KR20080082883A - 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 (ｂｂｓ) 균주 및 그의제조 방법, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 그를 이용한포유동물의 ｂｂｓ 감염증을 치료 또는 예방하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica: 이하 BBS)의 aroA 유전자가 제거된 BBS 균주, 그를 포함하는 면역원성 조성물, 그를 이용한 포유동물의 BBS 감염증을 치료 또는 예방하는 방법 및 약독화된 BBS 균주의 제조 방법을 제공한다.

약독화 보르데텔라 브론키셉티카 (BBS), aroA 유전자, 면역원성 조성물, 상동 재조합

Description

약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 (ＢＢＳ) 균주 및 그의 제조 방법, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 ＢＢＳ 감염증을 치료 또는 예방하는 방법{An attenuated Bordetella bronchiseptica (BBS) strain and method for producing thereof, an immunogenic composition comprising the strain and a method of treating or preventing BBS infection from mammals using the same}

도 1은 BBS aroA 유전자 양단의 40mer 씩을 포함하는 프라이머를 이용하여 pKD13 헬퍼 플라스미드로부터 카나마이신 내성 유전자(kan^R)를 PCR로 증폭하여 상동 재조합용 DNA 인서트를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.

도 2는 aroA 유전자좌가 kan^R으로 치환되었는지를 알아보기 위한 검증 PCR의 모식도이다.

도 3은 PCR를 이용하여 증폭시킨 aroA 양단을 포함하는 Kan^R이 PCR로 증폭된 그림 (A) 및 aroA 양단을 포함하는 Kan^R이 클로닝 벡터인 pGEM-T easy에 삽입되었음을 확인하기 위해 제한효소 EcoRI으로 처리한 그림 (B)이다.

도 4는 PCR 검증 1번과 2번을 실시한 결과, 기대되는 크기의 PCR 산물이 각각 0.85kb 및 1.2kb의 크기로 생성되었음을 보여주는 그림이다.

도 5는 본 발명의 BBS 변이주 및 야외주를 비강을 통해 접종 후 분리되는 BBS의 균수 측정 결과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 변이주와 야외주의 항-BBS 항체 생산 유도능을 비교한 그래프이다.

도 7은 본 발명의 변이주 및 PBS로 면역을 시킨 후, 야외주를 접종하여 BAL 및 폐 조직 내에 분리되는 BBS를 측정한 결과이다.

도 8은 본 발명의 변이주를 이용하여 면역을 실시한 결과, 음성 대조군 (PBS)과 비교하여 BAL 내의 마우스 체세포 (면역 세포)의 개수가 거의 동일하게 측정되었음을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica: 이하 BBS)의 aroA 유전자가 제거된 약독화된 BBS 균주, 그를 포함하는 면역원성 조성물, 그를 이용한 포유동물의 BBS 감염증을 치료 또는 예방하는 방법 및 약독화된 BBS 균주의 제조 방법에 관한 것이다.

돼지 위축성비염(Atropic rhimitis: AR)은 대부분의 양돈장에 상재하는 돼지의 만성호흡기 질환으로 비강에 침입한 병원체(Bordetella bronchiseptica)에 의해 비강점막의 염증을 일으키고, 점점 병세가 진행될수록 비갑개골과 상악골의 위축이 되고, 좀 더 지나면 코가 비뚤어지는 특성을 가진 질병으로 어린 일령의 자돈에 감 염이 쉽게 일어나고 본 병이 감염되면 사료 효율과 증체율도 떨어져 양돈산업에 많은 경제적 손실을 주는 호흡기 질병이다.

이 질병은 특히 파스튜렐라 멀토시다 D형( Pasteurella multocida type D)이 2차적으로 감염시 증상이 심해진다. 위축성비염 감염돈은 콧물 속에 병원체가 배출되어 코끝을 통한 직접 접촉에 의한 감염과 먼지에 부착된 병원체가 공기를 통해 전파되기도 한다. 일단 전파되면 비강점막에 강하게 부착되어 독소를 분비하여 비강점막을 손상시키며 조직을 괴사시키고 비갑개의 위축을 가져와 코가 비뚤어지는 증상을 나타낸다. 돈사의 위생, 환기상태불량, 유독가스(암모니아 가스)의 체류 등은 위축성비염 전파를 빠르게 하고 증상을 악화시킨다.

처음에는 가벼운 재채기에서 시작되어 점차 코에서 점액성의 농이 배설되고, 눈이 붓고 충혈되며 눈물이 나고, 눈가에 먼지가 부착되어 검은 반점이 생긴다. 심한 경우 코에서 출혈이 생기고 콧등의 피부가 주름지며 생후 4 - 5주령부터 안면의 변형과 코가 비뚤어진다. 이때부터 유행성 폐렴이나 흉막폐렴 등 호흡기 질병이 증가한다. 만성경과 돼지는 사료 효율과 증체량이 보통 20% 씩 떨어진다.

육안으로 기침이나 비강의 분비물, 코가 비뚤어지는 외관상의 임상증상을 통해 관찰할 수 있으며 폐사돈은 부검하여 비갑개의 위축정도를 확인한다.

혈청학적 진단법은 거의 모든 돼지에서 항체가 형성되어 있으므로 효과적인 방법이 되지 못하나 BBS만 선택적으로 배양하는 선택 배지를 이용하여 코끝이나 비강주변을 멸균 면봉으로 채취하여 배양하면 쉽게 원인체를 분리할 수 있다.

이 질병에 대한 예방 백신으로는 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida)의 독소 를 톡소이드화한 것과 BBS의 사균백신 혼합제가 가장 많이 사용되고 있으나, 사균백신의 경우 BBS가 생산하는 독소인 데모네크로톡신의 생산이 없을 것이므로, 사균백신에 의한 BBS의 예방은 절대로 기대하기 어렵다는 점이다.

그러므로, 상기 균의 대사에 중요한 역할을 담당하는 유전자(예를 들면, aroA 유전자)를 제거하여 약독화 생독 균주를 생산하여 백신에 이용하는 것은 새로운 대안이라 할 수 있을 것이다.

한국공개특허 제2005-55837호에는 돼지의 위축성비염에 대한 면역활성을 높이기 위한 백신 전달용 키토산 미립자가 기재되어 있으나, 본 발명의 aroA 유전자가 제거된 약독화 균주와는 상이하다.

또한, 한국공개특허 제2005-103215호에는 BBS에 대한 개 백신이 기재되어 있으며, p68 항원을 이용하는 백신 조성물이므로 본 발명과는 상이하다.

본 발명자들은 놀랍게도 aroA 유전자가 제거된 BBS의 약독화 균주는 병원성은 없으면서 면역원성을 유지한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은, BBS의 aroA 유전자가 제거된 약독화된 BBS 균주 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 균주를 포함하는 BBS 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역원성 조성물을 포유동물에 투여하여 상기 포유동물의 BBS 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BBS의 aroA 유전자가 제거된 약독화된 BBS 균주를 제공한다. 상기 약독화된 BBS 균주는 바람직하게는, 수탁번호 KCCM-10840P인 것이다.

aroA는 돼지 호흡기 질병인 위축성비염의 원인 병원체인 BBS의 중요한 대사과정에 관여하는 유전자이며, 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 가진다.

본 발명에서, "약독화된"은 독성 있는 균주가 변형 전보다 덜 독성 있는 균주 또는 약한 병원균이 되는 방식으로 변형되는 것이다.

본 발명의 약독화된 BBS 균주는 하기와 같이 제조되었다. 돼지 호흡기 질병인 위축성비염의 원인 병원체인 BBS의 중요한 대사과정에 관여하는 유전자인 aroA 유전자 부위 중에서 N-말단 40mer와 C-말단 40mer를 포함하는 카나마이신 내성 유전자(Kan^R) 서열을 PCR로 증폭, 클로닝하고 이를 상동 재조합용 인서트로 사용하여 aroA 유전자좌를 제거하였다.

보다 구체적으로는,

a) BBS aroA 유전자 결손 비병원성 변이주 생산을 위하여, aroA 유전자 부위 중에서 N-말단 40mer와 C-말단 40mer를 포함하는 카나마이신 내성 유전자(Kan^R) 서열을 PCR로 증폭한다 (도 1 참조). 즉, Kan^R 유전자가 삽입되어 있는 헬퍼 벡터 pKD13으로부터 Kan^R을 증폭하는데 사용하는 프라이머 양 말단에 aroA 유전자의 N-말단 40mer를 5'-프라이머에 추가하여 프라이머를 합성하고, 반대로 aroA 유전자 C-말단 40mer를 3'-프라이머에 추가하여 합성한 다음, 상기 2개의 프라이머를 이용하여 PCR로 Kan^R을 증폭하면 양 말단에 각각 40mer씩의 aroA 유전자 부위를 갖는 Kan^R이 증폭된다 (도 1 참조).

b) 상기 PCR 산물을 클로닝 벡터인 pGEM-T easy에 클로닝하고 상동 재조합용 선형 DNA 인서트를 제조하기 위해 EcoRI으로 절단하고 원하는 인서트를 겔 용출로 추출해 낸다.

c) BBS 야외 균주에 pKD46 플라스미드를 전기천공 방법으로 형질전환시켜 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포를 제조한다. 상기 pKD46 헬퍼 벡터는 상동 재조합을 일으키는 효소인 λ Red 리콤비나제(recombinase)를 발현시켜 균체 내에서 상동 재조합에 의한 유전자좌 치환을 일으킨다.

d) pKD46 플라스미드가 도입되어 형질전환된 BBS에서 λ Red 리콤비나제가 유도되게 하기 위해서, L-아라비노스를 최종농도가 10mM이 되도록 준비한 배지에서 배양하고 상동 재조합용 선형 DNA를 형질전환하기 위해 준비한다.

e) 선형 DNA를 전기천공법으로 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포에 형질전환하고, 카나마이신이 첨가된 배지에서 선택한다.

f) PCR을 통한 형질전환체의 게놈 DNA에서의 해당 목적 유전자의 녹아웃을 확인한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BBS의 aroA 유전자가 제거된 약독화된 BBS 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 포함하는, 포유동물의 BBS 감염증의 치료 또는 예방용 면역원성 조성물을 제공한다.

상기 약독화된 BBS 균주는 상기한 바와 같다. 바람직하게는, 상기 BBS 균주는 수탁번호 KCCM-10840P인 것이다.

"면역원성"이라는 것은 특정 병원체에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유발시키는 조성물의 능력을 의미한다. 면역 반응은 세포독성 T-세포 및 시토카인-생성 T-세포에 의해 주로 매개되는 세포 면역 반응, 또는 헬퍼(헬퍼) T-세포에 의해 주로 매개된 후 B-세포를 활성화시켜 항체를 생성시키는 체액 면역 반응일 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 유효한 양으로 투여될 수 있다. "유효한 양"이란 치료 또는 예방하고자 하는 증상을 완화 또는 제거하는데 요구되는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 상기 약독화된 BBS 균주를 1일 1x10⁶ 내지 1x10¹⁰ cfu/mL, 바람직하게는 1일 1x10⁷ 내지 1x10⁹ cfu/mL, 더욱 바람직하게는, 1일 1x10⁷ 내지 1x10⁸ cfu/mL의 범위로 투여할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은, 상기 약독화된 BBS 균주에 더하여, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 담체는 희석제, 완충제, 보존제 등을 포함하는 의미로서 사용된다. 상기 담체에는 당업계에 알려진 부형제, 붕해 제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 어주반트는 항원의 면역원성을 증진시키기 위하여 사용되는 물질이며, 본 발명에 사용하기에 적합한 어주반트로는, 몇몇 어주반트 부류, 예컨대 미네랄 염, 예컨대 Alum, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트; 계면활성제 및 미립자, 예컨대, 비이온성 블록 중합체 계면활성제(예컨대, 콜레스테롤), 비로솜(virosome), 사포닌(saponin)(예컨대, Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오솜, 면역 자극 착체, 코클레에이트, 4차 아민(디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA)), 아브리딘, 비타민 A, 비타민 E; 박테리아 생성물, 예컨대 RIBI 어주반트 시스템(Ribi Inc.), 미코박테리룸 플레이(Mycobacterum phlei)의 세포벽 골격(Detox(등록상표)), 무라밀 디펩티드(MDP) 및 트리펩티드(MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실러스 칼메테-구에린(Bacillus Calmete-Guerin), 열-불안정한 대장균 엔테로톡신(enterotoxin), 콜레라 독소, 트레할로스 디미콜레이트, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드; 시토카인 및 호르몬, 예컨대, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 과립구집락자극인자, 데히드로에피안드로스테론, 1,25-디히드록시 비타민 D3; 폴리아니온, 예컨대 덱스트란; 폴리아크릴릭(예컨대, 폴리메틸메타크릴레이트, Carbopol 934P); 담체, 예컨대 테타누스 톡시드, 딥테리아 톡시드, 콜레라 독소 B 서브유닛, 엔테로톡시제닉 대장균의 돌연변이체 열-불안정한 엔테로톡신(rmLT), 열 쇼크 단백질; 수중유적형 유화액, 예컨대 AMPHIGEN(등록상표)(Hydronics, 미국); 및 유중수적형 유화액, 예컨대 프로인트(Freund)의 완전 및 불완전 어주반트가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 10∼40%의 프로필렌 글리콜, 및 용혈현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다. 상기 액제 또는 주사제에는 당업계에 알려진 임의의 희석제 또는 완충제가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은, 상기 약독화된 BBS 균주를 동결건조하여 바이알과 같은 용기에 보존하고, 사용하기 전에 주사제에 필요한 담체 또는 아주반트, 식염수 등을 부가함으로서, 사용 직전에 조제될 수도 있다.

본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 소, 돼지, 염소, 개, 양 등일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 돼지이다.

본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 BBS 감염증은 BBS 감염에 의하여 야기되는 임의의 증상을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 돼지 위축성비염이 포함된다.

본 발명의 면역원성 조성물은, 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, BBS 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 포유동물은 비인간 포유동물이며, 바람직하게는 소, 돼지, 개, 염소 및 양으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는, 상기 포유동물은 돼지이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 BBS 감염증은 BBS 감염에 의하여 야기되는 임의의 증상을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 돼지 위축성비염이 포함된다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 투여는 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여되는 것이다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 당업자라면, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 바람직하게는, 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 상기 약독화된 BBS 균주를 1일 1x10⁶ 내지 1x10¹⁰ cfu/mL, 바람직하게는 1일 1x10⁷ 내지 1x10⁹ cfu/mL, 더욱 바람직하게는, 1일 1x10⁷ 내지 1x10⁸ cfu/mL의 범위로 투여할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BBS의 aroA 유전자를 상동 재조합에 의해 제거하는 단계를 포함하는 약독화된 BBS 균주의 제조 방법을 제공한다.

구체적으로, 포유동물 호흡기 질환을 일으키는 원인균 중의 하나인 BBS의 게놈상의 aroA 유전자를 제거함으로서 약독화 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 즉, BBS의 aroA 유전자를 녹아웃시키고 그 부위에 선택 마커로서 카나마이신 내성 유전자(Kan^R)을 치환해 넣는 기술로, aroA 유전자 양 말단의 40 bp를 포함하는 Kan^R를 PCR로 증폭하고 이를 BBS에 형질전환 후, λ Red 리콤비나제(recombinase)를 이용해 상동 재조합을 통해 aroA 유전자 위치에 Kan^R를 치환하여 약독화 균주를 제조한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 균주의 제조 방법에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCCM-10840P이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: BBS의 aroA 유전자가 제거된 약독화된 BBS 균주의 제조

(1) 공시균주 및 플라스미드

대장균 JM109는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사로부터 구입하여 사용하였고, pGEM-T easy 벡터 (Promega, Madison, WI)는 클로닝에 이용되었다. Red 헬퍼 플라스미드 pKD46(Genbank #AY048746)은 pBAD 프로모터를 이용하여 red와 gam 단백질을 생산하는 벡터로서 균체 내로 외부 DNA가 유입되었을 경우, 상동 재조합을 일으키는 작용을 한다. 즉, Red 리콤비나제를 포함하고 있는 벡터이다. 선택 마커로 사용되는 Kan^R는 pKD13 헬퍼 벡터(Genbank #AY048744)로부터 클로닝하여 사용하였다. BBS 표준 균주는 국립수의과학 검역원에서 분양받아 사용하였다.

(2) aroA N- 또는 C-말단 40mer를 포함하는 카나마이신 내성 유전자 (Kan ^R ) 클로닝

PCR 프라이머의 구성은 다음과 같다. 즉 기존의 aroA 유전자 정보를 이용하여 (GenBank database: AF182427) pKD13 헬퍼 벡터를 주형으로 하여, 정방향 프라이머로서 aroA N-말단 40mer 및 pKD13의 프라이밍 부위를 포함하는 aroA-FRT-F(P1): 5'-ATG AGC GGA TTG GCA TAT CTC GAC CTG CCC GCG GCG CGC C-GT GTA GGC TGG AGC TGC TTC-3'(서열번호 2)를 사용하였고, 역방향 프라이머로서 aroA C-말단 40mer 및 pKD13의 역방향 프라이밍 부위를 포함하는 aroA-FRT-R(P2): 5'-TCA GTC CCG CGC GGC CAG CAG GCC CGC GTA CAC GTC GAA AAT TCC GGG GAT CCG TCG ACC-3'(서열번호 3)을 사용하였다.

PCR 조건은 94℃에서 5분간 예비변성, 94℃/30s, 57℃/30s, 그리고 72℃/1min으로 30 사이클을 실시하고 최종 연장을 72℃/5min간 실시하였다. PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하였다. 형질전환된 콜로니를 선택하여 다시 증균 및 플라스미드 정제를 거치고 제한효소인 EcoRI으로 처리하여 인서트의 삽입 여부를 확인하고, 확인된 구축물에 한하여 전체 시퀀싱을 실시하여 원하는 염기서열이 증폭되었는지 재확인하였다. EcoRI으로 처리된 1.3kb 분획은 상동 재조합용 인서트로 사용되었다.

프라이머 aroA-FRT-F와 aroA-FRT-R을 이용하여 pKD13을 주형으로 하여 Kan^R을 PCR로 증폭한 결과, 도 3의 A와 같이 1.3kb의 PCR 산물을 얻을 수 있었고, 이를 클로닝 벡터인 pGEM-T easy에 클로닝 후 삽입 여부를 확인하기 위해 제한효소 EcoRI으로 처리하여 1.3kb의 PCR 산물이 클로닝 되었음을 확인하였다 (도 3의 B).

(3) 상동 재조합을 통한 aroA 유전자좌 제거

신선하게 준비된 BBS 배양액 5ml을 500 ml BHI 브로쓰 (BBL™, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)에 접종하여 OD값이 0.5가 될 때까지 배양하고, 배양 후 얼음 위에서 20분간 냉각 후 4000xg로 15분간 원심분리하여 균을 회수하였다. 이를 2.5ml의 냉각된 10% 글리세롤 용액으로 농축하여, 전기천공용 컴피턴트 세포를 제조하였다. 상기 균체에서 λ Red 리콤비나제를 발현하기 위해 pKD46 플라스미드를 Gene Pulser Xcell™ 전기천공 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 형질전환 후, 암피실린과 L-아라비노스 (최종 농도 10 mM)가 첨가된 250ml SOB 배지 (증류수 1 리터당 박토트립톤 20 g, 박토 효모 추출액 5 g, NaCl 0.5 g을 넣고 멸균하여 제조)에서 선택 후, 30℃에서 OD값이 0.5가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 다시 2.5ml의 냉각된 10% 글리세롤 용액으로 농축하여 먼저 제조된 상동 재조합용 선형 DNA를 형질전환하기 위한 일렉트로컴피턴트 세포를 제조하였다.

40㎕의 일렉트로컴피턴트 세포에 1㎕ (100ng)의 인서트 DNA를 전기천공법으로 형질전환하고, 50 ㎍/ml 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 선택하여 aroA가 제거된 균을 선택하였다.

실시예 2: PCR 검증

카나마이신 선택 배지에서 생존한 콜로니는 kan^R이 삽입되었음을 알려주는 리포터 역할을 하는 것이 사실이지만, 다시 한 번 분자생물학적 방법으로 검증을 하기 위해서 PCR 검증을 실시하였다. 즉, aroA 유전자좌에 kan^R이 치환되었는지 확인하기 위해 다음과 같이 PCR을 실시하였다 (도 2 참조). 즉, 2 종류의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함에 있어 PCR 검증 1번 (V1)은 aro-FRT-F (P1)와 kan-F 프라이머 (P4, 5'-ATGATTGAACAAGATGGATT-3'(서열번호 4))를, 검증 2번 (V2)은 kan-R (P3, 5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3'(서열번호 5))와 aroA-FRT-R (P2)를 이용하여, 각각 0.85kb 및 1.2kb의 PCR 산물의 증폭을 수행하였다.

그 결과, 검증 1번에서는 0.85kb의 PCR 산물이, 그리고 검증 2번에서는 1.2kb의 PCR 산물이 생성됨을 확인하여 성공적으로 aroA 유전자가 제거되었음을 알 수 있었다 (도 4).

본 발명자들은 상기한 바와 같은 실시예로부터 얻어진 약독화된 BBS 균주를 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자 은행에 2007년 2월 8일 기탁하였다 (수탁번호 KCCM-10840P).

실시예 3: 본 발명의 BBS 변이주의 약독화 규명

본 발명의 약독화된 BBS 변이주가 약독화되었는지 알아보기 위하여, 본 발명의 변이주와 야외주 (wild-type, W/T)를 BHI 배지에서 동시 배양한 후, 6주령의 BALB/c 마우스의 비강으로 균 배양액 10㎕(1×10⁸ BBS 세포/ml)를 각각 투입하였다. 이 후 1일 간격으로 마우스를 희생하여 폐기관세척액 (bronchio-alveolar lavage, BAL) 및 폐 조직으로부터 BBS를 분리하여 균수를 측정하였다. 그 결과, BBS 변이주는 마우스 비강에서 1일 이내에 모두 사멸하여 약독화가 되었음을 보여준 반면, 야외주는 접종 후 6일 동안 계속하여 균이 방출됨을 알 수 있었다 (도 5).

실시예 4: 본 발명의 BBS 변이주에 의한 항체 생산 유도 확인

본 발명의 BBS 변이주에 의해서도 야외주와 마찬가지로 BBS에 대해 항체가 유사하게 발현 유도되는지를 알아보기 위해, 6주령의 BALB/c 마우스를 5 마리씩 3 그룹으로 나누어 비강으로 균 배양액 10㎕(1×10⁸ BBS 세포/ml)를 각각 투입하고 음성 대조군은 PBS(인산완충염수)를 투여하였다. 실험군은 14일 및 28일째에 2차 부스팅(boosting)을 실시하였고, 최종접종 후 1주일 후 채혈하여 혈청을 준비하였다. 혈청 중에 존재하는 항-BBS IgG를 검출하기 위해, 항원으로는 포르말린을 처리한 BBS 균체를, 2차 항체로는 염소 항-마우스 HRP 접합된 항체 (Pierce, USA)를 이용하여 ELISA법으로 항-BBS 항체를 검출하였으며, 발색을 위해 50㎕의 기질 용액과 반응시켰다. 기질 용액은 포스페이트-시트레이트 버퍼(pH 5.0, 24 mM 시트레이트, 64 mM 디소듐 히드로겐 포스페이트, 0.01% (v/v) 과산화수소 포함)에 0.04% (w/v) o-페닐렌디아민 (Sigma, USA)을 녹인 것을 사용하였다. 발색 반응은 50㎕의 10% SDS 용액을 첨가하여 정지시켰고 Multiskan Ascent microplate reader (Thermo Labsysterms, USA)로 405 nm의 파장에서 읽었다. 그 결과, 본 발명의 변이주는 야외주와 비슷하게 항-BBS 항체를 유도함으로써, 변이주가 되었더라도 항체의 생산 유도 능력은 변함이 없음을 알 수 있었다 (도 6).

실시예 5: 백신 및 방어 실험

본 발명의 변이주를 이용한 백신을 공격 접종 후 야외주의 생존률 (분리율) 및 BAL 내에서의 면역세포 유도 등에 대해 알아보기 위해 실험을 실시하였다. 즉, 마우스 비강으로 균 배양액 10㎕(1×10⁸ BBS 세포/ml)를 각각 투입하고 음성 대조군은 PBS를 투여하였다. 두 그룹 모두 접종 14일 및 28일째에 부스팅을 실시하였고 최종 접종 3일 후에 야외주를 동량으로 접종하여 BAL 및 폐 조직에서의 야외주 분리를 실시하였다. 그 결과, 변이주로 면역을 실시한 그룹에서는 야외주의 분리가 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게(P < 0.01) 낮은 것으로 나타났다 (도 7).

한편, BAL 내의 마우스 체세포 (면역 세포)의 개수를 측정하기 위해, 상기에서 실시한 방법과 동일하게 접종 후 마지막 챌린지 3일 후 세포 수를 혈색소계(hematometer)를 이용하여 측정한 결과, 변이주를 이용하여 면역을 실시한 그룹에서 거의 동일한 수의 세포 수가 측정되었다 (도 8).

본 발명의 약독화된 BBS 균주에 의하면, 면역원성은 있으나 독성은 약화되어 생백신으로 사용될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물에 의하면, 포유동물 내에 투여되는 경우 BBS 독소에 대한 항체 생산을 유도할 수 있다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> An attenuated Bordetella bronchiseptica (BBS) strain and method for producing thereof, an immunogenic composition comprising the strain and a method of treating or preventing BBS infection from mammals using the same <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1329 <212> DNA <213> Bordetella bronchiseptica <400> 1 atgagcggat tggcatatct cgacctgccc gcggcgcgcc tggcgcgcgg cgaggtggcc 60 ctgccgggtt ccaagagcat ctccaacagg gtattgctgc tggccgcgct ggccgaaggc 120 agcaccgaaa tcacgggcct gctcgattcc gatgacaccc gcgtcatgct ggccgcgttg 180 cgccagctgg gcgtatcggt gggcgaggtg gccgatggcc gcgtgaccat cgaaggcgtg 240 gcgcgctttc cgaccgaaca ggccgagctg ttcctaggca acgccggcac cgcgttccgg 300 ccgctgaccg cggcgctggc gttgatgggc ggcgattacc gcctgtccgg cgtgccgcgc 360 atgcacgagc ggcccatcgg cgacctggtc gacgccttgc gccagttcgg cgccgggatc 420 gaatatctgg ggcaggcggg gtatccgccg ctgcgcatcg gcggcggcag cattcgcgtc 480 gacgggccgg tgcgggtgga gggctcggtg tccagccagt tcctgaccgc cttgctgatg 540 gccgcccccg tgctggctcg gcgcagcggc caggacatca ccatcgaggt ggtgggcgag 600 ctgatttcca aaccctatat cgagatcacg ctcaatctga tggcgcgttt tggcgtgtcg 660 gtgcggcgcg acggctggcg cgccttcacg atcgcgcgcg atgcggccta ccgcggcccg 720 ggccgcatgg cgatcgaggg cgatgcctcg acggcgtcgt acttcctggc cctgggcgcc 780 atcggcggcg ggccggtgcg cgtcaccggc gtgggcgagg acagcatcca gggcgacgtg 840 gcgttcgccg cgacgctggc ggcgatgggc gccgacgtgc gctatggccc gggctggatc 900 gagacgcgcg gcgtgcgggt ggccgagggc ggacgcctga aggcgttcga cgctgacttc 960 aacctgattc ccgacgccgc catgacggcc gcgacgctgg cgctgtacgc cgacggccca 1020 tgccgcctgc gcaacatcgg cagctggcgc gtcaaggaga ccgaccgcat ccacgccatg 1080 cacaccgagc tggagaagct gggggcgggc gtgcaaagcg gggcggactg gctggaggtg 1140 gcgccgccgg cgcccggcgg ctggcgcgac gcccacatcg gcacctggga cgaccaccgc 1200 atggccatgt gcttctcgct ggccgcgttc ggtccggctg cggtgcgcat cctggatccg 1260 ggttgcgtca gcaagacttt ccccgattat ttcgacgtgt acgcgggcct gctggccgcg 1320 cgggactga 1329 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 atgagcggat tggcatatct cgacctgccc gcggcgcgcc gtgtaggctg gagctgcttc 60 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 tcagtcccgc gcggccagca ggcccgcgta cacgtcgaaa attccgggga tccgtcgacc 60 60 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 atgattgaac aagatggatt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 tcagaagaac tcgtcaagaa 20

Claims (12)

1. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica: BBS)의 aroA 유전자가 제거된 약독화된 BBS 균주.
2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCCM-10840P인 것을 특징으로 하는 브론키셉티카 균주.
3. 제1항에 있어서, 상기 aroA 유전자는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 브론키셉티카 균주.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 BBS 약독화 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 포함하는, 포유동물의 BBS 감염증의 치료 또는 예방용 면역원성 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 BBS 감염증은 돼지 위축성비염인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
7. 제4항에 따른 면역원성 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, BBS 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 포유동물은 비인간 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 비인간 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 감염증은 돼지 위축성비염인 것을 특징으로 하는 방법.
11. BBS의 aroA 유전자를 상동 재조합에 의해 제거하는 단계를 포함하는 약독화된 BBS 균주의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서, BBS의 aroA 유전자 양 말단의 40 bp를 포함하는 카나마이신 내성 유전자(Kan^R) 서열을 PCR로 증폭하고, BBS에 형질전환 후, λ Red 리콤비나제(recombinase)를 이용해 상동 재조합을 통해 aroA 유전자 위치에 Kan^R를 치환하여 약독화 균주를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.

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