KR20080071134A - Ｇｌｐ-２ 모방체，폴리펩티드，조성물，방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

포유류의 GLP-2 모방체, 폴리펩티드 및 핵산을 개시한다. 또한 GLP-2 관련 질환을 치료하기 위한 모방체 및 폴리펩티드의 사용 방법을 개시한다.

Description

ＧＬＰ-２ 모방체，폴리펩티드，조성물，방법 및 용도{GLP―２ MIMETIBODIES, POLYPEPTIDES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES}

본 발명은 포유류의 GLP-2 폴리펩티드 및 모방체, 및 치료제로서 이들의 용도에 관한 것이다.

글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2)는 프로글루카곤의 번역 후 과정을 통하여 생성되는 33개 아미노산의 장영양성 펩티드 호르몬이다(Orskov et al., FEBS Lett. 247: 193-196(1989); Hartmann et al., Peptides 21: 73- 80(2000)). 포유류에서 GLP-2는 췌장이 아닌, 장 및 뇌에서 프로글루카곤으로부터 유리되고, 결과적으로 소화관 내분비성 세포에서 프로호르몬 전환 효소의 세포 특이적 발현을 초래한다(Dhanvantari et al., Mol. Endocrinol. 10: 342-355(1996); Rothenberg et al., Mol. Endocrinol. 10: 334- 341(1996); Damholt et al., Endocrinology 140: 4800-4808(1999); Hoist, Trends Endocrinol Metab. 10: 229-235(1999)). 고성능 액체 크로마토그래피 및 자리 특이적 GLP-2 항혈청의 배합을 사용한 랫트 및 인간 혈청 의 분석은 2개의 기본적인 순환 분자 형태, GLP-2^1-33 및 GLP-2^3-33의 존재를 밝혔다(Hartmann et al., Supra; Brubaker et al., Endocrinol. 138: 4837-4843(1997); Hartmann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 2884-2888(2000)). GLP-2^1-33는 프로테아제 디펩티딜 펩티다아제 IV(DPP IV)에 의해 생체 내에서 절단되고, 이는 제 1의 두개의 잔기, 히스티딘 및 알라닌(HA)을 제거한다. 산출된 펩티드 GLP-2^3-33은 본질적으로 비활성적이다.

GLP-2는 위의 운동성, 위산 분비, 장의 헥소오스 수송을 조절하고, 소화관 상피의 장벽 기능을 증진시킨다(Drucker, J. Clin. Endocr. Metab. 86: 1759-1764(2001)의 리뷰). 이는 장세포 및 크립트(crypt) 구획에서 크립트 세포 분화의 촉진 및 아포토시스의 억제를 통하여 점막 상피의 표면 영역을 유의하게 증가시킨다(Drucker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 7911-7916(1996)). GLP-2는 소장 및 대장의 염증에서 사망을 감소시키고 점막 상해, 사이토카인 발현 및 박테리아 패혈증을 줄인다(Boushey et al., Am. J. Physiol. 277: E937-E947(1999); Prasad et al., J. Pediatr. Surg. 35: 357-359(2000)). GLP-2는 또한 단장증후군(SBS)을 갖는 설치류 또는 인간에서 영양 흡수 및 소화관 흡수를 증진시킨다(Jeppesen et al., Gastroenterology 120: 806-815(2001)).

GLP-2의 기능은 GLP-2 수용체(GLP-2R)에 의해 변환되고, G 단백질-커플 수용체는 위, 소장, 결장의 소화관 내분비성 세포에서 뿐만 아니라, 장 신경 및 내막하 근섬유모세포(subendothelial myofibroblast)에서 발현된다(Munroe et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 96: 1569-1573(1999); Yusta et al., Gastroenterology 119: 744-755(2000); Bjerknes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 12497- 12502(2001); Orskov et al., Regul . Pept. 124: 105-112(2005)). GLP-2 수용체(BHK-GLP-2R 세포)를 발현하는 형질전환된 새끼 햄스터 신장 섬유아세포에서 GLP-2R 신호의 직접적인 활성은 사이클로헥시미드-유도 아포토시스에 대한 내성에 기여한다(Yusta et al., J. Biol. Chem. 275: 35345-35352(2000)).

GLP-2의 세포보호, 회복 및 에너지 보호 성질이 GLP-2가 장 점막 상피의 상해 및/또는 기능장애로 특정지어지는 인간 장애의 치료에 있어서 잠재적으로 유용할 것으로 제안되었다. 장의 상피 상해는 크론씨병 및 궤양성 대장염을 포함하는, 염증성 장질환(IBD)을 갖는 환자 및 장에서 염증 반응과 관련된 자가면역 질환, 예컨대, 셀리악 질환을 갖는 환자에서 발견된다(Hanauer, New England J. Med. 334: 841-848(1996)의 리뷰). 또한, 일부 화학요법 약물은 장의 상피에 상해를 일으켜 용량 한정적인 독성 부작용을 초래한다(Oster, Oncology 13: 41(1999)). 증가된 장의 투과성이 또한 급성 췌장염의 원인이라고 보고되었고(Kouris et al., Am. J. Surg. 181: 571-575(2001)) 마크로분자가 내막하 구획에 접근하는 것을 허용함으로써 식품 알러지에 기여할 수 있다(Troncone et al., Allergy 49: 142-146(1994)).

영양 흡수에서 중요한 조절 호르몬으로서, GLP-2는 또한 단장증후군(SBS)을 갖는 환자 치료에서 또한 잠재력이 있다(Drucker et al., Supra; Rubin, Gastroenterol. 117:261-263(1999); Nightingale, Gut 45: 478- 479(1999)). SBS는 해부 또는 기능상의 소장의 상당한 길이의 상실로부터 흡수 불량으로서 정의된 다(Jeppesen, J. Nutr. 133: 3721- 3724(2003)의 리뷰). 단장증후군의 원인은 성인과 아동에서 상이하다: 성인에서는 주로 크론씨병 또는 장간막경색(mesenteric infarction)에 대한 수술의 결과로 나타나는 반면; 유아에서는 괴사성 장염, 위벽파열(gastroschisis), 폐쇄증 및 염전(volvulus)을 포함하는 더욱 일반적인 원인을 포함한다(Platell et al. , World J. Gastroenterol. 8: 13-20(2002)).

테두글루티드, DPP-IV 내성 GLP-2 펩티드 유사체(여기에서 알라닌-2는 글리신(A2G)으로 치환된다)는 SBS, 크론씨병 및 소아의 GI 장애를 포함하는 위장(GI) 질환의 효과적인 치료를 위하여 개발 중이다. 테두글루티드는 또한 암 화학요법 및 IBD와 관련된 점막염의 치료에 효과를 갖는다. 그러나, 펩티드의 저분자량 때문에, 테두글루티드는 30분 미만의 반감기를 가지므로 빠르게 제거된다. 따라서, 1일 투여는 치료적 수준의 유지가 요구된다(Shin et al., Curr. Opin. Endocrin. Diabetes 12: 63-71(2005)). 그러므로, 이의 기능을 유지하고 개발 및 제조는 손쉽게 제공됨과 동시에 짧은 반감기를 극복한 변형된 GLP-2가 요망된다.

침습술(invasive surgery) 또는 외상성의 상해에 따른 공동작용가능한 위장 운동성의 일시적 손상, 염증성 장폐색은병원 재원기간 지연 및 회복 기간 동안의 의학적 합병증에 종종 기여하는, 주요한 임상적 문제로 남아있다(Holte and Kehlet, Br. J. Surg. 87: 1480-1493(2000)). 장폐색은 지연되는 위 배출(gastric emptying), 소장 및 결장의 확장, 복부의 팽창, 정상적 추진성 수축 패턴의 상실, 가스 또는 대변 배출의 무능력으로 특정지어지고, 지속되는 환자의 불편을 초래한다(복부의 팽창, 메스꺼움, 구토).

의심스러운 개인, 예컨대, 심폐 컴프로미스(cardiopulmonary compromise)를 갖는 노인 또는 환자에서, 장폐색은 급성 위확장, 부정맥, 호흡 곤란, 흡인성 폐렴 및 외과적 문합의 실패를 포함하는 더욱 심각한 합병증을 유도할 수 있다. 위험한 경우에, GI 관의 정상적인 "하우스키핑(housekeeping)" 수축 활성의 장기간의 상실은 박테리아의 과도성장 및 박테리아의 전좌 및 인트리(entry)의 전신의 순환에 따른 장의 장벽 기능의 붕괴를 초래할 수 있다(Anup and Balasubramanian, J. Surg. Res. 92: 291-300(2000)). 이는 차례로, 나이 많은 환자에게 걸리기 쉬운, 내독소증, 패혈증, 다장기장해 및 궁극적으로 사망의 결과를 초래한다. 합병증의 부재시에도, 정상적인 장 기능의 회복은 환자의 퇴원에 있어서 가장 원초적인 제한 요소이고, 염증성 장폐색이 있다면, 병원 재원기간은 3일 내지 5일까지 증가한다. 따라서, 증가된 이환율 및 연장된 병원 재원기간으로부터 발생된 비용은 상당할 수 있다.

장폐색의 진전 및 유지에 기여하는 인자는 노르에피네프린을 장벽으로 방출하는 중추 교감 억제 반사의 활성, 억제성 채액제, 마취제 및 진통제, 및 염증 매개체를 포함한다(Livingston and Passaro, Dig. Dis. Sex. 35: 121-132(1990); Bauer et al., Curr. Opin. Crit . Care 8: 152-157(2002)). 설치류 연구의 결과는 GI 관의 벽 이내의 염증이 장폐색의 초기 및 유지에 중심적인 역할을 한다는 것을 시사하였다.

수술 후 장폐색의 설치류 모델을 사용한 연구는 외근육층이 면역학적으로 높은 활성 구획임을 증명한다. 외근육층의 이내에는 정상적으로 휴기지인 인상적인 일련의 공통 백혈구가 있다(Mikkelsen, Histol. Histopathol. 10: 719-736(1995); Kalff et al., Ann. Surg. 228: 652-663(1998)). 가장 풍부한 것은 휴지기 마크로파지이고, 식도에서 결장까지 세포의 확장 네트워크 형태이고, 상해 및 장애로부터 위장관을 방어하는 것이 유지된다. 복부 수술 중의 장에 대한 방해는 이 마크로파지 네트워크를 활성화시키고, 국부적 분자 염증 반응을 개시한다. 활성된 마크로파지는 근육층 이내의 근육신경 전달을 억제하고 혈관 내피세포 상에서 접합 분자(ICAM-1, P-셀렉션)의 발현을 유도하는 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines, IL-6, IL-lβ, TNFα) 및 케모카인(MCP-1)을 방출한다(Kalff et al., J. Leukoc. Biol. 63: 683-691(1998); Josephs et al., J. Surg. Res. 86: 50-54(1999); Kalff et al., Gastroenterology 117: 378-387(1999); Kalff et al., Gastroenterology 118: 316-327(2000); Wehner et al., Sugery 137: 436-46(2005)). 이는 번갈아 체순환으로부터 백혈구(단핵구, 호중성 백혈구, T-세포, 비만 세포)의 보충으로 특정지어지는 세포 염증 반응을 유도하고, 여기에서 염증 세포 투과 광도와 장폐색의 정도는 파지티브 관계이다(Kalff et al., Sugery 126: 498-509(1999)). 침투 백혈구는 부가의 사이토카인뿐만 아니라 프로테아제 및 근육신경 기능장애를 부가적으로 초래하는 활성 산소 종을 방출한다(von Ritter et al., Gastroenterology 97: 605-609(1989); Bielefeldt 및 Conklin, Dig. Dis. Sci. 42: 878-884(1997)).

현재, 염증성 장폐색의 관리에 대하여 임상에서 가능한 선택은 거의 없다. 프로키네틱스, 예컨대, 시사프라이드(Cisapride) 및 네오스티그민은 수술 후의 장 운동성을 개선시키는 것으로 나타났다(Shibata and Toyoda, Surg. Today 28: 787-791(1998)). 그러나, 결과는 지속적이지 않고 이들 약물은 심각하고 환자의 감수성을 예상하기 어렵게하는 심장 혈관의 역효과의 위험을 증가시킨다. COX-2 억제제는 동물연구에서 수술 후 소장의 비운동성에 대하여 예방(Schwarz et al., Gastroenterology 121: 1354-1371(2001))적인 것으로 나타났으나, 결장의 비운동성에는 효과가 작은 것으로 나타났다(Turler et al., Anal. Surg., 231(1): 56-66(2002)). 인간에서 임상 I기 시험을 celecoxib와 rofecoxib를 비교하면서 수행(Bouras et al., Neurogastroenterol. Motil. 16: 729-735(2004))하였고, 이들 두 약제는 모두 수술 후의 운동성을 개선시키지 못했다.

수술 후 경구 영양에 대한 빠른 회복은 운동성 패턴의 정상적인 호르몬의 조절을 촉진하는 수단으로서 개선되어 왔다. 이는 장 기능의 회복을 촉진시키고 장의 회복에 대한 다중-모델 접근으로서 사용될 경우 환자의 일부집단에서 편안함을 증진시키는 것으로 발견되었다(Holte & Kehlet, Minerva. Anestesiol., 68(4): 152-156(2002)). 그러나, 이 치료는 병원 재원기간의 길이에 유의한 감소를 초래하지는 않았다. 또한, 호르몬 패턴의 적절한 촉진은 많은 환자들이 견디기 힘든 역치 열량 부하를 요구한다.

장기 장폐색의 진전에 기여하는 가장 공통적인 인자의 하나는 수술 후의 통증 완화를 위한 오피오이드 진통제의 투여이다. 오피오이드는 뇌의 통증 공정 센터의 뉴런에 존재하는 세개의 수용체 서브타입의 하나 이상의 상호작용으로 그들의 진통성 효과를 발휘한다. 현재 가장 보편적인 오피오이드 진통제, 예컨대, 모르핀 은 우선적으로 μ-(뮤) 및 δ(델타)-오피오이드 수용체를 활성화시킴으로써 작동한다. 그러나, 이와 같은 수용체는 또한 장 운동성을 조절하는 위장관 이내의 뉴런에서 발현된다. 염증성 장폐색의 존재 또는 부재시, 수용체의 활성은 유의하게 위장 수축 기능을 억제하여, 장 정체 및 변비를 초래한다. Adalor Corporation은 말초적으로 제한되고 뇌혈관장벽을 통과하지 못하는 선택적인 μ-OR 길항제, Alvimopan을 사용하여 제 I 및 II기 임상 시도를 수행하였다. 오피오이드 진통제와 결합이 제공될 경우, Alvimopan은 오피오이드로 유도된 장 운동성의 억제를 예방하였다(Gonenne et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 3: 784-791(2005)). 플라시보와 비교할 경우, Alvimopan은 장 기능의 회복을 빠르게하고 복부 수술 후, 마일드한 수술-후 장폐색을 경험한 환자의 병원 재원기간을 단축시켰다(Viscusi et al., Surg. Endosc. 20: 64-70(2006)). Alvimopan은 염증을 변경하지는 않았다.

현재, 염증성 장폐색의 치료에 대하여 선택가능한 안전하고 적절한 치료는 없다. 현행 사용가능한 가장 효과적인 요법은 자연적으로 보완되거나 오피오이드 무통의 컴파운딩 효과를 향상시키는 것이다. 이들은 근원적인 장폐색의 원인으로서 염증을 어드레싱하지 않는다. 그러므로, 상당히 충족되지 않은 의료적 요구가 남아있다.

도 1은 U937 세포 용해물과 배양한 후 GLP-2 모방체 Pro 치환 변이체(서열 번호 43 및 44)의 SDS-PAGE 겔의 이미지를 나타낸다.

도 2는 A2G GLP-2 모방체로 처리한 마우스의 점막 스크래핑의 습식 중량의 농도 의존적 증가를 나타낸다.

도 3은 A2G-GLP-2 펩티드로 처리된 마우스에서 장통과의 의미있는 축적을 나타낸다. 통계적 유의성은 쌍을 이루지 않은 스튜던트의 t검정으로 결정되었다.

도 4는 A2G-GLP-2 모방체로 처리된 마우스에서 장통과의 의미있는 축적을 나타낸다. 통계적 유의성은 쌍을 이루지 않은 스튜던트의 t검정으로 결정되었다.

도 5는 뮤린 A2G GLP-2 모방체로 처리된 마우스에서 수술-후 염증성 장폐색과 관련된 위장 통과에서 지연의 의미있는 감쇠를 나타낸다. 통계적 유의성은 Bonferroni post hoc test에 따르는 ANOVA에 의해 결정되었다.

도 6은 복부 수술에 따른 마이엘로퍼옥시다제(MPO)-포함 백혈구의 증가된 수를 갖는 장 근육의 전체 마운트를 나타낸다. 뮤린 A2G GLP-2 모방체의 처리는 침투 세포의 수를 유의하게 감소시키는 반면, IgG2a는 효과가 없었다.

도 7은 도 6에 적용된 세포 수를 갖는 히스토그램을 나타낸다. 통계적 유의성은 Bonferroni post hoc test에 따르는 ANOVA에 의해 결정되었다.

발명의 요약

본 발명의 일측면은 하기 일반적인 화학식 (II)를 갖는 모방체이다:

상기 식에서,

GLP2RAg는 포유류 GLP-2R 효능제이고,

Lk는 폴리펩티드 또는 화학 결합이며,

V2는 면역글로블린 가변 영역의 C-말단 부분이고,

Hg는 면역글로블린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이며,

C_H2는 면역글로블린 중쇄 C_H2 불변 영역이고

C_H3는 면역글로블린 중쇄 C_H3 불변 영역이며

t는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.

본 발명의 다른 측면은 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75 또는 77로 나타내어지는 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 모방체이다.

본 발명의 다른 측면은 서열 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76 또는 78로 나타내어지는 서열 또는 상보성의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 측면은 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75 또는 77로 나타내어지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 측면은 서열 번호 52, 54, 55 또는 74로 나타내어지는 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드이다.

본 발명의 다른 측면은 서열 번호 52, 54, 55 또는 74로 나타내어지는 아미 노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 측면은 GLP-2 폴리펩티드 조성물 또는 GLP-2 모방체 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 장 점막 상피의 상해 및/또는 기능장애로 특정지어지는 징후의 감소 또는 치료 방법이다.

본 발명의 다른 측면은 GLP-2 폴리펩티드 조성물 또는 GLP-2 모방체 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장폐색의 예방, 징후의 감소 또는 치료 방법이다.

본 명세서에서 언급된, 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 한정하려는 것은 아니지만, 본원에서 전체를 통하여 참조로서 인용된다. 단일 문자 아미노산 코드는 당업자들에게 이해되는 것으로서 본원에서 사용된다. 면역글로블린 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 야생형 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인에서 N-말단 아미노산인 잔기를 기초로 하였다.

본 발명은 포유류의 GLP-2의 특성 및 활성을 갖는 단백질 작제물을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에는 면역글로블린, 예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM, 및 이의 임의의 서브클래스, 예컨대, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 배합물의 상이한 모방 타입인 단백질 작제물이고, 하기에 "GLP-2 모방체" 또는 단지 "모방체"로 언급된다. 본 발명의 다른 구체예는 GLP-2의 변이체인 폴리펩티드이고 여기에서 폴리펩티드는 야생형 분자의 성질 및 활성을 갖는다. 본 발명은 또한 GLP-2 모방체, 폴리펩티드, 및 이들 핵산, 숙주 세포, 조성물을 포함하는 벡터 및 GLP-2 모방체 및 폴리펩티드의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

GLP-2 모방체 , 폴리펩티드 및 조성물

본 발명은 일반적으로 하기의 일반적인 화학식 (I)을 갖는 모방체 폴리펩티드에 관한 것이다:

상기 식에서,

Pep는 원하는 생물학적 성질을 갖는 폴리펩티드이고,

Lk는 폴리펩티드 또는 화학 결합이며,

V2는 면역글로블린 가변 영역의 C-말단 부분이고,

Hg는 면역글로블린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이며,

C_H2는 면역글로블린 중쇄 C_H2 불변 영역이고

C_H3는 면역글로블린 중쇄 C_H3 불변 영역이며

t는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.

더욱 특히, 본 발명은 GLP-2R에 결합하여 GLP-2R를 활성화시키는 GLP-2 모방체 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 하기의 일반적인 화학식 (II)를 갖는다:

상기 식에서,

GLP2RAg는 포유류 GLP-2R 효능제이고,

Lk는 폴리펩티드 또는 화학 결합이며,

V2는 면역글로블린 가변 영역의 C-말단 부분이고,

Hg는 면역글로블린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이며,

C_H2는 면역글로블린 중쇄 C_H2 불변 영역이고

C_H3는 면역글로블린 중쇄 C_H3 불변 영역이며

t는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.

본원에서 사용된 "GLP-2R 효능제"는 GLP-2R에 결합하여 GLP-2R을 활성화시키는 임의의 분자를 포함한다. GLP-2R 효능제는 야생형 포유류의 GLP-2 및 GLP-2의 펩티드의 유사체를 포함한다. 예시의 야생형 GLP-2 펩티드는 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는다. 자연적으로 발생하는 GLP-2에서 특정한 아미노산 잔기는 야생형 GLP-2의 GLP-2R 결합 성질을 유지하는 유사체를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 야생형 인간 GLP-2 펩티드의 Ala2는 Ser(A2S) 또는 Gly(A2G)로 치환될 수 있다. 생성된 아미노산 서열을 각각 서열 번호 2 및 3으로 나타내었다.

본 발명에서, 야생형 인간 GLP-2의 신규한 유사체는 GLP-2R 효능제로서 작용하도록 개발되었다. 이들 유사체의 아미노산 서열은 하기에 나타낸 서열 번호 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 및 74(야생형 GLP-2에 대하여 변이체로 디자인됨)로 나타내었다. 이들 유사체는 모방체의 GLP2RAg 성분으로서 유용하다.

GLP-2 펩티드는 자체 회합(self-associate)할 수 있고 동종의 치료적 후보의 개선 및 제조에 대한 문제를 내포하고 있는 것으로 발견되었다. 미국 특허 20040122210 A1 참조. 하기 실시예에서 기재한 바와 같이, 서열 번호 52, 54, 55 및 74로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 pH 7.5에서 모노머가 되도록 디자인되고 감소된 나선형 경향을 갖는다. 따라서, 이들 인간 GLP-2 펩티드 유사체는 모방체 작제물 또는 있는 그대로의 치료 펩티드로서 특히 유용할 것이다.

본 발명의 모방체에서, 링커 단백질(Lk)은 모방체가 대안적인 순응 및 결합 성질을 갖도록 함으로써 구조적 유연성을 제공한다. 예시 링커는 비펩티드 화학 결합 또는 펩티드 결합에 의해 결합되는 20개의 아미노산을 포함하고, 여기에서 아미노산은 자연적으로 발생하는 20개의 아미노산으로부터 선택된다. 링커 단백질은 입체적으로 방해받지 않는 아미노산, 예컨대, 글리신, 알라닌 및 세린의 대부분을 포함할 수 있고 GS, GGGS(서열 번호 19), GSGGGS(서열 번호 20) 및 중합체 또는 이의 배합물을 포함한다. 본 발명의 범위 이내의 다른 예시적 링커는 20개의 잔기보다 더 길 수 있고 글리신, 알라닌 및 세린 외의 다른 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 모방체에서, V2는 면역글로블린 가변 영역, 예컨대, 중쇄 가변 영역의 C-말단 도메인의 일부이다. 예시의 V2 아미노산 서열은 GTLVTVSS(서열 번호 21)이다.

O-당화는 V2 영역에서 두개의 Tyr 잔기에서 일어날 수 있다고 보고되어 있지만, 당화의 정도는 숙주 세포주에 따라 상당히 좌우되고 또한 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. O-글리칸은 블록 애그리게이션 및 단백질 가수 분해를 위하여 작용할 수 있고, 더욱 우수한 생체 내 안정성을 초래한다. 그러나, O-당화는 이질성 및 부족한 재현성 때문에 폐기될 가능성도 있다. 따라서, 대안적인 예시적 V2 아미노산 서열은 GALVAVSS(서열 번호 22)이다.

본 발명의 모방체에서, Hg는 면역글로블린 가변 영역, 예컨대 중쇄 가변 영역의 힌지 도매인의 부분이다. 예시의 Hg 아미노산 서열은 EPKSCDKTHTCPPCP(서열 번호 23) , EPKSADKTHTCPPCP(서열 번호 24), ESKYGPPCPSCP(서열 번호 25), ESKYGPPCPPCP(서열 번호 26) 및 CPPCP(서열 번호 27)를 포함한다.

본 발명의 모방체에서, C_H2는 면역글로블린 중쇄 C_H2 불변 영역이다. 예시의 C_H2 아미노산 서열은 하기를 포함한다:

본 발명의 모방체에서, C_H3는 면역글로블린 중쇄 CH3 불변 영역이다. 예시의 C_H3 아미노산 서열은 하기를 포함한다:

이는 당업자들에게 본 발명의 모방체의 C_H3 영역은 특정의 재조합 시스템에서 발현될 경우 갈라져서 제거된 이의 C-말단 아미노산을 가질 수 있다.

본 발명의 모방체에서, 면역글로블린 분자의 FcRn 스캐빈저 수용체 결합 자리는 C_H2 및 C_H3 영역의 접합에서 보존된다. FcRn 결합은 세포 외부 공간으로 음세포화된 면역글로블린 백(back)의 회복을 가능하게하므로, GLP-2 모방체의 반감기는 GLP-2 펩티드와 비교하여 유의하게 연장될 것으로 예상된다.

본 발명의 모방체의 일 구체예에서, 모노머 구조(GLP2-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3)는 다른 모노머에 비공유결합적으로 결합되거나 공유결합적, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, Cys-Cys 디설파이드 결합으로 결합될 수 있다.

IgG1 및 IgG4 서브클래스는 힌지 영역의 시스테인 수로 달라진다. IgG1 서브클래스의 경우에는, 중쇄 사이의 디설파이드 결합에 관여하는 IgG4 힌지에 두개의 시스테인이 있다. 그러나, 일반적으로 경쇄에 디설파이드 결합하는 것과 관련된 IgG1 힌지의 시스테인은 IgG4 힌지에 존재하지 않는다. 그러므로, IgG4 힌지는 IgG1 힌지보다 덜 유연하다.

또한, 두개의 아이소타입은 보체 의존적 독성(CDC) 및 항체-의존 세포독성(ADCC)을 중재하는 그들의 능력에 따라 달라진다. CDC는 보체 존재 하에 표적을 용해한다. 보체 활성 경로는 보체 시스템(C1q)의 제1의 성분을 동족 항원과 복합된 분자에 결합시킴으로써 개시된다. IgG1은 보체 캐스캐이드 및 연속되는 CDC 활성의 강력한 유도인자인 반면, IgG4는 약간의 보체-유도 활성을 갖는다.

ADCC는 세포-중재 반응이고 여기에서 Fc 수용체(FcRs)(예: 자연 살해(NK) 세포, 호중성 백혈구 및 마크로파지)를 발현하는 비특이적 독성 세포는 표적 세포 상에서 결합 항체를 인지하고 이어서 표적 세포의 용해를 초래한다. IgG1 서브클래스는 Fc 수용체에 고친화적으로 결합하고 ADCC에 기여하는 반면, IgG4는 겨우 약하게 결합할 뿐이다. 활성 이펙터 작용에 대한 IgG4의 상대적 무능은 세포 소멸없이 세포로 모방체를 전달하는 것이 가능하기 때문에 바람직하다.

또한, FcRn 스캐빈저 수용체에 대한 결합 자리는 IgG4 및 IgG1 아이소타입에 존재하고 둘 모두 유사한 결합 성질을 갖는다. 그러므로, 본 발명의 IgG1 및 IgG4 모방체의 약물 동력학은 유사할 것으로 예상된다.

면역글로블린 영역(Hg-C_H2-C_H3)의 힌지-C_H2-C_H3 부분은 또한 광범위하게 변형되어 본 발명의 변이체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 모방체 분자로 수득될 수 없는 구조적 특성 또는 작용 활성을 제공하는 하나 이상의 원래 자리는 제거될 수 있다. 이들 자리는 예를 들어, 잔기의 치환 또는 결실, 자리로 잔기를 삽입 또는 자리를 포함하는 부분을 자름으로써 제거될 수 있다. 예시의 Hg-C_H2-C_H3 변이체를 하기에 기재한다.

1. 디설파이드 결합 형성과 관련된 자리는 본 발명의 모방체에서 다른 아미노산에 의한 결실 또는 치환으로 제거될 수 있다. 통상, 이 모티브에서 존재하는 시스테인 잔기는 제거되거나 치환될 수 있다. 이들 자리의 제거는 이중체 C_H3-C_H2-힌지 도메인이 서로 비공유결합적으로 유지될 수 있도록 하면서, IgG4-기반 작제물에서 모방체-생산 숙주세포 또는 내재성-디설파이드의 결합 존재 하에 다른 시스테인-함유 단백질과의 디설파이드 결합을 막을 수 있다.

대부분의 IgG 타입의 항체, 예컨대, IgG1는 두개의 동일한 중쇄(H) 및 두개의 동일한 경쇄(L)로 제조된, 통상 H₂L₂로 약칭되는 동종이합체 분자이다. 따라서, 이들 분자는 일반적으로 항원 결합, 즉 동일한 결합 특이성을 갖는 IgG 분자의 둘의 항원 결합(Fab) 팔에 대하여 2가이다.

IgG4 아이소타입 중쇄는 그들의 힌지 영역에서 CPSC(서열 번호 34) 모티브를 포함하는 사이- 또는 내부-중쇄 디설파이드 결합(즉, CPSC 모티브에서 두개의 Cys 잔기는 다른 H쇄(사이)에서 상응에는 Cys 잔기와 디설파이드 결합될 수 있거나 제공된 CPSC 모티브 이내에서 두개의 Cys 잔기는 서로 디설파이드 결합(내부)될 수 있다)을 포함한다. 생체 내 아이소메라아제 효소는 사이-중쇄 결합을 내부-중쇄 결합으로 전환 및 그 역의 전환이 가능하다고 사료되었다(Aalberse and Schuurman, Immunology 105, 9-19(2002)). 힌지 영역에서 내부-중쇄 결합을 갖는 그들 IgG4 분자에서 HL 쌍은 서로 공유결합으로 결합되어 있지 않으므로, 그들은 이중특이성, 이종이형체 IgG4 분자를 형성하는 다른 IgG4 분자로부터 유래된 HL 모노머로 재결합되기보다 HL 모노머로 분리될 수 있다. 이중특이성 IgG 항체에서 항체 분자의 두개의 Fab은 그들이 결합하는 에피토프에서 달라진다. Pro를 갖는 IgG4의 힌지 영역에서 Ser228의 치환은 "IgG1-유사 행동", 즉 분자가 중쇄 사이에서 안정한 디설파이드 결합을 형성하도록 함으로써 다른 IgG4 분자와 HL 교환이 쉽지 않다.

2. H-C_H2-C_H3는 본 발명의 모방체를 선택적 숙주 세포와 더욱 경쟁하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 모방체가 E. coli와 같은 박테리아 세포에서 재조합될 경우, 힌지에서 Pro-Ala 서열은 E. coli 효소 프롤린 이미노펩티다아제에 의한 소화를 방지하기 위하여 제거될 수 있다.

3. 힌지 영역의 부분은 선택된 숙주에서 발현된 산물의 이질성의 막기 위하여 본 발명의 모방체에서 다른 아미노산에 의해 결실되거나 치환될 수 있다.

4. 하나 이상의 당화 자리는 본 발명의 모방체에서 제거될 수 있다. 통상, 당화된 잔기(예: Asn)는 모방체에 대하여 Fc-의존, 세포 중재의 세포독성 활성을 제공할 수 있다. 이러한 잔기는 Ala와 같이 당화되지 않는 잔기로 결실되거나 치환될 수 있다.

5. 보체와 상호작용하는 자리, 예컨대, C1q 결합 자리는 본 발명의 모방체에서 제거될 수 있다.

6. 자리는 본 발명의 모방체에서 FcRn 샐비지(salvage) 수용체 외에 Fc 수용체에 결합하는데 영향을 미치도록 제거될 수 있다. 예를 들어, ADCC 활성과 관련된 Fc 수용체는 본 발명의 모방체에서 제거될 수 있다. 예를 들어, IgG1의 힌지 영역에서 Leu234/Leu235의 L234A/L235A로의 변형 또는 IgG4의 힌지 영역에서 Phe234/Leu235의 P234A/L235A로의 변형은 FcR 결합을 최소화하고 면역글로블린의 효능을 감소시켜 보체 의존적 독성 및 ADCC를 중재한다.

본 발명의 일 구체예는 화학식 (II)의 GLP-2 모방체이고 여기에서 Hg-C_H2-C_H3는 IgG4 서브클래스로부터 유래되고 Ser228Pro(S228P) 치환 및 P234A/L235A 변이를 포함한다. GLP-2 펩티드 서열에서 이들 변이체 및 A2S 및 A2G를 갖는 GLP-2 모방체의 완전한 폴리펩티드 서열을 각각 서열 번호 4 및 5에 나타내었다. 이들 서열은 모방체 작제물의 모든 도메인, 즉, GLP2RAg-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3 도메인을 포함한다. 이들 모방체 작제물은 동일하고 FcR-중재 이펙터 작용을 유발하지 않는 안정한 집단일 것으로 예상된다. 본원에 나타낸 치환 및 변이체는 예시적이다; 본 발명의 범위 이내의 Hg-C_H2-C_H3 도메인은 다른 치환, 변이체 및/또는 결실을 포함할 수 있다.

가변 링커 길이를 갖는 본 발명의 GLP-2 모방체를 기반으로 하는 다른 예시의 A2G의 부분적 폴리펩티드 서열을 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11에 나타내었다. 이들 서열은 C_H2 및 C_H3 도메인을 제외한 모든 도메인을 나타낸다. C_H2 및 C_H3 도메인이 작용성 모방체에 포함될 수 있다는 것은 당업자들에게 이해될 것이다.

서열 번호 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 및 57로 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 GLP-2 유사체를 기반으로 한 다른 예시의 본 발명의 GLP-2 모방체의 부분적 폴리펩티드 서열을 각각 서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 및 65에 나타내었다. 이들 서열은 C_H2 및 C_H3 도메인을 제외한 모든 도메인을 나타낸다. C_H2 및 C_H3 도메인이 작용성 모방체에 포함될 수 있다는 것은 당업자들에게 이해될 것이다.

본 발명은 GLP-2R 결합, 활성을 가능하게 하는 GLP-2 모방체를 포함한다. 본 발명의 모방체는 넓은 범위의 친화성으로 GLP-2R와 결합할 수 있다. GLP-2R에 대한 GLP-2 모방체의 친화성은 임의의 적절한 방법, 예를 들어, Biacore 또는 KinExA instrumentation을 사용하는 ELISA 및 경합 결합 어세이(competitive binding assays) 방법에 의해 실험적으로 측정될 수 있다.

본 발명의 GLP-2 모방체 및 폴리펩티드는 장 점막 상피의 염증, 상해 및/또는 기능장애에 의해 특정지어지는 장애 또는 증후를 치료하는데 유용하다. GLP-2의 효과는 또한 골 형성 및 유지에 주목되고, 중추신경계 관련 장애에서 중추 포만 인자로서 그의 역할을 유도한다. 본 발명의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드를 사용하여 치료될 수 있는 질환 또는 증후는 한정하는 것은 아니지만, SBS를 포함하는 GI 질환, 염증성 장질환(IBD), 크론씨병, 대장염, 췌장염, 회장염, 염증성 장폐색(수술 후 및 다른 원인 모두로부터), 암 화학요법 및/또는 방사선 요법과 관련된 점막염, 총비경구영양 또는 허혈에 의한 장 위축, 뼈 관련 장애, 예컨대, 골다공증, 비만을 포함하는 영양 관련 장애, 및 신생아 괴사성 장염을 유도하는 장 상실을 포함하는 소아의 GI 장애를 포함한다. 본 발명의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드는 또한 염증성 장폐색의 예방 및 치료에 사용될 수 있고 염증성 장폐색의 증후를 감소시킨다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은 본 발명의 적어도 하나의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드 및 당업계에 공지된 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이다. 담체 또는 희석제는 용액, 현탁액, 에멀젼, 콜라이드 또는 분말일 수 있다.

본 발명의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드는 치료적 또는 예방적 유효량으로 약제학적 조성물로서 제제화된다. 용어 "유효량"은 통상 효과적인 요법, 즉 추구하는 치료에 대하여 증후 또는 장애의 부분 또는 완전한 경감에 대하여 요구되는 모방체 또는 폴리펩티드의 양을 의미한다. 상술한 증후 또는 장애의 발병의 가망성을 감소하시키고자 하는 예방 치료는 효과적인 요법의 정의 이내에 포함된다.

조성물은 본원에 개시된 질환 상태를 치료하는데 유용한 적어도 하나의 부가적 화합물, 단백질 또는 조성물을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 모방체 또는 폴리펩티드는 글루타민 또는 체중의 증가, 장 치료의 보조 또는 영양 흡수의 개선이 예상되는 다른 영양 보충제와 배합물로서 사용될 수 있다. 또한 항염증제와의 배합물도 포함된다. 본원 및 청구항에서 사용된 "배합물" 은 기재한 시약이 혼합물로서 함께, 단일 시약으로서 동시에 또는 단일 시약으로서 임의의 순서로 연속적으로 포유류에 투여될 수 있는 것을 의미한다.

핵산, 벡터 및 세포주

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드의 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 유의한 동일성을 갖거나 상보적이거나 이를 포함하는 분리된 핵산 분자이다. 본 발명의 다른 측면은 핵산 분자 및 세포주 및 핵산 분자의 발현이 가능한 기관을 코딩하는 본 발명의 적어도 하나의 분리된 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드를 포함하는 재조합 백터를 포함한다. 핵산, 발현 벡터 및 세포주는 통상 본 발명의 모방체를 생산하는데 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 핵산 조성물은 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 74, 75 및 77 중 임의의 하나와 동일하거나 실재적으로 일치하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75 및 77로 나타내어진 폴리펩티드 서열을 코딩하는 예시의 핵산 서열은 각각 서열 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76 및 78로 나타내어진다. 또한 상술한 핵산의 대립형질 변이체도 제공된다.

통상, 본 발명의 핵산은 본 발명의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드의 제조를 위하여 발현 벡터에 사용된다. 본 발명의 범위 이내의 벡터는 바이러스 프로모터 기원 벡터, 예컨대, CMV 프로모터 기원 벡터, 예를 들어, pcDNA3.1, pCEP4 및 이들의 유도체, 배큘로바이러스 발현 벡터, 초파리 발현 벡터 및 포유류의 유전자 프로모터, 예컨대, 인간 Ig 유전자 프로모터에서 기원된 발현 벡터를 포함하는 진핵의 발현에 필수적인 요소를 제공한다. 다른 예시는 원핵의 발현 벡터, 예컨대, T7 프로모터 기원 벡터, 예를 들어, pET41, 락토오스 프로모터 기원 벡터 및 아라비노오스 유전자 프로모터 기원 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드를 발현하는 세포주에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시의 진핵 세포는 포유류의 세포, 예컨대, 한정하고자 하는 것은 아니나, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, HepG2, 653, SP2/0, NSO, 293, HeLa, 골수종 임파종 세포 또는 이의 임의의 유도체이다. 가장 바람직하게, 숙주 세포는 HEK293, NSO, SP2/0 또는 CHO 세포이다. 본 발명의 세포주는 적어도 하나의 GLP-2 모방체를 안정적으로 발현할 수 있다. 세포주는 안정적으로 생산되거나 당업계에 공지된 한시적 트랜스펙션 방법으로 생산될 수 있다.

본 발명은 또한 조건 하에 세포주를 배양하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드를 발현시키는 방법을 제공하고, 여기에서 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드는 검출 또는 회수가능한 양으로 발현된다. 본 발명은 또한 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드가 검출가능하거나 회수가능한 양으로 발현할 수 있도록 조건 하에 생체 내 또는 인시추(in situ)에서 핵산을 코딩하는 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드의 번역을 포함하는, 적어도 하나의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

GLP-2 모방체는 한정하는 것은 아니나, 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 결합 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실애퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지된 방법으로 회수되고 정제될 수 있다. 또한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 정제에 사용할 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 GLP-2 유래 폴리펩티드는 당업자들에게 공지된 화학적 합성 기술로 제조될 수 있다. 재조합 또는 화학적 방법에 의해 생산된 본 발명의 폴리펩티드는 당업자들에세 공지된 방법으로 회수 및 정제될 수 있다.

사용 방법

GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드는 특히 연구 시약 및 치료제로서 유용하다. 일 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 포유류에게 제공하는 것을 포함하는, GLP-2의 생물학적 활성의 변형 방법에 관한 것이다. GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드는 GLP-2R를 통하여 세포 신호 캐스캐이드를 활성화시킬 수 있다. 특히, GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드는 GLP-2R의 효능제로서 작용할 수 있다. 용어 "효능제" 는 가장 넓은 의미로 사용되고 GLP-2R의 하나 이상의 생물학적 활성을 직접적 또는 간접적으로, 부분적 또는 전체적으로 활성, 증가 또는 개선시킬 수 있는 분자를 포함한다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 적어도 하나의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 GLP-2 관련 증상 또는 질환의 증후를 감소 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료하기에 적절한 증상 및 질환은 한정하는 것은 아니지만, SBS를 포함하는 GI 질환, 크론씨병, 및 소아의 GI 장애, 암 화학요법과 관련된 점막염, IBD, 염증성 장폐색, 및 상술한 다른 질환 및 증상을 포함한다.

GLP-2는 장신경계의 뉴런 상 및 장내분비 세포를 포함하는 GLP-2 상에서 주로 발견되는 GLP-2R와 선택적으로 상호작용한다(Guan et al., Gastroenterology 130: 150-164(2006)). GLP-2의 주요 기능 중의 하나는 융모 선와(villus crypt)에서 원주 세포분화를 증진시키는 것이고 여기에서 이는 상피 세포 회전 및 점막 상처 치료를 강화시키고(Bulut et al., Regul. Pept. 121: 137-43(2004)), 점막 방어 작용(Benjamin et al., Gut 47: 112-119(2000))을 강화시키며, 아포토시스에 의한 세포 자살을 억제시킨다(Brubaker 및 Drucker, Endocrinology 145:2653-2659(2004)). GLP-2R는 선와 원주 상피 세포에서 발현되지 않으므로 이들 효과는 신경에 좌우되는 것으로 나타났다(Bjerknes and Cheng, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 12497-12502(2001)). 장의 뉴런 상에 GLP-2의 존재는 GLP-2가 장염증에 중요한 역할을 하는 운동성뿐만 아니라 신경계-면역계 상호작용도 변형시킬 수 있다는 것을 시사한다.

따라서, 본 발명은 또한 GLP-2 폴리펩티드 조성물 또는 GLP-2 모방체 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장폐색을 치료 또는 염증성 장폐색 증후를 감소, 예방하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용한 "염증성 장폐색"은 위장관, 예를 들어, 위, 소장 및/또는 결장의 임의의 부분의 장폐색일 수 있다. 또한, "염증성 장폐색"은 장폐색, 예를 들어, 복부 수술, 예컨대 이식 수술 또는 이식 수술, 창자(bowel) 수술, 예컨대, 창자 절제술 및 정형외과 수술 이외의 복부 수술을 포함하는 수술; 외상성의 상해, 예를 들어, 낙상, 자동차 사고, 신체 폭력으로부터 초래된 임의의 인자로부터 발생되거나 외상성의 상해에 의한 임의의 휴유증, 예를 들어, 사지 골절, 늑골 골절, 척추의 골절, 흉부 병변, 허혈, 후복막 혈종; 복강내 염증, 예를 들어, 복강내 패혈증, 급성 충수염, 담낭염, 췌장염, 요관 산통, 기저 폐렴; 심근 경색; 대사 장애; 또는 이의 임의의 배합으로부터 발생할 수 있다.

상술한 바와 같이, GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드 약제학적 조성물은 유효량의 적어도 하나의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 제공된 요법에 있어서 치유적 또는 예방적 유효량은 통상적으로 투여의 수단, 표적 사이트 및 투여된 다른 의약을 포함하는 다른 요소에 의해 좌우될 것이다. 따라서, 치료는 안정성 및 효율성을 최대화하도록 적정화될 필요가 있을 것이다.

본 발명의 방법은 부차적으로 병용투여 또는 상술한 질환 목록을 치료하기 위하여 임의의 기준 요법을 갖는 배합 요법을 임의로 포함할 수 있다.

투여의 모드는 숙주에 약제학적 유효량의 본 발명의 GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드를 전달하기 위한 임의의 적절한 경로가 될 수 있다. 예를 들어, GLP-2 모방체 또는 폴리펩티드는 장관외 투여, 예컨대, 장관외 투여, 예컨대, 피하, 근육내, 피내, 정맥내 또는 비강 투여 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 수단을 통하여 전달될 수 있다.

본 발명은 또한 부가적으로 하기 실시예로서 설명된다. 이들 실시예는 본 발명의 측면을 단지 설명하고자 하는 것이며 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

포유류 세포에서 GLP-2 모방체의 클로닝 , 발현 및 정제

A2S GLP-2를 코딩하는 핵산 서열을 2-단계 PCR 증폭으로 제조하였다. 첫번째 단계의 증폭은 정방향 프라이머 5'-CCAAAGTATACAGGCGCATAGCGATGGTTCTTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3'(서열 번호 37) 및 역방향 프라이머 5'-TTGGTCTGAATCAACCAGTTTATAAAGTCTCGAGCGGCAAGATTATCAAGAATGGTGTTCATCTC-3'(서열 번호 38)를 이용하여 수행하였다. 융해, 어닐링 및 연장 온도를 각각 96℃, 48℃, 및 72℃로 설정하였다. 반응을 3 사이클 수행하였다.

두번째 단계의 증폭을 위하여, 정방향 프라이머는 NotI 제한 효소 인식 자리를 포함하고 역방향 프라이머는 BamHI 자리를 포함하였다. 정방향 프라이머의 서열은 5'-TTTGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCG-3'(서열 번호 39)이고 역방향 프라이머의 서열은 5'-AAAGGATCCGTCAGTGATTTTGGTCTGAATCAACCAG-3'(서열 번호 40)이다. 융해, 어닐링 및 연장 온도를 각각 96℃, 48℃ 및 60℃로 설정하였다. 반응을 3 사이클 수행하였다.

A2G GLP-2를 코딩하는 핵산 서열은 증폭의 첫번째 단계에서 사용된 정방향 프라이머가 5'-CCAAAGTATACAGGCGCATGGCGATGGTTCTTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG- 3'(서열 번호 41)인 것을 제외하고는 동일한 절차로 수행하였다.

증폭된 PCR 산물(A2S 및 A2G GLP-2)을 기준 클로닝 절차를 사용하여 인간 IgG4 ΔCH1, Ser에서 Pro, Ala/Ala 발현 벡터, CMV 프로모터 기원의 NotI/BamHI 자리로 클론하였다.

A2S 및 A2G GLP-2 IgG4 모방체를 HEK 293E 세포에서 한시적으로 발현시키고 기준 절차에 따라 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 조건화 배지로부터 정제하였다. 단백질 A 친화성 컬럼으로부터 용출된 물질을 한층 더 정제하기 위하여 부차적으로 크기 배제 컬럼에 적용하였다.

정제된 A2S 및 A2G GLP-2 모방체를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 정적 광산란 분석(SEC-SLS)에 커플된 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 환원 및 비환원 변성 조건 하에서 SDS-PAGE 상의 정제된 모방체의 이동은 기대된 범위 내에 이루어졌다. SEC-SLS에 의한 분석은 모방체의 다이머에 상 응하는 약 123KD의 분자량을 갖는 단백질은 나타내었다. GLP-2 모방체는 SDS-PAGE 겔 상에서 모노머로서 이동하기 때문에, 비공유결합 상호작용을 통하여 다이머화된다.

실시예 2

cAMP 발현 어세이

GLP-2 모방체의 시험관 내 활성 평가를 위하여, cAMP 발현 어세이를 수행하였다. 이 목적을 달성하기 위하여, 변이된 인간 GLP-2R을 발현하는 클론 세포주를 HEK 293E 세포에 트랜스팩션하여 생산하였다. 변이된 인간 GLP-2R는 C-말단 세포내 영역(서열 번호 36) 이내의 세개의 아미노산 위치에서 야생형 인간 GLP-2R(서열 번호 35)와 달라진다. GLP-2 펩티드는 이 세포주에서 cAMP 발현을 자극하고 이 자극은 특이적인 반면, 대조 펩티드는 cAMP 발현을 자극하지 않는다.

A2S 및 A2G IgG4 GLP-2 모방체를 재조합 세포주에서 cAMP 발현을 자극하는 효능에 대하여 상응하는 GLP-2 펩티드(A2S 및 A2G)와 비교하였다. 요약하면, 세포를 30분 동안 개별적으로 GLP-2 모방체 또는 GLP-2를 배양하였다. cAMP 발현을 cAMP Direct Screen System(Cat. No. CSD 200, Applied BioSystems, Bedford, MA)을 사용하여 정량하였다. A2S 및 A2G 펩티드에 대한 EC₅₀은 각각 0.5 nM 및 0.8 nM이었다; A2S 및 A2G 모방체에 대한 EC₅₀은 각각 2.2 nM 및 3.8 nM이었다. 그러므로, 이 어세이에서 GLP-2 모방체의 효능은 펩티드보다 ~4배 작었다.

실시예 3

GLP-2 모방체 변이체

GLP-2 모방체 상에서 링커 길이의 효과를 조사하기 위하여, 다양한 링커 길이를 갖는 상이한 작제물을 생산하였다. 코어 영역의 서열을 표 1에 나타내었다.

이들 변이체는 한시적으로 HEK 293 세포에서 발현되었고, SDS-PAGE에 의해 정제 및 분석되었다. SEC-SLS에 의한 분석은 모방체에 상응하는 하나의 다이머 외에 모방체의 모노머에 상응하는 65-70 kDa의 분자량을 갖는 피크를 나타내었다. 이는 더 긴 링커 길이, 모노머 집단의 더 높은 부분에서 관찰되었다.

링커 길이 및 V2 영역 변이체를 실시예 2에서 기재한 바와 같이 cAMP 발현 어세이로 테스트하였다. EC₅₀으로 측정한 바, 데이터는 GLP-2 모방체 활성이 링커 길이와 직접적으로 관련있다는 것, 즉 더 긴 링커를 갖는 모방체가 더 높은 활성을 갖는다는 것을 증명하였다(표 1).

표 1. 다양한 링커 길이를 갖는 GLP-2 모방체의 코어 아미노산 서열 및 EC ₅₀

표에서 ^*는 단지 아미노산 수가 1-59인 서열 번호 5를 의미한다.

서열번호 11^**은 V2 영역 변이체를 나타낸다.

GLP-2 모방체의 안정성을 증가시키기 위하여, V2 또는 Hg 영역의 단백질 가수분해 절단 민감성 자리(cleavage sensitive site)에서 아미노산 잔기가 Pro로 치환된 일련의 변이체를 작제하였다. GLP-2 모방체 변이체의 코어 영역 서열을 하기 표 2에 나타내었다.

표 2. Pro 치환을 갖는 GLP-2 모방체의 코어 아미노산 서열 및 EC ₅₀

Pro 치환 변이체가 HEK 293 세포에서 한시적으로 발현되었고, SDS-PAGE에 의해 정제 및 분석되었다. cAMP 발현 어세이로부터의 데이터 분석을 EC₅₀으로 측정한 바, 이들 GLP-2 모방체 변이체의 활성은 A2G GLP-2 모방체(서열 번호 5)의 활성보다 우수한 것으로 증명되었다.

정제된 Pro 치환 변이체를 CompleteMini U937 프로테아제 억제제 정제(Cat. No. 1 836 153, Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 존재 하에 세포 용해물과 0, 12 또는 24 시간 동안 배양하였다. 이후에 GLP-2 모방체 변이체를 단백질 A 비드를 사용하여 정제하고 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. 도 1에서와 같이, A2G GLP-2 모방체(서열 번호 5)와 비교할 경우, 테스트 기간 24 시간 동안 Pro 치환 변이체(서열 번호 43 또는 44)에서 더 작게 분해되었다. 결과적으로, Pro 치환 변이체는 시험관 내 단백질 가수 분해에서 더욱 내성이 있다.

실시예 4

소장에서 GLP-2 모방체의 점막 중량 증가 촉진

생체 내에서 GLP-2 모방체의 활성을 증명하기 위하여, CD1 마우스에 GLP-2 모방체를 주사하고 소장의 끝부분을 측정하였다. 요약하자면, 암컷 CD1 마우스에 A2G GLP-2 펩티드(서열 번호 3), A2G GLP-2 IgG4 모방체(서열 번호 5) 또는 대조 모방체를 10일 동안 매일 피하 주사하였다. 이어서, 마우스를 희생시키고 소장을 제거하여, 살린으로 채우고, 하기에 기재된 바와 같이 수행하였다.

특정적인 하기 4cm 부분을 배양하였다: (1) 유문(십이지장)의 바로 말단, (2) 트라이츠(Treitz; 공장) 인대의 2cm 떨어진 시작부분, (3) 맹장(회장)의 거의 바로 말단. 약 4cm 인접한 맹장에서 트라이츠 인대의 ~6 cm 떨어진 곳로부터 남아있는 소장을 점막 스크래핑을 제조하는데 사용하였다. 나머지의 인접 및 말단으로부터 동일한 거리를 15 cm 부분이 남을 때까지 제거하고, 나머지를 세로로 자르고, 세정하고, 유리 현미경용 슬라이드의 짧은 말단을 사용하여 점막 층을 제거하였다. 인택트 장 구획 및 점막의 습윤 중량를 측정하였다.

상이한 마우스로부터 채취한 공막 및 회장 사이의 15 cm 구획의 점막 스크래핑의 중량은 도 2에 나타낸 바와 같다. A2G GLP-2 모방체를 주사한 마우스에 있어서, 점막 습윤 중량에서 점막 농도 의존적 증가가 관찰되었다. 0.8 및 8 mg/kg(각 0.26 및 2.6 nmole)에서의 증가는 대조 모방체(각 p<0.0001 및 p<0.0004)와 비교하여 통계학적으로 유의하였다.

통계학적으로 유의적인 증가(p<0.0001)가 또한 2.5 mg/kg(13.3 nmole)에서 A2G GLP-2 펩티드를 주사한 마우스에서 나타났다. 비교할 경우, A2G GLP-2 모방체는 생체 내에서 A2G GLP-2 펩티드보다 50-배(몰 기준으로) 더 낮은 농도에서 효과 적이었다.

실시예 5

GLP-2 모방체의 약물 동력학

GLP-2 모방체의 약물 동력학을 측정하기 위하여, CD1 마우스를 3mg/kg의 A2G GLP-2 모방체(서열 번호 5)로 정맥내 또는 피하 투여하였다. 혈액을 상이한 시점에서 프로테아제 억제제를 함유한 구연산 버퍼에 채취하여 생체 외 분해의 가능성을 최소화하고 혈장을 원심분리로 분리하였다.

활성 모방체를 측정하기 위하여 시간 분해 형광(TRF) 어세이를 사용하였다. 활성 모방체는 모방체의 Fc 영역에 부착할 때까지 펩티드의 인택트 N-말단에 영향을 미친다.

TRF 실험을 기초로 하여, 마우스에서 계산된 A2G GLP-2 모방체의 반감기는 26.5 시간이었다. 반면, 인간에서 보고된 GLP-2 펩티드이 반감기는 7.2 +/- 2 분(Hartmann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 2884-2888(2000))이었다. 그러므로, A2G GLP-2 모방체의 반감기는 GLP-2 펩티드의 반감기보다 200-배 이상이다.

유사한 실험에서, 시아노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에 1 mg/kg의 A2G GLP-2 모방체를 정맥 내 투여하였다. TRF 데이터를 기초로하여, 시아노몰구스 원숭이에서 계산된 A2G GLP-2 모방체의 반감기는 4.8일이었다.

실시예 6

GLP-2 모방체의 약력학

이의 확장된 약물 동력학을 기초로 하여, GLP-2 모방체는 더 긴 반응 기간을 가질 것으로 예상된다. A2G GLP-2 모방체의 약력학을 평가하기 위하여, 마우스를 매일, 격일로, 주마다 또는 연구 시작 시 단지 한번을 투여하였다. 동물 취급의 대조를 위하여, 마우스에 A2G GLP-2 모방체를 제공하지 않은 날에, 이들에 네가티브 대조 모방체, 즉, GLP- 2 펩티드 없는 모방체 면역글로블린 스캐폴드를 주사하였다. A2G GLP-2 모방체 및 네가티브 대조의 투여는 모든 그룹에 대하여 4 mg/kg(1.3 nmoles/kg)으로 하였다. 연구 기간은 11일이었고 조직은 실시예 4에서 기재한 바와 같이 프로세스하였다. 주마다 한번 A2G GLP-2 모방체가 투여된 마우스는 대조 모방체와 비교하여 유의하게 증가된 점막 중량을 가졌다. A2G GLP-2 모방체를 매일 또는 격일로 투여할 경우 더욱 차이가 생겼다. 유사한 패턴이 소장 부분의 습윤 중량에서 관찰되었다. 십이지장 및 공장 둘 모두에서, 대조 모방체를 통한 중량에서 유의한 증가가 단일 투여 실험을 제외한 모든 처방에서 나타났다.

실시예 7

GLP-2에서 변이체의 펩티드 다이머화의 예방

고농도에서 야생형 GLP-2 펩티드(서열 번호 1)를 다이머화하였다. 예를 들어, PBS(pH 7.5)에서, GLP-2가 0.4 mg/mL에서는 모노머로서 존재하지만 모노머(약 20%)의 혼합물로서 존재하고 역으로 2 mg/mL(데이터로 나타내지 않음)에서는 자가- 결합 다이머(약 80%)로 존재한다. 자가-결합은 동일한 치료의 발달 및 제조에 대한 면역성 테스트를 갖는다.

펩티드 유사체(서열 번호 52, 54, 55 및 74)는 야생형 GLP-2 생물학적 활성을 유지하도록 디자인되었고 고농도에서 모노머로 존재한다. GLP-2(A2G, L1 7Q)(서열 번호 54) 및 GLP-2(A2G, N16G, L17Q)(서열 번호 55)를 분석하고 >95%의 순도로 정제하였다. 펩티드 GLP-2(서열 번호 1), GLP-2(A2G)(서열 번호 3) 및 GLP-1(서열 번호 79)은 유사체의 특성에서 대조로서 포함된다.

펩티드의 용액 분자량을 SEC-SLS로 측정하였다. 요약하자면, 0.4 내지 2.0 mg/mL에서 PBS(pH 7.5) 중의 펩티드 용액을 Superdex 펩티드 컬럼(Amersham Pharmacia)을 통하여 분획하였다. 용출된 피크를 690 nm에서 정적 광산란으로 모니터링하고 용액 분자량을 Astra 소프트웨어 패키지(Wyatt Inc.)를 사용하여 UV 280 nm에서 결정하였다.

1 mg/㎖에서, GLP-1이 모노머 크기 이내의 분자량을 갖는 단일 피크로서 용출되었다. GLP-2 및 GLP-2(A2G)는 유사한 오버랩핑 다이머 및 모노머 피크의 분포를 나타내었다. 유사체 펩티드 GLP-2(A2G, L17Q) 및 GLP-2(A2G, N16G, L17Q) 둘 모두는 주로 모노머 펩티드를 갖는 일관된 분자량의 단일 피크로서 용출되었다.

테스트된 펩티드의 2차 구조는 PBS 중의 0.2 mg/mL 펩티드 용액을 사용하여 결정하였다. 요약하자면, CD 스펙트럼을 0.1 cm 통로 길이 세포에서 25℃에서 1 nm 간격으로 3회 회수하였다. 2차 구조는 CD 스펙트럼 소프트웨어(CD 스팩트럼 Deconvolution software 2.1)를 사용하여 CD 스펙트럼을 장착함으로써 결정하였다. 테스트된 모든 펩티드는 알파 헬릭스 존재에 상응하는 피크를 포함하였다. 그러나, 유사체 펩티드 GLP-2(A2G, L17Q) 및 GLP-2(A2G, N16G, L17Q)에서 헬릭스 함량은 GLP-1의 헬릭스 함량과는 유사하고, GLP-2 및 GLP-2(A2G)의 헬릭스 함량보다는 낮은 ~17%이었다(표 3).

표 3. GLP 펩티드에서 헬릭스 및 랜던 코일 구조의 퍼센트

또한, 트리플루오로에탄올(TFE)은 펩티드에서 헬릭스 형성을 유도하는 것으로 공지되어 있다(Soennichsen et al., Biochemistry 31: 8791(1992)). 따라서, TFE를 사용하여 헬릭스 경향 분석을 수행하였다. 요약하자면, 테스트된 펩티드를 0, 1, 5, 15, 33 또는 50% TFE를 포함하는 PBS(pH 7.5)에서 0.2 mg/mL로 희석하였다. CD 스팩트럼을 회수하고 CD 플랏을 데이터 에버리징, 버퍼 삭감 및 곡선 스무딩 후에 산출하였다. 헬릭스 경향 값은 222 nm에서 평균 잔기 타원율(MRE) 대 %TFE 플랏으로부터 수득하였다. 222 nm에서 CD 스팩트럼의 50% 변형에 영향을 주는 TFE의 농도를 헬릭스 경향의 측정으로서 사용하였다.

GLP-2 및 GLP-2(A2G)가 최대 헬릭스 신호에 대한 변형에 대하여 ~16% TFE를 요구하는, 보다 큰 헬릭스 경향을 나타내는 결과를 보였다. 상대적으로, GLP-1은 헬리칼 변형에 대하여 >20% TFE를 요구하는, 더 낮은 헬릭스 경향을 가졌다. 유의적으로, 유사체 펩티드 GLP-2(A2G, L17Q) 및 GLP-2(A2G, N16G, L17Q) 둘 모두는 헬릭스 변형에 대하여 >20% TFE를 요구하였고, GLP-2보다 GLP-1과 더욱 유사하였다. 그러므로, L17Q 치환은 GLP-2 펩티드의 헬릭스-형성 효능을 감소시킨다.

실시예 8

GLP-2에서 변이의 모방체 다이머화의 예방

A2G, L17Q(서열 번호 75) 및 A2G, N16G, L17Q(서열 번호 77) 유사체를 갖는 GLP-2 모방체를 코딩하는 핵산 서열을 QuickChange XL 키트(Stratagene)를 사용하여 제조하였다. 이 모방체 변이체를 HEK 293E 세포에서 한시적으로 발현시키고 실시예 1에서 기재한 바와 같이 하기 절차에 따라 정제하였다. SEC-SLS 분석을 기초로 하여, GLP-2(A2G, N16G, L17Q) 모방체는 모노머를 갖는 일관된 분자량을 나타낸 반면 GLP-2(A2G, L17Q) 모방체는 모노머 및 다이머 혼합물이 반영된 분자량을 나타내었다.

실시예 9

GLP-2 유사체 모방체의 시험관 내 활성

GLP-2 유사체의 시험관 내 활성을 cAMP 발현 어세이로 테스트하였다. 이 어세이는 HEK 293E 세포에서 변이된 huGLP-2R을 발현하는 세포주를 이용하는, cAMP Direct Screen System(Applied Biosystems)을 기초로 하였다. 0.5% BSA를 갖는 PBS 중 0.01 nM 내지 1.0 uM의 농도 범위의 펩티드를 96-웰 플레이트 중에 현탁된 ~50,000 세포에 첨가하였다. 37℃에서 30-분 배양한 다음, 용해 버퍼를 제조자의 지침(Applied Biosystems Luminescence 프로토콜: cAMP-Screen Direct System)에 따라 발광 시약(Applied Biosystems)을 첨가하였다. 발광을 TopCount 액체 섬광 계수기(PerkinElmer)를 사용하여 정량하였고, 데이터를 Softmax 소프트웨어(Molecular Devices Corporation)를 사용하여 프로세스하였다. cAMP 수준의 플랏 대 펩티드 농도로부터 수득된 EC-50 값을 하기 표 5에 기재하였다.

표 5: cAMP 수준의 플랏 대 펩티드 농도로부터 수득된 GLP-2 펩티드의 EC-50 값

데이터는 야생형 GLP-2와 비교하여 GLP-2(_{A2G, N16G , L17Q}) 및 GLP-2(_{A2G, L17Q})가 각각 단지 2x- 및 3x- 덜 활성적임을 나타낸다.

실시예 10

A2G-GLP-2 펩티드의 상부 GI 통과의 촉진

정상 마우스에서 상부 위장관 통과 상에서 A2G-GLP-2의 효과 테스트를 랜덤하게 2 그룹에 할당하였다(테스트 그룹 당 14 마리). 각 그룹에 연속적인 10일 동안 A2G-GLP-2 펩티드(50 ㎍/마우스) 또는 인산 완충액 비히클을 매일 피하 주사(총 부피 200 ㎖)하였다.

연구 중, 상부 위장관 통과를 카르민 염료 기술을 사용하여 측정하였다. 마우스에 0.5%(w/v) 메틸셀룰로오스와 혼합된 카르민 코치닐 분말의 6%(w/v) 용액의 테스트 사료를 18 게이지의 피딩 튜브(feeding tube)로 위장내 투여하였다. 이어서 테스트 사료를 경구 투여하고, 마우스를 그들의 사육 상자에 두었다. 마커 사료 투여 20분 후, 마우스를 경추 탈골로 빠르게 희생시키고 위장관 전체를 결장에서 떨어진 부분으로부터 위의 유문을 향하여 절단하였다. 잘라낸 소화관을 기관이 늘어나는 것을 막기 위하여 직선 미터 스케일 룰러에 대하여 세로로 평행하게 배열하였다. 소장을 통하여 카르민 염료 전면에 의해 가로지르는 직선 거리를 소장의 총 길이와 함께 측정하였다. 상부 위장관 통과를 20분의 테스트 기간 동안 카르민 염료 전면에 의해 가로지르는 총 소장의 퍼센트로 표현하였다: 이동된 소장 % = [소장(cm)을 통한 염료 전면에 의해 가로지는 거리/ 전체 소장 길이(cm) x 100]. 도 3에서 나타낸 바와 같이, A2G-GLP-2 처리는 상부 위장관 통과의 촉진을 유도하였다.

실시예 11

GLP-2 모방체의 상부 GI 통과의 촉진

정상 마우스에서 상부 위장관 통과 상의 GLP-2 모방체의 효과를 테스트하기 위하여, 마우스를 랜덤하게 2 그룹에 할당하였다(테스트 그룹 당 4 마리). 각 그룹에 위장 통과 측정하기 4일 전에 A2G GLP-2 모방체(서열 번호 5)(4 mg/kg) 또는 IgG4 네가티브 대조의 단독 주사를 제공하였다.

연구 중, 상부 위장관 통과를 FITC-덱스트란 방법을 사용하여 측정하였다. 이 방법은 위장 통과의 측정 및 위장관을 따라 테스트 사료의 분포 패턴의 판독 둘 모두를 제공한다. 마우스에 150 ㎖의 FITC-덱스트란 용액(0.5% 메틸셀룰로오스/탈이온수 중의 플루오로세인-이소티오시아네이트에 결합된 5 ㎎/㎖의 분자량 70,000의 덱스트란)의 테스트 사료를 18 게이지의 피딩 튜브로 위장내 투여하였다. 이어서 FITC-덱스트란 테스트 사료를 경구 투여하고, 마우스를 그들의 사육 상자에서 회복시켰다. 30분의 테스트 기간이 통과의 촉진을 검출하기 위한 가장 최적의 기간이었던 반면, 45분의 테스트 기간이 지연된 통과 검출에 있어서 최적이었다. 다음으로, 적절한 테스트 기간에, 마우스를 이산화탄소에 노출시켜 희생시켰다. 하부 식도 괄약근에서 말단 결장으로부터 전체 위장관을 제거하였다. 장 구획을 장측 피막을 따라서 열었다. 위의 조직 및 루미날 함량, 소장의 10 동량의 구획, 결장의 3 동량의 구획을 각각 1 ㎖의 PBS를 포함하는 에펜도르프 튜브에 넣었다. 조직을 탁상형 볼텍스 상에서 강하게 혼합하고, 고체 물질을 원심분리하여 펠렛화하였다. 선명한 상청액의 분취물을 96-웰 발광 플레이트 리더기 상에서 각 장의 구획에서의 발광 신호의 광도를 정량하기 위하여 2회 판독하였다. 이 값은 기하 중 심(GC)을 계산하기 위하여 사용하였고, 이는 위장관을 따라 형광 신호의 평균 분포를 측정함으로써 정의된다: GC = ∑(구획 당 총 형광 신호의 % × 구획 수/100. 더 높은 값은 1 내지 15의 스케일 상에서 더 빠른 통과율을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, GLP-2 모방체 처리의 단일 투여는 상부 위장관 통과의 촉진을 유도하였다. FITC-덱스트란의 분포 패턴에서 모방체-유도 쉬프트는 상부 패널에 나타난다. 위에서 감소된 라벨링 및 소장에서 더욱 떨어진 구획의 라벨의 벌크의 전반적인 쉬프트가 있다. GC는 통계적 비교에 있어서 더 낮은 패널로 계산된다. 정상 마우스는 테스트 기간 30분 동안 GC = 6을 나타내었고, 이는 IgG4 스캐폴드 처리에 의해 변하지 않았다. GLP-2 모방체의 처리는 GC를 7.5로 증가시켰다.

실시예 12

GLP-2 모방체의 수술-후 염증성 장폐색과 관련된 손상된 GI 운동성의 약화

마우스에서 인간 IgG4의 면역원성 때문에, 뮤린 GLP-2 모방체, 즉, 뮤린 IgG2a 스캐폴드(서열 번호 80)의 인간 A2G-GLP2 펩티드를 하기 실험에 사용하였다.

수술-후 염증성 장폐색과 관련된 손상된 GI 운동성 상에서 GLP-2 모방체의 효과를 테스트 하기 위하여, 마우스를 랜덤하게 3개의 그룹(그룹 당 8마리)으로 나누고 2 mg/kg 뮤린 A2G-GLP-2 모방체, IgG2a 또는 PBS로 처리하였다. 1 시간 후, 마우스를 개복술하고 소장을 촉진하였다. 요약하자면, 수컷 CD-I 마우스를 이소풀루란을 흡입시켜 희생시키고 수술을 위하여 준비하였다. 복부의 털을 제거하고 방부성 용액으로 처리하였다. 동물을 외과용 드레이프로 덮었다. 복부를 정중 개복 술(mid-line laparotomy)을 통하여 개복하고, 전체 소장을 멸균된 드레이프 상으로 적출하였다. 두개의 촉촉하고 멸균된 면봉(cotton-tipped applicator)을 사용하여, 소장을 트라이츠 인대에서 회맹 접합부까지의 길이를 따라 부드럽게 압축하였다. 이어서 소장을 복강으로 다시 넣고 절개를 봉합하여 닫았다. 그 후, 마우스를 그들의 사육 상자에 두었다. 8마리의 4번째 그룹을 처리하지 않은 대조로 제공하였다.

모든 마우스에 수술 48 시간 후 FITC-덱스트란의 경구 테스트 사료를 제공하였다. 위장 통과는 경구 영양 45분 후 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 처리하지 않은 대조는 정상적인 45-분 통과(GC = 8.2)를 나타내었다. PBS-처리 동물에서 복부 수술은 유의적인 지연을 유도하였다. IgG2a 처리는 통과에서 수술적으로 유도된 지연 상에 효과가 없었지만, 뮤린 A2G-GLP-2 모방체의 처리는 통과에서 유의한 개선을 유도하였다.

실시예 13

GLP-2 모방체의 수술-후 염증성 장폐색과 관련된 세포 염증의 감소

세포 염증 상에서 GLP-2 모방체의 효과를 테스트하기 위하여, 마우스에서 수술-후 염증성 장폐색을 실시예 12에서 기재한 바와 같이 유도하였다. 마이엘로퍼옥시다제 조직화학을 수술 후 마우스의 정중-소장으로부터 배양된 조직 상에서 수행하였다.

요약하자면, 정중-소장의 구획을 실시예 12에서 기재한 바와 같이 원심분리 튜브로부터 회수하였다. 근육층의 전체 양을 Sylgard^®이 정열된 페트리 디쉬에 조직을 핀으로 고정함으로써 준비하고 조직을 이의 길이의 2배 및 이의 폭의 1.5배로 늘렸다. 점막을 정밀한 절개로 제거하였다. 이어서 전체 점막을 1 시간 동안 100% 에탄올로 고정시키고, PBS로 3회 세정하고, 0.1% 과산화 수소 및 1 mg/㎖의 Hanker-Yates 시약을 함유한 PBS에서 20분 동안 배양하였다. 이어서 PBS로 두번째 세정을 하고, 전체 양을 유리 슬라이드, 커버 슬립에 적재하고, 광학 현미경 상에서 관찰하였다. 백혈구를 포함하는 마이엘로퍼옥시다제를 6 내지 8 인접 200 ×광학 필드에서 계수하고 평균 세포 수를 계산하고 기록하였다.

Hanker-Yates 시약을 사용하여 마이엘로퍼옥시다제(MPO) 활성에 대하여 염색된 장 점막의 대표적인 전체 양을 도 6에 나타내었다. 검은색의 점은 소장의 근육층을 침투하는 MPO-파지티브 백혈구를 나타낸다. 처리하지 않은 마우스로부터 배양된 조직에서 소수의 MPO-파지티브 세포가 발견되었다. 백혈구를 침투한 대다수에서 유의한 증가는 소장의 외과적 조작 전에 PBS로 처리한 마우스에서 발견되었다. IgG2a의 처리는 침투 세포의 수에 영향을 미치지 않았다. 반면, 뮤린 A2G- GLP-2 모방체의 처리는 침투 세포의 수를 유의하게 감소시켰다. 세포 수는 통계적 비교를 위하여 도 7에 편집하였다.

이제 본 발명을 완전히 기술하였고, 이에 많은 변화 및 변경이 첨부된 청구항의 관점 또는 범위를 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> CENTOCOR, INC. <120> GLP-2 MIMETIBODIES, POLYPEPTIDES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES <130> CEN5115PCT <140> 11/552,408 <141> 2006-10-24 <150> 60/729704 <151> 2005-10-24 <150> 60/824160 <151> 2006-08-31 <150> 60/862487 <151> 2006-10-23 <160> 80 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 2 His Ser Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 3 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 4 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 4 His Ser Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Leu Gly Lys 275 <210> 5 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 5 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly Lys 275 <210> 6 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 6 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro 35 40 <210> 7 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 7 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro 35 40 45 <210> 8 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 8 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Cys Pro Pro Cys Pro 50 <210> 9 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 9 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 10 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 10 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 60 <210> 11 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 11 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 12 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 12 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180 cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240 atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300 gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360 cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540 cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720 gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780 ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaatg a 831 <210> 13 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 13 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atcctgccca 120 ccatgcccg 129 <210> 14 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 14 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggtggt 120 ggcggcagtt gcccaccatg cccg 144 <210> 15 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 15 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggcggt 120 ggcggatctg gtggtggcgg cagttgccca ccatgcccg 159 <210> 16 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 16 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggtgga 120 ggaggctcag gcggtggcgg atctggtggt ggcggcagtt gcccaccatg cccg 174 <210> 17 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 17 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gaggaggtgg atccggcgga 120 ggaggttccg gtggaggagg ctcaggcggt ggcggatctg gtggtggcgg cagttgccca 180 ccatgcccg 189 <210> 18 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 18 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 gccttagtcg ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 19 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 20 Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V2 variant <400> 22 Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser 1 5 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 28 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Cys Pro Ser Cys 1 <210> 35 <211> 553 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Lys Leu Gly Ser Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ser Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Val His Glu Leu Pro Met Gly Ile Pro Ala Pro Trp 20 25 30 Gly Thr Ser Pro Leu Ser Phe His Arg Lys Cys Ser Leu Trp Ala Pro 35 40 45 Gly Arg Pro Phe Leu Thr Leu Val Leu Leu Val Ser Ile Lys Gln Val 50 55 60 Thr Gly Ser Leu Leu Glu Glu Thr Thr Arg Lys Trp Ala Gln Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Ala Cys Leu Arg Asp Leu Leu Lys Glu Pro Ser Gly Ile Phe Cys 85 90 95 Asn Gly Thr Phe Asp Gln Tyr Val Cys Trp Pro His Ser Ser Pro Gly 100 105 110 Asn Val Ser Val Pro Cys Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Trp Ser Glu Glu 115 120 125 Ser Ser Gly Arg Ala Tyr Arg His Cys Leu Ala Gln Gly Thr Trp Gln 130 135 140 Thr Ile Glu Asn Ala Thr Asp Ile Trp Gln Asp Asp Ser Glu Cys Ser 145 150 155 160 Glu Asn His Ser Phe Lys Gln Asn Val Asp Arg Tyr Ala Leu Leu Ser 165 170 175 Thr Leu Gln Leu Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Phe Ser Leu Ile Ser 180 185 190 Leu Phe Leu Ala Leu Thr Leu Leu Leu Phe Leu Arg Lys Leu His Cys 195 200 205 Thr Arg Asn Tyr Ile His Met Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg 210 215 220 Thr Leu Ala Val Leu Val Lys Asp Val Val Phe Tyr Asn Ser Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Arg Pro Asp Asn Glu Asn Gly Trp Met Ser Tyr Leu Ser Glu Met 245 250 255 Ser Thr Ser Cys Arg Ser Val Gln Val Leu Leu His Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Ala Asn Tyr Leu Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Thr Leu 275 280 285 Leu Glu Pro Thr Val Leu Pro Glu Arg Arg Leu Trp Pro Arg Tyr Leu 290 295 300 Leu Leu Gly Trp Ala Phe Pro Val Leu Phe Val Val Pro Trp Gly Phe 305 310 315 320 Ala Arg Ala His Leu Glu Asn Thr Gly Cys Trp Thr Thr Asn Gly Asn 325 330 335 Lys Lys Ile Trp Trp Ile Ile Arg Gly Pro Met Met Leu Cys Val Thr 340 345 350 Val Asn Phe Phe Ile Phe Leu Lys Ile Leu Lys Leu Leu Ile Ser Lys 355 360 365 Leu Lys Ala His Gln Met Cys Phe Arg Asp Tyr Lys Tyr Arg Leu Ala 370 375 380 Lys Ser Thr Leu Val Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Ile Leu 385 390 395 400 Phe Ser Phe Ile Thr Asp Asp Gln Val Glu Gly Phe Ala Lys Leu Ile 405 410 415 Arg Leu Phe Ile Gln Leu Thr Leu Ser Ser Phe His Gly Phe Leu Val 420 425 430 Ala Leu Gln Tyr Gly Phe Ala Asn Gly Glu Val Lys Ala Glu Leu Arg 435 440 445 Lys Tyr Trp Val Arg Phe Leu Leu Ala Arg His Ser Gly Cys Arg Ala 450 455 460 Cys Val Leu Gly Lys Asp Phe Arg Phe Leu Gly Lys Cys Pro Lys Lys 465 470 475 480 Leu Ser Glu Gly Asp Gly Ala Glu Lys Leu Arg Lys Leu Gln Pro Ser 485 490 495 Leu Asn Ser Gly Arg Leu Leu His Leu Ala Met Arg Gly Leu Gly Glu 500 505 510 Leu Gly Ala Gln Pro Gln Gln Asp His Ala Arg Trp Pro Arg Gly Ser 515 520 525 Ser Leu Ser Glu Cys Ser Glu Gly Asp Val Thr Met Ala Asn Thr Met 530 535 540 Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ser Glu Ile 545 550 <210> 36 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP 2R Variant <400> 36 Met Lys Leu Gly Ser Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ser Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Val His Glu Leu Pro Met Gly Ile Pro Ala Pro Trp 20 25 30 Gly Thr Ser Pro Leu Ser Phe His Arg Lys Cys Ser Leu Trp Ala Pro 35 40 45 Gly Arg Pro Phe Leu Thr Leu Val Leu Leu Val Ser Ile Lys Gln Val 50 55 60 Thr Gly Ser Leu Leu Glu Glu Thr Thr Arg Lys Trp Ala Gln Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Ala Cys Leu Arg Asp Leu Leu Lys Glu Pro Ser Gly Ile Phe Cys 85 90 95 Asn Gly Thr Phe Asp Gln Tyr Val Cys Trp Pro His Ser Ser Pro Gly 100 105 110 Asn Val Ser Val Pro Cys Pro Ser Tyr Leu Pro Trp Trp Ser Glu Glu 115 120 125 Ser Ser Gly Arg Ala Tyr Arg His Cys Leu Ala Gln Gly Thr Trp Gln 130 135 140 Thr Ile Glu Asn Ala Thr Asp Ile Trp Gln Asp Asp Ser Glu Cys Ser 145 150 155 160 Glu Asn His Ser Phe Lys Gln Asn Val Asp Arg Tyr Ala Leu Leu Ser 165 170 175 Thr Leu Gln Leu Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Phe Ser Leu Ile Ser 180 185 190 Leu Phe Leu Ala Leu Thr Leu Leu Leu Phe Leu Arg Lys Leu His Cys 195 200 205 Thr Arg Asn Tyr Ile His Met Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg 210 215 220 Thr Leu Ala Val Leu Val Lys Asp Val Val Phe Tyr Asn Ser Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Arg Pro Asp Asn Glu Asn Gly Trp Met Ser Tyr Leu Ser Glu Met 245 250 255 Ser Thr Ser Cys Arg Ser Val Gln Val Leu Leu His Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Ala Asn Tyr Leu Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Thr Leu 275 280 285 Leu Glu Pro Thr Val Leu Pro Glu Arg Arg Leu Trp Pro Arg Tyr Leu 290 295 300 Leu Leu Gly Trp Ala Phe Pro Val Leu Phe Val Val Pro Trp Gly Phe 305 310 315 320 Ala Arg Ala His Leu Glu Asn Thr Gly Cys Trp Thr Thr Asn Gly Asn 325 330 335 Lys Lys Ile Trp Trp Ile Ile Arg Gly Pro Met Met Leu Cys Val Thr 340 345 350 Val Asn Phe Phe Ile Phe Leu Lys Ile Leu Lys Leu Leu Ile Ser Lys 355 360 365 Leu Lys Ala His Gln Met Cys Phe Arg Asp Tyr Lys Tyr Arg Leu Ala 370 375 380 Lys Ser Thr Leu Val Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Ile Leu 385 390 395 400 Phe Ser Phe Ile Thr Asp Asp Gln Val Glu Gly Phe Ala Lys Leu Ile 405 410 415 Arg Leu Phe Ile Gln Leu Thr Leu Ser Ser Phe His Gly Phe Leu Val 420 425 430 Ala Leu Gln Tyr Gly Phe Ala Asn Gly Glu Val Lys Ala Glu Leu Arg 435 440 445 Lys Tyr Trp Val Arg Phe Leu Leu Ala Arg His Ser Gly Cys Arg Ala 450 455 460 Cys Val Leu Gly Lys Asp Phe Arg Phe Leu Gly Lys Cys Pro Lys Lys 465 470 475 480 Leu Ser Glu Gly Asp Gly Ala Glu Lys Leu Arg Lys Leu Gln Pro Ser 485 490 495 Leu Asn Ser Gly Arg Leu Leu His Leu Ala Met Arg Gly Leu Ala Asp 500 505 510 Val Gly Ala Gln Pro Gln Gln Asp His Ala Arg Trp Pro Arg Gly Ser 515 520 525 Ser Leu Ser Glu Cys Ser Glu Gly Asp Val Thr Met Ala Asn Thr Met 530 535 540 Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ser Glu Ile 545 550 <210> 37 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ccaaagtata caggcgcata gcgatggttc tttctctgat gagatgaaca ccattcttg 59 <210> 38 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ttggtctgaa tcaaccagtt tataaagtct cgagcggcaa gattatcaag aatggtgttc 60 atctc 65 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 tttgcggccg cccaaagtat acaggcg 27 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 aaaggatccg tcagtgattt tggtctgaat caaccag 37 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 ccaaagtata caggcgcatg gcgatggttc tttctctgat gagatgaaca ccattcttg 59 <210> 42 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 42 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Pro Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 43 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 43 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Pro Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 44 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 44 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Pro Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 45 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 45 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Pro Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 46 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 46 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 gccttagtcc ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 47 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 47 atggcgatgg ttctttctct gatgagatga acaccattct tgataatctt gccgctcgag 60 actttataaa ctggttgatt cagaccaaaa tcactgacgg atccggtgga ggctccggtg 120 ccttagtcgc cgtcccctca gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccg 176 <210> 48 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 48 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 gccttagtcg ccgtctcccc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 49 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 49 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 gccttagtcg ccgtctcctc agagtccaaa cctggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 50 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 50 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 51 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 51 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Val Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 52 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 52 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 53 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 53 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 54 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 54 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 55 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 55 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 56 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 56 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 57 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 variant <400> 57 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 58 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 58 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 59 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 59 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Asp Val Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 60 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 60 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 61 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 61 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 62 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 62 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 63 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 63 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 64 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 64 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 65 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 65 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 66 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 66 catggcgatg gttctttctc tagtgacatg tcgaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 67 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 67 catggcgatg gttctttctc tagtgacgtc tcgaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 68 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 68 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacacctatc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 69 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 69 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggtct tgccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 70 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 70 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatca ggccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 71 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 71 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggcca ggccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 72 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 72 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttatag cctggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 73 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mimetibody <400> 73 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatct tgccgctcga 60 gactttataa actggttggt taagggcaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccg 177 <210> 74 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 Peptide with A2G, M10V mutation <400> 74 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Val Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile 20 25 30 Thr Asp <210> 75 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 Mimetibody amino acid sequence with A2G, L17Q mutation <400> 75 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly Lys 275 <210> 76 <211> 828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 Mimetibody nucleic acid sequence with A2G, L17Q mutation <400> 76 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgataatca ggccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180 cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240 atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300 gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360 cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540 cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720 gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780 ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaa 828 <210> 77 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 Mimetibody nucleic acid sequence with A2G, N16G, L17Q mutation <400> 77 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly Lys 275 <210> 78 <211> 828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 Mimetibody nucleic acid sequence with A2G, N16G, L17Q mutation <400> 78 catggcgatg gttctttctc tgatgagatg aacaccattc ttgatggcca ggccgctcga 60 gactttataa actggttgat tcagaccaaa atcactgacg gatccggtgg aggctccggt 120 accttagtca ccgtctcctc agagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccggcg 180 cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 240 atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 300 gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 360 cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 420 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 480 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagcctcgag agccacaggt gtacaccctg 540 cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 600 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 660 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 720 gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 780 ctgcacaacc actacacaca gaaaagcttg tccctgtctc tgggtaaa 828 <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 Mimetibody amino acid sequence <400> 79 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 80 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human A2G-GLP2 peptide in murine IgG2a scaffold <400> 1 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Glu 35 40 45 Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala 50 55 60 Pro Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile 65 70 75 80 Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val 85 90 95 Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 100 105 110 Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp 115 120 125 Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln 130 135 140 Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp 145 150 155 160 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val 165 170 175 Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr 180 185 190 Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu 195 200 205 Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr 210 215 220 Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr 225 230 235 240 Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr 245 250 255 Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys 260 265 270 Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 275 280

Claims (31)

1. 하기 화학식 (II)의 모방체:

   

   상기 식에서,

   GLP2RAg는 포유류 GLP-2R 효능제이고,

   Lk는 폴리펩티드 또는 화학 결합이며,

   V2는 면역글로블린 가변 영역의 C-말단 부분이고,

   Hg는 면역글로블린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이며,

   C_H2는 면역글로블린 중쇄 C_H2 불변 영역이고

   C_H3는 면역글로블린 중쇄 C_H3 불변 영역이며

   t는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
2. 제 1항에 있어서, GLP2RAg가 서열 번호 2, 3, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 74의 아미노산 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 모방체.
3. 제 1항에 있어서, Hg, C_H2 및 C_H3는 IgG1 서브클래스로부터 유래됨을 특징으로 하는 모방체.
4. 제 3항에 있어서, Hg의 Cys220은 Ala로 치환되고, C_H2의 Leu234 및 Leu235는 Ala234 및 Ala235로 변이됨을 특징으로 하는 모방체.
5. 제 1항에 있어서, Hg는 IgG4 서브클래스로부터 유래되고, C_H2 및 C_H3는 IgG1 서브클래스로부터 유래됨을 특징으로 하는 모방체.
6. 제 1항에 있어서, Hg, C_H2 및 C_H3는 IgG4 서브클래스로부터 유래됨을 특징으로 하는 모방체.
7. 제 6항에 있어서, Hg의 Ser228은 Pro로 치환되고 C_H2의 Phe234 및 Leu235는 Ala234 및 Ala235로 변이됨을 특징으로 하는 모방체.
8. 제 1항에 있어서, GLP-2 수용체에 결합됨을 특징으로 하는 모방체.
9. 제 1항에 있어서, 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75 또는 77로 나타내어지는 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 모방체.
10. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항의 모방체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
11. 서열 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76 또는 78로 나타내어지는 서열 또는 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
12. 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 42, 43, 44, 45, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 75 또는 77로 나타내어지는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
13. 제 11항 또는 12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
14. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항의 모방체를 발현하는 세포주.
15. 제 13항의 벡터를 포함하는 세포주.
16. 제 15항에 있어서, HEK293, NSO, SP2/0 또는 CHO 세포임을 특징으로 하는 세포주.
17. 제 16항의 세포주를 배양하고 발현된 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하 는 폴리펩티드의 제조 방법.
18. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항의 유효량의 적어도 하나의 모방체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
19. 제 18항의 약제학적 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 GLP-2의 생물학적 활성의 변형 방법.
20. 제 18항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 GLP-2 관련 증상 또는 장애 증후의 감소 또는 치료 방법.
21. 제 20항에 있어서, GLP-2 관련 증상 또는 장애는 뼈 관련 장애 또는 영양 관련 장애임을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21항에 있어서, 위장 장애는 단장증후군, 염증성 장질환, 크론씨병, 대장염, 췌장염, 회장염, 점막염 또는 장 위축임을 특징으로 하는 방법.
23. 제 21항에 있어서, 위장 장애는 소아의 위장 장애임을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21항에 있어서, 뼈 관련 장애는 골다공증임을 특징으로 하는 방법.
25. 제 21항에 있어서, 영양 관련 장애는 비만임을 특징으로 하는 방법.
26. 제 18항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장폐색의 예방, 증후의 감소 또는 치료 방법.
27. 서열 번호 52, 54, 55 또는 74로 나타내어지는 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
28. 제 27항의 유효량의 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
29. 제 28항의 약제학적 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 GLP-2의 생물학적 활성의 변형 방법.
30. 제 28항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 GLP-2 관련 증상 또는 장애 증후의 감소 또는 치료 방법.
31. 제 28항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장폐색의 예방, 증후의 감소 또는 치료 방법.

Images