KR20080048034A - 만성 신장병증 치료용 인자 ｈ 및 이의 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인과적으로 단백뇨와 관련되지 않는 만성 신장병증 및 인과적으로 단백뇨와 관련된 만성 신장병증 둘다를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 인자 H의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인자 H의 대규모 정제 방법에 관한 것이다.

인자 H, 만성 신장병증, 단백뇨, 비정형 용혈요독증후군, II형 막증식성 사구체신염, 보체계

Description

만성 신장병증 치료용 인자 Ｈ 및 이의 제조{Factor H for the treatment of chronic nephropathies and production thereof}

본 발명은 인과적으로 단백뇨와 관련되지 않는 만성 신장병증 및 인과적으로 단백뇨와 관련된 만성 신장병증 둘다를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 인자 H의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인자 H의 대규모 정제방법에 관한 것이다.

40종 이상의 상이한 단백질을 포함하는 보체계는 3가지의 상이한 활성화 경로(부경로, 렉틴 경로 및 고전경로)를 통해서 미생물, 외래 입자 및 변형된 자기세포의 공격 및 제거를 직접 또는 간접적으로 매개한다[참조: Rother K et al. (Eds) The Complement System. 2^nd revised edition, 1998; Springer Verlag]. 이러한 과정은 시간과 공간 측면에서 고도로 제한되며 자기(숙주 세포)와 외래(예: 미생물)를 구분할 수 있다.

일부 사람 질환은 명백히 이러한 연쇄증폭반응(cascade)-유사 활성화 경로의 활성화를 동반하는데, 이는 억제제-프로테아제 복합체를 포함하여 보체계의 조기 내지 후기 성분의 범위를 포함하는 전형적 활성화 마커의 상승된 수준에 의해 반영된다. 또한, 때때로 관찰되는 세포 손상은 일반적으로는 엄격한 조절하에 있는 보 체계의 적어도 국소적 탈선의 지표로서 간주된다. 정량적 관점에서, 특이적 C3 전환효소에 의한 C3의 단백질분해적 절단은 보체 활성에 있어 중요한 역할을 한다. 이러한 전환효소는 새로운 C3 전환효소 분자의 잠재적 성분을 나타내는 C3b 형태를 생성시킴으로써 연쇄증폭반응을 자극한다.

자기-세포 및 조직의 보호는 유동상 및/또는 막-결합형으로 존재하는 특이적 조절제 또는 억제제에 의해 매개된다. 이러한 조절제로는 보체 수용체 1(CR1 또는 CD35: C3b 및 C4b에 결합하고, C3 전환효소를 분해시키고, 인자 I에 의해 C3b/C4b가 분해될 수 있게 한다), 붕괴 가속화 인자(decay accelerating factor)(DAF 또는 CD55: C3b에 결합하고, C3/C5 전환효소를 분해한다) 및 막-조인자 단백질(MCP 또는 CD46: C3b 및 C4b에 결합하여 C3b 및 C4b가 인자 I에 의해 분해되게 한다)가 포함되며, 이들은 모두 전적으로 막-고정된 단백질이다.

막-고정된 조절 단백질 이외에, 가용성 보체 조절제 인자 H(20개의 짧은 컨센서스 반복부(short consensus repeat; SCR)로 이루어진 일본쇄 당단백질; 약 9.3% 탄수화물)의 자기세포의 다가음이온성 표면에 대한 부착은 억제 잠재성을 증가시킴으로써 세포 표면을 보호하기 위한 강력한 성분을 나타낸다[참조: Josi M et al.; Histol Histopathol 2004;19:251-8]. 이러한 보호는 주로, 공유결합된 C3b에 결합하고 Bb를 치환시킴에 의해 선택적 C3 전환효소(C3bBb)의 수명을 효율적으로 감소시킴으로써(붕괴 가속화) 그리고 세린 프로테이나제 인자 I에 의한 단백질분해성 절단을 통한 C3b의 영구적 불활성화를 촉매함으로써(조인자 활성: 예를 들면, iC3b, C3c의 생성)[참조: Rother K et al. (2nd revised edition) The Complement System. 1998, Springer Verlag;p.28,34-7] 달성된다. 표면 층의 외부 상(약 20 내지 140 nm) 내에서 프로테아제 인자 I에 대한 조인자로서의 인자 H의 활성은 인자 H가 C-말단 SCR에 의해 표면에 위치하는 프로테오글리칸에 결합함으로써 촉진된다[참조; Jozsi M et al.; Histol Histopathol 2004;19:251-8]. 인자 H의 보호 잠재성은 보체 연쇄증폭반응의 진행을 국소적으로 제한한다. 이것은 적은 수의 상기한 막-고정된 조절제를 발현하는 세포 또는 신장 사구체 기저막과 같은 내인성 조절 단백질이 완전히 결여된 조직에 있어 특히 중요하다[참조: Hogasen K et al.; J Clin Invest 1995;95:1054- 61].

특허 EP 0 222 611 B1는 인자 H가 오직 일시적으로만 감소된 면역복합체 관련 질환에서의 인자 H의 용도, "혈관 자가면역 질환의 치료에서 사용하기 위한 인자 H 및/또는 인자 I", "전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 또는 사구체 신염의 치료에서 사용하기 위한 인자 H 및/또는 인자 I", 및 "인자 H 및/또는 인자 I를 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 보조제와 혼합함을 포함하는, 혈관 자가면역 질환의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조방법"을 포함한다. 그러나, 상기 특허의 범주는 명백히 신장의 외부 또는 내부에 생성된 면역복합체(IC)의 사구체 침착/형성을 동반한 IC-매개성 신장병증과 같은 사구체 신염(예: 굿파스튜어(Goodpasture) 증후군)에 관한 것이다. EP 0 222 611 B1에는, 예를 들면, 세뇨관 사이의 공간(간질)내 섬유성 조직의 형성을 특징으로 하는 세뇨관간질 섬유증(tubulointerstitial fibrosis; TIF)과 같은 항체-비의존적 만성 신장병증의 치료에 대한 교시가 포함되어 있지 않다.

본 발명의 하나의 양태는 단백뇨와 인과적으로 연관되지 않는 항체-비의존적 만성 신장병증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 인자 H의 용도이다.

기능적 활성 분자의 결여된 또는 감소된 단백질 수준으로 인해 또는 관련 리간드의 결합에 의해 이러한 기능을 매개하는데 중요한 분자 영역내의 각각의 유전자 돌연변이(들)로 인해 결여된 또는 현저하게 감소된 인자 H 기능은, 결국에는 신장 기능이 손상되는 질환, 예를 들면, 비정형 용혈요독증후군(aHUS) 또는 II형 막증식성 사구체신염(MPGN II)에서 입증된 바 있다. 사구체 막에는 내인성 조절제가 결여되어 있기 때문에, C3의 연속적 절단이 이 부위에서 일어나서, 보체 활성화 산물의 분해가 초래되고, 사구체 기저막과 상피 세뇨관(epithelial tubulus) 및 내피 세포의 C3 전환효소-매개된 손상의 형성, 세포외 매트릭스 및/또는 보체계의 성분(예: C3 분열 산물) 및 항체의 침착을 통한 막 두꺼워짐이 초래되고, 그 결과로서 여과 결손(단백뇨)이 초래된다.

"조밀 침착 질환(dense deposit disease)"으로도 지칭되는 MPGN II는 사구체 모세관 벽의 기저막내의 보체 함유 조밀 침착물 및 후속적 모세관 벽 두꺼워짐, 메산지움 세포(mesangial cell) 증식 및 사구체 섬유화를 특징으로 하는 희귀 질환이다[참조: Ault BH; Pediatr Nephrol 2000;14:1045-53].

MPGN II 이외에, MPGN I 및 MPGN III라 불리는 2개의 아형이 더 있다. 모든 3가지 아형은 메산지움 세포 증식 및 사구체 모세관 벽의 두꺼워짐을 동반한 메산지움 매트릭스의 증가를 특징으로 한다(MPGN I: 기저막과 내피 세포 사이에 메산지움 세포와 매트릭스가 삽입되어 이중 구조가 형성됨; 내피하 전자 조밀 침착물. MPGN III: 내피하 및 상피하 전자 조밀 침착물). 모든 아유형에서의 침착물은 C3 및 기타 보체 인자를 함유한다. 일부 환자에서, MPGN과 함께 지방이상증 및 망막 변형과 같은 신장외 징후의 동반이 발견될 수 있다[참조; Levy Y et al.; Immunol Res 1998;18:55-60].

MPGN은 주로 아동 및 성인(질환의 발생시 중간 나이: 약 10세)에서 발생한다. 환자의 50%는 신장 증후군을 나타내며, 나머지는 경미한 단백뇨를 나타내고, 20%는 육안적혈뇨증을 나타낸다. 환자의 30%에서는 질환의 발생과 함께 고혈압이 발생한다. MPGN을 앓는 아동에서는 8 내지 16년 후에 불리한 후기 예후가 나타나며 말기 신장 질환(ESRD)이 발생한다(MPGN I: 15.3년; MPGN II: 8.7년; MPGN III: 15.9년)[참조: Schwertz R et al. Acta Paediatr 1996;85:308-12].

최근의 발견[참조: Klein RJ et al. Science 2005 Mar 10;10.1126/science.1109557; Haines JL et al. Science 2005 Mar 10;10.1126/science. 1110359]은 노인성 황반변성(AMD) 위험의 증가와 인자 H 변이체(짧은 컨센서스 반복부 7번(SCR7)내의 아미노산 402에서의 티로신-히스티딘 변화) 간의 연관성을 나타낸다. 그러나, 인자 H 기능의 상실(SCR7은 헤파린, C-반응성 단백질 및 M-단백질에 대한 결합 부위를 함유한다)과 AMD 간의 인과적 연관성은 아직 입증되지 않았다.

인자 H 연관된 aHUS- 및 MPGN II-환자의 가능한 치료법은 체중-관련 치료 스케쥴(체중 kg당 10 내지 40 ml, 격주)을 기초로 하는 갓 동결된 혈장의 투여이다. 상기 치료법에서 결실된 기능적 인자 H는 정상 혈장 수준으로 회복된다. 그러나, 인자 H-단백질이 감소되지 않고, 여전히 세포성 막에 결합하지만 붕괴 가속화 능력 및/또는 조인자 활성을 상실하여 보체계를 하향조절하는 돌연변이체인 경우, 돌연변이체 인자 H는 치료학적으로 부가된 용량의 정상 인자 H의 막에 대한 연결을 경쟁적으로 차단한다. 따라서, 몰(mole) 기준에서 기능적 인자 H의 생리학적 수준을 회복시키기에 불충분할 뿐만 아니라, 막으로부터의 기능장애 인자 H를 대체하기 위해 인자 H의 수준을 정상 수준 이상으로 상승시키는 용량이 투여될 필요가 있다.

인자 H 돌연변이는 다음과 분류될 수 있다: (1) 예를 들면 간으로부터의 인자 H 분비를 차단하여 혈장중 인자 H의 완전한 부재를 초래하는 돌연변이, (2) (a) 단백질의 조절성 도메인(SCR 1-4), (b) 단백질의 인식 도메인(SCR 19-20) 또는 (c) 기타 기능, 예를 들면, 헤파린 결합을 부여하는 단백질의 상이한 부분에서 인자 H 기능의 결함을 초래하는 돌연변이. 인식 도메인에서의 돌연변이(2b)는 인자 H 단백질이 표면에 결합하는 것을 방지하는 한편, 조절성 도메인에서의 돌연변이(2a)는 기능적 결함성 인자 H를 초래하지만, 당해 단백질이 표면에 결합할 수 있게 한다.

FFP 주입을 통한 인자 H의 보충은 오직 (1)(= 결실된 혈장 인자 H) 및 (2b)(=인자 H 결합에 영향을 주는 돌연변이)의 경우에서만 정상 범위 혈장 수준을 달성하기 위해 필요하다. 그러나, 표면 결합 부위에 대해서 내인성 불활성 인자 H 분자와 주입된 활성 인자 H 분자가 경쟁하기 때문에, (2a) 및 (2c)(= 인자 H 기능에 영향을 주지만 인자 H 결합에는 영향을 주지 않는 돌연변이)에서는 정상 이상의 혈장 인자 H 수준이 요구된다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 새로이 부가된 인자 H의 혈장 농도를 인자 H의 천연적 농도와 비교해 생리학적 수준 이상으로 유도하는 용량의 기능적 인자 H를 이용하여 aHUS 또는 MPGN II과 같은 항체 비의존적 만성 신장병증을 치료하는 것이다. 바람직하게는, 인자 H의 농도는 치료되는 환자의 정상 혈장 수준보다 10% 이상 높게 증가된다. 보다 바람직하게는, 인자 H의 농도는 치료되는 환자의 정상 혈장 수준의 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 100% 이상, 보다 바람직하게는 200% 이상, 가장 바람직하게는 300% 이상으로 증가된다.

본 발명의 다른 양태는 인과적으로 단백뇨와 관련된 항체 비의존적 만성 신장병증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 인자 H의 용도이다.

무작위적 예측성 임상 시험(prospective, randomized clinical trial)은 단백질의 불충분한 사구체 여과가 단백뇨와 연관되고 간질 섬유화 및 진행성 신부전의 발병 및 진행에 대한 주요 위험 요소임을 나타냈다[참조: Jerums G et al. Kidney lnt Suppl 1997;63:87-92]. 질환에서 사구체로부터 세뇨관 구획으로의 조직 손상의 확산과 관련된 기작에 대해서는 거의 공지되어 있지 않고 간질 섬유화가 어떻게 유도되는지 검토된 바 없다.

본질적으로 항체-비의존적인 것으로 공지된 기작인 부경로를 통한 보체의 활성화는 근위 세뇨관 상피 세포 부위에서 일어나는 것으로 제시되었다(문헌[Tang S et al. Kidney Blood Press Res. 2002;25: 120-6)에서 검토됨).

다른 보다 최근의 문헌은 급성 세뇨관 괴사와 수반되는 보체의 부경로의 항체 비의존적 활성화를 입증한다[참조: Thurman JM et al. Kidney lnt 2005,67:524-30].

항체 침착의 부재하의 단백질 과부하는 근위 세뇨관의 첨막(apical membrane)상에서의 보체 성분의 활성화와 관련된다는 것이 입증되었다. 제안된 관련 기작은 말기 보체 연쇄증폭반응을 포함하여 C3를 활성화시킬 수 있는 친핵체인 암모니아의 신장내 수준을 증가시켰다(암모니아발생)[참조: I-Hong Hsu S, Couser WG. J Am Soc Nephrol 2003,14:186-91]. 가용성 보체 수용체 1(CR1), 붕괴 가속화 인자(DAF) 및 기타 분자와 같은 각종 천연 및 인공 보체 억제제는 약리학적 중재를 위한 잠재적 치료학적 표적으로서 논의되어 있다[참조: 상기 동일 문헌]. 그러나, 인자 H의 용도는 언급되어 있지 않다.

따라서, 내인성 막-고정된 조절제가 결여된 세포성 막의 보호를 위한 치료제로서 인자 H의 용도는 신규하며 시험관내 또는 시험관내 모델에서 아직 조사된 바 없다. 일반적으로, 인자 H로부터 이득을 얻는, 단백뇨와 인과적으로 연관된 항체 비의존적 만성 신장병증을 앓는 환자는 정상 인자 H 수준을 갖고 있다. 치료학적 효과는 바람직하게는 인자 H 농도를 생리학적 수준 이상의 수준으로 증가시켜 달성한다. 이러한 특정한 측면이 지금까지 조사되지 않았던 이유는 기질처럼 소모되지 않는, 프로테아제-연관된 조인자로서의 인자 H의 기능 때문이다.

본 발명의 하나의 양태는 인과적으로 단백뇨(이의 생성은 항체-매개성 IC 형성과 독립적이다)와 관련된 만성 신장병증을 치료하기 위한 인자 H를 제공하는 것이다. 단백뇨는 주로 세포의 여과 기작에 관여하는 구조 단백질의 변경에 의해 유발될 수 있다. 그러나, 후속적인 혈장 단백질의 존재는, 인자 H의 정상적 수준에도 불구하고 명백히 내인성 막 조절제(예: CR1, DAF)의 부재하에 일어나는 보체-매 개성, IC-비의존성 세포성 손상을 촉진하는 것으로 사료된다. 단백뇨의 병태생리학적 원인은 다음의 주요 그룹으로 나뉠 수 있다: (1) 사구체 기저막, 족세포(podocyte) 또는 세극막(slit diaphragm)과 같은 "사구체 여과 단위"를 형성하는 구조의, 유전적으로 결정된 장애, (2) 자가면역에 의해 직접적으로 유발되거나 또는 미생물에 의해 간접적으로 유도되는 염증 반응, (3) 제제에 의해 유발되는 사구체 손상 또는 (4) 최종적 결과로서 결국에는 전체 네프론의 기능 상실을 초래하는 진행성 세뇨관간질 손상. 보다 구체적으로, 본 발명은 세뇨관 상피 세포의 수준에서 TIF를 치료하기 위한 인자 F의 용도에 관한 것이며, 여기서 단백뇨는 최종적으로 TIF를 초래하는 사건들의 연쇄증폭반응을 유도한다. 새로이 부가된 인자 H의 혈장 농도를 인자 H의 천연 농도와 비교해 생리학적 수준 이상으로 유도하는 용량이 본 발명의 바람직한 양태이다. 바람직하게는, 인자 H의 농도는 치료되는 환자의 정상 혈장 수준보다 10% 이상 높게 증가된다. 보다 바람직하게는, 인자 H의 농도는 치료되는 환자의 정상 혈장 수준의 50% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 200% 이상, 가장 바람직하게는 300% 이상으로 증가된다.

인자 H는 사람 혈장 또는 혈청으로부터 수득하거나 재조합에 의해 수득할 수 있다. 본원에서 사용되는 "인자 H"는 천연 사람 인자 H의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이는 또한, 변형된 단백질이 실질적으로 인자 H의 활성을 보유하는 한, 다소 변형된 아미노산 서열, 예를 들면, N-말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단을 갖는 단백질을 포함한다. 상기한 정의 내에서 "인자 H"는 또한 개체마다 서로 다르게 존재하거나 발생할 수 있는 천연 대립형질 변 이체를 포함한다. 상기 정의 내에서 "인자 H"는 추가로 인자 H로 이루어진다. 이러한 변이체는 야생형 서열과 하나 이상의 잔기가 상이하다. 이러한 상이함의 예로는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산 잔기)에 의한 N- 및/또는 C-말단의 절두(truncation) 또는 N- 및/또는 C-말단에 하나 이상의 추가 잔기의 부가, 예를 들면, N-말단에의 메티오닌 잔기의 부가 뿐만 아니라 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 특성을 갖는 아미노산 그룹, 예를 들면, (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산, (6) 방향족 아미노산 내에서 이루어지는 치환이 포함될 수 있다. 이러한 보존적 치환의 예는 하기 표에 제시한다.

(1)	알라닌, 글리신
(2)	아스파르트산, 글루탐산
(3a)	아스파라긴, 글루타민
(3b)	세린, 트레오닌
(4)	아르기닌, 히스티딘, 리신
(5)	이소류신, 류신, 메티오닌, 발린
(6)	페닐알라닌, 티로신, 트립토판

본 발명에서 사용되는 "기능적 인자 H"는 용액 중에서 및/또는 세포 표면에서 선택적 C3 전환효소의 붕괴 가속화 및/또는 인자 I에 의한 C3b의 영구적 단백질분해를 촉매하는 조인자 활성과 같은 활성을 나타내는 인자 H 분자를 포함한다.

"재조합"이란 용어는 예를 들면, 변이체가 유전공학 기술에 의해 숙주 유기체에서 생산되도록 함을 의미한다.

본 발명의 숙주 세포는 사람 인자 H의 생산 방법에서 사용될 수 있다. 당해 방법은

a) 사람 인자 H가 발현되도록 하는 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

b) 임의로, 상기 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 사람 인자 H를 회수하는 단계를 포함한다.

글리코실화 또는 기타 해독후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포의 환경의 성질에 따라 달라질 수 있다. 특정 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이러한 서열의 해독후 변형은 본 출원에 포함된다.

적합한 숙주 세포에서의 고수준의 재조합 단백질의 생산은, 상기한 변형된 cDNA를, 당업자에게 공지된 방법에 따라서 다양한 발현 시스템에서 증식시킬 수 있는 재조합 발현 벡터 내에서 적합한 조절성 요소와 함께 효율적 전사 단위로 어셈블리하는 것을 필요로 한다. 효율적인 전사적 조절 요소는 천연 숙주로서 동물 세포를 갖는 바이러스로부터 또는 동물 세포의 염색체성 DNA로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스 또는 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부로부터 유래된 프로모터-인핸서 조합 또는 베타 액틴 또는 GRP78과 같은 동물 세포에서 강력하게 구성적으로(constitutively) 전사되는 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합이 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 mRNA의 안정한 고수준을 달성하기 위해, 전사 단위는 이의 3'-근위 부분에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야 한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 시미안 바이러스 40 조기(early) 전사 영역, 토끼-글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성화인자 유전자로 부터 유래된다.

그 다음, cDNA를 인자 H의 발현에 적합한 숙주 세포주의 게놈내로 삽입시킨다. 바람직하게는, 당해 세포주는 정확한 폴딩, Gla-도메인 합성, 디설파이드 결합 형성, 아스파라긴-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화 및 기타 해독후 변형 뿐만 아니라 배양 배지로의 분비를 보장하기 위해 척추동물 기원의 동물 세포주여야 한다. 기타 해독후 변형의 예로는 미성숙(nascent) 폴리펩타이드 쇄의 하이드록실화 및 단백질분해성 프로세싱이 있다. 사용될 수 있는 세포주는 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포이며, 바람직하게는 햄스터 CHO-세포이다. 재조합 인자 H의 해독후 변형이 복잡하기 때문에, 재조합 인자 H를 사람 세포주에서 발현시키는 것이 바람직하다.

상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 수가지의 다른 방법으로 동물 세포주 내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스에 기초하는 벡터로부터 생성시킬 수 있다. 이들의 예는 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 소 파필로마 바이러스에 기초하는 벡터이다.

또한, 게놈내에 재조합 DNA가 삽입된 특정 세포 클론의 분리를 촉진하기 위해, 상응하는 cDNA를 암호화하는 전사 단위를 해당 동물 세포에서 우성 선택성 마커로서 작용할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포에 도입시킬 수도 있다. 이러한 유형의 우성 선택성마커 유전자의 예는 제네티신에 대한 내성을 부여 하는 Tn5 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제(G418), 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 및 푸로마이신에 대한 내성을 부여하는 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 이러한 선택성 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 목적 단백질의 DNA를 암호화하는 하나의 벡터로서 동일한 벡터상에 존재할 수 있거나, 숙주 세포의 게놈내로 동시에 도입되고 통합되는 개별적 벡터상에 암호되어 빈번하게 상이한 전사 단위 간의 단단한 물리적 결합을 야기할 수 있다.

목적 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 다른 유형의 선택성 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위에 기초한다. 이러한 유형의 유전자를 내인성 dhfr-활성이 결여된 세포, 바람직하게는 CHO-세포(DUKX-B11, DG-44) 내로 도입시킨 후, 당해 세포를 뉴클레오시드가 결여된 배지에서 성장하도록 할 수 있다. 이러한 배지의 예는 하이포크산틴, 티미딘 및 글리신을 함유하지 않는 햄스(Ham's) F12이다. 이들 dhfr-유전자를 동일한 벡터 또는 상이한 벡터상에서 연결된 상태로 응혈 인자 cDNA 전사 단위 함께 상기한 유형의 CHO-세포내로 도입시켜, 재조합 단백질을 생산하는 dhfr-양성 세포주를 생성시킬 수 있다.

상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에 성장하는 경우, 메토트렉세이트에 대해 내성인 새로운 세포주가 출현한 것이다. 이들 세포주는 연결된 dhfr 및 목적 단백질의 전사 단위의 증폭된 수로 인해서 증가된 속도로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이들 세포주를 메토트렉세이트의 농도를 증 가시키면서(1 내지 10000 nM) 증식시키는 경우, 매우 높은 속도로 목적 단백질을 생산하는 새로운 세포주가 수득될 수 있다.

목적 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁 배양물 중에서 또는 각종 고체 지지체상에서 대규모로 성장시킬 수 있다. 이들 지지체의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스에 기초한 미립담체 또는 중공 섬유 또는 각종 세라믹 물질 형태의 고체 지지체이다. 세포 현탁 배양물 중에서 또는 미립담체상에서 성장시키는 경우, 상기 세포주의 배양은 회분 배양 또는 연장된 기간에 걸쳐서 조건화된 배지(conditioned medium)를 연속적으로 공급하는 관류 배양으로서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라서, 상기 세포주는 목적하는 재조합 단백질의 산업적 생산 방법의 개발에 매우 적합하다.

상기 유형의 분비성 세포의 배지 중에 축적되는 재조합 단백질은 목적 단백질과 기타 물질 사이의 크기, 전하, 소수성, 가용성, 특이적 친화성 등에서의 차이를 이용한 방법을 포함하는 다양한 생화학적 및 크로마토그래피 방법에 의해 세포 배양 배지 중에 농축시키고 정제할 수 있다.

이러한 정제의 예는 고체 지지체상에 고정화된 모노클로날 항체에 대한 재조합 단백질의 흡착이다. 흡착 후, 단백질을 상기한 특성에 기초하여 다양한 크로마토그래피 기술로 추가 정제할 수 있다.

본 발명의 인자 H를 60% 이상의 순도, 보다 바람직하게는 80% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하고, 특히 바람직한 것은 오염성 거대분자, 특히 기타 단백질 및 핵산과 관련해 순도가 95%를 초과하고 감염성 및 발열성 인자가 없는 순수한 상태이다.

EP 0 222 611 B1에 언급된 모든 잠재적 정제 방법은 전적으로 사람 혈장 또는 혈청으로부터의 단일 단백질의 정제를 위해서만 개발된 전형적 실험실 방법으로서, 통상적으로 알부민, 면역글로불린 및 응고 인자에 중점을 둔 다중성분-사용에 기초하는 산업적 응용에서 확립된 기술을 등한히 한다.

따라서, 본 발명의 다른 목적은 대규모에 적합한, 치료용의 혈장 유래 형태의 사람 인자 H에 대한 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명과 관련해 대규모란, 200ℓ 이상, 바람직하게는 500ℓ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 2000ℓ 이상의 사람 혈장에 기초하는 제조방법을 의미한다. 제조에 대해서, 사람 혈장으로부터 출발하는 청구된 방법은 예를 들면, 냉각된 에탄올에 의한 분별 침전으로 수득된 전형적인 산업적 중간체의 세부분별(subfractionation)에 기초한다[참조: Schultze HE, Heremans JF; Molecular Biology of Human Proteins. Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317]. 이러한 정제의 바람직한 양태는, 항트롬빈(AT) 또는 면역글로불린과 같은 약제 규제 기관의 통제하에 있는 혈장 생성물의 확립된 및 인증된 제조방법이 영향을 받지 않도록 하는, 산업적 규모의 혈장 분별의 부(副) 분획으로부터의 기능적 인자 H의 정제이다. 8% 에탄올-침전물의 상청액(콘(Cohn) 등의 방법, 참조: 상기 인용문헌, p. 251)은 산업적 규모의 혈장 분별로부터 출발하는 인자 H의 공급원의 한 예이다. AT와 함께 인자 H는 헤파린-기반 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 상청액으로부터 흡착될 수 있고, 인자 H는 AT를 함유하지 않는 용출물의 정제된 분획일 수 있다. 침전물 III(온클리(Oncley) 등의 방법; 참조: 상기 인용문헌, p. 253) 또는 침전물 B (키스틀러(Kistler) 및 니츠만(Nitschmann)의 방법; 참조: 상기 인용문헌, p. 253)은 AT의 흡착이 통상적으로 수행되지 않는 경우의 이러한 인자 H의 산업적 공급원의 다른 예이다. 이들 부 분획으로부터 출발하여, 당업계에 공지된 정제 방법을 사용하여 인자 H를 정제할 수 있다. 이들 방법은 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 침전[참조: Nagasawa S, Stroud RM; MoI Immunol 1980; 17: 1365-72], 고정화된 헤파린을 통한 친화성 크로마토그래피[참조: 상기와 같은 인용문], 이온 교환 크로마토그래피[참조: Crossley LG, Porter RR; Biochem J 1980; 191 : 173-82] 및 소수성 상호작용 크로마토그래피[참조: Ripoche J, Al Salihi A, Rousseaux J, Fontaine M ; Biochem J 1984; 221, 89-96]에 기초할 수 있다.

본 발명에서 기술되는 인자 H는 치료용 약제학적 제제로 제형화할 수 있다. 정제된 단백질을 임의로 약제학적 부형제가 부가될 수 있는 통상의 생리학적 상용성 수성 완충액에 용해시켜 약제학적 제제를 제공할 수 있다.

이러한 약제학적 담체 및 부형제 뿐만 아니라 적합한 약제학적 제형은 당업계에 공지되어 있다[참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)]. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조된 형태 또는 안정한 가용성 형태로 제형화할 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 동결건조시킬 수 있다. 동결건조된 제형은 사용 전에 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 예를 들면, 멸균 주사용수 또는 멸균 생리 식염 용액을 부가하여 재구성한다.

조성물의 제형은 임의의 약제학적으로 적합한 투여 방식에 의해 개체에게 전달시킨다. 각종 전달 시스템이 공지되어 있으며 임의의 통상적 경로에 의해 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전신 투여된다. 전신 사용의 경우, 본 발명의 인자 H는 통상의 방법에 따라서 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피) 또는 장관(예를 들면, 경구, 질 또는 직장) 전달용으로 제형화된다. 가장 바람직한 투여 경로는 정맥내 및 피하 투여이다. 제형은 주입 또는 일시 주사(bolus injection)에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방출 시스템을 포함한다.

본 발명의 인자 H는 허용되지 않는 유해한 부작용을 발생시키는 용량에 도달하지 않으면서 목적하는 효과를 발생시켜, 치료될 상태 또는 증상의 중증도 또는 확산을 예방 또는 경감시키기에 충분한 용량을 의미하는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다.

정확한 용량은 많은 요인, 예를 들면, 증상, 제형, 투여 방식에 따라 좌우되며 각각의 개별적 증상에 대한 전임상 및 임상 실험에서 결정되어야 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이들 치료제는 동일한 약제의 일부분으로서 혼입될 수 있다.

인자 H 작용 방식의 실험적 확인

알포트 증후군을 모방하는 COL4α3 넉 아웃(knock out) 마우스는 사구체 기저막의 결함을 유발하는 콜라겐 4의 결함성 α3 쇄를 발현한다. 이는 출생후 4.5주부터 시작하여 사구체 단백뇨 및 진행성 세뇨관간질 섬유증을 초래하고, 약 10주후에 신부전 및 사망을 유발한다. "브레너(Brenner) 가설"[참조: Brenner et al.; N Engl J Med 1982;307: 652-9]에 따르면, 관내 단백질은 세뇨관 상피 세포에 의해 재흡수되고 이로써 세뇨관 상피 세포가 활성화된다. 활성화된 상피 세포는 (1) 염증 또는 (2) 섬유화촉진 2차 메신저 경로(profibrotic second messenger pathway)를 유도하거나 (3) 스스로 "상피-중간엽 전이" (EMT)를 겪게 된다.

상기한 바와 같이, 인자 H는 활성화된 보체계의 중요한 혈장/체액 조절제이다. 인자 H 결핍은 aHUS 또는 MPGN II와 같은 신장 질환을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 인자 H 결핍은 내피 세포 표면의 수준에서 또는 사구체 기저막 내에서 보체 활성화를 유도/유발하는 반면, 적어도 부분적으로는 사구체 여과기를 통과할 수 있는 인자 H의 보충은 세뇨관 상피 세포의 수준에서 보체 활성화를 감소시킬 수 있을 것이며 따라서 사구체 단백뇨에 의해 유발된 만성/진행성 신장 질환에 대한 치료 대안이 될 것이다.

인자 H 투여의 효과는 COL4α3 넉 아웃 마우스를 출생후 4.5주(마우스를 이유시킨 후 가능한 가장 빠른 시점)부터 시작하여 마우스 혈청으로부터 정제된 생리학적 수준 이상의 수준의 인자 H로 처리하여 시험할 수 있다. 인자 H는 피하, 복강내 또는 근육내 적용한다. 마우스를 이들이 치사될 때까지 처리하거나(그룹 1), 7.5주 및 9.5주 후에 희생시킨다(그룹 2). 그룹 2의 동물을 마취시키고, 뇨 및 혈 액 샘플을 수집하고, 신장을 빠르게 수거하고, 1개의 신장을 포름알데히드 고정시키고 면역조직학을 위해 사용하고, RNA 추출 및 후속적 실시간 역전사효소 PCR(RT-PCR) 분석을 위해 다른 신장으로부터 피질을 분리시킨다.

당해 결과는 만성 사구체 단백뇨의 마우스 모델에서 인자 H로의 만성적 처리는 (1) 세뇨관 상피 세포의 수준에서 보체 활성화를 경감시키고, (2) 세뇨관 상피 세포에 의해 개시된 염증 및 섬유화촉진 2차 경로의 활성화를 감소시키고, (3) 세뇨관간질 섬유증 정도를 감소시키고, (4) COL4α3 넉 아웃 마우스의 생존 기간을 증가시킴을 보여준다.

이들 결과는 일반적으로 만성 신장 질환의 최종적인 공통된 주요 특징인 만성 단백뇨의 치료를 위한 인자 H의 사용을 강력하게 뒷받침한다.

이미 설명한 바와 같이, 단백뇨는 사구체 여과기의 기능의 결함(예를 들면, 신장염 증후군 또는 신장 증후군)을 나타내는 것일 뿐만 아니라 세뇨관 간질에서의 염증 및 섬유화 촉진 과정의 유도를 통해 만성 신장 질환의 진행을 촉진한다. 과장 없이, 단백뇨는 만성 신장 질환(CRD)의 최종적 공통 경로로서 볼 수 있으며, 단백뇨의 감소 및 단백뇨에 의해 유도된 효과의 감소는 만성 신장 질환의 효과적 치료에 대한 단서를 증명한다.

세뇨관 상피 세포의 첨막상에서의 보체계의 활성화가 단백뇨 유발된 CRD에서 병원성 사건들의 연쇄증폭반응에서 중요한 매개체중 하나라는 개념에 근거하여, 인자 H를 통한 치료(예를 들면, 최대 80㎖ FFP/체중 kg/처리의 주입, 또는 80㎖ FFP/체중 kg에 상당하는 인자 H의 정맥내 또는 피하 또는 근육내 투여)는 혈장 인자 H 를 생리학적 수준 이상으로(예를 들면, 2배) 증가시키고 (a) 세뇨관 상피 세포의 첨막상에서 인자 H가 이용될 수 있게 하고, 이어서 (2) 이러한 측면에서 보체계의 활성화를 감소시킨다.

온전한 세포 결합 특징을 갖지만 기능적으로 결함이 있는 단백질을 발현하는 인자 H 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 질환을 갖는 환자에서(예를 들면, 인자 H의 SCR 4의 돌연변이에 기초하는 MPGN II, 참조: Licht et al, Kidney lnt 2006), 인자 H 수준을 2배 또는 3배까지 상승시키는 것을 목표로 하는 인자 FFP를 통한 치료(예를 들면, 최대 80 내지 120㎖ FFP/체중 kg/처리의 주입, 또는 80 내지 120㎖ FFP/체중 kg에 상당하는 인자 H의 정맥내 또는 피하 또는 근육내 투여)는 세포 표면에 대한 온전한 인자 H 분자의 경쟁적 결합을 초래하여 후속적으로 보체 활성화의 감소를 초래한다.

치료의 성공은 (a) 보체 활성화의 감소(증가된 C3, 감소된 C3b), (b) 혈뇨 및 단백뇨의 감소(또는 적어도 추가 증가의 방지) 및 (c) 신장 기능의 안정화 - 가능하게는 개선으로 나타난다.

Claims (13)

1. 인과적으로 단백뇨와 관련되지 않는 항체-비의존적 만성 신장병증의 치료 및/또는 진행 억제 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 기능적 인자 H의 용도.
2. 제1항에 있어서, 기능적 인자 H의 용량이 치료법 동안에 환자의 혈장중 기능적 인자 H의 생리학적 수준 이상의 수준이 달성되도록 하는, 인과적으로 단백뇨와 관련되지 않는 항체-비의존적 만성 신장병증의 치료 및/또는 진행 억제 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 기능적 인자 H의 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인자 H가 막에 결합하는 기능 이외의 기능에 결함을 갖고 막에 결합하는 능력을 여전히 보유하는 환자에서 인과적으로 단백뇨와 관련되지 않는 항체-비의존적 만성 신장병증의 치료 및/또는 진행 억제 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 기능적 인자 H의 용도.
4. 제3항에 있어서, 기능적 인자 H의 용량이, 돌연변이된 내인성 인자 H의 혈장 수준보다 10% 이상 높은 혈장 수준이 달성되도록 하는, 기능적 인자 H의 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 용혈요독증후군(aHUS) 및/또는 II형 막증식성 사구체신염(MPGN II)을 치료하기 위한 인자 H의 용도.
6. 정상적 인자 H 수준을 갖는 환자에서 인과적으로 단백뇨와 관련된 만성 신장병증의 치료 및/또는 진행 억제 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 기능적 인자 H의 용도.
7. 제6항에 있어서, 기능적 인자 H의 용량이, 주사후에 각 환자의 정상적 인자 H 혈장 농도보다 10% 이상 높은 혈장 수준이 달성되도록 하는, 기능적 인자 H의 용도.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 세뇨관간질 섬유증(tubulointerstitial fibrosis; TIF) 및/또는 진행성 신부전을 치료하기 위한 기능적 인자 H의 용도.
9. 에탄올을 이용하는 사람 혈장 또는 혈청의 대규모 분별 침전에 의해 수득된 중간체에 기초하는, 기능적 인자 H의 정제 방법.
10. 제9항에 있어서, 혈장으로부터 상업적으로 수득되는 기타 치료학적 단백질의 규제 승인에 영향을 주지 않는, 에탄올을 이용하는 사람 혈장 또는 혈청의 대규모 분별 침전에 의해 수득된 중간체에 기초하는, 기능적 인자 H의 정제 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 정제가 콘(Cohn)의 방법에 따르는 8% 에탄올- 침전물의 상청액, 온클리(Oncley)의 방법에 따르는 침전물 III 또는 키스틀러(Kistler) 및 니츠만(Nitschmann)의 방법에 따르는 침전물 B에 기초하는, 기능적 인자 H의 정제 방법.
12. 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 에탄올을 이용하는 사람 혈장 또는 혈청의 대규모 분별 침전과 함께 크로마토그래피 과정에 의해 수득된 중간체에 기초하는, 기능적 인자 H의 정제 방법.
13. 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 용출물에서 항트롬빈 III로부터 인자 H를 분리시키는, 기능적 인자 H의 정제 방법.