터에 의해 비드의 방사능을 측정한 결과, 10 내지 1,000pg/㎖의 IFN α8 및 그 변이 단백질을 양호한 정밀도 검출할 수 있었다.
실시예 8
<효소 면역 검정에 의한 BALL-1세포 유래의 인간 nIFN α8 단백질의 정량>
인간 림프아구성 세포주의 BALL-1세포(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 소유)에 HVJ를 첨가해서 유도된 nIFN α는, nIFN α2와 nIFN α8(IFN α8b)을, 72±9:28±9의 비율(질량)로 함유하고, nIFN α7을 약간 함유하는 것이 알려져 있다(예를 들면, 시게하루 후쿠다 등(Shigeharu Fukuda et al.), 『림포카인(Lymphokine)』, 제7권, 제2호, 제175 내지 185페이지(1988년) 참조). 실시예 6에서 사용한 본 발명의 효소 면역 검정계가, 이 BALL-1세포 유래의 인간 nIFN α 중의 nIFN α8을 특이적으로 정량할 수 있는 것을 확인하기 위해서 이하의 시험을 실행했다. 즉, BALL-1세포를 햄스터의 신생아의 등부 피하에 이식하고, 증식시킨 BALL-1세포를, RPMI1640 배지에 부유시켜서, HVJ를 첨가하여 하룻밤 배양한 배양 상청에 자외선을 조사해서 HVJ를 불활화한 용액(이하, 「BALL-1 배양 상청」이라고 약기한다.), 및, 이 용액을 단일클론 항체 칼럼(론자사 판매, 상품명 「NK2-세파로오스」)으로 정제한 인간 nIFN α 표품을, 생물학적 검정 및, IFN α2 또는 IFN α8 특이적인 효소 면역 검정에 제공했다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 또한, 생물학적 검정에서는, 미리, 실시예 4에서 조제한 항IFN α8 항체(α8#139mAb)를 첨가해서 nIFN α8의 활성을 특이적으로 중화한 표품의 활성을 측정한 결과도 함께 표 6에 나타낸다. 또한, 효소 면역 검정에는, nIFN α8의 정량은, 실시예 6에서 구축한 검정계를 사용하고, nIFN α2는 시판의 IFN α 검정 키트(주식회사 JIMRO 판매, 상품명 「인간 IFN α 측정 키트」)를 사용했다. 또한, 측정은 1시료에 대해서 3웰을 사용하여, 그 평균을 구했다.
표 6으로부터 명확한 바와 같이, BALL-1 배양 상청에 함유되는 인간 nIFN α는, 생물학적 검정으로는 총 인간 IFN α 활성의 약 38%가 nIFN α8로 계산되었다. 또한, 동일한 배양 상청을, nIFN α2 및 nIFN α8에 특이적인 효소 면역 검정으로 측정했을 경우는, 총 인간 IFN α 활성의 약 40%가 nIFN α8로 계산되었다. 또한, BALL-1 배양 상청을 항체 칼럼으로 정제한 표품에서는, 생물학적 검정으로는 총 인간 IFN α 활성의 약 37%가 IFN α8로 계산되었다. 또한, 동일한 배양 상청을, nIFN α2 및 nIFN α8에 특이적인 효소 면역 검정으로 측정했을 경우도, 총 인간 IFN α 활성의 약 32%가 nIFN α8로 계산되었다. 이 효소 면역 검정에 근거한, 총 인간 IFN α 활성에 차지하는 IFN α8 활성의 비율(%)은, 생물학적 검정에 의한 활성 측정의 오차를 감안하면, 문헌값이나 이번의 생물학적 검정의 결과와 잘 일치하고 있다고 판단했다. 또한, 표에는 나타내지 않았지만, 시판의 항체 칼럼(NK2-세파로오스 칼럼)으로 정제한 표품(항체 칼럼 정제 인간 nIFN α)의 단백질량을, 브래드퍼드법(Bradford method)에 의해 측정한 결과, 184.9㎍/㎖가 되어, 효소 면역 검정의 결과로부터 계산한 nIFN α2와 nIFN α8의 합계의 단백질량 173㎍/㎖와도 거의 일치했다. 이 결과는, 본 발명의 단일클론 항체를 사용한 효소 면역 검정계는, IFN α8 단백질량을 특이적으로, 또한, 생물학적 검정과의 상관도 잘 측정할 수 있다는 것을 말하고 있다.
실시예 9
<인간 nIFN α(BALL-1세포 유래) 및 nIFN α8의 변이 단백질의 약품 동태>
인간 nIFN α(nIFN α2를 6.46㎍, nIFN α8을 1.81㎍ 함유), 실시예 6에서 사용한 IFN α8-MUT2(5.83㎍ 함유) 또는 IFN α8-MUT3(5.38㎍ 함유)을, 각각 4마리의 BALB/c 마우스(주식회사 일본 찰스리버 판매, 암컷, 9주령)에, 약 106IU/마리로 피하 투여했다. 투여 후, 경시적(經時的)으로(0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 24시간) 꼬리 정맥으로부터 혈액을 샘플링하고, 원심 후 얻어진 혈장을, 실시예 8에서 사용한 것과 동일한 IFN α2, IFN α8 특이적인 효소 면역 검정에 제공했다. 측정 결과에 근거하여, IFN α8 또는 그 변이 단백질을 투여했을 때의 각 마우스에서 있어서의 AUC(혈중 농도-시간 곡선하면적), MRT(평균 체류 시간), Cmax(최고 혈중 농도), Tmax(최고 혈중 농도 도달 시간) 및 EBA(생물학적 이용률)를 구하여, 각 IFN 표품을 투여한 4마리의 마우스의 평균을 구해서 표 7에 나타낸다. 또한, 측정은 1시료에 대해서 3웰을 사용하여, 그 평균을 구했다.
표 7로부터 명확한 바와 같이, 인간 nIFN α에 함유되어 있는 nIFN α8은 nIFN α2의 3분의 1에도 미치지 않지만, 인간 nIFN α를 마우스의 피하에 투여했을 경우, nIFN α8은 nIFN α2에 비해서, 약동력학 정수인 AUC로는 3.6배(≒1975÷553), MRT로는 1.7배(≒ 3.9÷2.4) 높았다. 또한, IFN α8 변이 단백질의 혈중 동태는, MRT나 EBA로부터 보면 nIFN α8보다도 오히려 nIFN α2를 닮아 있는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 본 발명의 IFN α8에 특이적인 효소 면역 검정계가, IFN α8이나 그 변이 단백질의 체내 동태, 분포 배설 등의 생체 내에서의 거동을 모니터링하기 위해서, 생물학적 검정보다도 적합한 검정 방법인 것을 말하고 있다.
실시예 10
<면역친화성 크로마토그래피용 겔의 조제>
실시예 4의 방법에 따라 얻은 α8#139mAb의 정제품을 80mg 넣고, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 붕산 완충액(pH 8.5)에 대하여 4℃로 하룻밤 투석했다. 수불용성 담체(GE 헬스케어 바이오사이언스사 판매, 상품명 「CNBr-활성화 세파로오스 4B」) 4g을 1mM 염산 수용액 중에서 팽윤시켜, 신선한 1mM 염산 수용액, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 붕산 완충액(pH 8.5)의 순서로 세정한 후, 상기의 단일클론 항체 수용액 약 10㎖를 첨가하여, 실온 하에서 2시간, 4℃로 또 하룻밤 완만하게 교반했다. 그 후, 겔을 1M 에탄올 아민 수용액(pH 8.0)으로 세정하고, 또한, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 붕산 완충액(pH 8.5) 및 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 아세트산 완충액(pH 4.0)을 이 순서로 이용해서 세정하는 공정을 5회 반복하고, 최후에 PBS로 세정해서 면역친화성 크로마토그래피용 겔을 얻었다. 통상적인 방법에 의해 분석한 결과, 겔 1㎖당, 약 6mg의 단일클론 항체 α8#139mAb가 결합하고 있었다.
실시예 11
<면역친화성 크로마토그래피에 의한 nIFN α8의 정제>
실시예 10에서 얻은 면역친화성 크로마토그래피용 겔 10㎖를 플라스틱제 원통관 내부에 칼럼 형상으로 충전하고, PBS로 세정 후, 일본국 특허 제112301호 공보에 기재된 방법에 의해, 면역 억제한 햄스터에게 이식해서 증식시킨 BALL-1세포에, HVJ를 첨가해서 산생시킨 인간 nIFN α를 약 0.1mg/㎖ 함유하는 획분 40㎖를 부하했다. 신선한 PBS로 세정한 후, 칼럼에, 0.3M의 NaCl을 함유하는 0.1M 시트르산 완충액(pH 1.9)을 통액하고, 항바이러스 활성이 있는 획분을 채취했다. 채취한 획분을 모아서, 농축 후, 단백질 함량을 측정한 결과, 순도 99.8% 이상의 정제 단백질이 얻어진 것이 밝혀졌다. 또한, 이 정제 단백질을, 실시예 8에서 사용한 IFN α2 혹은 IFN α8 특이적인 효소 면역 검정에 제공한 결과, IFN α2 단백질은 검출되지 않고, IFN α8만이 검출되었다. 그 단백질량은, nIFN α8의 비활성을 감안하면, 이 정제 단백질의 항바이러스 활성과 잘 일치하고, 또한, 칼럼에 부하한 인간 nIFN α에 함유되어 있는 nIFN α8의 거의 전량이 회수되어 있었으므로, 이 항체 칼럼이 IFN α8 정제용에 적합한 것이 밝혀졌다.
실시예 12
<α8#139가 산생하는 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부 영역의 cDNA 단편 클로닝과 염기서열의 동정(同定)>
하이브리도마 α8#139(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11081)가 산생하는 단일클론 항체 α8#139mAb의 중쇄 및 경쇄 가변부를 포함하는 영역의 cDNA 단편의 클로닝과 염기서열(아미노산 서열을 포함한다)의 동정을 아래와 같이 실행했다.
<RNA의 추출>
α8#139를 통상적인 방법에 의해 배양하고, 약 3×106개의 세포를 조제했다. 시판의 RNA 조제 키트(QIAGEN사 판매, 상품명 「RNeasy Mini Kit(Cat. No. 74104)」)를 이용해서 그 취급 설명서 중의 「원심법을 이용한 동물세포로부터의 토털 RNA 정제」에 따라서, 세포의 호모지네이트로부터 RNA를 추출하여, 30 내지 60㎍의 RNA를 얻었다. 또한 세포의 호모지네이트의 조제에는, 시판의 칼럼(QIAGEN사 판매, 상품명 「QIAshredder Spin Column」)을 사용하고, 그때 DNAaseI 처리는 실행하지 않았다.
<역전사효소 반응 및 PCR 반응>
역전사효소 반응 및 PCR 반응은, 시판의 키트(Invitrogen사 판매, 상품명 「SuperScript III 역전사효소(카탈로그 번호18080-044)」)를 이용하여, 그 취급 설명서 「First Strand cDNA Synthesis」에 따라서, 시판의 oligo(dT)12-18(Invitrogen사 판매, 카탈로그 번호 18418-012)을 프라이머로 해서 역전사효소 반응을 실시했다. 얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 시판의 Mouse Ig-Primer 세트(Novagen사 판매, 카탈로그 번호#69831-3)를 프라이머로 해서, PCR 반응을 실행했다. DNA 폴리메라제는, 시판품(TOYOBO사 판매, 상품명 「KOD-Plus-(카탈로그 번호 KOD-201)」, 이하, 「KOD 키트)라고 한다)을 사용했다. 또한, 이 KOD 키트로 증폭을 할 수 없었을 경우에는, 다카라 바이오사 판매, 상품명 「TaKaRa Ex Taq(code RR001A)」(이하, 「Ex Taq 키트」라고 한다.)를 사용했다. 또한, Mouse Ig-Primer 세트 중, α8#139mAb의 중쇄 가변부 영역의 DNA 증폭에는, 5'프라이머로서 6개의 프라이머 「MuIgGVH5'A∼F」와, 3'프라이머로서 1개의 프라이머 「MuIgGVH3'-2」를 이용한 조합으로 PCR를 실행했다. α8#139mAb의 경쇄 가변부 영역의 증폭에는, 5'프라이머로서 7개의 프라이머 「MuIgκVH5'A∼G」와 3'프라이머로서 1개의 프라이머 「MuIgκVL3'-1」을 사용했다. 또한 5'프라이머는 모두, 개시 코돈을 포함하는 염기서열을 포함하는 것을 사용했다. 이하에, KOD 키트와 Ex Taq 키트 사용 시의 반응 조건을 나타낸다.
<KOD 키트의 반응 조건>
KOD-Plus-(1U/㎕) 0.5㎕
10×PCR Buffer 2.5㎕
25mM MgSO4 1㎕
2mM dNTPs 2.5㎕
역전사효소 반응 후 주형 1㎕
5'프라이머:
5'A and B 프라이머의 경우 12.5pmol
혹은,
5'C-G 프라이머의 경우 5pmol
3'프라이머 2.5pmol
적량의 증류수를 첨가해서 전량을 25㎕/튜브로 한다.
이 튜브를, 94℃ 2분 처리 후, 94℃, 15초, 처리 온도*, 30초, 68℃ 1분의 3개의 온도 사이클로, 30 내지 40회 반복하여 처리하고, 4℃로 냉각한다.
처리 온도*; 5'A and B Leader 프라이머는 50℃, 5'C-G Leader 프라이머는 60℃로 실행했다.
<Ex Taq 키트의 반응 조건>
Ex Taq(5U/㎕) 0.25㎕
10×Ex Taq PCR Buffer 5㎕
2.5mM dNTPs 4㎕
역전사효소 반응 후 주형 1㎕
5'프라이머:
5'A and B 프라이머의 경우 25pmol
혹은,
5'C-G 프라이머의 경우 10pmol
3'프라이머 5pmol
적량의 증류수를 첨가해서 전량을 50㎕/튜브로 한다.
이 튜브를, 94℃, 1분, 처리 온도*, 1분, 72℃, 1분의 3개의 온도 사이클로, 30 내지 35회 반복하여 처리하고, 4℃로 냉각한다.
처리 온도*; 5'A and B Leader 프라이머는 50℃, 5'C-G Leader 프라이머는 60℃로 실행했다.
<DNA 단편 조제>
상기의 중쇄 및 경쇄 가변부 영역의 DNA를 증폭한 PCR 반응액을, 각각 아가로오스겔 전기영동에 제공하고, 약 500bp의 DNA 증폭 단편을 포함하는 겔로부터, 시판의 키트(QIAGEN 회사판매, 상품명 「QIAEX II Gel Extraction Kit」)를 사용하여, 그 취급 설명서의 「QIAEX II Agarose Gel Extraction Protocol」, 혹은, 시판의 키트(Stratagene사 판매, 상품명 「PCR-Script Cam Cloning Kit(#211192)」에 포함되는 「StrataPrep PCR Purification Kit」)를 사용하고, 그 취급 설명서의 「Purifying the PCR Products with the StrataPrep PCR Purification Kit」에 따라서, PCR 후의 반응액으로부터 PCR 증폭 단편을 정제했다. 또한, Ex Taq 키트로 증폭한 DNA 단편은, Stratagene사의 PCR-Script Cam Cloning Kit의 조작 방법 「Polishing the Purified PCR Products」에 따라서 DNA 단편의 말단의 평활화를 실행했다.
<형질 전환 및 스크리닝>
얻어진 정제 DNA 단편은, Stratagene사의 PCR-Script Cam Cloning Kit(#211192)를 이용해서 pPCR-Script Cam SK(+)Vector에 결찰하고(ligate), 동 키트의 컴피턴트 세포(competent cell) XL10-Gold를 변환했다. 계속해서 X-gal, 클로람페니콜, IPTG 함유 플레이트에 파종 후, 흰 콜로니를 픽업하고, 콜로니 다이렉트 PCR법에 의해, 목적으로 하는 크기의 인서트를 포함하는 클론을 선택했다. 목적으로 하는 크기의 단편을 포함하는 콜로니의 배양액으로부터, 시판의 플라스미드 조제 키트(QIAGEN사 판매, 상품명 「QIAprep spin Miniprep Kit(Cat No. 27106)」)를 이용해서 플라스미드를 조제했다. 이하에, 콜로니 다이렉트 PCR법의 반응 조건을 나타낸다.
<콜로니 다이렉트 PCR 반응 조건>
Ex Taq(5U/㎕) 0.05㎕
10×Ex Taq PCR Buffer 1㎕
2.5mM dNTPs 0.8㎕
T3 프라이머 10ng
T7 프라이머 10ng
증류수를 첨가해서 전량을 10㎕/튜브로 한다.
칩으로 뚫은 콜로니의 레플리카를 넣고, 튜브의 반응액에 섞는다.
이 튜브를, 94℃, 1분, 55℃, 1분, 72℃, 1분의 3개의 온도 사이클로, 30 내지 35회 반복하여 처리하고, 4℃로 냉각한다.
<시퀀스>
DNA의 염기서열은, DNA 자동 시퀀서(BECKMAN COULTER사 판매, 상품명 「CEQ8000」)를 이용하고, 벡터의 T3 프라이머(5'AATTAACCCTCACTAAAGGG3':서열표에 있어서의 서열번호 1), T7 프라이머(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3':서열표에 있어서의 서열번호 2)를 이용해서 쌍방향으로부터 시퀀싱 반응을 실행하고, 중쇄 가변부 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 클론 3개 및 경쇄 가변부 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 클론 3개를 얻어, 그 DNA의 염기서열을 결정했다. 중쇄 가변부 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 클론 3개 중 2개의 클론은 서열표에 있어서의 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을, 나머지 1개의 클론은 서열표에 있어서의 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가지고 있었다. 또한, 경쇄 가변부 영역의 서열을 포함하는 3개의 클론은, 모두 서열표에 있어서의 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지고 있었다.
<아미노산 서열>
상기 3개의 DNA의 염기서열에 근거하여, 클로닝에 사용한 5'프라이머 부분의 아미노산 서열에 이어지는, α8#139mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변부 영역을 포함하는 아미노산 서열을 추정한 결과를, 각각, 서열표에 있어서의 서열번호 6 내지 8로 표시되는 아미노산 서열로 나타낸다. 또한, 기지의 중쇄 및 경쇄의 불변영역의 아미노 말단의 아미노산 서열에 근거하여, 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단의 아미노산을 결정하고, α8#139mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변부 영역의 아미노산 서열을 결정하여, 각각 서열표에 있어서의 서열번호 9 내지 11로 표시되는 아미노산 서열로 나타낸다. 서열표에 있어서의 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열 중, 아미노 말단으로부터 37번째의 페닐알라닌(Phe)이 이소로이신(Ile)으로, 79번째의 이소로이신(Ile)이 트레오닌(Thr)으로 치환된 서열을 가지고 있었다. 얻어진 클론의 수로 보면, α8#139mAb의 중쇄 가변 부위의 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 일부의 항체는, 서열표에 있어서의 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 있다는 것을 말하고 있다.
실시예 13
<α8Y36-2가 산생하는 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부 영역의 cDNA 단편 클로닝과 염기서열의 동정>
하이브리도마 α8Y36-2(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11082)가 산생하는 단일클론 항체 α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄 가변부 영역의 cDNA 단편의 클로닝과 염기서열(아미노산 서열을 포함한다)의 동정을, 아래와 같이 실행했다. 즉, α8Y36-2를 통상적인 방법에 의해 배양하여, 약 3×106개의 세포를 조제했다. RNA의 추출 이후의 조작은, 실시예 12와 동일한 방법으로 실행했다. 중쇄의 가변부 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 클론 3개 및 경쇄 가변부 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 클론 2개를 얻어, 그 DNA의 염기서열을 결정했다. 중쇄의 가변부 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 클론 3개 중 2개의 클론은 서열표에 있어서의 서열번호 12로 표시되는 염기서열을, 나머지 1개의 클론은 서열표에 있어서의 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 가지고 있었다. 또한, 경쇄 가변부 영역의 서열을 포함하는 2개의 클론은, 모두 서열표에 있어서의 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 가지고 있었다.
<아미노산 서열>
상기 3개의 DNA의 염기서열에 근거하여, 클로닝에 사용한 5'프라이머 부분의 아미노산 서열에 이어지는, α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변부 영역을 포함하는 아미노산 서열을 추정한 결과를, 각각, 서열표에 있어서의 서열번호 15 내지 17로 표시되는 아미노산 서열로 나타낸다. 또한, 기지의 중쇄 및 경쇄의 불변영역의 아미노 말단의 아미노산 서열에 근거하여, 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단의 아미노산을 결정하고, α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변부 영역의 아미노산 서열을 결정하여, 각각 서열표에 있어서의 서열번호 18 내지 20으로 표시되는 아미노산 서열로 나타낸다. 서열표에 있어서의 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열 중, 아미노 말단으로부터 19번째의 글리신(Gly)이 아스파라긴산(Asp)으로 치환된 서열을 가지고 있었다. 얻어진 클론의 수로 보면, α8Y36-2mAb의 중쇄 가변 부위의 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 일부의 항체는, 서열표에 있어서의 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 있다는 것을 말하고 있다.
또한, 실시예 12 및 13의 결과는, α8#139mAb 및 α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위의 DNA의 염기서열 및 아미노산 서열을 이용하여, 그대로, 그 부분 서열을 이용하여, 혹은, 그 아미노산의 1 내지 100개 정도를, 결실, 부가, 치환하는 등으로 해서, 재조합체를 조제하고, 인간 IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 인식하는, IFN α8의 정량·정성, IFN α8의 정제, 또, IFN α8이 관여하는 질환 치료제, 임상진단약 등으로서 사용하는 키메라 항체, 인간화 항체, 혹은, 인간 항체를 공지의 방법(예를 들면, 일본국 특개 2004-533217호 공보나 일본국 특개 2007-252372호 공보)에 의해 조제하는 것도 유리하게 실시할 수 있다는 것을 말하고 있다.
또한, 실시예 12 및 13에서 얻어진 α8#139mAb 및 α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카바트(Kabat) 등의 방법(NIH 출판, No. 91-3242, 제I권, 647 내지 669페이지(1991년) 참조)에 의해, α8#139mAb 및 α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위 중에 각각 3개소 존재하는, 초가변 부위의 아미노산 서열을 결정했다. α8#139mAb의 중쇄의 초가변 부위는, 각각 서열표에 있어서의 서열번호 21 내지 23으로 표시되는 아미노산 서열이며, 경쇄의 초가변 부위는, 각각 서열표에 있어서의 서열번호 24 내지 26으로 표시되는 아미노산 서열인 것이 밝혀졌다. 또한, α8Y36-2mAb 중쇄 및 경쇄의 초가변 부위는, 각각 서열표에 있어서의 서열번호 27 내지 29로 표시되는 아미노산 서열이며, 경쇄의 초가변 부위는, 각각 서열표에 있어서의 서열번호 30 내지 32로 표시되는 아미노산 서열인 것이 밝혀졌다. 이 결과는, α8#139mAb 및 α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄가 가지는, 그 항체의 특이성을 규정하는 초가변 부위의 DNA의 염기서열 및 아미노산 서열을 이용하여, 그러한 아미노산 서열에, 1 내지 100개 정도의 아미노산을 부가하고, 또, 초가변 부위의 아미노산을 적당히 결실, 부가, 치환하여, 재조합체를 조제하고, 인간 IFN α8 및 그 변이 단백질을 특이적으로 인식하는, IFN α8의 정량·정성, IFN α8 정제, 또, IFN α8이 관여하는 질환 치료제, 임상진단약 등으로서의 사용에 적합한 키메라 항체, 인간화 항체, 혹은, 인간 항체를 조제하는 것도 유리하게 실시할 수 있다는 것을 말하고 있다.
실시예 14
<치료제>
실시예 4의 방법에 의해 조제한 9종류의 단일클론 항체의 어느 하나를 150mg/㎖, α,α-트레할로오스(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조, 파이로젠 프리)를 140mg/㎖, L-염산 히스티딘을 3.4mg/㎖, L-히스티딘을 2.2mg/㎖ 및, 트윈 20을 0.6mg/㎖가 되도록 정제수에 용해하여, 1㎖씩 바이알에 나누어 붓고, 통상적인 방법에 의해, 9종류의 주사용 동결 건조 제제를 조제했다. 이 제품은, 사용 시에 생리식염수에 용해해서 주사제로 하여 사용할 수 있다. 이 제품은, IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제로서 유용하다. 이 9종류의 건조 제제를, 각각 생리식염수로 용해하고, 각 제제를, 각각 5마리의 래트(평균 체중 123g/마리)에, 1일 1회, 7일간 매일, 5㎖/마리(단일클론 항체로서 750mg/마리/회) 복강 내 투여하여, 체중을 매일 측정했다. 대조로서, 5마리의 래트(평균 체중 127g/마리)에, 1일 1회, 7일간 매일, 생리식염수를 5㎖/마리 복강 내 투여하여, 체중을 매일 측정했다. 각 제제를 투여한 래트의 체중과 대조의 래트의 체중을 비교한 결과, 어느 제제를 투여했을 경우에도, 대조와 차이는 보이지 않았다. 또한, 외관적인 관찰로도, 각 제제를 투여한 래트 및 대조의 래트에, 이상은 조금도 보이지 않았다.
실시예 15
<치료제>
실시예 12에서 얻은 α8#139mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위를 포함하는 영역을 코딩하는 염기서열(서열표에 있어서의 서열번호 3 내지 5) 및 가변 부위의 아미노산 서열(서열표에 있어서의 서열번호 9 내지 11)에 근거하여, 통상적인 방법에 의해 인간화 항체를 조제하여, 순도 99.98% 이상으로 정제 후, 그 항체를 200mg/㎖, α,α-트레할로오스(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조, 파이로젠 프리)를 140mg/㎖, L-염산 히스티딘을 3.4mg/㎖, L-히스티딘을 2.2mg/㎖ 및, 트윈 20을 0.6mg/㎖가 되도록 정제수에 용해하여, 1㎖씩 바이알에 나누어 붓고, 통상적인 방법에 의해, 동결 건조 제제를 조제했다. 이 제품은, 사용 시에 생리식염수에 용해해서 주사제로 하여 사용할 수 있다. 이 제품은, IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제로서 유용하다. 이 제품을 생리식염수로 용해하고, 5마리의 마우스(평균 체중 23g/마리)에, 1일 1회, 7일간 매일, 0.5㎖/마리(단일클론 항체로서 100mg/마리/회) 정맥 내 투여하여, 체중을 매일 측정했다. 대조로서, 5마리의 마우스(평균 체중 24g/마리)에, 1일 1회, 7일간 매일, 생리식염수를 0.5㎖/마리 정맥 내 투여하여, 체중을 매일 측정했다. 이 제품을 투여한 마우스와 대조의 마우스의 체중을 비교한 결과, 차이는 보이지 않았다. 또한, 외관적인 관찰로도, 이 제품을 투여한 마우스 및 대조의 마우스에, 이상은 조금도 보이지 않았다.
실시예 16
<치료제>
실시예 13에서 얻은 α8Y36-2mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위를 포함하는 영역을 코딩하는 염기서열(서열표에 있어서의 서열번호 12 내지 14) 및 그 아미노산 서열(서열표에 있어서의 서열번호 18 내지 20)에 근거하여, 통상적인 방법에 의해 인간화 항체를 조제하여, 순도 99.98% 이상으로 정제 후, 그 항체를 200mg/㎖, α,α-트레할로오스(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조, 파이로젠 프리)를 140mg/㎖, L-염산 히스티딘을 3.4mg/㎖, L-히스티딘을 2.2mg/㎖ 및, 트윈 20을 0.6mg/㎖가 되도록 정제수에 용해하여, 1㎖씩 바이알에 나누어 붓고, 통상적인 방법에 의해, 동결 건조 제제를 조제했다. 이 제품은, 사용 시에 생리식염수에 용해해서 주사제로 하여 사용할 수 있다. 이 제품은, IFN α8이 발증이나 악화에 관여하는 각종 질환의 치료제로서 유용하다. 이 제품을 생리식염수로 용해하고, 5마리의 마우스(평균 체중 23g/마리)에, 1일 1회, 7일간 매일, 0.5㎖/마리(단일클론 항체로서 100mg/마리/회) 정맥 내 투여하여, 체중을 매일 측정했다. 대조로서, 5마리의 마우스(평균 체중 23g/마리)에, 1일 1회, 7일간 매일, 생리식염수를 0.5㎖/마리 정맥 내 투여하여, 체중을 매일 측정했다. 이 제품을 투여한 마우스와 대조의 마우스의 체중을 비교한 결과, 차이는 보이지 않았다. 또한, 외관적인 관찰로도, 이 제품을 투여한 마우스 및 대조의 마우스에, 이상은 조금도 보이지 않았다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 단일클론 항체는, IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적으로 반응한다. 따라서, 본 발명의 단일클론 항체는, 이와 같은 IFN α8 및 그 변이 단백질의 검출 및 정제 등에 다종다양한 용도를 가지는 것이 된다. 이처럼 유용한 본 발명의 단일클론 항체는, 하이브리도마를 이용하는 제조 방법 등에 의해, 소망량을 용이하게 얻을 수 있다. 본 발명은, 이처럼 현저한 작용 효과를 발휘하는 것이며, 이 업계에 공헌하는 바가 매우 다대한 의의가 있는 발명이라 할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
<120> Monoclonal antibodies specific for human interferon-alpha subtype alpha8 and its mutants proteins
<130> 101184PCT
<160> 32
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aattaaccct cactaaaggg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 3
<211> 400
<212> DNA
<213> murine
<400> 3
c ctg gtg aca ttc cca agc tgt gtc cta tcc cag gtg cag ctg aag cag 49
Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
1 5 10 15
tca gga cct ggc cta gtg cag ccc tca cag agc ctg tcc atc acc tgc 97
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
20 25 30
aca gtc tct ggt ttc tca tta act agc tat ggt gta cac tgg att cgc 145
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Ile Arg
35 40 45
cag tct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg gga gtg ata tgg agt ggt 193
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
50 55 60
gga aac aca gac tat aat gca gct ttc att tcc aga ctg agc atc acc 241
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr
65 70 75 80
aag gac aat tcc aag agc caa ttt ttc ttt aaa atg aac agt ctg caa 289
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Phe Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
85 90 95
gct aaa gac aca gcc ata tat tac tgt gcc aga ggt aga ggg aat tac 337
Ala Lys Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr
100 105 110
gtt ccc ttt act tat tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca 385
Val Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
gcc aaa acg aca ccc 400
Ala Lys Thr Thr Pro
130
<210> 4
<211> 400
<212> DNA
<213> murine
<400> 4
c ctg gtg aca ttc cca agc tgt gtc cta tcc cag gtg cag ctg aag cag 49
Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
1 5 10 15
tca gga cct ggc cta gtg cag ccc tca cag agc ctg tcc atc acc tgc 97
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
20 25 30
aca gtc tct ggt atc tca tta act agc tat ggt gta cac tgg att cgc 145
Thr Val Ser Gly Ile Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Ile Arg
35 40 45
cag tct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg gga gtg ata tgg agt ggt 193
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
50 55 60
gga aac aca gac tat aat gca gct ttc att tcc aga ctg agc acc acc 241
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Thr Thr
65 70 75 80
aag gac aat tcc aag agc caa ttt ttc ttt aaa atg aac agt ctg caa 289
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Phe Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
85 90 95
gct aaa gac aca gcc ata tat tac tgt gcc aga ggt aga ggg aat tac 337
Ala Lys Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr
100 105 110
gtt ccc ttt act tat tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca 385
Val Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
gcc aaa acg aca ccc 400
Ala Lys Thr Thr Pro
130
<210> 5
<211> 388
<212> DNA
<213> murine
<400> 5
c ctg cta atc agt gcc tca gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc 49
Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu
1 5 10 15
acc cag tct cca aca atc atg tct gca tct cta ggg gaa cgg gtc acc 97
Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr
20 25 30
atg acc tgc act gcc agc tca agt gta agt tcc act tac ttg cac tgg 145
Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu His Trp
35 40 45
tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc ttg att tat agc aca 193
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr
50 55 60
tcc aac ctg gct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct 241
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
65 70 75 80
ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc aac atg gag gct gaa gat gct 289
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala
85 90 95
gcc act tat tac tgc cac cag tat cat cgt tcc cca ccc atg acg ttc 337
Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Met Thr Phe
100 105 110
ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act 385
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
115 120 125
gta 388
Val
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> murine
<400> 6
Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
20 25 30
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Ile Arg
35 40 45
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
50 55 60
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr
65 70 75 80
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Phe Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
85 90 95
Ala Lys Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr
100 105 110
Val Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
Ala Lys Thr Thr Pro
130
<210> 7
<211> 133
<212> PRT
<213> murine
<400> 7
Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
20 25 30
Thr Val Ser Gly Ile Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Ile Arg
35 40 45
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
50 55 60
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Thr Thr
65 70 75 80
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Phe Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
85 90 95
Ala Lys Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr
100 105 110
Val Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
Ala Lys Thr Thr Pro
130
<210> 8
<211> 129
<212> PRT
<213> murine
<400> 8
Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu
1 5 10 15
Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr
20 25 30
Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu His Trp
35 40 45
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr
50 55 60
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
65 70 75 80
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Met Thr Phe
100 105 110
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
115 120 125
Val
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> murine
<400> 9
Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
20 25 30
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Ile Arg
35 40 45
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
50 55 60
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr
65 70 75 80
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Phe Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
85 90 95
Ala Lys Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr
100 105 110
Val Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
<210> 10
<211> 128
<212> PRT
<213> murine
<400> 10
Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
20 25 30
Thr Val Ser Gly Ile Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Ile Arg
35 40 45
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
50 55 60
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Thr Thr
65 70 75 80
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Phe Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
85 90 95
Ala Lys Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr
100 105 110
Val Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> murine
<400> 11
Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu
1 5 10 15
Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr
20 25 30
Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu His Trp
35 40 45
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr
50 55 60
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
65 70 75 80
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Met Thr Phe
100 105 110
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120
<210> 12
<211> 388
<212> DNA
<213> rat
<400> 12
t gtc ctt tta ata aaa ggt gtt cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct 49
Val Leu Leu Ile Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
1 5 10 15
ggg gga ggc tta gtg cag ccc gga agg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca 97
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
20 25 30
gcc tca gga ttc act ttc agt aaa tat ggc atg gcc tgg gtc cgc cag 145
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln
35 40 45
gct cca acg aag ggt ctg gag tgg gtc gca tcc att agt act ggt ggt 193
Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly
50 55 60
tac aac act tac tat cga gac tcc gtg aag ggc cga ttc act att tcc 241
Tyr Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
65 70 75 80
aga gat aat gca aaa aac acc caa tac ctg caa atg gac agt ctg agg 289
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg
85 90 95
tct gag gac acg gcc act tat tac tgt aca aga ccc ccc gcg ttt gat 337
Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Pro Ala Phe Asp
100 105 110
cac tgg ggc caa gga atc atg gtc aca gtc tcc tca gct gaa aca aca 385
His Trp Gly Gln Gly Ile Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr
115 120 125
gcc 388
Ala
<210> 13
<211> 388
<212> DNA
<213> rat
<400> 13
t gtc ctt tta ata aaa ggt gtt cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct 49
Val Leu Leu Ile Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
1 5 10 15
ggg gga gac tta gtg cag ccc gga agg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca 97
Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
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Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln
35 40 45
gct cca acg aag ggt ctg gag tgg gtc gca tcc att agt act ggt ggt 193
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50 55 60
tac aac act tac tat cga gac tcc gtg aag ggc cga ttc act att tcc 241
Tyr Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
65 70 75 80
aga gat aat gca aaa aac acc caa tac ctg caa atg gac agt ctg agg 289
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg
85 90 95
tct gag gac acg gcc act tat tac tgt aca aga ccc ccc gcg ttt gat 337
Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Pro Ala Phe Asp
100 105 110
cac tgg ggc caa gga atc atg gtc aca gtc tcc tca gct gaa aca aca 385
His Trp Gly Gln Gly Ile Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr
115 120 125
gcc 388
Ala
<210> 14
<211> 363
<212> DNA
<213> rat
<400> 14
ctc cca gcc atg aga tgt gac atc aag atg acc cag tct cct tca ttc 48
Leu Pro Ala Met Arg Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe
1 5 10 15
ctg tct gca tct gtg gga gac aga gtc act atc aac tgc aaa gca agt 96
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser
20 25 30
cag aat att gac aag tac tta aac tgg tat cag caa aag ctt gga aaa 144
Gln Asn Ile Asp Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys
35 40 45
gct ccc aga ctc ctg atg tat aat aca aac aat ttg caa acg ggc atc 192
Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile
50 55 60
cca tca agg ttc agt ggc agt gga tct act act gat ttc aca ctc acc 240
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agc agc ctg cag cct gaa gat gtt gcc aca tat ttc tgc tcg cac 288
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Ser His
85 90 95
cat agt gtt agg ccg tat acg ttt gga gct ggg acc aag ctg gaa ctg 336
His Ser Val Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
aaa cgg gct gat gct gca cca act gta 363
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
115 120
<210> 15
<211> 129
<212> PRT
<213> rat
<400> 15
Val Leu Leu Ile Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
20 25 30
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln
35 40 45
Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly
50 55 60
Tyr Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ala
<210> 16
<211> 129
<212> PRT
<213> rat
<400> 16
Val Leu Leu Ile Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
1 5 10 15
Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
20 25 30
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln
35 40 45
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115 120 125
Ala
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<212> PRT
<213> rat
<400> 17
Leu Pro Ala Met Arg Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe
1 5 10 15
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser
20 25 30
Gln Asn Ile Asp Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys
35 40 45
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<212> PRT
<213> rat
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Val Leu Leu Ile Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
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<212> PRT
<213> rat
<400> 19
Val Leu Leu Ile Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
20 25 30
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln
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50 55 60
Tyr Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
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115 120
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<212> PRT
<213> rat
<400> 20
Leu Pro Ala Met Arg Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe
1 5 10 15
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser
20 25 30
Gln Asn Ile Asp Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys
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100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> murine
<400> 21
Ser Tyr Gly Val His
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<212> PRT
<213> murine
<400> 22
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<212> PRT
<213> murine
<400> 23
Gly Arg Gly Asn Tyr Val Pro Phe Thr Tyr
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> murine
<400> 24
Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu His
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<213> murine
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<213> murine
<400> 26
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<213> rat
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Lys Tyr Gly Met Ala
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<211> 9
<212> PRT
<213> rat
<400> 32
Ser His His Ser Val Arg Pro Tyr Thr
1 5
Claims (14)
- 항인간 인터페론(IFN) α 단일클론 항체로써, 인간 IFN α 서브타입 α8(IFN α8) 및 그 변이 단백질과의 결합 능력을 가지고, 인간 IFN α 서브타입 α1, α2, α5, α6, α10, 컨센서스 IFN, 인간 IFN β, 인간 IFN γ, 마우스 IFN α/β, 래트 IFN α 및 인간 종양괴사인자(TNF α)와 실질적으로 결합하지 않는 단리(單離)된 단일클론 항체.
- 청구항 1에 있어서,
인간 IFN α8 및 그 변이 단백질의 정량에 사용하는 단일클론 항체. - 청구항 1에 있어서,
인간 IFN α8 및 그 변이 단백질의 정제에 사용하는 단일클론 항체. - 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항에 있어서,
인간 IFN α8의 변이 단백질이, 인간 IFN α 서브타입 α8b의 아미노산 서열의 아미노 말단의 시스테인 잔기로부터 145번째의 아르기닌 잔기를 이소로이신 잔기 또는 로이신 잔기로, 146번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 149번째의 메티오닌 잔기를 티로신 잔기로 치환한 아미노산 서열을 가지는 단일클론 항체. - 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 한 항에 있어서,
중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 21, 22, 23, 27, 28 및 29로 표시되는 아미노산 서열의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체. - 청구항 1 내지 청구항 5 중의 어느 한 항에 있어서,
경쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 24, 25, 26, 30, 31 또는 32로 표시되는 아미노산 서열의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체. - 청구항 1 내지 청구항 6 중의 어느 한 항에 있어서,
중쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 9, 10, 18 및 19로 표시되는 아미노산 서열의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체. - 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 있어서,
경쇄 가변영역에 서열표에 있어서의 서열번호 11 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체. - 청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 한 항에 있어서,
하이브리도마 mAb-IFN α8#139(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11081) 또는 mAb-IFN α8Y36-2(독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁 번호 FERM BP-11082)가 산생하는 단일클론 항체가, 상기 단일클론 항체의 항원 결합 부위와 상동(相同)의 결합 부위를 가지는 단일클론 항체. - 청구항 1 내지 청구항 9 중의 어느 한 항에 있어서,
인간 IFN α8 및 그 변이 단백질의 항바이러스 활성에 대한 중화 능력을 가지는 단일클론 항체. - 인간 IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적인 정량 방법에 있어서, 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 기재한 단일클론 항체로부터 선택되는 어느 1종 또는 2종을 이용하는 정량 방법.
- 인간 IFN α8 및 그 변이 단백질에 특이적인 정제 방법에 있어서, 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 기재한 단일클론 항체로부터 선택되는 어느 하나를 담체에 고정화한 항체 칼럼을 사용하는 공정을 포함하는 정제 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 기재한 단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마.
- 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 기재한 단일클론 항체 또는 그 항원 인식 부위를 가지는 단편을 포함하는 의약조성물 또는 임상진단약.
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