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KR20090019864A - Ｔａｕ와 아밀로이드 전구체 단편을 발현하는 유전자도입 파리 - Google Patents

Ｔａｕ와 아밀로이드 전구체 단편을 발현하는 유전자도입 파리 Download PDF

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KR20090019864A
KR20090019864A KR1020087031695A KR20087031695A KR20090019864A KR 20090019864 A KR20090019864 A KR 20090019864A KR 1020087031695 A KR1020087031695 A KR 1020087031695A KR 20087031695 A KR20087031695 A KR 20087031695A KR 20090019864 A KR20090019864 A KR 20090019864A
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transgenic
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drosophila
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fly
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KR1020087031695A
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크리스토퍼 커밍스
매튜 마호네이
캐롤 엠. 싱
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엔비보 파마슈티칼즈, 인코퍼레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명에서는 인간 아밀로이드-β 전구체 단백질(amyloid-β precursor protein, APP)의 카르복시 말단 단편을 발현하는 유전자도입(transgenic) 파리 및 APP와 tau 단백질의 단편을 모두 발현하는 이중 유전자도입 파리를 개시한다. 본 발명의 유전자도입 파리는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)과 같은 신경변성 질환(neurodegenerative disorder)의 모형을 제시한다. 본 발명에서는 또한, 유전적 변경인자(genetic modifier)를 확인하는 방법 및 이들 유전자도입 파리를 이용하여 신경변성 질환을 치료하는 치료 화합물(therapeutic compound)을 확인하는 스크리닝 방법을 개시한다.
파리(fly)

Description

ＴＡＵ와 아밀로이드 전구체 단편을 발현하는 유전자도입 파리{TRANSGENIC FLIES EXPRESSING TAU AND AMYLOID PRECURSOR}
본 출원은 2006년 6월 16일자 제출된 가출원 60/814,227 및 2006년 6월 23일자 제출된 60/815,986에 우선권을 주장하는데, 이들의 내용은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
본 발명에서는 인간 아밀로이드-β 전구체 단백질(amyloid-β precursor protein, APP)의 카르복시 말단 단편을 발현하는 유전자도입(transgenic) 파리 및 APP와 tau 단백질의 단편을 모두 발현하는 이중 유전자도입 파리를 개시한다.
알츠하이머병(AD)은 인간에서 가장 일상적인 신경변성 질환(neurodegenerative disorder)이다. 상기 질환은 인식(cognition)과 기억(memory)에서 점진적인 손상으로 특징된다. 신경병리학적 수준(neuropathological level)에서 AD의 징표는 "노인성 반점(senile plaque)"에서 아밀로이드-β 펩티드(Aβ)의 세포외 축적 및 미소관-결합된 단백질, tau로 구성된 신경원섬유(neurofibrillary tangle)의 세포내 침착이다. AD 환자의 뉴런 조직 내에서, tau는 과인산화(hyperphosphorylation)되고 형태-의존성 항체(conformation-dependent antibody)에 의해 확인되는 병리학적 형태(pathological conformation) 를 취한다. 아밀로이드-β 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 절단 산물(cleavage product)이다. 정상 개체에서, 대부분의 Aβ는 40개-아미노산 형태이지만, 42개 아미노산 길이의 Aβ(Aβ42) 역시 소량 존재한다. AD 환자에서는 Aβ42가 과잉 존재하는데, 이는 주요한 독성 Aβ 형태인 것으로 생각된다. 유전 형태(hereditary form)의 AD와 연관된 APP 내에서 다수의 병원성 돌연변이가 발견되었는데, 이들 중에서 일부는 Aβ 서열 내에 위치한다. 이들 돌연변이는 AD와 상이한 표현형을 결과하는데, 대규모 아밀로이드 축적이 뇌혈관 벽(cerebral blood vessel wall)에서 관찰된다. 2가지 돌연변이, 다시 말하면, Dutch(Glu22Gln)와 Flemish(Ala21Gly) 돌연변이가 보고되었다(Levy, et al., Science 248, 1124-1126 (1990)), (van Broeckhoven et al. (1990)), (Hendriks, et al., Nature Genet 1, 218-221 (1992)). 이들 돌연변이를 갖는 환자는 뇌출혈(cerebral hemorrhage)과 혈관 증상(vascular symptom)으로 고통받는다. 이들 혈관 증상은 혈관 벽 내에 Aβ의 집합(아밀로이드 맥관장애(amyloid angiopathy))에 의해 유발된다. 세 번째 병원성 인트라-Aβ 돌연변이가 한 이탈리아 가계(Glu22Lys)에서 발견되었는데, 임상적 결과는 Dutch 환자와 유사하였다(Tagliavini, et al., AIz Report 2, S28 (1999)). APP 내에서 또 다른 병원성 AD 돌연변이, Arctic 돌연변이(Glu22Gly) 역시 APP 유전자의 Aβ 펩티드 도메인 내에 위치한다. 이러한 돌연변이의 보균자(carrier)는 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease)의 증상 없이 AD의 전형적인 임상적 특징(clinical feature)을 갖는 진행성 치매(progressive dementia)가 발병한다. AD는 야생형 Aβ 펩티드의 프로토피브릴(protofibril) 형성과 비교하여 돌연변이된 A β 펩티드를 포함하는 프로토피브릴(Aβ40ARC 및/또는 Aβ42ARC)의 가속화된 형성으로 분명하게 특징된다. 최종적으로, Aβ 내에 Asp23Asn 돌연변이를 보유하는 Iowa 돌연변이의 보균자는 심각한 뇌 아밀로이드 맥관장애, 광범위한 신경원섬유 및 반점 내에 Aβ40의 현저하게 광범위한 분포를 보인다(Grabowski et al., Ann. Neurol. 49: 691-693 (2001)).
Aβ 서열 외부에 APP 유전자의 돌연변이 역시 알츠하이머병과 연관된다. 이들 돌연변이체는 APP의 C-말단 영역 내에서 아미노산 치환을 인코딩하는데, 이들은 감마 세크레타아제(gamma secretase)에 의한 절단에 영향을 주어 Aβ40에 대한 Aβ42의 비율을 증가시킨다. 이런 돌연변이에는 Austrian(Thr714Ile, APP770 동소체(isoform)의 코돈 넘버링(codon numbering)), Florida(Ile716 VaI), French(Val715Met), German(Val715Ala), Indiana(Val717Leu)와 London(Val717Ile) 돌연변이가 포함된다(참조: De Jonge et al., Hum. Molec. Gen. 10:1665-71 (2001)).
야생형 또는 돌연변이체 인간 APP를 발현하는 다수의 유전자도입 생쥐 모형이 산출되었다. APP의 이러한 돌연변이체 형태는 차별적으로 절단되어 Aβ 반점 내에 증가된 양의 Aβ42가 침착된다. 이들 유전자도입 생쥐는 손상된 기억과 운동 기능과 같은 알츠하이머병의 신경학적 증상을 나타낸다(Janus C. et al., Curr. Neurol. Neurosci. Rep 1 (5): 451-457 (2001)). 돌연변이체 인간 APP와 돌연변이체 인간 tau를 모두 발현하는 유전자도입 생쥐 역시 산출되었다(Jada, et. al., Science 293:1487-1491 (2001)). 이러한 이중 유전자도입 생쥐는 강화된 신경섬유 변성(neurofibrillary degeneration)을 나타내는 AD의 설치류 모형인데, 이는 APP 또는 Aβ가 신경원섬유의 형성에 영향을 주는 것을 암시한다. 생쥐 모형이 잠재적 AD 치료제를 검사하는데 매우 유용한 것으로 입증되긴 했지만, 치료제 검사에서 이들의 이용은 값비쌀 뿐만 아니라 많은 시간이 소요된다. 따라서, 더욱 저렴하고 알츠하이머병에 대한 치료제를 선별하는데 효율적으로 이용될 수 있는 대안적 모형, 예를 들면, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 또는 노랑초파리(Drosophila melanogaster)와 같은 비-포유동물 모형을 찾는 것이 바람직할 것이다.
모형 생물체(model organism)로서 초파리(Drosophila)의 이용은 인간 신경변성 경로의 해명에서 중요한 도구인 것으로 입증되었는데(Fortini, M. and Bonini, N. Trends Genet. 16: 161-167 (2000)), 그 이유는 초파리(Drosophila) 게놈이 기능에서 극히 잘 보존된 다수의 유관한 인간 오솔로그(ortholog)를 포함하기 때문이다(Rubin, G.M., et al., Science 287: 2204-2215 (2000)). 가령, 노랑초파리(Drosophila melanogaster)는 신경계 기능(nervous system function)에 관여하는 인간 APP에 상동한 유전자를 보유한다. 이러한 APP-유사 유전자(APPL)는 뉴런 동소체인 APP695에 대략 40% 동일하고(Rosen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2478-2482 (1988)), 인간 APP695와 유사하게, 신경계 내에서만 배타적으로 발현된다. APPL 유전자가 결함된 파리는 인간 APP 유전자에 의해 회복될 수 있는 행동 결함(behavioral defect)을 보이는데, 이는 이들 두 유전자가 각 생명체 내에서 유사한 기능을 한다는 것을 암시한다(Luo et al., Neuron 9:595-605 (1992)). 이에 더하여, 세포 수준과 병리학적 수준에서 인간에서 질병 상태(disease state)를 가깝게 모방하는, 폴리글루타민 반복 질환(polyglutamine repeat disease)(Jackson, G.R., et al., Neuron 21:633-642 (1998); Kazemi-Esfarani, P. and Benzer, S., Science 287:1837-1840 (2000); Fernandez-Funez et al., Nature 408: 101-6 (2000)), 파킨슨병(Parkinson's disease)(Feany, M.B. and Bender, W. W., Nature 404:394-398 (2000))과 다른 질환의 초파리(Drosophila) 모형이 확립되었고, 이들 질환에 관여하는 다른 유전자를 확인하는데 성공적으로 이용되고 있다. 따라서, 모형 시스템(model system)으로서 초파리(Drosophila)의 효력은 이러한 질병 상태를 전시하고, 대규모 유전학적 선별(large scale genetic screen)을 수행하여 질병의 결정적인 구성요소를 확인하는 능력에서 검증되었다.
본 발명의 요약
본 발명에서는 인간 APP의 카르복시 말단 단편(CTFAPP), 예를 들면, 각각 "C99"와 "C100"으로 지칭되는 C-말단 99개 또는 100개 아미노산을 발현하는 유전자도입(transgenic) 파리를 개시한다. 본 발명의 유전자도입 파리의 체세포(somatic cell)와 생식세포(germ cell)는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, CTFAPP를 인코딩하는 도입유전자(transgene)를 포함한다. 일부 구체예에서, 도입유전자의 발현은 변형된 표현형을 갖는 파리를 결과한다. 특정 구체예에서, 변형된 표현형은 신경 변성(neural degeneration)의 형태 또는 이의 소인(predisposition)에 관련된다. 특정 구체예에서, 유전자도입 파리는 초파리(Drosophila)이다. CTFAPP를 인코딩하는 DNA 서열은 예로써, 아미노산 링커에 대한 서열을 통하여 신호 펩티드에 대 한 DNA 서열에 융합된다. 도입유전자는 조직-특이적(tissue-specific), 시간-특이적(time-specific) 또는 발달 단계-특이적(developmental stage-specific)인 발현 조절 서열에 의해 시간적으로 또는 공간적으로 조절될 수 있다. 일부 구체예에서, CTFAPP는 돌연변이체 또는 변이체 형태이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 유전자도입 파리는 tau 단백질을 인코딩하는 두 번째 도입유전자를 포함한다. 두 번째 도입유전자는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 이중 유전자도입 파리는 CTFAPP 단독 형태를 발현하는 유전자도입 파리에서 의해 전시되는 변형된 표현형과 비교하여 상조적인 변형된 표현형을 전시한다. 일부 구체예에서, tau 단백질은 인간 tau, 예를 들면, 인간 tau의 공지된 절단접합 변이체(splice variant) 중의 하나이다.
본 발명의 발현 조절 서열은 조직-특이적일 수 있다. 일부 구체예에서, 발현 조절 서열은 GAL4를 인코딩하는 DNA 서열에 기능적으로 결합된 UAS 조절 요소를 포함한다. GAL4 인코딩 서열은 조직 특이적 프로모터(promoter) 또는 인핸서(enhancer) 서열에 의해 작동된다. 특정 구체예에서, 프로모터 또는 인핸서는 범-신경(pan-neural) 발현, 또는 뇌 또는 눈에서 발현에 특이적이다.
본 발명에서는 또한, 본 발명의 유전자도입 파리로부터 수득된 일차 세포 배양액을 제시한다. 일차 세포 배양액은 예로써, 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는데 이용될 수 있다. 유전자도입 파리로부터 수득된 유전자도입 세포는 알츠하이머병과 같은 신경변성 질환에 관련된 변형된 표현형을 보유할 수 있다. 유전자도입 세포는 분자 성분(molecular component)의 변형된 형태 또는 변형 된 생화학적 상태, 예를 들면, tau 단백질의 변형된 인산화 상태 또는 아밀로이드 폴리펩티드의 변형된 용해도와 같은 변형된 표현형을 보유할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 (1) 후보 약제를 본 발명의 유전자도입 파리와 접촉시키는 단계 및 (2) 후보 약제와 접촉하지 않은 유사한(대조) 유전자도입 파리 또는 세포와 비교하여, 유전자도입 파리, 또는 유전자도입 파리로부터 수득된 세포의 표현형을 관찰하는 단계를 포함한다. 대조 파리 또는 세포와 비교하여 후보 약제와 접촉한 유전자도입 파리 또는 세포의 표현형에서 임의의 관찰가능 차이는 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 지시한다.
본 발명은 또한, 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는 다른 방법에 관계한다. 상기 방법은 (1) 후보 약제를 본 발명의 유전자도입 파리 또는 이런 파리로부터 수득된 세포와 야생형 대조 파리 또는 세포와 접촉시키는 단계 및 (2) 유전자도입 파리 또는 세포와 대조 파리 또는 세포 사이에서 표현형에서 차이를 관찰하는 단계를 포함하고, 여기서 표현형에서 차이는 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 지시한다.
다른 측면에서, 본 발명은 APP 경로의 유전적 변경인자(genetic modifier) 또는 알츠하이머병에 영향을 줄 수 있는 유전자를 확인하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 (1) 야생형 또는 앞서 열거된 돌연변이체 형태 중의 하나인 지에 상관없이, CTFAPP를 인코딩하는 도입유전자를 포함하고, tau 단백질을 인코딩하는 도입유전자를 선택적으로 포함하는 유전자도입 파리를 게놈에서 선택된 유전자에서 돌연변이 를 포함하는 파리와 교잡(crossing)하는 단계 및 (2) 유전자도입 표현형의 변경에 대하여 후손을 관찰하는 단계를 포함한다. 일형의 CTFAPP 및/또는 tau를 인코딩하는 도입유전자와 연관된 표현형의 변경은 선택된 유전자가 APP 경로를 변경하거나, 또는 알츠하이머병에 영향을 줄 수 있음을 지시한다. 일형의 CTFAPP 또는 tau를 인코딩하는 도입유전자는 각각, 조직-특이적 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일형의 CTFAPP를 인코딩하는 도입유전자는 신호 서열에 선택적으로 융합된다.
도 1에서는 CTFAPP를 발현하는 유전자도입 파리에서 Aβ 펩티드의 존재를 증명하는 면역블랏(immunoblot)을 도시한다. 상기 실험의 상세는 실시예 1에 기술된다.
도 2에서는 연령의 함수(function of age)로서 유전자도입 초파리(Drosophila)의 감퇴하는 보행 능력(locomotor ability)을 도시한다. 초파리(Drosophila)는 실시예 3에 기술된 바와 같이 기어오름 분석(climbing assay)을 수행하였다. 이들 파리는 야생형(wt)이거나, 또는 1개의 도입유전자(tau 또는 CTFAPP) 또는 2개의 도입유전자(CTFAPP, tau)를 보유하였다.
본 발명에서는 단독으로 또는 tau 단백질과의 조합으로, 인간 C-말단 APP 단편을 발현하는 유전자도입 파리를 개시한다. 이들 유전자도입 파리는 보행 표현형, 행동 표현형(가령, 식욕(appetite), 교미 행동(mating behavior) 및/또는 수명(life span)) 및 형태적 표현형(가령, 세포, 기관 또는 부속 기관(appendage)의 외형(shape), 크기(size), 또는 위치(location); 또는 파리의 크기, 외형, 또는 성장률(growth rate))을 비롯한 다양한 변형된 표현형을 유도할 수 있는 신경변성(neurodegeneration)을 나타낸다.
본 명세서에서, "유전자도입 파리"는 체세포와 생식세포가 프로모터에 작동가능하게 연결된 도입유전자를 포함하는 파리를 지칭하는데, 여기서 도입유전자는 인간 C-말단 APP 단편을 인코딩하고, 신경계 내에서 상기 도입유전자의 발현은 뉴런 변성(neural degeneration)의 소인(predisposition)을 갖거나 이런 변성을 유발하는 파리를 결과한다. "이중 유전자도입 파리"는 체세포와 생식세포가 최소한 2개의 도입유전자를 포함하는 유전자도입 파리를 지칭하는데, 여기서 도입유전자는 tau와 인간 C-말단 APP 단편을 인코딩한다. 예시된 이중 유전자도입 파리가 2개의 단일 유전자도입 파리를 교잡함으로써 생산되긴 하지만, 본 발명의 이중 유전자도입 파리는 외래 DNA를 동물 내로 도입하기 위한 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 생산될 수 있다. "유전자도입 파리"와 "이중 유전자도입 파리"에는 임의의 발달 단계, 즉, 유충(embryonic), 애벌레(larval), 번데기(pupal)와 성체(adult) 단계의 파리가 포함된다. 특정 파리, 예를 들면, 초파리(Drosophila)의 발달은 온도 의존성(temperature dependent)이다. 초파리(Drosophila) 알은 대략 1/2 밀리미터(millimeter) 길이이다. 유충이 발달하여 지렁이-유사 애벌레(worm-like larva)로 부화하는 데에는 수정(fertilization)후 대략 하루가 걸린다. 애벌레는 끊임없이 먹고 성장하며, 부화후 1일, 2일과 4일에 탈피한다(첫 번째, 두 번째와 세 번째 영(instar)). 세 번째 영(instar) 애벌레로서 2일후, 애벌레는 1회 이상 탈피하여 움직이지 않는 번데기를 형성한다. 다음 4일 동안, 몸체가 완전히 개조되어 성체 유시형(winged form)으로 변하고, 이는 번데기 케이스를 깨고 나오고 하루가 지나면 생식능력을 갖는다(25℃에서 발달 시간이다; 18℃에서는 발달에 거의 2배의 시간이 소요된다).
본 명세서에서, "뉴런 변성"은 신경(nervous) 또는 신경감각(neurosensory) 기관, 조직 또는 세포의 형태적, 기능적 또는 발달적 변경; 행동 결함(behavioral deficit); 또는 보행 결함(locomotor deficit)을 유발하는 중추신경계에서 이상을 의미한다; 여기서, 이런 변경은 애벌레 또는 성체 파리에서 정량적으로 또는 정성적으로 분석될 수 있다.
본 명세서에서, "파리"는 날개를 가진 작은 곤충, 특히, 예로써 초파리(Drosophila)와 같은 쌍시류(dipteran)를 지칭한다. 본 명세서에서, "초파리(Drosophila)"는 초파리과(Drosophilidae)의 임의의 구성원을 지칭하는데, 여기에는 제한 없이, 부엌초파리(Drosophila funebris), 드로소필라 멀피스피나(Drosophila multispina), 드로소필라 수브푸네브리스(Drosophila subfunebris), 구티페라(guttifera) 종 그룹, 드로소필라 구티페라(Drosophila guttifera), 드로소필라 알보미칸스(Drosophila albomicans), 돌산줄무늬초파리(Drosophila annulipes), 굽은꼬리초파리(Drosophila curviceps), 드로소필라 포르모사나(Drosophila formosana), 드로소필라 히로카우스타(Drosophila hypocausta), 왕노랑초파리(Drosophila immigrans), 드로소필라 케플라우아나(Drosophila keplauana), 드로소필라 코흐코아(Drosophila kohkoa), 드로소필라 나수타(Drosophila nasuta), 드로소필라 네오히포카우스타(Drosophila neohypocausta), 드로소필라 니베이프론스(Drosophila niveifrons), 드로소필라 팔리디프톤스(Drosophila pallidiftons), 드로소필라 풀라우아(Drosophila pulaua), 드로소필라 쿠아드릴리네아타(Drosophila quadrilineata), 드로소필라 시아마나(Drosophila siamana), 드로소필라 술푸리가스테르 알보스트리가타(Drosophila sulfurigaster albostrigata), 드로소필라 술푸리가스테르 빌림바타(Drosophila sulfurigaster bilimbata), 드로소필라 술푸리가스테르 네오나수타(Drosophila sulfurigaster neonasuta), 드로소필라 탁손 F(Drosophila Taxon F), 드로소필라 탁손 I(Drosophila Taxon I), 드로소필라 우스툴라타(Drosophila ustulata), 드로소필라 멜라니카(Drosophila melanica), 드로소필라 파라멜라니카(Drosophila paramelanica), 까마귀초파리(Drosophila tsigana), 다루마초파리(Drosophila daruma), 드로소필라 폴리채타(Drosophila polychaeta), 퀴나리아(quinaria) 종 그룹, 드로소필라 팔레니(Drosophila falleni), 큰별초파리(Drosophila nigromaculata), 드로소필라 팔루스트리스(Drosophila palustris), 드로소필라 팔레라타(Drosophila phalerata), 드로소필라 수브팔루스트리스(Drosophila subpalustris), 드로소필라 에오하이데이(Drosophila eohydei), 제주흑점초파리(Drosophila hydei), 노랑점먹초파리(Drosophila lacertosa), 드로소필라 로부스타(Drosophila robusta), 왕먹초파리(Drosophila sordidula), 드로소필라 레플레토이데스(Drosophila repletoides), 드로소필라 카네코이(Drosophila kanekoi), 먹초파리(Drosophila virilis), 드로소필라 마쿨리나타타(Drosophila maculinatata), 드로소필라 포네라(Drosophila ponera), 드로소필라 아나나쌔(Drosophila ananassae), 드로소필라 아트리펙스(Drosophila atripex), 드로소필라 비펙티나타(Drosophila bipectinata), 드로소필라 에르세페애(Drosophila ercepeae), 드로소필라 말레르코틸리아나 말레르코틸리아나(Drosophila malerkotliana malerkotliana), 드로소필라 말레르코틸리아나 폴렌스(Drosophila malerkotliana pollens), 드로소필라 파라비펙티나타(Drosophila parabipectinata), 드로소필라 슈도아나나쌔 슈도아나나쌔(Drosophila pseudoananassae pseudoananassae), 드로소필라 슈도아나나쌔 니그렌스(Drosophila pseudoananassae nigrens), 드로소필라 바리안스(Drosophila varians), 드로소필라 엘레간스(Drosophila elegans), 드로소필라 구눙콜라(Drosophila gunungcola), 드로소필라 에우그라실리스(Drosophila eugracilis), 무화과초파리(Drosophila ficusphila), 드로소필라 에렉타(Drosophila erecta), 드로소필라 마우리티아나(Drosophila mauritiana), 노랑초파리(Drosophila melanogaster), 드로소필라 오레나(Drosophila orena), 드로소필라 세켈리아(Drosophila sechellia), 어리노랑초파리(Drosophila simulans), 드로소필라 테이씨에리(Drosophila teissieri), 드로소필라 야쿠바(Drosophila yakuba), 흰점박이초파리(Drosophila auraria), 드로소필라 바이마이(Drosophila baimaii), 드로소필라 바르바래(Drosophila barbarae), 산흰점박이초파리(Drosophila biauraria), 드로소필라 비르치이(Drosophila birchii), 드로소필라 복키(Drosophila bocki), 드로소필라 복퀘티(Drosophila bocqueti), 드로소필라 부를라이(Drosophila burlai), 드로소필라 콘스트릭타(Drosophila constricta)(sensu Chen & Okada), 드로소필라 잠불리나(Drosophila jambulina), 드로소필라 카오야나(Drosophila khaoyana), 드로소필라 킥카와이(Drosophila kikkawai), 드로소필라 락테이코르니스(Drosophila lacteicornis), 드로소필라 레온티아(Drosophila leontia), 드로소필라 리니(Drosophila lini). 드로소필라 마이리(Drosophila mayri), 드로소필라 파르불라(Drosophila parvula), 드로소필라 펙티니페라(Drosophila pectinifera), 드로소필라 푼자비엔시스(Drosophila punjabiensis), 드로소필라 쿠아드라리아(Drosophila quadraria), 드로소필라 루파(Drosophila rufa), 드로소필라 세구이(Drosophila seguyi), 드로소필라 세라타(Drosophila serrata), 드로소필라 사바우라리아(Drosophila subauraria), 드로소필라 타니(Drosophila tani), 드로소필라 트라페지프론스(Drosophila trapezifrons), 들흰점박이초파리(Drosophila triauraria), 드로소필라 트런카타(Drosophila truncata), 드로소필라 불카나(Drosophila vulcana), 드로소필라 와나타베이(Drosophila watanabei), 드로소필라 푸아마이(Drosophila fuyamai), 드로소필라 비아르미페스(Drosophila biarmipes), 드로소필라 미메티카(Drosophila mimetica), 드로소필라 풀츠렐라(Drosophila pulchrella), 벗초파리(Drosophila suzukii), 드로소필라 우니펙티나타(Drosophila unipectinata), 겉노랑초파리(Drosophila lutescens), 드로소필라 파랄루테아(Drosophila paralutea), 드로소필라 프로스티펜니스(Drosophila prostipennis), 타카하시초파리(Drosophila takahashii), 드로소필라 트릴루테아(Drosophila trilutea), 두줄검정초파리(Drosophila bifasdata), 드로소필라 이마이(Drosophila imaii), 드로소필라 슈도옵스큐라(Drosophila pseudoobscura), 드로소필라 살라탄스(Drosophila saltans), 드로소필라 스투르테반티(Drosophila sturtevanti), 드로소필라 네불로사(Drosophila nebulosa), 드로소필라 파울리스토룸(Drosophila paulistorum)과 드로소필라 윌리스토니(Drosophila willistoni)가 포함된다. 한 구체예에서, 파리는 노랑초파리(Drosophila melanogaster)이다.
본 명세서에서, "인간 APP의 카르복시 말단 단편", "카르복시 말단 APP 단편", "C-말단 APP 단편"과 "CTFAPP" 모두, C99 또는 C100을 결과하는 인간 APP의 동소체의 베타 세크레타아제 절단에 기인하는 단편으로 본질적으로 구성되는 인간 APP의 단편을 지칭한다. 일부 구체예에서, CTFAPP는 세포내 도메인, 막통과 도메인 및 대략 β-세크레타아제 절단 부위(cleavage site)가지 확장하는 APP의 세포외 도메인의 일부분을 포함한다. 적절하게는, 본 발명의 CTFAPP는 각각, C-말단에서 N-말단으로, 99개 또는 100개 아미노산 신장하는 APP의 C-말단 단편에 상응하는, C99(SEQ ID NO: 1에서 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 SEQ ID NO:2, 여기서 유전자 코드(genetic code)의 축퇴(degeneracy)로 인하여, 상이한 뉴클레오티드 서열이 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩할 수 있다) 또는 CTFAPP(SEQ ID NO:3에서 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 SEQ ID NO:4)이다. 본 발명의 CTFAPP는 야생형이거나, 또는 돌연변이, 예를 들면, 알츠하이머병, 또는 심혈관 합병증(cardiovascular complication)과 같은 다른 증상의 조기 발병(early onset)을 유발하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 가족성 돌연변이(familial mutation)를 포함할 수 있다. 이런 돌연변이에는 E665D, K/M670N/L, A673T, H677R, D678N, A692G, E693G, E693Q, E693K, D694N, A713T, A713V, T7141, T714A, V715M, V715A, 1716V, 1716T, V717F, V717G, V717L과 L723P가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. tau를 인코딩하는 도입유전자를 보유하는 이중 유전자도입 파리 역시 야생형이거나, 또는 London 돌연변이(V717I)를 포함하는 CTFAPP를 보유할 수 있다. tau 도입유전자를 보유하지 않는 유전자도입 파리는 CTFAPP의 돌연변이체만을 보유하고 야생형 CTFAPP와 London 돌연변이를 배제한다.
본 명세서에서, "아밀로이드 반점 침착"은 Aβ42와 같은 아밀로이드 펩티드의 축적에 의해 세포외 형성되는 불용성 단백질 집합체(aggregate)를 지칭한다.
본 명세서에서, "신호 펩티드"는 파리의 소포체(endoplasmic reticulum) 분비 경로로 또는 이런 경로를 통하여 단백질을 유인하는 짧은, 전형적으로, 20개 아미노산 길이 이하의 아미노산 서열을 지칭한다.
본 발명에서 "신호 펩티드"에는 인간 APP695의 신호 펩티드(SEQ ID NO:5), "wingless(wg) 신호 펩티드"에 동의어인 Dint 단백질의 초파리(Drosophila) 신호 펩티드(SEQ ID NO:6), "argos(aos) 신호 펩티드"(SEQ ID NO:7), 초파리(Drosophila) APPL 신호 펩티드(SEQ ID NO:8), 프레세닐린(presenilin) 신호 펩티드(SEQ ID NO:9)와 windbeutel 신호 펩티드(SEQ ID NO: 10)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 앞서 언급된 신호 펩티드의 변이체를 비롯하여, 소포체를 통하여 단백질을 유인하고 감마 세크레타아제 절단에 민감한 막 내에서 CTFAPP의 발현을 결과하는 임의의 신호 서열이 본 발명에 이용될 수 있다.
본 명세서에서, "아미노산 링커"는 2개의 개별 펩티드가 측면에 접하는 대략 2개 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 아미노산 서열을 지칭한다.
본 명세서에서, "tau 단백질"은 미소관 조합(assembly)과 안정화(stabilization)에 관여하는 미소관-결합된 단백질 tau를 지칭한다. 알츠하이머병 환자의 뉴런 조직 내에서, tau는 신경원섬유의 세포내 침착에서 관찰된다. 많은 인간 tau 유전자 서열이 존재한다. 성인 뇌에서, 6가지 tau 동소체가 택일적 mRNA 절단접합에 의해 단일 유전자로부터 생산된다(Goedert et al., Neuron. (1989) 3:519-26). 유전자 코드의 축퇴로 인하여, 상이한 뉴클레오티드 서열이 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩할 수 있다. 인간 tau 단백질을 인코딩하는 인간 유전자는 Andreadis, A. et al., Biochemistry, 31 (43): 10626-10633 (1992)에 기술된 바와 같이 11개의 엑손을 포함한다. 성인 뇌에서, 6가지 tau 동소체가 택일적 mRNA 절단접합에 의해 단일 유전자로부터 생산된다. 이들은 아미노-말단 절반에 위치하는 29-개 또는 58-개 아미노산 삽입체(insert)와 카르복실-말단 절반에 위치하는 31개-아미노산 반복의 존재 또는 부재에 의해 서로 달라진다. tau 유전자의 엑손 10에 의해 인코딩되는 후자의 포함은 각각 4개의 반복을 포함하는 3가지 tau 동소체를 발생시킨다. 본 명세서에서, "tau 단백질"은 택일적 mRNA 절단접합에 의해 생산되는 다양한 tau 동소체 및 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13과 SEQ ID NO:14에 기술된 바와 같은 인간 tau 단백질의 돌연변이체 형태를 포괄한다. 한 구체예에서, 이중 유전자도입 파리를 산출하는데 이용되는 tau 단백질은 SEQ ID NO: 15(아미노산 서열)와 SEQ ID NO: 16(뉴클레오티드 서열)으로 표시된다. 상기 동소체는 Tau 엑손 2와 3 및 4개의 미소관-결합 반복(microtuble-binding repeat)을 포함한다. 정상 인간 대뇌 피질(cerebral cortex) 내에서, 4개 반복보다는 3개 반복 tau 동소체가 약간 우세하다. 이들 반복과 일부 인접 서열(adjoining sequence)은 tau의 미소관-결합 도메인을 구성한다(Goedert, et al., 1998 Neuron 21, 955-958). 알츠하이머병 환자의 뉴런 조직 내에서, tau는 과인산화(hyperphosphorylation)되고 형태-의존성 항체(conformation-dependent antibody), 예를 들면, MCI와 ALZ50에 의해 탐지되는 비정상적 및/또는 병리학적 형태를 취한다(Jicha G. A., et al., Journal of Neuroscience Research 48:128-132 (1997)). 따라서, 본 명세서에서, "tau 단백질"은 이들 형태-특이적 항체(conformation-specific antibody)에 의해 인식되는 tau 단백질을 포괄한다.
본 발명에서는 또한, 이들 tau 서열의 등가물로서, 신경원섬유를 형성하는 tau의 생물학적 효과를 유지하는 돌연변이체 서열을 안출한다. 이런 이유로, 본 명세서에서, "tau 단백질"은 돌연변이와 변이체를 포함하는 tau 단백질을 포괄한다. 이들 돌연변이에는 Exon 10+12 "Kumamoto pedigree" (Yasuda et al., (2000) Ann Neurol. 47:422-9); I260V (Grover et al., Exp Neurol. 2003 Nov; 184:131-40); G272V (Hutton et al., 1998 Nature 393:702-5; Heutink et al., (1997) Ann Neurol. 41:150-9; Spillantini et al., (1996) Acta Neuropathol (Berl). 1996 Jul;92:42-8); N279K (Clark et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13103-13107; D'Souza et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:5598-5603; Reed et al., (1997) Ann Neurol. 1997 42:564-72; Hasegawa et al., (1999) FEBS Letters 443:93-96; Hong et al., (1998) Science 282: 1914-17); delK280 (Rizzu et al., (1999) Am J Hum Genet 64:414-421; D'Souza et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:5598-5603); L284L (D'Souza et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:5598-5603); P301L (Hutton et al., 1998 Nature 393:702-5; Heutink et al., (1997) Ann Neurol. 41: 150-9; Spillantini et al., (1996) Acta Neuropathol (Berl) (1996) 92:42-8; Hasegawa et al., (1998) FEBS Lett. 1998 437(3):207-10; Nacharaju et al., (1999) FEBS Letters 447:195-199); P301S (Bugiani (1999) J Neuropathol Exp Neurol 58:667-77; Goedert et al., (1999) FEBS Letters 450: 306-311); S305N (Iijima et al., (1999) Neuroreport 10:497-501; Hasegawa et al., (1998) FEBS Lett. 1998 437:207-10; D'Souza et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:5598-5603); S305S (Stanford et al., Brain, 123, 880-893, 2000); S305S (Wszolek et al., Brain. 2001 124:1666-70); V337M (Poorkaj et al., (1998) Ann Neurol. 1998 43:815-25; Spillantini et al., (1998) American Journal of Pathology 153: 1359-1363; Sumi et al., (1992) Neurology. 42:120-7; Hasegawa et al., (1998) FEBS Lett. 1998 437:207-10); G389R (Murrell et al., J Neuropathol Exp Neurol. (1999) 58:1207-26; Pickering-Brown, et al., Ann Neurol. (2000) 48:859-67); R406W (Hutton et al., (1998) Nature 393:702-5; Reed et al., (1997) Ann Neurol. 42:564-72; Hasegawa et al., (1998) FEBS Lett. 437:207-10); 3'Ex10+3, GtoA (Spillantini et al., (1998) American Journal of Pathology 153:1359-1363; Spillantini et al., (1997) Proc Natl Acad Sci U S A. 94:4113-8); 3'Ex10+16 (Baker et al., (1997) Annals of Neurology 42:794-798; Goedert et al., (1999b) Nature Medicine 5:454-457; Hutton et al., (1998) Nature 393:702-705); 3'Ex10+14 (Hutton et al., (1998) Nature 393:702-705; Lynch et al., (1994) Neurology 44:1878-1884); 3'Ex10+13 (Hutton et al., (1998) Nature 393:702-705)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명에서는 또한, 서열 다형성(sequence polymorphism)을 포함하는 tau 유전자의 용도를 제시한다(표 1 참조).
Figure 112008089602917-PCT00001
Figure 112008089602917-PCT00002
본 발명에서는 또한, 생쥐(Lee et al., Science 239:285-8 (1988)), 쥐(Goedert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:1983-1987 (1992)), 한우(Bos taurus)(Himmler et al., MoI. Cell. Biol. 9:1381-1388 (1989)), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(Heidary & Fortini, Mech. Dev. 108:171-178 (2001))와 개구리(Xenopus laevis)(Olesen et al., Gene 283:299-309 (2002))가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 동물로부터 tau 단백질 또는 유전자의 용도를 안출한다. 다른 동물로부터 tau 유전자는 앞서 기술된 것들과 등가의 돌연변이를 부가적으로 포함할 수 있다. 등가의 위치는 서열 정렬(sequence alignment)에 의해 확인될 수 있고, 등가의 돌연변이는 부위 직접 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 또는 당분야에 공지된 다른 수단에 의해 도입될 수 있다.
본 명세서에서, "신경원섬유(neurofibrillary tangle)"는 세포내 형성되고 주로 tau 단백질로 구성되는 불용성 꼬인 섬유(twisted fiber)를 지칭한다.
본 명세서에서, "작동가능하게 연결된"은 본 명세서에 기술된 구성요소가 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계로 놓이는 병렬(juxtaposition)을 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 발현 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 대조 서열의 활성과 양립하는 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다.
본 명세서에서, "발현 조절 서열"은 프로모터, 인핸서(enhancer) 요소 및 소정의 핵산 서열의 통제된 발현에 기여하는 다른 핵산 서열을 지칭한다. "프로모터"는 전사(transcription)의 개시 동안 RNA 중합효소에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭하고 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "인핸서 요소"는 거리와 방향과 무관하게, 상동성 프로모터와 이질성 프로모터로부터 전사 개시(transcription initiation)를 조절하는 cis-작용 핵산 요소를 지칭한다. 적절하게는, "인핸서 요소"는 전사 개시의 조직과 시간 설계를 조절한다. 특정 구체예에서, 인핸서 요소에는 UAS 조절 요소가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 본 명세서에서, "UAS"는 GAL4 전사 활성인자(transcriptional activator)에 의해 인식되고 결합되는 상류 활성화 서열에 관계한다. 본 명세서에서, "UAS 조절 요소"는 GAL4 전사 조절인자 단백질에 의해 활성화되는 UAS 요소를 지칭한다. 적절하게는, 본 발명의 발현 조절 서열은 조직-특이적 방식으로 발현을 작동시키는 능력에 대하여 선택된다. 대안적으로, 발현 조절 서열은 튜불린(tubulin), 악틴(actin), 또는 유비퀴틴(ubiquitin)과 같은 편재성으로 발현되는 유전자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 발현 조절 서열은 테트라사이클론-조절된 전사 활성인자(tetracycline-controlled transcriptional activator, tTA) 반응성 조절 요소(responsive regulatory element)를 포함한다. 선택적으로, tau와 CTFAPP 도입유전자를 보유하는 유전자도입 파리는 tTA 유전자를 더욱 보유한다.
본 명세서에서, "조직-특이적" 발현 조절 서열은 최소한 하나의 다른 조직 내에서 본질적으로 불활성이지만 한 조직 또는 조직의 부분집합 내에서 발현을 작동시키는 발현 조절 서열을 지칭한다. "본질적으로 불활성"은 조직-특이적 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 서열의 발현이 발현 조절 서열이 활성을 나타내는 조직 내에서 상기 서열의 발현 수준의 5% 이하이다. 적절하게는, 조직 내에서 발현 수준은 최대 활성(maximal activity)의 1% 이하이거나, 또는 조직 내에서 서열의 발현이 탐지되지 않는다. "조직-특이적 발현 조절 서열"은 눈(eye), 날개(wing), 배판(notum), 뇌 및 중추신경계와 말초신경계의 조직과 같은 기관에 특이적인 것들을 포괄한다. 본 발명의 조직-특이적 발현 조절 서열은 GAL4-UAS 시스템 내에서 드라이버(driver)로서 이용되거나, 또는 대안으로, cis 작용 방식으로 이의 발현을 조절하기 위하여 도입유전자로부터 상류에 삽입될 수 있다.
조직 특이적 대조 서열의 실례에는 눈 발달에 중요한 프로모터/인핸서, 예를 들면, sevenless(Bowtell et al., Genes Dev. 2:620-34 (1988)), eyeless(Bowtell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:6853-7 (1991))와 GMR/glass(Quiring et al., Science 265:785-9 (1994)); 눈에서 발현에 유용한, 로돕신(rhodopsin) 유전자로부터 유래된 프로모터/인핸서; 날개에서 발현에 유용한, dpp, vestigial, 또는 wingless 유전자로부터 유래된 인핸서/프로모터(Staehling-Hampton et al., Cell Growth Differ. 5:585-93 (1994); Kim et al., Nature 382:133-8 (1996); Giraldez et al., Dev. 세포 2:667-676 (2002)); 신경에 특이적인 프로모터/인핸서, 예를 들면, 유사분열후 뉴런(post-mitotic neuron) 내에서 범-뉴런(pan-neuronal) 발현에 특이적인 elav (Yao and White, J. Neurochem. 63:41-51 (1994)), 신경모세포(neuroblast)에서부터 뉴런까지 범-신경 발현에 특이적인 scabrous(sca) (Song et al., Genetics 162:1703-24 (2002)), APPL (Martin-Morris and White, Development 110: 185-95 (1990)), 중추신경계 내에서 발현에 특이적인 Nervana 2(Nrv2)(Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:10438-43 (1999)), 콜린성 뉴런(cholinergic neuron)에 특이적인 Cha (Barber et al., J. Comp. Neurol. 22:533-43 (1989)), 도파민성 뉴런(dopaminergic neuron)에 특이적인 TH (Friggi-Grelin et al., J. Neurobiol. 54:618-27 (2003)), 유충과 애벌레의 중추신경계 및 성체의 뇌, 흉추 신경절(throacic ganglion)과 장(gut)에 특이적인 CaMKII (Takmatsu et al., 세포 Tissue Res. 310:237-52 (2002)), 인두 감각 뉴런(pharyngeal sensory neuron)에 특이적인 P (Gendre et al., Development 131:83-92 (2004)), Dmef2 (Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:198-203 (2004), "P247"로 명명된 GAL4 라인)와 뇌의 머쉬룸 바디(mushroom body)에 특이적인 OK107 (Lee et al., Development 126:4065-4076 (1999)), 운동 뉴런(motor neuron)에 특이적인 C164 (Torroja et al., J. Neurosci. 19:7793-7803 (1999))와 다른 뉴런-특이적 유전자로부터 유래된 프로모터/인핸서; 아교세포(glial cell)에 특이적인 gcm (Dumstrei et al., J. Neurosci. 23:3325-35 (2003))이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다; 이들 모든 참고문헌은 본 명세서에 참조로 편입된다. 발현 조절 서열의 다른 실례에는 온도 유도된 발현에 유용한, hsp70과 hsp83 유전자로부터 열 쇼크(heat shock) 프로모터/인핸서 및 편재성으로 발현된 유전자, 예를 들면, 튜불린, 악틴, 또는 유비퀴틴으로부터 유래된 프로모터/인핸서가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, 유전자도입 파리와 관련하여 "표현형"은 파리의 관찰가능 및/또는 측정가능 물리적, 행동적, 또는 생화학적 특징을 지칭한다. 본 명세서에서, "변형된 표현형" 또는 "표현형에서 변화"는 야생형 파리의 표현형과 비교하여 측정가능하게 또는 관찰가능하게 변하는 표현형을 지칭한다. 변형된 표현형의 실례에는 행동적 표현형, 예를 들면, 식욕(appetite), 교미 행동(mating behavior) 및/또는 수명(life span); 형태적 표현형, 예를 들면, 거친 눈 표현형, 오목한 날개 표현형, 또는 기관 또는 부속 기관의 상이한 외형, 크기, 색깔, 성장률 또는 위치, 또는 대조 파리에서 관찰된 유사한 특징과 비교하여 조직 또는 세포의 상이한 분포 (distribution) 및/또는 특징; 보행 기능장애 표현형, 예를 들면, 감소된 기어오름 능력, 감소된 보행 능력(walking ability), 감소된 비행(flying ability), 감소된 속도 또는 가속도, 비정상적 궤도(trajectory), 비정상적 회전(turning)과 비정상적 몸치장(grooming)이 포함된다. 변형된 표현형은 대조 파리의 표현형과 비교하여 측정가능한 양, 예를 들면, 최소한 통계학적으로 유의한 양(statistically significant amount), 바람직하게는, 최소한 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 변하는 표현형이다. 본 명세서에서, "상조적인 변형된 표현형" 또는 "상조적인 표현형"은 파리의 관찰가능 및/또는 측정가능 물리적, 행동적, 또는 생화학적 특징이 구성요소들의 총합 이상인 표현형을 지칭한다.
본 발명의 유전자도입 파리로부터 수득된 세포, 예를 들면, 이런 파리로부터 수득된 일차 배양액 내에서 세포와 관련하여 "표현형"은 세포의 관찰가능 및/또는 측정가능 물리적, 생리학적적, 또는 생화학적 특징을 지칭한다. 세포 표현형은 예로써, 세포의 임의의 형태적 특성, 예를 들면, 세포의 크기, 외형, 집합 상태, 또는 세포 내부의 초미세구조(ultrastructural) 특성, 예를 들면, 세포 소기관(organelle) 또는 분자 조립(molecular assemblage)의 분포 또는 외관, 또는 세포골격(cytoskeleton)의 구성, 세포내 미세신경원섬유의 존재 또는 출현, 또는 세포외 반점의 존재 또는 출현을 지칭한다. 세포 표현형은 또한, 세포 이동성(cell motility), 기질(substratum) 또는 다른 세포에 부착, 축색돌기(axon) 또는 수지상세포(dendrite)와 같은 구조의 확장, 축색돌기 수송(axonal transport), 세포외유출(exocytosis), 세포내이입(endocytosis), 분비(secretion), 신경전달물질 방출(neurotransmitter release), 거대분자(macromolecular) 합성 또는 파괴, 물질대사(metabolism), 산화성 스트레스에 대한 감수성, 생화학적 기질 또는 산물의 수준, 단백질의 인산화 수준(가령, tau의 변형된 인산화 또는 tau의 β-아밀로이드 유도된 변형된 인산화), 수송 활성(transport activity), 전기생리학적 특성(electrophysiological property), DNA 합성, 유전자 전사, 단백질 합성, 세포 주기 현상(cell cycle phenomenon), 생존능(viability) 등의 임의의 측면을 포괄한다.
본 명세서에서, "거친 눈" 표현형은 뉴런 세포의 변성에 의해 유발될 수 있는 감간분체(rhabdomere)의 상실, 불규칙한 홑눈 패킹(ommatidial packing), 빈번한 홑눈 병합(ommatidial fusion) 및 빠진 강모(missing bristle)로 특징된다. 눈은 야생형 파리에서 외관과 비교하여 질감(texture)에서 거칠어지고, 현미경에 의해 용이하게 관찰될 수 있다. 신경변성은 파리의 겹눈(compound eye) 내에서 용이하게 관찰되고 정량되는데, 이는 견본(specimen)의 준비 없이 채점될 수 있다(Fernandez-Funez et al., 2000, Nature 408:101-106; Steffan et. al, 2001, Nature 413:739-743; Agrawal et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:3777-3781). 상기 생물체의 눈은 각 초파리(Drosophila) 낱눈(ommatidium)의 광수용체 뉴런(photoreceptor neuron)에 의해 생산된 7개 시각 감간분체의 규칙적인 사다리꼴 정렬(trapezoidal arrangement)로 구성된다. 특히, 초파리(Drosophila) 눈 내에서 돌연변이체 도입유전자의 발현은 감간분체의 점진적 상실과 차후에, 거친-질감의 눈을 유발하는데, 이는 예로써, 낱눈(ommatidium)당 감간분체의 총수로서 정량적으로 표시될 수 있다(Fernandez-Funez et al., 2000; Steffan et. al, 2001). 이들 생물체에 치료 화합물의 투여는 광수용체 변성(photoreceptor degeneration)을 지연시키고 거친-눈 표현형을 개선한다(Steffan et. al, 2001).
본 명세서에서, "오목한 날개" 표현형은 날개가 긴 가장자리를 따라 위쪽으로 굽어지는 파리 날개의 비정상적인 접힘(folding)으로 특징된다.
본 명세서에서, "보행 기능장애"는 파리가 대조 파리와 비교하여 운동 활동, 움직임, 또는 자극에 대한 반응에서 결함(가령, 최소한 통계학적으로 유의한 차이, 또는 측정가능 파라미터에서 최소한 10% 차이)을 갖는 표현형을 지칭한다.
운동 활동에는 비행, 기어오름, 기어감과 회전이 포함된다. 이에 더하여, 결함이 측정될 수 있는 움직임 특성(movement trait)에는 i) 정해진 기간 동안 이동한 평균 총 거리(average total distance); ii) 정해진 기간 동안 한 방향으로 이동한 평균 거리(average distance); iii) 평균 속도(average speed)(시간 단위(time unit)당 이동한 평균 총 거리(average total distance)); iv) 시간 단위(time unit)당 한 방향으로 이동한 거리; v) 가속도(acceleration)(시간에 대한 속도의 변화율); vi) 회전(turning); vii) 비틀거림(stumbling); viii) 특정의 한정된 구역 또는 지점으로 파리의 공간적 위치(spatial position); ix) 이동하는 파리의 경로 모양; x) 애벌레 움직임 동안 기복(undulation) ; xi) 애벌레 머리 들기; xii) 애벌레 꼬리 치기(tail flick)가 포함된다. 공간적 위치(spatial position)로 특징되는 움직임 특성의 실례에는 제한 없이, (1) 관심 구역 내에서 보낸 평균 시간(가령, 컨테이너의 바닥, 중심, 또는 상부에서 보낸 시간; 컨테이너 내에 한정된 구역에 방문 횟수) 및 (2) 파리와 관심 지점(가령, 구역의 중심) 사이에 평균 거리(average distance)가 포함된다. 경로 모양 특성(path shape trait)의 실례에는 (1) 등각 속도(angular velocity)(움직임 방향으로 변화의 평균 속도); (2) 회전(2개의 연속 샘플 간격(sample interval)의 움직임 벡터(movement vector) 사이에 각도); (3) 회전의 빈도(시간 단위당 회전의 평균량); (4) 비틀거림 또는 곡절(meandering)(거리에 상대적인 움직임 방향에서 변화)이 포함된다. 회전 파라미터(turning parameter)에는 회전에서 부드러운 움직임(작은 회전 각도로 정의됨) 및/또는 회전에서 거친 움직임(큰 회전 각도로 정의됨)이 포함될 수 있다. 보행 표현형은 예로써, U.S. Application No. 2004/0076583, 2004/0076318과 2004/0076999에 기술된 방법을 이용하여 분석될 수 있는데, 이들 각각은 본 명세서에 순전히 참조로서 편입된다.
검사 또는 참고 개체군의 페노프로필(phenoprofile)은 상기 개체군의 특성을 측정함으로써 결정된다. 본 발명은 개체군의 복수 특성의 동시 측정이 가능하다. 단일 특성이 측정될 수 있긴 하지만, 복수 특성 역시 측정될 수 있다. 가령, 개체군에서 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 7개 또는 최소한 10개의 특성이 평가될 수 있다. 측정된 이들 특성은 움직임 특성 단독, 행동적 특성 단독, 형태적 특성 단독, 또는 복수 범주에서 특성의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 움직임 특성과 최소한 하나의 비-움직임 특성이 평가된다.
본 명세서에서, "대조 파리"는 비교되는 유전자도입 파리의 동일한 유전형(genotype)의 애벌레 또는 성체 파리를 지칭하는데, 여기서 대조 파리는 i) 유전자도입 파리 내에 존재하는 도입유전자 중에서 하나 또는 둘 모두를 포함하지 않거나, 또는 ii) 후보 약제가 투여되지 않았거나, 또는 iii) GAL4-UAS 시스템에 대한 드라이버를 보유하지 않는다.
본 명세서에서, "후보 약제"는 유전자도입 파리에 투여되면 파리의 표현형을 변화시키는, 예를 들면, 변형된 표현형을 야생형 파리의 표현형으로 부분적으로 또는 완전하게 반전시키는 잠재력을 갖는 생물학적 또는 화학적 화합물을 지칭한다. 본 명세서에서, "약제(agent)"는 임의의 재조합, 변형된 또는 자연 핵산 분자, 재조합, 변형된 또는 자연 핵산 분자의 라이브러리(library), 합성, 변형된 또는 자연 펩티드, 합성, 변형된 또는 자연 펩티드의 라이브러리; 소형 분자를 비롯한 임의의 유기 또는 무기 화합물, 또는 소형 분자를 비롯한 임의의 유기 또는 무기 화합물의 라이브러리를 포괄할 수 있다.
본 명세서에서, "소형 분자"는 3000이하, 바람직하게는, 2000 또는 1500 이하, 더욱 바람직하게는, 1000 이하, 가장 바람직하게는, 600 이하 달톤(Dalton)의 분자량(molecular mass)을 갖는 화합물을 지칭한다. 적절하게는, 소형 분자는 올리고펩티드(oligopeptide) 이외의 화합물이다.
본 명세서에서, "치료제"는 포유동물, 특히, 인간에서 알츠하이머병과 같은 신경변성 질환의 증상 중에서 한가지이상을 완화시키는 약제를 지칭한다. 치료제는 상기 질환의 한가지이상의 증상을 감소시키거나, 한가지이상의 증상의 발생을 지연시키거나, 또는 상기 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
설명
I. 유전자도입 초파리(Drosophila)의 산출
CTFAPP를 인코딩하는 도입유전자를 보유하는 유전자도입 파리 및 tau 단백질과 CTFAPP를 모두 인코딩하는 도입유전자를 보유하는 이중 유전자도입 파리가 개시된다. 이들 유전자도입 파리는 Aβ42 펩티드의 세포외 축적 및 미소관-결합된 단백질 tau의 과인산화된 형태의 세포내 침착으로 특징되는 알츠하이머병과 같은 신경변성 질환의 모형을 제공한다. 본 발명의 유전자도입 파리는 알츠하이머병의 치료에 효과적인 치료제를 선별하는데 이용될 수 있다.
초파리(Drosophila)와 같은 파리는 γ-세크레타아제 활성을 보유하지만 β-세크레타아제 활성을 보유하지 않는다. 이런 이유로, 유전자도입 파리 내에서 인간 APP 단독의 발현은 Aβ42 또는 Aβ40 펩티드의 형성을 결과하지 않을 것이다. 하지만, CTFAPP의 N-말단이 베타 세크레타아제 절단으로부터 발생하는 N-말단에 가깝기 때문에, 유전자도입 파리 내에서 CTFAPP 단독의 발현은 기질로서 CTFAPP에 대한 파리 내에서 γ-세크레타아제의 작용으로 인하여 Aβ42, Aβ40과 유사한 펩티드의 형성을 결과할 것이다. 이런 이유로, 본 발명의 파리는 Aβ42의 가공(processing), 교통(trafficking)과 축적(accumulation) 및 결과의 신경변성, 그리고 APP 유전자의 CTFAPP 인코딩 영역 내에서 돌연변이와 변이 또는 tau 유전자 내에서 돌연변이와 변이의 효과를 연구하는데 적합한 모형이다.
본 발명의 유전자도입 파리는 당업자에게 공지된 임의의 수단으로 산출될 수 있다. 유전자도입 초파리(Drosophila) 변종의 생산과 분석 방법은 널리 확립되어 있고 Brand et al., Methods in Cell Biology 44:635-654 (1994); Hay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(10):5195-200 (1997); Drosophila: A Practical Approach (ed. D. B. Roberts), pp 175-197, IRL Press, Oxford, UK (1986)에서 기술된다.
일반적으로, 유전자도입 파리를 산출하기 위하여 목적 도입유전자는 파리 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 임의의 파리가 이용될 수 있긴 하지만, 본 발명의 선호되는 파리는 초파리과(Drosophilidae)의 구성원이다. 전형적인 파리는 노랑초파리(Drosophila melanogaster)이다.
다양한 형질전환 벡터가 본 발명의 유전자도입 파리의 산출에 유용한데, 여기에는 도입유전자의 게놈 내로 무작위 통합(random integration)을 매개하는 트랜스포손(transposon) 서열을 포함하는 벡터 및 상동성 재조합(homologous recombination)을 이용하는 벡터(Rong and Golic, Science 288:2013-2018 (2000))가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 선호되는 벡터는 목적 도입유전자의 파리 게놈 내로의 삽입을 매개하는 전이가능 P-요소로부터 서열을 포함하는 pUAST(Brand and Perrimon, Development 118:401-415 (1993))이다. 다른 선호되는 벡터는 PdL인데, 이는 독시사이클린-의존성 과다발현(doxycycline-dependent overexpression)을 유도할 수 있다(Nandis, Bhole and Tower, Genome Biology 4 (R8):l-14, (2003)). 또 다른 선호되는 벡터는 클로닝(cloning) 및 게놈 위치 지도작성(mapping)이 용이한 pExP-UAS이다. 본 발명에 이용되는 2가지 특정 벡터는 pExP-UAS:CTF-I(SEQ ID NO: 17)와 pExP-UAS:CTF-II(SEQ ID NO: 18)이다. pExP-UAS:CTF-I는 인간 APP, CTFAPP와 myc tag의 신호 서열을 인코딩한다. pExP-UAS:CTF-II는 초파리(Drosophila) 외피 단백질(Vinc), CTFAPP와 3x HA 태그의 신호 서열을 인코딩한다.
P-요소 트랜스포손 매개된 형질전환은 유전자도입 파리의 산출에 통상적으로 이용되는 기술이고 Spradling, P-element mediated transformation, in Drosophila: A Practical Approach (ed. D. B. Roberts), pp175-197, IRL Press, Oxford, UK (1986)에서 상세하게 기술된다. 전이가능 요소에 기초한 다른 형질전환 벡터에는 예로써, hobo 요소 (Blackman et al., Embo J. 8:211-7 (1989)), mariner 요소 (Lidholm et al., Genetics 134:859-68 (1993)), hermes 요소 (O'Brochta et al., Genetics 142:907-14 (1996)), Minos 요소 (Loukeris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9485-9 (1995)), 또는 PiggyBac 요소 (Handler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7520-5 (1998))가 포함된다. 일반적으로, 전위(transposition)에 필요한 트랜스포손의 말단 반복 서열은 형질전환 벡터 내로 통합되고, 말단 반복 서열이 목적 도입유전자의 측면에 위치하도록 정렬된다. 적절하게는, 형질전환 벡터는 유전자도입 동물을 확인하는데 이용되는 마커 유전자(marker gene)를 포함한다. 통상적으로 이용되는, 초파리(Drosophila) white 유전자(Pirrotta V., & C. Brockl, EMBO J. 3(3):563-8 (1984)) 또는 초파리(Drosophila) rosy 유전자(Doyle W. et al., Eur. J Biochem. 239(3):782-95 (1996))의 유도체와 같은 마커 유전자는 초파리(Drosophila)의 눈 색깔에 영향을 준다. 유전자도입 동물 내에서 신뢰할 수 있고 용이하게 측정되는 표현형 변화(phenotypic change)를 결과하는 임의의 유전자가 마커로서 이용될 수 있다. 형질전환에 이용되는 다른 마커 유전자의 실례에는 뻣뻣하고 엷은 색소 침착(pigmentation)을 변화시키는 yellow 유전자 (Wittkopp P. et al., Curr Biol. 12(18): 1547-56 (2002)); 뻣뻣한 형태를 변화시키는 forked 유전자 (McLachlan A., MoI Cell Biol. 6(l):l-6 (1986)); Adh- 변종의 형질전환을 위한 선택가능 마커(selectable marker)로서 이용되는 Adh+ 유전자 (McNabb S. et al., Genetics 143(2):897-911 (1996)); Ddc ts2 돌연변이체 변종을 형질전환시키는데 이용되는 Ddc+ 유전자 (Scholnick S. et al., Cell 34(1):37-45(1983)); 대장균(E. coli)의 lacZ 유전자; 대장균(E. coli) 트랜스포손 Tn5로부터 네오마이신R 유전자; 녹색 형광 단백질 (GFP; Handler and Harrell, Insect Molecular Biology 8:449-457 (1999))이 포함되는데, 이들은 상이한 프로모터/인핸서 요소, 예를 들면, 눈, 더듬이(antenna), 날개와 다리 특이적 프로모터/인핸서, 또는 폴리-유비퀴틴(poly-ubiquitin) 프로모터/인핸서 요소의 통제를 받을 수 있다.
소요의 도입유전자의 도입을 위한 플라스미드 구조체는 게놈 DNA 내로 상기 도입유전자를 통합하는데 요구되는 특정 트랜스포사제를 발현하는 보조 플라스미드와 함께, 적절한 유전적 배경을 갖는 초파리(Drosophila) 애벌레 내로 공동 주입된다. 주입된 애벌레로부터 성장하는 동물(GO 성체)은 마커 유전자 표현형의 발현에 기초하여 유전자도입 모자이크 동물(mosaic animal)에 대하여 선택되거나, 또는 수동으로 선별되고, 차후에 목적 도입유전자의 하나이상의 사본을 안정적으로 보유하는 완전한 유전자도입 동물을 산출하기 위하여 교잡된다(G1과 차후의 산출).
이원 시스템(binary system), 예를 들면, UAS/GAL4 시스템이 유전자도입 파리의 산출에 통상적으로 이용된다. 이는 Brand and Perrimon, Development 118:401-15 (1993))와 Rorth et al, Development 125:1049-1057 (1998)에 기술된 바와 같이, 효모 GAL4 전사 활성인자 단백질에 의한 프로모터의 조절을 위한 UAS 상류 조절 서열을 이용하는 널리 확립된 시스템이다. 이러한 접근법에서, "표적" 품종으로 지칭되는 유전자도입 초파리(Drosophila)가 산출되는데, 여기서 목적 유전자(가령, C-말단 APP 단편 또는 tau를 인코딩하는 도입유전자))는 UAS에 의해 조절되는 적절한 프로모터(가령, hsp70 TATA 박스; Brand and Perrimon, Development 118:401-15 (1993) 참조)에 작동가능하게 연결된다. "드라이버" 품종으로 지칭되는 다른 유전자도입 초파리(Drosophila) 변종이 산출되는데, 여기서 GAL4 코딩 영역은 특정 조직, 예를 들면, 눈, 더듬이, 날개, 또는 신경계 내에서 GAL4 활성인자 단백질의 발현을 작동시키는 프로모터/인핸서에 작동가능하게 연결된다. 목적 유전자는 이러한 목적 유전자에 결합된 프로모터로부터 전사를 "작동"시키는 전사 활성인자(transcriptional activator)의 부재로 인하여 "표적" 품종 내에서 발현되지 않는다. 하지만, UAS-표적 품종이 GAL4 드라이버 품종과 교잡되면, 목적 유전자가 유도된다. 생성된 후손은 GAL4 품종에 특징적인 특정의 발현 패턴을 전시한다.
이러한 접근법의 기술적 간소함은 목적 유전자를 보유하는 유전자도입 표적 품종을 산출하고, 표적 품종을 한 무리의 기존 드라이버 품종과 교잡함으로써 다양한 조직 내에서 목적 유전자의 지향된 발현의 효과를 샘플링(sampling)하는 것을 가능하게 한다. 특정의 드라이버를 보유하는 다수의 GAL4 드라이버 초파리(Drosophila) 변종이 기존 문헌에서 보고되었고, 다른 변종이 확립된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다(Brand and Perrimon, Development 118:401-15 (1993)). 본 발명에 이용되는 드라이버 변종에는 예로써, 날개, 뇌와 개재뉴런(interneuron) 내에서 발현을 위한 apterous-GAL4; 유사분열후 뉴런(post-mitotic neuron) 내에서 범-신경 발현을 위한 elav-GAL4; 신경모세포(neuroblast)에서부터 뉴런까지 발달중인 신경계 내에서 범-신경 발현을 위한 scabrous-GAL4; 눈에서 발현을 위한 sevenless-GAL4, eyeless-GAL4와 GMR-GAL4; 중추신경계 내에서 발현을 위한 Nervana 2-GAL4; 콜린성 뉴런 내에서 발현을 위한 Cha-(콜린 아세틸트랜스퍼라아제, choline acetyltransferase) GAL4; 도파민성 뉴런(dopaminergic neuron) 내에서 발현을 위한 TH-(티로신 수산화효소, tyrosine hydroxylase); 유충과 애벌레의 중추신경계 및 성체의 뇌, 흉추 신경절(throacic ganglion)과 장(gut) 내에서 발현을 위한 CaMKII-; 인두 감각 뉴런(pharyngeal sensory neuron) 내에서 발현을 위한 P-GAL4; 아교 세포 내에서 발현을 위한 gcm-GAL4가 포함된다.
본 발명에서는 신호 펩티드에 대한 DNA 서열에 선택적으로 융합된, CTFAPP를 인코딩하는 DNA 서열을 그들의 게놈 내로 통합하는 유전자도입 파리를 개시한다. 일부 구체예는 tau 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 및 CTFAPP를 인코딩하는 DNA 서열을 보유하는 이중 유전자도입 파리이다.
단일 도입유전자를 보유하는 유전자도입 파리의 산출은 당업자에게 공지된 임의의 표준 수단을 이용하여 수행될 수 있다. 이중 유전자도입 파리를 산출하기 위하여, CTFAPP 또는 tau 단백질을 발현하는 유전자도입 파리는 독립적으로 만들어지고, 이후 양쪽 단백질을 모두 발현하는 파리를 산출하기 위하여 교잡된다.
유전자도입 파리의 하나이상의 도입유전자는 선택된 프로모터 또는 UAS/GAL4 시스템에 의해 직접적으로 작동될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 유전자도입 초파리(Drosophila)는 UAS/GAL4 대조 시스템을 이용하여 생산된다. 간단히 말하면, 도입유전자(가령, CTFAPP)를 발현하는 유전자도입 파리를 산출하기 위하여, 상기 도입유전자를 인코딩하는 DNA 서열은 GAL4 반응성 요소 UAS에 작동가능하게 연결되도록 벡터 내로 클로닝된다. UAS 요소를 포함하는 벡터, 예를 들면, UAS 서열 요소가 전사된 영역의 상류에 위치하는 pUAST 벡터(Brand and Perrimon, Development 118:401-415 (1993))는 상업적으로 가용하다. 상기 DNA는 표준 방법을 이용하여 클로닝되고(Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Y, (1995)), 본 명세서의 분자 기술 섹션에서 더욱 상세하게 기술된다. 상기 DNA를 적절한 벡터, 예를 들면, pUAST 내로 클로닝한 이후, 상기 벡터는 유전자도입 초파리(Drosophila)를 산출하기 위하여 표준 절차에 의해 초파리(Drosophila) 유충(가령, yw 유충) 내로 주입된다(Brand et al., Methods in Cell Biology 44:635-654 (1994); Hay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5195-200 (1997)).
이원 UAS/GAL4 시스템이 이용되면, 유전자도입 후손은 변형된 표현형의 존재를 평가하기 위하여 초파리(Drosophila) 드라이버 변종과 교잡될 수 있다. 바람직한 초파리(Drosophila)는 눈 특이적 드라이버 변종 GMR-GAL4를 보유하는데, 이는 거친 눈 표현형의 강도에 기초하여 유전자도입 파리의 확인과 분류를 가능하게 한다. 가령, 초파리(Drosophila) 눈에서 tau의 발현은 거친 눈 표현형을 결과하는데, 이는 현미경에 의해 용이하게 관찰될 수 있다. 유전자도입 품종에 의해 전시되는 거친 눈 표현형의 강도는 강함, 중간, 또는 약함으로 분류될 수 있다. 약한 또는 중간 품종은 눈의 복 부위(ventral portion)를 덮는 거칠고 불규칙한 외관을 갖는다. 중간 강도 품종은 전체 눈에서 더욱 강한 거침(roughness)을 나타내는 반면, 강한 강도 품종에서 전체 눈은 많은 홑눈(ommatidia)과 홑눈간 강모(interommatidial bristle)가 상실/융합되는 것으로 보이고, 전체 눈은 부드럽고 광택 있는 외관을 갖는다; 부가적으로, 눈 전체에서 괴사 패치(necrotic patch)가 탐지될 수 있다.
CTFAPP를 발현하는 유전자도입 파리를 산출하기 위하여, CTFAPP를 인코딩하는 DNA 서열은 CTFAPP가 세포 막 내로 삽입될 수 있도록 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 인 프레임 결찰된다. 신호 서열은 CTFAPP 코딩 서열에 직접적으로 연결되거나, 또는 DNA 링커 서열, 예를 들면, 3개, 6개, 9개, 12개, 또는 15 뉴클레오티드의 DNA 링커 서열을 이용함으로써 간접적으로 연결된다. 단백질을 초파리(Drosophila)의 소포체 분비 경로로 또는 이런 경로를 통하여 지향시키는 신호 펩티드가 이용된다. 본 발명의 바람직한 신호 펩티드는 인간 APP (SEQ ID NO:5), wingless(wg) (SEQ ID NO:6), argos(aos) (SEQ ID NO:7), 초파리(Drosophila) APPL (SEQ ID NO:8), presenilin(psn) (SEQ ID NO:9), windbeutel (SEQ ID NO: 10)과 Vinc이다.
CTFAPP를 인코딩하는 DNA는 표준 결찰 기술에 의해 신호 서열에 연결되고, 이후 상기 서열이 GAL4 반응성 요소 UAS에 작동가능하게 연결되도록 벡터 내로 클로닝된다. CTFAPP 유전자도입 파리의 산출을 위한 바람직한 형질전환 벡터는 pUAST 벡터이다(Brand and Perrimon, Development 118:401-415 (1993)). tau 유전자도입 파리의 산출에서 앞서 기술된 바와 같이, 벡터는 표준 절차에 의해 초파리(Drosophila) 유충(가령, yw 유충) 내로 주입되고(Brand et al., Meth. in Cell Biol. 44:635-654 (1994)); Hay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5195-200 (1997)), 후손은 선택된 마커 유전자의 표현형에 기초하여 선택되고 교잡된다. 이원 UAS/GAL4 시스템이 이용되면, 유전자도입 후손은 변형된 표현형의 존재를 평가하기 위하여 초파리(Drosophila) 드라이버 변종과 교잡될 수 있다. 바람직한 초파리(Drosophila) 드라이버 변종은 GMR-GAL4(눈)와 elav-GAL4(CNS)이다.
눈 표현형(가령, 거친 눈 표현형)을 평가하기 위하여, GMR-GAL4 드라이버 변종이 교잡에 이용될 수 있다. 초파리(Drosophila) 눈에서 CTFAPP의 정규 장소외 과다발현은 홑눈(초파리(Drosophila) 겹눈을 형성하는 동일한 단일 단위)의 광수용체 세포의 규칙적인 사다리꼴 정렬을 파괴하는 것으로 생각되는데, 이의 심각도는 도입유전자 사본수와 발현 수준에 좌우되는 것으로 생각된다. 보행과 행동 표현형(가령, 기어오름 분석)을 평가하기 위하여, elav-GAL4 드라이버 변종이 교잡에 이용된다. 초파리(Drosophila) 중추신경계(CNS) 내에서 CTFAPP의 정규 장소외 과다발현은 손상된 움직임, 기어오름과 비행과 같은 보행 결함을 유발하는 것으로 생각된다.
단일 유전자도입 파리가 생산되면, 이들 파리는 교미(mating)에 의해 서로 교잡될 수 있다. 파리는 통상적인 방법에 따라 교잡된다. 이원 UAS/GAL4 시스템이 이용되면, 파리는 적절한 드라이버 변종과 교잡되고, 변형된 표현형은 앞서 기술된 바와 같이 평가되고, 유전자도입 파리는 표현형 강도(phenotypic severity)를 평가함으로써 분류된다. 가령, 본 명세서에 개시된 바와 같이, tau와 CTFAPP 도입유전자 조합은 눈에 상조적인 영향을 주는 것으로 생각된다.
도입유전자 발현의 특이성(specificity)과 세기(intensity)를 변경하기 위하여 여러 인자가 변화될 수 있다. 도입유전자의 서열 변이체 또는 도입유전자 조합이 표현형을 변경하는데 이용될 수 있다. 상이한 발현 드라이버, 예를 들면, 단독으로 또는 GAL4 시스템과 공동으로 이용되는 조직 특이적 프로모터는 발현의 조직 특이성과 세기에 영향을 주는데 이용될 수 있다. 발달 온도 역시 변화될 수 있는데, 이는 발현의 조직 분포 또는 세기에 영향을 줄 수 있다. 일반적으로, 더욱 높은 온도는 도입유전자의 더욱 강한 발현을 작동시킨다.
유전자도입 파리 내에서 tau와 CTFAPP 단백질의 발현은 표준 기술, 예를 들면, 파리 조직 횡단면(tissue cross-section)의 웨스턴 블랏 분석 또는 면역염색(immunostaining)에 의해 확증되는데, 이들 둘 모두 하기에 기술된다.
웨스턴 블랏 분석은 표준 방법에 의해 수행된다. 간단히 말하면, 예로써, 웨스턴 블랏 분석으로 CTFAPP 또는 tau의 발현을 탐지하기 위하여, 전체 파리, 또는 파리의 머리(가령, 80-90개 머리)가 수집되고, "완전" 프로테아제 저해물질(Boehringer Mannheim)과 함께 100 ㎕의 2% SDS, 30% 수크로오스, 0.718 M Bis-Tris, 0.318 M Bicine을 포함하고 드라이아이스 위에 놓인 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 넣어지고, 이후 기계적 균질화기(mechanical homogenizer)를 이용하여 으깨어진다. 샘플은 95℃에서 5분 동안 가열되고 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리되며, 상층액(supernatant)은 새로운 에펜도르프 튜브로 이전된다. 5% β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)과 0.01% 브롬페놀 블루(bromphenol blue)가 추가되고, 샘플은 분리 겔(separating gel) 상에서 적하(loading)에 앞서 끓여진다. 대략 200 ng의 전체 단백질 추출물이 8M 요소를 포함하는 15% Tricine/Tris SDS PAGE 겔 상에서 각 샘플에 적하된다. 분리후, 샘플은 PVDF 막(BIO-RAD, 162-0174)으로 이전되고, 이들 막은 차후에, 3분 동안 PBS 내에서 끓여진다. 항-tau 항체(가령, T14(Zymed)와 AT100(Pierce-Endogen)), 항-APP 항체(가령, 6E10(Senetek PLC Napa, CA)), 또는 항-Aβ42는 일반적으로, 실온에서 90분 동안 5% 탈지 우유(non-fat milk), 0.1% Tween 20을 포함하는 1 x PBS에서 1:2000의 농도로 혼성화된다. 샘플은 이후, 1 x PBS-0.1% Tween-20에서 각각, 5분, 15분과 15분 동안 3회 세척된다. 표지된 이차 항체(가령, 항-생쥐-HRP; Amersham Pharmacia Biotech, NA 931)는 전형적으로, 실온에서 90분 동안 5% 탈지 우유(non-fat milk), 0.1% Tween 20을 포함하는 1 x PBS에서 1:2000의 농도로 제조된다. 샘플은 이후, 1 x PBS-0.1% Tween-20에서 각각, 5분, 15분과 15분 동안 3회 세척된다. 그 다음, 단백질은 적절한 방법을 이용하여 탐지된다. 가령, 항-생쥐-HRP가 공액된 이차 항체로서 이용되면, ECL(ECL Western Blotting Detection Reagents, Amersham Pharmacia Biotech, # RPN 2209)이 탐지에 이용된다.
유전자도입 파리에서 단백질 발현을 확증하는 방법으로서, 초파리(Drosophila) 기관 횡단면 또는 전체의 면역염색이 수행된다. 이런 방법은 병들지 않은 조직 내에 존재하는 tau 단백질의 변형된 형태인 과인산화된 tau의 존재를 확증하는데 특히 유용하다. 과인산화된 tau는 tau 단백질과 비교하여 변형된 병리학적 확증(pathological conformation)을 나타내고, 알츠하이머병과 같은 특정의 신경변성 질환을 앓는 환자로부터 병든 조직 내에 존재한다.
초파리(Drosophila) 기관의 횡단면은 Wolff, Drosophila Protocols, CSHL Press (2000)에서 기술된 방법과 같은 임의의 통상적인 냉동절단(cryosectioning)에 의해 만들어질 수 있다. 냉동절편(cryosection)은 이후, 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여, tau와 C-말단 APP 단편 펩티드의 탐지를 위하여 면역염색될 수 있다. 바람직한 구체예에서, Vectastain ABC 키트(이는 비오틴화된 항-생쥐 IgG 이차 항체 및 양고추냉이 과산화효소 H (Vector Laboratories)에 공액된 아비딘/비오틴(avidin/biotin)을 포함한다)가 단백질을 확인하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 이차 항체는 형광단(fluorophore)에 공액된다. 간단히 말하면, 냉동절편(cryosection)은 Vectastain ABC 키트 프로토콜에 따라, 정상적인 말 혈청(horse serum)을 이용하여 차단된다. CTFAPP 또는 tau를 인식하는 일차 항체는 전형적으로, 1:3000의 희석도(dilution)로 이용되고, 이차 항체와 함께 배양은 Vectastain ABC 키트 프로토콜에 따라, 1-2% 정상 말 혈청을 포함하는 PBS/1%BSA에서 수행된다. ABC 키트에서 이러한 절차가 추종된다; ABC 반응물과 함께 배양이 PBS/0.1% 사포닌(saponin)에서 수행되고, 이후 PBS/0.1% 사포닌에서 4 x 10분 세척이 수행된다. 절편은 이후, 슬라이드(slide)당 0.5 ㎖의 양고추냉이 과산화효소 H 기질 용액(substrate solution), 400 ㎍/㎖ 3,3'-디아미노벤지덴(diaminobenzidene, DAB), PBS/0.1% 사포닌에서 0.006% H2O2에서 배양된다. 반응은 3분후, PBS에서 0.02% 나트륨 아지드화물(sodium azide)로 중단된다. 절편은 PBS에서 수회 헹굼되고, DPX(Fluka)에서 고정(mounting)에 앞서 에탄올 시리즈(ethanol series)를 통하여 탈수된다.
횡단면을 면역염색하는데 이용될 수 있는 전형적인 항체에는 Aβ42 펩티드를 인식하는 단클론 항체 6E10 (Senetek PLC Napa, CA.) 및 항-tau 항체 ALZ50과 MCI (Jicha GA, et al., J. of Neurosci. Res. 48:128-132 (1997))이다.
대안으로, C-말단 APP 단편과 tau를 인식하는 본 발명에 유용한 항체는 당분야에 공지된 표준 프로토콜을 이용하여 만들어질 수 있다(참조: Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). 생쥐, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유동물은 면역원성 형태(immunogenic form)의 단백질(가령, 항체 반응(antibody response)을 유도할 수 있는 Aβ42 또는 tau 폴리펩티드 또는 항원성 단편)으로 면역될 수 있다. 항체를 발생시키기 위한 면역원(immunogen)은 이들 폴리펩티드(가령, 분리된 재조합 폴리펩티드 또는 합성 펩티드)를 어쥬번트(adjuvant)와 혼합함으로써 제조된다. 대안으로, C-말단 APP 단편 또는 tau 폴리펩티드는 대형 면역원성 단백질에 대한 융합 단백질(fusion protein)로서 만들어질 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 다른 대형 면역원성 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 공유 연결될 수 있다. 대안으로, C-말단 APP 단편 또는 tau, 또는 이들 단백질의 단편을 인코딩하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 이들 폴리펩티드를 발현하고, Costagliola et al., J. Clin. Invest. 105:803-811 (2000)에 기술된 바와 같이 동물에서 면역 반응(immune response)을 산출하는데 이용될 수 있다. 항체를 발생시키기 위하여, 면역원은 전형적으로, 실험 동물, 예를 들면, 토끼, 양과 생쥐에 피내, 피하, 또는 근육내 투여된다. 앞서 언급된 항체 이외에, 단일 사슬 항체(single chain antibody)와 같은 유전자 조작된 항체 유도체가 만들어질 수 있다.
면역화(immunization)의 진행은 혈장(plasma) 또는 혈청(serum) 내에서 항체 역가(antibody titer)의 탐지로 모니터될 수 있다. 표준 ELISA, 유세포분석법(flow cytometry) 또는 다른 면역검사(immunoassay) 역시 면역원을 항원으로 하여, 항체의 수준을 평가하는데 이용될 수 있다. 항체 제조물은 면역화된 동물의 혈청으로부터 간단히 유래되거나, 또는 원하는 경우에, 다클론 항체(polyclonal antibody)가 예로써, 고정된 면역원(immobilized immunogen)을 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 혈청으로부터 분리될 수 있다.
단클론 항체(monoclonal antibody)를 생산하기 위하여, 항체-생산 비장세포(splenocyte)는 면역된 동물로부터 수확되고, 표준 체세포 융합 절차에 의해, 영속화 세포(immortalizing cell), 예를 들면, 골수종(myeloma) 세포와 융합되어 하이브리도마(hybridoma) 세포를 산출한다. 이런 기술은 당분야에 널리 공지되어 있는데, 여기에는 예로써, 하이브리도마 기술 (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)에서 최초 보고됨), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbar et al., Immunology Today, 4: 72 (1983)) 및 인간 단클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96 (1985))이 포함된다. 하이브리도마 세포는 C-말단 APP 단편 또는 tau 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체, 또는 이런 하이브리도마 세포를 포함하는 배양액의 배지로부터 분리된 폴리펩티드와 단클론 항체의 생산을 위하여 면역조직화학적으로 선별될 수 있다.
II. 유전자도입 초파리(Drosophila)로부터 일차 세포 배양액의 제조
세포는 본 발명의 유전자도입 파리로부터 수득되고 일차 배양액에 유지될 수 있는데, 여기서 이들은 표현형이 평가되거나, 또는 신경변성에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는데 이용될 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 기술이 유전자도입 파리로부터 세포의 분리, 이들의 배양, 이들의 선택적인 분화 촉진 및 이들의 표현형 연구에 적용될 수 있다.
간단히 말하면, 하나이상의 세포는 유전자도입 파리의 기관 또는 조직의 절개(dissection) 및/또는 분리(dissociation)에 의해, 임의의 발달 단계에서 상기 파리로부터 수득된다. 이들 세포는 그들의 표현형을 연구하는데 충분한 기간, 전형적으로, 수시간 내지 수일 또는 수주 동안 그들의 생존능(viability)을 유지하는데 적합한 배양 배지(culture medium) 내로 놓인다. 파리 조직의 분리에 다양한 기술이 가용하다. 가령, 여러 유충은 느슨한 Potter-Elvehjem 유리 균질화기(glass homogenizer)를 이용하여 집합적으로 균질화되어 완전 유충 세포 현탁액을 제공한다. 이들 세포는 균질화되고, 10% 비-열 불활화된 소 태아 혈청(fetal bovine serum)으로 보충된 무균 배지(sterile medium), 예를 들면, Schneider 불완전 배지(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)에서 배양되고, 배양기 내에서 20-30℃ 온도 범위에서 CO2 없이 유지된다(참조: Guha et al., J. Cell Sci. 116:3373-86 (2003)). 개별 세포 유형은 예로써, 세포 형태 또는 다른 특징에 의해, 배양액으로부터 선택될 수 있다. 가령, 예로써, lacZ 발현 (참조: Krasnow et al., Science 251 :81-85 (1991)) 또는 GFP-태그된 단백질의 발현 (참조: Guha et al., J. 세포 Sci. 116:3373-86 (2003))을 이용한 표현형에 기초하여, 전체 동물 세포 분류(whole animal cell sorting)를 이용하여 원하는 세포 유형, 예를 들면, 뉴런 전구체 세포 또는 혈구(hemocyte)를 분리할 수 있다.
일차 배양액에서 세포는 신경과 근육(Hayashi et al., In Vitro Cell Dev Biol Anim 30A:202-8 (1994)) 또는 신경과 외피(Luer et al., Development 116:377- 85 (1992))를 비롯한 다양한 말단 분화된 세포로 분화될 수 있다. 세포는 또한, 발달 후기 단계 또는 성체로부터 배양될 수 있다. 가령, 눈 성충판(imaginal disc)은 애벌레 또는 번데기로부터 분리되고, 번데기로부터 채취되면 신경돌기 생성물(neurite outgrowth)을 연구하는데 이용되거나, 또는 이보다 이전 단계로부터 유사분열 세포(mitotic cell)를 제공하는데 이용될 수 있다(Li et al., J Neurobiol 28:363-80 (1995)). 일차 배양액에서 세포는 제거 직후에, 다시 말하면, 제거되는 시점에서 발달 단계에서 연구되거나, 또는 시험관내에서 분화하도록 허용되고 분화 이후에 연구될 수 있다.
CTFAPP 또는 CTFAPP와 tau를 보유하는 유전자도입 파리로부터 배양된 세포의 표현형은 신경변성과 관련된 현상에 대한 이들 폴리펩티드의 효과를 연구하는데 이용될 수 있다. 가령, 배양된 세포는 예로써, CTFAPP, Aβ 또는 tau에 특이적으로 결합하는 표지된 항체의 분포를 조사함으로써, 세포외 아밀로이드 반점 또는 세포내 얽힘(intracellular tangle)의 발생에 대하여 시험될 수 있다. 세포골격(cytoskeleton)의 구성에서 변경은 세포골격 단백질, 예를 들면, 악틴(actin), 튜불린(tubulin)과 연관된 단백질에 대한 표지된 항체로 조사될 수 있다. 신경 기능(neurological function)은 이온 채널 활성(ion channel activity) 또는 신경전달물질의 방출의 전기생리학적 측정(electrophysiological measurement)을 수행함으로써 세포 수준에서 연구될 수 있다. 세포-세포 결합과 유전자 발현 역시 알츠하이머병과 같은 신경변성 질환에서 활동하는 병리학적 기전(pathological mechanism)에 단서를 제공할 수 있다. 더 나아가, 일차 배양액은 유전자도입 세포 표현형에 대한 후보 약제의 효과를 조사함으로써, 신경변성 질환에 대한 유익한 효과를 나타낼 가능성이 높은 화학적 약제를 확인하는 스크리닝 과정(screening process)에 이용될 수 있다.
III. 분자 기술
본 발명에서, tau 또는 인간 Aβ42italian을 인코딩하는 DNA 서열은 유전자도입 파리의 산출에 적합한 형질전환 벡터 내로 클로닝된다.
tau 또는 인간 C-말단 APP 단편을 인코딩하는 DNA 서열의 산출
tau와 C-말단 APP 단편을 인코딩하는 DNA 서열은 게놈 DNA로부터 수득되거나, 또는 당분야에 널리 공지된 방법을 이용한 합성 수단에 의해 산출될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Y, (1995)). 간단히 말하면, 인간 게놈 DNA는 페놀 추출(phenol extraction)에 의해, 또는 QLAamp 조직 키트 (Qiagen, Chatsworth, CaI.), Wizard 게놈 DNA 정제 키트 (Promega, Madison, Wis.) 및 ASAP 게놈 DNA 분리 키트 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)와 같은 키트를 이용한 추출에 의해 말초혈(peripheral blood) 또는 점막 부스러기(mucosal scraping)로부터 분리될 수 있다. tau와 C-말단 APP 단편을 인코딩하는 DNA 서열은 이후, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 게놈 DNA로부터 증폭되고(Mullis and Faloona Methods Enzymol, 155: 335 (1987))), 적절한 재조합 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
대안으로, tau 또는 인간 C-말단 APP 단편을 인코딩하는 cDNA는 RT-PCR을 이용하여 mRNA로부터 증폭되고, 적절한 재조합 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다. RNA는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다; 선택은 샘플 공급원에 의해 좌우될 것이다. RNA를 제조하는 방법은 Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, NY, Chapter 11 (1986); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 4, John Wiley and Sons, NY (1987); Kawasaki and Wang, PCR Technology, ed. Erlich, Stockton Press NY (1989); Kawasaki, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. eds. Academic Press, San Diego (1990)에 기술되는데, 이들 모두 본 명세서에 참조로서 편입된다.
PCR 또는 RT-PCR에 의한, tau 또는 CTFAPP 단편을 인코딩하는 서열의 산출 이후에, 이들 서열은 가급적, 클론된 단편의 서열이 양 방향으로서 핵산 염기서열분석(nucleic acid sequencing)에 의해 확증될 수 있도록 하기 위하여, 적절한 염기서열분석 벡터(sequencing vector) 내로 클론된다.
본 발명에 이용하기 적합한 재조합 클로닝 벡터는 상기 벡터가 하나이상의 선택된 호스트 세포 내에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 전형적올, 클로닝 벡터 내에서, 이러한 서열은 벡터가 호스트 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하고, 복제 기점(origin of replication) 또는 자가 복제 서열(autonomously replicating sequence)을 보유하는 서열이다. 이들 서열은 다양한 세균, 효모와 바이러스에서 널리 공지되어 있다. 가령, 플라스미드 pBR322로부터 복제 기점은 대부분의 그람-음성(Gram-negative) 세균에 적합하고, 2 마이크론(micron) 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점(가령, SV40, 아데노바이러스)은 포유동물 세포 내에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점은 이들이 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예를 들면, COS 세포에 이용되는 것이 아니라면 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다.
유리하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 선택가능 마커(selectable marker)로 지칭되는 선택 유전자(selection gene)를 포함한다. 상기 유전자는 선택적 배양 배지 내에서 성장된 형질전환된 호스트 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 인코딩한다. 이런 이유로, 선택 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 호스트 세포는 이러한 배양 배지 내에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 항생제와 다른 독소, 예를 들면, 암피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 테트라사이클린(tetracycline)에 내성(resistance)을 공여하는 단백질, 영양요구성 결함(auxotrophic deficiency)을 보충하는 단백질, 또는 성장 배지 내에서 가용하지 않은 필수 영양소(critical nutrient)를 제공하는 단백질을 인코딩한다.
클로닝이 대장균(E. coli)에서 가장 편의하게 수행되기 때문에, 대장균(E. coli)-선택가능 마커, 예를 들면, 항생제 암피실린에 내성을 공여하는 β-락타마아제(lactamase) 유전자가 유용하다. 이들은 대장균(E. coli) 플라스미드, 예를 들면, pBR322, 또는 pUC 플라스미드(가령, pUC18 또는 pUC19)로부터 수득될 수 있다.
tau 또는 인간 C-말단 APP 단편을 인코딩하는 서열은 또한, 유전자도입 파리의 산출에 적합한 형질전환 벡터, 예를 들면, 전이가능 요소 사이에 서열의 삽입, 또는 UAS 요소의 하류에 삽입을 가능하게 하는 벡터, 예를 들면, pUAST 내로 직접적으로 클로닝될 수 있다. 적절하게는, 유전자도입 파리의 산출에 적합한 벡터는 유전자도입 파리가 확인될 수 있도록 하는 마커 유전자(marker gene), 예를 들면, white 유전자, rosy 유전자, yellow 유전자, forked 유전자 및 앞서 언급된 다른 유전자를 포함한다. 적절한 벡터는 또한, 앞서 기술된 바와 같은 조직 특이적 대조 서열, 예를 들면, 눈에서 발현에 유용한 sevenless 프로모터/인핸서, eyeless 프로모터/인핸서, glass-반응성 프로모터 (GMR)/인핸서; 날개에서 발현에 유용한 dpp 또는 vestigial 유전자로부터 유래된 인핸서/프로모터 등을 포함한다.
tau 또는 인간 C-말단 APP 단편을 인코딩하는 서열은 발현 조절 서열이 코딩 서열에 작동가능하게 연결되도록 하는 방식으로 재조합 벡터 내로 결찰된다.
본 명세서에서, tau 또는 인간 C-말단 APP 단편을 인코딩하는 DNA 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 또는 PCR에 추후 이용되는 cDNA를 합성하는 RNA-유인된 DNA 중합효소(가령, 역전사효소(reverse transcriptase))를 이용하는 RT-PCR의 이용을 통하여 산출될 수 있다.
IV. 표현형 및 변형된 표현형을 탐지하는 방법
파리의 임의의 관찰가능 및/또는 측정가능 물리적 또는 생화학적 특징은 본 발명에 따라 평가될 수 있는 표현형이다. 소요의 특성, 예를 들면, 스크리닝 검사에 적합한 특성을 갖는 유전자도입 파리는 대조(가령, 야생형 파리, 또는 도입유전자가 발현되지 않는 파리)와 비교하여 변형된 표현형을 나타내는 파리를 확인함으로써 생산될 수 있다. 치료제는 투여 직후에, 후보 약제가 투여되지 않은 유전자도입 파리와 비교하여 유전자도입 파리의 변형된 표현형에서 변화를 결과하는 약제를 선별함으로써 확인될 수 있다.
변형된 표현형에서 변화에는 관찰된 표현형의 완전한 또는 부분적인 반전(reversion)이 포함된다. 완전한 반전은 변형된 표현형의 부재, 또는 대조 파리에서 관찰된 표현형으로 이러한 표현형의 100% 반전으로 정의된다. 변형된 표현형의 부분적인 반전은 대조 파리에서 관찰된 표현형으로 5%, 10%, 20%, 바람직하게는, 30%, 더욱 바람직하게는, 50%, 가장 바람직하게는, 50% 초과 반전일 수 있다. 전형적인 측정가능 파라미터에는 눈과 같은 기관의 형태; 조직과 기관의 분포; 행동 표현형(가령, 식욕과 교미); 보행 능력이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일부 구체예에서, 단일 표현형만 결정된다. 다른 구체예에서, 2가지 이상의 표현형이 결정된다. 또 다른 구체예에서, 복수 표현형(특성), 예를 들면, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 7가지, 10가지, 또는 그 이상의 특성이 결정되고 "페노프로필(phenoprofile)"을 산출하는데 이용된다. 측정된 이들 특성은 움직임 특성 단독, 행동적 특성 단독, 형태적 특성 단독, 또는 복수 범주에서 특성의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 움직임 특성과 최소한 하나의 비-움직임 특성이 평가된다. 표현형 또는 페노프로필은 개별 파리 또는 파리 개체군에서 비교될 수 있다. 파리 개체군이 조사되면, 각 특성에 대한 포괄적 수치가 비교될 수 있고, 이들 개체군 사이에 유의하게 상이한 일단의 특성이 확인될 수 있다. 이러한 일단의 특성 및 특정 개체군(가령, 부모 파리 군체)에서 이들 특성의 수치는 상기 개체군의 "페노프린트(phenoprint)"로서 지칭된다. 따라서, 생물학적 견본의 검사 개체군(test population)이 대조 생물학적 견본의 개체군과 구별되는 특성은 상기 검사 개체군의 "페노프린트(phenoprint)"로서 지칭된다.
기술된 다양한 특성 파라미터 각각에 대하여, 통계학적 척도가 결정될 수 있다(참조: PRINCIPLES OF BIOSTATISTICS, second edition (2000) Mascello et al., Duxbury Press). 특성 파라미터(trait parameter)당 통계의 실례에는 분포(distribution), 평균(mean), 분산(variance), 표준 편차(standard deviation), 표준 오차(standard error), 최대값(maximum), 최소값(minimum), 빈도(frequency), 첫 번째 발생까지 잠복, 마지막 발생까지 잠복, 총 지속 기간(second 또는 %), 평균 지속 기간(유관하면)이 포함된다.
보행 표현형
보행 표현형은 예로써, U.S. Application Nos. 2004/0076583, 2004/0076318과 2004/0076999에 기술된 바와 같이 평가될 수 있는데, 이들 모두 순전히 참조로서 편입된다. 가령, 보행 활동은 파리를 바이알 내에 위치시키고, 이들을 바이알의 바닥에 충돌시키고, 이후 정해진 기간 동안 바이알 상에서 정해진 마커를 넘어 기어오르는 파리의 총수를 계산함으로써 기어오름 분석에서 평가될 수 있다. 이러한 실시에서, 대조 파리의 100% 보행 활동은 일정한 마커를 넘어 기어오르는 파리의 총수로 표시된다; 반면, 변형된 보행 활동을 나타내는 파리는 대조 파리 개체군에서 관찰된 활동의 80%, 70%, 60%, 50%, 바람직하게는, 50% 미만, 또는 더욱 바람직하게는, 30% 미만을 갖는다.
한 측면에서, 이들 특성은 컨테이너, 예를 들면, 바이알 내에서 파리 개체군의 움직임을 탐지하고 연속적으로 분석함으로써 측정된다. 파리의 움직임은 기록 장치(recording instrument), 예를 들면, CCD-비디오카메라에 의해 모니터될 수 있고, 결과의 영상(image)은 본 명세서에 기술된 바와 같은 프로세서-지원된 알고리즘(processor-assisted algorithm)을 이용하여 디지털화되고 분석될 수 있으며, 분석 데이터는 컴퓨터-접근가능 방식(computer-accessible manner)으로 보관될 수 있다. 가령, 파리 움직임에 관련된 특성을 측정하는데 있어, 각 동물의 궤도(trajectory)는 이들 동물에 대한 하나이상의 변수(가령, 속도, 수직 단독 속도(vertical only speed), 수직 거리(vertical distance), 회전 빈도, 작은 움직임의 빈도 등)의 산정으로 모니터된다. 이런 변수의 수치는 이후, 바이알 내에 동물 개체군에 대하여 평균되고, 각 개체군(가령, 부모 군체 파리와 유전자도입 파리)에 대한 특성을 기술하는 포괄적 수치가 획득된다.
본 명세서에서, "움직임 특성 데이터"는 하나이상의 움직임 특성으로 구성되는 척도를 지칭한다. "움직임 특성 데이터" 척도의 실례에는 X-pos, X-속도, 속도, 회전, 비틀거림, 크기, T-카운트, P-카운트, T-길이, 크로스하이(Crosshigh), 크로스로우(Crosslow)와 F-카운트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이들 특정 척도의 설명은 하기에 제공된다.
이런 "움직임 특성"의 실례에는
a) 총 거리(정해진 기간 동안 이동한 평균 총 거리);
b) X 단독 거리(정해진 기간 동안 X 방향으로 이동한 평균 거리);
c) Y 단독 거리(정해진 기간 동안 Y 방향으로 이동한 평균 거리);
d) 평균 속도(시간 단위당 이동한 평균 총 거리);
e) 평균 X-단독 속도(시간 단위당 X 방향으로 이동한 거리);
f) 평균 Y-단독 속도(시간 단위당 Y 방향으로 이동한 거리);
g) 가속도(시간에 대한 속도의 변화율);
h) 회전;
i) 비틀거림;
j) 특정의 한정된 구역 또는 지점으로 파리의 공간적 위치(spatial position)(공간적 위치 특성의 실례에는 (1) 관심 구역 내에서 보낸 평균 시간(가령, 컨테이너의 바닥, 중심, 또는 상부에서 보낸 시간; 컨테이너 내에 한정된 구역에 방문 횟수); (2) 파리와 관심 지점(가령, 구역의 중심) 사이에 평균 거리(average distance); 2개의 샘플 지점(sample point)을 연결하는 벡터의 평균 길이(가령, 2마리 파리 사이에, 또는 파리와 한정된 지점 또는 물체 사이에 선 거리(line distance)); (4) 2개의 샘플 지점을 연결하는 벡터의 길이가 사용자 정의 파라미터(user define parameter)보다 작거나, 크거나, 또는 동등한 평균 시간 등이 포함된다);
k) 이동하는 파리의 경로 모양, 즉, 파리가 이동하는 경로의 기학학적 모양(경로 모양 특성의 실례에는 (1) 등각 속도(angular velocity)(움직임 방향으로 변화의 평균 속도); (2) 회전(2개의 연속 샘플 간격(sample interval)의 움직임 벡터(movement vector) 사이에 각도); (3) 회전의 빈도(시간 단위당 회전의 평균량); (4) 비틀거림 또는 곡절(meandering)(거리에 상대적인 움직임 방향에서 변화)이 포함된다) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이는 앞서 정의된 비틀거림과 상이하다. 회전 파라미터(turning parameter)에는 회전에서 부드러운 움직임(작은 회전 각도로 정의됨) 및/또는 회전에서 거친 움직임(큰 회전 각도로 정의됨)이 포함될 수 있다
움직임 특성은 예로써, 아래의 파라미터를 이용함으로써 정량될 수 있다:
X-Pos: X-Pos 스코어는 모든 궤도에 대한 x-위치의 목록을 결부시키고, 이후 결부된 목록에서 모든 수치의 평균을 계산함으로써 산정된다.
X-속도: X-속도 스코어는 먼저, 차후 프레임(frame)에 대한 x-위치에서 절대 차이(absolute difference)를 채택하여 속도 벡터(speed vector)의 x-구성요소의 길이를 계산함으로써 산정된다. 이후, 모든 궤도에 대한 x-속도의 결과 목록은 결부되고, 결부된 목록에 대한 평균 x-속도가 계산된다.
속도: 속도 스코어는 속도 벡터의 x-구성요소의 길이를 이용하는 대신에, 전체 벡터의 길이가 이용된다는 점을 제외하고 X-속도 스코어에서와 동일한 방식으로 산정된다. 다시 말하면, [길이] = ([x-길이]2 + [y-길이]2)의 제곱근(square root).
회전: 회전 스코어는 속도 벡터의 길이를 이용하는 대신에, 0과 90도 사이의 수치를 제공하는, 현재 속도 벡터와 이전 속도 벡터 사이에 절대 각도(absolute angle)가 이용되는 점을 제외하고 속도 스코어에서와 동일한 방식으로 산정된다.
비틀거림: 비틀거림 스코어는 속도 벡터의 길이를 이용하는 대신에, 0과 90도 사이의 수치를 제공하는, 현재 속도 벡터와 신체 지향(body orientation)의 방향 사이에 절대 각도(absolute angle)가 이용되는 점을 제외하고 속도 스코어에서와 동일한 방식으로 산정된다.
크기: 크기 스코어는 속도 벡터의 길이를 이용하는 대신에, 탐지된 파리의 크기가 이용되는 점을 제외하고 속도 스코어에서와 동일한 방식으로 산정된다.
T-카운트: T-카운트 스코어는 무비(movie)에서 탐지된 궤도의 수이다.
P-카운트: P-카운트 스코어는 무비에서 지점(point)의 총수(즉, 무비에서 모든 궤도에서 합산된, 각 궤도에서 지점의 수)이다.
T-길이: T-길이 스코어는 무비에서 모든 파리가 보행하는 전체 길이를 제공하는, 무비에서 모든 속도 벡터의 길이의 총합이다.
크로스하이(Crosshigh): 크로스하이 스코어는 무비 동안 바이알의 위쪽 절반에서 네거티브 x-방향으로(바이알의 바닥에서 상부로) 한 수치에 설정된 선을 교차하거나, 또는 무비의 시작 시점에 상기 선을 이미 넘어서는 궤도의 수이다. 후자 범주는 파리가 때때로, 튜브의 바닥으로 내려가지 않는다는 사실을 보상하기 위하여 포함되었다. 다시 말하면, 이 스코어는 전체 무비 동안 튜브에 붙어있거나, 또는 x 선 위로 기어 올라가는 탐지된 파리의 수를 측정한다.
크로스로우(Crosslow): Crosslow 스코어는 바이알의 아래쪽 절반에서 선이 대용된다는 점을 제외하고 크로스하이 스코어에 동등하다.
F-카운트: F-카운트 스코어는 각 개별 프레임 내에서 탐지된 파리의 수를 계산하고, 이후 모든 프레임 상에서 이들 수치의 최대값을 채택한다. 따라서, 이는 무비(movie) 동안 임의의 단일 프레임 내에서 동시에 관찰되는 파리의 최대수를 측정한다.
LIP: LIP는 비디오 화면에서 "멈춰있는"(즉, 사용자에 의해 특정된 시간 동안 움직임이 거의 없는) 파리의 수를 측정한다.
최대높이(maxheight): fly count metric에 의해 추정된 바이알 내에 파리의 숫자로 나눗셈된, 모든 프레임에서 x-위치의 최대 합(maximum sum).
Flycount: 최대값 대신에 97번째 백분위수(percentile)가 이용되는 점을 제외하고 fly count metric에서와 동일함.
t에서 fcross: 명시된 시간 프레임(t)에서 설정 높이(set height) 위에 동시에 존재하는 파리의 수.
X-Y 좌표 시스템(coordinate system)에서 방향의 지정은 임의적이다. 본 명세서에서, "X"는 수직 방향(vertical direction)(전형적으로, 파리가 수용되는 컨테이너의 장축(long axis)을 따라서)을 지칭하고, "Y"는 수평 방향(horizontal direction)(가령, 바이알의 표면을 따라서)으로 움직임을 지칭한다.
눈 표현형
본 발명에 따른 이중 유전자도입 파리는 눈에서 측정가능 형태적 변화를 유발하는 눈의 점진적인 신경변성에 의해 발생된 변형된 눈 표현형을 나타낼 수 있다(Fernandez-Funez et al., Nature 408:101-106 (2000); Steffan et. al., Nature 413:739-743 (2001)). 초파리(Drosophila) 눈은 각 초파리(Drosophila) 낱눈의 광수용체 뉴런에 의해 생성된 8개 감간분체(7개는 단일 구역 내에서 관찰됨)의 규칙적인 사다리꼴 정렬(regular trapezoidal arrangement)로 구성된다. 본 발명에 따른 표현형 눈 돌연변이체는 감간분체의 점진적인 상실 및 차후에, 거친 질감의 눈을 유발한다. 거친 질감의 눈 표현형은 현미경 또는 비디오카메라에 의해 용이하게 관찰된다. 이러한 표현형을 변화시키는 화합물에 대한 스크리닝 검사에서, 광수용체 변성(photoreceptor degeneration)의 지연 및 거친-눈 표현형의 개선이 관찰될 수 있을 것이다(Steffan et. al, Nature 413:739-743 (2001)).
행동 표현형
중추신경계에서 뉴런 변성은 보행 장애(locomotor deficit)가 포함되지만 이에 국한되지 않는 행동 장애(behavioral deficit)를 유발하게 되는데, 이는 애벌레와 성체 초파리(Drosophila) 모두에서 분석되고 정량될 수 있다. 가령, 표준 기어오름 분석(참조: Ganetzky and Flannagan, J. Exp. Gerontology 13:189-196 (1978); LeBourg and Lints, J. Gerontology 28:59-64 (1992))에서 초파리(Drosophila) 성체 동물의 기어오름 실패는 정량될 수 있고, 이들 동물에서 운동 장애(motor deficit)와 신경변성의 정도를 지시한다. 신경변성 표현형에는 예로써, 날개의 신경근육 조절(neuromuscular control)의 점진적인 상실; 전반적인 조정(general coordination)의 점진적인 퇴행; 운동력(locomotion)의 점진적인 퇴행; 식욕의 점진적인 상실이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 분석될 수 있는 파리 행동의 다른 측면에는 24시간 주기 행동 리듬(circadian behavioral rhythm), 식사 행동(feeding behavior), 외부 자극에 습관화(inhabituation)와 향기 조건형성(odorant conditioning)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 모든 표현형은 파리의 표준 시각적 관찰(standard visual observation)에 의해 당업자에 의해 측정된다.
다른 뉴런 변성 표현형은 감소된 수명이다, 가령, 초파리(Drosophila) 수명은 10-80%, 예를 들면, 대략 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70% 감소될 수 있다.
기억과 학습 표현형
초파리(Drosophila)에서, 연관 학습(associative learning)과 기억에 대한 가장 특징화된 검사는 향기-회피 행동 과제(odor-avoidance behavioral task)이다(T. Tully, et al., J. Comp. Physiol. Al 57, 263-277 (1985)). 이러한 고전적인(Pavlovian) 조건형성은 한 번에 하나씩 연속으로 2가지 향기(조건 자극, conditioned stimuli(CS))에 파리를 노출시키는 단계를 수반한다. 이들 향기 노출 중의 한 가지 향기 노출(CS+) 동안, 파리는 전기 충격(무조건 자극, unconditioned stimulus(US))을 동시에 받는 반면, 다른 향기에 노출(CS-)은 이러한 부정적인 강화(reinforcement)가 부재한다. 훈련 이후에, 파리는 향기가 반대 방향으로부터 흘러나오는 "선택 지점(choice point)"에 놓이게 되고, 어떤 향기를 피할 지를 결정할 것으로 예상된다. 편의를 위해, 학습(learning)은 시험이 훈련 직후에 실시될 때 파리의 성과로서 정의된다. 단일 훈련 시험은 강한 학습을 산출한다: 전형적인 반응은 파리의 >90%가 CS+를 회피하는 것이다. 이러한 1회 훈련으로부터 야생형 파리의 성과는 대략 24-시간 기간에 감쇠하는데, 이 시점에서 파리는 2가지 향기 사이에 균일하게 분포하게 된다. 파리는 또한, 장기간 지속되는 연관 후각 기억(associative olfactory memory)을 형성할 수 있긴 하지만, 이는 통상적으로, 반복적인 훈련 계획을 필요로 한다.
V. 유전자도입 파리의 유용성
질병 모형
본 발명의 유전자도입 파리는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)과 타우병증(tauopathy), 예를 들면, 괌의 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)/파킨슨증-치매(parkinsonism-dementia) 복합군, 피질 기저핵 변성(corticobasal degeneration), 호은성 그레인 치매(Guam argyrophilic grain dementia), 권투선수 치매(dementia pugilistica), 석회화를 동반하는 확산성 신경원섬유(diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 염색체 17에 연관된 파킨슨증(Parkinsonism linked to chromosome 17(FTDP-17))을 동반하는 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 픽병(Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증(progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy)(PSP), 원섬유 단독 치매(tangle only dementia), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 다운 증후군(Down syndrome), 저스트만-스트라우슬러-쉐인커 병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy), 연령-관련된 기억 손상(age-related memory impairment), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 괌(Guam)의 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)/파킨슨증-치매(parkinsonism-dementia) 복합군, 자가면역 장애(auto-immune condition)(가령, 귈레인 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 낭창(Lupus)), 빈스완거 병(Binswanger's disease), 뇌와 척수 종양(신경섬유종증(neurofibromatosis) 포함), 뇌 아밀로이드 맥관병증(Journal of Alzheimer's vol. 3, 65-73 (2001)), 뇌성 마비(cerebral palsy), 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease)(변이 형태 포함), 피질 기저핵 변성(corticobasal degeneration), CNS 실질의 발달 장애에 기인한 질환(conditions due to developmental dysfunction of the CNS parenchyma), 뇌혈관의 발달 장애에 기인한 질환(conditions due to developmental dysfunction of the cerebrovasculature), 다발 경색 치매(dementia - multi infarct), 겉질밑치매(dementia - subcortical), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 치매, 조직구조가 불명한 치매(dementia lacking distinct histology), 덴다토루보팔리돌루시안 위축(dendatorubopallidolusian atrophy), 신경변성을 수반하는 눈, 귀와 전정계(vestibular system) 질환(황반 변성(macular degeneration)과 녹내장(glaucoma) 포함), 다운 증후군(Down's syndrome), 운동장애(dyskinesias)(발작성), 근육긴장이상(dystonias), 본태성 진전증(essential tremor), 파 증후군(Fahr's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's ataxia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia)와 염색체 17에 연관된 파킨슨증(Parkinsonism linked to chromosome 17(FTDP-17)), 전두측두엽 치매(frontotemporal lobar degeneration), 전두엽 치매(frontal lobe dementia), 간성 뇌증(hepatic encephalopathy), 유전성 강직성 대마비(hereditary spastic paraplegia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 뇌수종(hydrocephalus), 가성뇌종양(pseudotumor cerebri)과 CSF 기능장애(dysfunction)를 수반하는 다른 질환, 가우셔병(Gaucher's disease), 척수성 근위축증(spinal muscular atrophy)(Hirayama disease, Werdnig-Hoffrnan disease, Kugelberg-Welander disease), 코르사코프씨병(Korsakoff's syndrome), 마샤드 죠셉병(Machado-Joseph disease), 경미한 인지 장애(mild cognitive impairment), 단일사지 근육위축(monomelic amyotrophy), 운동 뉴런 질환(motor neuron diseases), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 다른 탈수초 질환(demyelinating condition)(가령, 백색질이영양증(leukodystrophy)), 근육통성 뇌척수염(myalgic encephalomyelitis), 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy), 화학물질, 약물과 독소에 의해 유도된 간대성근경련(myoclonus) 신경변성, AIDS 치매를 비롯한 AIDS의 신경학적 증상, 폴리글루타민 확대(polyglutamine expansion)에 기인한 신경 장애(neurological condition), 장내바이러스(enterovirus)가 포함되지만 이에 국한되지 않는 세균 및/또는 바이러스 감염의 신경학적/인식 증상과 결과, 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 신경원섬유을 동반하는 비-괌인 운동 뉴런 질환(non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangle), 비케톤성 고글리신혈증(non-ketotic hyperglycinemia), 올리브-교-소뇌위축증(olivo-ponto cerebellar atrophy), 황반 변성(macular degeneration)과 녹내장(glaucoma)을 비롯한 신경변성을 수반하는 안구와 귀 질환, 파킨슨병(Parkinson's disease), 픽병(Pick's disease), 비마비성 회백수염(non-paralytic polio)을 비롯한 급성회백수염(poliomyelitis), 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), kuru 병, 치사성 가족 불면증(fatal familial insomnia)과 저스트만-스트라우슬러-쉐인커 병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)을 비롯한 프리온 질환(prion disease), 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 맥관장애(cerebral amyloid angiopathy), 뇌염후 파킨슨증(postencephalitic Parkinsonism), 후-소아마비증후군(post-polio syndrome), 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 맥관장애, 진행성 근위축증(progressive muscular atrophy), 진행성 구마비(progressive bulbar palsy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 하지불안 증후군(restless leg syndrome), 레트 증후군(Rett syndrome), 샌드호프병(Sandhoff disease), 근긴장(spasticity), 척수구근 근위축증(spino-bulbar muscular atrophy)(Kennedy's disease), 척수소뇌실조증(spinocerebellar ataxias), 산발성 전두측두엽 치매(sporadic fronto-temporal dementias), 선조흑질 변성(striatonigral degeneration), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis), 아황산염 산화효소 결핍(sulphite oxidase deficiency), 시드넘 무도병(Sydenham's chorea), 원섬유 단독 치매(tangle only dementia), 테이삭스병(Tay-Sachs disease), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 전염성 해면상 뇌증(transmissable spongiform encephalopathy), 혈관성 치매(vascular dementia)와 윌슨병(Wilson disease)과 같은 인간 신경 질환에서 관찰되는 것과 같은 신경변성에 대한 모형을 제공한다.
치료제를 확인하는 방법
본 발명에서는 또한, 본 명세서에 개시된 유전자도입 파리를 이용하여 신경변성 질환용 치료제를 확인하는 방법을 제시한다. 본 명세서에서, "치료제"는 의사에 의해 결정되는, 신경변성 질환의 증상 완화를 유도하는 약제를 지칭한다. 가령, 치료제는 신경변성 질환을 예방 또는 치료하거나, 이러한 질환의 하나이상의 증상을 감소시키거나, 또는 이들 증상의 발생을 지연시킬 수 있다.
AD와 같은 신경변성 질환에 효과적인 치료제를 선별하기 위하여, 후보 약제는 유전자도입 파리에 투여된다. 유전자도입 파리는 이후, 후보 약제가 투여되지 않은 대조 유전자도입 파리에 의해 전시되는 표현형과 비교하여 표현형에서 변화가 분석된다. 표현형에서 관찰된 변화는 질병 치료에 유용한 약제를 지시한다.
후보 약제는 다양한 수단으로 투여될 수 있다. 가령, 약제는 후보 약제를 파리 배양 배지에 적용함으로써, 예를 들면, 파리 배양액에 추가될 수 있는 효모 반죽(yeast paste)과 같은 파리 사료에 약제를 혼합함으로써 투여될 수 있다. 대안으로, 후보 약제는 1% 수크로오스 용액(sucrose solution)에서 제조될 수 있고, 상기 용액은 특정된 시간, 예를 들면, 10 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 또는 72 시간 동안 파리에 공급될 수 있다. 한 구체예에서, 후보 약제는 2000년 6월 29일자 공개된 WO 00/37938에 기술된 바와 같이, 파리의 혈액림프(hemolymph) 내로 미세주입된다. 다른 투여 양식에는 예로써, 후보 약제의 증발(vaporization)에 의한 에어로졸 전달(aerosol delivery)이 포함된다.
후보 약제는 수정란, 유충, 애벌레와 성체 단계를 비롯한 임의의 파리 발달 단계에서 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 후보 약제는 성체 파리에 투여된다. 더욱 적절하게는, 후보 약제는 예로써, 눈 발달이 진행되는 주요한 애벌레 단계인 세 번째 애벌레 영 단계에서 파리 배양액에 상기 약제를 추가함으로써 애벌레 단계 동안 투여된다.
약제는 단일 분량(single dose) 또는 복수 분량( multiple dose)으로 투여될 수 있다. 적절한 농도는 당업자에 의해 결정될 수 있고, 약제의 생물학적 특성과 화학적 특성 및 투여 방법에 좌우될 것이다. 가령, 후보 약제의 농도는 경구 전달되는 경우에, 0.0001 μM 내지 20 mM, 또는 주사되는 경우에, 0.1 μM 내지 20 mM, 1 μM 내지 10 mM, 또는 10 μM 내지 5 mM 범위일 수 있다.
개별 후보 약제로 스크리닝 이외에, 후보 약제의 효율적인 스크리닝을 위하여, 이들 후보 약제는 약제의 혼합물 또는 집합, 예를 들면, 약제의 라이브러리로서 투여될 수 있다. 본 명세서에서, 약제의 "라이브러리"는 20개, 100개, 103개, 104개, 105개, 106개, 108개, 1012개, 또는 1015개 이상의 개별 약제의 혼합물로 특징된다. "약제의 집합"은 라이브러리 또는 더욱 작은 개체군, 예를 들면, 3개, 5개, 10개, 또는 20개 미만의 약제의 혼합물일 수 있다. 약제의 집합은 유전자도입 파리에 투여될 수 있고, 이들 파리는 유전자도입 파리에 의해 전시되는 표현형의 완전한 또는 부분적인 반전에 대하여 조사될 수 있다. 약제의 집합이 유전자도입 파리 표현형의 변화를 결과하면, 이러한 집합의 개별 약제는 이후, 특정의 목적 약제를 확인하기 위하여 독립적으로 분석될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 후보 약제의 고속 처리 검색(high throughput screen)이 수행되는데, 여기서 다수의 약제, 최소한 50개의 약제, 100개의 약제 또는 그 이상의 약제가 복수의 파리 개체군에서 동시에 개별적으로 시험된다. 파리 개체군은 최소한 2개, 10개, 20개, 50개, 100개, 또는 그 이상의 성체 파리 또는 애벌레를 포함한다. 한 구체예에서, 보행 표현형, 행동 표현형(가령, 식욕, 교미 행동(mating behavior) 및/또는 수명), 또는 형태적 표현형(가령, 세포, 기관 또는 부속 기관의 외형, 크기, 또는 위치; 또는 파리의 크기, 외형, 또는 성장률(growth rate))은 개체군 내에서 파리의 디지털화된 무비(digitized movie)를 만듦으로써 관찰되고, 상기 무비는 파리 표현형에 대하여 분석된다.
후보 약제
본 발명의 스크리닝 검사에 유용한 약제에는 유전자도입 파리에 투여되면 변형된 표현형을 변경하는, 예를 들면, 상기 표현형을 부분적으로 또는 완전하게 반전시키는 잠재력을 갖는 생물학적 또는 화학적 화합물이 포함된다. 약제는 임의의 재조합, 변형된 또는 자연 핵산 분자; 재조합, 변형된 또는 자연 핵산 분자의 라이브러리; 합성, 변형된 또는 자연 펩티드; 합성, 변형된 또는 자연 펩티드의 라이브러리; 소형 분자를 비롯한 임의의 유기 또는 무기 화합물; 또는 소형 분자를 비롯한 임의의 유기 또는 무기 화합물의 라이브러리를 포괄할 수 있다. 약제는 또한, 치료제의 회수를 용이하게 할 수 있는 통상적인 또는 독특한 태그(tag)에 연결될 수 있다.
전형적인 약제 공급원에는 무작위 펩티드 라이브러리 및 D- 및/또는 L-형태 아미노산으로 구성되는 조합 화학(combinatorial chemistry)-유래된 분자 라이브러리; 포스포펩티드(phosphopeptide)(무작위 또는 부분 축퇴, 유도된 포스포펩티드 라이브러리의 구성원이 포함되지만 이들에 국한되지 않음; 참조: Songyang et al., Cell 72:767-778 (1993)); 항체(다클론, 단클론, 인간화, 항-이디오타입(anti-idiotypic), 키메라(chimeric) 또는 단일 사슬 항체(single chain antibody), FAb, F(ab')2와 FAb 발현 라이브러리 단편 및 이들의 에피토프-결합(epitope-binding) 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않음); 소형 유기 또는 무기 분자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
당분야에 공지된 다수의 라이브러리, 예를 들면, 화학적으로 합성된 라이브러리, 재조합 라이브러리(가령, 파지(phage)에 의해 생산됨) 및 in vitro 번역-기초된 라이브러리가 이용될 수 있다. 화학적으로 합성된 라이브러리의 실례는 Fodor et al., Science 251:767-773 (1991); Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991); Lam et al., Nature 354:82-84 (1991); Medyuski, Bio/Technology 12:709-710 (1994); Gallop et al., J. Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426 (1994); Houghten et al., Biotechniques 13:412 (1992); Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614-1618 (1994); Salmon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712 (1993); PCT Publication No. WO 93/20242; Brenner and Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381- 5383 (1992)에서 기술된다. 비펩티드 라이브러리(nonpeptide library)의 실례로써, 벤조디아조핀 라이브러리(benzodiazepine library)(참조: Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712 (1994))가 이용을 위하여 개조될 수 있다.
펩토이드 라이브러리(peptoid library) (Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992)) 역시 이용될 수 있다. 라이브러리의 다른 실례가 이용될 수 있는데, 여기서 펩티드 내에서 아마이드 기능기(amide functionality)는 Ostresh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :11138-11142 (1994)에 기술된 바와 같이, 화학적으로 변형된 조합 라이브러리를 산출하기 위하여 퍼메틸화(permethylation) 된다. 펩티드 라이브러리가 생산될 수 있는 파지 전시 라이브러리(phage display library)의 실례는 Scott & Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990); Christian et al., J. MoI. Biol. 227:711-718 (1992); Lenska, J. Immunol. Meth. 152:149-157 (1992); Kay et al., Gene 128:59-65 (1993); PCT Publication No. WO 94/18318, August 18, 1994에서 기술된다.
본 명세서에 기술된 방법으로 시험되고 확인될 수 있는 약제에는 Aldrich (Milwaukee, Wl 53233), Sigma Chemical (St. Louis, MO), Fluka Chemie AG (Buchs, Switzerland) Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY;), Eastman Chemical Company, Fine Chemicals (Kingsport, TN), Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, 25 Germany), Takasago (Rockleigh, NJ), SST Corporation (Clifton, NJ), Ferro (Zachary, LA 70791), Riedel-deHaen Aktiengesellschaft (Seelze, Germany), PPG Industries Inc., Fine Chemicals (Pittsburgh, PA 15272)를 비롯한 임의의 상업적 공급원으로부터 획득된 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 미생물, 진균, 식물 또는 동물 추출물을 비롯한 다른 종류의 자연 산물이 본 명세서에 기술된 방법을 이용하여 선별될 수 있다.
더 나아가, 소형 분자 검사 화합물(small molecule test compound)을 비롯한 검사 약제의 다양한 라이브러리가 이용될 수 있다. 가령, 라이브러리는 Specs and BioSpecs B. V. (Rijswijk, The Netherlands), Chembridge Corporation (San Diego, CA), Contract Service Company (Dolgoprudoy, Moscow Region, Russia), Comgenex USA Inc. (Princeton, NJ), Maybridge Chemicals Ltd. (Cornwall PL34 OHW, United Kingdom)과 Asinex (Moscow, Russia)로부터 상업적으로 구입될 수 있다.
이에 더하여, 생물학적 라이브러리; 공간적으로 접근가능 병렬(spatially addressable parallel) 고체 상(solid phase) 또는 용액 상(solution phase) 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 요하는 합성 라이브러리 방법; "일-비드 일-화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법; 친화성 크로마토그래피 선택(affinity chromatography selection)을 이용한 합성 라이브러리 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 당분야에 공지된 조합 라이브러리(combinatorial library) 방법이 이용될 수 있다. 이러한 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리에 국한되는 반면, 다른 접근법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머(oligomer) 또는 화합물의 소형 분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam, Anticancer Drug Des.12: 145 (1997)). 소형 분자 검사 화합물을 비롯한 검사 화합물의 조합 라이브러리가 이용될 수 있는데, 이들은 예로써, Eichler & Houghten, MoI. Med. Today 1 :174-180 (1995); Dolle, MoI. Divers. 2:223-236 (1997); Lam, Anticancer Drug Des. 12:145-167 (1997)에 개시된 바와 같이 산출될 수 있다.
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 실례는 예로써, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422 (1994); Zuckermaim et al., J. Med. Chem. 37:2678 (1994); Cho et al., Science 261:1303 (1993); Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 (1994); Gallop et al., 15 J. Med. Chem. 37:1233 (1994)에서 확인할 수 있다.
약제 라이브러리는 핵산 분자; DNA, RNA, 또는 이의 유사체의 라이브러리일 수 있다. 가령, 목적하는 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 수집된 mRNA로부터 cDNA 라이브러리가 작제되거나, 또는 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)를 이용하거나 게놈 DNA를 무작위 단편화시키는 방법을 이용하여 적절한 크기의 단편이 생산되도록 게놈 DNA가 처리될 수 있다. RNA 분자를 보유하는 라이브러리는 예로써, 세포로부터 RNA를 수집함으로써, 또는 이들 RNA 분자를 화학적으로 합성함으로써 작제될 수 있다. 핵산 분자의 다양한 라이브러리는 분자 내에서 무작위화된 영역의 생산을 용이하게 하는 고형 상 합성(solid phase synthesis)을 이용하여 만들어질 수 있다. 원하는 경우에, 무작위화(randomization)는 분자 내에 한 위치에서 특정 비율의 하나이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 라이브러리가 산출되도록 치우칠 수 있다(U.S. Pat. No. 5,270,163).
유전적 변경인자를 확인하는 방법
본 명세서에 기술된 유전자도입 파리는 AD와 같은 신경변성 질환에 영향을 주는 유전자를 확인하는데 이용될 수 있다. "유전적 변경인자"로 지칭되는 이들 유전자는 하나이상의 도입유전자, 예를 들면, CTFAPP 또는 CTFAPP + tau에 의해 발생된 표현형을 변화시키는 능력을 통하여 확인될 수 있다. 가령, 후보 유전적 변경인자인 유전자에서 돌연변이를 보유하는 파리의 집합은 CTFAPP를 발현하는 단일 유전자도입 파리 품종 또는 CTFAPP + tau를 발현하는 이중 유전자도입 파리 품종과 교잡될 수 있다. 일정한 돌연변이가 도입유전자 또는 이들 도입유전자 조합과 연관된 표현형을 변화시키면, 상기 돌연변이를 포함하는 유전자는 유전적 변경인자로서 확인된다. 가령, CTFAPP를 발현하고 눈 표현형(가령, 변형된 홑눈 패킹)을 나타내는 유전자도입 파리는 돌연변이체 파리와 교잡될 수 있고, 유전적 변경인자는 정상적인 눈 표현형의 복원으로 확인될 수 있다. 임의의 표현형, 바람직하게는, 가시적인 표현형이 유전적 변경인자를 확인하는 스크리닝에 이용될 수 있다. 도입유전자 또는 도입유전자 조합은 프로모터에 의해 직접적으로 작동되거나, 또는 UAS/GAL4 시스템에 의해 작동될 수 있다. 유전적 변경인자를 보유하는 돌연변이체 변종이 확인되면, 이러한 변경인자의 좌위(locus)는 확립된 기술, 예를 들면, 결함 지도작성(deficiency mapping) (Parks et al., Nat Genet. 36:288-92 (2004)) 또는 단일 뉴클레오티드 다형성과 동시에 감수분열 재조합 지도작성(meiotic recombination mapping) (Hoskins et al., Genome Res. 11:1100- 13 (2001))을 이용하여 결정될 수 있다. 유전적 변경인자 내에 돌연변이를 보유하는 유전자도입 변종은 또한, 유전적 변경인자 및 도입유전자 또는 도입유전자 조합 사이에 상호작용을 변경하는 약물을 확인하는, 앞서 개요된 기술을 이용한 고속 처리 검색(high throughput screen)의 기초를 형성할 수 있다.
실시예 1: CTFAPP를 발현하는 유전자도입 초파리( Drosophila )의 산출
노랑초파리(Drosophila melanogaster)의 유전자도입 변종은 인간 APP695의 CTFAPP 단편을 포함하도록 제조되었다. 파리는 APP695의 신호 펩티드에 인 프레임(in frame) 융합된 인간 APP695의 아미노산 596-695를 인코딩하는 cDNA를 포함하는 Dyrks 등(FEBS Lett. 309, 20-24 (1992))의 SP65/A4CT 벡터를 보유하고, 상류 활성화 서열(upstream activating sequence, UAS)이 SP65/A4CT 벡터의 상류에 위치하는 구조체(construct)를 주입하였다. 이후, 유전자도입 변종은 노랑초파리(D. melanogaster)의 GMR-GAL4 드라이버 변종과 교잡하여 눈에서 CTFAPP를 발현시켰다.
도 1에서는 CTFAPP 유전자도입 파리로부터 추출물의 웨스턴 블랏(Western blot)을 도시하는데, 이는 CTFAPP 유전자도입 파리에서 Aβ42의 생산을 증명한다. 면역침전(immuniprecipitation) 항체는 인간 APP/아밀로이드 β에 특이적인 항체 4G8(Signet)이었다. 웨스턴 블랏을 위한 일차 항체는 4G8과 약간 상이한 에피토프(epitope)를 포함하긴 하지만 인간 APP/아밀로이드 β에 역시 특이적인 6E10(Signet)이었다. 이차 항체는 HRP 공액된 염소-항-생쥐(goat-anti-mouse)이었다. 앞서 기술된 절차에 의해 산출된 3가지 독립된 유전자도입 품종은 왼쪽으로부터 첫 번째 3개의 레인에 도시된다. 왼쪽으로부터 네 번째 레인에 도시된 Aβ42 대조 파리는 argos 신호 서열에 인 프레임(in frame) 융합된 Aβ42를 인코딩하는 cDNA를 포함하는 유전자도입 노랑초파리(D. melanogaster) 변종을 노랑초파리(D. melanogaster) GMR-GAL4 드라이버 변종과 교잡함으로써 수득된 Aβ42 유전자도입 변종으로부터 수득하였다. 대조로서 제공된 야생형 파리 추출물(레인 5)은 Aβ42를 발현하지 않았다.
실시예 2: CTFAPP와 tau를 발현하는 유전자도입 초파리( Drosophila )의 산출
인간 tau를 인코딩하는 도입유전자를 포함하는 유전자도입 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 변종 및 인간 CTFAPP를 인코딩하는 도입유전자를 포 함하는 유전자도입 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 변종이 본 명세서에 기술된 바와 같이 산출된다. 이들 2가지 유전자도입 파리 변종은 이후, 재결합시켜 인간 tau와 인간 CTFAPP를 모두 인코딩하는 유전자를 포함하는 이중 유전자도입 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 변종을 수득한다.
도입유전자 구조체
CTFAPP와 tau 유전자도입 파리를 모두 산출하는데 UAS/GAL4 시스템이 이용된다. 최장 인간 뇌 tau 동소체(isoform)을 인코딩하는 cDNA는 형질전환(transformation) 벡터, pUAS- 2N4R tauwt를 산출하기 위하여, 표준 결찰 기술(standard ligation technique)(Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989)을 이용하여 EcoRI 단편으로서 벡터 pUAST(Brand and Perrimon, Development 118:401-415 (1993)) 내로 클로닝된다. SEQ ID NO: 15(아미노산 서열)와 SEQ ID NO: 16(핵산 서열)으로 표시되는 tau 동소체는 tau 엑손(exon) 2와 3 및 4개의 미소관-결합 반복부위(microtubule-binding repeat)를 포함한다.
CTFAPP를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 pExP-UAS 형질전환 벡터가 산출된다. 상기 벡터는 인간 APP 신호 펩티드에 융합된 CTFAPP 및 myc tag를 인코딩한다(pExP-UAS-CTFAPP-I, SEQ ID NO: 17에 도시된 서열). pExP-UAS-CTFAPP-I를 산출하기 위하여, CTFAPP를 인코딩하는 DNA 서열은 myc tag를 인코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드(synthetic oligonucleotide)에 먼저 인 프레임 융합된다. 상기 DNA 단편은 이후, 인간 APP 신호 서열을 인코딩하는 PCR 증폭된 서열에 인 프레임 융합된다. 생성된 DNA 서열은 이후, pExP-UAS 벡터 내로 클로닝된다.
유전자도입 변종
tau 또는 CTFAPP를 발현하는 유전자도입 초파리(Drosophila) 품종을 산출하기 위하여, 앞서 기술된 pUAST 또는 pExP 구조체, pExP-UAS-CTFAPP-I 또는 pUAS- 2N4R tauwt는 Rubin and Spradling, Science 218:348-353, (1982)에 기술된 바와 같이, y 1 w 1118 또는 w 1118 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 유충 내로 주입된다.
pUAS- 2N4Rtau -wt의 경우에, 6가지 유전자도입 품종이 산출되고, 본 명세서에 기술된 바와 같이 시각적 검사(visual inspection)에 의해, GMR-GAL4 드라이버 변종과의 교잡 이후에 관찰된 눈 표현형의 강도(severity)에 기초하여 강함, 중간, 또는 약함으로 분류된다.
pExP-UAS-CTFAPP-I의 경우에, 유전자도입 품종이 산출되고, GMR-GAL4 드라이버 변종과의 교잡 이후에 관찰된 눈 표현형의 강도(severity)에 기초하여 강함, 중간, 또는 약함으로 분류된다. GMR-GAL4 드라이버와 pExP-UAS-CTFAPP-I 또는 pUAS- 2N4R tauwt를 보유하는 중간 눈 표현형의 유전자도입 초파리(Drosophila) 변종은 tau와 CTFAPP 펩티드를 모두 발현하는 이중 유전자도입 초파리(Drosophila) 품종을 산출하기 위하여 교잡된다. 중간 눈 표현형의 단일 유전자도입 파리의 교잡은 강함으로 분류되는 상조적인 눈 표현형을 결과한다.
형질전환 구조체 pExP-UAS-CTFAPP-I와 pUAS- 2N4R tauwt의 경우에, 유전자도입 품종은 Rubin and Spradling, Science 218:348-353, (1982)에 기술된 바와 같이, 상기 구조체를 y 1 w 1118 또는 w 1118 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 유충 내로 주입함으로써 산출되고, 눈 색깔을 모니터함으로써 게놈 DNA 내로 도입유전자의 삽입이 조사된다. pExP와 pUAST 벡터는 상기 white 유전자 마커의 일부를 포함한다. CTFAPP 도입유전자를 보유하는 유전자도입 초파리(Drosophila)는 이후, 중추신경계에서 도입유전자의 발현을 위하여 elav-GAL4 드라이버 변종과 교잡된다. 이들 교잡에서 측정가능 표현형이 나타나지 않는다면, 상기 도입유전자는 CTFAPP 도입유전자를 보유하는 유전자도입 초파리(Drosophila)를 트랜스포사제(transposase)의 공급원을 보유하는 초파리(Drosophila)와 교잡함으로써 사본수(copy number)의 확대를 위하여 동원된다. 전위가능 요소(transposable element)의 재동원(remobilization)은 더욱 강한 표현형을 나타내는 더욱 강한 삽입을 제공할 수 있다. 대체 삽입 부위(alternate insertion site)를 보유하는 다른 유전자도입 품종과의 재조합(recombination)에 의한 도입유전자의 증가된 사본수(copy number) 역시 더욱 강한 표현형을 제공할 수 있다. 새로운/복수 삽입으로 이러한 교잡으로부터 후손은 눈 색깔에서 변화에 기초하여 선택된다. CTFAPP 도입유전자의 더욱 높은 사본수 또는 더욱 강한 삽입을 보유하는 파리는 이후, elav-GAL4 드라이버 변종과 교잡되고, 후손의 보행 능력이 기어오름 분석(climbing assay)에서 검사된다. 유전자도입 품종은 보행 표현형을 나타낼 수 있는데, 이들 파리는 그들 자체와 elav-GAL4 드라이 버 대조 파리와 비교하여 강함, 중간, 약함, 또는 매우 약함으로 분류된다.
CTFAPP와 tauwt 도입유전자를 보유하는 이중 유전자도입 초파리(Drosophila)는 이후, tauwt 유전자도입 초파리(Drosophila)와 CTFAPP 유전자도입 초파리(Drosophila)의 교잡 또는 재조합에 의해 산출된다. 보행 능력이 평가되고, elav-GAL4 드라이버 대조 파리와 비교하여 강함, 중간, 약함, 또는 매우 약함으로 분류된다.
연령의 함수(function of age)로서 기어오름 수행(climbing performance)은 대략 25℃에서 다양한 유전형(genotype)의 파리 개체군에서 결정된다. 기어오름 분석은 동일 연령의 대략 10마리 개체의 군에서 수행된다.
초파리(Drosophila) 뇌는 이후, 냉동절단(cyrosectioning)되고, elav-GAL4; pUAS- 2N4R tauwtlpExP-UAS-CTFAPP 파리의 수평 횡단면(horizontal cross section)은 항-tau 형태 의존성 항체(conformation dependent antibody) ALZ50과 MCI로 면역침전된다. 뉴런의 양성 염색(양성 staining)은 MCI 항체와 ALZ50 항체 모두로 관찰될 수 있다. 이런 결과는 elav-GAL4; pUAS- 2N4R tauwtlpExP-UAS-CTFAPP 이중 유전자도입 초파리(Drosophila)의 뇌에서 발현되는 tau 단백질이 알츠하이머병과 연관된 단백질 형태를 나타낸다는 것을 증명한다.
또한, 아밀로이드의 존재를 평가하기 위하여 본 명세서에서 기술된 유전자도입 파리의 세포와 신경돌기(neurite)에서 티오플라빈(thioflavin)-S 염색이 수행된다. 티오플라빈-S로 염색되면, 아밀로이드는 형광 현미경(fluorescence microscope) 하에서 형광을 발한다. 티오플라빈-S 염색 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 파리는 대략 25℃에서 현색된다. 티오플라빈-S 양성 세포는 tau만을 발현하는 파리에서 관찰되지 않는다.
티오플라빈-S 양성 세포는 CTFAPP만을 발현하는 파리에서 관찰된다. 하지만, 티오플라빈-S-양성 세포의 수는 tau와 CTFAPP를 모두 발현하는 파리에서 더욱 커질 것으로 예상된다.
실시예 3: 신경변성에 대한 CTFAPP와 tau의 효과
기어오름 표현형은 야생형 초파리(Drosophila) 및 CTFAPP 또는 tau 도입유전자, 또는 양쪽 도입유전자를 보유하는 초파리(Drosophila)에서 평가되었다. 도입유전자는 elav-GAL4 드라이버의 통제를 받았는데, 이는 중추신경계 내에서 도입유전자의 선택적인 발현을 결과한다. 파리는 25℃에서 사육되었다. 기어오름 표현형은 앞서 기술된 "크로스하이(crosshigh)" 계량을 이용하여 평가되었다. 데이터는 도 2에 도시된다. 상기 데이터는 연령-의존성 신경변성이 CTFAPP의 발현에 의해 가속화되고, CTFAPP와 tau 모두의 발현에 의해 더욱 가속화된다는 것을 암시한다.
실시예 4: 치료제의 스크리닝(screening)
알츠하이머병에 효과적인 치료제를 선별하기 위하여, 후보 약제는 GMR-GAL4 드라이버 및 pUAS- 2N4R tauwt와 조합으로 도입유전자 pExP-UAS-CTFAPP-I를 보유하는 복수의 elav-GAL4; pUAS- 2N4R tauwtlpExP-UAS-CTFAPP-I 유전자도입 파리 애벌레(larvae)에 도입된다. 후보 약제는 세 번째 영(instar) 유전자도입 노랑초파 리(Drosophila melanogaster) 애벌레(3일 내지 5일령 애벌레) 내로 미세주입된다. 애벌레는 피하 주사(hypodermic needle)를 이용하여 한정된 양의 각 화합물이 표피(cuticle)를 통하여 혈액림프(hemolymph) 내로 주입된다. 주입 이후에, 이들 애벌레는 발달의 완결을 위하여 바이알 내에 놓여진다. 부화(eclosion) 이후, 성체 파리는 CO2로 마취되고, 해부 현미경(dissecting microscope)을 이용한 시각적 검사에 의해, 후보 약제가 투여되지 않은 대조 파리와 비교하여 초파리(Drosophila) 눈 표현형의 전환(reversion)이 평가된다. 대조 GMR-GAL4 드라이버 변종에 의해 전시되는 표현형을 지향하는, elav-GAL4; pUAS- 2N4R tauwtlpExP-UAS-CTFAPP-I 유전자도입 파리 눈 표현형의 관찰된 전환은 AD의 치료에 유용한 약제를 지시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Cummings, Christopher J. <120> TRANSGENIC FLIES EXPRESSING TAU AND AMYLOID PRECURSOR FRAGMENT <130> 209000/2301B <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 297 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gacgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 60 gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 120 atagcgacag tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaacagta cacatccatt 180 catcatggtg tggtggaggt tgacgccgct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag 240 atgcagcaga acggctacga aaatccaacc tacaagttct ttgagcagat gcagaac 297 <210> 2 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 35 40 45 Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80 Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95 Met Gln Asn <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggacgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc 60 tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt 120 gtcatagcga cagtgatcgt catcaccttg gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc 180 attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc 240 aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac 300 <210> 4 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 15 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile 20 25 30 Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile 35 40 45 Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly 50 55 60 Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser 65 70 75 80 Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu 85 90 95 Gln Met Gln Asn 100 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 6 Met Asp Ile Ser Tyr Ile Phe Val Ile Cys Leu Met Ala Leu Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 7 Met Pro Thr Thr Leu Met Leu Leu Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ala Val Ala Val Gly 20 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 8 Met Cys Ala Ala Leu Arg Arg Asn Leu Leu Leu Arg Ser Leu Trp Val 1 5 10 15 Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Gln Val Gln Ala 20 25 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 9 Met Ala Ala Val Asn Leu Gln Ala Ser Cys Ser Ser Gly Leu Ala Ser 1 5 10 15 Glu Asp Asp Ala 20 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 10 Met Met His Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Ile His Ser Ile 1 5 10 15 Pro Thr Thr Trp Ala Val Thr 20 <210> 11 <211> 3747 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cctcccctgg ggaggctcgc gttcccgctg ctcgcgcctg ccgcccgccg gcctcaggaa 60 cgcgccctct cgccgcgcgc gccctcgcag tcaccgccac ccaccagctc cggcaccaac 120 agcagcgccg ctgccaccgc ccaccttctg ccgccgccac cacagccacc ttctcctcct 180 ccgctgtcct ctcccgtcct cgcctctgtc gactatcagg tgaactttga accaggatgg 240 ctgagccccg ccaggagttc gaagtgatgg aagatcacgc tgggacgtac gggttggggg 300 acaggaaaga tcaggggggc tacaccatgc accaagacca agagggtgac acggacgctg 360 gcctgaaaga atctcccctg cagaccccca ctgaggacgg atctgaggaa ccgggctctg 420 aaacctctga tgctaagagc actccaacag cggaagatgt gacagcaccc ttagtggatg 480 agggagctcc cggcaagcag gctgccgcgc agccccacac ggagatccca gaaggaacca 540 cagctgaaga agcaggcatt ggagacaccc ccagcctgga agacgaagct gctggtcacg 600 tgacccaaga gcctgaaagt ggtaaggtgg tccaggaagg cttcctccga gagccaggcc 660 ccccaggtct gagccaccag ctcatgtccg gcatgcctgg ggctcccctc ctgcctgagg 720 gccccagaga ggccacacgc caaccttcgg ggacaggacc tgaggacaca gagggcggcc 780 gccacgcccc tgagctgctc aagcaccagc ttctaggaga cctgcaccag gaggggccgc 840 cgctgaaggg ggcagggggc aaagagaggc cggggagcaa ggaggaggtg gatgaagacc 900 gcgacgtcga tgagtcctcc ccccaagact cccctccctc caaggcctcc ccagcccaag 960 atgggcggcc tccccagaca gccgccagag aagccaccag catcccaggc ttcccagcgg 1020 agggtgccat ccccctccct gtggatttcc tctccaaagt ttccacagag atcccagcct 1080 cagagcccga cgggcccagt gtagggcggg ccaaagggca ggatgccccc ctggagttca 1140 cgtttcacgt ggaaatcaca cccaacgtgc agaaggagca ggcgcactcg gaggagcatt 1200 tgggaagggc tgcatttcca ggggcccctg gagaggggcc agaggcccgg ggcccctctt 1260 tgggagagga cacaaaagag gctgaccttc cagagccctc tgaaaagcag cctgctgctg 1320 ctccgcgggg gaagcccgtc agccgggtcc ctcaactcaa agctcgcatg gtcagtaaaa 1380 gcaaagacgg gactggaagc gatgacaaaa aagccaagac atccacacgt tcctctgcta 1440 aaaccttgaa aaataggcct tgccttagcc ccaaactccc cactcctggt agctcagacc 1500 ctctgatcca accctccagc cctgctgtgt gcccagagcc accttcctct cctaaacacg 1560 tctcttctgt cacttcccga actggcagtt ctggagcaaa ggagatgaaa ctcaaggggg 1620 ctgatggtaa aacgaagatc gccacaccgc ggggagcagc ccctccaggc cagaagggcc 1680 aggccaacgc caccaggatt ccagcaaaaa ccccgcccgc tccaaagaca ccacccagct 1740 ctggtgaacc tccaaaatca ggggatcgca gcggctacag cagccccggc tccccaggca 1800 ctcccggcag ccgctcccgc accccgtccc ttccaacccc acccacccgg gagcccaaga 1860 aggtggcagt ggtccgtact ccacccaagt cgccgtcttc cgccaagagc cgcctgcaga 1920 cagcccccgt gcccatgcca gacctgaaga atgtcaagtc caagatcggc tccactgaga 1980 acctgaagca ccagccggga ggcgggaagg tgcagataat taataagaag ctggatctta 2040 gcaacgtcca gtccaagtgt ggctcaaagg ataatatcaa acacgtcccg ggaggcggca 2100 gtgtgcaaat agtctacaaa ccagttgacc tgagcaaggt gacctccaag tgtggctcat 2160 taggcaacat ccatcataaa ccaggaggtg gccaggtgga agtaaaatct gagaagcttg 2220 acttcaagga cagagtccag tcgaagattg ggtccctgga caatatcacc cacgtccctg 2280 gcggaggaaa taaaaagatt gaaacccaca agctgacctt ccgcgagaac gccaaagcca 2340 agacagacca cggggcggag atcgtgtaca agtcgccagt ggtgtctggg gacacgtctc 2400 cacggcatct cagcaatgtc tcctccaccg gcagcatcga catggtagac tcgccccagc 2460 tcgccacgct agctgacgag gtgtctgcct ccctggccaa gcagggtttg tgatcaggcc 2520 cctggggcgg tcaataattg tggagaggag agaatgagag agtgtggaaa aaaaaagaat 2580 aatgacccgg cccccgccct ctgcccccag ctgctcctcg cagttcggtt aattggttaa 2640 tcacttaacc tgcttttgtc actcggcttt ggctcgggac ttcaaaatca gtgatgggag 2700 taagagcaaa tttcatcttt ccaaattgat gggtgggcta gtaataaaat atttaaaaaa 2760 aaacattcaa aaacatggcc acatccaaca tttcctcagg caattccttt tgattctttt 2820 ttcttccccc tccatgtaga agagggagaa ggagaggctc tgaaagctgc ttctggggga 2880 tttcaaggga ctgggggtgc caaccacctc tggccctgtt gtgggggttg tcacagaggc 2940 agtggcagca acaaaggatt tgaaaacttt ggtgtgttcg tggagccaca ggcagacgat 3000 gtcaaccttg tgtgagtgtg acgggggttg gggtggggcg ggaggccacg ggggaggccg 3060 aggcaggggc tgggcagagg ggaggaggaa gcacaagaag tgggagtggg agaggaagcc 3120 acgtgctgga gagtagacat ccccctcctt gccgctggga gagccaaggc ctatgccacc 3180 tgcagcgtct gagcggccgc ctgtccttgg tggccggggg tgggggcctg ctgtgggtca 3240 gtgtgccacc ctctgcaggg cagcctgtgg gagaagggac agcgggttaa aaagagaagg 3300 caagcctggc aggagggttg gcacttcgat gatgacctcc ttagaaagac tgaccttgat 3360 gtcttgagag cgctggcctc ttcctccctc cctgcagggt agggcgcctg agcctaggcg 3420 gttccctctg ctccacagaa accctgtttt attgagttct gaaggttgga actgctgcca 3480 tgattttggc cactttgcag acctgggact ttagggctaa ccagttctct ttgtaaggac 3540 ttgtgcctct tgggagacgt ccacccgttt ccaagcctgg gccactggca tctctggagt 3600 gtgtgggggt ctgggaggca ggtcccgagc cccctgtcct tcccacggcc actgcagtca 3660 ccccgtctgc gccgctgtgc tgttgtctgc cgtgagagcc caatcactgc ctatacccct 3720 catcacacgt cacaatgtcc cgaattc 3747 <210> 12 <211> 2796 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cctcccctgg ggaggctcgc gttcccgctg ctcgcgcctg ccgcccgccg gcctcaggaa 60 cgcgccctct cgccgcgcgc gccctcgcag tcaccgccac ccaccagctc cggcaccaac 120 agcagcgccg ctgccaccgc ccaccttctg ccgccgccac cacagccacc ttctcctcct 180 ccgctgtcct ctcccgtcct cgcctctgtc gactatcagg tgaactttga accaggatgg 240 ctgagccccg ccaggagttc gaagtgatgg aagatcacgc tgggacgtac gggttggggg 300 acaggaaaga tcaggggggc tacaccatgc accaagacca agagggtgac acggacgctg 360 gcctgaaaga atctcccctg cagaccccca ctgaggacgg atctgaggaa ccgggctctg 420 aaacctctga tgctaagagc actccaacag cggaagatgt gacagcaccc ttagtggatg 480 agggagctcc cggcaagcag gctgccgcgc agccccacac ggagatccca gaaggaacca 540 cagctgaaga agcaggcatt ggagacaccc ccagcctgga agacgaagct gctggtcacg 600 tgacccaagc tcgcatggtc agtaaaagca aagacgggac tggaagcgat gacaaaaaag 660 ccaagggggc tgatggtaaa acgaagatcg ccacaccgcg gggagcagcc cctccaggcc 720 agaagggcca ggccaacgcc accaggattc cagcaaaaac cccgcccgct ccaaagacac 780 cacccagctc tggtgaacct ccaaaatcag gggatcgcag cggctacagc agccccggct 840 ccccaggcac tcccggcagc cgctcccgca ccccgtccct tccaacccca cccacccggg 900 agcccaagaa ggtggcagtg gtccgtactc cacccaagtc gccgtcttcc gccaagagcc 960 gcctgcagac agcccccgtg cccatgccag acctgaagaa tgtcaagtcc aagatcggct 1020 ccactgagaa cctgaagcac cagccgggag gcgggaaggt gcagataatt aataagaagc 1080 tggatcttag caacgtccag tccaagtgtg gctcaaagga taatatcaaa cacgtcccgg 1140 gaggcggcag tgtgcaaata gtctacaaac cagttgacct gagcaaggtg acctccaagt 1200 gtggctcatt aggcaacatc catcataaac caggaggtgg ccaggtggaa gtaaaatctg 1260 agaagcttga cttcaaggac agagtccagt cgaagattgg gtccctggac aatatcaccc 1320 acgtccctgg cggaggaaat aaaaagattg aaacccacaa gctgaccttc cgcgagaacg 1380 ccaaagccaa gacagaccac ggggcggaga tcgtgtacaa gtcgccagtg gtgtctgggg 1440 acacgtctcc acggcatctc agcaatgtct cctccaccgg cagcatcgac atggtagact 1500 cgccccagct cgccacgcta gctgacgagg tgtctgcctc cctggccaag cagggtttgt 1560 gatcaggccc ctggggcggt caataattgt ggagaggaga gaatgagaga gtgtggaaaa 1620 aaaaagaata atgacccggc ccccgccctc tgcccccagc tgctcctcgc agttcggtta 1680 attggttaat cacttaacct gcttttgtca ctcggctttg gctcgggact tcaaaatcag 1740 tgatgggagt aagagcaaat ttcatctttc caaattgatg ggtgggctag taataaaata 1800 tttaaaaaaa aacattcaaa aacatggcca catccaacat ttcctcaggc aattcctttt 1860 gattcttttt tcttccccct ccatgtagaa gagggagaag gagaggctct gaaagctgct 1920 tctgggggat ttcaagggac tgggggtgcc aaccacctct ggccctgttg tgggggttgt 1980 cacagaggca gtggcagcaa caaaggattt gaaaactttg gtgtgttcgt ggagccacag 2040 gcagacgatg tcaaccttgt gtgagtgtga cgggggttgg ggtggggcgg gaggccacgg 2100 gggaggccga ggcaggggct gggcagaggg gaggaggaag cacaagaagt gggagtggga 2160 gaggaagcca cgtgctggag agtagacatc cccctccttg ccgctgggag agccaaggcc 2220 tatgccacct gcagcgtctg agcggccgcc tgtccttggt ggccgggggt gggggcctgc 2280 tgtgggtcag tgtgccaccc tctgcagggc agcctgtggg agaagggaca gcgggttaaa 2340 aagagaaggc aagcctggca ggagggttgg cacttcgatg atgacctcct tagaaagact 2400 gaccttgatg tcttgagagc gctggcctct tcctccctcc ctgcagggta gggcgcctga 2460 gcctaggcgg ttccctctgc tccacagaaa ccctgtttta ttgagttctg aaggttggaa 2520 ctgctgccat gattttggcc actttgcaga cctgggactt tagggctaac cagttctctt 2580 tgtaaggact tgtgcctctt gggagacgtc cacccgtttc caagcctggg ccactggcat 2640 ctctggagtg tgtgggggtc tgggaggcag gtcccgagcc ccctgtcctt cccacggcca 2700 ctgcagtcac cccgtctgcg ccgctgtgct gttgtctgcc gtgagagccc aatcactgcc 2760 tatacccctc atcacacgtc acaatgtccc gaattc 2796 <210> 13 <211> 2622 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cctcccctgg ggaggctcgc gttcccgctg ctcgcgcctg ccgcccgccg gcctcaggaa 60 cgcgccctct cgccgcgcgc gccctcgcag tcaccgccac ccaccagctc cggcaccaac 120 agcagcgccg ctgccaccgc ccaccttctg ccgccgccac cacagccacc ttctcctcct 180 ccgctgtcct ctcccgtcct cgcctctgtc gactatcagg tgaactttga accaggatgg 240 ctgagccccg ccaggagttc gaagtgatgg aagatcacgc tgggacgtac gggttggggg 300 acaggaaaga tcaggggggc tacaccatgc accaagacca agagggtgac acggacgctg 360 gcctgaaagc tgaagaagca ggcattggag acacccccag cctggaagac gaagctgctg 420 gtcacgtgac ccaagctcgc atggtcagta aaagcaaaga cgggactgga agcgatgaca 480 aaaaagccaa gggggctgat ggtaaaacga agatcgccac accgcgggga gcagcccctc 540 caggccagaa gggccaggcc aacgccacca ggattccagc aaaaaccccg cccgctccaa 600 agacaccacc cagctctggt gaacctccaa aatcagggga tcgcagcggc tacagcagcc 660 ccggctcccc aggcactccc ggcagccgct cccgcacccc gtcccttcca accccaccca 720 cccgggagcc caagaaggtg gcagtggtcc gtactccacc caagtcgccg tcttccgcca 780 agagccgcct gcagacagcc cccgtgccca tgccagacct gaagaatgtc aagtccaaga 840 tcggctccac tgagaacctg aagcaccagc cgggaggcgg gaaggtgcag ataattaata 900 agaagctgga tcttagcaac 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cctggccgtt agggagccga taaagaggtc atcctgctgg acataggcgc 6000 acctggcctg catctccttg gcgtccacag gttggccatt gagcagtcgc atcccggatg 6060 gcgatacttg gatgccctgc ggcgatcgaa aggcaagggc attcagcagg gtcgtctttc 6120 cggcaccgga actgcccatc acggccaaaa gttcgcccgg ataggccacg ccgcaaactg 6180 agtttcaaat tggtaattgg accctttatt aagatttcac acagatcagc cgactgcgaa 6240 tagaaactca ccgttcttga gcaaatgttt cctgggcgcc ggtatgtgtc gctcgttgca 6300 gaatagtccg cgtgtccggt tgaccagctg ccgccatccg gagcccggct gattgaccgc 6360 cccaaagatg tccatattgt gccaggcata ggtgaggttc tcggctagtt ggccgctccc 6420 tgaaccggag tcctccggcg gactgggtgg caggagcgtg ccgtagtttt tggcctgccc 6480 gaagccctgg ttaatgcagc tctgcgaagc gtccgctgtc accctgcaat gataggggat 6540 ctcaaatatc aactacaagc gttatgctca tctaaccccg aacaaaacga agtatcctac 6600 gaagtaggtt tatactttta tttatttttt gtgcatagct taaaatatct ggttgttata 6660 ttttttgtaa aaaagaatgt agtcgaaaat gaatgccttt agatgtcttg atcatgatat 6720 gatcttaaaa attgtcttat atagcgagca cagctaccag aataatctgt ttcgtgtcac 6780 tatttgtttg 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agcgccggag tataaataga ggcgcttcgt ctacggagcg acaattcaat 7680 tcaaacaagc aaagtgaaca cgtcgctaag cgaaagctaa gcaaataaac aagcgcagct 7740 gaacaagcta aacaatctgc agtaaagtgc aagttaaagt gaatcaatta aaagtaacca 7800 gcaaccaagt aaatcaactg caactactga aatctgccaa gaagtaatta ttgaatacaa 7860 gaagagaact ctgaataggg aattgggaat tctaggcgcg ccaatcaaca tgctgcccgg 7920 tctggccctg ctgctgctgg ccgcctggac cgctcgtgcc gatgcagaat tccgacatga 7980 ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa 8040 caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcgacag tgatcgtcat 8100 caccttggtg atgctgaaga agaaacagta cacatccatt catcatggtg tggtggaggt 8160 tgacgccgct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag atgcagcaga acggctacga 8220 aaatccaacc tacaagttct ttgagcagat gcagaacgag cagaagctga tctccgagga 8280 ggacctgtaa ccgcggtcta gaaggactaa gcgtcgcgcc acttcaacgc tcgatgggag 8340 cgtcattggt gggcggggta accgtcgaaa tcagtgttta cgcttccaat cgcaacaaaa 8400 aattcactgc aacactgaaa agcatacgaa aacgatgaag attgtacgag aaaccataaa 8460 gtattttatc cacaaagaca cgtatagcag aaaagccaag ttaactcggc gataagttgt 8520 gtacacaaga ataaaatcgg ccagattcag tgttgtcaga aataagaaaa ccccactatg 8580 tttttctttg ccttttcttt ctcccagcga tcattcattt cgtggtgaaa gaacggggtc 8640 attgcacgga gtttcgactg cgggaaagca gagctgccgt tcacttcgtc tataattagc 8700 gctttctatt ttccccgatt cgggccgctg ctgcgctttt ccgcctgctg tttgtggcaa 8760 gtgtagcagc aggctgtgca cgcaggtggc atgcacttgg ctttccaccg ttggtatcga 8820 ttctctggga cgatgagtca ttcctttcgg ggccacagca taatcgttgc cagctcaccg 8880 aaatggtgac ttcatttctt aactgccgtc aagcatgcga ttgtacatac atacatattt 8940 atatatgtac atatttatgt gactatggta ggtcgatata atagcaatca acgcaagcaa 9000 atgtgtcagt cctgcttaca ggaacgattc tatttagtaa ttttcgttgt ataaagtaat 9060 tatgtatgta tgtaagcccc ataaatctga aacaattagg caaaaccatg cgaagctcgc 9120 actagtgcct gcagccaagc tttgcgtact cgcaaattat taaaaataaa actttaaaaa 9180 taatttcgtc taattaatat tatgagttaa ttcaaacccc acggacatgc taagggttaa 9240 tcaacaatca tatcgctgtc tcactcagac tcaatacgac actcagaata ctattccttt 9300 cactcgcact 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aaagggcctc 720 gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 780 ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 840 aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 900 aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 960 cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 1020 ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 1080 cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 1140 ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 1200 gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 1260 gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 1320 acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 1380 cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 1440 acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 1500 ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 1560 ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 1620 gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 1680 atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 1740 ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 1800 attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 1860 ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 1920 aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 1980 aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 2040 ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 2100 tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 2160 ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 2220 cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 2280 agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 2340 gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 2400 ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 2460 tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 2520 tggaaaaacg ccttcttctt gaactcgggc tcggtgccag tatacctcaa atggttgtcg 2580 tacctctcat ggttccgtta cgccaacgag ggtctgctga ttaaccaatg ggcggacgtg 2640 gagccgggcg aaattagctg cacatcgtcg aacaccacgt gccccagttc gggcaaggtc 2700 atcctggaga cgcttaactt ctccgccgcc gatctgccgc tggactacgt gggtctggcc 2760 catgatgaaa taacataagg tggtcccgtc gaaagccgaa gcttaccgaa gtatacactt 2820 aaattcagtg cacgtttgct tgttgagagg aaaggttgtg tgcggacgaa tttttttttg 2880 aaaacattaa cccttacgtg gaataaaaaa aaatgaaata ttgcaaattt tgctgcaaag 2940 ctgtgactgg agtaaaatta attcacgtgc cgaagtgtgc tattaagaga aaattgtggg 3000 agcagagcct tgggtgcagc cttggtgaaa actcccaaat ttgtgatacc cactttaatg 3060 attcgcagtg gaaggctgca cctgcaaaag gtcagacatt taaaaggagg cgactcaacg 3120 cagatgccgt acctagtaaa gtgatagagc ctgaaccaga aaagataaaa gaaggctata 3180 ccagtgggag tacacaaaca gagtaagttt gaatagtaaa aaaaatcatt tatgtaaaca 3240 ataacgtgac tgtgcgttag gtcctgttca ttgtttaatg aaaataagag cttgagggaa 3300 aaaattcgta ctttggagta cgaaatgcgt cgtttagagc agcagccgaa ttaattctag 3360 ttccagtgaa atccaagcat tttctaaatt aaatgtattc ttattattat agttgttatt 3420 tttgatatat ataaacaaca ctattatgcc caccattttt ttgagatgca tctacacaag 3480 gaacaaacac tggatgtcac tttcagttca aattgtaacg ctaatcactc cgaacaggtc 3540 acaaaaaatt accttaaaaa gtcataatat taaattagaa taaatatagc tgtgagggaa 3600 atatatacaa atatattgga gcaaataaat tgtacataca aatatttatt actaatttct 3660 attgagacga aatgaaccac tcggaaccat ttgagcgaac cgaatcgcgc ggaactaacg 3720 acagtcgctc caaggtcgtc gaacaaaagg tgaatgtgtt gcggagagcg ggtgggagac 3780 agcgaaagag caactacgaa acgtggtgtg gtggaggtga attatgaaga gggcgcgcga 3840 tttgaaaagt atgtatataa aaaatatatc ccggtgtttt atgtagcgat aaacgagttt 3900 ttgatgtaag gtatgcaggt gtgtaagtct tttggttaga agacaaatcc aaagtctact 3960 tgtggggatg ttcgaagggg aaatacttgt attctatagg tcatatcttg tttttattgg 4020 cacaaatata attacattag ctttttgagg gggcaataaa cagtaaacac gatggtaata 4080 atggtaaaaa aaaaaaacaa gcagttattt cggatatatg tcggctactc cttgcgtcgg 4140 gcccgaagtc ttagagccag atatgcgagc acccggaagc tcacgatgag aatggccaga 4200 cccacgtagt ccagcggcag atcggcggcg gagaagttaa gcgtctccag gatgaccttg 4260 cccgaactgg ggcacgtggt gttcgacgat gtgcagctaa tttcgcccgg ctccacgtcc 4320 gcccattggt taatcagcag accctcgttg gcgtaacgga accatgagag gtacgacaac 4380 catttgaggt atactggcac cgagcccgag ttcaagaaga agccgccaaa gagcaggaat 4440 ggtatgataa ccggcggacc cacagacagc gccatcgagg tcgaggagct ggcgcaggat 4500 attagatatc cgaaggacgt tgacacattg gccaccagag tgaccagcgc caggcagttg 4560 aagaagtgca gcactccggc ccgcagtccg atcatcggat aggcaatcgc cgtgaagacc 4620 agtggcactg tgagaaaaag cggcaattcg gcaatcgttt tgcccagaaa gtatgtgtca 4680 cagcgataaa gtcgacttcg ggcctccctc ataaaaactg gcagctctga ggtgaacacc 4740 taaatcgaat cgattcatta gaaagttagt aaattattga aatgcaaatg tattctaaac 4800 atgacttaca tttatcgtgg caaagacgtt ttgaaaggtc atgttggtca ggaagaggaa 4860 gatggctccg ttgatattca tcacacccac ttgcgtgagt tgttggccca aaaagatgag 4920 gccaatcaag atggcaacca tctgcaaatt aaaatgttac tcgcatctca ttaatattcg 4980 cgagttaaat gaaatttatt tatcttctgc aaaactataa actatacatc tcattgaaaa 5040 aaactaagaa gggtgtggaa tcaggcaatt ctatctaaaa tctagcgaat ttgtttccaa 5100 gaattgtaag cgttatatca tttgtttcca ctggaaccac tcaccgttgt ctgaataagt 5160 cgcactttta cgaggagtgg ttccttgagc accgacagcc aggatcgcca caggaccgcc 5220 cggaactgca tgaaccaggt ggccttgtag gtgtacccat tctccggctg ctccagtggc 5280 ttctccagat ttttggtggc caacaactgc tccatatccc gggctacttt gctaatggca 5340 aaattgtcgc catatcttgg cgatccgatc acgggactcg atctcccgtc cgggcacaac 5400 ggccaacacc tgtacgtaaa agtccgccgg attgtagttg gtaggacact gggcacccac 5460 gctggatagg agttgagatg taatgtaatg ctagataccc ttaataaaca catcgaactc 5520 actaggaaaa gaagtcgacg gcttcgctgg gagtgcccaa gaaagctacc ctgccctcgg 5580 ccatcagaag gatcttgtca aagagctcaa acagctcgga agacggctga tgaatggtca 5640 ggatgacggt cttgcccttc tgcgacagct tcttcagcac ctggacgacg ctgtgggcgg 5700 taaatgagtc cagtccggag gtgggctcat cgcagatcag aagcggcgga tcggttagtg 5760 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ttaacttaca tacatactag aattaattcc tcgagtaggc cggccatggt accgaggatc 7500 caagcttgca tgcctgcagg tcggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc 7560 ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga 7620 gactctagcg agcgccggag tataaataga ggcgcttcgt ctacggagcg acaattcaat 7680 tcaaacaagc aaagtgaaca cgtcgctaag cgaaagctaa gcaaataaac aagcgcagct 7740 gaacaagcta aacaatctgc agtaaagtgc aagttaaagt gaatcaatta aaagtaacca 7800 gcaaccaagt aaatcaactg caactactga aatctgccaa gaagtaatta ttgaatacaa 7860 gaagagaact ctgaataggg aattgggaat tctaggcgcg ccaatcaaca tgttcaagtt 7920 cgtcatgatc ctggcagtgg tgggcgtggc cacggctgat gcagaattcc gacatgactc 7980 aggatatgaa gttcatcatc aaaaattggt gttctttgca gaagatgtgg gttcaaacaa 8040 aggtgcaatc attggactca tggtgggcgg tgttgtcata gcgacagtga tcgtcatcac 8100 cttggtgatg ctgaagaaga aacagtacac atccattcat catggtgtgg tggaggttga 8160 cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg cagcagaacg gctacgaaaa 8220 tccaacctac aagttctttg agcagatgca gaactgcggc cgcatctttt acccatacga 8280 tgttcctgac tatgcgggct atccctatga cgtcccggac tatgcaggat cctatccata 8340 tgacgttcca gattacgctg ctcagtgcgg ccgctaaccg cggtctagaa ggactaagcg 8400 tcgcgccact tcaacgctcg atgggagcgt cattggtggg cggggtaacc gtcgaaatca 8460 gtgtttacgc ttccaatcgc aacaaaaaat tcactgcaac actgaaaagc atacgaaaac 8520 gatgaagatt gtacgagaaa ccataaagta ttttatccac aaagacacgt atagcagaaa 8580 agccaagtta actcggcgat aagttgtgta cacaagaata aaatcggcca gattcagtgt 8640 tgtcagaaat aagaaaaccc cactatgttt ttctttgcct tttctttctc ccagcgatca 8700 ttcatttcgt ggtgaaagaa cggggtcatt gcacggagtt tcgactgcgg gaaagcagag 8760 ctgccgttca cttcgtctat aattagcgct ttctattttc cccgattcgg gccgctgctg 8820 cgcttttccg cctgctgttt gtggcaagtg tagcagcagg ctgtgcacgc aggtggcatg 8880 cacttggctt tccaccgttg gtatcgattc tctgggacga tgagtcattc ctttcggggc 8940 cacagcataa tcgttgccag ctcaccgaaa tggtgacttc atttcttaac tgccgtcaag 9000 catgcgattg tacatacata catatttata tatgtacata tttatgtgac tatggtaggt 9060 cgatataata gcaatcaacg caagcaaatg tgtcagtcct gcttacagga acgattctat 9120 ttagtaattt tcgttgtata aagtaattat gtatgtatgt aagccccata aatctgaaac 9180 aattaggcaa aaccatgcga agctcgcact agtgcctgca gccaagcttt gcgtactcgc 9240 aaattattaa aaataaaact ttaaaaataa tttcgtctaa ttaatattat gagttaattc 9300 aaaccccacg gacatgctaa gggttaatca acaatcatat cgctgtctca ctcagactca 9360 atacgacact cagaatacta ttcctttcac tcgcacttat tgcaagcata cgttaagtgg 9420 atgtctcttg ccgacgggac caccttatgt tatttcatca tg 9462

Claims (33)

  1. 게놈에서 SEQ ID NO:1에 열거된 첫 번째 DNA 서열, SEQ ID NO:16에 열거된 두 번째 DNA 서열 및 Gal4를 인코딩하는 세 번째 DNA 서열을 포함하는 유전자도입(transgenic) 초파리(Drosophila)에 있어서, 첫 번째 DNA 서열은 SEQ ID NO:5에 열거된 DNA 서열에 융합되고, 세 번째 DNA 서열은 elav 프로모터(promoter)에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 초파리(Drosophila).
  2. 게놈에서 인간 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein)의 카르복시 말단 단편을 인코딩하는 첫 번째 DNA 서열 및 tau 단백질을 인코딩하는 두 번째 DNA 서열을 포함하는 유전자도입 파리에 있어서, 첫 번째와 두 번째 DNA 서열 각각은 발현 조절 서열(expression control sequence)에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  3. 청구항 2에 있어서, 두 번째 DNA 서열은 인간 tau 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  4. 청구항 2에 있어서, 초파리(Drosophila)인 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  5. 청구항 2에 있어서, 첫 번째 또는 두 번째 DNA 서열에 연결된 발현 조절 서열은 조직 특이적인 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  6. 청구항 5에 있어서, 첫 번째 또는 두 번째 DNA 서열에 연결된 발현 조절 서열은 UAS 조절 요소를 포함하고, 유전자도입 파리는 Gal4를 인코딩하는 세 번째 DNA 서열을 더욱 포함하고, 세 번째 DNA 서열은 조직-특이적 프로모터(promoter) 또는 인핸서(enhancer)에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  7. 청구항 6에 있어서, 프로모터 또는 인핸서는 범-신경(pan-neural) 발현에 특이적인 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  8. 청구항 6에 있어서, 프로모터 또는 인핸서는 눈 또는 중추신경계에서 발현에 특이적인 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  9. 청구항 6에 있어서, 프로모터 또는 인핸서는 elav, sea, Nrv2, Dmef2, Cha, TH, P, CaMKII, GMR, OK107, C164, wingless, vestigial, sevenless, eyeless, 또는 gem에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  10. 청구항 2에 있어서, 첫 번째 DNA 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열 에 융합되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  11. 청구항 10에 있어서, 신호 펩티드는 인간 APP, APPL, wg, aos, presenilin, windbeutel, 또는 Vine에서 선택되는 단백질로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  12. 청구항 2에 있어서, 유충(embryonic), 애벌레(larval), 번데기(pupal), 또는 성체(adult) 단계에 있는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  13. 청구항 2에 있어서, 변형된 표현형을 보유하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  14. 청구항 13에 있어서, 변형된 표현형은 보행 기능장애(locomotor dysfunction), 행동적 표현형(behavioural phenotype), 형태적 표현형(morphological phenotype), 또는 생화학적 표현형(biochemical phenotype)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  15. 청구항 2에 있어서, 인간 아밀로이드 전구체 단백질의 카르복시 말단 단편은 세포내 도메인, 막통과 도메인 및 인간 아밀로이드 전구체 단백질의 세포외 도메인의 일부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  16. 청구항 2의 유전자도입 파리로부터 만들어진 일차 세포 배양액.
  17. 게놈에서 인간 아밀로이드 전구체 단백질의 돌연변이체 카르복시 말단 단편을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 유전자도입 파리에 있어서, DNA 서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 인간 아밀로이드 전구체 단백질의 돌연변이체 카르복시 말단 단편은 London 돌연변이체가 아닌 것을 특징으로 하는 유전자도입 파리.
  18. 청구항 17의 유전자도입 파리로부터 만들어진 일차 세포 배양액.
  19. 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 후보 약제를 청구항 2의 유전자도입 파리와 접촉시키는 단계;
    (b) 유전자도입 파리의 선택된 표현형을 관찰하는 단계;
    여기서, 후보 약제와 접촉한 유전자도입 파리와 후보 약제와 접촉하지 않은 대조 유전자도입 파리 사이에서 관찰된 표현형에서 차이는 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 지시한다.
  20. 청구항 19에 있어서, 유전자도입 파리는 초파리(Drosophila)인 것을 특징으 로 하는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 유전자도입 파리는 유충, 애벌레, 번데기, 또는 성체 단계에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 발현 조절 서열은 조직 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 발현 조절 서열은 UAS 조절 요소를 포함하고, 유전자도입 파리는 Gal4를 인코딩하는 세 번째 DNA 서열을 더욱 포함하고, 세 번째 DNA 서열은 조직-특이적 프로모터(promoter) 또는 인핸서(enhancer)에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 프로모터 또는 인핸서는 범-신경(pan-neural) 발현에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 프로모터 또는 인핸서는 눈 또는 중추신경계에서 발현에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 23에 있어서, 프로모터 또는 인핸서는 elav, sea, Nrv2, Dmef2, Cha, TH, P, CaMKII, GMR, OK107, C164, wingless, vestigial, sevenless, eyeless, 또는 gem에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 23에 있어서, 유전자도입 파리의 첫 번째 DNA 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 융합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 23에 있어서, 표현형은 보행 기능장애(locomotor dysfunction), 행동적 표현형(behavioural phenotype), 형태적 표현형(morphological phenotype), 또는 생화학적 표현형(biochemical phenotype)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 후보 약제를 청구항 1의 유전자도입 파리 및 대조 야생형 파리와 접촉시키는 단계;
    (b) 유전자도입 파리와 대조 파리에서 선택된 표현형을 관찰하는 단계;
    여기서, 유전자도입 파리와 대조 파리 사이에서 관찰된 표현형에서 차이는 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 지시한다.
  30. 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 후보 약제를 청구항 16의 일차 세포 배양액으로부터 유전자도입 세포 및 야생형 파리로부터 만들어진 배양액으로부터 대조 세포와 접촉시키는 단계;
    (b) 유전자도입 세포와 대조 세포에서 선택된 표현형을 관찰하는 단계;
    여기서, 유전자도입 세포와 대조 세포 사이에서 관찰된 표현형에서 차이는 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 지시한다.
  31. 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 후보 약제를 청구항 16의 일차 세포 배양액으로부터 유전자도입 세포와 접촉시키는 단계;
    (b) 유전자도입 세포에서 선택된 표현형을 관찰하는 단계;
    여기서, 후보 약제와 접촉한 유전자도입 세포와 후보 약제와 접촉하지 않은 유전자도입 세포 사이에서 관찰된 표현형에서 차이는 신경변성 질환에서 활성을 나타내는 약제를 지시한다.
  32. 청구항 30 또는 31에 있어서, 표현형은 세포 형태, 세포의 집합 상태, 세포내 미세신경원섬유(microfibrillary tangle)의 존재 또는 출현, 세포외 반점(extracellular plaque)의 존재 또는 출현, 아밀로이드 폴리펩티드의 용해도, tau의 인산화 상태(phosphorylation state), 또는 산화성 스트레스(oxidative stress)에 대한 감수성에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 알츠하이머병에 영향을 줄 수 있는 유전자를 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 청구항 2의 유전자도입 파리 또는 청구항 24의 유전자도입 파리를 게놈에서 선택된 유전자에 돌연변이를 포함하는 파리와 교잡하는 단계;
    (b) 청구항 2의 파리의 도입유전자(transgene) 또는 청구항 17의 파리의 도입유전자 및 선택된 유전자를 보유하는 후손에서, 청구항 2의 파리의 도입유전자 또는 청구항 16의 파리의 도입유전자와 연관된 표현형의 변경을 관찰하는 단계;
    여기서, 표현형의 변경은 선택된 유전자가 알츠하이머병에 영향을 줄 수 있음을 지시한다.
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