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KR20100111283A - 개선된 피브로넥틴계 결합 분자 및 그들의 용도 - Google Patents

개선된 피브로넥틴계 결합 분자 및 그들의 용도 Download PDF

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KR20100111283A
KR20100111283A KR1020107016774A KR20107016774A KR20100111283A KR 20100111283 A KR20100111283 A KR 20100111283A KR 1020107016774 A KR1020107016774 A KR 1020107016774A KR 20107016774 A KR20107016774 A KR 20107016774A KR 20100111283 A KR20100111283 A KR 20100111283A
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프랑크 콜빙거
카렌 제인 빈센트
바르바라 브란네띠
슈테판 에베르트
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노파르티스 아게
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Publication date
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Abstract

본 발명은 피브로넥틴계 결합 분자, 및 공여 CDR을 피브로넥틴계 결합 스캐폴드, 특히, Fn3 내로 도입하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 특히 포유동물 세포 내에서 개선된 반감기 및 안정성을 위해 다른 모이어티, 예를 들어, Fc, 항-FcRn, HSA, 항-HSA, 및 PEG에 추가로 컨쥬게이팅될 수 있다. 본 발명은 또한 표적 항원에 대한 결합에 대해 상기 분자를 스크리닝하는 방법, 및 후보 바인더의 제조 및 정제 방법을 제공한다.

Description

개선된 피브로넥틴계 결합 분자 및 그들의 용도{IMPROVED FIBRONECTIN-BASED BINDING MOLECULES AND THEIR USE}
관련 정보
본원은 2007년 12월 27일 출원된 미국 특허 가출원 61/009,361을 기초로 한 우선권을 주장한다. 본원 명세서 전체에 걸쳐서 언급되는 임의의 특허, 특허 출원 및 참조문은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
목적하는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 분자는 치료적 및 의학적 진단 도구 모두로서 대단히 중요하다. 상기 분자 클래스의 예는 모노클로날 항체이다. 거의 모든 구조적 에피토프에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 항체가 선택될 수 있다. 그 결과, 항체는 치료 및 진단용 모노클로날 항체의 전세계 시장이 현재 미화 300억 달러에 이를 정도로 연구 도구로서 및 FDA 승인 치료제로서 통상적으로 사용되고 있다.
그러나, 모노클로날 항체에는 단점이 많다. 예를 들어, 고전적인 항체는 크고 복잡한 분자이다. 이들은 사슬간 및 사슬내 디술피드 연결 모두에 의해 함께 연결된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 이종사량체 (heterotetramer) 구조를 갖는다. 이러한 구조적 복잡성은 항체 또는 다중특이적 항체, 예를 들어 2개의 상이한 분자 치료 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 분자의 쉬운 발현을 방해한다. 또한, 항체의 큰 크기는 그들의 치료 유효성을 제한하고, 그 이유는 이들 항체가 종종 특정 조직 공간을 효율적으로 통과할 수 없기 때문이다. 또한, 치료 항체는 Fc 구역을 갖기 때문에 때때로 바람직하지 않은 효과기 세포 기능 및/또는 혈액 응고 캐스케이드를 촉발한다.
따라서, 당업계에서는 높은 친화도 및 특이성으로 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 대체 결합 분자가 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명에서는 피브로넥틴계 결합 분자, 및 공여 CDR을 피브로넥틴계 결합 스캐폴드 (scaffold), 특히, Fn3 내로 도입하기 위한 방법을 제공함으로써 상기한 문제를 해결한다. 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 개선된 반감기 및 안정성을 위해 추가로 공학처리되거나 다른 모이어티 (moiety), 예를 들어, PEG, Fc, HSA, 항-HSA에 컨쥬게이팅될 수 있다. 본 발명은 또한 표적 항원에 대한 결합에 대해 상기 분자를 스크리닝하는 방법, 및 후보 바인더 (binder)의 제조 및 정제를 위한 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 Fn3계 결합 분자가 생체 내에서, 특히 포유동물 세포, 예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 인간 세포 또는 그로부터 유도된 세포주 내에서 성공적으로 발현됨을 처음으로 입증한다. 또한, 본 발명은 공학처리되거나 다른 모이어티, 예를 들어 PEG, Fc, HSA, 항-HSA에 컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자가 포유동물 세포 내에서 또한 성공적으로 발현되고 분자 반감기 증가의 목적하는 생리학적 효과를 보임을 입증한다.
따라서, 본 발명은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 몇몇 잇점이 있다:
- 그들의 작은 크기 및 면역원성 결여로 인해 치료제로서 적합한 피브로넥틴계 결합 분자, 예를 들어, 변형된 피브로넥틴계 결합 분자의 제공;
- 반감기가 연장된 피브로넥틴계 결합 분자의 제공;
- 바람직한 기능적 모이어티, 예를 들어 차단 모이어티, 검출가능한 모이어티, 진단 모이어티, 또는 치료 모이어티를 연결하기 위한 부위를 또한 제공하면서 피브로넥틴계 결합 분자의 제공; 및
- 진단 또는 치료를 위한 피브로넥틴계 결합 분자를 필요로 하는 대상의 치료 방법.
한 측면에서, 본 발명은 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하는 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 제공하고, 여기서 루프 구역 서열은 특이적 표적에 결합하는 비-Fn3 결합 서열 (즉, 외인성 결합 서열)을 포함한다. 일반적으로, 결합 분자는 기능적 모이어티를 부착하기 위해 야생형 피브로넥틴 타입 III (Fn3) 분자 (서열 1)에 비해 적어도 하나의 변형된 아미노산 잔기를 더 포함한다.
특정 실시태양에서, Fn3계 결합 분자 내의 비-Fn3 결합 서열은 상보성 결정 구역 (CDR), 예를 들어 항체, 특히 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체 또는 카멜리드 나노바디 (nanobody)의 CDR의 전부 또는 일부를 포함한다. CDR은 CDR1, CDR2, CDR3 구역, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 그러한 비-Fn3 결합 서열은 세포 수용체, 세포 수용체 리간드, 성장 인자, 인터류킨, 세균, 또는 바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 표적에 결합하도록 선택될 수 있다.
Fn3계 결합 분자 내의 변형된 아미노산 잔기는 예를 들어, 적어도 하나의 시스테인 잔기 또는 비-천연 아미노산 잔기에 의한 적어도 하나의 Fn3 아미노산 잔기의 부가 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 시스테인 또는 비-천연 아미노산 잔기는 루프 구역, 베타-가닥 구역, 베타 유사 가닥, C-말단 구역 내에, C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이에, N-말단 구역 내에, 및/또는 N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이에 위치한다. 특정 실시태양에서, 변형된 아미노산 잔기는 하나 이상의 다음 잔기의 치환을 포함한다: Ser 17, Ser 21, Ser 43, Ser 60, Ser 89, Val 11, Leu 19, Thr 58 및 Thr 71. 다른 측면에서, 본 발명은 비-Fn3 폴리펩티드에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하고, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하고, 여기서 루프 구역은 특이적 표적에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 루프 구역은 특이적 표적에 결합하는 외인성 결합 서열을 포함한다.
일반적으로, 비-Fn3 폴리펩티드는 제2 표적에 결합하고/하거나 생체 내에 투여될 때 Fn3계 결합 분자의 안정성 (즉, 반감기)를 증가시킬 수 있다. 적합한 비-Fn3 폴리펩티드는 항체 Fc 구역, 인간 혈청 알부민 (HSA) (또는 그의 일부), 및/또는 예를 들어, 트랜스페린과 같은 반감기가 증가된, HSA 또는 다른 혈청 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
비-Fn3 모이어티는 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 더 길도록 컨쥬게이트의 반감기를 증가시킨다. 컨쥬게이트의 반감기는 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 2-5시간, 5-10시간, 10-15시간, 15-20시간, 20-25시간, 25-30시간, 35-40시간, 45-50시간, 50-55시간, 55-60시간, 60-65시간, 65-70시간, 75-80시간, 80-85시간, 85-90시간, 90-95시간, 95-100시간, 100-150시간, 150-200시간, 200-250시간, 250-300시간, 350-400시간, 400-450시간, 450-500시간, 500-550시간, 550-600시간, 600-650시간, 650-700시간, 700-750시간, 750-800시간, 800-850시간, 850-900시간, 900-950시간, 950-1000시간, 1000-1050시간, 1050-1100시간, 1100-1150시간, 1150-1200시간, 1200-1250시간, 1250-1300시간, 1300-1350시간, 1350-1400시간, 1400-1450시간, 1450-1500시간 더 길다. 컨쥬게이트의 반감기는 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 또는 1000배 더 길다.
한 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 Fn3계 결합 분자에 융합된 항체 Fc 구역이다. 상기 컨쥬게이트의 반감기는 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5-30배 더 길고, 컨쥬게이트의 생체내 반감기는 적어도 9.4시간이다. 또 다른 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 Fn3계 결합 분자에 연결된 혈청 알부민 또는 트랜스페린, 또는 그의 일부이다. 상기 컨쥬게이트의 반감기는 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 25-50배 더 길고, 컨쥬게이트의 생체내 반감기는 적어도 19.6시간이다. 또 다른 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 Fn3계 결합 분자에 연결된 항-혈청 알부민 또는 항-트랜스페린, 또는 그의 일부이다. 상기 컨쥬게이트의 반감기는 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 10-35배 더 길고, 컨쥬게이트의 생체내 반감기는 적어도 7.7시간이다. 또 다른 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 Fn3계 결합 분자에 연결된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 상기 컨쥬게이트의 반감기는 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5-25배 더 길고, 컨쥬게이트의 생체내 반감기는 적어도 3.6시간이다.
한 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 N-말단 구역 또는 C-말단 구역에서 Fn3계 결합 분자에 융합된 항체 Fc 구역을 포함한다. 항체 Fc 구역은 또한 루프 구역, 베타-가닥 구역, 베타 유사 가닥, C-말단 구역, C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이, N-말단 구역, 및 N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이로 이루어지는 군 중에서 선택된 구역에서 Fn3계 결합 분자에 융합될 수 있다. Fc 컨쥬게이트의 반감기는 생체 내에서 적어도 약 9.4시간 증가한다.
또 다른 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 혈청 알부민 (SA), 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 그의 일부, 또는 SA에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어 항-HSA를 포함한다. SA 컨쥬게이트의 생체내 반감기는 적어도 약 19.6시간인 한편, 항-SA 컨쥬게이트의 생체내 반감기는 적어도 약 7.7시간이다.
또 다른 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. PEG 모이어티는 티올기 또는 아민기에 부착된다. PEG 모이어티는 부위 지정 PEG화 (PEGylation)에 의해 Fn3계 결합 분자에, 예를 들어 Cys 잔기에 또는 비-천연 아미노산 잔기에 부착된다. PEG 모이어티는 루프 구역, 베타-가닥 구역, 베타 유사 가닥, C-말단 구역, C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이, N-말단 구역, 및 N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이로 이루어지는 군 중에서 선택된 Fn3계 결합 분자 내의 구역 상에 부착된다. PEG 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa이다. PEG 컨쥬게이트의 반감기는 생체 내에서 적어도 약 3.6시간 증가한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 항체 Fc 구역에 결합하는 폴리펩티드에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하는, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트에 관한 것이고, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하고, 컨쥬게이트는 특이적 표적에 결합하고 혈청 반감기가 적어도 9.4시간이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 혈청 알부민 (SA) 모이어티에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하는, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트에 관한 것이고, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하고, 컨쥬게이트는 특이적 표적에 결합하고 혈청 반감기가 적어도 19.6시간이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 혈청 알부민 (SA) 모이어티에 결합하는 폴리펩티드에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하는, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트에 관한 것이고, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하고, 컨쥬게이트는 특이적 표적에 결합하고 혈청 반감기가 적어도 7.7시간이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 PEG 모이어티에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하는, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트에 관한 것이고, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하고, 컨쥬게이트는 특이적 표적에 결합하고 혈청 반감기가 적어도 3.6시간이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 항-FcRn 모이어티에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하는, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트에 관한 것이고, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하고, 컨쥬게이트는 신생 FcR 수용체 (FcRn)에 산성 pH에서 높은 친화도로, 중성 pH에서 낮은 친화도로 결합한다. 산성 pH는 약 1 내지 약 7일 수 있고, 중성 pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 한 실시태양에서, 산성 pH는 약 pH 6.0이고, 중성 pH는 약 pH 7.4이다.
Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트는 1Fn-17Fn 모듈 중 임의의 하나로부터의 적어도 2개의 동일한 또는 상이한 피브로넥틴 모듈로부터 유래된 Fn3 도메인을 가질 수 있고, 임의의 조합, 예를 들어, 10Fn3-10Fn3, 10Fn3-9Fn3, 10Fn3-8Fn3, 9Fn3-8Fn3으로 조합될 수 있다. 컨쥬게이트, 예를 들어 10Fn3-10Fn3-HSA, 또는 항-HSA 또는 Fc, 또는 PEG; 10Fn3-9Fn3-HSA, 또는 항-HSA 또는 Fc, 또는 PEG, 10Fn3-8Fn3-HSA, 또는 항-HSA 또는 Fc, 또는 PEG, 9Fn3-8Fn3-HSA, 또는 항-HSA 또는 Fc, 또는 PEG가 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트는 적어도 3개 이상의 동일한 또는 상이한 피브로넥틴 모듈로부터 유래된 Fn3 도메인, 예를 들어, 10Fn3-10Fn3-10Fn3(-10Fn3)n (여기서, n은 2-10 10Fn3 도메인 중 임의의 수임); 10Fn3-9Fn3-8Fn3(-Fn3)n (여기서, n은 2-10 Fn3 도메인 중 임의의 수임); 9Fn3-8Fn3-7Fn3(-Fn3)n (여기서, n은 2-10 Fn3 도메인 중 임의의 수임)일 수 있다. 이들 분자의 컨쥬게이트도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 추가로 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산, 프로모터와 작동가능하게 연결된 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 핵산을 포함하는 세포, 및 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 세포, 특히 생체 내의 세포에서 발현시킴으로써, 표적에 결합하는 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 래트, 마우스, 햄스터, 인간 세포 또는 그로부터 유도된 세포주이다.
본 발명의 Fn3계 결합 분자는 본원에서 논의된 바와 같이, (예를 들어, 인간) 야생형 Fn3 서열, 및 상기 서열의 변형된 버전에 기반할 수 있다. 예를 들어, Fn3계 결합 분자는 적어도 2개의 상이한 피브로넥틴 모듈로부터 유래된 Fn3 베타-가닥을 갖는 키메라일 수 있다. 가능한 키메라의 예를 도 6에 제시한다.
본 발명에서는 적합한 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 Fn3계 결합 분자 및 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
본 발명의 Fn3계 결합 분자 및 컨쥬게이트는 항체가 사용될 수 있는 임의의 용도를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 치료 및 진단 용도에서 사용될 수 있다. 그러한 용도는 예를 들어, 자가면역 질환, 염증, 암, 감염성 질환, 심혈관 질환, 위장관 질환, 호흡기 질환, 대사 질환, 근골격계 질환, 신경변성 질환, 정신 질환, 안질환 및 이식 거부반응을 포함하고 이로 제한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 및 진단을 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 다음 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 자명할 것이다.
<본 발명의 상세한 설명>
본원 명세서 및 특허청구범위에 대한 명확한 이해를 제공하기 위해서, 다음 정의가 편리하게 아래에 제공된다.
정의
본원에서 사용할 때, 용어 "피브로넥틴 타입 III 도메인" 또는 "Fn3 도메인"은 임의의 유기체로부터의 야생형 Fn3 도메인, 및 2개 이상의 상이한 Fn3 도메인으로부터의 베타 가닥으로부터 구성된 키메라 Fn3 도메인을 모두 나타낸다. 당업계에 공지된 바와 같이, 천연 발생 Fn3 도메인은 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 루프로 칭하는 6개의 루프에 의해 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 칭하는 7개의 베타-가닥의 베타-샌드위치 (sandwich) 구조를 갖는다 (예를 들어, 그 전체 교시내용이 본원에 참조로 포함된 [Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:8990, 1992]; [Bork et al., Nature Biotech. 15:553, 1997]; [Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910, 1993]; [Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990]; [Main et al., 1992]; [Leahy et al., 1992]; [Dickinson et al., 1994]; 미국 특허 6,673,901; 국제특허조약 (PCT) 공개 WO/03104418; 및 US 특허 출원 2007/0082365 참조). 3개의 루프는 도메인의 상단에 있고 (BC, DE 및 FG 루프), 3개의 루프는 도메인의 저변에 있다 (AB, CD 및 EF 루프) (도 1 참조). 본 발명의 특정 실시태양에서, Fn3 도메인은 인간 피브로넥틴의 제10 Fn3 도메인 (10Fn3)으로부터의 것이다 (서열 1).
본원에서 사용될 때, 용어 "Fn3계 결합 분자" 또는 "피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자"는 하나 이상의 비-Fn3 결합 서열을 함유하도록 변경된 Fn3 도메인을 의미한다.
용어 "비-Fn3 결합 서열"은 천연 발생 (예를 들어, 야생형) Fn3 도메인에 존재하지 않고, 특이적 표적에 결합하는 아미노산 서열을 의미한다. 상기 비-Fn3 결합 서열은 일반적으로 야생형 Fn3 도메인을 변형시킴으로써 (예를 들어, 치환 및/또는 부가에 의해) 도입된다. 이것은 예를 들어 야생형 Fn3 도메인 내의 아미노산 잔기의 무작위 또는 소정의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 비-Fn3 결합 서열은 부분적으로 또는 전체적으로 외인성, 즉 상이한 유전자 또는 아미노산 공급원으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 외인성 서열은 항체의 초가변 구역, 예를 들어 알려진 표적 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 CDR 구역으로부터 유도될 수 있다. 상기 CDR은 단일 항체 사슬 (예를 들어 경쇄 또는 중쇄의 가변 구역)로부터 또는 상이한 항체 사슬들의 조합으로부터 유도될 수 있다. 또한, CDR은 2개의 상이한 항체 (예를 들어, 상이한 특이성을 갖는)로부터 유도될 수 있다. 특정 실시태양에서, CDR(들)은 나노바디, 예를 들어 카멜리대 (Camelidae)-유사 중쇄로부터 유도된다.
용어 "상보성 결정 구역 (CDR)"은 항체 가변 도메인으로부터 또는 T-세포 수용체로부터 유도된 초가변 루프를 의미한다. 항체 가변 구역 내의 CDR의 위치는 정밀하게 규정된 바 있다 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991] 및 [Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987] 참조).
용어 "단일 도메인 항체"는 예를 들어 도만티스/지에스케이 (Domantis/GSK, 영국 캠브리지)에 의해 설명된 인간 도메인 항체 (예를 들어, 문헌 [Ward et al., 1989, Nature 341(6242):484-5]; WO04058820 참조), 또는 아래에서 규정되는 카멜리드 나노바디를 포함하여 임의의 천연 발생 단일 가변 도메인 항체 또는 상응하는 공학처리된 결합 단편을 의미한다.
용어 "단일쇄 항체"는 예를 들어 재조합 방법을 사용하여 사슬을 VL 및 VH 구역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 형성시킬 수 있는 합성 링커에 의해 연결된 경쇄 가변 구역의 항원 결합부 및 중쇄 가변 구역의 항원 결합부로 구성된 항체를 의미한다.
용어 "카멜리드 나노바디"는, 경쇄가 결여된 작은 단일 가변 도메인이고 표적에 대한 높은 친화도를 갖는 작은 단백질을 생성하는 유전공학 처리에 의해 저 분자량 항체 유래 단백질을 생성시킴으로써 얻을 수 있는 카멜리드 항체의 구역을 의미한다. 예를 들어, WO07042289 및 1998년 6월 2일 등록된 미국 특허 5,759,808; 및 예를 들어 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004, J Biol Chem. 279(2): 1256-61] 참조. 카멜리드 항체 및 항체 단편의 공학처리된 라이브러리는 예를 들어 아블링스 (Ablynx, 벨기에 겐트)로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체처럼, 카멜리드 항체의 아미노산 서열은 인간 서열에 보다 유사하게 닮은 서열을 얻도록 재조합 방식으로 변경될 수 있다. 즉, 나노바디는 "인간화"될 수 있다. 이것은 인간에게 투여될 때 이미 천연적으로 낮은 카멜리드 항체의 항원성을 더욱 감소시킨다.
용어 "표적"은 본 발명의 Fn3계 결합 분자에 의해 인식되는 (즉, 결합되는) 항원 또는 에피토프를 의미한다. 표적은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 및/또는 지질 상에 존재하는 에피토프를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "컨쥬게이트"는 하나 이상의 비-Fn3 모이어티에 화학적으로 또는 유전적으로 연결된 Fn3계 결합 분자를 의미한다.
용어 "비-Fn3 모이어티"는 그 모이어티가 부착되는 분자에게 추가의 기능성을 부여하는 생물학적 또는 화학적 엔티티를 의미한다. 특정 실시태양에서, 비-Fn3 모이어티는 폴리펩티드, 예를 들어, 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 그의 단편 또는 돌연변이체, 항-HSA, 또는 그의 단편 또는 돌연변이체, 항체 Fc 또는 그의 단편 또는 돌연변이체, 또는 화학적 엔티티, 예를 들어, Fn3계 결합 분자의 생체내 반감기를 증가시키는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다.
용어 "비-천연 아미노산 잔기"는 천연 발생 (야생형) Fn3 도메인에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 의미하고, 예를 들어 화학적으로 변형된 아미노산을 포함한다. 그러한 비-천연 아미노산 잔기는 천연 발생 아미노산의 치환, 및/또는 천연 발생 아미노산 Fn3 서열 내로의 비-천연 아미노산의 삽입에 의해 도입될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Sakamoto et al., 2002, Nucleic Acids Research, 30(21) 4692-4699] 참조). 또한, 비-천연 아미노산 잔기는 목적하는 기능성, 예를 들어, 기능적 모이어티 (예를 들어, PEG)를 연결하는 능력을 Fn3계 결합 분자에게 부여하도록 통합될 수 있다.
용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제 또는 커플링 또는 활성화 모이어티를 사용한 유도체화가 존재하거나 존재하지 않는 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 의미한다.
용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 적어도 1 x 10-6 M의 친화도로 표적에 결합하고/하거나, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 표준 생리학적 염 및 pH 조건 하에서 실온에서 비특이적 항원에 대한 그의 친화도보다 적어도 2배 (바람직하게는 적어도 10배) 더 큰 친화도로 표적에 결합하는 Fn3계 결합 분자의 능력을 의미한다.
도 1A는 세린 잔기를 막대로 표시한 야생형 피브로넥틴 분자의 제10 타입 III 모듈을 보여주고, 도 1B는 그의 2차 구조 환경에서 Fn3의 아미노산 서열 (서열 103)을 보여준다. 베타 가닥 내의 잔기는 백색 원으로서 도시된다. 측쇄가 소수성 코어 (core)를 형성하는 잔기는 보다 두꺼운 선으로 둘러싸인다. 루프 잔기는 음영으로 도시된다. 화살표는 Fn3이 분리되어 상보성 단편을 생성하는 루프 내의 위치를 표시한다.
도 2는 변형을 위해 이용가능한 제안된 세린 잔기를 갖는 야생형 피브로넥틴 분자의 제10 타입 III 모듈을 보여준다 (Ser 17 - Ser 21 - Ser 43 - Ser 60 - Ser 89).
도 3은 야생형 피브로넥틴 분자의 제10 타입 III 모듈의 3-가닥 시트 (가닥 A-B-E)를 보여준다. 시트의 저변에, 후보 잔기 Ser 17 및 Ser 60이 위치한다. 후보 잔기 Ser 21은 상단에 위치한다. Ser 55는 결합 표면에 가까우므로 배제되었다. 다른 잠재적인 후보 잔기, 즉, Val 11, Leu 19, 및 Thr 58이 도시된다.
도 4는 야생형 피브로넥틴 분자의 제10 타입 III 모듈의 4-가닥 시트를 보여준다 (스캐폴드의 다른 측면). Thr 71은 Ser 89에 가까이 위치하고, 또한 변형을 위한 잠재적인 후보이다.
도 5는 야생형 피브로넥틴 분자의 제10 타입 III 모듈의 FG 및 CD 루프를 보여준다.
도 6A-B는 피브로넥틴계 결합 분자 키메라를 생산하기 위한 야생형 피브로넥틴 분자의 모듈 7, 8, 9, 및 10 타입 III 모듈의 베타-가닥의 다양한 조합을 보여준다 (베타-가닥 스와핑 (swapping)).
도 7A-C는 예시적인 표적에 관한 정보를 제공한다.
도 8은 환원제를 사용하지 않은 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 및 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의)_cys (도 8A) 및 환원제를 사용한 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의)_30kDa PEG (도 8B)의 SDS PAGE 분석의 결과를 보여준다.
도 9는 이. 콜라이 (E. coli) 발현 시스템을 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의)에 대한 루이스 (Lewis) 래트에서의 (약동학) PK를 보여준다.
도 10은 이. 콜라이 발현 시스템을 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - PEG에 대한 루이스 래트에서의 PK를 보여준다.
도 11은 WinNonLin 소프트웨어에 의해 분석할 때 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 및 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - PEG에 대한 계산된 반감기를 보여준다.
도 12는 환원제를 사용한 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의)-RSA (도 12a) 및 환원제를 사용한 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의)-HSA (도 12b)의 SDS PAGE 분석의 결과를 보여준다.
도 13은 포유동물 발현 시스템을 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - RSA에 대한 루이스 래트에서의 PK를 보여준다.
도 14는 포유동물 발현 시스템을 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - HSA에 대한 루이스 래트에서의 PK를 보여준다.
도 15는 WinNonLin 소프트웨어에 의해 분석할 때 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 및 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - RSA 및 HSA에 대한 계산된 반감기를 보여준다.
도 16은 환원제를 사용하는 VEGFR 10Fn3 바인더 - RSA (도 16a) 및 환원제를 사용하는 VEGFR 10Fn3 바인더 - HSA (도 16b)의 SDS PAGE 분석의 결과를 보여준다.
도 17은 VEGFR 10Fn3 바인더 - HSA 및 RSA를 사용하는 ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 18은 포유동물 발현 시스템을 사용하는 VEGFR-결합 Fn3 - HSA에 대한 루이스 래트에서의 PK를 보여준다.
도 19는 포유동물 발현 시스템을 사용하는 VEGFR-결합 Fn3 - RSA에 대한 루이스 래트에서의 PK를 보여준다.
도 20은 WinNonLin 소프트웨어에 의해 분석할 때 VEGFR-결합 Fn3 - HSA 및 VEGFR-결합 Fn3 - RSA에 대한 계산된 반감기를 보여준다.
도 21은 환원제를 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - 항RSA의 SDS PAGE 분석의 결과를 보여준다.
도 22는 이. 콜라이 발현 시스템을 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - 항RSA에 대한 루이스 래트에서의 PK를 보여준다.
도 23은 WinNonLin 소프트웨어에 의해 분석할 때 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 및 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - 항-RSA에 대한 계산된 반감기를 보여준다.
도 24는 환원제를 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - Fc의 SDS PAGE 분석의 결과를 보여준다.
도 25는 포유동물 발현 시스템을 사용하는 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - Fc에 대한 루이스 래트에서의 PK를 보여준다.
도 26은 WinNonLin 소프트웨어에 의해 분석할 때 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 및 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - Fc에 대한 계산된 반감기를 보여준다.
개요
본 발명은 피브로넥틴계 결합 분자, 및 공여 CDR을 피브로넥틴계 결합 스캐폴드, 특히, Fn3 내로 도입하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 아래에서 더욱 논의하는 바와 같이, 또한 모이어티에 컨쥬게이팅되기에 적합한 아미노산 잔기를 피브로넥틴계 결합 분자 또는 스캐폴드 내로 도입하기 위한 방법을 제공한다. 상기 잇점 때문에, 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 다른 그러한 분자에 추가로 컨쥬게이팅되어 이중특이적 및 다중특이적 결합 분자를 생성할 수 있고/있거나 개선된 반감기 및 안정성을 위해 PEG와 같은 모이어티에 대해 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 표적, 대개 단백질 항원에 대한 특이적 결합에 대해 그러한 결합 분자의 스크리닝, 및 예를 들어, 원핵생물 또는 진핵생물 시스템에서의 분자의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보 결합 분자의 정제 및 그의 제형화 방법을 제공한다.
또한 추가로, 본 발명은 다양한 진단 및 치료 용도에서, 특히, 인간 질환의 진단 또는 치료를 위한 그러한 제형화된 결합 분자의 사용 방법을 제공한다.
피브로넥틴계 결합 스캐폴드 및 그의 변형
한 측면에서, 본 발명은 결합 분자의 제조를 위한 개선된 스캐폴드를 제공한다. 본 발명에 사용하기 적합한 스캐폴드는 안키린 반복 스캐폴드, 또는 면역글로불린 수퍼패밀리의 하나 이상의 멤버, 예를 들어, 항체 또는 피브로넥틴 도메인을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 피브로넥틴 타입 III 도메인 (Fn3)은 스캐폴드 분자로서 역할을 한다 (미국 특허 6,673,901, PCT 공개 WO/03104418, 및 미국 특허 출원 20070082365). 상기 도메인은 단백질 서열 데이타베이스에서 400회 초과로 나타나고, 피브로넥틴, 테나신, 세포내 세포골격 단백질, 및 원핵생물 효소를 포함한 지금까지 서열결정된 단백질의 2％에서 나타나는 것으로 추정되었다 ([Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:8990, 1992]; [Bork et al., Nature Biotech. 15:553, 1997]; [Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910, 1993]; [Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990]). Fn3의 3D 구조는 NMR (Main et al., 1992) 및 X-선 결정학 ([Leahy et al., 1992]; [Dickinson et al., 1994])에 의해 결정할 수 있다. 구조는 Fn3이 9개 대신에 7개의 β-가닥을 갖는 것을 제외하고는 항체 VH 도메인의 구조에 유사한 베타-샌드위치로서 설명된다. 각각의 Fn3 도메인의 각각의 단부 상에 3개의 루프가 존재하고; BC, DE 및 FG 루프의 위치는 대략 각각 항체의 VH 도메인의 CDR1, 2 및 3의 위치에 상응한다 (미국 특허 6,673,901, PCT 공개 WO/03104418). 임의의 종으로부터의 임의의 Fn3 도메인이 본 발명에 사용하기 적합하다.
또 다른 실시태양에서, Fn3 스캐폴드는 인간 Fn3의 제10 모듈 (10Fn3)이고, 이는 94개의 아미노산 잔기를 포함한다. IgG 중쇄의 항원-결합 루프에 상응하는 10Fn3의 3개의 루프는 아미노산 잔기 21-31 (BC), 51-56 (DE), 및 76-88 (FG) 사이에 이어진다 (미국 특허 출원 20070082365). 이들 BC, DE 및 FG 루프는 각각 항체 가변 구역으로부터, 특히 단일 도메인 항체의 CDR로부터의 CDR1, 2 및 3 루프에 의해 직접 치환될 수 있다.
10Fn3은 Fn3계 결합 분자의 생성을 위한 Fn3 스캐폴드의 하나의 실시태양을 나타내지만, 다른 분자가 본원에서 설명되는 분자 내에서 10Fn3을 치환할 수 있다. 이들은 비제한적으로 인간 피브로넥틴 모듈 1Fn3-9Fn3 및 11Fn3-17Fn3뿐만 아니라 비-인간 동물 및 원핵생물로부터의 관련 Fn3 모듈을 포함한다. 또한, 10Fn3에 서열 상동성을 갖는 다른 단백질로부터의 Fn3 모듈, 예를 들어 테나신 및 운둘린이 또한 사용될 수 있다. 상이한 유기체 및 모 단백질로부터의 모듈이 상이한 용도에 대해 가장 적절할 수 있고; 예를 들어, 항체 모방체를 설계하는데 있어서, 그에 대해 치료 또는 진단 분자가 의도되는 유기체에 천연 상태인 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유사 분자로부터의 단백질을 생성하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, Fn3은 인간 이외의 다른 종으로부터 유도된 것이다. 비-인간 Fn3은 인간 환자에게 투여될 때 유해한 면역 반응을 야기할 수 있다. 이를 방지하기 위해, 비-인간 Fn3은 항원성 아미노산 또는 에피토프를 제거하기 위해 유전공학에 의해 처리될 수 있다. 비-인간 Fn3의 항원성 구역의 확인 방법은 미국 특허 6,673,580에 기재된 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또 다른 실시태양에서, Fn3 스캐폴드는 하나 이상의 Fn3, 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 Fn3, 예를 들어 10Fn3 및 9Fn3의 일부로 구성된 키메라이다. Fn3 도메인의 공지의 아미노산 서열 및 3D 구조를 사용하여, 숙련된 작업자는 기능적 키메라 Fn3 분자를 제조하기 위해 조합될 수 있는 상이한 Fn3 분자의 구역을 쉽게 확인할 수 있다. 상기 키메라 Fn3 도메인은 PCR-기반 또는 효소-매개 유전공학 처리, 압 이니시오 (ab initio) DNA 또는 RNA 합성 또는 카세트 돌연변이 유발을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 방법으로 구성될 수 있다.
상기 언급된 피브로넥틴계 결합 스캐폴드는 압 이니시오로 구성되거나 또는 인 실리코 (in silico) 분자 모델링을 사용하여 특징을 분석할 수 있다. 인 실리코 또는 컴퓨터 보조 모델링은 예를 들어 Ras-Mol을 사용하는 간단한 핵산 또는 아미노산 서열 정렬 또는 3-D 모델링을 포함할 수 있다. 스캐폴드의 모델링을 통해, 스캐폴드의 어느 구역 또는 루프가 초가변 구역을 제시하기 위해 선택될 수 있는지에 대한 합리적인 방법을 수행할 수 있다. 또한, 모델링은 하나 이상의 초가변 구역의 최적 제시를 위해 스캐폴드를 가장 양호하게 변형하는 방법을 가능하게 한다.
초가변 구역/ CDR 을 피브로넥틴계 결합 스캐폴드 상에 그라프팅하는 방법
한 측면에서, 본 발명은 다른 Ig 수퍼패밀리 분자로부터의 초가변 구역을 본 발명의 피브로넥틴계 결합 스캐폴드 내로 그라프팅하기 위한 개선된 방법을 특징으로 한다.
한 실시태양에서, 항체 가변 구역, 예를 들어, 중쇄 가변 구역, 경쇄 가변 구역, 또는 둘 모두로부터의 하나 이상의 CDR이 상기 언급된 결합 스캐폴드 중의 하나의 하나 이상의 루프 내로 그라프팅된다. 임의의 항체 가변 구역, 또는 그의 항원 결합 단편의 CDR 구역이 그라프팅에 적합하다. CDR은 설치류, 영장류, 카멜리드 또는 상어를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 동물의 항체 레퍼토리로부터 얻을 수 있다. 특정 실시태양에서, CDR은 단일 도메인 항체, 예를 들어 나노바디의 CDR1, CDR2 및 CDR3으로부터 얻는다. 보다 구체적인 실시태양에서, 단일 도메인 항체, 예를 들어 나노바디의 CDR1, 2 및 3은 Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 내로 그라프팅되어, 원래의 나노바디의 표적 결합 특이성을 피브로넥틴계 결합 분자에 제공한다. 카멜리드 항체 및 항체 단편의 공학처리된 라이브러리는 예를 들어 아블링스로부터 상업적으로 입수가능하다. 항체 레퍼토리는 하나 이상의 항원으로 시험접종된 동물로부터 또는 항원으로 시험접종되지 않은 나이브 (naive) 동물로부터 유도될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, CDR은 시험관내 폴리좀 (polysome) 또는 리보좀 디스플레이, 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이 기술을 포함하고 이로 제한되지 않는 시험관내 또는 생체내 라이브러리 스크리닝 방법에 의해 생산된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 얻을 수 있다. 이것은 원래 시험관내 또는 생체내 라이브러리 스크리닝 방법에 의해 생성되지 않지만 후속적으로 시험관내 또는 생체내 스크리닝 방법을 사용하여 돌연변이 유발 또는 하나 이상의 친화도 증진을 겪은 항체를 포함한다. 그러한 시험관내 또는 생체내 라이브러리 스크리닝 방법 또는 친화도 증진 방법의 예는 예를 들어 미국 특허 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5866344 및 PCT 공개 WO06023144에 기재되어 있다.
항체 CDR의 확인 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 ([Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)] 참조). 특정 항체를 코딩하는 핵산은 단리되어 서열결정될 수 있고, CDR 서열은 확립된 항체 서열 명칭에 대한 코딩된 단백질의 조사에 의해 유추될 수 있다. 초가변 구역 또는 CDR을 본 발명의 피브로넥틴계 결합 스캐폴드 내로 그라프팅하는 방법은 예를 들어 유전공학 처리, 드 노보 (de novo) 핵산 합성 또는 PCR-기반 유전자 조립을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 5,225,539 참조).
개선된 CDR 제시/결합을 위한 변형에 적합한 피브로넥틴계 결합 스캐폴드 잔기의 확인 방법
상기 기술을 사용하면, 초가변 구역 또는 CDR의 선택 및 제시를 위한 적합한 스캐폴드 루프를 확인할 수 있다. 그러나, Fn3 도메인 및 공여 항체의 구조 모델링에 기초한 초가변 구역의 적합성 및 제시를 보다 개선시키기 위해 추가의 측정 기준을 적용할 수 있다.
한 측면에서, Fn3 스캐폴드의 임의의 베타-가닥 내의 특정 아미노산 잔기는 CDR 루프가 항원에 대한 결합을 보유하거나 개선시키는 입체형태를 채용하도록 돌연변이된다. 상기 절차는 구조 모델링 및 서열 비교의 조합을 사용하여 이종 항체 프레임워크 내로의 CDR 그라프팅과 유사한 방식으로 수행할 수 있다. 한 실시태양에서, CDR에 인접한 Fn3 잔기는 퀸 (Queen) 등에 의해 수행된 바와 유사한 방식으로 돌연변이된다 (미국 특허 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 7,022,500 참조). 또 다른 실시태양에서, CDR 잔기의 1 판 데어 발스 (Van der Waals) 반경 내의 Fn3 잔기가 윈터 (Winter) 등에 의해 수행된 바와 유사한 방식으로 돌연변이된다 (미국 특허 6,548,640; 6,982,321 참조). 또 다른 실시태양에서, CDR 잔기의 입체형태를 변형하기 위해서, CDR 잔기에 인접하지 않지만 Fn3 도메인 및 공여 항체의 구조적 모델링을 기초로 하여 예측되는 Fn3 잔기가 카터 (Carter) 등 또는 아데어 (Adair) 등에 의해 수행된 바와 유사한 방식으로 돌연변이된다 (미국 특허 6,407,213; 6,639,055; 5,859,205; 6,632,927 참조).
다른 측면에서, 하나 이상의 그라프팅된 항체 CDR을 함유하는 Fn3 스캐폴드는 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 친화도 증진 단계에 적용된다. 목적하는 항원에 대한 Fn3/CDR의 결합을 개선시키는 Fn3 스캐폴드 또는 CDR 내의 아미노산 변화를 야기하는 임의의 친화도 증진 방법이 사용된다. 이들 아미노산 변화는 예를 들어 무작위 돌연변이 유발, "워크 쓰루 (walk through) 돌연변이 유발, 및 "룩 쓰루 (look through) 돌연변이 유발을 통해 달성될 수 있다. 모노바디 (monobody)의 상기 돌연변이 유발은 예를 들어 오류-경향 PCR, 효모 또는 세균의 "돌연변이 유발 유전자 (mutator)" 종, 모노바디의 전부 또는 일부의 압 이니시오 합성 동안 무작위 또는 규정된 핵산 변화의 도입을 사용하여 달성될 수 있다. 친화도 증진 및/또는 돌연변이 유발을 수행하는 방법은 예를 들어 미국 특허 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5866344 및 PCT 공개 WO06023144에 기재되어 있다. 또한, 최소의 필수적인 결합 결정자를 포함하는 새로운 CDR 서열은 US20050255552에 기재된 바와 같은 칼로비오스 (Kalobios) 기술을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
공학처리되고 변형된 피브로넥틴계 결합 분자
다른 측면에서, 본 발명은 원래의 피브로넥틴계 분자에 비해 변경된 특성을 갖도록 변형된 피브로넥틴계 결합 분자를 특징으로 한다. 변형은 분자를 다른 분자에 컨쥬게이팅 또는 융합시키는 것, 및 화학적으로 분자를 변형시키거나 분자 구조의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 변경시키는 것을 포함한다.
피브로넥틴 융합체
본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 다른 분자에 융합 또는 컨쥬게이팅될 수 있다. 그러한 컨쥬게이트는 본원에서 "Fn 융합체"로 언급된다. 예를 들어, Fn 융합체는 결합 분자 (예를 들어, Fc 구역, HSA, 또는 항-HSA 결합 분자)의 안정성 또는 반감기를 증가시키는 분자에 융합된 피브로넥틴계 결합 분자를 포함한다.
예를 들어, Fn 융합체는 IgG의 불변 구역 (Fc)을 10Fn3 모듈과, 바람직하게는 10Fn3의 C-말단을 통해 융합시킴으로써 인간 면역 반응과 통합될 수 있다. 상기 10Fn3-Fc 융합 분자 내의 Fc는 면역 반응의 보체 성분을 활성화시키고, 항체 모방체의 치료 값을 증가시킨다. 이와 유사하게, 10Fn3과 보체 단백질, 예를 들어 C1q 사이의 융합체는 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있고, 10Fn3과 독소 사이의 융합체는 특정 항원을 보유하는 세포를 특이적으로 파괴하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 임의의 형태의 10Fn3은 혈류 내의 그의 반감기 및 그의 조직 투과성을 증가시키기 위해서 알부민과 융합될 수 있다. 임의의 상기 융합체는 표준 기술에 의해, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 유전자 서열을 사용하여 구성된 재조합 융합 유전자로부터 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.
또한, Fn 융합체는 순환시 알부민의 수명 연장에 관여하는, "브람벨 (Brambell) 수용체"로도 불리는 신생 Fc 수용체 (FcRn)를 사용하여 생성될 수 있다 ([Chaudhury et al., (2003) J. Exp.Med., 3: 315-322]; [Vaccarao et al., (2005) Nature Biotech. 23: 1283-1288] 참조). FcRn 수용체는 3개의 세포외 도메인을 갖는 43 kD α 사슬에 비공유 결합된 β-2-마이크로글로불린으로 구성된 가용형 경쇄, 막횡단 구역 및 약 50개 아미노산의 세포질 테일로 구성된 통합 막 당단백질이다. 세포질 테일은 수용체의 내재화에 관련되는 디뉴클레오티드 모티프-기반 세포내이입 (endocytosis) 신호를 함유한다. α 사슬은 단백질의 비고전적인 MHC I 패밀리의 멤버이다. α 사슬과의 β 2m 회합은 FcRn의 정확한 폴딩 (folding) 및 엔도좀 (endosome) 및 세포 표면으로의 이동을 위해 소포체로부터 빠져나가는데 중요하다.
FcRn의 전체 구조는 클래스 I 분자와 유사하다. α-1 및 α-2 구역은 MHC I 분자에서 갈라진 펩티드와 매우 유사한 2개의 역평행 (antiparallel) α-나선이 상부에 덮인 단일 β-시트를 형성하는 8개의 역평행 β 가닥으로 구성된 플랫폼 (platform)과 유사하다. 사실상, FcRn은 IgG에 결합하고, 이를 모체 순환계로부터 태아 순환계로 태반 융합세포 영양막을 가로질러 수송하고, IgG를 성인에서의 분해로부터 보호한다. 항상성 이외에, FcRn은 조직에서 IgG의 세포전달 작용 (transcytosis)을 조절한다. FcRn은 상피 세포, 내피 세포 및 간세포에 편재한다.
연구는 알부민이 FcRn에 결합하여 IgG와 3 분자 복합체를 형성함을 보여주었다. 알부민과 IgG 모두가 FcRn 상의 구분되는 부위에 협동하여 결합하는 것을 아니다. 인간 FcRn의 세파로스 (Sepharose)-HSA 및 세파로스-hIgG에 대한 결합은 pH 의존적이며, pH 5.0에서 최대이고, pH 7.0 내지 pH 8에서는 결합하지 않는다. FcRn이 IgG에 결합하는 것과 동일한 pH 의존 방식으로 알부민에 결합한다는 관찰은 알부민이 FcRn과 상호작용하여 분해로부터 보호되는 메카니즘이 IgG의 메카니즘과 동일하고, FcRn과의 유사한 pH-감수성 상호작용을 통해 매개됨을 시사한다. FcRn 및 알부민은 IgG 결합 부위와 구분되는 부위 상에서 pH-의존 방식으로 알부민의 D-III 도메인을 통해 상호작용한다.
본 발명의 Fn 융합체는 또한 Fn-FcRn 융합 단백질 또는 Fn-항-FcRn 융합 분자를 포함한다. 한 실시태양에서, Fn 융합체는, FcRn에 대한 IgG의 결합과 유사하게 항-FcRn 융합 분자가 신생 FcR 수용체 (FcRn)에 대해 산성 pH (예를 들어 pH 6.0)에서 높은 친화도로, 중성 pH (예를 들어 pH 7.4)에서 낮은 친화도로 결합할 수 있는 Fn-항-FcRn 융합 분자이다. Fn-항-FcRn 융합체의 생체내 반감기는 증가하였고, 따라서 개선된 치료 유용성을 제공한다.
분자를 Fc 도메인, 예를 들어 IgG1의 Fc 도메인에 융합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, U.S. 5,428,130 참조). 상기 융합체는 FcRn에 결합하는 Fc의 능력 때문에 증가된 순환 반감기를 갖고, 이는 IgG 항상성에서 중요한 기능을 수행하고, 그에 대해 결합된 분자를 이화로부터 보호한다 (예를 들어, US 20070269422 참조).
다른 융합체는 인간 혈청 알부민 (HSA 또는 HA)에 융합된 피브로넥틴계 결합 분자를 포함한다. 그의 성숙 형태에서 585개 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민은 혈청의 유의한 비율의 삼투압을 책임지고, 내인성 및 외인성 리간드의 담체로서도 기능한다. 담체 분자로서의 알부민의 역할 및 그의 불활성 특성은 생체 내에서 폴리펩티드의 담체 및 수송체로서 사용하기에 바람직한 특성이다. 다양한 단백질에 대한 담체로서의 알부민 융합 단백질의 성분으로서 알부민을 사용하는 것은 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 EP 413 622에서 제안된 바 있다. 또한, 폴리펩티드에 대한 융합을 위한 HSA의 N-말단 단편의 사용도 제안된 바 있다 (EP 399 666). 따라서, 본 발명의 분자를 알부민, 또는 알부민의 단편 (일부) 또는 변이체, 또는 단백질 및/또는 그의 활성의 안정화에 충분한, HSA에 결합할 수 있는 분자 ("항-HSA 바인더")에 유전적으로 또는 화학적으로 융합 또는 컨쥬게이팅시킴으로써, 본 발명의 분자는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 저장 수명의 연장, 및/또는 용액 내에서 연장된 기간 동안 분자의 활성 보유를 위해 안정화된다.
알부민을 다른 단백질에 융합시키는 것은 HSA를 코딩하는 DNA, 또는 그의 단편이 단백질을 코딩하는 DNA에 연결되도록 하는 유전자 조작에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 융합 폴리펩티드를 발현하도록 적합한 플라스미드 상에 배열된 융합된 뉴클레오티드 서열로 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시킨다. 발현은 예를 들어 원핵생물 또는 진핵생물 세포로부터 시험관 내에서, 또는 생체 내에서, 예를 들어 트랜스제닉 유기체로부터 실시될 수 있다. HSA 융합에 관한 추가의 방법은 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2001077137 및 WO 200306007에서 볼 수 있다. 특정 실시태양에서, 융합 단백질의 발현은 포유동물 세포주에서 수행된다. 포유동물 세포의 예는 인간 배아 신장 세포 (예를 들어 HEK 프리스타일 (Freestyle), HEK293, HEK293T); 차이니즈 햄스터 난소 세포 (예를 들어 CHO); 햄스터 신장 세포 (예를 들어 BHK); 인간 배아 망막 세포 (예를 들어 PERC6); 마우스 골수종 (Sp/20); HEK293과 인간 B 세포주의 교잡 세포 (예를 들어 HKB11); 자궁경부암 세포 (예를 들어 HeLa); 및 원숭이 신장 세포 (예를 들어 COS)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 다른 융합체는 피브로넥틴계 결합 분자를 다른 기능적 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 항체 또는 리간드)에 연결시켜 "이중특이적 분자"를 생성시키는 것을 포함한다. 이중 특이적 분자는 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 적어도 2개의 상이한 표적 분자, 예를 들어 피브로넥틴 분자 및 항-HSA 바인더에 의해 표적화되는 결합 부위에 결합하고, 상기 항-HSA 바인더는 피브로넥틴계 분자로부터 (상기 설명한 바와 같이) 또는 다른 비-피브로넥틴 스캐폴드로부터, 및 예를 들어 단일 도메인 항체로부터 유도된다 (예를 들어, WO2004041865 (아블링스) 및 EP1517921 (도만티스) 참조). 또한, 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 동일한 표적 분자 상의 2개 초과의 상이한 결합 부위, 및/또는 2개의 상이한 표적 분자 및 그의 다양한 변형체 상의 2개의 별개의 결합 부위에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하도록 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결될 수 있다. 한 실시태양에서, Fn3계 결합 다중특이적 분자는 각각의 Fn3 도메인이 동일한 치료 표적의 상이한 부위, 예를 들어, TNF 상의 상이한 부위에 결합하도록, 예를 들어 함께 연결되고 반감기 연장 모이어티, 예를 들어 HSA에 컨쥬게이팅된 적어도 2개의 Fn3 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, Fn3계 결합 다중특이적 분자는 각각의 Fn3 도메인이 상이한 치료 표적에 결합하도록, 예를 들어, 제1 Fn3 도메인이 Her3에 결합하고 제2 Fn3 도메인이 Her2에 결합하도록, 예를 들어 함께 연결되고 반감기 연장 모이어티, 예를 들어 HSA에 컨쥬게이팅된 적어도 2개의 Fn3 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, Fn3계 결합 다중특이적 분자는 각각의 Fn3 도메인이 상이한 치료 표적 및 그의 다양한 변형체 상의 상이한 부위에 결합하도록, 예를 들어, 제1 Fn3 도메인이 Her3의 부위 1에 결합하고 제2 Fn3 도메인이 Her 3의 부위 2에 결합하고, 제3 Fn3 도메인이 Her2의 부위 1에 결합하고 제4 Fn3 도메인이 Her2의 부위 2에 결합하도록, 예를 들어 함께 연결되고 반감기 연장 모이어티, 예를 들어 HSA에 컨쥬게이팅된 적어도 2개의 Fn3 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 다중특이적 분자는 본원에서 사용되는 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구성 결합 특이성 부분을 컨쥬게이팅함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이성 부분은 별개로 생성시킨 후, 서로 컨쥬게이팅될 수 있다. 결합 특이성 부분이 단백질 또는 펩티드일 경우, 다양한 커플링 또는 가교결합제가 공유 컨쥬게이션을 위해 사용될 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:8648]). 다른 방법은 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132]; [Brennan et al. (1985) Science 229:81-83], 및 [Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 바람직한 컨쥬게이팅제는 둘 모두 피어스 케미칼 컴퍼니 (Pierce Chemical Co., 미국 일리노이주 록포드)로부터 입수가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이성 부분이 1개 초과의 항체를 포함할 경우 (예를 들어, 다중특이적 구성체에서), 컨쥬게이션은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 구역의 술프히드릴 결합을 통해 달성될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 힌지 구역은 컨쥬게이션 전에 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
별법으로, 두 결합 특이성 부분은 동일한 벡터 내에서 코딩되고, 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립될 수 있다. 이중특이적 분자의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 5,260,203; 미국 특허 5,455,030; 미국 특허 4,881,175; 미국 특허 5,132,405; 미국 특허 5,091,513; 미국 특허 5,476,786; 미국 특허 5,013,653; 미국 특허 5,258,498; 및 미국 특허 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그들의 특이적 표적에 대한 결합은 다양한 분석에 의해 확인될 수 있고, 예를 들어, 융합체는 방사성 표지되어 방사성 면역 분석 (RIA)에 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사성 동위원소는 예를 들어 γ-계수기 또는 섬광 계수기를 사용하여 또는 자가방사기록법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 다른 융합체는 피브로넥틴계 결합 분자를 태그 (예를 들어, 비오틴) 또는 화학물질 (예를 들어, 면역독소 또는 화학치료제)에 연결시키는 것을 포함한다. 그러한 화학물질은 세포에 유해한 (예를 들어, 세포를 치사시키는) 임의의 물질을 포함한다. 그 예는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 및 상동체를 포함한다. 또한, 치료제는 항대사물질 (예를 들어 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어 다우노루비신 (예전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어 닥티노마이신 (예전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항유사분열제 (예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다. 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자에 컨쥬게이팅될 수 있는 치료 세포독소의 다른 예는 듀오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 오리스타틴, 및 그의 유도체를 포함한다.
세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 사용하여 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자에 컨쥬게이될 수 있다. 세포독소를 컨쥬게이팅하기 위해 사용된 링커 종류의 예는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 리소좀 구획 (compartment) 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예를 들어 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예를 들어 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.
세포독소의 종류, 링커 및 치료제를 컨쥬게이팅하기 위한 방법에 대한 추가의 논의에 대해서는, 또한 문헌 [Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215]; [Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212]; [Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763]; [Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091]; [Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]을 참조한다.
본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 또한 방사성 면역컨쥬게이트로도 언급되는 세포독성 방사성 약제를 생성시키기 위해 방사성 동위원소에 컨쥬게이팅될 수 있다. 진단 또는 치료 목적으로 사용하기 위해 피브로넥틴계 결합 분자에 컨쥬게이팅될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 요오도131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬1 77을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 방사성 면역컨쥬게이트의 제조 방법은 당업계에 확립되어 있다. 이브리투모맙, 티욱세탄, 및 토시투모맙을 포함하여 항체-기반 방사성 면역컨쥬게이트의 예는 상업적으로 입수가능하고, 본 발명의 분자를 사용하여 방사성 면역컨쥬게이트를 제조하기 위해 유사한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 Fn 융합체는 제시된 생물학적 반응을 변형하기 위해 사용될 수 있고, 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 생각하지 않아야 하다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질은 예를 들어 효소 활성 독소, 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 (pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어, 림포킨, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
그러한 치료 모이어티를 컨쥬게이팅하기 위한 기술은 잘 알려져 있고, 본 발명의 분자에 적용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]을 참조한다.
화학적 변형
다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 분자의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화에 의해 변형된 피브로넥틴계 결합 분자를 제공한다. 분자의 PEG화를 위해, 분자 또는 그의 단편은 일반적으로 하나 이상의 PEG 기가 분자에 부착되는 조건 하에서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티, 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응한다. 용어 "PEG화 모이어티", "폴리에틸렌 글리콜 모이어티", 또는 "PEG 모이어티"는 커플링제 또는 커플링 또는 활성화 모이어티 (예를 들어, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지르딘, 옥시란, 또는 바람직하게는 말레이미드 모이어티, 예를 들어, PEG-말레이미드)를 사용한 유도체화가 존재하거나 존재하지 않는 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 포함한다. 다른 적절한 폴리알킬렌 글리콜 화합물은 말레이미도 모노메톡시 PEG, 활성화된 PEG 폴리프로필렌 글리콜, 및 다음 종류의 대전된 또는 중성 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다: 덱스트란, 콜로민산, 또는 다른 탄수화물계 중합체, 아미노산의 중합체, 및 비오틴 유도체.
PEG 유도체에 대한 적합한 관능기의 선택은 분자 상의 이용가능한 반응성 기의 종류 또는 PEG에 커플링되는 분자를 기초로 한다. 단백질에 대해, 전형적인 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 타이로신을 포함한다. 또한, N-말단 아미노기 및 C-말단 카르복실산도 사용될 수 있다.
바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용할 때, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 임의의 형태의 PEG, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하도록 의도된다. 단백질의 PEG화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들어, WO 2005056764, U.S. 7,045,337, U.S. 7,083,970, U.S. 6,927,042, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다. 피브로넥틴계 결합 분자는 적어도 하나의 시스테인 아미노산 또는 PEG화를 용이하게 하는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하도록 공학처리될 수 있다.
본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 또한 약물 특성을 변경시키기 위해 약물 물질에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체를 이용하는 HES화 (hesylation)에 의해 변형될 수 있다. HES는 신체의 효소에 의해 대사되는 찰옥수수 (waxy maize) 전분으로부터 유도된 변형된 천연 중합체이다. 상기 변형은 분자의 안정성을 증가시키고 신장 청소를 감소시킴으로써 순환 반감기를 연장시켜 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, HES화는 잠재적으로 면역원성 또는 알레르기원성을 변경시킨다. 상이한 파라미터, 예를 들어 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 넓은 범위의 HES 약물 컨쥬게이트의 맞춤 제조가 가능하다.
DE 196 28 705 및 DE 101 29 369에는 각각 헤모글로빈 및 암포테리신 B의 유리 아미노기와 히드록시에틸 전분의 대응하는 알도놀락톤을 통해 무수 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중에서 히드록시에틸 전분의 커플링을 수행하는 가능한 방법이 기재되어 있다. 특이적으로 단백질의 경우에 용해도 때문에 또는 단백질의 변성 때문에 무수 비양성자성 용매를 사용하는 것이 종종 불가능하기 때문에, 수성 배지 내에서 HES를 사용한 커플링 방법도 이용가능하다. 예를 들어, 사슬의 환원 말단에서 선택적으로 산화된 히드록시에틸 전분의 알돈산에 대한 커플링은 수용성 카르보디이미드 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카르보디이미드)의 매개를 통해 가능하다 (PCT/EP 02/02928). 본 발명에 적용될 수 있는 추가의 HES화 방법은 예를 들어 U.S. 20070134197, U.S. 20060258607, U.S. 20060217293, U.S. 20060100176, 및 U.S. 20060052342에 기재되어 있다.
본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 또한 당 잔기를 통해 변형될 수 있다. 단백질의 당 잔기를 변형하거나 단백질을 글리코실화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Borman (2006) Chem. and Eng. News 84(36): 13-22] 및 [Borman (2007) Chem. and Eng. News 85:19-20] 참조), 본 발명의 분자에 적용될 수 있다. 또한, 그러한 탄수화물 변형은 예를 들어 피브로넥틴계 결합 분자 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 구역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에서의 글리코실화를 방지하는 하나 이상의 아미노산 치환이 실시될 수 있다. 상기 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 상기 방법은 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세히 설명되어 있다.
추가로 또는 별법으로, 변경된 종류의 글리코실화, 예를 들어 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 과소푸코실화 (hypofucosylated) 패턴을 갖는 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자 또는 증가된 이분 (bisecting) GlcNac 구조를 갖는 피브로넥틴계 결합 분자를 제조할 수 있다. 상기 탄수화물 변형은 예를 들어 피브로넥틴계 결합 분자를 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 발현시킴으로써 달성할 수 있다. 변경된 글리코실화 기구가 존재하는 세포는 당업계에서 설명되었고, 본 발명의 재조합 피브로넥틴계 결합 분자를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)에서는 그 세포주에서 발현된 항체가 과소푸코실화를 보이도록 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자 (이는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩한다)를 갖는 세포주를 설명하고 있다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 또한 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 과소푸코실화를 야기하는, 푸코스를 Asn(297)-연결 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, 즉 Lec13 세포를 설명하고 있다 (또한 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)에서는 공학처리된 세포주에서 발현된 항체가 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 증가된 이분 GlcNac 구조를 보이도록 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글로코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 공학처리된 세포주가 설명되어 있다 (또한, 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 인간-유사 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 방법은 또한 EP1297172B1 및 글리코파이 (Glycofi)의 다른 특허 패밀리에 기재되어 있다.
아미노산/뉴클레오티드 변형
하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 변경)을 갖는 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 다양한 공지의 방법에 의해 생산할 수 있다. 그러한 변형된 분자는 예를 들어 재조합 방법에 의해 생산할 수 있다. 또한, 유전자 코드의 다의성 (degeneracy) 때문에, 각각의 목적하는 분자를 코딩하기 위해 다양한 핵산 서열이 사용될 수 있다.
출발 분자의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자의 제조를 위한, 당업계에서 승인된 방법의 예는 분자를 코딩하는 기제조된 DNA의 부위 지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
부위-지정 돌연변이 유발은 치환 변이체 제조를 위한 바람직한 방법이다. 상기 기술은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985)] 및 [Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:488 (1987)] 참조). 간단히 설명하면, DNA의 부위 지정 돌연변이 유발을 수행하는데 있어서, 모 DNA는 먼저 목적하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 상기 모 DNA의 단일 가닥에 혼성화시킴으로써 변경된다. 혼성화 후에, 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하고 모 DNA의 단일 가닥을 주형으로서 사용하면서 DNA 중합효소를 사용하여 전체 제2 가닥을 합성한다. 따라서, 목적하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 생성되는 이중 가닥 DNA 내에 통합된다.
또한, PCR 돌연변이 유발은 출발 분자의 아미노산 서열 변이체를 제조하기 위해 적합하다 ([Higuchi, in PCR Protocols, pp.177-183 (Academic Press, 1990)]; 및 [Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)] 참조). 간단히 설명하면, 소량의 주형 DNA를 PCR에서 출발 물질로서 사용할 때, 주형 DNA 내의 대응하는 구역과 서열이 약간 상이한 프라이머를 사용하여, 프라이머가 주형과 상이한 위치에서만 주형 서열과 상이한 비교적 대량의 특이적 DNA 단편을 생성할 수 있다.
변이체를 제조하기 위한 다른 방법인 카세트 돌연변이 유발은 문헌 [Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)]에 설명된 기술을 기초로 한다. 출발 물질은 돌연변이시킬 출발 폴리펩티드 DNA를 포함하는 플라스미드 (또는 다른 벡터)이다. 돌연변이시킬 모 DNA 내의 코돈(들)이 확인된다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각각의 측면 상에 특유한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 존재해야 한다. 그러한 제한 부위가 존재하지 않으면, 이들 부위는 이들을 출발 폴리펩티드 DNA 내의 적절한 위치에 도입하기 위해 상기한 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이 유발 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 플라스미드 DNA는 선형화를 위해 상기 부위에서 절단된다. 제한 부위 사이의 DNA의 서열을 코딩하지만 목적하는 돌연변이(들)을 함유하는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드는 표준 절차를 이용하여 합성되고, 여기서 올리고뉴클레오티드의 2개의 가닥은 따로 합성된 후, 표준 기술을 이용하여 함께 혼성화된다. 상기 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 카세트로서 불린다. 상기 카세트는 플라스미드에 직접 라이게이팅될 수 있도록 선형화된 플라스미드의 단부들과 적합성인 5' 및 3' 말단을 갖도록 설계된다. 상기 플라스미드는 이제 돌연변이된 DNA 서열을 함유한다.
별법으로 또는 추가로, 분자의 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 목적하는 아미노산 서열이 결정될 수 있고, 그러한 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 합성 방식으로 생성될 수 있다.
당업자는 아미노산 서열은 (예를 들어, 야생형과) 상이하지만, 목적하는 활성은 상이하지 않도록 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자가 추가로 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 일으키는 추가의 뉴클레오티드 치환이 단백질에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분자 내의 비-필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 아미노산의 스트링 (string)은 측쇄 패밀리 멤버의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 교체될 수 있고, 즉, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기가 교체되는 보존적 치환이 이루어질 수 있다.
염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에서 확인되었다.
아미노산 치환 이외에, 본 발명에서는 기능상 동등한 분자를 생성하기 위해 출발 분자 아미노산 서열의 다른 변형을 고려한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 상기 실시태양에 따라 1 내지 약 10개 이하의 잔기가 결실될 것이다. 하나 이상의 아미노산 결실을 포함하는 본 발명의 피브로넥틴 분자는 바람직하게는 출발 폴리펩티드 분자의 적어도 약 80％, 바람직하게는 적어도 약 90％, 가장 바람직하게는 적어도 약 95％를 보유할 것이다.
또한, 원래의 피브로넥틴-분자 기능성을 보유하는 아미노산 삽입 변이체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 잔기 (예를 들어 1 내지 2개의 아미노산 잔기, 일반적으로 10개 이하의 잔기)를 분자 내에 도입할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 아미노산 변형들이 단일 피브로넥틴 분자 내에서 조합될 수 있다.
한 실시태양에서, 공지의 컨쥬게이팅 방법을 사용하여 모이어티를 피브로넥틴계 결합 분자에 컨쥬게이팅하기 적합한 시스테인 또는 다른 비-천연 아미노산을 포함하도록 아미노산 치환이 피브로넥틴 타입 3 도메인에 대해 수행된다. 특히, 본 발명은 Fn3 스캐폴드를 갖는 피브로넥틴계 결합 분자의 특이적 아미노산 변이체에 관한 것이고, 여기서 하나 이상의 세린 아미노산 잔기는 시스테인 또는 비-천연 아미노산에 의해 치환된다. 치환될 수 있는 세린 아미노산 잔기는 Ser 17, Ser 21, Ser 43, Ser 60, 및 Ser 89를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 치환될 수 있는 Fn3 스캐폴드의 다른 아미노산 위치는 Val11, Leu19, Thr58 및 Thr71을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 비-천연 발생 아미노산은 예를 들어 암브렉스 (Ambrex) 기술을 이용하여 Fn3 스캐폴드 내로 치환될 수 있다 (예를 들어, US 7,045,337; 7,083,970 참조).
개선된 피브로넥틴계 결합 분자를 확인하기 위한 스크리닝 분석
본 발명의 개선된 피브로넥틴계 결합 분자를 확인하기 위해 다양한 스크리닝 분석을 이용할 수 있다. 한 실시태양에서, 피브로넥틴계 결합 분자는 목적하는 항원에 대한 개선된 결합 친화도에 대해 스크리닝된다. 목적하는 항원에 대한 개선된 결합을 선택하는 임의의 시험관내 또는 생체내 스크리닝 방법이 고려된다.
또 다른 실시태양에서, 피브로넥틴계 결합 분자는 세포, 바이러스 또는 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이되고, 고정된 항원을 사용하여 선택된다. 적합한 스크리닝 방법은 미국 특허 7,063,943; 6,699,658; 7,063,943 및 5866344에 설명되어 있다. 그러한 표면 디스플레이는 세포, 바이러스 또는 박테리오파지의 외부 표면 상에 정상적으로 존재하는 적합한 단백질과 피브로넥틴계 결합 분자의 융합 단백질의 생성을 필요로 할 수 있다. 그로부터 상기 융합체를 제조하기 적합한 단백질은 당업계에 잘 알려져 있다.
또 다른 실시태양에서, 피브로넥틴계 결합 분자는 시험관내 표현형-유전자형 연관 디스플레이, 예를 들어 리보좀 또는 폴리좀 디스플레이를 사용하여 스크리닝된다. 그러한 "분자 진화 (evolution)" 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어 미국 특허 6,194,550 및 7,195,880 참조).
본 발명에서 사용되는 스크리닝 방법에서는 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 피브로넥틴계 결합 분자 내로 도입되는 것을 필요로 할 수 있다. 임의의 당업계에서 인정되는 돌연변이 유발 방법이 고려된다. 한 실시태양에서, Fn3 스캐폴드 내의 하나 이상의 아미노산 또는 그라프팅된 CDR이 무작위로 돌연변이된 피브로넥틴계 결합 분자의 라이브러리가 생성된다. 또 다른 실시태양에서, Fn3 스캐폴드 내의 하나 이상의 아미노산 또는 그라프팅된 CDR이 하나 이상의 예정된 아미노산으로 돌연변이된 피브로넥틴계 결합 분자의 라이브러리가 생성된다.
본 발명에서 사용되는 스크리닝 방법에서는 또한 항원에 대한 개선된 친화도를 갖는 피브로넥틴계 결합 분자를 선택하기 위해 항원-결합 스크리닝 분석의 엄격성이 증가되는 것을 필요로 할 수 있다. 단백질-단백질 상호작용 분석의 엄격성을 증가시키기 위한 당업계에 인정되는 방법을 여기서 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, 목적하는 항원에 대한 피브로넥틴계 결합 분자의 친화도를 감소시키기 위해 하나 이상의 분석 조건이 변화된다 (예를 들어, 분석 버퍼의 염 농도). 또 다른 실시태양에서, 피브로넥틴계 결합 분자가 목적하는 항원에 결합하도록 허용되는 시간이 감소된다. 또 다른 실시태양에서, 경쟁적 결합 단계가 단백질-단백질 상호작용 분석에 추가된다. 예를 들어, 피브로넥틴계 결합 분자를 먼저 목적하는 고정된 항원에 결합시킨다. 이어서, 고정된 항원과 결합을 위해 경쟁하는 역할을 하는 특정 농도의 비-고정된 항원을 첨가하여, 고정된 항원으로부터 항원에 대한 최저 친화도를 갖는 피브로넥틴계 결합 분자가 용출되도록 함으로써 개선된 항원 결합 친화도를 갖는 피브로넥틴계 결합 분자를 선택할 수 있다. 분석 조건의 엄격성은 분석에 첨가되는 비-고정된 항원의 농도를 증가시킴으로써 추가로 증가될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는 또한 개선된 항원 결합을 갖는 하나 이상의 피브로넥틴계 결합 분자를 농축하기 위해 다수의 라운드의 선택을 필요로 할 수 있다. 한 실시태양에서, 각각의 라운드의 선택에서, 추가의 아미노산 돌연변이가 피브로넥틴계 결합 분자 내로 도입된다. 또 다른 실시태양에서, 각각의 라운드의 선택에서, 항원에 대한 친화도가 증가된 피브로넥틴계 결합 분자를 선택하기 위해 목적하는 항원에 대한 결합의 엄격성이 증가된다.
제조 방법
본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 일반적으로 재조합 발현에 의해 생산된다. 분자를 코딩하는 핵산을 발현 벡터 내로 삽입한다. 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트는 그들의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 발현 제어 서열은 프로모터 (예를 들어, 천연 회합 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵생물 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵생물 프로모터 시스템이다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 통합되면, 숙주를 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현, 및 교차반응하는 피브로넥틴계 결합 분자의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지시킨다.
이들 발현 벡터는 일반적으로 숙주 유기체 내에서 에피좀으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용하도록 선택 마커 (예를 들어, 암피실린 내성, 히그로마이신 내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성)를 함유한다 (예를 들어, 미국 특허 4,704,362 (Itakura et al.) 참조).
이. 콜라이가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 서열)를 클로닝하기 위한 특히 유용한 하나의 원핵생물 숙주이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 간균, 예를 들어 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균과, 예를 들어 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia), 및 다양한 슈도모나스 종을 포함한다.
다른 미생물, 예를 들어 효모가 또한 발현을 위해 유용하다. 사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 피치아 (Pichia)가, 요구되는 경우에 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등이 존재하는 적합한 벡터를 함유하는 예시적인 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 해당 효소를 포함한다. 유도가능한 효모 프로모터는 특히 알콜 데히드로게나제, 이소시토크롬 C, 및 메탄올, 말토스, 및 갈락토스 활용을 책임지는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물에 추가로, 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들어, 면역글로불린 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 발현하고 생산하기 위해 포유동물 조직 배양액을 또한 사용할 수 있다 ([Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)] 참조). 진핵생물 세포가 실제로 바람직하고, 이는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포, 및 하이브리도마를 포함하여 이종 단백질 (예를 들어, 무손상 면역글로불린)을 분비할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었기 때문이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 처리 정보 부위, 예를 들어 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다 ([Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)] 참조).
별법으로, 코딩 서열은 트랜스제닉 동물의 게놈 내로의 도입 및 트랜스제닉 동물의 유즙 내에서의 후속 발현을 위해 도입유전자 (transgene) 내에 통합될 수 있다 (예를 들어, U.S. 5,741,957 (Deboer et al.), U.S. 5,304,489 (Rosen) 및 U.S. 5,849,992 (Meade et al.) 참조). 적합한 도입유전자는 카제인 또는 베타 락토글로불린과 같은, 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된, 경쇄 및/또는 중쇄의 코딩 서열을 포함한다.
목적하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 발현 제어 서열을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 종류에 따라 상이한 공지의 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 화학적으로 수용성인 (competent) 원핵생물 세포는 잠깐 동안 열 충격될 수 있고, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 바이오리스틱 (biolistic) 또는 바이러스-기반 형질감염은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)] 참조). 포유동물 세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포좀, 전기천공, 및 마이크로주사의 사용을 포함한다 (일반적으로 [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조). 트랜스제닉 동물의 생산을 위해, 도입유전자는 수정란 내에 마이크로주사될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈 내로 통합되고, 상기 세포의 핵을 제핵 (enucleated) 난모세포 내로 전달할 수 있다.
발현된 후, 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 황산암모늄 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 포함하는 당 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)] 참조). 균질성이 적어도 약 90 내지 95％인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99％ 이상의 균질성이 제약 용도를 위해 가장 바람직하다.
조성물
본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자 (및 그의 변이체, 융합체, 및 컨쥬게이트)는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 효용을 갖는다. 따라서, 본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화된, 피브로넥틴계 결합 분자 (또는 그의 변이체, 융합체, 및 컨쥬게이트) 중의 하나 또는 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉, 다른 물질과 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 소염제, 항암제, 및 화학치료제를 포함하는 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 방사선 요법과 함께 투여될 수 있다. 다른 피브로넥틴계 분자와의 동시-투여도 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용할 때, "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 적합성인 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
"제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 바람직하지 않은 독성학적 효과를 보이지 않는 염을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 상기 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 무독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터, 및 무독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터, 및 무독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유도된 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 상이할 것이다. 활성 화합물은 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화 (microencapsulated) 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제형과 같이 신속 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 그러한 제형 제조를 위한 많은 방법은 특허 등록되었거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 그의 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나 그러한 물질과 화합물을 동시-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 적절한 담체, 예를 들어, 리포좀, 또는 희석제 내에서 대상에게 투여될 수 있다. 제약상 허용되는 희석제는 염수 및 수성 버퍼 용액을 포함한다. 리포좀은 수중유중수형 CGF 에멀젼 및 통상적인 리포좀을 포함한다 (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 수분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 물질의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 화합물에 비적합성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물도 조성물 내로 포함시킬 수 있다.
치료 조성물은 일반적으로 멸균되고 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙적인 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 경우에 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 활성 화합물을 요구되는 양으로 적절한 용매 내에 포함시킨 후, 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산매와 상기 열거한 것으로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 포함시킴으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 그의 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 요구되는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
투여 계획은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스 (bolus)가 투여될 수 있거나, 수회의 분할 용량이 일정 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성이 나타내는 바에 따라 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자는 피하 주사에 의해 매주 1회 또는 2회, 또는 피하 주사에 의해 매달 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 투여형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용될 때 단위 투여형은 치료할 대상을 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분되는 단위를 나타내고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형에 대한 상세 내역은 (a) 활성 화합물의 특유한 특징 및 달성할 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감수성 치료를 위해 상기 활성 화합물을 화합하는 기술에 내재된 한계에 의해 지시되고 그에 대해 직접적으로 의존한다.
제약상 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
치료 조성물에 대해, 본 발명의 제형은 경구, 비내, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 것을 포함한다. 제형은 편리하게는 단위 투여형으로 제공될 수 있고, 제약업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여형을 생산할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상, 및 특정 투여 방식에 따라 변할 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여형을 생산할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성시키는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100％ 중에서, 상기 양은 약 0.001％ 내지 약 90％, 바람직하게는 약 0.005％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게는 약 0.01％ 내지 약 30％의 활성 성분일 것이다.
질 투여에 적합한 본 발명의 제형은 또한 적절한 것으로 당업계에 공지된 상기 담체를 함유하는 페서리 (pessary), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포체 (foam) 또는 스프레이 제형을 포함한다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물을 멸균 조건 하에 제약상 허용되는 담체, 및 요구될 수 있는 임의의 보존제, 버퍼 또는 추진제와 혼합할 수 있다.
본원에서 사용되는 문구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된"은 대체로 주사에 의한, 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에 사용할 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물, 식물유, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 존재 예방은 상기한 멸균 절차에 의해 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입에 의해 보장할 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것도 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 도입에 의해, 주사가능한 제약 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.
본 발명의 화합물이 인간 및 동물에게 의약품으로서 투여될 때 이들은 단독으로, 또는 예를 들어 0.001 내지 90％ (보다 바람직하게는 0.005 내지 70％, 예를 들어 0.01 내지 30％)의 활성 성분을 제약상 허용되는 담체와 조합으로 함유하는 제약 조성물로서 제공될 수 있다.
선택된 투여 경로에 무관하게, 본 발명의 화합물 (이는 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있음) 및/또는 본 발명의 제약 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용되는 투여형으로 제형화된다.
본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료의 지속 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합으로 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의료력, 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사한 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 따라 결정될 것이다. 당업계의 통상적인 수준의 의사 또는 수의사는 요구되는 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에서 사용되는 본 발명의 화합물의 용량을 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 더 낮은 수준에서 사용하기 시작하고, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 용량은 치료 효과를 생성하기 위해 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 그러한 유효 용량은 일반적으로 상기 설명된 인자에 따라 결정될 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 투여가 바람직하고, 바람직하게는 표적 부위에 근접하게 투여된다. 원하는 경우에, 치료 조성물의 유효 일일 용량은 임의로 단위 투여형으로 하루 내내 적절한 간격으로 별개로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 하위-용량으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 화합물을 제약 제형 (조성물)으로 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예를 들어 미국 특허 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, 또는 4,596,556에 개시된 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 공지된 임플란트 및 모듈의 예는 약물을 제어된 속도로 분배하기 위한 삽입형 미세-주입 펌프를 제시하는 미국 특허 4,487,603; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 제시하는 미국 특허 4,486,194; 약물을 정확한 주입 속도로 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 제시하는 미국 특허 4,447,233; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 유동 삽입형 주입 장치를 제시하는 미국 특허 4,447,224; 다챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 4,475,196을 포함한다. 다른 많은 그러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 분자는 생체 내에서 적합한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 많은 고친수성 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 가로지르도록 (원하는 경우에) 보장하기 위해, 이들을 예를 들어 리포좀 내에 제형화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정한 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송되어, 표적화된 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조); 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 ([P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); 본 발명의 제형, 및 본 발명의 분자의 성분을 포함할 수 있는 상이한 종; p120 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다 (문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, (1994) FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 또한 참조한다). 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀 내에서 제형화되고; 보다 바람직한 실시태양에서, 리포좀은 표적화 모이어티를 포함한다. 가장 바람직한 실시태양에서, 리포좀 내의 치료 화합물은 볼러스 주사에 의해 종양 또는 감염에 근접한 부위로 전달된다. 조성물은 주사가능성을 용이하게 하는 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하고, 미생물에 대해, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 분자는 태반을 가로지른 수송을 방지 또는 감소시키도록 제형화될 수 있다. 이것은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 피브로넥틴계 결합 분자의 PEG화에 의해 이루어질 수 있다. 문헌 ["Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates, Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152:177-190]; 및 ["Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283])을 추가로 참조할 수 있다. 이것은 피브로넥틴계 결합 분자가 재발성 자연 유산을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 때 특히 관련된다.
암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 별법으로, 조성물의 상기 특성은 숙련된 당업자에게 공지된 분석에 의해 시험관 내에서 상기 억제를 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가할 수 있다. 치료 유효량의 치료 화합물은 종양 크기를 감소시키거나, 대상에서 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자는 대상의 체격, 대상의 증상의 심도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 멸균되고 조성물이 시린지에 의해 전달가능한 정도로 유체이어야 한다. 물 이외에, 담체는 등장 완충 염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.
활성 화합물이 상기 설명한 바와 같이 적합하게 보호될 때, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체를 사용하여 경구 투여될 수 있다.
치료 및 진단 용도
본원에서 설명되는 피브로넥틴계 결합 분자는 관심있는 임의의 항원에 결합하도록 구성될 수 있고, 증가된 안정성 및 반감기, 및 추가의 기능적 모이어티를 갖도록 변형될 수 있다. 따라서, 이들 분자는 연구, 치료 및 진단 분야를 포함한, 항체가 사용되는 모든 영역에서 항체 대신에 사용될 수 있다. 또한, 상기 분자는 항체에 비해 뛰어난 용해도 및 안정성 특성을 가지므로, 본원에서 설명되는 항체 모방체는 또한 항체 분자를 파괴하거나 불활성화시킬 조건 하에 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 분자는 다양한 질환을 치료, 예방 또는 진단하기 위해 배양액 내에서, 예를 들어 시험관 내에서 또는 생체 외에서, 또는 대상에서, 예를 들어, 생체 내에서 세포에 투여될 수 있다. 용어 "대상"은 본원에서 사용될 때 인간 및 비-인간 동물을 포함하도록 의도된다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함한다. 피브로넥틴 분자가 다른 물질과 함께 투여될 때, 2개는 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자 (및 그의 변이체, 융합체, 및 컨쥬게이트)는 그 분자에 의해 결합된 표적 및/또는 이중특이적/다중특이적 피브로넥틴계 결합 분자에 의해 결합된 표적의 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 샘플 (예를 들어, 시험관내 샘플) 및 대조 샘플을 분자와 표적(들) 사이의 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 분자와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 분자와 표적(들) 사이에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다. 예를 들어, 당업계에 잘 공지된 표준 검출 방법, 예를 들어 ELISA, FACS, 및 유동 세포 분석을 본 발명의 조성물을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 피브로넥틴계 결합 분자, 그의 변이체, 융합체, 및 컨쥬게이트) 및 사용 지시서를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범위 내에포함된다. 키트는 적어도 하나의 추가의 시약, 또는 하나 이상의 추가의 본 발명의 피브로넥틴 분자 (예를 들어, 제1 분자와 구분되는 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 상보 활성을 갖는 항체)를 더 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 지시하는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 또는 다른 방식으로 키트에 부속되는 임의의 필기물, 또는 기록물을 포함한다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 분자는 연구, 치료, 및 진단 분야의 모든 영역에서 사용될 수 있다. 본 발명의 피브로넥틴계 결합 분자 (및 그의 변이체, 융합체, 및 컨쥬게이트)를 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 질환/질환은 자가면역 질환, 염증, 암, 감염성 질환, 심혈관 질환, 위장관 질환, 호흡기 질환, 대사 질환, 근골격계 질환, 신경변성 질환, 정신 질환, 안질환, 과다형성, 당뇨성 망막병증, 황반 변성, 염증성 장 질환, 크론 (Crohn) 병, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염, 당뇨병, 사르코이드증, 천식, 부종, 폐 고혈압, 건선, 각막 이식 거부반응, 신생혈관 녹내장, 오슬러-웨버 (Osler-Webber) 증후군, 심근 혈관신생, 경화반내 신생혈관 증식, 재협착증, 혈관 외상 후의 신생혈관내막 형성, 모세혈관확장증, 혈우병 관절, 혈관섬유종, 만성 염증 연관 섬유증, 폐 섬유증, 아밀로이드증, 알츠하이머 (Alzheimer) 병, 장기 이식 거부반응, 심부 정맥 혈전증 또는 상처 과립형성을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 본 발명의 분자는 자가면역 질환, 예를 들어 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 피부근염, 시덴함 (Sydenham) 무도병, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신장염, 류마티스열, 다분비선 증후군, 수포성 유천포창, 연소기 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 (Henoch-Schonlein) 자색반, 연쇄구균 감염후 신장염, 결절 홍반, 다까야스 (Takayasu) 동맥염, 애디슨 (Addison) 병, 류마티스 관절염, 다발 경색증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굳패스쳐 (Goodpasture) 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 원발성 담즙성 경화증, 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 갑상선 기능항진증 (즉, 그레이브스 (Graves) 병), 피부경화증, 만성 활동성 간염, 다발근육염/피부근염, 다발연골염, 심상성 천포창, 베게너 (Wegener) 육아종증, 막성 신장병증, 근위축성 측삭 경화증, 척수 매독, 거대세포 동맥염/다발성 근육통, 악성 빈혈, 신속 진행형 사구체신장염, 건선 또는 섬유화 폐포염의 치료를 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 분자는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 표적화될 수 있는 종양의 예시적인 종류는 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담도암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결직장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 호지킨 림프종, 폐암, 갑상선 수질암, 비-호지킨 림프종, 다발 골수종, 신장암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 간암, 전립선암, 신경교 및 다른 뇌 및 척수 종양, 및 방광암을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 분자는 병원성 유기체, 예를 들어 세균, 바이러스, 진균, 또는 단세포 기생충의 치료를 위해 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 예시적인 진균은 마이크로스포룸 (Microsporum), 트리코피톤 (Trichophyton), 에피더모피톤 (Epidermophyton), 스포로쓰릭스 쉔키이 (Sporothrix schenckii), 크립토코커스 네오프르만스 (Cryptococcus neoformans), 코시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis), 히스토플라스마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 블라스토마이세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis) 또는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)을 포함한다. 예시적인 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 유두종 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 센다이 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 레오 바이러스, 폴리오 바이러스, 인간 혈청 파르보-유사 바이러스, 원숭이 바이러스 40, 호흡기 세포융합 바이러스, 마우스 유선 종양 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 뎅기 바이러스, 풍진 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 볼거리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 신드비스 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스 또는 청설 바이러스를 포함한다. 예시적인 세균은 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 스트렙토코커스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophilia), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 네이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 뉴모코커스 (Pneumococcus) 종, 헤모필리스 인플루엔자에 비 (Hemophilis influenzae B), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 라임병 스피로헤테스 (spirochetes), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 미코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae), 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 미코박테리움 튜베르큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 또는 미코플라스마 (Mycoplasma)를 포함한다. 예시적인 기생충은 기아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 기아르디아 종, 뉴모시스티스 카리니이 (Pneumocystis carinii), 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 크립토스포르디움 (Cryptospordium) 종, 아칸타모아베 (Acanthamoeba) 종, 나에글레리아 (Naegleria) 종, 리슈만편모충 (Leishmania) 종, 발란티디움 콜라이 (Balantidium coli), 트리파노소마 에반시 (Trypanosoma evansi), 트리파노소마 종, 디엔타모에바 프라길리스 (Dientamoeba fragilis), 트리코모나스 바기날리스 (Trichomonas vaginalis), 트리코모나스 종, 엔타모에바 종, 디엔타모에바 종, 바베시아 종, 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 이소스포라 (Isospora) 종, 톡소플라스마 (Toxoplasma) 종, 엔테로시토준 (Enterocytozoon) 종, 뉴모시스티스 종 및 발란티듐 종을 포함한다.
치료 및 진단 용도
본원에서 설명되는 피브로넥틴계 결합 분자는 관심있는 임의의 항원 또는 표적에 결합하도록 구성될 수 있다. 그러한 표적은 클러스터 도메인, 세포 수용체, 세포 수용체 리간드, 성장 인자, 인터류킨, 단백질 알레르겐, 세균, 또는 바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, 도 7A-C 참조). 본원에서 설명되는 피브로넥틴계 결합 분자는 또한 증가된 안정성 및 반감기, 및 추가의 기능적 모이어티를 갖도록 변형될 수 있다. 따라서, 이들 분자는 연구, 치료 및 진단 분야를 포함하여 항체가 사용되는 모든 영역에서 항체 대신에 사용될 수 있다. 또한, 상기 분자는 항체에 비해 뛰어난 용해도 및 안정성 특성을 가지므로, 본원에서 설명되는 항체 모방체는 또한 항체 분자를 파괴하거나 불활성화시키는 조건 하에서도 사용될 수 있다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 예시되고, 실시예는 추가로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원 전체에서 인용된 모든 도면 및 모든 참조문, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
예시
실시예 전체에서, 달리 진술하지 않으면 다음 물질 및 방법을 사용하였다.
물질 및 방법
일반적으로, 본 발명 실시에서는 달리 나타내지 않으면 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학의 통상적인 기술 (특히 예를 들어, 항체 기술), 및 폴리펩티드 제조에서 표준 기술을 사용한다. 예를 들어, 문헌 ([Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996)]; [Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Ir1 Pr (1996)]; [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley and Sons (1992)])을 참조한다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 적합한 다른 방법, 기술 및 서열은 미국 특허 7,153,661; 7,119,171; 7,078,490; 6,703,199; 6,673,901; 및 6,462,189에서 발견된다.
서열
다음 서열을 실시예 전체에 걸쳐 사용하였다.
야생형 Fn3 서열
Figure pct00001
야생형 Fn3 서열 (RGD로부터 RGA로의)
Figure pct00002
TNF -결합 Fn3 서열
Figure pct00003
TNF -결합 Fn3 ( R18L 및 I56T )
Figure pct00004
VEGFR -결합 Fn3
Figure pct00005
dsbA 신호 서열
Figure pct00006
CD33 신호 서열 + TNF -결합 Fn3 서열
Figure pct00007
CD33 신호 서열 + TNF -결합 Fn3 ( R18L 및 I56T )
Figure pct00008
CD33 신호 서열 + 야생형 Fn3
Figure pct00009
CD33 신호 서열 + 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의)
Figure pct00010
CD33 신호 서열 + VEGFR -결합 Fn3
Figure pct00011
TNF -결합 나노바디
Figure pct00012
TNF -결합 단일 도메인 항체
Figure pct00013
항- HSA 바인더
Figure pct00014
항- MSA 바인더
Figure pct00015
항- RSA 바인더
Figure pct00016
인간 혈청 알부민 ( HSA )
Figure pct00017
래트 혈청 알부민 ( RSA )
Figure pct00018
hIgG1 Fc
Figure pct00019
프라이머
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
실시예
실시예 1
CDR 그라프팅
컴퓨터 모델링을 이용하여, TNF-결합 나노바디 (서열 10)로부터의 CDR 루프 1 (SGFTFSDYWM - 서열 35) 및 루프 3 (RSPSGFNR - 서열 36)을 인간 피브로넥틴 타입 III 모듈 ("10Fn3" 또는 "야생형 Fn3")의 야생형 제10 도메인의 프레임워크 상으로 그라프팅하였다. TNF-결합 나노바디 및 야생형 Fn3 분자의 아미노산 서열은 다음과 같다:
TNF -결합 나노바디 (서열 10)
Figure pct00023
야생형 Fn3 (서열 1)
Figure pct00024
동일한 방법을 사용하여, TNF-결합 단일 도메인 항체 (서열 40)으로부터의 CDR 루프 1 (SQAIDSY - 서열 38) 및 루프 3 (QVVWRPFT - 서열 39)을 야생형 Fn3 상에 그라프팅하였다. TNF-결합 단일 도메인 항체의 아미노산 서열은 다음과 같다:
TNF -결합 단일 도메인 항체 (서열 40)
Figure pct00025
이어서, 아래에 제시된 형식의 DNA 서열을 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. 생성되는 DNA 단편을 NdeI/BamHI로 소화시키고, pET9a의 대응하는 부위 내로 라이게이팅하였다 (적절한 옆에 접하는 (flanking) DNA 서열을 아래의 형식에 첨가하였다).
형식:
1) TNF 결합 나노바디 - His 태그 (pET9a)로부터의 CDR1 및 CDR3 루프를 갖는 야생형 Fn3
Figure pct00026
2) TNF 결합 나노바디 - His 태그 (pET9a)로부터의 CDR1 및 CDR3 루프를 갖는 야생형 Fn3 (여기서 처음 8개의 아미노산은 서열로부터 제거된다).
Figure pct00027
3) TNF 결합 단일 도메인 항체 - His 태그 (pET9a)로부터의 CDR1 및 CDR3 루프를 갖는 야생형 Fn3
Figure pct00028
4) TNF 결합 단일 도메인 항체 - His 태그 (pET9a)로부터의 CDR1 및 CDR3 루프를 갖는 야생형 Fn3 (여기서 처음 8개의 아미노산은 서열로부터 제거된다)
Figure pct00029
라이게이션 믹스 (mix)를 사용하여 XL1-Blue 또는 DH5알파 수용성 세포를 형질전환시켰다. 양성 클론을 DNA 서열결정에 의해 입증하였다. 구성체를 BL21 (DE3)을 포함한 몇몇 이. 콜라이 종에서 발현시켰다. 유도 및 발현 후에, 세포 펠렛을 -20℃에서 동결시킨 후, 용해 버퍼 (20 mM NaH2PO4, 10 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 50 ml 버퍼 당 EDTA가 없는 Complete (로슈 (Roche)) 1 정제, 2 mM MgCl2, 10 U/ml 벤조나제 (머크 (Merck)) [pH7.4]) 내에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 초음파 분해하고, 원심분리하였다. 상등액을 여과하고 Ni-NTA 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 세척 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 20 mM 이미다졸을 함유함)로 세척한 후, 용출 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 500 mM까지의 이미다졸을 함유함)를 사용하여 용출시켰다. 샘플을 Bis-Tris 겔 (인비트로겐 (Invitrogen)) 상에서 분석한 후, Amicon Ultra-15 튜브 내에서 농축시키고, 수퍼덱스 프렙 (Superdex prep) 등급 컬럼 (아머샴 (Amersham)) 상으로 로딩하고, 10 mM Tris 또는 PBS로 용출시켰다. 샘플을 다시 Bis-Tris 겔 상에서 분석하였다.
실시예 2
아미노산 변형에 대한 피브로넥틴 분자 내의 위치의 확인
야생형 Fn3 서열의 검토에 기초하여, 아미노산 변형, 예를 들어, PEG화를 용이하게 하기 위해 시스테인 또는 비-천연 발생 아미노산 잔기로의 치환을 위한 잠재적인 부위로서의 위치를 확인하였다. 예를 들어, 세린 잔기를 아래에 설명되는 바와 같이 분석하였다. 총 11개의 Ser 잔기가 존재하고, 이를 아래의 서열에서 밑줄친다 (또한, 세린 잔기를 막대로 표시한 야생형 Fn3 분자를 보여주는 도 1을 참조한다)
야생형 Fn3
Figure pct00030
결합 표면 가까이에 위치하는 세린 잔기, 예를 들어, N-말단 구역에 속하고 또한 FG 및 BC 루프와 접촉하는 Ser 2 (아래의 서열에서 밑줄친 Ser 잔기)는 분석으로부터 배제하였다.
Figure pct00031
Ser 53 - Ser 55 - 이들 잔기는 DE 루프에 속한다 (아래에 밑줄침).
Figure pct00032
Ser 81 - Ser 84 - Ser 85 - 이들 잔기는 FG 루프에 속한다 (아래에 밑줄침).
Figure pct00033
변형을 위한 세린 후보는 Ser 17 - Ser 21 - Ser 43 - Ser 60 - Ser 89를 포함한다. 이들 세린 잔기는 모두 용매에 노출되고, Ser 43을 제외하고는 모두 베타-가닥의 일부이다 (도 2 참조).
Ser 17 및 Ser 21은 각각 B 가닥의 시작 및 끝에 위치한다. Ser 60은 E 가닥의 끝에 위치한다.
Ser 21 및 Ser 60은 피브로넥틴의 3-가닥 시트를 형성하는 2개의 인접한 가닥 상에 위치한다.
Ser 89는 또한 4-가닥 시트를 형성하는 마지막 가닥인 G 가닥의 중간에 위치한다. 따라서, Ser 89는 또한 용매에 노출되고 외부 분자에 접근가능하다.
Ser 43은 분자의 저변에 위치하고, 용매를 향해 굽어진 루프의 끝에서 CD 루프에 속한다 (도 2 참조).
잠재적인 변형 부위를 위한 다른 잔기는 베타 가닥 상에 위치하고 용매에 노출되는 다음 잔기를 포함한다: V11 - L19 - T58 - T71 (아래의 서열에서 밑줄침).
Figure pct00034
도 3을 살펴보면, 3-가닥 시트가 도시된다 (가닥 A-B-E). 시트의 저변에, 후보 잔기 Ser 17 및 Ser 60이 존재한다. 후보 잔기 Ser 21은 상단에 위치한다. Ser 55는 결합 표면에 가까우므로 배제되었다.
가닥 A의 개시에 가까이 위치하는 Val 11은 피브로넥틴 모듈 서열에 보존되는 것으로 보이지 않는다.
가닥 B의 중간에 위치하는 Leu 19도 보존된 위치가 아니다.
Thr 58은 가닥 E의 끝에 위치한다.
도 4 (스캐폴드의 다른 측면; 4-가닥 시트)를 살펴보면, Thr 71은 Ser 89에 가까이 위치한다. 상기 위치도 또한 보존되지 않는다. 피브로넥틴 분자의 상기 부분이 일종의 "C" 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다. FG 루프 및 CD 루프는 서로를 향하여 보고 있다 (도 5 참조).
분자에 부착하는 PEG 분자의 크기에 따라, 분자의 상기 측면은 PEG화에 이용가능하지 않을 수 있다.
실시예 3
Fn3 서열의 PEG 화
Fn의 반감기를 증가시키기 위해, (1) 시스테인 및 (2) 비-천연 아미노산을 사용하는 TNF-결합 Fn3 (서열 3), TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) (서열 4), 야생형 Fn3 (서열 1) 및 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) (서열 2)의 PEG화를 다음과 같이 수행하였다.
TNF -결합 Fn3
Figure pct00035
TNF -결합 Fn3 ( R18L 및 I56T )
Figure pct00036
야생형 Fn3
Figure pct00037
야생형 Fn3 서열 (RGD로부터 RGA로의)
Figure pct00038
시스테인을 사용하는 PEG 화
상기한 TNF-결합 Fn3 및 야생형 Fn3 서열에 상응하는 DNA 서열을 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. C-말단 시스테인 잔기의 삽입을 위해, TNF-결합 서열을 프라이머 6 (서열 21) 및 7 (서열 22)을 사용하여 증폭시키고, 야생형 서열을 프라이머 6 (서열 21) 및 8 (서열 23)을 사용하여 증폭시켰다 (물질 및 방법 섹션에서 상기 설명된 프라이머 참조). PCR 생산물을 NdeI/BamHI로 소화시키고, pET9a의 대응하는 부위 내로 클로닝하였다. 또한, TNF-결합 서열을 프라이머 9 (서열 24) 및 10 (서열 25)을 사용하여 증폭시키고, 야생형 서열을 프라이머 9 (서열 24) 및 11 (서열 26)을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생산물을 BamHI/HindIII으로 소화시키고, dsbA 신호 서열을 갖는 pQE-80L의 대응하는 부위 내로 클로닝하였다.
형식:
1) TNF-결합 Fn3 서열 - 3xA 링커 - C - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00039
2) TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) 서열 - 3xA 링커 - C - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00040
3) 야생형 Fn3 서열 - 3xA 링커 - C - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00041
4) 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - 3xA 링커 - C - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00042
4) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 서열 - 3xA 링커 - C - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00043
5) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) 서열 - 3xA 링커 - C - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00044
6) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 서열 - 3xA 링커- C - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00045
7) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - 3xA 링커 - C - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00046
8) 야생형 Fn3 서열 (RGD로부터 RGA로의) - His 태그 (pET9a)
Figure pct00047
라이게이션 믹스를 사용하여 XL1-Blue 또는 DH5알파 수용성 세포를 형질전환시켰다. 양성 클론을 DNA 서열결정에 의해 입증하였다. 구성체를 KS474, TG1 (-) 및 BL21 (DE3)을 포함한 몇몇 이. 콜라이 종에서 발현시켰다. 유도 및 발현 후에, 세포 펠렛을 -20℃에서 동결시킨 후, 용해 버퍼 (20 mM NaH2PO4, 10 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 50 ml 버퍼 당 EDTA가 없는 Complete (로슈) 1 정제, 2 mM MgCl2, 10 U/ml 벤조나제 (머크) [pH7.4]) 내에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 초음파 분해하고, 원심분리하였다. 상등액을 여과하고 Ni-NTA 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 세척 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 20 mM 이미다졸을 함유함)로 세척한 후, 용출 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 500 mM까지의 이미다졸을 함유함)로 용출하였다. 샘플을 Bis-Tris 겔 (인비트로겐) 상에서 분석한 후, Amicon Ultra-15 튜브 내에서 농축시키고, 수퍼덱스 프렙 등급 컬럼 (아머샴) 상으로 로딩하고, PBS [pH6.5에서 7.2]로 용출하였다 (겔 여과 전에 가벼운 환원이 때때로 사용된다). 샘플을 다시 Bis-Tris 겔 상에서 분석하였다. 정제된 단백질에 DTT (최종 농도 10 μM)를 보충한 후, Amicon Ultra-4 튜브, 100k를 통해 여과하여 내독소를 제거하였다. DTT 제거를 위해 HiTrap 탈염 컬럼을 사용하였다. pH 5.5에서 50 mM MES 버퍼 내의 샘플을 약 4시간 동안 실온에서 5 내지 10 몰 과량의 PEG-말레이미드와 커플링시키고, PEG화의 효율을 SDS-PAGE 및 MS에 의해 분석하였다. 과잉의 PEG는 HiTrap-SP-FF 컬럼에 이어, PBS 또는 Tris를 사용한 투석을 통해 제거하였다. 상응하는 항원에 대한 결합은 ELISA에 의해 입증하였다. PEG화의 부위를 환원, 알킬화 및 트립신 소화에 의해 결정하였다. 100 ㎍의 샘플을 건조시키고, 100 ㎕의 최종 부피에서 6.4M 우레아, 0.32M NH4CO3 및 0.01M DTT와 함께 30분 동안 50℃에서 아르곤 하에 인큐베이팅한 후, IAA를 첨가하고 (0.03M), 15분 동안 실온에서 암소에서 인큐베이팅하였다. 샘플을 탈염하고, 건조시킨 후, 50 ㎕의 최종 부피에서 0.8M 우레아, 0.04M NH4CO3, 0.02M Tris (pH 10) 및 1 ㎍ 트립신과 함께 인큐베이팅하고, LC-MS에 의해 분석하였다.
이들 구성체의 반감기를 생체 내에서 결정하였다. 10 mg/kg의 각각의 화합물을 루이스 래트 (n=3)에 정맥내 투여하고, 투여전, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 192 및 384 hr에 샘플을 취하였다. Biacore 분석을 표준 아민 커플링을 이용하여 CM5 칩을 사용하여 수행하였다. 유동 셀 (cell) 1은 참조 삭감을 위한 블랭크 (blank)였다 (EDC/NHS를 사용한 표면 활성화 및 에탄올아민을 사용한 후속적인 비활성화). 유동 셀 2를 PK 판독 (read-out)을 위해 THE 항-HIS mAb (젠스크립트 코프 (GenScript Corp))로 코팅하였다. 유동 셀 3 및 4를 면역원성 판독을 위해 동물에게 투여한 화합물로 코팅하였다 (표면 포화). 래트 혈청 샘플을 HBS-EP 및 NBSreducer (비아코어 (Biacore); 최종 농도 1 mg/ml)로 1:8로 희석하였다. 화합물 정량을 위해 표준 곡선을 작성하고, 동물에게 투여된 대응하는 화합물의 20 mg/l에서 0.078 mg/l로의 1:2 연속 희석액을 래트 혈청 (젠텍스 (GeneTex)) 내에 제조하였다. 래트 혈청을 HBS-EP 및 1 mg/ml NSBreducer로 1:8로 희석하였다. 표준 곡선 데이타를 XLfit 4.2를 사용하여 피팅하고, 이를 사용하여 혈청 샘플 내의 화합물 농도 (PK)를 계산하였다. 화합물 반감기는 WinNonlin 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. PK 데이타는 비-구획 모델을 사용하여 피팅하였다.
야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 및 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의)_cys를 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하고, SDS PAGE에 의해 분석하였다 (도 8a). 단량체에 추가하여, 시스테인 변이체에 대해 이량체가 또한 관찰되었다. LC-MS에서는 비변형된 것에 대해 10.85 kDa 및 시스테인 변이체에 대해 11.38 kDa의 질량을 보여주었고, 이들 분자량은 예상된 단백질에 상응한다 (데이타 미제시).
야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의)_cys를 30 kDa PEG-말레이미드로 변형시켰다. 도 8b은 SDS-PAGE에 의해 PEG화된 단백질의 존재를 보여주고, 이는 MALDI-TOF_MS에 의해 추가로 확인되었다. PEG화된 샘플은 42.8 kDa의 MW를 보였고, 넓은 피크는 PEG로 인한 것이었다. PEG화의 부위는 환원된, 알킬화된 및 트립신 소화된 PEG화된 및 비-PEG화된 샘플 (데이타 미제시)의 LC-MS 분석에 의해 결정하였다. 펩티드 맵 (map)의 비교는 RT 10.89 min에서 피크가 PEG화된 샘플에서 손실됨을 보여주었다. 상기 펩티드는 1527.7 Da의 단일등방 (monoisotropic) MW를 갖고, 이는 예상된 단백질 (데이타 미제시)의 T[95-108]H (위치 99에서 시스테인을 함유하는 펩티드)에 상응한다.
생체내 데이타는 비변형된 10Fn3 (도 9)에 비교할 때 PEG화된 야생형 10Fn3 (도 10)에 대해 유의한 반감기 개선을 보여주었다. 비변형된 10Fn3에 대한 평균 반감기는 0.52h이고, 이는 PEG화된 10Fn3에 대해 3.6h로 증가하였다 (도 11). 동물 EV3을 사용하여 신호가 검출될 수 없었다.
상기 래트 연구의 결과는 PEG화된 컨쥬게이트로서 제조될 때 피브로넥틴 (10Fn3)의 생체내 혈청 반감기가 유의하게 연장될 수 있음을 입증한다.
래트 연구로부터의 생체내 반감기 결과를 인간에 외삽하기 위해, 다음 화학식을 사용한다:
Figure pct00048
식에서, 지수 0.25는 실험값이고, 유사한 청소 메카니즘을 갖는 종을 사용한 외삽을 위한 우수한 기초를 제공한다 (예를 들어, 문헌 [West et al. (1997) Science 276:122-126]; [Bazin-Redureau et al. (1998) Toxicology and applied pharmacology 150:295-300]; 및 [Dedrick (1973) J. Pharmacokinetics and Biopharmaceuticals 5:435-461] 참조). 수학식 1을 이용하여, 사람에서 외삽된 평균 반감기는 약 14.9시간인 것으로 예상된다.
컨쥬게이팅된 Fn3 분자를 사용한 반감기의 평균 증가 배수는 컨쥬게이팅된 Fn3 분자의 평균 반감기를 비컨쥬게이팅된 Fn3 분자의 평균 반감기로 나누어 계산할 수 있다. 예를 들어, 평균 Fn3-PEG 컨쥬게이트 (3.6)를 평균 비컨쥬게이팅된 Fn3 (0.52)으로 나누면, PEG-Fn3 컨쥬게이트의 생체내 반감기에서 약 7의 증가 배수를 생성시킨다.
비-천연 아미노산을 사용하는 PEG 화
TNF-결합 Fn3 (서열 3 및 서열 4) 및 야생형 Fn3 (서열 1 및 서열 2) 서열에 상응하는 상기 설명된 DNA 서열을 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. C-말단 앰버 (amber) 코돈의 삽입을 위해, 프라이머 12 (서열 27) 및 13 (서열 28)을 사용하여 TNF-결합 서열 (서열 3 및 서열 4)를 증폭시키고, 프라이머 12 (서열 27) 및 14 (서열 29)를 사용하여 야생형 서열 (서열 1 및 서열 2)을 증폭시켰다. PCR 생산물을 NdeI/BamHI로 소화시키고 pET9a의 대응하는 부위 내로 클로닝하였다. 또한, 프라이머 15 (서열 30) 및 16 (서열 31)을 사용하여 TNF-결합 서열 (서열 3 및 서열 4)을 또한 증폭시키고, 프라이머 15 (서열 30) 및 17 (서열 32)을 사용하여 야생형 서열 (서열 1 및 서열 2)을 증폭시켰다. PCR 생산물을 BamHI/HindIII로 소화시키고, dsbA 신호 서열을 갖는 pQE-80L의 대응하는 부위 내로 클로닝하였다.
형식:
1) TNF-결합 Fn3 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00049
2) TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00050
3) 야생형 Fn3 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00051
4) 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pET9a)
Figure pct00052
5) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00053
6) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00054
7) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00055
8) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - 3xA 링커 - 앰버 코돈 - 3xA 링커 - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00056
*는 비-천연 아미노산의 위치를 나타낸다.
라이게이션 믹스를 사용하여 XL1-Blue 또는 DH5알파 수용성 세포를 형질전환시켰다. 양성 클론을 DNA 서열결정에 의해 입증하였다. 상기 구성체 및 pAmber-AcPheRS를 동시-형질전환시키고, KS474, TG1 (-), BL21 (DE3) 및 DH10B를 포함한 몇몇 이. 콜라이 종에서 발현시켰고, 배지는 1 mM p-아세틸-L-페닐알라닌을 함유하였다. 유도 및 발현 후에, 세포 펠렛을 -20℃에서 동결시킨 후, 용해 버퍼 (20 mM NaH2PO4, 10 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 50 ml 버퍼 당 EDTA가 없는 Complete (로슈) 1 정제, 2 mM MgCl2, 10 U/ml 벤조나제 (머크) [pH7.4]) 내에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 초음파 분해하고, 원심분리하였다. 상등액을 여과하고 Ni-NTA 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 세척 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 20 mM 이미다졸을 함유함)로 세척한 후, 용출 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 500 mM까지의 이미다졸을 함유함)로 용출하였다. 샘플을 Bis-Tris 겔 (인비트로겐) 상에서 분석한 후, Amicon Ultra-15 튜브 내에서 농축시키고, 수퍼덱스 프렙 등급 컬럼 (아머샴) 상으로 로딩하고, 10 mM Tris로 용출하였다. 샘플을 다시 Bis-Tris 겔 상에서 분석하였다. 정제된 단백질을 100 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)에 대해 투석하고, 약 2시간 동안 실온에서 5 내지 10 몰 과량의 PEG-히드라지드와 커플링시켰다. PEG화의 효율을 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 분석하였다. 이어서, 농축된 Tris를 사용하여 pH를 증가시키고, 과잉의 PEG는 Ni-NTA 크로마토그래피에 이어서 PBS 또는 Tris를 사용한 투석에 의해 제거하였다.
실시예 4
Fn3 서열의 혈청 알부민 ( HSA ) 융합
항-HSA (서열 12), 항-MSA (서열 13), 항-RSA 바인더 분자 (서열 78), RSA (서열 79), 또는 HSA (서열 14)와 조합한 상기 설명된 TNF-결합 Fn3 서열 (서열 3), TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) (서열 4), 야생형 Fn3 서열 (서열 1), 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) (서열 2) 또는 VEGFR-결합 FN3 (서열 76)을 사용하여 피브로넥틴 - 혈청 알부민 융합 분자를 제조하였다.
(i) 항- HSA , 항- MSA 또는 항- RSA 융합 분자
항-HSA 바인더 (서열 12) 또는 항-MSA 바인더 (서열 13)에 대한 DNA 서열을 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. 생성되는 DNA 단편을 BamHI/HindIII을 사용하여 dsbA 신호 서열을 갖는 pQE-80L 내로 라이게이팅하였다 (적절한 옆에 접하는 DNA 서열이 첨가되었다). TNF-결합 Fn3 서열 (서열 3 및 서열 4) 및 야생형 Fn3 서열 (서열 1 및 서열 2)에 상응하는 DNA 서열을 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. 생성되는 DNA 단편을 TNF-결합 Fn3 서열 (서열 3 및 서열 4)에 대해 프라이머 3 (서열 18) 및 4 (서열 19)를 사용하여 또는 야생형 Fn3 서열 (서열 1 및 서열 2)에 대해 프라이머 3 (서열 18) 및 5 (서열 20)을 사용하여 증폭시키고, BglII/BamHI로 소화시키고, pQE-80L-dsbA-항HSA 또는 pQE-80L-dsbA-항MSA의 BamHI 부위 내로 라이게이팅하였다. 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - GS 링커 - 항-RSA His (서열 92)를 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 pQE-80L에서 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - GS 링커 - 항-MSA His (서열 71)로부터 제조하였다. IKHLK (서열 104)에서 SSYLN (서열 105)으로의 제1 돌연변이 유발은 프라이머 20 (서열 80) 및 21 (서열 81)을 사용하여 수행하고; GASR (서열 106)에서 RNSP (서열 107)로의 제2 돌연변이 유발은 프라이머 22 (서열 82) 및 23 (서열 83)을 사용하여 수행하고; GARWPQ (서열 108)에서 TYRVPP (서열 109)로의 제3 돌연변이 유발은 프라이머 24 (서열 84) 및 25 (서열 85)를 사용하여 수행하였다.
형식:
1) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 서열 - GS 링커 - 항-HSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00057
2) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) 서열 - GS 링커- 항-HSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00058
3) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 서열 - GS 링커 - 항HSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00059
4) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - GS 링커 - 항HSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00060
5) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 서열 - GS 링커 - 항-MSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00061
6) dsbA 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) 서열 - GS 링커 - 항-MSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00062
7) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 서열 - GS 링커 - 항-MSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00063
8) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - GS 링커 - 항-MSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00064
9) dsbA 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - GS 링커 - 항-RSA - His 태그 (pQE-80L)
Figure pct00065
라이게이션 믹스를 사용하여 XL1-Blue 또는 DH5알파 수용성 세포를 형질전환시켰다. 양성 클론을 DNA 서열결정에 의해 입증하였다. 구성체를 KS474 및 TG1 (-)을 포함한 몇몇 이. 콜라이 종에서 발현시켰다. 유도 및 발현 후에, 세포 펠렛을 -20℃에서 동결시킨 후, 용해 버퍼 (20 mM NaH2PO4, 10 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 50 ml 버퍼 당 EDTA가 없는 Complete (로슈) 1 정제, 2 mM MgCl2, 10 U/ml 벤조나제 (머크) [pH7.4]) 내에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 초음파 분해하고, 원심분리하였다. 상등액을 여과하고 Ni-NTA 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 세척 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 20 mM 이미다졸을 함유함)로 세척한 후, 용출 버퍼 (용해 버퍼와 같지만 500 mM까지의 이미다졸을 함유함)로 용출하였다. 샘플을 Bis-Tris 겔 (인비트로겐) 상에서 분석한 후, Amicon Ultra-15 튜브 내에서 농축시키고, 수퍼덱스 프렙 등급 컬럼 (아머샴) 상으로 로딩하고, 10 mM Tris 버퍼 또는 PBS로 용출하였다. 100K Amicon 원심분리 필터를 사용하여 내독소를 제거하였다. 샘플을 다시 Bis-Tris 겔 상에서 및 LC-MS에 의해 분석하였다. 상응하는 항원에 대한 결합은 ELISA에 의해 입증하였다. 이들 구성체의 반감기는 생체 내에서 결정하였다. 10 mg/kg의 각각의 화합물을 루이스 래트 (n=3)에 정맥내 투여하고, 투여전, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 192 및 384 hr에 샘플을 취하였다. Biacore 분석을 표준 아민 커플링을 이용하여 CM5 칩을 사용하여 수행하였다. 유동 셀 1은 참조 삭감을 위한 블랭크였다 (EDC/NHS를 사용한 표면 활성화 및 에탄올아민을 사용한 후속적인 비활성화). 유동 셀 2를 PK 판독을 위해 HSA (플루카 (Fluka))로 코팅하였다. 유동 셀 3 및 4를 면역원성 판독을 위해 동물에게 투여한 화합물로 코팅하였다 (표면 포화). 래트 혈청 샘플을 HBS-EP 및 NBSreducer (비아코어; 최종 농도 1 mg/ml)로 1:8로 희석하였다. 화합물 정량을 위해 표준 곡선을 작성하고, 동물에게 투여된 대응하는 화합물의 20 mg/l에서 0.078 mg/l로의 1:2 연속 희석액을 래트 혈청 (젠텍스) 내에 제조하였다. 래트 혈청을 HBS-EP 및 1 mg/ml NSBreducer로 1:8로 희석하였다. 표준 곡선 데이타를 XLfit 4.2를 사용하여 피팅하고, 이를 사용하여 혈청 샘플 내의 화합물 농도 (PK)를 계산하였다. 화합물 반감기는 WinNonlin 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. PK 데이타는 비-구획 모델을 사용하여 피팅하였다. 연구 결과를 아래에 설명한다.
( ii ) 혈청 알부민 융합 분자
CD33 SS-TNF-결합 Fn3 서열 (서열 6), CD33 SS-TNF-결합 Fn3 (R18L & I56T) (서열 7), CD33 SS-야생형 Fn3 서열 (서열 8) 및 CD33 SS-야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) (서열 9)에 상응하는 DNA 서열을 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. 생성되는 DNA 단편을 BlpI/XbaI를 사용하여 pRS5a 내로 라이게이팅하였다 (적절한 옆에 접하는 DNA 서열, 예를 들어 Kozak을 벡터에 첨가하였다). HSA를 프라이머 1 (서열 16) 및 2 (서열 17) (프라이머 2는 His 태그를 코딩한다)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, RsrII/XbaI을 사용하여 pRS5a (CD33-TNF-결합 Fn3 서열 (서열 6 및 서열 7) 또는 CD33-야생형 Fn3 서열 (서열 8 및 서열 9) 내로 삽입하였다. RSA를 프라이머 26 (서열 86) 및 27 (서열 87)을 사용하여 벡터 IRBPp993CO328D (RZPD)로부터 PCR에 의해 증폭시킨 후, RsrII/XbaI를 통해 pRS5a-CD33 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - HSA - His (서열 99) 내로 클로닝하였다. I431V는 프라이머 28 (서열 88) 및 29 (서열 89)를 사용하는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 통합되고, L262V는 프라이머 30 (서열 90) 및 31 (서열 91)을 사용하는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 통합되었다. VEGFR-결합 Fn3 (서열 77)에 대한 DNA 서열을 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. DNA를 RsRII/CelII로 소화시키고, pRS5a-CD33 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - HSA - His (서열 99)의 대응하는 부위 내로 클로닝하였다. RSA를 벡터 pRS5a-CD33 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의)- RSA - His (서열 100)으로부터 단리하고, RsrII/XbaI을 통해 pRS5a-CD33 신호 서열 - VEGFR 결합 Fn3 - HSA - His (서열 101) 내로 클로닝하였다.
형식:
1) CD33 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 서열 - HSA - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00066
2) CD33 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 (R18L & I56T) 서열 - HSA - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00067
3) CD33 신호 서열 - 야생형 Fn3 서열 - HSA - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00068
4) CD33 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - HSA - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00069
5) CD33 신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - RSA - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00070
6) CD33 신호 서열 - VEGFR-결합 Fn3 - HSA - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00071
7) CD33 신호 서열 - VEGFR-결합 Fn3 - RSA - His 태그 (pRS5a)
라이게이션 믹스를 사용하여 XL1-Blue 또는 DH5알파 수용성 세포를 형질전환시켰다. 양성 클론을 DNA 서열결정에 의해 입증하였다. 구성체를 HEK293T, FreeStyle™293-F, HKB11 및 HEKEBNA을 포함한 몇몇 세포주에서 발현시켰다. 모든 단계에 내독소 '미함유' 버퍼를 사용하였다. 배양 상등액을 여과하고 Ni-NTA 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 세척 버퍼 (20 mM NaH2PO4, 20 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 50 ml 버퍼 당 EDTA가 없는 1정의 Complete (로슈), 2 mM MgCl2, 10 U/ml 벤조나제 (머크) [pH7.4])로 세척한 후, 용출 버퍼 (세척 버퍼와 같지만 500 mM까지의 이미다졸을 함유함)로 용출하였다. 샘플을 Bis-Tris 겔 (인비트로겐) 상에서 분석한 후, Amicon Ultra-15 튜브 내에서 농축시키고, 수퍼덱스 프렙 등급 컬럼 (아머샴) 상으로 로딩하고, 10 mM Tris 버퍼 또는 PBS로 용출하였다. 샘플을 다시 Bis-Tris 겔 상에서 및 LC-MS에 의해 분석하였다. 상응하는 항원에 대한 결합은 ELISA에 의해 입증하였다. 이들 구성체의 반감기는 생체 내에서 결정하였다. 10 mg/kg의 각각의 화합물을 루이스 래트 (n=3)에 정맥내 투여하고, 투여전, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 192 및 384 hr에 샘플을 취하였다. Biacore 분석을 표준 아민 커플링을 이용하여 CM5 칩을 사용하여 수행하였다. 유동 셀 1은 참조 삭감을 위한 블랭크였다 (EDC/NHS를 사용한 표면 활성화 및 에탄올아민을 사용한 후속적인 비활성화). 유동 셀 2를 PK 판독을 위해 THE 항-HIS mAb (젠스크립트 코프)로 코팅하였다. 유동 셀 3 및 4를 면역원성 판독을 위해 동물에게 투여한 화합물로 코팅하였다 (표면 포화). 래트 혈청 샘플을 HBS-EP 및 NBSreducer (비아코어; 최종 농도 1 mg/ml)로 1:8로 희석하였다. 화합물 정량을 위해 표준 곡선을 작성하고, 동물에게 투여된 대응하는 화합물의 20 mg/l에서 0.078 mg/l로의 1:2 연속 희석액을 래트 혈청 (젠텍스) 내에 제조하였다. 래트 혈청을 HBS-EP 및 1 mg/ml NSBreducer로 1:8로 희석하였다. 표준 곡선 데이타를 XLfit 4.2를 사용하여 피팅하고, 이를 사용하여 혈청 샘플 내의 화합물 농도 (PK)를 계산하였다. 화합물 반감기는 WinNonlin 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. PK 데이타는 비-구획 모델을 사용하여 피팅하였다.
야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - RSA 및 HSA 융합체를 포유동물 세포에서 발현시키고, 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (도 12). LC-MS에서는 정확한 단백질 (데이타 미제시)에 상응하는 환원 후에 각각 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - RSA 및 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - HSA에 대한 76.62 kDa 및 77.17 kDa의 질량을 보여주었다. N-말단 분석에서는 또한 예상되는 단백질에 상응하는 서열을 보여주었다. 생체내 데이타는 비변형된 10Fn3 (도 9)에 비해 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) RSA 및 HSA 융합체 모두 (도 13 및 14)에 대해 유의한 반감기 개선을 보여주었다. 비변형된 10Fn3에 대한 평균 반감기는 0.52h이고, 이는 10Fn3-RSA에 대해 19.6h 및 10Fn3-HSA에 대해 5.9h로 증가하였다 (도 15). 10Fn3-HSA에 대한 반감기는 래트에서 10Fn3-RSA에 비해 더 낮았다. 이는 HSA가 루이스 래트 FcRn에 효율적으로 결합하지 않을 가능성 때문일 수 있다.
수학식 1을 이용하여, 사람에서 외삽된 평균 반감기는 약 80.9시간인 것으로 예상된다.
RSA 컨쥬게이팅된 Fn3 분자를 사용한 반감기의 평균 증가 배수는 평균 Fn3-RSA 컨쥬게이트 (19.6)를 평균 비컨쥬게이팅된 Fn3 (0.52)으로 나눈 것이고, Fn3-RSA 컨쥬게이트의 생체내 반감기에서 약 38의 증가 배수를 생성시킨다. 이것은 HSA를 사용하여 사람에서 외삽하는 것으로 예상된다.
VEGFR-결합 Fn3 - RSA 및 HSA 융합체를 또한 포유동물 세포에서 발현시키고, 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (도 16). LC-MS에서는 각각 VEGFR-결합 Fn3 - RSA 및 VEGFR-결합 Fn3 - HSA에 대해 76.27 kDa 및 76.82 kDa의 질량을 보여주었고, 이들 분자량은 예상된 단백질 (데이타 미제시)에 상응하였다. hVEGFR에 대한 특이적 결합은 HSA 및 RSA 융합체 모두에 대해 ELISA에 의해 확인하였다 (도 17). RSA (도 18) 및 HSA (도 19) 융합체에 대한 평균 반감기는 각각 41.6h 및 15.3h이었다 (도 20).
치료적 Fn3, 예를 들어, VEGFR-결합 Fn3 - RSA를 사용하여, 사람에서 외삽된 평균 반감기는 약 172시간인 것으로 예상된다.
상기 컨쥬게이팅된 Fn3 분자의 반감기의 평균 증가 배수는 평균 VEGFR-결합 Fn3-RSA 컨쥬게이트 (41.6)를 평균 비컨쥬게이팅된 Fn3 (0.52)으로 나눈 것이고, Fn3-RSA 컨쥬게이트의 생체내 반감기에서 약 80의 증가 배수를 생성시킨다. 이것은 HSA를 사용하여 사람에서 외삽하는 것으로 예상된다 (데이타 미제시).
야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 항-RSA를 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (도 21). LC-MS에서는 정확한 단백질 (데이타 미제시)에 상응하는 23.68 kDa의 질량을 보여주었다. 생체내 데이타는 비변형된 10Fn3 (도 9)에 비해 항-RSA 융합체 (도 22)에 대해 유의한 반감기 개선을 보여주었다. 비변형된 10Fn3에 대한 평균 반감기는 0.52h이고, 이는 10Fn3-항RSA에 대해 7.7h로 증가하였다 (도 23).
상기 래트 연구의 결과는 혈청 알부민 또는 혈청 알부민 바인더에 대한 융합체로서 제조될 때 10Fn3의 생체내 혈청 반감기가 유의하게 연장될 수 있음을 입증한다.
수학식 1을 이용하여, 사람에서 외삽된 평균 반감기는 약 31.8시간인 것으로 예상된다.
항-HSA 컨쥬게이팅된 Fn3 분자를 사용한 반감기의 평균 증가 배수는 평균 Fn3-항-HSA 컨쥬게이트 (7.7)를 평균 비컨쥬게이팅된 Fn3 (0.52)으로 나눈 것이고, Fn3-항-HSA 컨쥬게이트의 생체내 반감기에서 약 15의 증가 배수를 생성시킨다.
실시예 5
Fc - 피브로넥틴 융합체
CD33 SS-TNF-결합 Fn3 서열 (서열 6), CD33 SS-TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) (서열 7), CD33 SS - 야생형 Fn3 서열 (서열 8) 및 CD33 SS - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) (서열 9)에 상응하는 DNA 서열을 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화하고, 게네아르트 아게 (독일)에서 제조하였다. 생성되는 DNA 단편을 BlpI/XbaI을 사용하여 pRS5a 내로 라이게이팅하였다 (적절한 옆에 접하는 DNA 서열, 예를 들어 Kozak을 벡터에 첨가하였다). hIgG1 Fc를 프라이머 18 (서열 33) 및 19 (서열 34) (프라이머 19는 His 태그를 코딩한다)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, RsrII/XbaI을 사용하여 pRS5a (CD33 - TNF-결합 Fn3 서열 (서열 6 및 서열 7) 또는 CD33 - 야생형 Fn3 서열 (서열 8 및 서열 9) 내로 삽입하였다.
형식:
1) CD33 신호 서열 - TNF-결합 Fn3 서열 - Fc - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00073
2) CD33신호 서열 - TNF-결합 Fn3 (R18L 및 I56T) 서열 - Fc - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00074
3) CD33신호 서열 - 야생형 Fn3 서열 - Fc - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00075
4) CD33신호 서열 - 야생형 Fn3 (RGD로부터 RGA로의) 서열 - Fc - His 태그 (pRS5a)
Figure pct00076
라이게이션 믹스를 사용하여 XL1-Blue 또는 DH5알파 수용성 세포를 형질전환시켰다. 양성 클론을 DNA 서열결정에 의해 입증하였다. 구성체를 HEK293T, FreeStyle™ 293-F, HKB11 및 HEKEBNA을 포함한 몇몇 세포주에서 발현시켰다. 모든 단계에 내독소 '미함유' 버퍼를 사용하였다. 배양 상등액을 여과하고 단백질 A 세파로스 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 PBS로 세척한 후, 50 mM 시트레이트 (pH 2.7), 140 mM NaCl로 용출하였다. 샘플을 중화시키고 Bis-Tris 겔 (인비트로겐) 상에서 분석한 후, Amicon Ultra-15 튜브 내에서 농축시키고, 수퍼덱스 프렙 등급 컬럼 (아머샴) 상으로 로딩하고, 10 mM Tris 버퍼 또는 PBS로 용출하였다. 샘플을 다시 Bis-Tris 겔 상에서 및 LC-MS에 의해 분석하였다. 환원 및 N-탈글리코실화를 위해, 샘플 (34 ㎍)을 50 ㎕의 최종 부피에서 0.8M 우레아, 0.04M NH4CO3 및 0.01M DTT와 함께 30분 동안 50℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 1x 반응 버퍼 G7 및 1 ㎍의 PNGaseF를 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 단백질 A 정제에 추가로, Ni-NTA 정제를 또한 선행 실시예에 설명된 바와 같이 수행하였다. 상응하는 항원에 대한 결합은 ELISA에 의해 입증하였다.
이들 구성체의 반감기는 생체 내에서 결정하였다. 10 mg/kg의 각각의 화합물을 루이스 래트 (n=3)에 정맥내 투여하고, 투여전, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 192 및 384 hr에 샘플을 취하였다. Biacore 분석을 표준 아민 커플링을 이용하여 CM5 칩을 사용하여 수행하였다. 유동 셀 1은 참조 삭감을 위한 블랭크였다 (EDC/NHS를 사용한 표면 활성화 및 에탄올아민을 사용한 후속적인 비활성화). 유동 셀 2를 PK 판독을 위해 THE 항-HIS mAb (젠스크립트 코프)로 코팅하였다. 유동 셀 3 및 4를 면역원성 판독을 위해 동물에게 투여한 화합물로 코팅하였다 (표면 포화). 래트 혈청 샘플을 HBS-EP 및 NBSreducer (비아코어; 최종 농도 1 mg/ml)로 1:8로 희석하였다. 화합물 정량을 위해 표준 곡선을 작성하고, 동물에게 투여된 대응하는 화합물의 20 mg/l에서 0.078 mg/l로의 1:2 연속 희석액을 래트 혈청 (젠텍스) 내에 제조하였다. 래트 혈청을 HBS-EP 및 1 mg/ml NSBreducer로 1:8로 희석하였다. 표준 곡선 데이타를 XLfit 4.2를 사용하여 피팅하고, 이를 사용하여 혈청 샘플 내의 화합물 농도 (PK)를 계산하였다. 화합물 반감기는 WinNonlin 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. PK 데이타는 비-구획 모델을 사용하여 피팅하였다.
야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - Fc를 포유동물 세포에서 발현시키고, 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (도 24). LC-MS에서는 천연 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - Fc에 대해 상이한 형태를 보여주었고, 76.12 kDa 질량은 이량체에 상응하고, 76.28 kDa 및 76.44 kDa 형태는 이량체 + 헥소스에 상응하였다. 환원 및 N-탈글리코실화를 위해, 예상된 단량체성 단백질 (데이타 미제시)에 상응하는 36.63 kDa의 질량을 얻었다. 단백질의 MW는 N-탈글리코실화 동안 Asn에서 Asp로의 변형으로부터의 질량 차이로 인해 탈글리코실화 후에 증가하였다. N-말단 분석에서는 또한 예상된 단백질에 상응하는 서열을 보여주었다.
생체내 데이타는 비변형된 10Fn3 (도 9)에 비해 야생형 10Fn3 (RGD로부터 RGA로의) - Fc (도 25)에 대한 유의한 반감기 개선을 보여주었다. 비변형된 10Fn3에 대한 평균 반감기는 0.52h이고, 이는 10Fn3-Fc에 대해 9.4h로 증가하였다 (도 26).
상기 래트 연구의 결과는 10Fn3의 생체내 혈청 반감기가 hIgG1 Fc에 대한 융합체로서 제조될 때 유의하게 연장될 수 있음을 입증한다.
수학식 1을 이용하여, 사람에서 외삽된 평균 반감기는 약 38.8시간인 것으로 예상된다.
Fn3 분자에 융합된 Fc를 사용한 반감기의 평균 증가 배수는 평균 Fn3-Fc 융합체 (9.4)를 평균 비컨쥬게이팅된 Fn3 (0.52)으로 나눈 것이고, Fn3-Fc 융합체의 생체내 반감기에서 약 18의 증가 배수를 생성시킨다.
종합적으로, 실시예 3-5의 결과는 Fn3 분자가 분자의 반감기를 증가시키기 위해 예를 들어, HSA, Fc 융합에 의해 변형될 수 있음을 보여준다. 모든 변형된 Fn3 분자는 반감기에서 현저한 증가를 나타냈다. 또한, 이들 실시예는 처음으로 Fn3 및 변형된 형태의 Fn3이 포유동물 세포에서 생체 내에서 성공적으로 발현될 수 있고, 청소에 대해 유의한 생체내 효과를 갖는 것을 입증한다.
실시예 6
키메라 피브로넥틴 분자
피브로넥틴의 타입 III 모듈 및 U.S. 6,673,901 B2에 설명된 베타-가닥의 서열 분석을 이용하여, 키메라 Fn3 분자를 생산하기 위해 피브로넥틴 가닥을 스와핑하기 위한 방법을 여기서 설명한다.
먼저, 도메인 7, 8, 9 및 10의 베타 가닥을 확인하였다. 이어서, 소수성 코어 상호작용에 관여하는 잔기를 확인하였다. 이어서, 다음 기준에 따른 유사성을 결정하였다:
(a) 가닥들 사이의 유사성;
(b) 소수성 코어 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 위치들에서만 유사성;
(c) 소수성 상호작용에 관여하지 않지만 용매 노출되는 위치들 사이에서 유사성.
아래 표를 살펴보면, 상응하는 전체 가닥 사이에서 동일성 및 유사성 ％, 용매 노출된 잔기만, 소수성 코어 잔기만을 Fn3의 제10 도메인과 비교하여 제시한다.
Figure pct00077
Figure pct00078
상기한 서열 동일성/유사성에 기초하여, 가능한 키메라를 도 6에 제시한다.
균등물
당업자는 단지 통상적인 실험을 통해 본원에서 설명되는 본 발명의 구체적인 실시태양의 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 특허청구범위에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> IMPROVED FIBRONECTIN-BASED BINDING MOLECULES AND THEIR USE <130> PAT052346-WO-PCT <140> PCT/IB2008/003962 <141> 2008-12-22 <150> 61/009,361 <151> 2007-12-27 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 2 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val 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Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Arg Ser Gly Leu Gln Ser Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Pro Trp Ala Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp Lys Ser Asp 65 70 75 80 Thr Tyr Lys Tyr Asp Asp Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala <210> 6 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 20 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Phe 465 470 475 480 Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu 485 490 495 Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val 500 505 510 Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 515 520 525 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro 530 535 540 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu 545 550 555 560 Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val 565 570 575 Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 580 585 590 Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu 595 600 605 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 610 615 620 Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro 625 630 635 640 Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala 645 650 655 Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala 660 665 670 Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 675 680 685 His His His His His His 690 <210> 102 <211> 693 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 102 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gly Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Arg 20 25 30 His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Leu Gln Pro Pro 50 55 60 Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr 65 70 75 80 Val Tyr Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser Ile Pro 85 90 95 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His 100 105 110 Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile 115 120 125 Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ile Lys 130 135 140 Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 145 150 155 160 Asn Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp Lys 165 170 175 Leu Cys Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp 180 185 190 Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His 195 200 205 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Phe Gln Arg Pro Glu Ala Glu 210 215 220 Ala Met Cys Thr Ser Phe Gln Glu Asn Pro Thr Ser Phe Leu Gly His 225 230 235 240 Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Lys Tyr Asn Glu Val Leu Thr Gln Cys Cys 260 265 270 Thr Glu Ser Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala Val 275 280 285 Lys Glu Lys Ala Leu Val Ala Ala Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser 290 295 300 Ser Met Gln Arg Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala 305 310 315 320 Arg Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr Lys 325 330 335 Leu Ala Thr Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp 340 345 350 Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys 355 360 365 Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Ala Cys 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Cys Phe Ser 580 585 590 Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu 595 600 605 Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Lys Glu Lys 610 615 620 Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro 625 630 635 640 Lys Ala Thr Glu Asp Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Ala Gln 645 650 655 Phe Val Asp Lys Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Asn Cys Phe Ala 660 665 670 Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Ala Arg Ser Lys Glu Ala Leu Ala His 675 680 685 His His His His His 690 <210> 103 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 103 Met Gln Val Ser Asp Val Pro Thr Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr 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Claims (62)

  1. 비-피브로넥틴 타입 III (Fn3) 모이어티에 연결된 Fn3계 결합 분자를 포함하고, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하고, 루프 구역 서열은 특이적 표적에 결합하는 것인 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 비-Fn3 모이어티가 제2 표적에 결합할 수 있는 것인 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 비-Fn3 모이어티가 생체 내에 투여될 때 Fn3계 결합 분자의 반감기를 증가시키는 것인 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, 비-Fn3 모이어티가 항체 Fc 구역을 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서, 항체 Fc 구역이 N-말단 구역 및 C-말단 구역으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 구역에서 Fn3계 결합 분자에 융합되는 것인 컨쥬게이트.
  6. 제4항에 있어서, 항체 Fc 구역이 루프 구역, 베타-가닥 구역, 베타 유사 가닥, C-말단 구역, C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이, N-말단 구역, 및 N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이로 이루어지는 군 중에서 선택된 구역에서 Fn3계 결합 분자에 융합되는 것인 컨쥬게이트.
  7. 제4항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 또는 1000배 더 큰 컨쥬게이트.
  8. 제4항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5-30배 더 큰 컨쥬게이트.
  9. 제4항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 2-5시간, 5-10시간, 10-15시간, 15-20시간, 20-25시간, 25-30시간, 35-40시간, 45-50시간, 50-55시간, 55-60시간, 60-65시간, 65-70시간, 75-80시간, 80-85시간, 85-90시간, 90-95시간, 95-100시간, 100-150시간, 150-200시간, 200-250시간, 250-300시간, 350-400시간, 400-450시간, 450-500시간, 500-550시간, 550-600시간, 600-650시간, 650-700시간, 700-750시간, 750-800시간, 800-850시간, 850-900시간, 900-950시간, 950-1000시간, 1000-1050시간, 1050-1100시간, 1100-1150시간, 1150-1200시간, 1200-1250시간, 1250-1300시간, 1300-1350시간, 1350-1400시간, 1400-1450시간, 또는 1450-1500시간 더 큰 컨쥬게이트.
  10. 제4항에 있어서, 생체내 반감기가 적어도 9.4시간인 컨쥬게이트.
  11. 제1항에 있어서, 비-Fn3 모이어티가 혈청 알부민 (SA), 또는 트랜스페린, 또는 그의 일부를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  12. 제11항에 있어서, 혈청 알부민 (SA), 또는 그의 일부가 인간 혈청 알부민 (HSA)인 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, HSA가 루프 구역, 베타-가닥 구역, 베타 유사 가닥, C-말단 구역, C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이, N-말단 구역, 및 N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이로 이루어지는 군 중에서 선택된 구역에서 Fn3계 결합 분자에 컨쥬게이팅된 것인 컨쥬게이트.
  14. 제12항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 또는 1000배 더 큰 컨쥬게이트.
  15. 제12항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 25-50배 더 큰 컨쥬게이트.
  16. 제12항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 2-5시간, 5-10시간, 10-15시간, 15-20시간, 20-25시간, 25-30시간, 35-40시간, 45-50시간, 50-55시간, 55-60시간, 60-65시간, 65-70시간, 75-80시간, 80-85시간, 85-90시간, 90-95시간, 95-100시간, 100-150시간, 150-200시간, 200-250시간, 250-300시간, 350-400시간, 400-450시간, 450-500시간, 500-550시간, 550-600시간, 600-650시간, 650-700시간, 700-750시간, 750-800시간, 800-850시간, 850-900시간, 900-950시간, 950-1000시간, 1000-1050시간, 1050-1100시간, 1100-1150시간, 1150-1200시간, 1200-1250시간, 1250-1300시간, 1300-1350시간, 1350-1400시간, 1400-1450시간, 또는 1450-1500시간 더 큰 컨쥬게이트.
  17. 제12항에 있어서, 생체내 반감기가 적어도 19.6시간인 컨쥬게이트.
  18. 제12항에 있어서, 혈청 알부민 (SA), 또는 트랜스페린, 또는 그의 일부에 결합하는 폴리펩티드가 항-인간 혈청 알부민 (HSA) 폴리펩티드 또는 항-트랜스페린 폴리펩티드인 컨쥬게이트.
  19. 제18항에 있어서, 항-인간 혈청 알부민 (HSA) 폴리펩티드 또는 항-트랜스페린 폴리펩티드가 루프 구역, 베타-가닥 구역, 베타 유사 가닥, C-말단 구역, C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이, N-말단 구역, 및 N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이로 이루어지는 군 중에서 선택된 구역에서 Fn3계 결합 분자에 컨쥬게이팅된 것인 컨쥬게이트.
  20. 제18항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 또는 1000배 더 큰 컨쥬게이트.
  21. 제18항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 10-35배 더 큰 컨쥬게이트.
  22. 제18항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 2-5시간, 5-10시간, 10-15시간, 15-20시간, 20-25시간, 25-30시간, 35-40시간, 45-50시간, 50-55시간, 55-60시간, 60-65시간, 65-70시간, 75-80시간, 80-85시간, 85-90시간, 90-95시간, 95-100시간, 100-150시간, 150-200시간, 200-250시간, 250-300시간, 350-400시간, 400-450시간, 450-500시간, 500-550시간, 550-600시간, 600-650시간, 650-700시간, 700-750시간, 750-800시간, 800-850시간, 850-900시간, 900-950시간, 950-1000시간, 1000-1050시간, 1050-1100시간, 1100-1150시간, 1150-1200시간, 1200-1250시간, 1250-1300시간, 1300-1350시간, 1350-1400시간, 1400-1450시간, 또는 1450-1500시간 더 큰 컨쥬게이트.
  23. 제18항에 있어서, 생체내 반감기가 적어도 7.7시간인 컨쥬게이트.
  24. 제1항에 있어서, 비-Fn3 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  25. 제24항에 있어서, PEG 모이어티가 티올기 또는 아민기에 부착되는 것인 컨쥬게이트.
  26. 제24항에 있어서, PEG 모이어티가 부위 지정 PEG화에 의해 Fn3계 결합 분자에 부착되는 것인 컨쥬게이트.
  27. 제24항에 있어서, PEG 모이어티가 Cys 잔기에 부착되는 것인 컨쥬게이트.
  28. 제24항에 있어서, PEG 모이어티가 비-천연 아미노산 잔기에 부착되는 것인 컨쥬게이트.
  29. 제24항에 있어서, PEG 모이어티가 루프 구역, 베타-가닥 구역, 베타 유사 가닥, C-말단 구역, C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이, N-말단 구역, 및 N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타 유사 가닥 사이로 이루어지는 군 중에서 선택된 Fn3계 결합 분자 내의 구역 상에 부착되는 것인 컨쥬게이트.
  30. 제24항에 있어서, PEG 모이어티의 분자량이 약 2 kDa 내지 약 100 kDa인 컨쥬게이트.
  31. 제24항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 또는 1000배 더 큰 컨쥬게이트.
  32. 제24항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 5-25배 더 큰 컨쥬게이트.
  33. 제24항에 있어서, 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn3계 결합 분자의 반감기보다 적어도 2-5시간, 5-10시간, 10-15시간, 15-20시간, 20-25시간, 25-30시간, 35-40시간, 45-50시간, 50-55시간, 55-60시간, 60-65시간, 65-70시간, 75-80시간, 80-85시간, 85-90시간, 90-95시간, 95-100시간, 100-150시간, 150-200시간, 200-250시간, 250-300시간, 350-400시간, 400-450시간, 450-500시간, 500-550시간, 550-600시간, 600-650시간, 650-700시간, 700-750시간, 750-800시간, 800-850시간, 850-900시간, 900-950시간, 950-1000시간, 1000-1050시간, 1050-1100시간, 1100-1150시간, 1150-1200시간, 1200-1250시간, 1250-1300시간, 1300-1350시간, 1350-1400시간, 1400-1450시간, 또는 1450-1500시간 더 큰 컨쥬게이트.
  34. 제24항에 있어서, 반감기가 생체 내에서 적어도 3.6시간인 컨쥬게이트.
  35. 항체 Fc 구역에 결합하는 폴리펩티드에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하고, 특이적 표적에 결합하고, 혈청 반감기가 적어도 9.4시간이며, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하는 것인, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트.
  36. 인간 혈청 알부민 (HSA) 모이어티에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하고, 특이적 표적에 결합하고, 혈청 반감기가 적어도 19.6시간이며, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하는 것인, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트.
  37. 인간 혈청 알부민 (HSA) 모이어티에 결합하는 폴리펩티드에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하고, 특이적 표적에 결합하고, 혈청 반감기가 적어도 7.7시간이며, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하는 것인, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트.
  38. PEG 모이어티에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하고, 특이적 표적에 결합하고, 혈청 반감기가 적어도 3.6시간이며, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하는 것인, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트.
  39. 항-FcRn 모이어티에 연결된 피브로넥틴 타입 III (Fn3)계 결합 분자를 포함하고, 신생 FcR 수용체 (FcRn)에 산성 pH에서는 높은 친화도로, 중성 pH에서는 낮은 친화도로 결합하며, 여기서 Fn3계 결합 분자는 각각의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열 사이에 연결된 루프 구역 서열을 갖는 적어도 2개의 Fn3 베타-가닥 도메인 서열을 포함하는 것인, 개선된 약동학 특성을 갖는 컨쥬게이트.
  40. 제39항에 있어서, 산성 pH가 약 1 내지 약 7인 컨쥬게이트.
  41. 제39항에 있어서, 산성 pH가 약 6인 컨쥬게이트.
  42. 제39항에 있어서, 중성 pH가 약 7 내지 약 8인 컨쥬게이트.
  43. 제39항에 있어서, 중성 pH가 약 7.4인 컨쥬게이트.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, Fn3 도메인이 적어도 2개의 피브로넥틴 모듈로부터 유래되는 것인 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, Fn3 도메인이 적어도 3개 이상의 피브로넥틴 모듈로부터 유래되는 것인 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
  47. 프로모터와 작동가능하게 연결된 제46항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  48. 제47항의 핵산을 포함하는 세포.
  49. 제48항에 있어서, 포유동물 세포인 세포.
  50. 제49항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 포유동물 세포인 세포.
  51. 제49항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 세포.
  52. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 표적에 결합하는 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트의 제조 방법.
  53. 제52항에 있어서, 포유동물 세포 내에서 핵산을 발현시키는 것을 더 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 포유동물 세포인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 방법.
  56. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트 및 담체를 포함하는 조성물.
  57. 대상에게 제1항 내지 제45항 및 제56항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자, 컨쥬게이트, 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환, 염증, 암, 감염성 질환, 심혈관 질환, 위장관 질환, 호흡기 질환, 대사 질환, 근골격계 질환, 신경변성 질환, 정신 질환, 안질환 및 이식 거부반응으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 질환에 대해 대상을 치료하는 방법.
  58. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 Fn3계 결합 분자 또는 컨쥬게이트를 표지하는 것, 표지된 결합 분자 또는 컨쥬게이트를 샘플과 접촉시키는 것, 및 결합 분자 또는 컨쥬게이트와 단백질 사이의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 단백질을 검출하는 방법.
  59. 비-피브로넥틴 타입 III (Fn3) 모이어티에 연결된 Fn3계 결합 분자를 포함하고 특이적 표적에 결합하며 그의 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn계 결합 분자의 반감기보다 적어도 3.6배 더 큰 컨쥬게이트를 포함하는 조성물의, 자가면역 질환, 염증, 암, 감염성 질환, 심혈관 질환, 위장관 질환, 호흡기 질환, 대사 질환, 근골격계 질환, 신경변성 질환, 정신 질환, 안질환 및 이식 거부반응으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 질환을 치료하기 위한 용도.
  60. 제59항에 있어서, 비-Fn3 모이어티가 PEG, HSA, 항-HSA, 및 항체 Fc 구역으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 용도.
  61. 자가면역 질환, 염증, 암, 감염성 질환, 심혈관 질환, 위장관 질환, 호흡기 질환, 대사 질환, 근골격계 질환, 신경변성 질환, 정신 질환, 안질환 및 이식 거부반응으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 질환의 치료를 위해 사용되는 의약의 제조에 있어서, 비-피브로넥틴 타입 III (Fn3) 모이어티에 연결된 Fn3계 결합 분자를 포함하고 특이적 표적에 결합하며 그의 반감기가 비컨쥬게이팅된 Fn계 결합 분자의 반감기보다 적어도 3.6배 더 큰 컨쥬게이트를 포함하는 조성물의 용도.
  62. 제61항에 있어서, 비-Fn3 모이어티가 PEG, HSA, 항-HSA, 및 항체 Fc 구역으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 용도.
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Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200531979A (en) 2003-12-05 2005-10-01 Compound Therapeutics Inc Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US8470332B2 (en) 2006-11-22 2013-06-25 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including IGF-IR
US8633297B2 (en) 2007-10-31 2014-01-21 Medimmune, Llc Protein scaffolds
AU2009213141A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind EGFR
EP2274331B1 (en) 2008-05-02 2013-11-06 Novartis AG Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof
CN102099373A (zh) 2008-05-22 2011-06-15 百时美施贵宝公司 基于纤连蛋白的多价支架结构域蛋白
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
US9139825B2 (en) 2009-10-30 2015-09-22 Novartis Ag Universal fibronectin type III bottom-side binding domain libraries
WO2011092233A1 (en) * 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
JP2013520426A (ja) * 2010-02-18 2013-06-06 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ−２３に結合する、フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質
TW201141508A (en) 2010-04-13 2011-12-01 Bristol Myers Squibb Co Fibronectin based scaffold domain proteins that bind PCSK9
BR112012026003B1 (pt) 2010-04-13 2022-03-15 Medimmune, Llc Estrutura multimérica recombinante específica trail r2, seu uso, bem como composição
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
WO2011150133A2 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins having improved stability
SG188666A1 (en) 2010-09-30 2013-05-31 Agency Science Tech & Res Methods and reagents for detection and treatment of esophageal metaplasia
WO2012142515A2 (en) * 2011-04-13 2012-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
WO2012158678A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
WO2012158739A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Improved methods for the selection of binding proteins
CN103874501B (zh) 2011-10-11 2018-07-20 米迪缪尼有限公司 Cd40l-特异性tn3-衍生的支架及其使用方法
US9522951B2 (en) 2011-10-31 2016-12-20 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin binding domains with reduced immunogenicity
US9603897B2 (en) 2012-03-12 2017-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating tissue damage associated with ischemia with apolipoprotein D
US9844582B2 (en) 2012-05-22 2017-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-PK IL-2 and therapeutic agents
IL270110B (en) 2012-09-13 2022-08-01 Bristol Myers Squibb Co Proteins based on the scaffolding domain of fibronectin that bind to myostatin
US20150361159A1 (en) 2013-02-01 2015-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins
EP3406629B1 (en) 2013-02-06 2020-06-24 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin type iii domain proteins with enhanced solubility
ES2870802T3 (es) 2013-02-12 2021-10-27 Bristol Myers Squibb Co Métodos de replegado de proteínas a elevado pH
WO2014126871A1 (en) 2013-02-12 2014-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
WO2014165093A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
CA2926262A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Janssen Biotech, Inc. Cysteine engineered fibronectin type iii domain binding molecules
MX2016011580A (es) * 2014-03-20 2016-11-29 Bristol Myers Squibb Co Dominios de fibronectina tipo iii que se unen a albumina de suero.
CN115322253A (zh) 2014-03-20 2022-11-11 百时美施贵宝公司 稳定化的基于纤连蛋白的支架分子
DK3180018T3 (da) 2014-08-12 2019-10-28 Massachusetts Inst Technology Synergistisk tumorbehandling med IL-2 og integrinbindende Fc-fusionsprotein
WO2016025645A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker
US10406251B2 (en) 2014-11-25 2019-09-10 Bristol-Myers Squibb Company PD-L1 binding polypeptides for imaging
CA2968961A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods and compositions for 18f-radiolabeling of biologics
SG11201708441RA (en) 2015-04-24 2017-11-29 Viiv Healthcare Uk (No 5) Ltd Polypeptides targeting hiv fusion
EP3353198B1 (en) 2015-09-23 2020-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Glypican-3binding fibronectin based scafflold molecules
CN108290941A (zh) * 2015-09-23 2018-07-17 百时美施贵宝公司 快解离速率的血清白蛋白结合性纤连蛋白iii型结构域
US10994033B2 (en) 2016-06-01 2021-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18F-radiolabeled biologics
KR102397783B1 (ko) 2016-06-01 2022-05-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Pd-l1 결합 폴리펩티드에 의한 pet 영상화
EP3471750A4 (en) 2016-06-21 2020-02-26 Janssen Biotech, Inc. CYSTEINE-MODIFIED TYPE III FIBRONECTIN BINDING MOLECULES
WO2018111978A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
WO2018111976A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Pd-l1 binding fibronectin type iii domains
AU2017378226A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Janssen Biotech, Inc. CD8A-binding fibronectin type III domains
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
US10603358B2 (en) 2017-01-10 2020-03-31 Nodus Therapeutics Combination tumor treatment with an integrin-binding-Fc fusion protein and immune stimulator
TW201842929A (zh) 2017-05-03 2018-12-16 美商必治妥美雅史谷比公司 結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物
US11485781B2 (en) 2017-08-17 2022-11-01 Massachusetts Institute Of Technology Multiple specificity binders of CXC chemokines
WO2019123262A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 VIIV Healthcare UK (No.5) Limited Antigen binding polypeptides
JP7505984B2 (ja) 2018-02-12 2024-06-25 バイオエヌテック エスエー サイトカインをコードするｒｎａを用いた治療
JP7550745B2 (ja) 2018-07-24 2024-09-13 バイオエヌテック エスエー Ｉｌ２アゴニスト
WO2020154032A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Combination immunotherapy dosing regimen for immune checkpoint blockade
DK3920960T3 (da) 2019-02-08 2024-07-22 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Behandling med car-manipulerede t-celler og cytokiner
BR112021016962A2 (pt) 2019-03-18 2021-11-23 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Variantes do receptor de interleucina-2 (il2r) e da interleucina-2 (il2) para ativação específica de células efetoras imunes
WO2020200481A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn)
TW202115105A (zh) 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
WO2021058091A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving therapeutic antibody and interleukin-2 (il2)
US11628222B2 (en) 2019-10-14 2023-04-18 Aro Biotherapeutics Company CD71 binding fibronectin type III domains
WO2021076574A2 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof
WO2021132117A1 (ja) * 2019-12-23 2021-07-01 積水メディカル株式会社 ヒト肝細胞キメラ動物におけるヒト肝細胞置換率の測定方法
WO2021129927A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment with immune effector cells engineered to express an antigen receptor
WO2021129945A1 (en) 2019-12-27 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh In vitro and in vivo gene delivery to immune effector cells using nanoparticles functionalized with designed ankyrin repeat proteins (darpins)
JP2023515633A (ja) 2020-02-28 2023-04-13 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 放射性標識されたフィブロネクチンに基づく足場および抗体ならびにそのセラノスティクス的使用
AU2021238582A1 (en) 2020-03-16 2022-09-22 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Antigen-specific T cell receptors and T cell epitopes
WO2021197589A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination
AU2021377232A1 (en) * 2020-11-10 2023-06-15 New York University Macropinocytosis selective monobody-drug conjugates
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
CA3215103A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Steffen Panzner Rna compositions comprising a buffer substance and methods for preparing, storing and using the same
EP4323409A2 (en) 2021-04-14 2024-02-21 ARO Biotherapeutics Company Cd71 binding fibronectin type iii domains
JP2024517642A (ja) 2021-04-20 2024-04-23 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア ウイルスワクチン
WO2023051926A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists
AU2021470029A1 (en) 2021-10-21 2024-05-02 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CA3234578A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Advait Vijay Badkar Compositions for administration of different doses of rna
WO2023083434A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection
WO2023126053A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 BioNTech SE Lipid-based formulations for administration of rna
WO2023165681A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 BioNTech SE Rna lipid nanoparticles (lnps) comprising a polyoxazoline and/or polyoxazine polymer
WO2023193892A1 (en) 2022-04-05 2023-10-12 BioNTech SE Nucleic acid compositions comprising an inorganic polyphosphate and methods for preparing, storing and using the same
AU2023281650A1 (en) 2022-05-30 2024-10-17 Hanall Biopharma Co., Ltd. Anti-fcrn antibody or antigen binding fragment thereof with improved stability
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
WO2024028325A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 BioNTech SE Nucleic acid compositions comprising amphiphilic oligo ethylene glycol (oeg)-conjugated compounds and methods of using such compounds and compositions
WO2024027910A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024028445A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024153324A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 BioNTech SE Rna formulations for pharmaceutical use
WO2024178305A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Modernatx, Inc. Compositions of mrna-encoded il-15 fusion proteins and methods of use thereof for treating cancer
WO2024213776A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024216212A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024216214A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
CN117304303B (zh) * 2023-07-14 2024-07-05 杭州恩和生物科技有限公司 纤连蛋白截短片段、组合物及用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818418B1 (en) * 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU775076B2 (en) * 1998-12-10 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU2002213251B2 (en) * 2000-10-16 2007-06-14 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU2003243436A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-22 Shohei Koide Reconstituted polypeptides
TW200531979A (en) * 2003-12-05 2005-10-01 Compound Therapeutics Inc Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
AU2008254704A1 (en) * 2007-05-18 2008-11-27 Medimmune, Llc IL-33 in inflammatory disease
WO2009023184A2 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 Protelix, Inc. Universal fibronectin type iii binding-domain libraries
CN102099373A (zh) * 2008-05-22 2011-06-15 百时美施贵宝公司 基于纤连蛋白的多价支架结构域蛋白

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