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KR20080068019A - 아포지단백질-ｂ100 발현 억제용 ｒｎａ 길항제 화합물 - Google Patents

아포지단백질-ｂ100 발현 억제용 ｒｎａ 길항제 화합물 Download PDF

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KR20080068019A
KR20080068019A KR1020087009039A KR20087009039A KR20080068019A KR 20080068019 A KR20080068019 A KR 20080068019A KR 1020087009039 A KR1020087009039 A KR 1020087009039A KR 20087009039 A KR20087009039 A KR 20087009039A KR 20080068019 A KR20080068019 A KR 20080068019A
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nucleotides
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KR1020087009039A
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헨릭 프라이덴룬드 한센
보 한센
마이켄 베스테르고르드
크리스토프 로센보흠
엘렌 마리에 스트로루프
Original Assignee
산타리스 팔마 에이/에스
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Publication date
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Abstract

ApoB-100 발현 조절을 위한 Apo-B100 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 조성물은 Apo-B100 코딩하는 핵산에 표적화된 올리고뉴클레오티드, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. Apo-B100 발현의 조절을 위한, 그리고 Apo-B100 과발현, 변이된 Apo-B100의 발현 또는 모두와 관련된 질병을 치료하기 위한 화합물을 사용하는 방법이 제공된다. 질병의 예는, 폐, 유방, 전립선, 췌장, 폐, 간, 갑상선, 신장, 뇌, 정소, 위, 장, 내장, 척수, 공동, 방광, 요도 또는 난소암들과 같은 암들이다. 올리고뉴클레오티드는 예컨대, 잠금 핵산 또는 그 조합들과 같은 핵산 유사체 또는 디옥시리보뉴클레오시드들로 구성될 수 있다.
RNA, 아포지단백질, Apo-B100

Description

아포지단백질-Ｂ100 발현 억제용 ＲＮＡ 길항제 화합물 {RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE INHIBITION OF Apo-B100 EXPRESSION}
본 발명은 아포지단백질-B100의 발현을 조절하는 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 아포지단백질-B100을 코딩하는 핵산과 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 화합물에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드 화합물은 아포지단백질-B100의 발현을 조절하는 것으로 나타나고, 그 약학적 제조 및 암 질병의 치료로써의 용도가 개시된다.
아포지단백질 B(ApoB, 아포지단백질 B-100; ApoB-100, 아포지단백질 B-48; ApoB-48 및 Ag(x) 항원)은 지질의 집합 및 분비와 별개의 종류의 지단백질(lipoprotein)의 전달과 수용체-매개 흡수(uptake) 및 수송에 있어서, 필수적인 역할을 하는 거대한 당단백질(glycoprotein)이다. ApoB는 순환하는 지단백질 수준의 조절에 있어서 중요한 역할을 하고, 그러므로, 아포지단백질B-포함 지단백질의 주변 농도와 높은 관련이 있는 아테크롬성 동맥경화증에 걸리기쉬움(susceptibility)과 관련되어 있다. 포유동물에 존재하는 두가지 형태의 ApoB, 그 구조 및 ApoB의 의학적 중요성에 관한 추가적인 자세한 내용은 Davidson and Shelness (Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193)을 참고한다.
ApoB-100-함유 지단백질 Lp(a)의 상승된 혈장 수준은 아테그롬성 동맥경화증 및 과콜레스테롤혈증 (Seed et al., N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499), 심근 경색 (Sandkamp et al., Clin. Chew., 1990, 36, 20-23), 및 혈전증 (Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, Eli)을 포함하는 그 발현의 증가된 위험과 관련있다.
Lp(a)의 혈장 농도는 유전적 요소에 의해 강한 영향을 받고, 대부분 약물이나 식이 요법 (Katan and Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessby et al., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71)에 의해 저항할 수 있다. 상승된 Lp(a) 수준의 약물 요법은 단지 적당히 성공적이고, 페레시스(apheresis)는 가장 효과적인 치료 양식으로 남아있다 (Hajjar and Nachman, Annul Rev. Med., 1996, 47, 423-442).
두가지 형태의 아포지단백질 B가 포유동물에 존재한다. ApoB-100은 인간 간에서 배타적으로 합성되는 4536 아미노산 잔기들을 포함하는 전장(full-length) 단백질을 나타낸다. ApoB-48로 알려진 트렁케이트된 형태는 아미노 터미널 2152 잔기들로 동일선상에 있고, 모든 포유동물의 소장에서 합성된다 (Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
아포지단백질 B의 공통 구조 유전자는 RNA 에디팅(editing)이라고 알려진 과정에 의해 두개의 별개의 단백질 이소형태(isoform)를 생산한다. 위치 특이적 사이토신-to-우라실 에디팅 반응은 UAA 정지 코돈 및 ApoB-48을 생산하기 위한 아포지단백질B의 번역 종결을 생산한다 (Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
포유동물의 ApopB의 의학적 중요성은 인간 ApoB 발현 (Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869) 또는 ApoB 낙-아웃(knock-out) 쥐 (Farese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92, 1774-1778; Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723)에 관한, 유전자이식(transgenic) 쥐 연구를 이용하여 증명되었다.
현재까지 아포지단백질B 기능을 억제하기 위한 전략은 Lp(a) 페레시스, 항체, 항체 단편 및 리보자임에 한정되어왔다. 또한, 낮은 생물학적 안정성 및/또는 낮은 결합 친화도 안티센스 올리고뉴클레오티드는 개시되었고, PCT 공보 WO 00/97662, WO 03/11887 및 WO 2004/44181에 청구되었다.
따라서, 아포지단백질B 기능을 효과적으로 길항하고, 그 결과로 혈장 Lp(a) 수준을 낮출 수 있는 추가적인 작용제의 필요가 남아있다.
본 발명은 효과적인 Locked Nucleic Acid (LNA) 올리고머 화합물 및 대안의 이소형태의 아포지단백질 B ApoB-48의 억제를 포함하는 아포지단백질B 발현을 조절하기 위한 방법에서 그 사용을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 아포지단백질 B (Apo-B100/Apo-B48)의 발현을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.특히, 본 발명은 아포지단백질B를 표적(targeting)하는 특정 모티프(motif)를 넘는 올리고뉴클리오티드 화합물에 관한 것이다. 상기 모티프들은 서열번호: 2-26, 특히 서열번호: 2, 3, 10, 11 및 21이다. 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 LNA의 특정 디자인은 또한 개시된다. 특히 바람직한 화합물은 서열번호: 29 내지 47, 특히 서열번호: 29, 30, 31, 36, 37, 38, 40 및 42이다. 본 발명의 화합물은 아포지단백질 mRNA 및 발현의 잠재적인 억제제이다. 생체 밖에(in vitro) 서열번호: 29 및 30은 1-5nM 근처의 IC50로 ApoB 발현을 하향-조절하고, 서열번호: 30은 약 0.5nM의 IC50을 나타낸다. 생체 내(in vivo)에, 복용 의존적인 방식으로, 서열번호: 29로 처리한 다음, ApoB-100 mRNA 발현은 간 및 공장(jejunum)에서 억제되었다. 감소된 ApoB-100 수준과 동시적으로, 혈장 내 총 콜레스테롤은 70% 감소되었다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 및 다른 조성물은 또한 제공된다. 또한, 상기 세포 및 조직에서 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 조성물의 접촉을 포함하는 아포지단백질B의 발현을 조절하는 방법이 추가적으로 제공된다. 아포지단백질 B와 관련된 질병 또는 상태를 갖는 것으로 의심되거나 갖기 쉬운 동물 또는 인간을 본 발명의 약학적으로 또는 예방적으로 유효량의 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계에 의해 치료하는 방법을 개시한다. 또한, 아포지단백질 B 활성과 관련있는 질병의 치료를 위해, 아포지단백질B의 발현을 억제하기 위한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법이 제공된다. 상기 질병의 예들로는 서로 상이한 형태의 HDL/LDL 콜레스테롤 불균형; 이상지질혈증, 예컨대, 가족성(familial) 혼합된 고지혈증(FHCL), 획득된 고지혈증, 고콜레스테롤혈증; 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질병(CAD) 관상 심장 질병(CHD) 아테크롬성 동맥경화증이 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 아포지단백질B (Apo-B100 및/또는 ApoB-48과 같은)를 코딩하는 핵산 화합물의 기능을 조절하는데 사용하기 위한 올리고머 화합물, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개시한다. 조절은 생산되는 아포지단백질B의 양에 최종적인 변화이다. 일 구체예에서, 이것은 올리고머 화합물의 제공에 의해 성취되고, 이것은 특이적으로 예컨대 메신저 RNA와 같이 아포지단백질B를 코딩하는 핵산과 혼성화한다. 이 조절은 좋기로는아포지단백질B의 발현을 억제하는 것으로 나타나고, 즉, 이것은 생산되는 기능적인 단백질의 수를 감소시키게 한다.
도 1은 LNA 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 단일 가닥 안티센스 뉴클레오티드 및 siRNA가 시험관 (in vitro)에서 동일한 나노몰 범위에서 강력하다는 것을 입증하는 것이다. 그러나, 생체내에서 본 발명의 16-머(mer) LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비변형된 및 콜레스테롤 콘쥬게이트된 siRNA 보다 우수하다.
도 2A 및 도 2B는 콜레스테릴 콘쥬게이트된 siRNA 보다 생체내에서 (cf.) 8배 이상 강력한 본 발명의 LNA 뉴클레오티드를 나타낸다. LNA 올리고뉴클레오티드는 쥐(mouse) 혈장에서 총 콜레스테롤을 감소시켰으나, 반면 siRNA 처리는 그렇지 못했다 (도 3). 또한, LNA 올리고뉴클레오티드는 siRNA 보다 훨씬 생물안정적이다.
표적(target)의 발현을 조절하는 올리고머화합물은 바라는(desired) 표적(target)에 대한 올리고뉴클레오티드 화합물을 고안하기 위한 가장 최선의 노하우, 표적에 관한 서열정보에 근거한 합리적인 고안 또는 실험을 통해 확인된다. 이 화합물의 서열은 본 발명의 구체예에서 선호된다. 유사하게, 이 바람직한 올리고머 화합물에 상보적인 표적 내 서열 모티프 ("hot spot"으로 간주)는 표적을 위한 위치에 선호된다.
올리고머 화합물 및 올리고뉴클레오티드 화합물
"올리고머 화합물"이라는 용어는, "올리고뉴클레오티드", "올리고" 및 "올리고뉴클레오티드 화합물"이라는 용어와 상호변형 가능한 것으로, 본 발명의 내용에서는, 올리고머, 즉, 기술분야에 알려져 있는, 핵산 폴리머(예컨대, 리보핵산 (RNA) 또는 디옥시리보핵산 (DNA)) 또는 핵산 유사체, 바람직하게, 잠금 핵산 (Locked Nucleic Acid; LNA) 또는 그 혼합물)를 의미한다. 이 용어는 자연적으로 일어난 핵염기, 당 및 인터뉴클레오시드 (골격) 결합 뿐만 아니라, 특이적 향상된 기능을 갖거나 유사하게 기능하는 비-자연적-일어나는 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 전체적으로 또는 부분적으로 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 상기 뉴클레오티드의, 예컨대, 세포막 투과성, 세포 외부 및 내부 뉴클레아제(nuclease)에 좋은 저항성, 핵산 표적(target)에 높은 특이성 및 친화도와 같은, 몇몇 바람직한 성질 때문에, 천연의 형태보다 자주 선호된다. LNA 유사체는 특히 예를 들어, 상기 언급된 성질에 관련하여 선호된다. 그러므로, 매우 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 "올리고머 화합물", "올리고뉴클레오티드", "올리고" 및 "올리고뉴클레오티드 화합물" 이라는 용어는, 12-50 뉴클레오티드/뉴클레오티드 유사체 (올리고머) 사이의 폴리머 화합물을 형성하기 위한 LNA 유닛과 같은, 모두 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 유닛으로 구성된 화합물이다.
용어에 의해, "유닛"은 모노머로 이해된다.
본 발명의 올리고머 화합물은 아포지단백질B 메신저 RNA(들) 및/또는 센스 또는 상보적 포유동물 아포지단백질 B(Apo-B) DNA 가닥들과 혼성화할 수 있다. NCBI 승인번호. NM_000384는 인간 아포지단백질B를 위한 mRNA 서열을 제공한다. 본 발명의 올리고머 화합물은 NCBI 승인번호. NM_000384에 개시된 핵산 또는 그 역 상보물(reverse complement)에 의해 코딩되는 인간 아포지단백질과 혼성화할 수 있고, 바람직한 구체예에서, mRNA 핵산 표적은 인간 아포지단백질로부터 유래된다.
바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 ApoB mRNA와 같은 핵산에 대하여 혼성화가능하여, 적어도 37℃, 적어도 40℃, 적어도 55℃, 또는 적어도 60℃의 Tm에서 듀플렉스(duplex)를 형성한다. 일 구체예에서 Tm은 50 내지 70℃와 같은 37℃ 및 80℃ 사이이다.
Tm의 측정
10mM 나트륨 인산/100mM NaCl/0.1nM EDTA, pH7.0 내 화합물의 3μM의 용액을 1분동안 90℃에서 10mM 나트륨 인산/100mM NaCl/0.1nM EDTA, pH7.0 내 3μM 농도에서 그 상보적인 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드와 혼합하고, 상온으로 식혔다. 듀플렉스의 융해 곡선은 그리고나서, 1℃/분의 가열율로 25 내지 95℃의 범위에서, 260nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. Tm은 융해 곡선의 첫번째 유도체의 최대값으로써 측정된 것이다.
올리고머 화합물은 좋기로는안티센스 올리고머 화합물이고, 또한, '안티센스 올리고뉴클레오티드' 및 '안티센스 억제제'를 의미한다.
상기 안티센스 억제제는, 표적(target) 핵산에 상보적인 뉴클레오티드/뉴클레오디트 유사체 서열을 포함하는 화합물이고, "siRNA", "miRNA", "리보자임", "올리고자임"의 형태를 취할 수 있다. 하지만, 바람직하게, 안티센스 억제제는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 단일가닥 올리고뉴클레오티드는 좋기로는표적 핵산의 상응하는(corresponding) 영역에 상보적이다.
전형적으로, 단일 가닥 '안티센스' 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 표적 유전자의 mRNA와 상호반응하고, 표적화된 mRNA의 분해, 예컨대, RNaseH 메커니즘을 통해, 또는 번역을 막도록 한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 올리고머 화합물은 센스 또는 안티센스 DNA 가닥과 같은 포유동물 ApoB를 코딩하는 DNA를 표적(target)으로 한다. siRNA는 표적(target) DNA와 상호반응할 수 있는 것으로 알려져있다.
본 발명에 따른 올리고머 화합물은 바람직하게는 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체는 좋기로는잠금 핵산 뉴클레오티드 유사체 및 여기에서 "LNA 올리고머 화합물", "LNA 올리고뉴클레오티드 화합물 " 및" LNA 올리고뉴클레오티드"를 나타내는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 올리고머 화합물이다.
적절하게, 본 발명에 따른 "올리고뉴클레오티드 화합물", "올리고머 화합물", "LNA 올리고머 화합물"은 여기에서 정의된 바와 같은, 올리고뉴클레오티드로, 이것은 인간 내에서 예를들어, 표적(target) 핵산에 수소결합에 의한 결합을 통해 바람직한 치료적 효과를 유도한다.
본 발명은 10-50, 특히 12-50 또는 12-25, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체와 같은 8-50으로 구성된 올리고뉴클레오티드와 같은, 올리고머 화합물을 나타내는 것으로, 여기서 상기 화합물은 예컨대, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 14, 15, 16, 17, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 서브시퀀스를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 Apo-B100 및/또는 Apo-B48 핵산 표적(target) 서열의 서열내에 위치(즉, 상응)된다. 뉴클레오티드 유사체는 서열번호: 2-26, 특히 서열번호: 2, 3, 10, 11 및 21의 각각의 뉴클레오티드의 유사체이다. 그리하여, 본 발명의 화합물의 서브시퀀스는 서열번호: 2-26, 특히 서열번호: 2, 3, 10, 11 및 21로 구성된 군에서 선택된 서열 내에 위치(즉, 상응)되거나, 서열번호: 2-26, 특히 서열번호: 2, 3, 10, 11 및 21의 서열 내에 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
화합물의 서브시퀀스가 위치되어 있는 (또는 서브시퀀스가 뉴클레오티드의 유사체를 포함하고 있는)서열의 바람직한 군은 서열번호: 2 및 3; 서열번호: 2 및 3 및 11; 서열번호: 10 및 11; 서열번호: 21을 함유한다.
일 구체예에서, 화합물의 서브시퀀스가 위치되어 있는 (또는 서브시퀀스가 뉴클레오티드의 유사체를 포함하고 있는)서열의 바람직한 군은 서열번호: 3을 함유한다.
일 구체예에서, 화합물의 서브시퀀스가 위치되어 있는 (또는 서브시퀀스가 뉴클레오티드의 유사체를 포함하고 있는)서열의 바람직한 군은 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 48 및 50로 구성된 군에서 선택된 서열을 함유한다.
일 흥미로운 예에서, 본 발명의 화합물은 8-50 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 화합물은 적어도 8개의 뉴클레오티드의 서브시퀀스를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 2 및 3으로 구성된 군에서 선택되는 서열내에 위치되고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드는 상응하는 뉴클레오티드 유사체에 의해 교체되고, 상기 3'말단은 뉴클레오티드 유사체보다는 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 구체적인 화합물은 8-50 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 화합물은 적어도 8개의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 2 및 3으로 구성된 군에서 선택된 서열 내에 위치되고, 상기 뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 전형적으로 여기에서 정의된 바와 같이, 2-6 LNA의 스트레치, 여기에서 정의된 바와 같이, 그 다음으로, 4-12 뉴클레오티드 스트레치, 그 다음으로 여기에서 정의된 바와 같이, 2-6 LNA의 스트레치를 포함한다.
"내에서 위치되는 (located within)" 및 "상응하는(corresponding to/correpond to)"라는 용어는 본 발명의 올리고머 화합물의 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체의 혼합된 서열, 또는 그 서브시퀀스와 i) 아포지단백질B 핵산 서열의 역 상보물및/또는 ii) 서열번호: 2-26 및 59-67 (즉, 서열 모티프)로 구성된 군 또는 그 역 상보물의 일 구체예에서 제공된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티도 서열 균등물 사이의 비교를 의미한다. 뉴클레오티드 유사체를 그 균등한 뉴클레오티드를 직접 비교된다.
서브시퀀스는 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20과 같은 적어도 8개의, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65, 서열번호: 66, 서열번호: 67 및 서열번호: 68로 구성된 군에서 선택된 핵산에서 존재하는 균등한 개수의 연속적인 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다 (도 7 참조).
바람직하게, 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체는 상기 서브시퀀스내에, 필요에 따라 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드 유사체의 연속적인 서열과 같은, 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체의 연속적인 서열로써, 위치된다.
바람직한 구체예에서, 올리고머 화합물은 오직 서브시퀀스로 구성되고, 즉, 올리고머 화합물의 전체 서열은 서열번호: 2-26 및 서열번호: 59-62로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 같은 상응한 서열에서 발견된다.
바람직하게, ApoB 표적(target) 서열의 상응하는 영역과 관련있을 때, 미스매치를 형성하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 없고, 즉, 본 발명의 올리고머에 존재하는 모든 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체는 ApoB 핵산 표적(target) 서열과 연속적인 염기 짝맞음(pairing)을 형성할 수 있다.
그러나, 일 구체예에서, 서브시퀀스 및 핵산 표적(target) 서열 내에 한개의 미스매치 또는 두개의 미스매치가 존재할 수 있다. 미스매치가 일어나면, 그것들은 뉴클레오티드 유사체 및 표적(target) 서열 사이에 존재하지 않는 것이 바람직하다.
그러나, 갭머(gapmer)의 '갭(gap)'에서, 이것은 RNaseH를 모을 수 있는 것으로, 미스매치는 RNaseH를 모으는 능력을 감소시키게 한다. 전형적으로 5 또는 6개의 연속적인 상보적 뉴클레오티드는 충분한 RNaseH 활성을 보장하기 위해 필요하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 화합물은 서열번호: 59 및/또는 서열번호: 60에 상응하는 서열을 포함하고, 상기 서브시퀀스는 필요에 따라 1개 또는 2개의 미스매치를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 화합물은 서열번호: 61 및/또는 서열번호: 62에 상응하는 서열을 포함하고, 상기 서브시퀀스는 필요에 따라 1개 또는 2개의 미스매치를 포함한다.
일 바람직한 구체예에서, 서브시퀀스는 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20과 같은 적어도 8개의, 서열번호: 63에서 균등한 개수의 연속적인 뉴클레오티드 내에 위치(즉, 상응)하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 임의적으로, 1개 또는 2개의 미스매치를 포함한다.
본 발명의 추가적인 구체예에서, 서브시퀀스는 적어도 10, 또는 적어도 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20과 같은 14 및 20 사이와 같은, 적어도 14와 같은, 적어도 8개의, 서열번호: 64, 서열번호: 65, 서열번호: 66, 서열번호: 67 및 서열번호: 68로 구성된 군에서 선택된 균등한 개수의 연속적인 뉴클레오티드 내에 위치(즉, 상응)하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 임의적으로, 1개 또는 2개의 미스매치를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 올리고머 화합물은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이고, 상기 각각의 가닥은 총 16-30 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함(또는 구성된다)한다. 이중 가닥의 복합체 (올리고뉴클레오티드)의 하나의 가닥은 여기에서 정의된 올리고뉴클레오티드 화합물에 상응하고, 다른 가닥은 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 것은 이해될 것이다.
예를 들어, 총 8-50개의 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 8-50 뉴클레오티드 또는 8-50 뉴클레오티드 유사체 또는, 혼합된 총 50 뉴클레오시드 유닛을 초과하지 않는 그 혼합물을 의미하는 것으로 의도된다.
좋기로는,화합물은 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 같은, 12-25 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 15 및 22 사이 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 같은, 14 및 18 사이 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 같은, 더 바람직한 15 또는 16 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 구성된다.
본 발명에서, "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"라는 용어는 일반적인 의미로 사용된다. 예컨대, 그것은 숫자 하나의 탄소원자를 통해 질소 염기 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 또는 구아닌(G)의 하나와 결합된 2-디옥시리보오스 유닛을 포함한다.
유사한 방법으로, "뉴클레오티드"라는 용어는, 예컨대, 본 발명의 화합물과 관련된 바람직한 구체예에서, "뉴클레오티드"라는 용어는 갯수 하나의 탄소원자를 통해 질소 염기 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 또는 구아닌(G)의 하나와 결합되고, 5개 탄소 원자를 통해 인터뉴클레오시드 포스페이트 (또는 일 구체예에서, 포스포로티오에이트기와 같은 균등물) 또는 말단기와 결합되는 2-디옥시리보오스 유닛을 의미한다. 뉴클레오티드는 또한, 예를 들어, 일 구체예에서, RNA 뉴클레오티드와 같은 리보오스 유닛을 포함한다.
여기에서 사용되는 경우, "뉴클레오티드 유사체"라는 용어는 비-자연적 일어나는 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 예컨대, 일 바람직한 구체예에서, 리보오스 유닛 은 2-디옥시리보오스와 다르고/또는 질소 염기는 A, C, T 및 G와 다르고/또는 인터뉴클레오시드 인산염 결합기는 다르다. 뉴클레오시드 유사체의 특정 예는 예컨대, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, and in Schemes 1에 의해 설명된다.
"상응하는 뉴클레오시드/노클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오시드/뉴클레오티드"라는 용어는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 및 뉴클레오시드/뉴클레오티드 내에 질소 염기와 동일하다는 것을 가리키는 것으로 의도된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 2-디옥시리보오스 유닛은 아데닌과 연결되고, "상응하는 뉴클레오시드 유사체"는 아데닌과 연결된 펜토오스 유닛(2-디옥시리보오스와 다르다)을 포함한다.
"핵산"이라는 용어는 둘 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 공유 결합에 의해 형ㅅ어되는 분자로 정의된다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 여기에서 상호변화가능하게 사용된다. 예를 들어, DNA 및 RNA는 핵산이다.
"핵산 유사체"라는 용어는 바람직한 구체예에서, LNA 유닛과 같은 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체 및 적어도 하나의 뉴클레오티드의 서열과 같은 화합물과 결합하는 비-자연적 일어나는 핵산을 의미한다. 그러한 화합물은 포유동물 유기체 (또는, 일 구체예에서는 본 발명시에 포유동물 유기체 내에 발견되는 것이 공공연하게 알려져 있지 않았다)에서는 자연적으로 발견되지 않는다.
바람직한 뉴클레오티드 유사체는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA, 가장 바람직한 베타-D-옥시-LNA와 같은 LNA이다. 본 발명의 화합물은 전형적으로 상기 뉴클레오티드는 인산염(phosphate)기, 포스포로티오에이트기, 및 보라노포스페이트(boranophosphate)기로 구성된 군으로부터 선택된 결합기를 포함하고, 인터뉴클레오시드(internucleoside) 결합은 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, 특히, 인산염기 및/또는 포스포로티오에이트기인 것이다. 일 특정한 구체예에서, 모든 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트기를 포함한다. 일 구체예에서, 뉴클레오티드 일부 또는 전부는 포스포로티오에이트기에 의해 서로 결합된다. 적절하게, 모든 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트기에 의해 서로 결합된다.
뉴클레오티드는 전형적으로 결합기에 의해 서로 결합된다.
뉴클레오티드 유사체 및 핵산 유사체는 예컨대, Freier & Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443) 및 Uhlmann (Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)에 개시된다. 도식 1 및 2는 핵산을 만들기 위한 적절한 뉴클레오티드 유사체의 선택적인 예를 나타낸 것이다.
Figure 112008026859529-PCT00001
도식 1
흥미로운 구체예에 있어서, 상기 화합물은 3~12개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 6 또는 7개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 가장 양호한 구체예에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체의 적어도 1개는 잠금 핵산 (LNA)이고, 예컨대 이들 뉴클레오티드 유사체의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 적어도 11개가 LNA일 수 있으며, 하나의 구체예에 있어서, 모든 뉴클레오티드 유사체가 LNA일 수 있다.
"LNA"는 1개의 바이시클릭 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 뉴클레오티드 유사체이고, LNA 단량체로서도 역시 불렸다.
"LNA"가 "LNA 올리고뉴클레오티드"의 문구에서 사용되는 경우, 이는 1개 이상의 바이시클릭 뉴클레오시드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물 중에서 사용되는 잠금 핵산 (LNA)은 구조가 다음 일반식이고,
Figure 112008026859529-PCT00002
X 및 Y는 -O-, -S-, -N(H)-, N(R)-, -CH2- 또는 -CH-(이중 결합의 일부라면), -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH-(이중 결합의 일부라면), -CH=CH-의 군 가운데서 독립적으로 선택되는데, 여기서 R는 수소 및 C1 -4 알킬로부터 선택된다. Z 및 Z＊는 뉴클레오시드간 결합, 말단기 또는 보호기 가운데서 독립적으로 선택된다. B는 천연 또는 비천연 핵염기를 구성하고, 비대칭기가 다른 배향(配向) 중에서 발견될 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물 중에서 사용되는 잠금 핵산 (LNA)은 다음 식의 어느 하나에 따른 적어도 1개의 잠금 핵산 (LNA) 유닛을 포함한다.
Figure 112008026859529-PCT00003
상기 식 중에서, Y는 -O-, -S-, -NH- 또는 N(RH)이고, Z 및 Z＊는 뉴클레오시드사이 결합, 말단기 또는 보호기 가운데서 독립적으로 선택된다. B는 천연 또는 비천연 핵염기를 구성하고, RH는 수소 및 C1 -4 알킬로부터 선택된다.
좋기로는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 중에서 사용되는 잠금 핵산 (LNA)은 -O-P(O)2-0-, -O-P(O,S)-0-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O- -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(0)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오시드간 결합을 포함하고, 여기서 RH는 수소 및 C1 -4 알킬로부터 선택된다.
언급된 바와 마찬가지로, 본 발명의 흥미로운 구체예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 화합물은 LNA (Locked Nucleic Acid)라고 불리는 적어도 1개의 화학 유닛을 함유한다.
특히 양호한 LNA 유닛들은 도식 2에서 보여진다.
Figure 112008026859529-PCT00004
도식 2
"티오-LNA"는 상기 일반식 중의 적어도 1개의 X, Y는 S 또는 -CH2-S-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두 중에 있을 수 있다.
"아미노-LNA"는 상기 일반식 중의 적어도 1개의 X, Y는 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, -CH2-N(R)- (여기서 R는 수소 및 C1 -4 알킬로부터 선택되는 것이다)로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 아미노-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두 중에 있을 수 있다.
"옥시-LNA"는 상기 일반식 중의 적어도 1개의 X, Y는 -O- 또는 -CH2-O-를 나타내는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두 중에 있을 수 있다.
"에나(ena)-LNA"는 상기 일반식 중의 Y는 -CH2-O- (여기서 -CH2-O-의 산소 원자는 핵염기 B에 대하여 2'-위치에 부착된다)인 잠금 뉴클레오티드를 포함한다.
양호한 구체예에 있어서, LNA는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA, 특히 베타-D-옥시-LNA로부터 선택된다. 뉴클레오시드 및/또는 LNA들은 일반적으로 인산염기 및/또는 포스포로티오에이트기에 의하여 상호 결합된다.
"적어도 1개"는 1보다 크거나 같은, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 등의 정수를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 마찬가지로, "표적 핵산"은 Apo-B100을 코딩하는 DNA, 그러한 DNA로부터 전사되는 RNA (전구(前驅) mRNA, mRNA 및 mRNA 에디트(edit)를 포함하는) 및 또한 그러한 RNA로부터 유래되는 cDNA를 포함한다.
"표적 단백질"은 포유 동물의 아포지단백질 B, 좋기로는 인간의 아포지단백질 B이다. ApoB-100 및 ApoB-48 모두가 동일한 유전자 서열로부터 발생하듯이, 본 발명에 따른 올리고머 화합물은 아포지단백질 B 형태들의 어느 하나 또는 모두, mRNA를 코딩하는 모든 ApoB-100 및 ApoB-48을 코딩하는 RNA 에디트(edit)된 형태의 하향 조절용으로 사용될 수 있다는 사실은 인식될 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 마찬가지로, "유전자"는 엑손, 인트론, 코딩하지 않는 5' 및 3' 영역, 조절 요소, 이들의 현재까지 알려진 모든 변이체 및 설명될 수 있는 임의의 추가 변이체들을 비롯한 유전자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 마찬가지로, "mRNA"는 표적 유전자의 현재까지 알려져 있는 mRNA 전사(들) 및 동일시될 수 있는 임의의 추가의 전사를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 마찬가지로, "조절"은 유전자 발현의 증가 (자극) 또는 감소 (억제) 중의 어느 하나를 의미한다. 본 발명에 있어서, 억제는 유전자 발현 조절의 양호한 형태이고, mRNA는 양호한 표적이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 특정의 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물 "타겟팅 (targeting)"은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포, 동물 또는 인간에게 안티센스 화합물이 결합하고 이것의 의도된 표적의 기능을 조절할 수 있도록 제공하는 것을 의미한다.
양호한 뉴클레오티드 유사체는 LNA이다.
더 양호한 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오시드간의 인산염 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)인 것이다.
더욱 양호한 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드가 뉴클레오시드간의 포스포로티오에이트 결합이 있는 LNA인 것이다.
흥미로운 구체예에 있어서, 본 발명의 화합물의 3' 말단은 뉴클레오티드 유사체보다는 뉴클레오티드를 포함한다.
좋기로는, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 올리고머 화합물은 적어도 1개의 잠금 핵산 (LNA) 유닛, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 잠금 핵산 (LNA) 유닛을, 좋기로는 4개 내지 9개의 LNA 유닛, 예컨대 6~9개의 LNA 유닛, 가장 좋기로는 6, 7 또는 8개의 LNA 유닛을 포함한다. 좋기로는 LNA 유닛은 적어도 1개의 베타-D-옥시-LNA 유닛, 에컨대 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 베타-D-옥시-LNA 유닛을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 올리고머 화합물은 1종보다 많은 LNA 유닛을 포함할 수 있다고 생각될 수 있지만, 모든 LNA 유닛이 베타-D-옥시-LNA 유닛일 수도 있다. 적절하게, 올리고머 화합물은 D-베타 또는 L-알파 배열 또는 이들의 혼합 중에서 베타-D-옥시-LNA 및 1개 이상의 다음 LNA 유닛, 즉 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, 에나-LNA 및/또는 알파-LNA 모두를 포함할 수 있다.
LNA 뉴클레오티드 유사체 등의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 본 발명의 화합물의 구체예에 있어서, 서브시퀀스는 일반적으로 본 명세서에 정의된 LNA 뉴클레오티드 유사체 등의 뉴클레오티드 유사체의 2~6개의 스트레치를 포함하고, 이는 본 명세서에서 정의된 LNA 뉴클레오티드 유사체 등의 뉴클레오티드의 2~6개의 스트레치에 연결된 뉴클레오티드의 4~12개의 스트레치에 의하여 연결되어 있다.
LNA 뉴클레오티드 유사체와 같은 뉴클레오티드 유사체의 스트레치, 그다음에 연결된 뉴클레오티드 스트레치에 그 다음 연결된 뉴클레오티드 유사체 LNA들의 스트레치를 포함하는 서브시퀀스는 갭머(gapmer)로서 알려져 있다.
적절하게, 하나의 그러한 "갭머(gapmer)" 구체예에 있어서, 상기 서브시퀀스는 본 명세서에서 정의된 LNA 뉴클레오티드 유사체 등의 4개의 뉴클레오티드 유사체의 스트레치를 포함하고, 이는 본 명세서에 정의된 LNA 뉴클레오티드 유사체 등의 4개의 뉴클레오티드 유사체의 스트레치에 연결된 8개의 뉴클레오티드에 연결되 있고, 필요에 따라 3' 말단의 단독 뉴클레오티드를 함께 포함한다. 그러한 고안은 매우 효과적인 것으로 놀랍게도 나타났다.
하나의 추가의 "갭머" 구체예에 있어서, 상기 서브시퀀스는 본 명세서에 정의된 LNA 뉴클레오티드 유사체 등의 3개의 뉴클레오티드의 스트레치에 연결된 8개의 뉴클레오티드의 스트레치에 연결된 본 명세서에서 정의된 것과 같은 LNA 뉴클레오티드 유사체 등의 4개의 뉴클레오티드의 스트레치를, 필요에 따라 3' 말단의 단독 뉴클레오티드와 함께 포함한다.
좋기로는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 올리고머 화합물은 LNA 및 DNA 유닛 모두를 포함할 수 있다. 좋기로는 LNA 및 DNA 유닛의 결합 총수는 14 내지 20 사이이고, 예컨대 15~18, 더 좋기로는 16 또는 17개의 LNA/DNA 유닛이다. 좋기로는 본 발명의 올리고머 화합물 중에 존재하는 DNA에 대한 LNA의 비는 0.3 내지 1 사이이고, 더 좋기로는 0.4 내지 0.9, 예컨대 0.6 내지 O.8이다.
좋기로는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 올리고머 화합물은 A (5' 영역)는 적어도 1개의 LNA 유닛, 예컨대 1~6개 사이의 LNA 유닛, 좋기로는 2~5개의 LNA 유닛, 가장 좋기로는 4개의 LNA 유닛을 구성 또는 포함하고, B (중앙 영역)는 좋기로는 A에 대하여 3' 인접하게, 적어도 1개의 DNA 당(糖) 유닛, 예컨대 1~12개의 DNA 유닛, 좋기로는 4~12개의 DNA 유닛, 더 좋기로는 6~10개의 DNA 유닛, 예컨대 7~9개의 DNA 유닛, 가장 좋기로는 8개의 DNA 유닛을 구성 또는 포함하고, C (3' 영역)는 좋기로는 B에 대하여 3' 방향 바로 옆, 적어도 1개의 LNA 유닛, 예컨대 1~6개의 LNA 유닛, 좋기로는 2~5개의 LNA 유닛, 가장 좋기로는 4개의 LNA 유닛을 구성 또는 포함하는 것인 식 (5'에서 3'으로), A-B-C (및 필요에 따라 D)의 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 갭머이다. 양호한 갭머 설계는 공보 WO2004/046160에 개시되어 있다.
갭머 올리고뉴클레오티드에 있어서, 좋기로는 DNA 유닛을 포함 또는 구성하는 상기 중앙 영역 (C) 내부에는 어떠한 미스매치(mismatch)도 존재하지 않는 것이 좋다. RNAse H 소화를 위하여 적어도 5개의 연속적인 뉴클레오티드 (또는 올리고/표적 혼성에 대한 RNaseH를 동원할 수 있는 유사체)가 중앙 영역에 필요하다는 사실은 일반적으로 발견되어 있다. 그러므로, 중앙 영역이 5개의 연속적인 뉴클레오티드를 초과하는 갭머를 위하여, 바람직하지는 않지만, 1개 또는 가능하다면 2개의 미스매치가 수용될 수 있다는 사실은 파악된다.
갭머 올리고뉴클레오티드의 한 가지 구체예에 있어서, 임의의 미스매치는 5' 또는 3' 말단 쪽에 위치하는 것이 좋을 수 있다. 그러한 구체예에 있어서, 표적 mRNA와 미스매치를 포함하는 갭머 올리고뉴클레오티드 중에, 그러한 미스매치는 5' 및/또는 3' 영역에 위치하고/위치하거나 상기 미스매치는 상기 갭머 올리고뉴클레오티드 및 표적 분자의 5' 또는 3' 말단 뉴클레오티드 유닛 사이에 있는 것이 좋다.
한 가지 구체예에 있어서, 식 A-B-C의 갭머는 1 및 2개의 DNA 당 잔기, 가장 좋기로는 1개의 DNA 당 잔기를 비롯한 1 내지 3개 사이의 DNA 당 잔기를 구성 또는 포함, 좋기로는 구성하는 추가 영역 D를 더 포함한다.
하나의 구체예에 있어서, LNA를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 본 발명에 따른 올리고머 화합물 내부에, 모든 LNA C 잔기(residue)는 5'메틸-시토신(Cytosine)이다.
한 가지 특히 흥미로운 구체예에 있어서, 상기 화합물은 식이
5'-[(LNA)3-4-(DNA/RNA)8-9-(LNA)3-(DNA/RNA)1]-3'
이고, 여기서 "LNA"는 LNA 뉴클레오티드를 말하고, "DNA"와 "RNA"는 각각 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드를 말한다.
더 상세하게 말하자면, 상기 화합물은 서열번호: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47로 이루어진 군으로부터 선택된다. 양호한 화합물은 서열번호: 29, 30, 31, 32, 36, 37, 38, 40, 41 및 42로 이루어진 군으로부터 또는 서열번호: 30 및 31로 구성되는 군으로부터 및/또는 서열번호: 36, 37 및 38로 이루어진 군으로부터 및/또는 서열번호: 41 및 42로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 현재 가장 양호한 화합물은 서열번호: 29, 서열번호: 30 및 서열번호: 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
적절하게, 상기 뉴클레오티드 및/또는 상기 LNA는 인산염기 및/또는 그들 조합의 포스포로티오에이트기에 의하여 상호 연결될 수 있다.
한 가지 구체예에 있어서, 상기 뉴클레오티드 및/또는 상기 LNA는 좋기로는 포스포로티오에이트기에 의하여 상호 연결된다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 29를 포함 또는 구성하는 올리고뉴클레오티드 화합물을 위하여 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 30을 포함하거나 또는 서열번호: 30으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 31을 포함하거나 또는 서열번호: 31로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 32를 포함하거나 또는 서열번호: 32로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 33을 포함하거나 또는 서열번호: 33으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 34를 포함하거나 또는 서열번호: 34로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 35를 포함하거나 또는 서열번호: 35으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 36을 포함하거나 또는 서열번호: 36으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 37을 포함하거나 또는 서열번호: 37로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 38을 포함하거나 또는 서열번호: 38로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 39를 포함하거나 또는 서열번호: 39로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 40을 포함하거나 또는 서열번호: 40으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 41을 포함하거나 또는 서열번호: 41로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 42를 포함하거나 또는 서열번호: 42로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 43을 포함하거나 또는 서열번호: 43으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 44를 포함하거나 또는 서열번호: 44로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 45를 포함하거나 또는 서열번호: 45로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 46을 포함하거나 또는 서열번호: 46으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 47을 포함하거나 또는 서열번호: 47로 이루어진 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 서열번호: 48, 49, 50 또는 51 등의 RNA 올리고뉴클레오티드인 경우, 3' 말단은 말단 리보뉴클레오티드에 바로 인접한 2개의 상호 결합된 2'-O-메틸-변형 리보뉴클레오티드 유닛을 함유한다.
올리고뉴클레오티드 화합물의 제조
LNA 뉴클레오티드 유사체 형성 블록 (β-D-옥시-LNA, β-D-티오-LNA, β-D-아미노-LNA 및 α-L-옥시-LNA)은 공개된 방법 및 거기에 인용된 참고 문헌, 예컨대 공보 WO 03/095467 A1; D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of lna Phosphoramidites, Synthesis 6, 802~808; M. D. Sorensen, L. Kværno, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (α-l-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176; S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079; C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663; 및 공보 WO 2004/069991 A2에 따라 제조될 수 있다.
티미딘 LNA 단량체의 한 가지 특정의 예시는 (1S, 3R, 4R, 7S)-7-히드록시-1-히드록시메틸-3-(티민-1일)-2,5-디옥사-바이시클로[2:2:1]헵탄이다.
LNA 올리고뉴클레오티드는 실시예 및 공보 WO 99/14226, WO 00/56746, WO 0056748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2000/094250 및 WO 03/006475 중에 설명되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 따라서, LNA 올리고뉴클레오티드는 유기화학 기술 분야의 평균적 숙련자에게 잘 알려진 핵산 화학의 올리고머화(oligomerization) 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 포스포라미다이트 접근법 (S. L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223)의 표준 올리고머화순환이 사용될 수 있으나, 예컨대 H-포스포네이트 화학, 포스포트리에스테르 화학도 역시 사용될 수 있다.
일부의 단량체를 위하여, 더 긴 커플링 시간 및/또는 반복 커플링 및/또는 더 농축된 커플링 시약의 사용이 필요하거나 유익할 수 있다.
포스포라미다이트는 일반적으로 만족스러운 95% 이상의 단계적 수율을 지닌 커플을 사용하였다. 인산(Ⅲ)을 산화시켜 인산(Ⅵ)를 얻는 것은 보통 예컨대, 요오딘/피리딘/H2O와 함께 행하여진다. 이는 탈보호 후에 본래의 포스포로디에스테르 뉴클레오시드간의 결합을 얻는다. 이 경우에 타이올화 단계를 포스포로디에스테르 뉴클레오시드간 결합의 합성에 사용되는 보통의, 예컨대 요오딘/피리딘/H2O 산화를 ADTT 시약 (잔탄(xanthane) 수소화물 (0.01M 아세토니트릴: 피리딘 9:1; v/v))을 사용하는 산화로 교체함으로써 수행하여 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 제조하였다. 뷰케이지 (Beatcage) 및 PADS 등의 기타 타이올화 시약 역시 사용 가능하다. 포스포로티오에이트 LNA 올리고뉴클레오티드를 98% 이상의 단계적 커플링 수율로서 효율적으로 합성하였다.
β-D-아미노-LNA, β-D-티오-LNA 및/또는 α-L-LNA를 함유하는 LNA 올리고뉴클레오티드를 포스포아미다이트 공정을 이용하여 98% 이상의 단계적 커플링 수율로서 효율적으로 역시 합성할 수 있다.
일회용 역상(逆相) 정제 카트리지 및/또는 역상 HPLC 및/또는 에탄올 또는 부탄올로부터의 침전을 이용하여 LNA 올리고뉴클레오티드의 정제를 달성할 수 있다. 모세관 겔 전기영동, 역상 HPLC, MALDI-MS 및 ESI-MS를 합성 LNA 올리고뉴클레오티드의 순도를 확인하는 데 사용한다.
염
상기 LNA 올리고뉴클레오티드는 여러 가지 약학적으로 허용되는 염에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 LNA 올리고뉴클레오티드의 필요한 생물학적 활성은 유지하면서 불필요한 독성학적 효과는 최소한으로 나타내는 염을 말한다. 그러한 염의 예로서는 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 나트륨, 칼륨 등의 금속 양이온 및 그 유사물, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌-디아민, D-글루코사민, 테트라에틸암모늄 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 양이온 또는 이들의 조합, 예컨대 아연 탄닌산염 또는 그 유사물 등과 결합하여 형성된 유기 아미노산 및 염기 부가 염과 결합하여 형성될 수 있는데, 이들로 한정되는 것은 아니다.
그러한 염은 포스포로디에스테르기 및/또는 포스포로티오에이트기를 보유하는 LNA 올리고뉴클레오티드로부터 형성되며, 이 염은 예컨대, 적절한 염기와 결합한 염이다. 이들 염으로서는 예컨대, 원소 주기율표의 Ⅰa, Ⅰb, Ⅱa 및 Ⅱb 족의 금속으로부터 유래된 비독성 금속염, 특히 적절한 알칼리 금속염, 예컨대 리튬, 나트륨 또는 칼륨염 또는 알칼리 토금속염, 예컨대 마그네슘 또는 칼슘염을 들 수 있다. 그들은 그 밖에, 아연염 및 암모늄염 또한 예컨대 치환되지 않은 또는 히드록시기로 치환된 모노-, 비스- 또는 트리-알킬아민, 특히 모노-, 디- 또는 트리-알킬아민 등의 적절한 유기 아민과 결합한 또는 4급 암모늄 화합물과 결합한, 예컨대 N-메틸-N-에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-히드록시-저급 알킬)아민, 예컨대 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-히드록시에틸)아민, 2-히드록시-tert-부틸아민 또는 트리스(히드록시메틸)메틸아민, N,N-디-저급 알킬-N-(히드록시-저급 알킬)아민, 예컨대 N,N-디메틸-N-(2-히드록시에틸)-아민 또는 트리-(2-히드록시에틸)아민 또는 N-메틸-D-글루카민 또는 테트라부틸암모늄 염 등의 4급 암모늄 화합물과 결합하여 형성된 염을 포함한다. 리튬염, 나트륨염, 마그네슘염, 아연염 또는 칼륨염이 좋고, 특히 나트륨염이 좋다.
전구 약물( Prodrug )
한 가지 구체예에 있어서, 상기 LNA 올리고뉴클레오티드는 전구 약물의 형태일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 (by virtue) 음전하를 띤 이온이다. 세포의 친지질성 때문에, 올리고뉴클레오티드의 세포성 섭취(uptake)는 중성 또는 친지질성 동등물에 비하여 감소된다. 이 극성 "장애"를 전구 약물 접근법 (예컨대 Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application . Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140 참조)을 사용하여 피할 수 있다. 이 접근법에 있어서, LNA 올리고뉴클레오티드는 보호 방법으로 제조되어 LNA 올리고뉴클레오티드가 투입시에 중성이 되도록 한다. 이들 보호기는 LNA 올리고뉴클레오티드가 세포에 흡수되는 경우 제거될 수 있도록 설계된다. 이들 보호기의 예로서는 S-아세틸티오에틸 (SATE) 또는 S-피발로티오에틸 (t-부틸-SATE)을 들 수 있다. 이들 보호기는 핵산 분해 효소에 내성이 있고 세포내에서 선택적으로 제거된다.
콘쥬게이트
본 발명의 또 다른 관점은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 적어도 1개의 비(非)뉴클레오티드 또는 비(非)폴리뉴클레오티드 부분(moiety)이 공유 결합된 화합물을 포함하는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 관련 관점에 있어서, 본 발명의 화합물은 상기 리간드 콘쥬게이트를 형성하도록 리간드에 결합되어 안티센스 올리고뉴클레오티드에 비하여 콘쥬게이트의 세포성 섭취를 증가시키려는 것이다.
또한 본 발명의 화합물 또는 콘쥬게이트는 활성 약물 물질, 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 콜레스테롤 저하제, 항당뇨병제, 화학요법제 또는 항생제와 콘쥬게이트 또는 추가 콘쥬게이트될 수 있다.
본 문헌에 있어서, "콘쥬게이트"는 본 명세서에서 설명된 LNA 올리고뉴클레오티드가 1개 이상의 비뉴클레오티드 또는 비폴리뉴클레오티드 부분에 공유 결합하여 형성된 이질적인 분자를 나타내려는 것이다.
따라서, LNA 올리고뉴클레오티드가 이합체 또는 수상돌기의 구조로 배열될 수 있는 것과 마찬가지로, LNA 올리고뉴클레오티드는 예컨대, 콘쥬게이트되거나 또는 펩티드 핵산 (PNA), 단백질 (예컨대 표적 단백질을 위한 항체), 거대분자, 저 분자량의 약물 물질, 지방산 사슬, 당 잔기, 당단백질, 중합체 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜), 미셀 형성기, 항체, 탄수화물, 결합 수용기, 콜레스테롤 등의 스테로이드, 폴리펩티드, 아크리딘 유도체 등의 중격제(intercalating agent), 긴 사슬 알코올, 덴드리머(dendrimer), 인지질 및 기타 친지질성기 또는 이들의 조합 등을 비롯한 비뉴클레오티드 또는 비폴리뉴클레오티드 부분과 결합하여 키메라를 형성할 수 있다. LNA 올리고뉴클레오티드 또는 콘쥬게이트는 활성 약물 물질, 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 술파 약물, 항당뇨병제, 항균제, 화학 치료 요법 화합물 또는 항생제에도 역시 콘주게이트 또는 추가 콘쥬게이트 될 수 있다.
이 방식의 콘쥬게이트는 LNA 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성에 관하여 이로운 특징을 수여한다. 특히, 이 방식의 콘쥬게이트는 세포성 섭취의 증가를 달성한다.
한 가지 구체예에 있어서, LNA 올리고뉴클레오티드는 리간드에 결합하여 콘쥬게이트를 형성하고, 상기 리간드는 안티센스 LNA 올리고뉴클레오티드에 비하여 콘쥬게이트의 세포성 섭취를 증가시키려는 것이다. 이 콘쥬게이트화는 말단 위치 5'/3'-OH에서 일어날 수 있지만, 상기 리간드는 당 및/또는 염기에서도 역시 일어날 수 있다. 특히, 안티센스 LNA 올리고뉴클레오티드가 콘쥬게이트될 수 있는 성장 인자는 트랜스페린 또는 엽산를 함유할 수 있다. 트랜스페린-폴리리신-올리고뉴클레오티드 복합체 또는 엽산-폴리리신-올리고뉴클레오티드 복합체는 높은 수준의 트랜스페린 또는 엽산 수용체를 나타내는 세포에 의하여 섭취되도록 제조될 수 있다. 기타의 콘쥬게이트/리간드의 예로서는 콜레스테롤 부분, 이크리딘 등의 이중 삽입제(intercalator), 폴리-L-리신, 포스포로모노티오에이트 등의 1개 이상의 핵산 분해 효소 내성 연결기와 결합한 "말단 캡핑 (end-capping)" 등을 들 수 있다.
트렌스페린 복합체의 올리고뉴클레오티드를 세포에 섭취시키는 담체로서의 제조법은 와그너 (Wagner et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87, 3410-3414 (1990))에 의하여 설명되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전달을 비롯하여 엽산-거대분자 콘쥬게이트의 엽산 수용체 세포내이입(엔도시토시스)을 통한 전달은 로우 (Low et al., 미국 특허 제5,108,921호)에 의하여 설명되어 있다. 또한 리아몬 (Leamon et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . 88, 5572 (1991))을 참조하라.
약학적 조성물
본 발명의 특정한 흥미로운 면은 여기에서 정의된 화합물 또는 여기에서 정의된 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 아쥬반트를 포함하는 약학적 조성물을 가리킨다. 특정한 흥미로운 구체예에서, 약학적 조성물은 경구 투여를 위해 개조된 것이다.
약학적 조성물의 제조용 지시는 Alfonso R.Gennaro에 의한 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" 및 아래에서 찾을 수 있다.
본 발명은 특히 약학적 조성물과 관련있는 것으로, 활성 성분으로서, 적어도 1개의 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 구성물을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 필요에 따라 약학적 담체를 포함하고, 약학적 조성물은 필요에 따라 안티센스 화합물, 화학요법의 작용제, 콜레스테롤 저하제, 항-염증 화합물, 항바이러스 화합물 및/또는 면역-조절 화합물을 더 포함한다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 적어도 1개의 치료적/예방적 화합물을 더 포함한다. 화합물은 전형적으로, 담즙염 격리 수지 (예컨대, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 및 콜레세벨람 하이드로클로라이드), HMGCoA-리덕타제 억제제 (예컨대, 로바스타틴, 세리바스타틴, 프레바스타틴, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 및 플루바스타틴), 니코틴산, 피브르산 유도체 (예컨대, 클로피브레이트, 젬피브로질, 페노피브레이트, 베자피브레이트 및 시프로피브레이트), 프로부콜, 네오마이신, 덱스트로티록신, 식물 스탄올 에스터, 콜레스테롤 흡수 억제제 (예컨대, 이제티마이브), 임플리타피드(implitapide), 담즙산 운반체 (첨단(apical) 나트륨 의존성 담즙산 운반체)의 억제제, 간장 CYP7a의 조절제, 에스트로겐 대체 치료제 (예컨대, 타모시펜), 및 항-염증성 (예컨대, 당질코르티코이드)로 구성된 군에서 전형적으로 선택된다.
본 발명에서 포함된 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 콘쥬게이트는 다양한 약학적으로 허용가능한 염에서 개시될 수 있다. 여기에서 사용한 것처럼, 그 용어는 여기에서 동정된 화합물의 소망하는 생물학적 활성을 함유하고, 소망하지않는 최소한의 독성 효과를 나타내는 염을 언급한 것이다, cf."콘쥬게이트".
본 발명의 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 콘쥬게이트는 전구약물의 형태일 수 있다, cf."전구약물".
본 발명은 또한 여기에서 개시된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 콘쥬게이트의 제형(formulation)을 함유한다. 약학적으로 허용가능한 결합제 및 아쥬반트는 조제된 약의 일부를 포함한다. 캡슐, 정제, 및 알약 등은 다음의 화합물의 예를 위해 포함된다: 미세결정 셀룰로오스, 결합제로써 검(gum) 또는 젤라틴; 부형제(excipient)로써 스타치(starch) 또는 락토오스; 윤활제로써 스테아르산염; 다양한 감미료 또는 향미료. 캡슐을 위한 투약(dosage) 단위는 지방유와 같은 액체 담체를 포함한다. 유사하게 당 또는 장의(enteric) 작용제는 투약 유닛의 일부일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 제형은 활성 약학적인 성분의 에멀젼 및 마이셀 에멀젼을 형성하는 지질일 수 있다. 그러한 제형은 특히 경구 투여에 유용하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 소망하는 작용에 손상을 주지않는 어떤 재료 또는 소망하는 작용을 보충하는 어떤 재료와도 혼합가능하다. 이것은 다른 뉴클레오티드를 함유하는 다른 약물을 함유할 수 있다.
비경구, 피하(皮下), 피내(皮內), 국부 투여를 위해, 제형은 무균의 희석제, 버퍼, 긴장성(tonicity)의 조절제 및 항박테리아제를 함유할 수 있다. 활성 화합물은 체내로부터 분해 또는 즉각적인 제거에 대하여 보호할 수 있는, 조절된 방출 능력을 가지는 이식편(implants) 또는 미세캡슐을 함유하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 정맥주사 투여를 위해, 선호되는 담체는 생리학적 식염수 또는 인산염 완충 식염수이다.
바람직하게, 올리고뉴클레오티드 화합물은, 치료되는 환자에게 심각한 부작용을 일으키지 않는 치료적으로 유효한 양을 환자에게 전달하기에 충분한 양으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에서와 같이, 유닛 제형 내에 함유된다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료되는 부위와, 국소적 또는 전신의 치료 어떤 것이 바람직한지에 좌우되는 여러 방법들로 투여될 수 있다. 투여는 (a) 경구, (b) 폐의, 예컨대, 분말 또는 에어로졸의 흡입기; 기관을통해(intratracheal), 비강을통해(intranasal)에 의한 것을 함유하는 흡입 또는 주입(insufflation); (c) 상피, 경피, 눈의 및, 질 및 직장의 전달을 함유하는 점막의,를 함유하는 국부, 또는 (d) 정맥, 동맥, 피하, 복막내(intraperitoneal), 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개의 (intracranial), 예컨대, 수막강내(intrathecal), IVH(intraventricular), 투여일 수 있다. 일 구체예에서, 활성 LNA 올리고뉴클레오티드는 IV, IP, 경구, 국부적으로 또는 볼루스(bolus) 주사로써 투여되거나, 표적(target) 장기로 직접 투여될 수 있다.
국부 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고제, 로션, 크림, 젤, 드롭(drops), 스프레이, 충전재(suppositories), 액체 및 분말을 함유할 수 있다. 종래의 약학적 담체, 수성의, 분말 또는 오일 염기, 증점제(thickeners) 및 그 유사물은 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 및 그 유사물 또한 이용가능하다. 바람직한 외용 제제(topical formulation)는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스터, 스테로이드, 킬레이팅제, 및 계면활성제와 같은 국부 전달제와 함께 혼합되는 형태를 포함한다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 이것에 제한되는 것은 아니나, 분말 또는 입자(granule), 미세입자(microparticulates), 나노입자(nanoparticulates), 물 또는 비-수성 미디어(media) 내에 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 사쉐(sachet), 정제 또는 미니정제를 함유한다. 전형적으로, 비경구, 수막강내(intrathecal), IVH(intraventricular) 투여를 위한 조성물 및 제형은 버퍼, 희석제, 및 이것에 제한되는 것은 아니지만, 침투율 향상제(penetration enhancers), 담체 화합물과 같은 적절한 다른 첨가제들을 포함하는 무균 수성 용액 및 다른 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유한다.
본 발명의 약학적 조성물은, 이것에 제한되는 것은 아니나, 용액, 에멀젼 및 리포솜-함유 제형을 함유한다. 이 조성물은 이것에 제한되는 것은 아니나, 전(per)형성된 액체, 자기유화 고체(self-emulsifying solid) 및 자기유화반고체(self-emulsifying semisolid)를 함유하는 다양한 성분으로부터 제조될 수 있다. 간 조직으로의 약물 전달은, 이것에 제한되는 것은 아니나, 양이온 리포솜(cationic liposome), 시클로덱스트린, 포르피린유사체, 가지달린 사슬 덴드리머(branched chain dendrimer), 폴리에틸렌이민 폴리머, 나노입자 및 마이크로스피어(microsphere)를 함유하는 미세담체-매개 전달에 의해 향상될 수 있다(Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27).
본 발명의 약학적 제형은, 편리하게는 유닛 투약 형태로 존재하는 것으로, 이것은 약학 산업에서 잘 알려진 종래 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술은 약학적인 담체(들) 또는 부형제(들)과 활성 성분과 연결을 초래하는 단계를 함유한다. 일반적으로, 제형은 균일하고, 직접적으로 활성 성분과 액체 담체 또는 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 다와 연결을 초래하고, 필요하다면, 그리고나서 제품을 모양을 만드는 것에 의해 제조된다.
본 발명의 조성물은 이것에 제한되는 것은 아니나, 정제, 캡슐, 젤(gel) 캡슐, 액체 시럽, 부드러운 젤 및 충전재와 같은 여러 가능한 투약 형태들 중 어느 것으로 제조가능하다. 본 발명의 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합된 미디어(media)로써 또한 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 예컨대, 소디움 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 함유하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 또한 포함한다. 현탁액은 또한 안정제(stabilizer)를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 LNA는 상기에서 가리킨 바와 같이 많은 수의 치료적 적용에 유용하다. 일반적으로, 본 발명의 치료 방법은 치료적으로 유효한 양의 LNA-변형된 올리고뉴클레오티드를 포유동물, 특히 인간에게, 투여하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 안티센스 화합물 및 (b) 비-안티센스 기전에 의해 기능하는 하나 이상의 다른 콜레스테롤 저하제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물과 사용할 때, 그러한 콜레스테롤 저하제는 개별적으로(예컨대, 아토르바스타틴 및 올리고뉴클레오티드), 연속적으로 (예컨대, 아트로바스타틴 및 올리고뉴클레오티드 한동안 그리고나서 다른 작용제 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 그러한 콜레스테롤 저하제와 조합하여 사용될 수 있다. 기술분야에 알려진 모든 콜레스테롤 저하제는 본 발명에 따른 화합물과 함께 혼합 치료로써 여기에 포함될 수 있다.
항염증 약물, 이것에 제한되는 것은 아니나, 비스테로이드 항염증 약물 및 코르티코스테로이드, 항바이러스 약물, 및 면역조절 약물은 본 발명의 조성물과 혼합될 수 있다. 둘 이상의 혼합된 화합물은 함께 또는 연속하여 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 첫번째 핵산에 표적화된(targeted) 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드 및 두번째 핵산 표적(target)에 표적화된 하나 이상의 추가적인 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 둘 이상의 혼합된 화합물은 함께 또는 연속적으로 사용가능하다.
투약(dosing)은 처리되는 질병 상태의 심각성(severity) 및 반응성에 좌우되고, 몇일에서 몇달까지로부터 지속되는 처리(treating) 또는 치료(cure)까지의 과정은 달성되거나, 질병 상태의 감소가 달성된다. 최적 투약 스케쥴은 환자의 체내에 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다.
최적 복용(dosing)은 개개 올리고뉴클레오티드의 상대적인 잠재능에 좌우되어 변화할 수 있다. 일반적으로, 시험관 내 및 생체 내 동물 모델에서 효과적인 것으로 나타난 EC50을 기초하여 평가될 수 있다. 일반적으로, 복용은 체중 1kg 당 0.01㎍ 부터 1g까지이고, 하루, 일주일, 한달, 1년에 하나 이상, 또는 심지어 매2 내지 10년 만에 한번 또는 몇 달에 이르는 시간동안 연속적인 주입에 의해 주어질 수 있다. 복용의 반복율은 체액 또는 조직내에 약물의 측정된 농도 및 지속시간에 기초하여 평가된다. 성공적인 치료후에, 질병상태의 재발을 막기위해 환자가 유지 치료법을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.
치료 방법
기술 분야에 당업자는 LNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드 화합물이 여러 상이한 원리에 의한 아포지단백질B (Apo-B100) 연결된 질병과 투쟁하는데 사용될 수 있고, 이것은 본 발명의 정신에 포함되는 것이다.
LNA 올리고뉴클레오티드 화합물은 아직은 부족하게 이해되고 있는 "안티센스-유사" 기전에 의해 특정 내생(endogenous) 또는 외래(exogenous) 유전자가 침묵하는 세포에 의해 사용되는 작은 이중 가닥 RNA 분자들인 siRNA's로써 고안될 수 있다.
β-D-oxy-LNA는 RNaseH의 활성을 지지해주지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 이것은 갭머(gapmer)라고 불리우는, β-D-oxy-LNA 및 DNA로 구성된 키메라 올리고뉴클레오티드를 만드는 것에 의해 본 발명에 따라 변화될수 있다. 갭머는 4-12 nt DNA의 중심 스트레치 또는 β-D-oxy-LNA의 1 내지 6 잔기(플랭크(flnak))에 의해 측면에 전형적으로 위치되는 RNaseH (갭)에 의해 인식가능하고 쪼갤수 있는 변형된 모노머들에 기초한다. 플랭크는 또한 LNA 유사체로 구성될 수 있다. RNaseH 매개된 기전을 통해 작용할 수 있는 본 발명에 따른 다른 키메라 구조물이 있다. 해드머(headmer)는 5'말단에 β-D-oxy-LNA 또는 LNA 유사체의 인접(contiguous) 스트레치, 다음으로, 3'말단으로 향하는 RNaseH에 의해 인식가능하고 쪼개질 수 있는 변형된 모노머 또는 DNA의 인접스트레치에 의해 정의되고, 테일머(tailmer)는 5'-말단에 RNaseH에 의해 인식가능하고 쪼개질 수 있는 변형된 모노머들 또는 DNA의 인접스트레치 그 다음으로, 3'-말단으로 향하는 β-D-oxy-LNA 또는 LNA 유사체의 인접(contiguous) 스트레치로 정의된다. DNA의 번갈아 일어나는 조성 또는 RNaseH 및 β-D-oxy-LNA 및/또는 LNA 유사체들에 의해 인식가능하고 쪼갤수 있는 변형된 모노머들로 구성되는 본 발명에 따른 믹스머(mixmer)라고 불리우는 다른 키메라들은 RNaseH, 결합 및 절단을 매개할 수 있다. 어떤 범위에 α-L-LNA는 RNaseH 활성을 모으기 때문에, 갭머 구조물을 위한 RNaseH에 의해 인식가능하고 쪼갤 수 있는 변형된 모노머들 또는 DNA의 작은 갭들은 필요하고, 믹스머 구조 내에 더 많은 유연성이 도입될 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 진단적 효율성은 약물동력학, 예컨대, 흡수, 분배, 세포적 섭취(uptake), 대사 및 배설의 중요한 범위(significant extent)에 의존한다. 차례로, 이러한 파라미터들은 올리고뉴클레오티드의 3차원 구조, 크기 및 기초를 이루는 화학에 의해 중요하게 좌우된다.
본 발명에 따른 LNA 올리고뉴클레오티드의 약물동력학적인 성질을 조절하는 것은 다양한 상이한 부분(moieties)의 결합을 통해 추가적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포막을 통과하는 올리고뉴클레오티드의 능력은 예컨대, 콜레스테롤 잔기(moiety), 티오에테르, 지방 사슬, 인지질 또는 폴리아민과 같은 지질 잔기(moiety)들과 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 증가된다. 유사하게, LNA 뉴클레오티드의 세포로의 섭취(uptake)는 막내에 분자들과 반응하는 올리고뉴클레오티드와 부분(moieties)과의 콘쥬게이션에 의해 증가되고, 이것은 세포질로의 수송을 매개한다.
약물동력학적 성질은 본 발명에 따라, 올리고머 섭취를 향상시키는 것, 분해에 저항성있는 올리고머를 증가시키는 것과 같은 생물안정성을 증가시키는 것, 및/또는 예컨대, mRNA 서열과 함께 올리고뉴클레오티드 혼성화 특징의 특이성 및 친화도를 증가시키는 것의 그룹으로 증가될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 ApoB-100의 비정상적 수준과 관련된 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
그러한 상태의 예는 고리포단백혈증, 가족성 타입 3 고지단백혈증 (가족성 고베타지단백혈증), 가족성 고알파지단백혈증(hyperalphalipoprotienemia); 고지혈증, 혼합된 고지혈증, 다원성(multiple) 지단백-타입 고지혈증, 및 가족성 혼합된 고지혈증; 고중성지방혈증, 가족성 고중성지방혈증, 및 가족성 지단백 분해효소; 고콜레스테롤혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증 가족성 고콜레스테롤혈증, 다원성 고콜레스테롤혈증, 및 가족성 결함있는 아포지단백질B; 아테크롬성 동맥경화증 및 관상 동맥 질병을 함유하는 심장혈관 질환; 혈전증; 말초 혈관 질환; 폰기에르케병 (글리코겐 저장 질병, 타입 I); 지방성이영양증(선천적인 및 획득된 형태); 쿠싱 증후군, 성 아테로이틱 왜소발육증(sexual ateloitic dwarfism) (분리된 성장 호르몬 결핍); 당뇨병; 갑상선항진증; 고혈압; 거식증; 워너증후군; 급성 간혈성 포르피리아; 원발성 담즙경화 (primary biliary cirrhosis); 간외성 담관 5 폐쇄(extrahepatic biliary 5 obstruction); 급성 간염; 간종양; 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis); 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathies) (골수종, 다발성 골수종, 매크로글로불린혈증, 및 림프종 포함); 내분비질환(endocrinopathies); 비만; 네프로시스증후군; 대사 증후군; 염증; 갑상선 기능저하증; 요독증(hyperurecemia); 발기부전(impotence); 폐쇄성 간질환; 특발성 고칼슘혈증; 디스클로풀리네미아(dysqlobulinemia); 상승된 인슐린 수준; X 증후군; 뒤피트렌 근위축증(Dupuytren's contracture); 에이즈; 알츠하이머병 및 치매이다.
본 발명은 또한 아포지단백질B 발현을 억제하기 위해 충분한 상당한 양의 본 발명의 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상태의 위험을 줄이는 방법을 제공하는 것으로, 상기 상태는 임신; 간헐성 파행증(intermittent claudication); 통풍(gout); 및 수은 중독(mercury toxicity) 및 아말감 질병(amalgam illness)에서 선택된다. 본 발명은 또한 아포지단백질 B 발현을 억제하기에 충분한 상당한 양의 본 발명의 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관 내피에 결합하는 콜레스테롤 입자를 억제하는 방법을 제공하고, 그 결과, 본 발명은 (i) 콜레스테롤 입자 산화; (ii) 혈관 내피에 결합하는 단핵세포(monocyte); (iii) 마크로파지내로 단핵세포 분화; (iv) 산화된 지질 30 입자의 마크로파지 섭식(macrophage ingestion) 및 사이토카인(이것에 제한되는 것은 아니나, IL-1, TNF-alpha, TGF-beta를 함유하는)의 방출 ; (v) 섬유질의 지방섬유 손상(fibrous fibrofatty lesion)의 혈소판 형성 및 염증; (vi) 클럿(clot)에 이르는 내피 손상; 및 (vii) 심근 경색 또는 발작에 이르는 클럿들의 위험을 감소하는 방법을 제공하는 것으로, 또한 아포지단백질B의 발현을 억제하기 위해 충분한 상당한 양의 본 발명의 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 알코올 중독, 흡연, 경구 피임약의 사용, 당질코르티코이드의 사용, 베타-아드레날린 차단제의 사용, 또는 이소트레티니온(13-시스 레티노산)의 사용과 관련된 고지혈증을 감소하는 방법을 제공하는 것으로, 또한 아포지단백질B의 발현을 억제하기 위해 충분한 상당한 양의 본 발명의 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 여기에 개시된 어떤 및 모든 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 화합물의 사용을 또한 제공한다.
일반적으로 말해서, 본 발명의 일면은 ApoB-100의 비정상적 수준과 관련된 상태에 있기 쉬운, 상태로부터 고통받는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것으로, 하나 이상의 LNA 유닛을 포함하는 Apo-B100이 표적화된 올리고뉴클레오티드의 치료적으로 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 흥미로운 면은 상기에 따른 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 여기에 정의된 화합물, 여기에서 정의된 콘쥬게이트의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 좋기로는ApoB-100의 비정상적 수준에 의해 야기된 질병에 대한 치료 또는 예방을 위해 개시된다.
또한, 여기에 개시된 본 발명은 치료를 필요로 하는 사람에게, 이것에 제한되는 것은 아니나, 높은 용량의 올리고머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 화합물을 조절하는 ApoB-100의 치료적으로 유효량을 포함하는 질병의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 본 발명은 올리고 뉴클레오티드 화합물을 조절하는 ApoB-100의 짧은 기간의 투여의 사용을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물은 리간드/콘쥬게이트에 연결된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포적 흡수(uptake)를 증가시키는 방법이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물은 또한 활성 약물 물질, 예컨대, 아스피린, 이브프로펜, 설파제, 항당뇨제(antidiabetic), 항박테리아제, 또는 항생제와 콘쥬게이트될 수 있다.
달리 말하자면, 본 발명은 또한 ApoB-100의 비정상적 수준을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 필요로 하는 환자에게 여기에서 정의된 약학적 조성물 또는 여기에서 정의된 화합물 또는 콘쥬게이트를 투여하는 단계와 추가적인 화학치료요법제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 상기 추가적인 투여는 추가적인 화학치료요법제가 본 발명의 화합물과 콘쥬게이트될 수있고, 약학적 조성물에 존재하거나, 분리된 제형에 투여될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하는 LNA는 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로써 또한 활용될 수 있다. 연구에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 및 실험동물 내에 Apo-B100의 합성을 억제하고, 이것에 의해, 표적(target)의 기능적 분석 또는 치료 개입 (therapeutic intervention) 을 위한 표적(target)으로써 그것의 유용성의 평가를 가능하게 한다. 진단에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 노던 블롯팅, 인-시투 혼성화 또는 유사한 기술에 의해 세포 내 및 조직의 Apo-B100 발현을 정량하고 검출하는데 사용될 수 있다. 치료를 위해, 질병 또는 질환을 갖는 것으로 의심되는 Apo-B100의 발현의 조절에 의해 치료가능한 동물 또는 사람은 본 발명에 따라 안티센스 화합물을 투여하는 것에 의해 치료된다. 본 발명의 조성물 또는 하나 이상의 안티센스 화합물의 치료적으로 또는 예방적으로 유효량을 투여하는 것에 의해 Apo-B100의 발현과 관련된 질병 또는 상태를 갖는 것으로 또는 걸리기 쉬운 것으로 의심되는 사람을 치료하거나, 동물 특히 마우스(mouse) 및 쥐(rat)를 치료하는 방법을 추가적으로 제공한다.
본 발명은 또한 약제로써 사용되기 위해 여기에서 정의된 화합물 또는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 Apo-B100의 비정상적 수준을 치료하기 위한 약제의 제조를 위해 여기에서 정의된 화합물 또는 콘쥬게이트의 사용에 관한 것이다. 전형적으로, Apo-B100의 상기 비정상적인 수준은 아테크롬성 동맥경화증, 고콜레스테로혈증, 또는 고지혈증에 있다.
또한, 본 발명은 아테크롬성 동맥경화증, 고콜레스테로혈증, 또는 고지혈증으로부터 선택된 질병 또는 상태로부터 고통받는 대상을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 여기에서 정의된 약학적 조성물을 필요로하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 약학적 조성물은 경구 투여된다.
본 발명의 몇몇 구체예
1. 총 12 내지 50개의 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체로 구성된 올리고머 화합물로, 상기 화합물은 적어도 10개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 서브시퀀스를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 48 및 서열번호: 50으로 구성된 군에서 선택된 서열에 위치되고, 상기 화합물은 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 올리고머 화합물.
2. 제1항에 따른 화합물에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 상기 각각의 가닥은 총 16 내지 30개의 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 상기 화합물은 적어도 10개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 서브시퀀스를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 27, 28, (및/또는 48 또는 50)으로부터 선택된 서열 내에 위치되고, 상기 화합물은 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
3. 12 내지 25개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 구성된 구체예 1에 따른 화합물.
4. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 구성된 구체예 3에 따른 화합물.
5. 16 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 구성된 구체예 4에 따른 화합물.
6. 구체예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 인산염기, 포스포로티오에이트(phosphorothioate)기, 및 보라노포스페이트(boranophosphate)기로부터 선택된 결합기를 포함하고, 뉴클레오시드간 결합은 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-인 것인 화합물.
7. 구체예 6에 따른 화합물에 있어서, 상기 결합은 인산염기인 것인 화합물.
8. 구체예 6에 따른 화합물에 있어서, 상기 결합은 포스포로티오에이트기인 것인 화합물.
9. 구체예 6에 따른 화합물에 있어서, 모든 뉴클레오티드들은 포스포로티오에이트기를 포함하는 것인 화합물.
10. 3-12 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 구체예 9에 따른 화합물.
11. 6개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 구체예 10에 따른 화합물.
12. 구체예 10-11 중 어느 하나에 따른 화합물에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체의 적어도 한개는 잠금 핵산 (LNA)인 것인 화합물.
13. 구체예 12에 따른 화합물에 있어서, 상기 LNA는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA로부터 선택된 것인 화합물.
14. 구체예 13에 따른 화합물에 있어서, 상기 뉴클레오시드 및/또는 LNA들은 인산염기에 의해 함께 결합되어 있는 것인 화합물.
15. 구체예 14에 따른 화합물에 있어서, 상기 뉴클레오시드 및/또는 LNA들은 포스포로티오에이트기에 의해 함께 결합되어 있는 것인 화합물.
16. 구체예 12에 따른 화합물에 있어서, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 2인 것인 화합물.
17. 구체예 12에 따른 화합물에 있어서, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 3인 것인 화합물.
18. 구체예 16-17 중 어느 하나에 따른 화합물에 있어서, 상기 3' 말단 LNA는 상응하는 천연 뉴클레오시드에 의해 교체되는 것인 화합물.
19. 서열번호: 29로 구성된 화합물.
20. 서열번호: 30으로 구성된 화합물
21. 구체예 1-20 중 어느 하나에 따른 화합물 및 상기 화합물과 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비(non)-뉴클레오티드 또는 비(non)-폴리뉴클레오티드 부분(moiety)을 포함하는 것인 콘쥬게이트.
22. 구체예 1-20 중 어느 하나에 의해 정의된 화합물 또는 구체예 21에서 정의된 콘쥬게이트, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 아쥬반트를 포함하는 약학적 조성물.
23. 적어도 1개의 콜레스테롤 저하 화합물을 포함하는 구체예 22에 따른 약학적 조성물.
24. 구체예 23에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 화합물은 담즙염 격리 수지 (예컨대, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 및 콜레세벨람 하이드로클로라이드), HMGCoA-리덕타제 억제제 (예컨대, 로바스타틴, 세리바스타틴, 프레바스타틴, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 및 플루바스타틴), 니코틴산, 피브르산 유도체 (예컨대, 클로피브레이트, 젬피브로질, 페노피브레이트, 베자피브레이트 및 시프로피브레이트), 프로부콜, 네오마이신, 덱스트로티록신, 식물 스탄올 에스터, 콜레스테롤 흡수 억제제 (예컨대, 이제티마이브), 임플리타피드(implitapide), 담즙산 운반체 (첨단(apical) 나트륨 의존성 담즙산 운반체)의 억제제, 간장(hepatic) CYP7a의 조절제, 에스트로겐 대체 치료제 (예컨대, 타모시펜), 및 항-염증제 (예컨대, 당질코르티코이드)로 구성된 군에서 선택된 것인 약학적 조성물.
25. 약제용으로 사용하기 위한 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에서 정의된 화합물 또는 구체에 21에서 정의된 콘쥬게이트.
26. 아포-B100의 비정상적 수준을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에서 정의된 화합물 및 구체에 21에서 정의된 콘쥬게이트의 용도.
27. 구체예 26에 따른 용도에 있어서, 상기 아포리포단백질-B100의 비정상적인 수준은 아테롬성 동맥경화증, 과다콜레스테롤 또는 고지혈증의 형태인 것인 용도.
본 발명은 후술하는 실시예에 의해 비제한적인 방식으로 추가적으로 기재될 것이다.
도 1A: 서열번호: 29의 지질보조 섭취(uptake), siRNA (비변형된) 또는 콜레스테릴 변형된 siRNA 후 마우스(mouse) 간세포 (Hepa1-6 세포들) 내에 상대적인 ApoB mRNA 발현.
도 1B: 서열번호: 29 및 30으로 처리한 후 BNLCL2 세포들 내에 상대적인 ApoB 발현. 두 화합물 모두 1nM 또는 5nM 농도에서 이미 ApoB-100의 강력한 억제제이다.
도 2A: 서열번호: 29, siRNA (비변형된)(서열번호: 48/49) 또는 콜레스테릴 변형된 siRNA (서열번호: 50/49) 처리 (3일동안 매일 i.v.) 후 간에서 상대적인 ApoB mRNA 발현.
도 2B: 서열번호: 29, siRNA (비변형된)(서열번호: 48/49) 또는 콜레스테릴 변형된 siRNA (서열번호: 50/49) 처리 (3일동안 매일 i.v.) 후 공장(jejunum)에서 상대적인 ApoB mRNA 발현.
도 3: 서열번호: 29, siRNA (비변형된)(서열번호: 48/49) 또는 콜레스테릴 변형된 siRNA (서열번호: 50/49) 처리된 마우스들의 혈장 내 콜레스테롤의 상대적인 수준.
도 4: BNCL 또는 Hepa 1-6 세포들에서 생체 밖(in vitro) ApoB-100 표적(target) 하향조절. 마우스 세포주들로부터 (GapDH로 표준화된) ApoB mRNA 수준 상에 서열번호: 29 및 37의 투약 반응 효과.
도 5A: C57BL/6 마우스들의 LNA 안티센스 처리후 간에서 생체 내 ApoB-100 침묵(silencing). LNA 안티센스 분자는 C57BL/6 마우스들에서 3 연속적인 날들에 1회 투여 (6.25, 12.5 or 25 mg/kg) 및 siRNA (50 mg/kg)가 투여되었다. ApoB-100 발현은 qPCR에 의해 측정되고, Gapdh로 표준화되었다. 자료는 평균±SD (n=7)을 나타낸다.
도 5B: C57BL/6 마우스들의 LNA 안티센스 처리후 공장에서 생체 내 ApoB-100 침묵(silencing). LNA 안티센스 분자는 C57BL/6 마우스들에서 3 연속적인 날들에 1회 투여 (6.25, 12.5 or 25 mg/kg) 및 siRNA (50 mg/kg)가 투여되었다. ApoB-100 발현은 qPCR에 의해 측정되고, Gapdh로 표준화되었다. 자료는 평균±SD (n=7)을 나타낸다.
도 6A: LNA 안티센스 처리후 혈장 콜레스테롤 수준. LNA 안티센스 분자는 C57BL/6 마우스들에서 3 연속적인 날들에 1회 투여 (6.25, 12.5 or 25 mg/kg) 및 siRNA (50 mg/kg)가 투여되었다. LDL-콜레스테롤 수준은 칼라리메트릭(colorimetric) 키트를 이용하여 측정되었다. 자료는 평균±SD (n=7)을 나타낸다.
도 6B: LNA 안티센스 처리후 혈장 콜레스테롤 수준. LNA 안티센스 분자는 C57BL/6 마우스들에서 3 연속적인 날들에 1회 투여 (6.25, 12.5 or 25 mg/kg) 및 siRNA (50 mg/kg)가 투여되었다. 혈장 총 콜레스테롤 수준은 칼라리메트릭(colorimetric) 키트를 이용하여 측정되었다. 자료는 평균±SD (n=7)을 나타낸다.
도 7: ApoB 표적 핵산의 선호되는 서열의 역(reverse) 상보물(compliment)의 서열 비교를 나타낸 것으로, 본 발명에 따른 올리고머 화합물의 고안에 사용된다.
도 8: 서로다른 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 Huh-7 (간세포) 세포들 내에 생체 밖(in vitro) 스크린 및 투약 반응 (1, 5, 또는 25nM) 및 표적(target) mRNA (ApoB-100) 하향 조절(QPCR)로서 측정된 올리고뉴클레오티드의 효과.
도 9: QPCR에 의해 분석된 Huh-7 세포들에서 측정된, 7개의 선택된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 위한 IC50 (표적(target) (ApoB-100) 발현의 50% 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도).
도 10A: 28일에 희생하여 간에서 측정된 ApoB-100 mRNA 수준. C57BL/6 마우스들은 4주동안 1주일에 2회 2.5 mg/kg/dose (총 8회 투약) 또는 1주일에 1회 5 mg/kg (총 4회 투약)으로 투약되었다.
도 10B: 후안 혈액(retro-orbital blood)에서 혈장 LDL 수준은 4주동안 1주일에 1회 측정되었다. C57BL/6 마우스들은 4주동안 1주일에 2회 2.5 mg/kg/dose (총 8회 투약) 또는 1주일에 1회 5 mg/kg (총 4회 투약)으로 투약되었다.
도 11A: 3, 5, 8, 13, 또는 21일에 희생하여 간 내 ApoB-100 mRNA로서 측정되는 작용의 지속. C57BL/6 마우스들은 서열번호: 37로 25 mg/kg/dose의 1, 2, 또는 3회 투약되었고, 각 투약량은 연속적인 1, 2, 또는 3일에 각각 투약되었다.
도 11B: 3, 5, 8, 13, 또는 21일에 희생하여 측정된 총 혈장 콜레스테롤 수준. C57BL/6 암컷 마우스들은 서열번호: 37로 25 mg/kg/dose의 1, 2, 또는 3회 투약되었고, 각 투약은 연속적인 1, 2, 또는 3일에 각각 투약되었다.
실시예 1: 모노머 합성
LNA 모노머 빌딩 블럭 및 그 유사체는 다음의 공개된 절차 및 거기에 인용된 참고문헌들에 따라 제조된다, 참고:
WO 03/095467 A1
D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.
M. D. Søensen, L. Kværnø, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (α-l-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176.
S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2＇-Amino- and 2＇-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.
C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sørensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2＇-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663.
D. S. Pedersen, T. Koch (2003) Analogues of LNA (Locked Nucleic Acid). Synthesis of the 2＇-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl Cytosine Phosphoramidites, Synthesis 4, 578-582.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드는 1μmol 내지 15μmol 크기에서 Expedite 8900/MOSS 합성기 (Multiple Oligonucleotide Synthesis System) 상에 포스포라미다이트 접근을 이용하여 합성하였다. 더 큰 크기의 합성을 위해 Akta Oligo Pilot가 사용되었다. 합성의 마지막에서 (DMT-on), 올리고뉴클레오티드는 상온에서 1-2시간동안 수성 암모니아를 이용하여 고체 지지체로부터 쪼개졌고, 또한 65℃에서 4시간동안 디프로펙트(deprotect) 되었다. 올리고뉴클레오티드는 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 정제되었다. DMT-그룹의 제거후에, 올리고뉴클레오티드는 AE-HPLC, RP-HPLC, 및 CGE에 의해 특징되었고, 분자량은 ESI-MS에 의해 확인되었다. 더 많은 자세한 사항은 아 래를 참고하라.
LNA-고체 지지체의 제조:
LNA 숙시닐 헤미에스터의 제조
5'-O-Dmt-3'-히드록시-LNA 모노머 (500mg), 숙신산 무수물 (1.2 eq.) 및 DMAP (1.2 eq.)는 DCM (35mL)에 용해되었다. 반응은 상온에서 밤새도록 흔들면서 진행되었다. NaH2PO4 0.1M pH5.5 (2x) 및 브라인(1x)로 추출 후에, 유기층은 무수 Na2SO4로 더 건조시키고, 증발시켰다. 헤미에스터 유도체는 95% 수율로 얻어졌고, 추가적인 정제없이 이용되었다.
LNA-지지체(support)의 제조
상기에서 제조된 헤미에스터 유도체(90μmol)는 최소량의 DMF에 용해되었고, DIEA 및 pyBOP(90μmol)이 추가되고, 1분동안 함께 혼합되었다. 이 전(pre)-활성화된 혼합물은 LCAA-CPG (500Å, 80-120 mesh size, 300 mg)와 메뉴얼 합성기에서 혼합되고, 휘젓어졌다. 상온에서 1.5시간 후에, 지지체는 필터되었고, DMF, DCM 및 MeOH로 세척되었다. 건조후에, 로딩은 57μmol/g되도록 측정되었다 (Tom Brown, Dorcas J.S.Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In: F.Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14 참고).
올리고뉴클레오티드의 연장
포스포라미다이트(A(bz), G(ibu), 5-methyl-C(bz)) 또는 T-β-시아노에틸-포 스포라미다이트)의 커플링은 활성제로써 아세토니트릴 (0.25M)에서 DCI(4,5-디시아노이미다졸) 및 아세토니트릴에서 5'-O-DMT-보호된 아미다이트 0.1M의 용액을 이용하여 수행되었다. 타이올화(thiolation)는 잔탄 클로라이드(아세토니트릴 내 0.01M:피리딘 10%) 를 이용하여 수행되었다. 시약의 나머지는 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 전형적으로 사용되었던 것들이다. 서플라이어(supplier)에 의해 제공된 프로토콜은 알맞게 최적화되었다.
RP-HPLC 에 의한 정제:
컬럼: Xterra RP18
흐름율: 3 mL/min
버퍼들: 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴
약어
DMT: 디메톡시트리틸
DCI: 4,5-디시아노이미다졸
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DCM: 디클로로메탄
DMF:디메틸포름아미드
THF:테트라히드로퓨란
DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민
PyBOP: 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포 스페이트
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
실시예 3: 올리고뉴클레오티드 화합물의 고안
siRNA는 21-뉴클레오티드 센스 가닥 (서열번호: 27) 및 23 뉴클레오티드 안티센스 가닥 (서열번호: 28)- 안티센스 가닥의 3'말단에서 두개-뉴클레오티드 오버행(overhang)이 일어나는-이다.
ApoB-siRNA 센스 5'-GUCAUCACACUGAAUACCAA*U-3'(서열번호: 48), ApoB-1-siRNA 안티센스 가닥 5'-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGAc*a*C-3 (서열번호: 49) 및 ApoB-siRNA-Chol 센스 가닥: 5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU*Chol-3' (서열번호: 50)은 RNATEC(Leuven)에 의해 합성되었다.
본 발명의 일 구체예에서, 서열번호: 2-26은 서열번호: 29-47와 같이, 6 또는 7 LNA 뉴클레오티드를 비롯한, 적어도 3개의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다.
표 1 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물
서열번호: 27, 28, 48, 49, 50에서, 상위 경우 글자는 리보뉴클레오티드 유 닛을 가리키고, 아래적은 문자 "s"는 포스포로티오트 결합을 나타낸다.
Figure 112008026859529-PCT00005
Figure 112008026859529-PCT00006
Figure 112008026859529-PCT00007
Figure 112008026859529-PCT00008
서열번호: 30은 본 발명에 따른 흥미로운 화합물이다.
실시예 4: 인간 또는 쥐 혈장에서 LNA 화합물의 안정성
LNA 올리고뉴클레오티드 안정성은 인간 또는 쥐로부터 혈장에서 시험되었다 (그것은 또한 마우스, 원숭이 또는 개 혈장에서도 할 수 있다). 45μl 혈장에서, 5μl올리고뉴클레오티드가 첨가되었다 (20μM의 최종농도). 올리고들은 37℃에서 0 내지 96시간동안 혈장에서 인큐베이션 되었다 (혈장은 96시간까지 뉴클레아제 활성을 위해 측정되었고, 뉴클레아제 쪼개짐-패턴상에 차이를나타내지 않았다). 지정된 시간에서, 샘플은 액체 질소에서 스낼-프로즌(snap-frozen) 되었다. 혈장 내 2μl (40pmol과 동일한) 올리고뉴클레오티드는 15μl의 물 및 3μl 6x 로딩 염료(Invitrogen)의 첨가에 의해 희석되었다. 마커로써 10bp 래더(ladder) (Invitrogen 10821-015)가 사용된다. 1μl까지 1μl 6x 로딩 및 4μl 물은 첨가되었다. 샘플은 혼합되었고, 10분동안 65℃에서 가열되고, 프리런(prerun) 젤 (16% 아크릴아미드, 7 M UREA, 1x TBE, pre-run at 50 Watt for 1h)에 로딩되고, 2 ½시간동안 50-60Watt에서 구동되었다. 다음으로, 젤은 1x SyBR 골드(molecular probes)로 1x TBE에서 15분동안 스테이닝되었다. 밴드는 Biorad로부터 Phosphoimager를 사용하여 시각화되었다.
실시예 5: 생체 밖(in vitro) 모델: 세포 배양
표적(target) 핵산 발현 상에 안티센스 화합물의 효과는 표적(target) 핵산이 측정가능한 수준으로 존재한다는 것을 제공하는 어떤 다양한 세포 타입들에서 시험될 수 있다.
표적은 상기 핵산을 코딩하는 핵산의 일시적인 또는 안정한 형질감염에 의해 내생적으로 발현될 수 있다.
표적(target) 핵산의 발현 수준은 예컨대, 노던 블럿 분석, 정량적 PCR, 리보뉴클레아제 프로텍션 어세이를 이용하여, 일상적으로 측정가능하다. 후술하는 세포 타입들은 예증적인 목적으로 제공되는 것이고, 다른 세포 타입들도 일상적으로 사용가능하고, 표적(target)이 선택된 세포 타입에서 발현된다는 것을 제공한다.
세포들은 하기에서 설명하는 적절한 배지에서 배양되었고, 5% CO2, 95-98% 습도, 37℃에서 유지되었다. 세포들은 일상적으로 1주마다 2-3번 계대되었다.
BNCL -2: 마우스(mouse) 간 세포주 BNCL-2는 ATCC로부터 구입되었고, 10% FBS + Glutamax I+ 비(non)-필수 아미노산들-겐타마이신 함유 DMEM (Sigma)에서 배양되었다.
Hepa1 -6: 마우스 간 세포주 Hepa1-6은 ATCC로부터 구입되었고, 10% FBS + Glutamax I+ 비-필수 아미노산들-겐타마이신 함유 DMEM (Sigma)에서 배양되었다.
HepG2: 인간 간 세포주 HepG2는 ATCC로부터 구입되었고, 10% FBS + Glutamax I+ 비-필수 아미노산들-겐타마이신 함유 DMEM (Sigma)에서 배양되었다.
실시예 6: 인 비트로 모델: 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료
세포 배양 및 형질감염(transfection): BNCL-2 또는 Hepa1-6 세포들은 10% FBS, Glutamax I 및 겐타마이신이 보충된 성장 배지에서 37℃ (5% CO2)에서 12-웰 플레이트에 시드(seed)되었다. 세포들이 60-70% 융합(confluent)되었을 때, 리포펙타민 2000 (5μg/mL)을 이용하여 서로다른 농도의 올리고뉴클레오티드 (0.04-25nM) 로 2통으로(in duplicates) 형질감염시켰다. 형질감염은 Dean et al. (1994, JBC 269:16416-16424)에 의해 개시된 것과 같이 필수적으로 수행되었다. 간단히, 세포들은 10분동안 OptiMEM에서 리포펙타민으로 인큐베이션되었고, 그 다음으로, 웰 당 총 부피 0.5mL 형질감염 믹스에 올리고뉴클레오티드가 첨가되었다. 4 시간 후에, 형질감염 믹스는 제거되었고, 세포들은 세척되고, 약 20시간동안 37℃에서 자랐다 (적절한 성장 배지 내에 mRNA 분석 및 단백질 분석). 세포들은 그리고나서 단백질 및 RNA 분석을 위해 얻어졌다.
실시예 7: 인 비트로 모델: RNA 및 cDNA 합성의 추출
총 RNA 분리
총 RNA 는 RNease mini kir (Qiagen)을 이용하여 분리되었다. 세포들은 PBS로 세척되었고, 그 웰에 1% 머캅토에탄올로 보충된 세포 용해 버퍼 (RTL, Qiagen)가 직접 첨가되었다. 몇분 후에, 시료는 제조자의 지시에 따라 처리되었다.
첫번째 가닥 합성
첫번째 가닥 합성은 제조자의 지시에 따라 (Qiagen) OmniScript 역전사효소 키트 또는 M-MLV 역전사효소 (제조자(Ambion)에 의해 개시된것과 같이 필수적으로)를 이용하여 수행되었다. OmniScript 역전사효소 키트를 이용 할 때, 0.5μg 총 RNA 각각의 샘플은 12μl로 조절되었고, 0.2μl 폴리 (dT)12-18 (0.5μg/μl) (Life Technologies), 2μl dNTP 믹스 (5mM 각각), 2μl 10x RT 버퍼, 0.5μl RNAguardTM RNase 억제제 (33 units/mL, Amersham) 및 1μl OmniScript 역전사효소와 혼합되었 고, 60분동안 37℃에서 인큐베이션되었고, 5분동안 93℃에서 열 불활성화되었다.
첫번째 가닥 합성이 랜덤 데카머(decamer) 및 M-MLV-역전사효소 (제조자(Ambion)에 의해 개시된 바와 같이 필수적으로) 를 이용하여 수행되는 경우, 0.25μg 총RNA의 각각 샘플은 H2O내에 10.8μl 로 조절되고, 2μl 데카머 및 2μl dNTP 믹스 (2.5mM 각각)는 첨가되었다. 샘플은 3분동안 70℃에서 가열되었고, 얼음물에서 즉시 냉각되었고, (2μl 10x RT 버퍼;1μl M-MLV 역전사효소; 0.25μl RNAase 억제제)를 함유하는 3.25μl 의 믹스에 첨가되었다. cDNA는 42℃에서 60분동안 합성되고, 10분동안 95℃에서 열 불활성화단계를 거치고, 최종적으로 4℃까지 냉각된다.
실시예 8: 생체 밖(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 모델: 리얼-타임 PCR 에 의한 Apo-B100 발현의 올리고뉴클레오티드 억제 분석
Apo-B100 발현의 안티센스 조절은 기술분야에 알려진 다양한 방법으로 어세이될 수 있다. 예컨대, Apo-B100 mRNA 수준은 예컨대, 노던 블럿 분석, 경쟁적 PCR, 또는 리얼-타임 PCR에 의해 정량될 수 있다. 리얼-타임 정량 PCR은 현재 선호된다. RNA 부석은 총 세포적 RNA 또는 mRNA상에 수행된다.
노던 블럿 분석과 같은 RNA 분리 및 RNA 분석의 방법은 기술분야에 일반적이고, 예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons에 개시되어 있다.
리어탈임 정량 (PCR)은 상업적으로 BioRAD에서 사용가능한 iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System을 이용하여 쉽게 이뤄질 수 있다. 리얼-타임 정량 PCR은 기술분야에 잘 알려진 기술이고, 예컨대, Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-99에 기재되어 있다.
Apo -B100 mRNA 수준의 리얼 -타임 정량 PCR 분석
처리된 및 비처리된 샘플 내 상대적인 마우스 ApoB mRNA 수준을 측정하기 위해, 생성된 cDNA는 BioRad로부터 iCycler를 이용하여 정량적 PCR 분석에 사용되었다.
8μl의 5배 (Gapdh 및 Beta-actin)의 희석된 cDNA는 29.5μl 플래티넘 qPCR을 함유하는 52μl의 믹스에 첨가되었다.
Supermix-UDG (in-vitrogen), 1030 nM의 각 프라이머, 0.57 X SYBR Green (Molecular probes) 그리고 11.4 nM 플루오레세인 (Molecular probes).
25μl의 한쌍 (duplicates)은 Q-PCR에 사용되었다: 120초동안 50℃, 120초동안 95℃ 및 40 사이클 [30초동안 95℃ 및 60초동안 60℃].
ApoB 발현은 50배 희석된 cDNA 및 스탠다드 Q-PCR 프로토콜을 이용하여 정량되었다. 프라이머들 (정방향 프라이머, 역방향 프라이머의 최종 농도는 각각 0.6μM 및 0.9μM)과 프로브 (최종 농도 0.1μM)는 2x 플레티넘 정량 PCR SuperMix UDG (cat.#11730, Invitrogen)과 혼합되었고, 최종 부피가 25μl가되도록 3.3μl cDNA에 첨가되었다. 각각의 샘플은 한쌍으로 분석되었다. PCR 프로그램: 2분동안 50℃, 10분동안 95℃ 그 다음에, 95℃, 15초, 60℃, 1분의 40사이클.
ApoB mRNA 발현은 Q-PCR을 이용하여 유사하게 정량된 마우스 β-액틴 또는 Gapdh mRNA에 표준화되었다.
프라이머:
mGapdh: 5'-agcctcgtcccgtagacaaaat-3'(서열번호: 51) 및 5'-gttgatggcaacaatctccacttt-3'(서열번호: : 52)
mβ-액틴: 5'-ccttccttcttgggtatggaa-3'(서열번호: : 53) 및 5'-gctcaggaggagcaatgatct-3'(서열번호: : 54)
mApoB: 5'-gcccattgtggacaagttgatc-3'(서열번호: : 55) 및 5'-ccaggacttggaggtcttgga-3'(서열번호: : 56)
mApoB Taqman probe: 5'-fam-aagccagggcctatctccgcatcc-3'(서열번호: : 57)
비처리된 마우스 간세포 세포주 (Hepa1-6 세포들) (5배 희석 및 ApoB 및 β-액틴 또는 Gapdh 모두 발현)로부터 합성된 cDNA 2배 희석액은 어세이를 위한 스탠다드 커브를 작성하기 위해 사용되었다. ApoB mRNA의 상대적인 정량은 iCycler iQ Real Time Detection System software를 이용하여 계산된 트레숄드 (threshold)사이클로부터 측정되었다.
실시예 9: Apo-B100 단백질 수준의 웨스턴 블럿 분석
형질감염된 세포들에서 Apo-B100 단백질 수준에서 Apo-B100 올리고들의 인 비트로 효과는 웨스턴 블럿팅에 의해 측정되었다.
세포들은 얻어졌고, 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)로 보충된 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% 글리세롤, 2.5% SDS, 5 mM DTT 및 6 M 요소에 용해되었다. 총 단백질 농도는 BCA 단백질 어세이 키트 (Pierce)를 이용하여 측정되었다. 50㎍ 총 단백질은 MOPS 내 10-12% Bis-Tris 젤 또는 3-8% 트리스 아세테이트 젤에서 구동되고, 제조자의 지시(Invitrogen)에 따라 PVDF 멤브레인 상에 블럿팅되었다. 블로킹 버퍼 (5% 저지방 우유 파우더로 보충된 PBS-T)에 밤새 인큐베이션 한 후, 멤브레인은 밤새 ApoB-100을 검출하는 1차 항체로 인큐베이션되었다. 로딩의 대조군으로, 튜블린 또는 액틴은 Neomarker로부터 모노클로날 항체를 사용하여 검출되었다. 멤브레인은 그리고나서 2차 항체로 인큐베이션되었고, ApoB-100은 Cromogenic immunodetection 키트 (Invitrogen) 또는 chemiluminescens ECL+ detection kit (Amersham)를 이용하여 보여졌다.
실시예 10: 생체 밖(in vitro) 분석: 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 Apo-B100 발현의 안티센스 억제
본 발명에 따라, 일련의 올리고뉴클레오티드는 인간 Apo-B100 RNA의 상이한 영역을 표적(target)으로 하여 고안되었다. 표 1을 참고. 올리고뉴클레오티드 화합물은 서열번호: 29, siRNA (비변형된) 또는 콜레스테릴 변형된 siRNA의 지질-보조 섭취 (도 1A와 2개의 LNA 올리고뉴클레오티드 서열번호: 29와 서열번호: 30에 의한 BNCL2에서 ApoB-100 (도1B)과 서열번호: 29 및 서열번호: 37에 의한 Hepa1-6 세포들 (도4)의 녹다운(knockdown)을 비교한 후 마우스 간세포(Hepa1-6세포들) 내 Apo-B100 mRNA 녹다운(knockdown)하는 능력이 평가되었다.
이 자료는 모크(mock) 형질감염된 세포들과 상대적으로 하향조절 퍼센트로 써 나타내었다. 전사 안정(steady) 상태는 리얼-타임 PCR로 모니터되었고, GAPDH 전사 안정 상태에 표준화되었다.
실시예 11: 올리고뉴클레오티드 화합물을 함유하는 LNA의 생체 내 표적(target) 하향 조절
C57BL/6 마우스들 (20 g) (그룹 크기: 7마리 마우스들)은 연속적인 3일동안 6.25, 12.5, 25 또는 50 mg/kg i.v.를 받았다. 안티센스 뉴클레오티드와 비교하여 siRNA-Chol의 분자량은 약 3:1이기 때문에, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 덜 투약하였다. 모든 siRNA's 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 0.9% 식염수 (NaCl)에 용해되었고, 10 mL/kg 체중에 주어졌다 (주사당 ~0.2 ml). 희생하여, 간의 무게를 기록하였다. ApoB mRNA 발현의 측정을 위한 조직은 후에 RNA (Ambion)에 사용될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 공장(jejunum) 및 간에서의 mRNA 분석과 혈장내 총 콜레스테롤은 마지막 정맥주사 후 24시간에 수행되었다 (도 2A 및 2B 참고).
실시예 12: 혈장 내 콜레스테롤 수준
혈장 내 총 콜레스테롤 수준은 ABX Pentra 로부터 colometric assay Cholesterol CP를 이용하여 측정되었다. 콜레스테롤은 효소적 가수분해 및 산화 후에 측정되었다. 21.5μl 물은 1.5μl 혈장에 첨가되었다. 250μl 시약은 첨가되고 5분내에 콜레스테롤 양이 540nM 파장에서 측정되었다. 각각의 동물 상에서 측정은 이중으로 하였다. 2배 희석된 대조군 화합물 (ABX Pentra N 대조군)로 민감도와 선형성(linearity)이 시험되었다. 상대적인 콜레스테롤 수준은 배경의 삭제를 통해 측정되었고, 식염수 처리된 마우스의 혈장에서 콜레스테롤 수준에 대하여 나타내었 다 (도 3 참고).
실시예 13: LNA 올리고뉴클레오티드 화합물의 생체 내 표적 하향 조절
C57BL/6 마우스들 (20 g) (그룹 크기: 7마리 마우스들)은 연속적인 3일동안 6.25, 12.5, 25 또는 50 mg/kg i.v.를 받았다. 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열번호: 29 및 서열번호: 37)는 0.9% 식염수 (NaCl)에 용해되었고, 10 mL/kg 체중에 주어졌다 (주사당 ~0.2 ml). ApoB mRNA 발현의 측정을 위한 조직은 사용될 때까지, 후에 RNA (Ambion)에 -20℃에서 저장하였다. 공장(jejunum) 및 간에서의 mRNA 분석과 혈장에서의 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤은 마지막 정맥주사 후 24시간에 수행되었다 (도 5A, 5B, 6A 및 6B 참고).
실시예 14: LNA 올리고뉴클레오티드 화합물의 마우스로의 경구 투여
C57BL/6 마우스들 (20 g)은 무균의 H2O (7.5 mg/ml), 0.1 mL 트윈80, 1.9 mL 올리브 기름 내에 1.0 mL 올리고뉴클레오티드 (서열번호: 29 또는 서열번호: 37)의 제형을 신선하게 제조하여 10 mL/kg, 즉. 0.2 mL을 받았다. 올리고뉴클레오티드 화합물의 최종 농도: 2.5mg/mL. 그 제형은 1분동안 흔들었고; 5분동안 (3회 반복) 초음파 처리하였다. 어떠한 부정적 효과(negative effect)도 관찰되지 않았다.
실시예 15: 생체 밖(in vitro) 분석: 세포 배양에 있어서 투약 반응 (인간 간세포 Huh-7)/ 인간 Apo-B100 발현의 안티센스 억제
본 발명에 따라, 일련의 올리고뉴클레오티드는 인간 Apo-B100 RNA의 상이한 영역을 표적으로 하여 고안되었다. 표 1을 참고. 올리고뉴클레오티드 화합물은 서열번호: 31-32, 36-38 및 40-42 (도 8)의 지질-보조 섭취 후 인간 간세포(Huh-7세포들) 내 Apo-B100 mRNA 녹다운(knockdown)하는 능력이 평가되었다. 실험은 실시예 5 내지 8에 기재된 것과 같이 수행되었다. 그 결과는 모든 화합물에 25nM로 매우 강력한 하향 조절(>80%)을 보여주었다. 그러나, 1nM에서 오직 2개의 화합물은 70%(서열번호: 37 및 40)정도의 높은 ApoB-100 mRNA 하향 조절을 나타내었고, 이것은 매우 강력한 하향 조절이다 (도 8).
실시예 16: 세포(인간 간세포 Huh-7) 배양에서 7개의 선택된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드의 IC50
50%의 ApoB-100 mRNA 발현 억제를 주는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도를 측정하기 위해, 생체 밖(in vitro) 하향 조절에서 가장 최상인 7개의 올리고뉴클레오티드는 IC50 연구로 선택되었다. 실험은 실시예 5-8에 개시된 바와 같이 하였다. 오직 서열번호: 36 및 37만이 약 1nM의 IC50을 갖었고, 반면에 서열번호: 38은 5.7정도의 높은 IC50을 갖었다 (도 9). 0.5nM의 IC50은 매우 강력한 화합물임을 가리키고, 이것은 서열번호: 37이 생체 내 데이터에 의해 확인되었다 (실시예17 및 실시예 18).
실시예 17:서열번호: 37의 1, 2, 또는 3회 복용(dose)의 작용 지속
C57BL/6 마우스들 (20 g) (그룹 크기: 5마리 마우스들)은 연속적인 1, 2, 또는 3일동안 6.25, 또는 25 mg/kg/dose i.p.를 받았다. 모든 안티센스 올리고뉴클레 오티드는 0.9% 식염수 (NaCl)에 용해되었고, 10 mL/kg 체중에 주어졌다 (주사당 ~0.2 ml). 희생하여 (3, 5, 8, 13 및 21일) 간의 무게는 기록되었다. ApoB mRNA 발현의 측정을 위한 조직은 사용될 때까지, 후에 RNA (Ambion)에 -20℃에서 저장하였다. 간에서 mRNA 분석은 희생하여 수행된 반면, 혈장 내 LDL- 및 총 콜레스테롤에서는 마지막 i.9. 주사후에 24시간, 2 또는 3 및 6, 11 및 19일 후에 수행되었다 (도 11). 이 연구는 서열번호: 37 복용(dose) 후에 매우 강력한 ApoB-100 mRNA의 하향 조절을 나타내었다: 1회 복용은 복용 후 3일부터 8일까지 45-60%의 ApoB mRNA 발현을 나타내었고, 반면에 3회 복용은 13일째에서 85-90%, 21일째에는 약 70%의 하향 조절을 나타내었고, 이것은 2 또는 3회 복용이 투여되는 경우, 간에서 20일 보다 길게 작용이 지속되는 것을 나타낸다. ApoB-100 mRNA 발현 및 총 콜레스테롤은 실시예 8 및 12에 기재된 바와 같이 측정되었다.
실시예 18: 서열번호: 37의 투약(dose) 요법
표적 (ApoB-100) mRNA 하향 조절 및 혈장 콜레스테롤 수준 (일주일에 1회 수집)상에 효과를 조사하기 위해, C57BL/6 마우스들 (20 g) (그룹 크기: 5마리 마우스들)은 일주일에 1회씩 4주동안 2.mg/kg/dose i.p.를 받았다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 0.9% 식염수 (NaCl)에 용해되었고, 10 mL/kg 체중에 주어졌다 (주사당 ~0.2 ml). 희생하여 (28일) 간의 무게는 기록되었다. ApoB mRNA 발현의 측정을 위한 조직은 사용될 때까지, 후에 RNA (Ambion)에 -20℃에서 저장하였다. 간에서 mRNA 분석은 희생하여 수행된 반면, 혈장 내 LDL 콜레스테롤은 7, 14, 21 및 28일에 측정되었다 (도 10 참고). 이 결과는 2.5mg/kg/dose로 일주일에 2번 투약한 후 식염수군 및 7일군과 비교하여 28일에서 30% 감소되는 시간에 LDL 콜레스테롤 수준의 선형적인 감소를 나타내었다. 일주일에 오직 한번 5mg/kg/dose로 투약한 것이지만 동일한 총량의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투약한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. 또한, 희생된 간에서의 ApoB-100 mRNA 수준은 (28일) 투약 요법(일주일에 1 또는 2회)과 독립적으로 28일에 20mg/kg 투약한 후 30-40%의 하향 조절을 나타내었다. 이러한 결과는 심지어 서열번호: 37의 낮은 투약에서도 ApoB-100의 중요한 하향 조절 효과를 나타내고, 이 하향 조절은 혈장내 LDL-콜레스테롤에서 30% 감소로 측정된 치료상에 효과를 갖는것을 나타낸다. ApoB-100 mRNA 발현 및 콜레스테롤 수준은 실시예 8 및 12에서 기재된 바와 같이 측정되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Santaris A/S <120> RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE INHIBITION OF APO-100 EXPRESSION <130> 16513PCT00 <160> 68 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Scambled LNA oligonucloeitde control <400> 1 cgtcagtatg cgaatc 16 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense motif <400> 2 ggtattcagt gtgatg 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense motif <400> 3 attggtattc agtgtg 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense motif <400> 4 ttgttctgaa tgtcca 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense motif <400> 5 tcttgttctg aatgtc 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense motif <400> 6 tggtattcag tgtgat 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense motif <400> 7 ttggtattca gtgtga 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense motif <400> 8 cattggtatt cagtgt 16 <210> 9 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5-methyl modified LNA cytosine <222> (3)..(3) <220> <221> LNA modified nucleotide <222> (13)..(15) <400> 44 cactaagaac cagaag 16 <210> 45 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Motif #24 <220> <221> 5-methyl modified LNA cytosine <222> (1)..(1) <220> <221> LNA modified nucleotide <222> (1)..(4) <220> <221> LNA modified nucleotide <222> (13)..(15) <220> <221> Phosphorothioate linkage <222> (1)..(15) <400> 45 ctaagaacca gaagat 16 <210> 46 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Motif #25 <220> <221> LNA modified nucleotide <222> (1)..(4) <220> <221> 5-methyl modified LNA cytosine <222> (13)..(13) <220> <221> LNA modified nucleotide <222> (13)..(15) <220> <221> Phosphorothioate linkage <222> (1)..(15) <400> 46 tgaatcgggt cgcatc 16 <210> 47 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Motif #26 <220> <221> LNA modified nucleotide <222> (1)..(4) <220> <221> Phosphorothioate linkage <222> (1)..(15) <220> <221> 5-methyl modified LNA cytosine <222> (13)..(13) <220> <221> LNA modified nucleotide <222> (13)..(15) <400> 47 tgaatcgggt cgcatt 16 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Unconjugated siRNA <400> 48 gucaucacac ugaauaccaa u 21 <210> 49 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Unconjugated siRNA <400> 49 auugguauuc agugugauga cac 23 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Cholesterol conjugated siRNA <400> 50 gucaucacac ugaauaccaa u 21 <210> 51 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Cholesterol conjugated siRNA <400> 51 auugguauuc agugugauga cac 23 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 52 agcctcgtcc cgtagacaaa at 22 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 53 gttgatggca acaatctcca cttt 24 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 54 ccttccttct tgggtatgga a 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 55 gctcaggagg 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motif <400> 65 atgactcaat ggaaaagt 18 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> target motif <400> 66 cactaagaac cagaaccaga agat 24 <210> 67 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> target motif <400> 67 tgaatcgggt cgcaty 16 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Subsequence/ preferred oligo motif <400> 68 tcttgttctg aatgtcca 18

Claims (35)

  1. 총 12 내지 50개의 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체로 구성된 올리고머 화합물로, 상기 화합물은 적어도 10개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 서브시퀀스를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로 구성된 군에서 선택된 서열에 상응하고, 상기 화합물은 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 올리고머 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 각각의 가닥은 총 16 내지 30개의 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 상기 화합물은 적어도 10개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 서브시퀀스를 포함하고, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로부터 선택된 서열 내에 위치되고, 상기 화합물은 적어도 3개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 서브시퀀스는 상기 적어도 3개의 뉴클레오 티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  4. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 서브시퀀스는 2 내지 6개의 뉴클레오티드 유사체의 스트레치, 그 다음으로, 4 내지 12개의 뉴클레오티드의 스트레치, 그 다음으로 2 내지 6개의 뉴클레오티드 유사체의 스트레치를 포함하는 것인 화합물.
  5. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 서브시퀀스는 상기 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로 구성된 군에서 선택된 서열 내 상응하는 서열과 비교할 때, 1개 또는 2개의 미스매치(mismatch)를 포함하는 것인 화합물.
  6. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 12 내지 25개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 구성된 것인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 구성된 것인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 15 또는 16 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 구성된 것인 화합물.
  9. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 인산염기, 포스포로티오에이트(phosphorothioate)기, 및 보라노포스페이트(boranophosphate)기로 구성된 군에서 선택된 결합기를 포함하고, 뉴클레오시드간 결합은 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-인 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 결합은 인산염기인 것인 화합물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 결합은 포스포로티오에이트기인 것인 화합물.
  12. 제10항에 있어서, 모든 결합들은 포스포로티오에이트기들인 것인 화합물.
  13. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3-12 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 6 또는 7 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 화합물
  15. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체의 적어도 3개를 비롯한, 적어도 1개는 잠금 핵산 (LNA), 또는 모든 뉴클레오티드 유사체들은 LNA인 것인 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 LNA는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA로부터 선택된 것인 화합물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 및/또는 LNA들은 인산염기 또는 포스포 로티오에이트기에 의해 함께 결합되어 있는 것인 화합물.
  18. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 63, 서열번호: 2, 서열번호: 3 및 서열번호: 11로 구성된 군에서 선택되는 것인 화합물.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 서브시퀀스는 서열번호: 18 또는 19을 비롯한 서열번호: 64, 서열번호: 20 또는 21)을 비롯한 서열번호: 65, 서열번호: 22, 23, 또는 24를 비롯한 서열번호: 66, 서열번호: 25 또는 26)을 비롯한 서열번호: 67, 및 서열번호: 4 또는 5를 비롯한 서열번호: 68로 이루어진 군에서 선택되는 것인 화합물.
  20. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 식
    5＇-[(LNA)2-6-(DNA/RNA)4-12-(LNA)2-6-(DNA/RNA)0-1]-3＇또는
    5＇-[(LNA)3-4-(DNA/RNA)8-9-(LNA)3-(DNA/RNA)1]-3＇를 가지고,
    "LNA"는 LNA 뉴클레오티드를 가리키고, "DNA" 및 "RNA"는 각각 디옥시리보뉴 클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 가리키는 것인 화합물.
  21. 서열번호: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47로 구성된 군에서 선택된 화합물.
  22. 제20항에 있어서, 서열번호: 29인 것인 화합물.
  23. 제20항에 있어서, 서열번호: 30인 것인 화합물.
  24. 제20항에 있어서, 서열번호: 37인 것인 화합물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 따른 화합물 및 상기 화합물과 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비(non)-뉴클레오티드 또는 비(non)-폴리뉴클레오티드 부분(moiety)을 포함하는 것인 콘쥬게이트.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 화합물 또는 제24항에서 정의된 콘쥬게이트, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 아쥬반트를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 경구 투여를 위해 개조된 것인 약학적 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 적어도 하나의 콜레스테롤-저하 화합물을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 화합물은 담즙염 격리 수지 (예컨대, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 및 콜레세벨람 하이드로클로라이드), HMGCoA-리덕타제 억제제 (예컨대, 로바스타틴, 세리바스타틴, 프레바스타틴, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 및 플루바스타틴), 니코틴산, 피브르산 유도체 (예컨대, 클로피브레이트, 젬피브로질, 페노피브레이트, 베자피브레이트 및 시프로피브레이트), 프로부콜, 네오마이신, 덱스트로티록신, 식물 스탄올 에스터, 콜레스테롤 흡수 억제제 (예컨대, 이제티마이브), 임플리타피드(implitapide), 담즙산 운반체 (첨단(apical) 나트륨 의존성 담 즙산 운반체)의 억제제, 간장 CYP7a의 조절제, 에스트로겐 대체 치료제 (예컨대, 타모시펜), 및 항-염증성 (예컨대, 당질코르티코이드)로 구성된 군에서 선택된 것인 약학적 조성물.
  30. 약제용으로 사용하기 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에서 정의된 화합물 또는 제25항에서 정의된 콘쥬게이트.
  31. 아포지단백질-B100의 비정상적 수준을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에서 정의된 화합물 및 제25항에서 정의된 콘쥬게이트의 용도.
  32. 제27항에 있어서, 상기 아포지단백질-B100의 비정상적인 수준은 아테롬성 동맥경화증, 과다콜레스테롤 또는 고지혈증으로 구성된 군에서 선택된 의학적 상태의 존재와 서로 관련있는 것인 용도.
  33. 아테롬성 동맥경화증, 과다콜레스테롤, 및 고지혈증으로부터 선택된 상태 또 는 질병으로 고통받는 대상을 치료하는 방법으로, 상기 방법은 필요로하는 대상에 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에서 정의된 콘쥬게이트 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 약학적 조성물 또는 콘쥬게이트는 경구 투여되는 것인 방법.
  35. 아포지단백질 B를 하향-조절하는 방법으로, 상기 방법은 제33항에서 정의된 대상을 비롯한 대상에 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에서 정의된 약학적 조성물 또는 콘쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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