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KR20070026802A - 한타바이러스 감염을 진단하기 위한 방법 및 시약 - Google Patents

한타바이러스 감염을 진단하기 위한 방법 및 시약 Download PDF

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KR20070026802A
KR20070026802A KR1020077000837A KR20077000837A KR20070026802A KR 20070026802 A KR20070026802 A KR 20070026802A KR 1020077000837 A KR1020077000837 A KR 1020077000837A KR 20077000837 A KR20077000837 A KR 20077000837A KR 20070026802 A KR20070026802 A KR 20070026802A
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KR1020077000837A
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스티브 에이치. 누옌
세르지오 피츄안테스
Original Assignee
노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

한타바이러스 감염의 검출을 위한 새로운 방법과 면역진단 검사 키트가 개시된다. 본 방법과 키트는 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)를 포함하는, 적어도 여섯 개의 다른 한타바이러스 항원형으로부터의 재조합 N 및/또는 G1 항원의 조합을 사용한다. 이들과 기타 한타바이러스 유형으로부터의 추가적인 한타바이러스 항원도 또한 존재할 수 있다. 이 방법은 고도로 정밀한 결과를 제공하고 감염의 검출을 허용하여, 치료가 수행되고 사망이 방지되도록 한다.
한타바이러스, 항원형, 키트, 항체, 재조합, 검출

Description

한타바이러스 감염을 진단하기 위한 방법 및 시약{METHODS AND REAGENTS FOR DIAGNOSING HANTAVIRUS INFECTION}
관련 출원에의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에서 2004년 6월 18일에 출원된 가출원 제60/581,027호의 이익을 주장하며, 본 출원은 여기에 참조로서 전체가 포함되었다.
연방정부 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 National Institute of Allergy and Infectious Diseases로부터, NIH Grant U01 AIO54779의 후원으로 만들어졌다. 따라서, 미국정부는 본 발명에 특정 권리를 가질 수 있다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 한타바이러스에 관련된다. 특히, 본 발명은 한타바이러스 감염의 진단을 위한 조성물에 사용하기 위한, 면역원성 뉴클레오캡시드와 당단백질 폴리펩티드를 포함하는, 다수의 한타바이러스 항원형들로부터 유래된 면역원성 시약에 관련된다.
한타바이러스(Bunyaviridae: Hantavirus)는 지질-외피를 보유한 마이너스-센스 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 RNA는 세 부분이며, 이것은 작은, 중간, 및 큰 게놈 단편에 대해 각각 S, M, 및 L로 일반적으로 지정되는 세 단편으로 구성된다. M 세그먼트는 G1과 G2로 명명된 두 개의 외피 당단백질을 형성하기 위해 가공되는 전구체 단백질을 코드화한다. S 세그먼트는 바이러스의 선형 나선형 뉴클레오캡시드를 형성하고 체액성 반응을 유도하는, N으로 명명된 뉴클레오캡시드 단백질을 코드화한다. 게놈의 L 세그먼트는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)를 코드화한다. 특정 설치류 또는 곤충 섭취 숙주들과 연관되어 이십 가지 이상의 개별 한타바이러스가 세계적으로 발견되었다. 인간, 자연 저장소, 및 인간 감염의 임상적 측면으로의 그들의 전염 방식들이 검토되었다. (예컨대, Mertz et al., Adv . Internal Med. (1997) 42:369-421을 참조).
한타바이러스 심폐 증후군(HCPS)으로도 알려진 한타바이러스 폐 증후군(HPS)은 50%에 이르는 사망률을 가진 급성 열병이다. 환자들은 비특이성 증상을 보이고 전격성 폐부종과 심장혈관 쇠약으로 급속히 진행된다. 북아메리카에서 HPS의 주 병원체는 신 놈브르(Sin Nombre) 바이러스이다(SNV; 포 코너스(Four Corners) 바이러스 및 뮤에르토 캐년(Muerto Canyon) 바이러스라고도 알려져 있다). (Song et al., Lancet (1994) 344:1637; Khan et al., J. Med . Virol (1995) 46:281-286; Kahn et al., Am. J. Med . (1996) 100:46-48; Morzunov et al., J. Virol (1995) 69:1980-1983; Rollin et al., J. Med . Virol (1995) 46:35-39; Centers for Disease Control and Prevention, Morbid. Mortal. Weekly Rep. (1993) 43:45-48). 뉴욕 (New York) 바이러스(NYV), 블랙 크릭 카낼(Black Creek Canal) 바이러스(BCCV) 및 바이유(Bayou) 바이러스(BAYV)를 포함하여 적어도 세 개의 다른 한타바이러스가 북 아메리카에서의 HPS와 연관되어 있다.
세계적으로, 더 큰 손실의 질환이 신장 증후군 동반 출혈열(HFRS)을 유발하는 유라시아 한타바이러스에 의해 야기된다. HFRS-연관 바이러스는 한탄(Hantaan) (HTNV), 푸말라(Puumala)(PUUV), 서울(Seoul)(SEOV), 및 도브라바-베오그라드(Dob rava-Belgrade)(DOBV) 바이러스를 포함한다. (Lee et al., J. Infect. Dis. (1978) 137:298-308; Lee, et al., J. Infect. Dis . (1982) 146:638-644; Lee et al., J. Infect. Dis . (1982) 146:645-651; Brummer-Korvenkontio et al., J. Infect. Dis. (1980) 141:131-134). HFRS의 임상적인 징후들은 일반적으로 HTNV와 DOBV 감염에 있어 가장 심각한 반면, PUUV 감염은 HFRS의 보다 가벼운 형태로서, 스칸디나비아, 핀란드, 서러시아 및 중유럽에서 발생하는 신장 장애 전염병(NE)과 연관되어 있다. HFRS의 가장 심한 형태들로부터 20%에 이르는 사망률이 보고되었다.
HFRS-연관 한타바이러스 중에서, HTNV, SEOV 및 DOBV는 항원성에 있어서 유사하다. HPS-연관 바이러스도 또한 서로 간에 밀접하게 연관되어 있고, PUUV와 교차 반응한다. 항원성 교차-반응성은 바이러스 N 단백질들 사이에서 가장 현저하다. 재조합 항원 진단 분석에서, 바이러스 N 항원은 바이러스 당단백질보다 우세하다. N 항원에 대한 항체는 감염 과정의 초기에 생기며 보편적으로 회복기에 검출될 수 있다. 급성 SNV 감염을 지닌 모든 사람들은 임상적 증상의 개시까지는 IgM 클래스의 SNV N 항원에 대한 검출가능 항체를 가지며, 거의 모두가 N 및 G1 항원에 대한 IgG 항체를 지닌다. (Bharadwaj et al., J Infect Dis . (2000) 182:43-48). SNV G1 항체는 다른 한타바이러스의 G1 항원과 비반응성이다. (Jenison et al., J. Virol. (1994) 68:3000-3006; Hjelle et al, J. Gen. Virol. (1994) 75:2881-2888).
한타바이러스는 설치류의 침, 소변, 및 대변의, 바이러스에 오염된 에어로졸의 흡입을 통하여 인간에게 전염된다. 노동자는 단지 감염된 설치류가 있는 방에 들어가는 것만으로도 한타바이러스에 감염될 수 있으며, 이는 한타바이러스가 공기를 매개로 전염된다는 지배적인 견해를 강력하게 뒷받침한다. 이러한 의견은 또한 실내에서의 노출이 지극히 일반적임을 보여주는 최근의 역학 조사에 의해 뒷받침되었다. 사람 간의 전염은 아르헨티나에서 안데스(Andes) 바이러스(ANDV)에 대해 입증되었고, 이는 칠레에서의 두 가족 집단에 대해서도 책임이 있는 것으로 보인다. 이 바이러스는 또한 설치류에 물린 후 및 아마도 오염된 음식 또는 물의 섭취를 통해서 전염될 수 있다.
한타바이러스의 모든 종들은 주로 특정의 설치류 숙주와 연관된 것으로 보인다. 한타바이러스의 세 가지 포괄적인 군이 있는데 이들은 설치류 아과인 Murinae, Arvicolinae 및 Sigmondontinae와 연관되어 있다. 이들 다양한 아과들에 속한 설치류 사이의 계통발생학적 관계는 대체로 각각 특정 저장소와 관련된 바이러스의 계통발생학적 및 항원적 관계에 대응한다. 이들 한타바이러스 군들의 각각은 인간 병원체로 알려진 하나 이상의 종 또는 유형을 포함한다. 다양한 한타바이러스에 관한 정보가 표 1에 제시된다.
Figure 112007003316004-PCT00001
Figure 112007003316004-PCT00002
한타바이러스 감염의 관리에서 현저한 진보가 있어 왔지만, 성공적인 관리는 환자들이 질병의 죽음 직전 단계 전에 진단받는 것을 필요로 한다. 제3기 간호 관리의 진보가 있었는데, 한타바이러스 감염으로 인한 사망을 감소시킬 수 있다. 그러나, 감염이 매우 급속하게 진행되므로, 이러한 진보는 시의 적절하게 진단이 내려질 수 있는 환자의 경우에만 그 경과에 영향을 미칠 수 있을 것으로 보인다. 전원 환경에 적합하고 질병의 초기에 적용될 수 있는 한타바이러스 항체의 신속한 검출을 위한 방법이 초기 개입의 가능성을 향상시킬 수 있다.
한타바이러스 감염의 적시 진단을 위한 몇몇 분석이 시도되었다. 예컨대, 실험실-배양 바이러스를 사용한 비드응집, 면역형광 및 면역침전 분석, 혈액응집 억제, 플라그- 및 포커스-감소 중화 분석, 및 ELISA 형식을 포함하는, 한타바이러스 감염의 혈청학적 진단을 위해 다양한 형식이 사용되었다. (Lee et al., J. Infect. Dis. (1978) 137:298-308; Lee et al., J. Infect. Dis . (1982) 146:638- 644; Lee et al., J. Infect. Dis. (1982) 146:645-651; Lundkvist et al., Clin . Diagnos . Lab. Immunol. (1995) 2:82-86; Chu et al. Virology (1994) 198:196-204; Elgh et al., J. Med . Virol (1995) 45:146-150).
또한, 스트립 면역블롯 분석이 한타바이러스 감염의 효율적인 진단 시도에서 사용되어 왔다. (예컨대, Hjelle et al., J. Clin . Microbiol. (1997) 35:600-608; Bharadwaj et al., J. Infect. Dis. (2000) 182:43-48; Yee, et al., J. Wildl . Dis. (2003) 39:271-277을 참조). 그러나, 한타바이러스의 다양한 종들을 식별하기 위한 보편적인 분석은 현재 입수할 수 없다.
한타바이러스 감염의 정확하고 효율적이며 신속한 분석의 널리 보급된 이용성이 높이 요망될 것이며 상당수의 인명을 구제할 수도 있다.
발명의 개요
본 발명은, 현존하는 한타바이러스의 유형을 결정하기 위해서 뿐만 아니라, 한타바이러스 감염을 진단하기 위한 간단하고 정확하며 효율적인 방법을 제공한다. 본 방법은 하나 이상의 한타바이러스 항원형으로부터의 한타바이러스와 같은, 여러 한타바이러스에 의해 야기된 한타바이러스 감염의, 예컨대 한 시간 이내의, 신속한 검출을 허용한다. 만약 감염이 검출되면, 사망을 방지하기에 충분한 시간 내에 그 사람에게 적합한 치료가 처치될 수 있다. 본 방법은 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV, 및 ANDV을 포함하는, 적어도 여섯 개의 다른 한타바이러스 항원형으로부터의 N 및/또는 G1 항원 및/또는 이들 항원에 대한 항체를 이용한다. 본 분석은 신속하고 신뢰할 수 있는 진단 검사를 제공하고, 비교적 고도하지 않은 실험실 능력의 시설에서의 사용에 적합하다. 더욱이, 본 분석은, 특정 설치류 집단이 바이러스에 감염되었는지를 결정하고, 그로 인하여 실험실 인력, 야외 작업자 및 야생 설치류와 작업하거나 이와 접촉하는 기타 사람들에의 감염을 예방하기 위하여, 한타바이러스 감염에 대한 야생 설치류 스크리닝에 사용될 수 있다.
유전자 재조합 기법이 기타 바이러스 오염원 및 유해한 단백질과 같은, 일반적으로 존재하는 기타 분자들이 없는 단백질 제제를 제공하기 위하여, 여기에 기술된 생산물을 생산하는데 사용될 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항체를 검출하는 방법에 관련된다. 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 생물학적 샘플을 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원과 접촉시키는 단계, 여기서 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV), 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하고, 여기서 각각의 항원형으로부터 적어도 하나의 재조합 항원이 존재하며, 접촉은 한타바이러스 항체가, 생물학적 샘플에 존재할 때, 적어도 하나의 G1 또는 N 항원에 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서 수행된다; 그리고
(b) 항체/항원 복합체의 존재 또는 부존재를 검출하여 샘플 내의 한타바이러스 항체의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계.
적어도 여섯 개의 한타바이러스 항원형, 즉, 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 적어도 하나의 항원이 존재하는 한, 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원은 G1 및 N 항원의 어떤 재조합일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원은 모두 N 항원이다.
추가적 구체예에서, 본 발명은 한타바이러스 감염을 검출하기 위한 면역진단 검사 키트에 관련된다. 본 검사 키트는 하기를 포함한다:
(a) 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원, 여기서 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울 (SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 항원형으로부터 적어도 하나의 항원이 존재한다; 그리고
(b) 면역진단 검사를 수행하기 위한 지시사항.
바람직한 구체예에서, 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원은 모두 N 항원이다.
더 나아간 구체예에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항원을 검출하는 방법에 관련된다. 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 생물학적 샘플을 적어도 여섯 개의 다른 항체와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 항체의 각각은 여섯 개의 한타바이러스 항원 중 적어도 하나에 특이적이며, 적어도 여섯 개의 한타바이러스 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 항원형으로부터 적어도 하나의 항원에 특이적인 적어도 하나의 항체가 존재하며, 여기서 접촉은 한타바이러스 항원이, 생물학적 샘플에 존재할 때, 항체에 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서 수행된다; 그리고
(b) 항체/항원 복합체의 존재 또는 부존재를 검출하여 샘플의 한타바이러스 항원의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계.
상기 방법의 특정 구체예에서, 항체는 모노클론 항체이다.
또 추가적 구체예에서, 본 발명은 한타바이러스 감염을 검출하기 위한 면역진단 검사 키트에 관련된다. 검사 키트는 하기를 포함한다:
(a) 적어도 여섯 개의 다른 항체, 여기서 각각의 항체는 여섯 개의 한타바이러스 항원 중 적어도 하나에 특이적이며, 여기서 여섯 개의 한타바이러스 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 항원형으로부터의 적어도 하나의 항원에 특이적인 적어도 하나의 항체가 존재한다; 그리고
(b) 면역진단 검사를 수행하기 위한 지시사항.
상기 면역진단 검사 키트의 특정 구체예에서, 항체는 모노클론 항체이다.
추가적 구체예에서, 본 발명은 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원을 포함하는 고체 지지물에 관련되며, 여기서 적어도 여섯 개의 한타바이러스 재조합 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바 (DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 항원형으로부터 적어도 하나의 항원이 존재한다. 고체 지지물은 니트로셀룰로오스 스트립일 수 있다.
특정 구체예에서, 고체 지지물은 적어도 하나의 항-인간 면역글로불린 항체를 더 포함하며, 이러한 하나 이상의 항체는 항-인간 IgM 항체, 항-인간 IgG 항체, 및 항-인간 IgA 항체로 구성된 군으로부터 선택되며, 한타바이러스 항원 및 항-인간 면역글로불린 항체는 고체 지지물 위의 별개의 위치에 고정된다.
추가적 구체예에서, 고체 지지물은 적어도 두 개의 내부 대조기준을 더 포함하며, 여기서 대조기준 중 하나는 고체 지지물을 사용하는 면역분석에서 양성 결과에 대한 낮은 검출 한계를 정의하고, 다른 하나의 대조기준은 고체 지지물을 사용하는 면역분석에서 높은 양성 결과를 정의한다.
더 나아간 구체예에서, 본 발명은 한타바이러스를 검출하기 위한 면역진단 검사 키트에 관련된다. 본 시험 키트는 하기를 포함한다:
(a) 전술된 바와 같은 고체 지지물; 그리고
(b) 면역진단 검사를 수행하기 위한 지시사항.
추가적 구체예에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항체의 존재를 검출하는 방법에 관련된다. 본 방법은 하기를 포함한다:
(a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
(b) 전술한 바와 같은 고체 지지물을 제공하는 단계;
(c) 한타바이러스 항체가, 만약 생물학적 샘플에 존재한다면, 적어도 하나의 한타바이러스 항원과 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서, 생물학적 샘플을 고체 지지물과 접촉시키는 단계; 그리고
(d) 항체/항원 복합체의 존재를 검출하여 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항체의 존재를 검출하는 단계.
특정 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 더 포함한다:
(e) 미결합된 한타바이러스 항체를 제거하는 단계;
(f) 항체/항원 복합체와 연합할 수 있는 하나 이상의 부분을 제공하는 단계; 그리고
(g) 하나 이상의 부분의 존재를 검출하여 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항체의 존재를 검출하는 단계.
특정 구체예에서, 하나 이상의 부분은 검출가능하게 표지된 한타바이러스 항원을 포함한다. 이들 및 기타 구체예에서, 검출가능한 표지는 효소일 수 있다.
또 추가적 구체예에서, 본 발명은 실질적으로 한타바이러스가 없는 전혈, 혈소판, 혈장 또는 혈청을 포함하는 혈액 공급을 제조하는 방법에 관련한다. 본 방법은 하기를 포함한다:
(a) 수집된 혈액 샘플으로부터의 전혈, 혈소판, 혈장 또는 혈청의 알리쿼트를 전술된 방법들 중 어느 하나의 방법에 의해 스크리닝하는 단계;
(b) 한타바이러스 항원 또는 한타바이러스 항체가 검출된 어떤 샘플을 제거하는 단계; 그리고
(c) 실질적으로 한타바이러스가 없는 혈액 공급을 제공하기 위하여 한타바이러스 항원도 한타바이러스 항체도 검출되지 않은 샘플들을 합하는 단계.
상기 방법 중 어느 방법에서도, 생물학적 샘플은 인간 혈액 샘플로부터 유래할 수 있다. 추가적으로, 상기 구체예들 중 어느 예에서도, G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원일 수 있다.
추가적으로, N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원일 수 있다.
G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가적 구체예에서, G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원이며, N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, 및 SEQ ID NO:36으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원이다.
추가적인 구체예에서, 적어도 하나의 G1 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV, 및 ANDV의 각각으로부터 존재하며, 적어도 하나의 N 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV, 및 ANDV의 각각으로부터 존재한다.
더 나아간 구체예에서, 적어도 하나의 N 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV, 및 ANDV의 각각으로부터 존재한다.
본 발명의 이들 및 기타 구체예는 여기의 개시에 비추어 당업자에게 즉시 떠오를 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 실행은, 다르게 지시되지 않는 한, 본 분야의 기술 수준 내에서, 바이러스학, 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 종래 방법들을 사용할 것이다. 그러한 기법들은 문헌상에 충분히 설명된다. 예컨대, Fundamental Virology, 3rd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Black well Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Mole cular Properties (W.H. Freeman & Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current ad.); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)를 참조.
여기에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은, 상기 또는 하기이건 간에 여기에 참조로서 전체가 포함되었다.
다음의 아미노산 약자들이 본문에 두루 사용되었다:
알라닌: Ala (A) 아르기닌: Arg (R)
아스파라긴: Asn (N) 아스파르트 산: Asp (D)
시스테인: Cys (C) 글루타민: Gln (Q)
글루탐 산: Glu (E) 글리신: Gly (G)
히스티딘: His (H) 이소류신: Ile (I)
류신: Leu (L) 리신: Lys (K)
메티오닌: Met (M) 페닐알라닌: Phe (F)
프롤린: Pro (P) 세린: Ser (S)
트레오닌: Thr (T) 트립토판: Trp (W)
타이로신: Tyr (Y) 발린: Val (V)
I. 정의
본 발명을 기술함에 있어 다음의 용어들이 사용될 것이며, 아래에 지시된 바와 같이 정의되도록 의도된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태, "한", 및 "그"는, 진의가 명확히 다르게 지시하지 않는 한, 복수 대상을 포함함이 주목되어야 한다. 따라서, 예컨대, "G1 폴리펩티드"의 지칭은 두 개 이상의 그러한 폴리펩티드의 혼합물 등을 포함한다.
용어, "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하며, 생산물의 최소 길이는 한정되지 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이합체, 다중체 등은 본 정의 내에 포함된다. 전장 단백질 및 그것의 단편 모두가 본 정의에 의해 포함된다. 본 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 수정, 예컨대, 글리코실레이션, 아세틸레이션, 포스포릴레이션 등을 포함한다. 게다가, 본 발명의 목적에서는, 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, "폴리펩티드"는 본래의 서열에 결실, 첨가, 치환 같은 (일반적으로 성질이 보존적인) 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이들 변형은 위치-특정 돌연변이 유발을 통하는 것과 같이 의도적일 수도, 혹은 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이나 PCR 증폭으로 인한 오류에 의한 것과 같이 우연적일 수도 있다.
본 발명과의 사용을 위한 다양한 한타바이러스 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 용어 "항원"은 천연, 재조합, 또는 합성이든지 간에, 한타바이러스 항체를 인식하는 하나 이상의 에피톱을 포함하고, 문제의 한타바이러스 종의 다양한 분리물 중 어느 것으로부터 유래된, N, G1 등등의 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, "한타바이러스 항원"은 한타바이러스 항원형, 종, 그리고 Murinae, Sigmodontinae, 및 Arvicolinae 아과의 다양한 분리물 중 어느 것을 비제한적으로 포함하는 분리물 중 어느 것으로부터 유래된 항원이다. 예컨대, SNV 항원은 원형 뉴 멕시코 SNV 분리물, 3H226, 캘리포니아 분리물, 브리티쉬 콜롬비아 분리물 등과 같은 다양한 신 놈브르 바이러스 분리물 중 어느 것으로부터 유래될 것이다. 유사하게, SEOV 항원은 다양한 서울 바이러스 분리물 및 다른 것들 중 어느 것으로부터 유래될 것이다. 본 발명에 사용을 위한 추가적인 항원은, 신 놈브르 바이러스(SNV; 포 코너스 바이러스 및 뮤에르토 캐년 바이러스도로 알려짐); 안데스 바이러스(ANDV); 뉴욕 바이러스(NYV); 블랙 크릭 카낼 바이러스(BCCV); 바이유 바이러스(BAYV); 한탄 바이러스 (HTNV), 푸말라 바이러스(PUUV), 서울 바이러스(SEOV), 및 도브라바-베오그라드 바이러스(DOBV)를 비제한적으로 포함하는, 기타 HPS- 및 HFRS-연관 한타바이러스로부터 유래될 수 있다. 이들 바이러스에 대한 게놈 서열은 주지이며, 본 발명에 사용을 위한 몇몇의 항원 서열이 하기에 더 기술된다.
문제의 항원은 참조 분자의 전장 아미노산 서열을 포함할 필요는 없으나 폴리펩티드가 적절한 한타바이러스 항체와 반응하기 위해서 필요한 만큼의 분자만을 포함할 수 있다. 따라서, 참조 분자의 오직 하나 또는 몇 개의 에피톱이 존재할 필요가 있다. 게다가, 항원은 전장 참조 분자 또는 참조 분자의 단편과 다른 한타바이러스 항원 및/또는 한타바이러스 항원의 반응성을 방해하지 않는 단백질과 같은 다른 단백질 사이에 융합 단백질을 포함할 수 있다. 따라서 항원이 참조 분자의 유사체, 뮤테인, 및 전구체 형태뿐만 아니라, 전장 서열, 단편, 절단 및 부분 서열을 포함할 수 있다는 것은 즉시 자명하다. 본 용어는 또한 항원이 한타바이러스 항체와 반응하는 능력을 유지하는 한, 참조 서열에 대한 결실, 첨가, 및 치환을 의미한다.
이러하므로, 자연적 변형은 특정 한타바이러스 종 내에서 분리물마다 발생할 것이다. 따라서, 본 용어는 그러한 변형, 및 특히 참조 항원으로부터 약 20퍼센트 미만, 보다 바람직하게는 약 10 내지 15퍼센트 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 5퍼센트 미만의 아미노산 조성이 가변적인 항원을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지나, 실질적으로 항체 결합력에 영향을 끼치지 않는 사소한 아미노산 치환을 지니는 단백질은 참조 폴리펩티드의 정의 내에 있다.
한타바이러스 항원형, 종, 또는 분리물 "로부터 유래된" 항원은 참조 한타바이러스 게놈에 의해 코드화된 항원의 서열을 포함하는 항원을 의도한다. 전형적으로, 항원은 하나 이상의 에피톱을 포함하며, 하기에 정의된 바와 같은, 통상 참조 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 가질 것이다. 따라서, 용어 "로부터 유래된"은 분자의 본래 기원을 확인하는 것에 사용되나, 예컨대, 화학 합성 또는 재조합 방법에 의할 수 있는, 분자가 만들어지는 방법을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "유사체" 및 "뮤테인"은 여기서 기술된 분석에서의 면역반응성과 같은, 원하는 활성을 유지하는, 참조 분자의 생물학적 활성 유도체를 지칭한다. 통상, 용어 "유사체"는, 변형이 면역원성 활성을 파괴하지 않는 한, 본래 분자에 연관된 하나 이상의 아미노산 첨가, (통상 성질이 보존적) 치환, 및/또는 결실을 지닌 본래 폴리펩티드 서열 및 구조를 지니고, 아래에 정의된 바와 같은 참조 분자에 "실질적으로 상동성"인 화합물을 지칭한다. 보존적 및 가변적 부분의 개수는 다양한 분리물들에 공지되어 있고, 통상 이들 부분으로부터 유래된 에피톱의 아미노산 서열은 고도의 서열 상동성을 가질 것이다. 두 서열이 정렬되었을 때는, 예컨대 50% 이상, 통상 60% 내지 70% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가질 것이다. 용어 "뮤테인"은 하나 이상의 펩티드 모방("펩토이드")을 지닌 펩티드를 지칭한다. 바람직하게, 유사체 또는 뮤테인은 본래 분자와 적어도 동일한 면역반응성을 가진다. 폴리펩티드 유사체 및 뮤테인을 만드는 방법은 본 분야에 주지이며 하기에 더 기술된다.
용어 "유사체" 및 "뮤테인"은 또한 참조 분자에 대해 만들어진 의도적인 변이를 포함한다. 특히 바람직한 유사체는 성질의 보존적인 치환, 즉, 그 측쇄와 연관된 아미노산의 과 이내에서 발생하는 치환을 포함한다. 구체적으로, 아미노산은 통상 네 개의 과로 분류된다: (1) 산성 -- 아스파르트산염 및 글루탐산염; (2) 염기성 -- 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 -- 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성 -- 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 예컨대, 류신의 이소류신 또는 발린과의, 아스파르트산염의 글루탐산염과의, 트레오닌의 세린과의 개별 치환, 또는 아미노산의 구조적으로 연관된 아미노산과의 유사한 보존적인 치환이 생물학적 활성에 주된 영향을 미치지 않을 것임은 합리적으로 예견가능하다. 예컨대, 관심의 항원은 분자의 희망하는 기능이 온전히 존속하는 이상, 약 5 내지 10까지의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 또는 약 15 내지 25, 50 또는 75까지의 보존적인 또는 비보존적인 아미노산 치환, 또는 5 내지 75 사이의 어떤 정수까지의 치환을 포함할 수 있다. 본 분야의 기법 중 하나는, 본 분야에 주지된, Hopp/Woods 및 Kyte-Doolittle 좌표를 참조하여 변화를 허용할 수 있는 관심 분자의 부분들을 즉시 결정할 수 있다.
"단편"은 온전한 전장 폴리펩티드 서열 및 구조의 일부분만을 포함하는 항원을 의도한다. 단편은 본래 폴리펩티드의 C-말단 결실, N-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 포함할 수 있다. 본 분석에 사용을 위한 대표적 G1 단편은 본원의 도 7 내지 12에 나타냈다. "면역원성 단편"은 하나 이상의 에피톱을 포함하고 따라서 여기에 기술된 하나 이상의 면역학적 반응을 유도하는 한타바이러스 폴리펩티드의 단편을 의도한다. 특정 한타바이러스 단백질의 "면역원성 단편"은, 문제의 단편이 여기서 정의된 것처럼 면역학적 반응을 유도하는 능력을 유지할 것을 조건으로, 에피톱 또는 다섯 개 아미노산 내지 전장 서열 사이의 어떤 정수로 정의하는, 통상 전장 분자의 적어도 약 5 내지 10의 연속적 아미노산 잔기, 바람직하게는 전장 분자의 적어도 약 15 내지 25의 연속적 아미노산 잔기, 그리고 가장 바람직하게는 전장 분자의 적어도 약 20 내지 50 또는 그 이상의 연속적 아미노산 잔기를 포함할 것이다.
"N 항원"은 상기 정의된 바와 같은, 문제의 한타바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질로부터 유래된 항원을 의미한다. 다양한 한타바이러스 N 단백질에 대한 DNA 및 대응 아미노산 서열은 주지이다. 예컨대, HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV로부터의 대표적 N 항원에 대한 뉴클레오티드 서열 및 대응 아미노산 서열은 도 13 내지 18에 각각 나타냈다. 추가적으로, 다수의 분리물의 N 단백질을 코드화하는 S 세그먼트가 GenBank에 기탁되었으며 하기에 더 기술된다. 추가적 서열은 1995년 1월 5일 공개된 국제공개번호 제WO95/00648호에 기술된다. Hjelle, et al, J. Virol (1994) 68:592-596은 SNV, 프로스펙트 힐(Prospect Hill) 바이러스(PHV) 및 PUUV로부터 유래된 N 항원의 아미노산 서열을 기술한다.
상기에 설명한 바와 같은, 본 분석에 사용을 위한 N 항원은 문제의 특정 한타바이러스 감염을 지닌 개인으로부터의 생물학적 샘플 내에 존재하는 항체와의 반응성이 유지되도록 하나 이상의 에피톱을 포함하는, 단백질의 단편, 융합, 또는 돌연변이뿐만 아니라, 전장 또는 실질적으로 전장 단백질도 포함한다. 예컨대, 여기에 기술된 분석에 사용을 위한 N 항원은 전장 SNV N 서열과 다른 한타바이러스 항원과 같은 다른 단백질 사이의 재조합 융합, 및/또는 50 kDa E. coli 말토스 결합 단백질, 또는 인간 또는 효모 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 단백질과 같은, 재조합 발현에 조력하는 단백질과의 융합일 수 있다. 본 분석에 유용한 N 단백질의 대표적 면역반응성 단편은, SNV NM 10에 관하여 번호 부여된, N 폴리펩티드의 17 내지 59 위치에서 발견되는 아미노산 서열에 대응하고, 아미노산 서열 QLVTARQKLKDAE RAVELDPDDVNKSTLQSRRAAVSALETKLG(SEQ ID NO:39)을 가지는 43 아미노산 아미노 말단-근접 세그먼트이다. 이 단편은 N 단백질의 면역우세 에피톱을 포함하며, 이 에피톱에 대한 항체는 PUUV, SEOV 및 HTNV로부터의 N 단백질과 교차-반응성이다. (예컨대, Yamada et al., J. Virol. (1995) 69:1939-1943; 및 1995년 3월 2일 공개된 국제공개번호 WO95/06250을 참조). 따라서, 이 서열을 포함하는 더 큰 단편뿐만 아니라, 이 단편도 본원의 분석에서 사용을 발견할 것이다. N 단백질의 에피톱에 대한 기술에 대해서, 또한 Lundkvist et al., Clin . Diag . Lab. Immunol . (1995) 2:82-86; 및 Gott et al., Virus Res. (1991) 19:1-16을 참조.
"G1 항원"은, 상기에 정의된 바와 같은, 문제의 한타바이러스의 G1으로 알려진 외피 당단백질로부터 유래된 항원을 의미한다. 다양한 한타바이러스 G1 단백질에 대한 DNA 및 대응 아미노산 서열이 주지이다. 대표적 G1 부분은 본원의 도 1 내지 6에 나타냈다. 추가로, 수많은 분리물로부터의 G1 단백질을 코드화하는 M 세그먼트가 GenBank에 기탁되었으며 하기에 더 기술된다. 상기에 설명된 바와 같은, 본 분석에 사용을 위한 G1 항원은, 문제의 특정 한타바이러스 감염을 지닌 개인으로부터의 생물학적 샘플에 존재하는 항체와의 반응성이 유지되도록 하나 이상의 에피톱을 포함하는, 단백질의 단편, 융합, 또는 돌연변이뿐만이 아니라, 전장 또는 실질적으로 전장 단백질을 포함한다. 여기에 기술된 분석에 사용되는 G1 항원은, 항원의 재조합 발현을 촉진하기 위하여, 문제의 G1 항원과 도 19에 나타낸 인간 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 서열 사이의 융합을 포함한다. 수많은 한타바이러스 항원형으로부터의 G1 단백질의 수많은 추가적인 대표적 면역반응성 단편들은 본원의 도 7 내지 12에 나타냈다. G1 단백질의 다른 대표적적 면역반응 단편은, SNV NM H1O에 관하여 번호 부여된, 아미노산 59 내지 89 사이의 세그먼트에 대해 맵핑되고, LKIE SSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS(SEQ ID NO:40)의 아미노산 서열을 가지는 31 아미노산 펩티드이다. G1 단백질의 이 부분은 다양한 SNV 분리물로부터의 SNV 항체에 의해 인식되는 면역반응 선형 에피톱을 포함한다. (Jenison et al, J. Virol. (1994) 68:3000-3006). 이 서열을 포함하는 더 큰 단편뿐만이 아니라, 이 단편도 본원에서의 분석에 사용을 발견할 것이다.
한타바이러스 항원의 "면역원성" 서열은, 적합한 숙주에서 항체 생산을 자극할 뿐만 아니라, 문제의 한타바이러스에 대한 항체와 반응할 수 있는 분자와 같은, 적어도 하나의 한타바이러스 에피톱을 지닌 아미노산 서열을 포함하는 분자를 의미한다. "에피톱"은, 문제 한타바이러스 에피톱이 항체 생산을 자극할 뿐만 아니라, 생물학적 샘플에 존재하는 한타바이러스 항체와 반응할 수 있게 하는, 특정 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 위치를 의미한다. 본 용어는 또한 "항원 결정원" 또는 "항원 결정 부위"와 상호 교체가능하게 사용된다. 하나의 에피톱은 그 에피톱에 특이한 공간 구조에서 셋 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 통상, 에피톱은 적어도 다섯 개의 그와 같은 아미노산을 포함하며, 보다 일반적으로, 적어도 8 내지 10개의 그와 같은 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
에피톱을 포함하는 기정 폴리펩티드의 부분은 본 분야에 주지된, 어떠한 수의 에피톱 맵핑법을 사용하여 확인할 수 있다. 예컨대, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey를 참조. 예컨대, 선형 에피톱은, 예컨대, 고체 지지물 상에 다수의 펩티드를 동시적으로 합성하고(여기서 펩티드는 단백질 분자의 부분에 대응한다), 펩티드가 여전히 지지물에 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 그러한 방법들은 본 분야에 주지이고, 예컨대, 미국특허 제4,708,871호; Geysen et al. (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:178-182; Geysen et al. (1986) Molec . Immunol . 23:709-715에 기술되어 있으며, 모두 여기에 참조로서 전체가 포함된다. 유사하게, 구조적 에피톱은, 예컨대, 엑스레이 결정학 및 2차원 핵자기공명에 의한 것과 같은, 아미노산의 공간 구조를 결정함으로써 즉시 확인될 수 있다. 예컨대, 상기 Epitope Mapping Protocols를 참조. 단백질의 항원 부분은 또한, 예컨대, Oxford Molecular Group으로부터 입수가능한 Omiga 1.0판 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것들과 같은, 표준 항원성 및 수성플롯을 사용하여 확인할 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위한 Hopp/Woods 방법, Hopp et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA (1981) 78:3824-3828, 및 수성플롯을 위한 Kyte-Doolittle 방법, Kyte et al., J. Mol . Biol. (1982) 157:105-132를 사용한다.
"면역원성 조성물"은 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드 (예컨대, N 및/또는 G1 한타바이러스 항원)를 포함하는 조성물이다.
통상 "실질적으로 정제된"은, 물질이 그것이 존재하는 샘플의 주된 퍼센트를 포함하게 하도록 하는 물질(합성물, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 폴리펩티드 조성물)의 분리를 지칭한다. 전형적으로 샘플 내에서 실질적으로 정제된 성분은 샘플의 50%, 바람직하게는 80% 내지 85%, 보다 바람직하게는 90% 내지 95%를 포함한다. 관심의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 정제하기 위한 기법은 본 분야에 주지이고, 예컨대, 이온-교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 및 밀도에 의한 침전을 포함한다.
"분리된"은 폴리펩티드를 지칭할 때, 지정된 분자가, 그 분자가 자연에서 발견되는 전체 생물로부터 별개이고 분리된 것이거나, 동일한 유형의 기타 생물학적 거대분자가 실질적으로 없는 곳에 존재하는 것을 의도한다. 폴리뉴클레오티드에 관한 용어 "분리된"은, 통상 자연에서 그것과 정상적으로 연관된 서열; 또는 자연에서 존재하는 대로이지만 그것과 연관된 이종성 서열을 가진 서열; 또는 염색체로부터 분리된 분자가, 전체적 또는 부분적으로 부존재인 핵산 분자이다.
"등가 항원성 결정원"은, 항원 결정원이 서열 변이로 인하여 반드시 동일할 필요는 없으나 문제의 한타바이러스 서열의 동일한 위치에 발생하는, 한타바이러스의 다른 분리물 또는 종으로부터의 항원 결정원을 의미한다. 통상, 등가 항원성 결정원의 아미노산 서열은 높은 서열 상동성, 예컨대, 두 서열이 정렬되었을 때, 30% 이상의 아미노산 서열 상동성, 일반적으로 60% 이상과 같은, 40% 이상 및 80% 내지 90% 이상의 상동성을 가질 것이다.
"상동성"은 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 부분들 사이의 퍼센트 동일성을 지칭한다. 두 핵산 또는 두 폴리펩티드 서열은, 서열들이 분자의 정의된 길이에 걸쳐, 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더 바람직하게는 적어도 약 80% 내지 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 내지 98%의 서열 동일성을 나타낼 때, 서로 간에 "실질적으로 상동성"이다. 여기에 사용된 바와 같은, 실질적으로 상동성은 또 특정의 서열에 완전 동일성을 나타내는 서열들을 지칭한다.
통상, "동일성"은 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 지칭한다. 퍼센트 동일성은, 서열들을 정렬하고, 두 정렬된 서열들 사이의 일치 쌍의 정확한 수를 세고, 참조 서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱함으로써, 두 분자들 (참조 서열 및 참조 서열에 대한 미지 % 동일성을 가진 서열) 사이의 서열 정보의 직접적인 비교에 의해 결정될 수 있다. 즉시 사용가능한 컴퓨터 프로그램은, 펩티드 분석을 위한 Smith and Waterman Advances in Appl . Math. 2:482-489, 1981의 국소 상동성 알고리즘을 도입하는, ALIGN, Dayhoff, M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC)와 같은 것으로 분석을 돕기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 Wisconsin Sequence Analysis Package, 8판(Genetics Computer Group, Madison, WI으로부터 구입가능), 예컨대, 또한 Smith and Waterman 알고리즘에 의존하는, BESTFIT, FASTA, 및 GAP 프로그램들이 가용하다. 이들 프로그램들은 제조사에 의해 추천되고 상기 참조된 Wisconsin Sequence Analysis Package에 기술된 기본설정 변수와 함께 즉시 활용될 수 있다. 예컨대, 참조 서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 여섯 개 뉴클레오티드 위치의 기본설정 점수표 및 갭 페널티와 함께 Smith and Waterman의 상동성 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 퍼센트 동일성을 수립하는 다른 방법은, University of Edinburgh에 의해 저작권 소유되고, John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의해 개발되며, IntelliGenetics, Inc.(Mountain View, CA)사에 의해 배포된 프로그램의 MPSRCH 패키지를 사용하는 것이다. 패키지의 이 슈트로부터 Smith-Waterman 알고리즘은 점수표를 위해 기본설정 변수가 사용되는 곳 (예컨대, 12의 갭 개방 페널티, 하나의 갭 확장 페널티, 및 여섯 개의 갭)에 사용될 수 있다. 생성된 데이터로부터 "일치" 수치는 "서열 동일성"을 반영한다. 서열들 사이에 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 기타 적합한 프로그램은 본 분야에 통상 주지이고, 예컨대, 다른 정렬 프로그램은 기본설정 변수와 함께 사용되는 BLAST이다. 예컨대, BLASTN 및 BLASTP는 하기의 기본설정 변수를 사용하여 사용될 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 사슬 = 양쪽; 커트라인 = 60; 예상 = 10; Matrix = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 정렬 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세는 즉시 획득할 수 있다.
대안으로, 상동성은 상동성 부분 사이에 안정된 이중나선을 형성하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화, 그 후 단일-사슬-특이적 뉴클레아제(들)와의 분해, 및 분해된 단편의 크기 결정으로써 결정될 수 있다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 예컨대, 그 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은, 엄격한 조건 하에 서던 혼성화 실험에서 확인할 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 본 분야의 기술 내에 있다. 예컨대, 상기 Sambrook et al.; 상기 DNA Cloning; 상기 Nucleic Acid Hybridization을 참조.
핵산 분자를 기술하기 위해 여기서 사용된 "재조합"은, 그것의 기원 또는 조작에 의해, 천연 연관된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 부분과 연관되지 않은, 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성적, 또는 합성적인 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 의미한다. 통상, 관심의 유전자는 클론되고, 그 후 아래 더 기술된 바와 같은, 형질전환된 생체 내에 발현된다. 숙주 생체는 발현 조건하에서 단백질을 생산하는 이질 유전자를 발현한다.
"항체"는 항원에 존재하는 관심의 에피톱에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. "특이적으로 결합한다"는, 항체와, 예컨대, 항체가 반응되는 검사 기질의 사이에 발생할지도 모르는 비-특이적 결합과는 반대로, 항원과 항체 사이의 복합체를 형성하기 위한 "자물쇠와 열쇠" 유형의 상호작용에서, 항체가 에피톱을 인식하고 이와 상호작용하는 것으로 의미된다. 따라서, 항-한타바이러스 G1 항체는 한타바이러스 G1 단백질의 에피톱에 특이적으로 결합하는 분자이다. 여기서 사용된 용어 "항체"는 하기 것들: 혼성(키메라) 항체 분자들(예컨대, Winter et al., Nature (1991) 349:293-299; 및 미국특허 제4,816,567호를 참조); F(ab')2 및 F(ab) 단편들; Fv 분자들 (비-공유 이형이합체들, 예컨대, Inbar et al., Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69:2659-2662; 및 Ehrlich et al., Biochem (1980) 19:4091-4096을 참조); 단일-사슬 Fv 분자들(sFv)(예컨대, Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:5879-5883을 참조); 이합체 및 삼합체 항체 단편 구조체들; 소체들(예컨대, Pack et al, Biochem(1992) 31:1579-1584; Cumber et al, J Immunology (1992) 149B:120-126을 참조); 인간화된 항체 분자들 (예컨대, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534-1536; 및 1994년 9월 21일 공개된 영국 특허공개번호 제GB2,276,169호를 참조); 및 그러한 분자들로부터의 어떠한 기능적 단편(여기서 그러한 단편들은 부모 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 유지한다), 뿐만 아니라, 폴리클론 및 모노클론 제제 양자로부터 획득된 항체를 포함한다.
여기서 사용된 바와 같은, 용어 "모노클론 항체"는 상동성 항체 집단을 포함하는 항체 조성물을 지칭한다. 본 용어는 항체의 종 또는 기원에 관해서 제한되지 않으며, 그것이 만들진 방식에 의해서도 제한되도록 의도되지도 않는다. 본 용어는, Fab, F(ab')2, Fv, 및 기타 단편과 같은 단편들 및 부모 모노클론 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는, 키메라 및 인간화 상동성 항체 집단들, 뿐만 아니라 전체 면역글로불린을 포함한다.
여기서 사용된 바와 같은, "고체 지지물"은 고분자, 예컨대, 자성 비드, 라텍스 비드, 마이크로타이터 플레이트 웰, 유리 플레이트, 나일론, 아가로스, 폴리아크릴아마이드, 실리카 입자, 니트로셀룰로스 막 등과 같은, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드가 부착될 수 있는 고체의 표면을 지칭한다.
"면역학적 반응성"은 문제의 항원이 한타바이러스-감염된 개인으로부터의 생물학적 샘플에 존재하는 항-한타바이러스 항체와 특이적으로 반응하는 것을 의미한다.
"면역 복합체"는 항체가 항원 상의 에피톱에 결합할 때 형성되는 조합을 의도한다.
여기서 사용된 바와 같은, "생물학적 샘플"은 혈액, 혈장, 혈청, 대변 물질, 소변, 골수, 담즙, 척추 유체, 림프 유체, 뇌척수 유체, 피부 샘플, 피부, 호흡, 장, 및 비뇨생식 경로의 분비물, 눈물, 타액, 유액, 혈구, 기관, 생체 조직, 및 또한, 예컨대, 재조합 세포와 같은, 배양 배지에서 세포 및 조직의 성장으로부터 기인하는 조건 배지를 비제한적으로 포함하는 시험관 내 세포배양 구성물의 샘플, 및 세포 구성요소와 같으나 이에 제한되지 않는, 피검자로부터 분리된 조직 또는 유체의 샘플을 지칭한다. 상기에 기술된 샘플은 출처로부터 직접 획득된 형태로 반드시 존재할 필요는 없다. 예컨대, 샘플은, 예컨대, 분석 전의 가열, 원심 분리, 등에 의한 것과 같이, 사용 전에 처리될 수 있다.
여기서 사용된 바와 같은, 용어 "표지" 및 "검출가능한 표지"는, 방사성 동위원소, 형광물질, 반도체 미립자, 화학발광물질, 크로모포어, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제, 염료, 금속 이온, 금속 졸, 리간드(예컨대, 비오틴, 스트렙파비딘, 또는 합텐) 등을 비제한적으로 포함하는, 검출할 수 있는 분자를 지칭한다. 용어 "형광물질"은 검출가능한 한도 내에서 형광성을 나타낼 수 있는 물질 또는 그것의 부분을 지칭한다. 본 발명하에 사용될 수 있는 표지의 특정 예들은, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 플루오레세인, FITC, 로다민, 댄실, 산형과, 디메틸 아크리디늄 에스테르(DMAE), 텍사스 레드, 루미놀, NADPH, 및 α-β-갈락토시다제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
II. 발명을 실행하는 방식
본 발명을 자세히 기술하기에 앞서, 본 발명은, 물론 다양할 수 있는, 특정의 제형 또는 과정 변수에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 여기서 사용된 용어는 발명의 특정 구체예를 기술하려는 것만을 목적으로 하며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 점이 또한 이해되어야 한다.
여기서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 수많은 방법 및 재료가 본 발명의 실행에 사용될 수 있으나, 바람직한 재료 및 방법이 여기에 기술된다.
본 발명은 정확하게 한타바이러스 감염을 검출하기 위한 신규 진단방법의 발견에 기초한다. 본 방법은, 면역우세 에피톱을 포함하는 한타바이러스 재조합 N 및 G1 항원, 및/또는 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV를 포함하는 적어도 여섯 개의 다른 한타바이러스 항원형으로부터의, 이들 항원에 대한 항체를 사용한다. 특정 구체예에서, 분석은, 예컨대, 여섯 개의 재조합 G1 항원들 (및/또는 여섯 개의 G1 항원들에 대한 항체들), 상기의 항원형 각각으로부터의 하나, 및/또는 여섯 개의 재조합 N 항원들, 상기의 항원형 각각으로부터의 하나를 포함한다. 대안적인 구체예에서, 분석은, 예컨대, 나머지 다섯 개의 항원형 중 하나 이상과 교차반응하는 항체를 생산하는, 이들 여섯 항원형 중 어느 하나로부터 유래된 적어도 하나의 재조합 N 항원, 및 여섯 개의 재조합 G1 항원들, 여섯 개 항원형 각각으로부터의 하나를 포함할 수 있다. 예컨대, 분석은 SNV로부터의 하나의 N 항원 (및/또는 N 항원에 대한 항체들)을 포함할 수 있다. 분석은 또한, 바람직하게는 여섯 개 모두의 항원형, HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV로부터의, G1 항원들 (및/또는 G1 항원들에 대한 항체들)을 포함할 것이다. 대안으로, 분석은 이들 여섯 개 항원형 중 어느 하나로부터의 하나의 G1 항원 (및/또는 그에 대한 항체들), 및 이들 여섯 개 항원형 각각으로부터의 여섯 개의 N 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들)을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 분석은, 예컨대, 여섯 개 항원형 중 셋으로부터의 세 개의 G1 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들), 및 여섯 개 항원형 중 다른 세 개로부터의 세 개의 N 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 분석은, 두 개의 G1 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들) 및 네 개의 N 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들), 또는 네 개의 G1 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들) 및 두 개의 N 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들), 또는 하나의 G1 항원 (및/또는 그에 대한 항체들) 및 다섯 개의 N 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들), 또는 다섯 개의 G1 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들) 및 하나의 N 항원 (및/또는 그에 대한 항체들), 또는 네 개의 G1 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들) 및 네 개의 N 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들), 또는 다섯 개의 G1 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들) 및 다섯 개의 N 항원들 (및/또는 그에 대한 항체들) 등을 포함할 수 있다. 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV, 및 ANDV가 대표되는 한, 재조합 G1 및 N 항원 (및/또는 그에 대한 항체들)의 어떠한 조합이든 사용될 수 있다는 것이 즉시 자명하다.
본 발명의 분석은 또한 표 1에서 기술되거나, 기타 후속적으로 확인된 다양한 한타바이러스 종의 어떠한 것으로부터 유래된 추가적인 한타바이러스 항원을 사용할 수 있다.
여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV로부터의 한타바이러스 N 및/또는 G1 항원 (및/또는 거기에 덧붙여 항체), 선택적으로 기타 한타바이러스 단백질 및/또는 항체와의 조합으로의 사용은 다양한 공지의 한타바이러스 항원형 중 어떤 것에 의해 야기된 감염의 진단을 허용한다. 게다가, 분석은 감염을 야기하는 특정 한타바이러스 항원형이 확인될 수 있도록 적합화될 수 있다. 예컨대, 다양한 HPS- 및 HFRS-연관 한타바이러스에 감염된 환자들로부터의 생물학적 샘플은 SNV N 항원과 반응하지만, SNV G1 항원과는 반드시 반응하는 것은 아니다. 따라서, SNV N 항원과 반응성의 존재 및 SNV G1 항원과 반응성의 부존재는 SVN 등이 아닌, 한타바이러스의 감염을 나타낸다. 다양한 항원 및 항원 조합 (또는 이들 항원에 대한 항체)이 본 진단 분석에 사용될 수 있다는 것이 즉시 자명하다.
본 방법은 설치류 집단에서뿐만 아니라, 인간에서도 한타바이러스 감염을 검출하는데 유용하다. 본 방법은 전혈, 혈청, 및 혈장을 비제한적으로 포함하는 혈액 샘플들에서 한타바이러스 감염을 검출할 수 있다. 따라서, 본 방법은 공여된 혈액 샘플 내에서 한타바이러스 오염을 검출하기 위한 것뿐만 아니라, 인간 또는 설치류 피검자와 같은 피검자의 한타바이러스 감염을 진단하는데 사용될 수 있다. 개별 공여된 샘플이나 집체화된 샘플로부터의 알리쿼트는 한타바이러스의 존재에 대해 스크리닝될 수 있고 한타바이러스로 오염된 그러한 샘플 또는 집체화된 샘플은 그것들이 합해지기 전에 제거될 수 있다. 이런 식으로, 실질적으로 한타바이러스 오염이 없는 혈액 공급이 제공될 수 있다.
본 발명의 한 층 더한 이해를 위해서, 하기에, 피검자 조성물 및 방법에 사용을 위한 다양한 한타바이러스 항원 및 항체뿐만 아니라, 한타바이러스에 관해서도 더 자세한 논의가 제공된다.
한타바이러스 항원
상기에서 설명된 바와 같은, 바이러스의 한타바이러스 과는 Bunyavirus 속에 속하며 바이러스는 외피보유 마이너스-센스 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 RNA는 세 부분이며, 이것은 작은, 중간, 및 큰 게놈 단편에 대해 각각 S, M, 및 L로 일반적으로 지정되는 세 단편으로 구성된다. M 세그먼트는 G1과 G2로 명명된 두 개의 외피 당단백질을 단일 개방 판독 프래임에서 코드화한다. S 세그먼트는 N으로 명명된 뉴클레오캡시드 단백질을 코드화하고, 게놈의 L 세그먼트는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 코드화한다.
세계적으로 몇몇의 특이한 한타바이러스가 특정 설치류 숙주와 연관되어 발견되었다. (표 1을 참조). 상기에서 설명된 바와 같은, 적어도 여섯 개의 주요 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV, 및 ANDV로부터 유래된 N 및/또는 G1 항원은 여기서 사용을 발견할 것이다. 이들 항원형에 속하는 것으로 확인된 다수 분리물로부터의 N 및 G1 항원에 대한 서열, 및 이들 항원을 코드화하는 핵산 서열은 주지이다. 그로부터 G1 항원이 유래될 수 있는 대표적 서열은 본원의 도 1 내지 12에 기술된다. 이 도면에 기술된 G1 항원은 N-말단 메티오닌을 포함하지만, 여기서 사용을 위한 G1 펩티드는, 특히 합성법에 의해 생산된다면, 이 메티오닌을 포함할 필요가 없다. 본원에서 사용을 위한 G1 항원은 전장 G1 단백질 및 G1 단백질의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. SNV NM H10 LKIESSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS (SEQ ID NO:40)에 관련되어 번호 부여된, 아미노산 59 내지 89에 의해 나타낸, 31 아미노산 서열에 대응하는 부분을 적어도 포함하는 단편은 특히 유용하다. G1 단백질의 이 부분은 면역원성 선형 에피톱을 포함하며, 본원의 도 7 내지 12에 나타낸 G1 면역원성 단편의 각각에서 발견된다. 이 서열은 여기 관심의 여섯 개 한타바이러스 항원형에서 동일하지 않다. 따라서, 이 서열에 "대응하는" 비-SNV 한타바이러스로부터의 아미노산 서열은, 동일한 부분에 정렬되고 이 서열에 상동성을 나타내나 이 서열에 반드시 100% 동일성일 필요는 없는 비-SNV 한타바이러스로부터의 아미노산 세그먼트이라는 것이 이해되어야 한다. 다른 다섯 한타바이러스 항원형 내의 이 대응 부분은 여기의 도 7 내지 12의 검토로부터 즉시 확인 가능하다.
SEQ ID NO:40에 나타낸 아미노산들의 서열에 대응하는 아미노산들의 서열을 포함하는 면역원성 G1 항원은, 31 아미노산, 예컨대, 31 내지 50...60...70...75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86...90...100...200...300... 400...500, 전장 G1 분자까지와 같은, 31 내지 500 아미노산, 바람직하게는 31 내지 250 아미노산, 보다 더 바람직하게는 31 내지 150 아미노산과 같은 전장 G1 분자까지의 아미노산, 또한 이들 범위 내의 어떠한 정수인 아미노산을 포함할 수 있다. 더구나, 여기에 사용을 위한 G1 항원은, 막관통 결합 영역 및/또는 외피의 C-말단에서 발견되는 세포질 미부의 모두 또는 부분이 결여될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 막관통 결합 영역 및/또는 세포질 미부의 전체 또는 부분이 결여된 항원뿐만 아니고, G1 단백질의 인접 부분뿐만 아닌, 막관통 결합 영역 및 세포질 미부를 유지하는 외피 폴리펩티드의 사용을 의도한다. 그런 영역의 위치는 Kyte-Doolittle 기법, Kyte et al., J. Mol . Biol . (1982) 157:105-132와 같은, 본 분야에서 주지된 컴퓨터 프로그램 및 알고리즘을 사용하여 즉시 결정될 수 있다.
G1 항원이 유래될 수 있는 추가적 서열은 주지이다. 예컨대, G1 서열은 승인번호 NC_005219, AF345636, D25532, D25529, D00377, D00376, AF288645, AF366569, AF035831, Y00386, U38177, U37729, M14627, 및 L08753 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 HTNV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. G1 서열은 승인번호 L37903, L25783, AF030552, AF030551, 및 U02471 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 SNV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. G1 서열은 승인번호 NC_003467 및 AF291703 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 ANDV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. G1 서열은 승인번호 AF458104, AB027521, AF 288654, AF288652, AF288650, 및 S47716 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 SEOV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. G1 서열은 승인번호 NC_005223, AY526218, U14136, U22418, L08754, L08755, X61034, X55129, 및 M29979 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 PUUV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. G1 서열은 승인번호 NC_005234, AJ410616, AY168578, AY168577 및 L33685로 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 DOBV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.
N 항원이 유래될 수 있는 대표적 서열은 본원의 도 13 내지 18에 기술된다. G1 항원에 대하여 상기에서 기술된 바와 같이, N 항원은 N-말단 메티오닌을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있다. 본원에서 사용을 위한 N 항원은 전장 N 단백질 또는 N 단백질의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. SNV NM H10(QLVTARQKLKDAERA VELDPDDVNKSTLQSRRAAVSALETKLG(SEQ ID NO:39))에 관련되어 번호 부여된, N 폴리펩티드의 17 내지 59 위치에서 발견되는, 43 아미노산 서열에 대응하는 부분을 적어도 포함하는 단편은 특히 유용하다. N 단백질의 이 부분은 면역우세 에피톱을 포함하며 이 에피톱에 대한 항체는 PUUV, SEOV, 및 HTNV로부터의 N 단백질과 교차-반응성이다.
이 서열은 본원의 관심의 여섯 개 한타바이러스 항원형에서 동일하지 않다. 따라서, 따라서, 이 서열에 "대응하는" 비-SNV 한타바이러스로부터의 아미노산 서열은 동일한 부분에 정렬되고 이 서열에 상동성을 나타내나 이 서열에 100% 동일성을 반드시 나타낼 필요는 없는 비-SNV 한타바이러스로부터의 아미노산 세그먼트임이 이해되어야 한다. 나머지 다섯 개 한타바이러스 항원형에서 대응하는 부분은 본원의 도 13 내지 18의 검토로부터 즉시 확인할 수 있다.
SEQ ID NO:39에 나타낸 아미노산들의 서열에 대응하는 아미노산들의 서열을 포함하는 면역원성 N 항원은 43 아미노산, 예컨대, 43 내지 60...70...80...90... 100...200...300...400, 전장 N 분자까지와 같은, 43 내지 350 아미노산, 바람직하게는 43 내지 300 아미노산, 더 바람직하게는 43 내지 200 아미노산, 보다 더 바람직하게는 43 내지 100 아미노산과 같은, 전장 N 분자에 이르는 아미노산, 또는 이들 범위 내의 어떠한 정수인 아미노산을 포함할 수 있다.
N 항원이 유래될 수 있는 추가적 서열은 주지이다. 예컨대, N 서열은 승인번호 AB127998, AB027101, AB027523, AB027097, D25533, AF288646, AF288644, AF 427324, AF427323, AF427322, AF427320, AF427319, AF427318, AF366568, AY017064, AF321095, AF321094, AF288296, U37768, 및 M14626 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 HTNV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. N 서열은, 승인번호 NC_005216, L37904, L25784, L33816, L33683, 및 U02474 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 SNV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. N 서열은, 승인번호 NC_003466, AF325966, AF0044660, 및 AF291702 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 ANDV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. N 서열은, 승인번호 NC_005236, AF488708, AF488707, AY273791, AB027522, AF329390, AF288655, AF 288653, AF288643, AF406965 및 AY006465로 NCBI 하에 기탁된 서열들과 같은 다양한 SEOV 서열 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. N 서열은 승인번호 NC_005224, AY526219, AJ314601, AJ314600, AJ314599, AJ314598, AJ314597, AF442613, AF367071, AF367070, AF367068, AF367067, AF367066, AF367065, AF367064, AJ277030, AJ277076, AJ277075, AJ277034, AJ277033, AJ277032, AJ277031, AJ238791, AJ 238790, AJ238789, AJ238788, X61035, AB010731, AB010730, U14137, AF294652, U22423, L08804, Ll1347 및 M32750로 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 PUUV 서열 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. N 서열은 승인번호 NC_005233, AJ616854, AJ410619, AJ410615, AJ131673, AJ131672, AJ269550, AJ269549, AJ 009775, AJ009773, AY168576, 및 L41916 하에 NCBI에 기탁된 서열들과 같은 다양한 DOBV 서열들 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.
재조합 N 및 G1 항원은 별개의 생산물로서 또는, HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV에 추가적인 항원형으로부터 유래된 항원과는 물론이고, 하나 이상의 이들 여섯 항원으로부터의 기타 한타바이러스 항원과 또는 이들 없이, 다양한 N 및 G1 항원의 융합으로서 제공될 수 있다. 예시로서, 융합은 상기 여섯 항원형으로부터의 G1 항원을 포함할 수 있다. 이 융합은 단일로 또는 하나 이상의 이들 여섯 항원형으로부터의 하나 이상의 N 항원을 포함하는 제2 융합과 조합으로 사용될 수 있다. 유사하게, 융합은 상기 여섯 항원형으로부터의 N 항원을 포함할 수 있고 이 융합은 단일로 또는 하나 이상의 이들 여섯 항원형으로부터의 하나 이상의 G1 항원을 포함하는 제2 융합과 조합으로 사용될 수 있다. 대안으로는, 모든 N 및 G1 항원은 단일 융합으로 또는 다중 융합으로 제공될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은, HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 N 및/또는 G1 항원이 존재하는 한, 어떠한 개수의 형태든 취할 수 있다는 것이 즉시 자명하다. 만약 융합이 생산되면, 폴리펩티드는 본래 바이러스에서 발견되는 것과 같은 동일한 순서로 조직될 필요는 없다. 따라서, 예컨대, G1 폴리펩티드는 N 폴리펩티드 등의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 다른 가능한 융합 단백질은 인간 또는 효모 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 단백질, 또는 SOD 단백질의 단편과 한타바이러스 G1 및/또는 N 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 인간 SOD 융합 항원으로서 발현된 재조합 단백질의 예에 대해, Barr et al., Vaccine (1987) 5:90-101; Pichuantes et al., Proteins Struct. Fuct . Genet. (1989) 6:324-327; Pichuantes et al., J. Biol . Chem . (1990) 23:13890-13898을 참조.
본 발명에 사용을 위한 항원은 표준 기법을 사용하여 획득할 수 있다. 예컨대, 한타바이러스 항원은 본 분야에 주지인 재조합 방법을 사용하여 편리하게 생산할 수 있다. 한타바이러스 항원의 재조합 생산에 대한 기술에 대해서는, 예컨대, 1995년 1월 5일에 공표된 국제공개 WO95/00648; 1995년 3월 2일에 공표된 국제공개 제WO95/06240호; 및 Hjelle, et al., J. Virol (1994) 68:592-596을 참조.
올리고뉴클레오티드 프로브는 한타바이러스 게놈의 공지 서열에 기초하여 고안될 수 있고, 본 발명에 유용한 항원을 코드화하는 한타바이러스 유전자에 대한 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 프로브하는데 사용될 수 있다. 유전자는 표준 기법, 및 원한다면, 전장 서열의 희망하는 부위에서 유전자를 변이하는데 사용하는 제한효소를 사용하여 더 분리될 수 있다.
유사하게, 한타바이러스 유전자는 페놀 추출(예컨대, 1995년 1월 5일에 공표된 국제공개 제WO95/00648호를 참조)과 같은 공지 기법을 사용하여 감염된 조직으로부터 직접 분리될 수 있고, 서열은 희망하는 변형을 생산하기 위해서 더 조작될 수 있다. DNA를 획득하고 분리하는데 사용되는 기법에 대한 기술에 대해서, 예컨대, 상기 Sambrook et al.을 참조. 마지막으로, 한타바이러스 항원을 코드화하는 유전자는, 공지된 서열에 기초하여, 합성으로 생산될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 희망하는 특정 아미노산 서열에 대한 적절한 코돈으로 설계될 수 있다. 통상, 사람은 서열이 발현될 의도된 숙주에 대해 바람직한 코돈을 선택할 것이다. 완전한 서열은 통상 표준방법에 의해서 제조된 겹치는 올리고뉴클레오티드로부터 조합되고 완전한 코딩 서열로 결합된다. 예컨대, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; Jay et al., J. Biol . Chem . (1984) 259:6311을 참조.
폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 다양한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하거나 자연에 존재하지 않는 인공서열을 포함할 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는, 원한다면 표준 분자 생물학 기법을 사용하여, 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 형성하기 위해 결찰될 수 있다.
일단 코딩 서열이 준비되거나 분리되면, 그러한 서열은 어떠한 적절한 벡터 또는 레플리콘 내로도 클론될 수 있다. 수많은 클로닝 벡터가 당업자에게 공지이고, 적절한 클로닝 벡터의 선택은 선택의 문제이다. 적절한 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체 또는 적절한 통제 요소와 연합되었을 때 복제가 가능한 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 코딩 서열은, 발현에 사용될 시스템에 따라서, 그 후 적절한 통제 요소의 조절하에 놓이게 된다. 따라서, 코딩 서열은, 관심의 DNA 서열이 적절한 형질전환체에 의해 RNA로 전사되도록, 프로모터, (박테리아 발현에 대한) 리보솜 부착 위치, 및 선택적으로, 오퍼레이터의 통제하에 놓일 수 있다. 코딩 서열은 번역 후 가공에서 숙주에 의해 추후 제거될 수 있는 신호 펩티드 또는 리더 서열을 포함 또는 불포함할 수 있다. 예컨대, 미국특허 제4,431,739호; 제4,425,437호; 제4,338,397호를 참조.
만약 존재한다면, 신호 서열은 관심의 한타바이러스 폴리펩티드와 관련하여 발견되는 본래 리더일 수 있다. 예컨대, 만약 발현되는 한타바이러스 폴리펩티드가 G1 항원이면, 본래 G1 리더 서열의 전부 또는 부분이 포함될 수 있다. 대안으로는, 이종성 신호 서열이 존재할 수 있는데, 이는 분비의 효율을 증가시킬 수 있다. 수 많은 대표적 리더 서열이 본 분야에 공지이고, 효모 α-인자 리더, TPA 신호 펩티드, Ig 신호 펩티드 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들과 기타 리더 서열에 대한 서열은 본 분야에 주지이다.
통제 서열에 더하여, 숙주세포의 성장과 관련된 서열의 발현을 조절하도록 허용하는 조절 서열을 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 서열은 당업자에게 주지이며, 예로는, 조절 화합물의 존재를 포함하는, 화학적 또는 물리적 자극에 대한 반응으로 유전자의 발현을 개시 또는 종결하게 유발하는 것들을 포함한다. 다른 형태의 조절 요소가 또한 벡터 내에 존재할 수 있다. 예컨대, 인핸서 요소가 구조체의 발현 레벨을 증가시키기 위해서 여기에 사용될 수 있다. 예는 SV40 초기 유전자 인핸서(Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), 루(Rous) 육종 바이러스의 긴-말단 반복(LTR)으로부터 유래된 인핸서/프로모터(Gorman et al. (1982) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 79:6777) 및 CMV 인트론 A 서열 내에 포함된 요소(미국특허 제5,688,688호)와 같은 인간 CMV로부터 유래된 요소(Boshart et al. (1985) Cell 41:521)를 포함한다. 발현 카세트는 적절한 숙주세포 내에서 자발적 복제를 위한 복제원점, 하나 이상의 선택가능 마커, 하나 이상의 제한위치, 고-복제 개수에 대한 잠재성 및 강한 프로모터를 더 포함할 수 있다.
발현벡터는 그 코딩 서열이 통제 서열의 "통제" 하에서 전사될 수 있도록 하는 방식으로 (즉, 코딩 서열을 전사하는 조절 서열 위치에서 DNA 분자와 결합하는 RNA 폴리머라제), 특정 코딩 서열이, 적절한 조절 서열, 위치, 및 존재하는 통제 서열에 대한 코딩 서열의 방향성으로서 벡터 내에 위치되도록 만들어진다. 관심의 분자를 코드화하는 서열의 변형이 본 목적을 달성하기 위해 바람직할 수 있다. 예컨대, 일부 경우에서 적절한 방향성으로 통제 서열이 부착되게 하도록, 즉 판독 프레임을 유지하도록, 서열을 변형하는 것이 필요할 수 있다. 통제 서열 및 기타 조절 서열은 벡터 내로 삽입 전에 코딩 서열에 결찰될 수 있다. 대안으로는, 코딩 서열은 통제 서열 및 적절한 제한위치를 이미 포함하는 발현벡터 내로 직접 클론될 수 있다.
상기에 설명된 바와 같이, 관심의 폴리펩티드의 변이체 또는 유사체를 생산하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 본 조성물 내의 사용을 위한 한타바이러스 폴리펩티드의 변이체 또는 유사체는 관심의 분자를 코드화하는 서열의 부분결실, 서열의 삽입, 및/또는 서열 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환에 의해서 제조될 수 있다. 위치-특정 돌연변이 유발 등과 같은 뉴클레오티드 서열을 변형하는 기법은 당업자에게 주지이다. 예컨대, Sambrook et al., supra; Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl . Acad . Sci . USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechniques 5:786; Zoller and Smith (1983) Methods Enzymol . 100:468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc . Natl . Acad . Sci USA 79:6409을 참조.
재조합 발현을 촉진하기 위해서, 관심의 분자는, 예컨대 50 kDa E. coli 말토오스 결합 단백질과의 융합과 같은, 인간 또는 효모 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 또는 그것의 단편과의 융합, 또는 유비퀴틴 융합 단백질같은 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
분자는, 모두가 본 분야에 주지인, 곤충, 포유동물, 박테리아, 바이러스, 및 효모 발현 시스템을 포함하는 광범위하게 다양한 시스템에서 발현될 수 있다. 예컨대, 바큘로바이러스 시스템과 같은 곤충 세포 발현 시스템은 당업자에게 공지이며, 예컨대, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No . 1555 (1987)에 기술되어 있다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료 및 방법은 키트 형태로, 특히 Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" 키트)사로부터 시중 구입가능하다. 유사하게, 박테리아 및 포유동물 세포 발현 시스템은 본 분야에 주지이고 예컨대, 상기 Sambrook et al.에 기술되어 있다. 효모 발현 시스템이 또한 본 분야에 공지이고, 예컨대, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London에 기술되어 있다.
상기 시스템과의 사용에 적절한 수많은 숙주세포가 또한 공지이다. 예컨대, 포유동물 세포주는 본 분야에 공지이고, 비제한적으로, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 배아 신장 세포, 인간 간세포 암종 세포(예컨대, Hep G2), Madin-Darby 소 신장("MDBK") 세포, 및 기타의 것과 같은 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 구입 가능한 불멸 세포주를 포함한다. 유사하게, E. coli, Bacillus subtilis, 및 Streptococcus 종과 같은 박테리아 숙주가 본 발현 구조체와의 사용에 발견될 것이다. 본 발명에 유용한 효모 숙주는, 특히, Saccharomyces cerevisiae , Candida albicans , Candida maltosa , Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis , Kluyveromyces lactis , Pichia guillerimondii , Pichia pastoris , Schizosaccharomyces pombe 및 Yatrowia lipolytica을 포함한다. 바큘로바이러스 발현 벡터와의 사용을 위한 곤충 세포는, 특히, Aedes aegypti , Autographa californica, Bombyx mori , Drosophila melanogaster , Spodoptera frugiperda , 및 Trichoplusia ni을 포함한다.
관심의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 본 분야에 주지된 다양한 유전자 송달 기법을 사용하여 숙주세포 게놈 내로 안정하게 통합되거나 적절한 숙주세포 내의 안정한 에피좀 요소로 유지된다. 예컨대, 미국특허 제5,399,346호를 참조.
선택된 발현 시스템과 숙주에 따라서, 분자는 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 상기에 기술된 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 성장시키는 것에 의해서 생산된다. 발현된 단백질은 그 후 숙주세포로부터 분리되고 정제된다. 만약 발현 시스템이 성장배지 내로 단백질을 분비하는 경우, 생산물은 배지로부터 직접 정제될 수 있다. 만약 분비되지 않으면, 세포 분해물로부터 분리될 수 있다. 적절한 성장 조건 및 회수 방법의 선택은 본 분야의 기술수준 내에 있다.
한타바이러스 항원을 생물학적 샘플 내의 바이러스에 대한 반응성 항체의 존재를 검출하기 위한 진단으로서 여기에 사용된다. 더 나아가, 항원은 어떠한 한타바이러스 형태가 감염에 책임이 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 항원은 또한 진단에 사용을 위한 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
한타바이러스 항체
한타바이러스 항원은 한타바이러스-특이적 폴리클론 및 모노클론 항체를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 한타바이러스-특이적 폴리클론 및 모노클론 항체는 한타바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 폴리클론 항체는 마우스, 토끼, 염소, 또는 말과 같은 포유동물에 한타바이러스 항원을 투여하여 생산될 수 있다. 면역된 동물로부터의 혈청이 수집되고, 항체는 예컨대 암모늄 술페이트와의 침전에 의해 혈장으로부터 정제되고, 크로마토그래피, 바람직하게는 친화 크로마토그래피가 뒤 따른다. 폴리클론 항혈청을 생산하고 가공하는 기법은 본 분야에 공지이다.
단백질 내에 존재하는 한타바이러스-특이적 에피톱에 대한 모노클론 항체가 또한 즉시 생산될 수 있다. 한타바이러스 항원으로 면역화된, 마우스(예컨대, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256:495-497을 참조), 또는 토끼(예컨대, 그 전체가 참고문헌으로서 여기에 포함된 미국특허 제5,675,063호를 참조)와 같은 포유동물로부터의 정상 B 세포는 하이브리도마를 생산하기 위하여, 예컨대 HAT-민감 마우스 골수종 세포와 융합될 수 있다. 한타바이러스-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마는 RIA 또는 ELISA를 사용하여 확인되고 반고체 아가 내에서 클로닝 또는 제한 희석에 의해 분리된다. 한타바이러스-특이적 항체를 생산하는 클론은 다음 회의 스크리닝에 의해 분리된다.
키메라 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 인간과 비인간 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항체는 인간에게서 면역원성을 감소시키기 위해서 마우스 모노클론 항체 분자로부터 형성될 수 있다 (Winter et al. (1991) Nature 349:293; Lobuglio et al. (1989) Proc . Nat . Acad . Sci . USA 86:4220; Shaw et al. (1987) J Immunol . 138:4534; 및 Brown et al. (1987) Cancer Res . 47:3577; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534; 및 Jones et al. (1986) Nature 321:522; 1992년 12월 23일에 공표된 유럽특허 공개 제519,596호; 및 1994년 9월 21일에 공표된 영국특허 공개 제GB2,276,169호).
부모 모노클론 항체 분자의 면역학 결합 특성을 나타내는 능력이 있는, 항체 분자 단편, 예컨대, F(ab')2, Fv, 및 sFv 분자는 공지 기법을 사용하여 생산될 수 있다. Inbar et al. (1972) Proc . Nat . Acad . Sci . USA 69:2659; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706; Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091; Huston et al. (1988) Proc. Nat . Acad . Sci . USA 85(16):5879; 및 Huston et al.에게 허여된 미국특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호; 및 Ladner et al에게 허여된 제4,946,778호.
대안으로는, 파지-전시 시스템이 시험관내 모노클론 항체 분자 집단을 확장시키기 위하여 사용될 수 있다. Saiki, et al. (1986) Nature 324:163; Scharf et al. (1986) Science 233:1076; 미국특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; Yang et al. (1995) J Mol Biol 254:392; Barbas, III et al. (1995) Methods : Comp . Meth Enzymol 8:94; Barbas, III et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:7978.
일단 생성되면, 파지 전시 라이브러리가 공지 기법을 사용하여 Fab 분자의 면역 결합 친화도를 개선하기 위하여 사용될 수 있다. 예컨대, Figini et al. (1994) J. Mol. Biol . 239:68을 참조. 파지 전시 라이브러리로부터 선택된 Fab 분자의 중쇄 및 경쇄 부분을 위한 코딩 서열은 분리되거나 합성될 수 있고, 발현을 위한 어떠한 적절한 벡터 또는 레플리콘 내로 클론될 수 있다. 상기에 기술된 것들을 포함한, 어떠한 적절한 발현 시스템도 사용될 수 있다.
한타바이러스 에피톱에 대한 항체는, 한타바이러스에 감염된 사람으로부터의 혈청 샘플과 같은, 샘플 내의 한타바이러스 또는 한타바이러스 항원의 존재를 검출하는데 특히 유용하다. 한타바이러스 항원에 대한 면역분석은 하나의 항체 또는 여러 개의 항체를 단독으로 또는 한타바이러스 항원과 조합하여 활용할 수 있다. 한타바이러스 항원에 대한 면역분석은, 예컨대 한타바이러스 에피톱에 대한 모노클론 항체, 하나의 한타바이러스 폴리펩티드의 에피톱들에 대한 모노클론 항체의 조합, 다른 한타바이러스 폴리펩티드의 에피톱들에 대한 모노클론 항체, 동일한 한타바이러스 항원에 대한 폴리클론 항체, 다른 한타바이러스 항원에 대한 폴리클론 항체, 또는 모노클론 및 폴리클론 항체의 조합을 사용할 수 있다. 면역분석 프로토콜은, 예컨대 표지된 항체를 사용하여, 예컨대 경쟁, 직접 반응, 또는 샌드위치형 분석에 기초할 수 있는데, 하기에 더 기술된다. 표지는, 예컨대, 형광, 화학발광, 또는 방사성일 수 있다.
한타바이러스 항체는 더 나아가 면역친화 컬럼에 의하여 한타바이러스 입자 또는 항원을 분리하는데 사용될 수 있다. 항체는, 예컨대, 흡착 또는 항체가 그것의 면역선택적 활성을 보유하도록 하는 공유결합에 의해서 고체지지물에 부착될 수 있다. 선택적으로, 스페이서기가 항체의 항원 결합 부위가 접근가능하게 유지되도록 포함될 수 있다. 고정화 항체가 그 후 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플로부터의 한타바이러스 입자 또는 항원과 결합하도록 사용될 수 있다. 결합된 한타바이러스 입자 또는 항원은 예컨대 pH의 변화에 의하여 컬럼 매트릭스로부터 회수된다.
한타바이러스 진단 분석
상기 설명된 바와 같이, 면역원성 한타바이러스 항원 및 그 항원에 대한 항체는 한타바이러스 감염을 확인하는 분석에 사용될 수 있다. 비록 적절한 경우 바이러스 단백질의 존재가 샘플 내의 한타바이러스의 지시자로서 검출되고 사용될 수 있기는 하지만, 전형적으로, 생물학적 샘플 내의 한타바이러스의 존재는 샘플 내의 한타바이러스에 대한 항체의 존재로 결정될 것이다. 시약이 전혈, 혈청 및 혈장을 비제한적으로 포함하는 혈액 샘플 내의 한타바이러스를 검출하는데 사용될 수 있다. 항원 및 항체는 공여된 혈액 샘플 내의 한타바이러스 오염을 검출하는 것은 물론이고 인간 또는 설치류 피검자와 같은 피검자 내의 한타바이러스 감염을 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 각 공여된 샘플 또는 집체화된 샘플로부터의 알리쿼트는 한타바이러스의 존재에 대해 스크리닝될 수 있고, 한타바이러스로 오염된 이들 샘플 또는 집체화된 샘플은 그들이 합쳐지기 전에 제거될 수 있다. 이러한 방식으로, 실질적으로 한타바이러스 오염이 없는 혈액 공급이 제공될 수 있다. "실질적으로 한타바이러스가 없는"은 한타바이러스의 존재가 여기에 기술된 분석, 바람직하게는 하기에 더욱 자세히 기술되는 스트립 면역블롯 분석을 사용하여 검출되지 않는다는 것을 의미한다.
여기에 사용을 위한 분석은 웨스턴 블롯; 응집검사; ELISA와 같은 효소-표지 및 중재 면역분석; 비오틴/아비딘 형 분석; 방사성면역분석; 면역전기영동; 면역침전; 스트립 면역블롯 분석 등과 같은 것을 포함한다. 반응은 통상 형광, 화학발광, 방사성, 효소표지 또는 염료 분자와 같은 표지를 찾아내는 것, 또는 항원과 항체간의 복합체의 형성 또는 그것과 반응한 항체를 검출하기 위한 기타 방법을 포함한다.
상기 언급된 분석은 통상 항원-항체 복합체가 결합된 고체상 지지물로부터 액체상 내의 미결합된 항체 또는 항원을 분리하는 것을 포함한다. 본 발명의 수행에 있어 사용될 수 있는 고체 지지물은 (예컨대, 막 또는 마이크로타이터 웰 형태 내의) 니트로셀룰로오스; 폴리비닐클로라이드 (예컨대, 쉬트 또는 마이크로타이터 웰); 폴리스티렌 라텍스(예컨대, 비드 또는 마이크로타이터 플레이트); 폴리비닐리딘 플루오라이드; 디아조화된 종이; 나일론 막; 활성화 비드, 자성 반응성 비드 등과 같은 기재를 포함한다.
본 발명의 한 관점에서, 적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원은 샘플 내의 항-한타바이러스 항체의 포획 또는 검출 또는 양자 모두를 위하여 사용된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 한타바이러스 항원에 대한 항체는 샘플 내의 한타바이러스 항원의 포획 또는 검출 또는 양자 모두를 위하여 사용된다. 분석물(즉, 샘플 내의 항-한타바이러스 항체 또는 한타바이러스 항원)의 "포획"은 분석물이 포획 분자의 결합에 의하여 샘플의 다른 구성요소로부터 분리될 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 포획 분자는, 직접적으로 또는 간접적으로, 고체 지지물과 연합된다. 전형적으로, 검출 분자는, 직접적으로 또는 간접적으로, 검출가능 표지와 연합된다.
전형적으로, 고체 지지물은 구성요소가 지지물에 실질적으로 고정화되도록 하는 적절한 결합 조건하에서 고체상 구성요소(예컨대, 적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원 및/또는 항-한타바이러스 항체)와 우선 반응된다. 때때로, 지지물로의 고정화는 더 나은 결합 특성을 지닌 단백질로의 제1 커플링에 의해서 증진될 수 있다. 적절한 커플링 단백질은 소혈청 알부민(BSA)를 포함하는 혈청 알부민과 같은 고분자, 키홀 림펫 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오발부민, 및 당업자에게 주지인 기타 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 지지물에 항원 또는 항체를 결합하는데 사용될 수 있는 기타 분자는 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체적 아미노산, 아미노산 공중합체 등을 포함한다. 그러한 분자 및 이들 분자를 커플링하는 방법은 당업자에게 주지이다. 예컨대, Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem . (1992) 3:2-13; Hashida et al., J. Appl . Biochem . (1984) 6:56-63; 및 Anjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res . (1987) 30:117-124을 참조.
고체상 구성요소와 고체 지지물을 반응시킨 후, 모든 비고정화 고체상 구성요소는 세척에 의해 지지물로부터 제거되고, 지지물-결합된 구성요소는 그 후 적절한 결합 조건하에서 리간드 구성요소(즉, 한타바이러스 항원 또는 항체)를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플과 접촉된다. 비결합된 리간드를 제거하기 위한 세척 후, 2차 결합제 부분이 적절한 결합 조건하에서 첨가될 수 있고, 여기서 2차 결합제는 결합된 리간드와 선택적으로 연합될 수 있는 능력이 있다. 2차 결합제의 존재는 본 분야의 주지된 기법을 사용하여 검출될 수 있다.
더욱 특정적으로, ELISA 방법이 사용될 수 있고, 여기서 마이크로타이터 플레이트의 웰은 적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원 및/또는 본 발명에 따른 항체로 코팅된다. 항-한타바이러스 면역글로불린 분자 또는 한타바이러스 항원을 포함하는 또는 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은 그 후 코팅된 웰에 첨가된다. 항원-항체 결합을 허용하기에 충분한 배양기간 후, 플레이트(들)은 미결합된 부분을 제거하기 위해 세척될 수 있고 검출가능하게 표지된 2차 결합 분자가 첨가될 수 있다. 2차 결합 분자는 어떠한 포획된 샘플과도 반응되도록 허용되고, 플레이트는 세척되며, 본 분야의 주지된 방법을 사용하여 2차 결합 분자의 존재가 검출된다.
한 특정 형태에서, ELISA 항원 샌드위치 형식이 사용된다. 이 경우, 고체 지지물은 적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원으로 코팅된다. 샘플은 항-한타바이러스 항체가, 만약 존재한다면, 하나 이상의 한타바이러스 항원과 결합하여 항원/항체 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서 그 후 지지물과 접촉된다. 미결합된 시약은 제거되고, 표지된 한타바이러스 N 및/또는 G1 항원과 같은 결합된 항원/항체 복합체와 반응하는 효소적으로 표지된 항원이 첨가된다. 효소 기질이 신호를 발생하기 위하여 사용된다.
또 다른 형식에서, 고체 지지물은 종-특이적 항-동위 항체 (예컨대, 항-인간 IgM 항체, 항-인간 IgG 항체, 항-인간 IgA 항체 등)으로 코팅된다. 지지물은 그 후 샘플 내에 존재하는 항체가 항-동위 항체에 결합하도록 허용하는 조건하에서 샘플과 접촉된다. 미결합된 항체는 제거될 수 있고 결합된 항-한타바이러스 항체의 존재는 본 발명의 표지된 한타바이러스 항원을 사용하여 검출된다. 표지는 전형적으로 효소 표지, 예컨대, HRP, AP 이다.
또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플로부터의 결합된 한타바이러스 리간드의 존재는 항체 리간드에 대한 항체를 포함하는 2차 결합제를 사용하여 즉시 검출될 수 잇다. 여러 개의 항-인간 면역글로불린(Ig) 분자는 본 분야에 공지이며, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 또는 우레아제와 같은 검출가능한 효소 표지에 즉시 컨쥬게이트화 될 수 있다. 적절한 효소 기질은 검출가능한 신호를 발생하기 위하여 그 후 사용된다. 다른 관련된 구체예에서, 경쟁형 ELISA 기법이 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
샘플 내의 항-한타바이러스 항체의 검출을 위한 다른 형식은 공지이고, 본 발병의 한타바이러스 항원의 조합은 한타바이러스 항원을 사용하는 어떠한 공지된 형식의 것과 함께 사용될 수 있다. 예컨대, Lee et al., J. Infect . Dis . (1978) 137:298-308; Lee et al., J. Infect . Dis . (1982) 146:638-644; Lee et al., J. Infect. Dis . (1982) 146:645-651; Lundkvist et al., Clin . Diagnos . Lab . Immunol. (1995) 2:82-86; Chu et al., Virology (1994) 198:196-204; Elgh et al., J. Med . Virol (1995) 45:146-150; Hjelle et al., J Clin . Microbiol . (1997) 35:600-608; Bharadwaj et al., J. Infect . Dis . (2000) 182:43-48; Yee, et al., J. Wildl Dis . (2003) 39:271-277)을 참조.
적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원은 다음과 같은 IgM 포획 ELISA에 사용될 수 있다. 항-인간 IgM 항체(예컨대, 염소 항-인간 IgM 항체)는 고체 지지물에 부착되고, 지지물은 항-한타바이러스 IgM이, 만약 존재한다면, 고체 지지물에 부착된 하나 이상의 항-인간 IgM 항체에 결합하여 항체/항체 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서, 한타바이러스에 대한 인간 IgM의 존재를 검사하기 위한 샘플과 접촉된다. 적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원은 항체/항체 복합체 내의 항-한타바이러스 IgM에 결합하여 항체/항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서 첨가된다. 미결합된 항원은 제거되고 검출가능하게 표지된 항-한타바이러스 항체는 결합된 항원에 결합하도록 허용하는 조건하에서 첨가된다. 샘플 내의 한타바이러스에 대한 IgM의 존재는 고체 지지물에 부착된 결합된 항-인간 IgM 항체/인간 항-한타바이러스 IgM/항원 복합체에 대한 검출가능하게 표지된 항-한타바이러스 항체의 존재에 의하여 결정된다. 대안으로는, 한타바이러스 항원 그 자체는 검출가능하게 표지될 수 있고, 이는 검출가능하게 표지된 항-한타바이러스 항체의 필요성을 제거한다.
적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원은 또한 다음과 같이 간접 IgG ELISA에 사용될 수 있다. 항원에 특이적인 항체가 고체 지지물에 부착되고, 지지물에 부착된 항-한타바이러스 항체에 결합하도록 하여 항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서, 지지물은 적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원에 접촉된다. 미결합된 항원은 제거되고 지지물은 인간 항-한타바이러스 IgG가, 만약 존재한다면, 항체/항원 복합체 내의 항원에 결합하도록 허용하는 조건하에서, 한타바이러스에 대한 인간 IgG의 존재를 검사하기 위한 샘플과 접촉된다. 결합된 항-한타바이러스 IgG의 존재는 검출가능하게 표지된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
전기 분석 형식 중 일부는 "ELISA"(효소 연결된 면역흡수 분석)로 용어화 하였지만, "효소 연결된" 결합 부분 이외의 검출가능 표지의 사용이 가능하며 많은 경우에 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 다른 적절한 검출가능 표지가 여기에 기술되는데 본 분야에 주지이다.
분석은 또한, 한타바이러스 항원 또는 항체 및 이들 분자에 특이적인 리간드가 침전 조건하에서 복합체를 형성하도록 하는 방식으로, 용액에서 수행될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 분자는, 직접적인 화학 커플링 또는 간접 커플링에 의한 것과 같은, 본 분야에 공지된 커플링 기법을 사용하여 고체상 입자(예컨대, 아가로스 비드 등)에 부착될 수 있다. 코팅된 입자는 그 후 적절한 결합 조건하에서 한타바이러스 항체 또는 항원을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플과 접촉된다. 결합된 항체간의 가교-연결은 세척 및/또는 원심분리를 사용하여 샘플로부터 침전 및 분리될 수 있는 복합체 응집체의 형성을 유발한다. 반응 혼합물은, 상기에 기술된 면역진단 방법들과 같은, 수 많은 표준 방법을 사용하여 복합체의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 분석될 수 있다.
또한 더 나아간 구체예에서, 면역친화도 매트릭스가 제공될 수 있는데, 여기서, 예컨대, 한타바이러스 항체를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플로부터의 항체의 폴리클론 집단이 기판에 고정화 된다. 샘플의 초기 친화도 정제는 고정화 항원을 사용하여 수행될 수 있다. 결과된 샘플 제제는 항-한타바이러스 부분을 포함할 것이고, 친화도 지지물에서의 잠재적 비특이적 결합 성질을 회피한다. 고수율로 면역글로불린(온전한 단편 또는 특이적 단편)을 고정화하고 항원 결합 친화도를 양호하게 유지하는 수 많은 방법은 본 분야에 공지이다. 일단 면역글로불린 분자가 면역친화도 매트릭스를 제공하기 위해 고정화되면, 표지된 분자는 적절한 결합 조건하에서 결합된 항체와 접촉된다. 비특이적으로 결합된 한타바이러스 항원이 면역친화도 지지물로부터 세척된 후, 결합된 항원의 존재는 본 분야의 공지된 방법을 사용하여 표지에 대해 분석하여 결정될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 스트립 면역블롯 분석(SIA)는, 검사 스트립에 고정화된, 적어도 여섯 개의 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV으로부터의 한타바이러스 G1 및/또는 N 항원을 사용하여, 생물학적 샘플 내의 한타바이러스 항체를 검출하기 위하여 사용된다. SIA 기법은 본 분야에 주지이고 종래의 웨스턴 블롯팅 및 점 블롯팅 기법을 조합한다, 예컨대, RIBA®(Chiron Corp., Emeryville, CA) SIA. 이들 분석에서, 한타바이러스 항원은 막성 지지물상의, 예컨대, 밴드 또는 점으로서, 개별적, 분리된 부분에 고정화된다. 따라서, 막 지지물 상에 "분리하여 고정화된"은, 존재하는 각 항원과의 반응성 또는 반응성의 부존재가 평가될 수도 있도록 하는 방식으로, 항원이 개별 구성요소로서 존재하여 혼합되지 않는다는 것을 의미한다. 한타바이러스에 대한 항체를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은 그 후 검사 막과 반응된다. 생물학적 샘플 내의 항-한타바이러스 반응성의 시각화는 발색 효소 기질과 조합된 항-인간 면역글로불린 효소-컨쥬게이트를 사용하여 달성된다. 항-인간 IgM 항체 및 항-인간 IgG 항체와 같은 내부 대조가 또한 검사 막 상에 존재할 수 있다. 분석은 수동적으로 또는 자동화 형식에서 사용될 수 있다.
스트립 면역블롯 분석의 수행에 사용될 수 있는 고체 지지물은 셀룰로오스, 폴리아미드(나일론), 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 및 상기의 조합 또는 유도체로 구성되는 복합수지를 포함하는 수많은 1차 중합체로부터 유래된 막 지지물을 포함하나, 이제 제한되지는 않는다. 특히 바람직한 것은 나일론 막은 물론이고 니트로셀룰로오스 막과 같은 셀룰로오스로부터 유래된 지지물이다. 기판은 통상 지지물로서 불활성 플라스틱 지지체가 있는 바람직한 막을 포함한다.
막에 도포되는 항원의 양은 문제의 항원에 따라서 가변적이다. 통상, 항원은 약 20 내지 500ng/스트립, 바람직하게는 50 내지 250ng/스트립, 더 바람직하게는 75 내지 150ng/스트립의 양으로 스트립에 도포된다. 당업자는 실용적인 결과를 얻기위해 필요한 양의 항원을 즉시 결정할 수 있다. 대안으로는, 낮은 농도 및 높은 농도와 같은, 두 농도의 항원이 존재할 수 있다. 따라서, 예컨대, SNV N 항원은 예컨대, 약 50 내지 150ng와 같이 25 내지 200ng의 농도, 예컨대, 100ng/스트립으로 하나 이상의 추가 밴드는 물론이고, 상기에 특정한 농도로 제공될 수 있다. 높은 농도 대조는 200 내지 500ng, 특히 250 내지 350ng와 같이 고도의 양성 결과를 나타내기에 충분히 높은 양, 예컨대, 300ng/스트립으로 존재할 것이다. 검사 스트립에 도포될 항원의 농도는 사용되는 특정 항원에 따라 가변적일 것이며 당업자에 의해 즉시 결정될 수 있다.
항-인간 IgM 항체, 항-인간 IgG 항체 및/또는 항-인간 IgA 항체와 같은 항면역글로불린 항체는 단일 농도로, 또는 하나는 낮고 하나는 높은 두 가지 농도로 존재할 수 있다. 예컨대, 항-IgG 항체는 약 50 내지 250ng/ml, 더 바람직하게는 약 75 내지 200ng/ml, 그리고 가장 바람직하게는 약 100 내지 185ng/ml의 농도로 존재할 수 있다. 높은 농도의 항-IgG 항체는 또한, 약 400 내지 1200ng/ml, 더 바람직하게는 약 450 내지 1000ng/ml, 그리고 가장 바람직하게는 약 500 내지 950ng/ml의 농도와 같이 또 다른 내부 대조를 제공하기 위하여, 낮은 농도의 항-IgG와 함께 존재할 수 있다.
바람직한 항원 및 Ig 분자와 막 지지물의 반응 후, 비고정화 고체상 구성요소는 세척에 의하여 막으로부터 제거되고, 막-결합된 구성요소는 절적한 결합 조건하에서, 한타바이러스에 대한 항체를 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플과 접촉된다. 모든 비결합된 항체를 제거하기 위한 세척 후, 2차 결합제 부분이 적절한 결합 조건하에서 첨가되며, 2차 결합제는 결합된 항체와 선택적으로 연합할 수 있는 능력이 있다. 2차 결합제의 존재는 그 후 본 분야에 주지인 기법을 사용하여 검출될 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 생물학적 샘플로부터의 결합된 항-한타바이러스 항원 리간드의 존재는 항체 리간드에 대한 항체를 포함하는 2차 결합제를 사용하여 즉시 검출될 수 있다. 수 많은 항-인간 면역글로불린(Ig) 분자는 시중 구입가능한 염소 항-인간 Ig 또는 토끼 항-인간 Ig와 같이 본 분야에 공지이다. 여기에서 사용을 위한 Ig 분자는 IgG, IgA 또는 IgM 형태의 것이 될 것이다. Ig 분자는 특히, 당업자에게 알려진 방법을 사용하여, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 포도당 옥시다제, β-갈락토시다제, 알칼리 포스파타제 및 우레아제와 같은 검출가능 효소 표지에 즉시 컨쥬게이트될 수 있다. 적절한 효소 기질이 검출가능 신호를 발생하기 위해서 그 후 사용된다.
더 나아가, 인간 중쇄 및 경쇄 항체에 대한 컨쥬게이트가 ISA를 IgG 및 IgM 반응을 모두 검출할 수 있도록 만들기 위해서 사용될 수 있다. 이 설계는 감염의 초기단계에서 항체 반응의 검출에 대한 민감성을 증가하기 위한 것으로 작용할 수 있다.
다른 검출 시약은 물론이고 한타바이러스 항원 및/또는 그것에 대한 항체를 포함하는 상기 기술된 분석 시약, 결합된 시약과의 고체 지지물이 상기에 기술된 분석을 수행하기 위하여 적절한 지시사항 및 기타 필요한 시약과 함께, 키트에 제공될 수 있다. 키트는 대조 제형(양성 및/또는 음성), 분석 형식이 동일한 것을 요구할 경우의 표지된 시약, 표지가 신호를 직접적으로 발생하지 않을 때의 신호 발생 시약(예컨대, 효소 기질)을 포함할 수 있다. 분석을 수행하기 위한 지시사항(예컨대, 서면, 테잎, VCR, CD-ROM, 등)은 통상 키트에 포함될 것이다. 키트는 또한, 사용된 특정 분석에 따라서, 다른 포장된 시약 및 재료(즉 세척 완충액 등)를 포함한다. 상기에 기술된 것들과 같은 표준 분석이 이들 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
도 1A 및 1B(SEQ ID NOS:1 및 2)는 G1 및 G2 외피 단백질(도 1A) 그리고 G1 단백질(도 1B)에 대한 대응 아미노산 서열을 코드화하는 HTNV 분리물 76-118의 전장 M 세그먼트에 대한 대표적 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 2A 및 2B(SEQ ID NOS:3 및 4)는 G1 및 G2 외피 단백질(도 2A) 그리고 G1 단백질(도 2B)에 대한 대응 아미노산 서열을 코드화하는 PUUV 분리물 CG1820의 전장 M 세그먼트에 대한 대표적 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 3A 및 3B(SEQ ID NOS:5 및 6)는 G1 및 G2 외피 단백질(도 3A) 그리고 G1 단백질(도 3B)에 대한 대응 아미노산 서열을 코드화하는 SEOV 분리물 80-39의 전장 M 세그먼트에 대한 대표적 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 4A 및 4B(SEQ ID NOS:7 및 8)는 G1 및 G2 외피 단백질(도 4A) 그리고 G1 단백질(도 4B)에 대한 대응 아미노산 서열을 코드화하는 DOBV의 전장 M 세그먼트에 대한 대표적 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 5A 및 5B(SEQ ID NOS:9 및 10)는 G1 및 G2 외피 단백질(도 5A) 그리고 G1 단백질(도 5B)에 대한 대응 아미노산 서열을 코드화하는 SNV 분리물 NM H10의 전장 M 세그먼트에 대한 대표적 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 6A 및 6B(SEQ ID NOS:11 및 12)는 G1 및 G2 외피 단백질(도 6A) 그리고 G1 단백질(도 6B)에 대한 대응 아미노산 서열을 코드화하는 ANDV 분리물 칠레-9717869의 전장 M 세그먼트에 대한 대표적 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 7A 및 7B(SEQ ID NOS:13 및 14)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 HTNV G1 펩티드의 뉴클레오티드 서열(도 7A) 및 대응 아미노산 서열(도 7B)을 나타낸다.
도 8A 및 8B(SEQ ID NOS:15 및 16)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 PUUV G1 펩티드의 뉴클레오티드 서열(도 8A) 및 대응 아미노산 서열(도 8B)을 나타낸다.
도 9A 및 9B(SEQ ID NOS:17 및 18)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 SEOV G1 펩티드의 뉴클레오티드 서열(도 9A) 및 대응 아미노산 서열(도 9B)을 나타낸다.
도 10A 및 10B(SEQ ID NOS:19 및 20)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 DOBV G1 펩티드의 뉴클레오티드 서열(도 10A) 및 대응 아미노산 서열(도 10B)을 나타낸다.
도 11A 및 11B(SEQ ID NOS:21 및 22)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 SNV G1 펩티드의 뉴클레오티드 서열(도 11A) 및 대응 아미노산 서열(도 11B)을 나타낸 다.
도 12A 및 12B(SEQ ID NOS:23 및 24)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 ANDV G1 펩티드의 뉴클레오티드 서열(도 12A) 및 대응 아미노산 서열(도 12B)을 나타낸다.
도 13A 및 13B(SEQ ID NOS:25 및 26)는 본 분석에 사용을 위한 분리물 76-118으로부터의 전장 HTNV N의 대표적 뉴클레오티드 서열(도 13A) 및 대응 아미노산 서열(도 13B)을 나타낸다.
도 14A 및 14B(SEQ ID NOS:27 및 28)는 본 분석에 사용을 위한 분리물 CG1820으로부터의 전장 PUUV N의 대표적 뉴클레오티드 서열(도 14A) 및 대응 아미노산 서열(도 14B)을 나타낸다.
도 15A 및 15B(SEQ ID NOS:29 및 30)는 본 분석에 사용을 위한 분리물 80-39으로부터의 전장 SEOV N의 대표적 뉴클레오티드 서열(도 15A) 및 대응 아미노산 서열(도 15B)을 나타낸다.
도 16A 및 16B(SEQ ID NOS:31 및 32)는 본 분석에 사용을 위한 전장 DOBV N의 대표적 뉴클레오티드 서열(도 16A) 및 대응 아미노산 서열(도 16B)을 나타낸다.
도 17A 및 17B(SEQ ID NOS:33 및 34)는 본 분석에 사용을 위한 분리물 NM H10으로부터의 전장 SNV N의 대표적 뉴클레오티드 서열(도 17A) 및 대응 아미노산 서열(도 17B)을 나타낸다.
도 18A 및 18B(SEQ ID NOS:35 및 36)는 본 분석에 사용을 위한 분리물 칠레-9717869로부터의 전장 ANDV N의 대표적 뉴클레오티드 서열(도 18A) 및 대응 아미노 산 서열(도 18B)을 나타낸다.
도 19A 및 19B(SEQ ID NOS:37 및 38)는 실시예에서 기술된, G1 및 N 항원과 SOD 융합에 사용되는, 대표적 인간 SOD 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 나타낸다. 융합된 SOD 서열은 클로닝을 위한 제한 위치를 제공하기 위해 C-말단(TRQNK, SEQ ID NO:41) 상의 비-SOD 서열의 다섯 가지 아미노산을 포함하는 도 19B(도 19A의 뉴클레오티드 1 내지 489)의 아미노산 1 내지 158을 포함한다.
도 20(SEQ ID NO:42)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/HTNV G1 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 21(SEQ ID NO:43)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/PUUV G1 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 22(SEQ ID NO:44)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/SEOV G1 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 23(SEQ ID NO:45)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/DOBV G1 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 24(SEQ ID NO:46)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/SNV G1 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 25(SEQ ID NO:47)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/ANDV G1 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 26(SEQ ID NO:48)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/HTNV N 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 27(SEQ ID NO:49)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/PUUV N 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 28(SEQ ID NO:50)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/SEOV N 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 29(SEQ ID NO:51)는 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/DOBV N 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 30(SEQ ID NO:52)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/SNV N 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 31(SEQ ID NO:53)은 본 분석에 사용을 위한 대표적 SOD/ANDV N 융합의 아미노산 서열을 나타낸다.
III. 실험
하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 구체예의 예이다. 실시예는 예시적 목적만을 위하여 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
사용된 숫자(예컨대, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보증하기 위한 노력을 하였으나, 일부 실험적 실수 및 이탈은, 물론, 허용되어야 한다.
실시예 1
한타바이러스 재조합 G1 단백질의 클로닝과 발현
표 2에 나타낸 한타바이러스 G1 항원을 다음과 같이 제조하였다. HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 G1 단백질의 80 내지 83 아미노산을 포함하는 재조합 G1 항원을 코드화하는 뉴클레오티드 단편을 각 세포주에 대한 관심의 영역에 대응하는 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용하여 합성하였다. 재조합 항원의 G1 단백질 서열의 부분을 표 2에 나타냈다. 이들 단편을 어닐링하여, 결찰하고, 서브클로닝 벡터 내로 클론하였으며, 정확한 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열결정에 의하여 확인하였다. 관심의 영역을 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 절단하고, ADH2/ GAPDH 프로모터 단편과 함께 pBS24.1 내로 클론하였다. 플라스미드 pBS24.1는 수없이 다양한 재조합 단백질을 발현하는데 광범위하게 사용되어 온 고-복제 개수 발현벡터이다 (Pichuantes et al., J. Biol . Chem . (1990) 23:13890-13898; Pichuantes et al., "Expression of heterologous gene products in yeast." In: Cleland JL, Craik C, editors. Protein engineering: a guide to design and production (1996) New York, NY, Wiley-Liss, Inc., pp 129-161). 이것은 2μ 및 자동적 복제를 위한 역반복(IR) 서열, 전사 종결을 보증하는 α-인자 터미네이터, 및 선별을 위한 leu2-d 및 URA3을 포함한다. 암피실린 저항성을 위한 β-락타마제 유전자 및 ColE1 복제원점이 또한 Escherichia coli 내의 자동적 복제를 위한 이 벡터 내에 존재할 수 있다.
SOD 융합 구조체를 위해서, 관심의 영역을 인간 SOD 유전자와 함께 ADH2/GAPDH 프로모터를 이미 포함하고 있는 유전학적으로 조작된 pBS24.1 벡터 내로 클론하였다. 한타바이러스 재조합 항원의 클로닝에 사용된 인간 SOD의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 Hallewell et al., Bio / Technology (1987) 5:363- 366에 기술되어 있다. 결과된 플라스미드를 S. cerevisiae 세포주 AD3 내로 형질전환하였고 재조합 단백질의 발현을 SDS-PAGE 및 면역블롯 분석에 의해 감시하였다. 생산된 다양한 SOD/G1 융합은 도 19에 나타낸 SOD 서열의 C-말단에 융합된 도 7 내지 12에 나타낸 G1 서열을 포함한다. SOD/G1 융합은 SEQ ID NOS:42 내지 47으로 나타냈다.
하기 프로토콜을 SOD 융합을 생산하기 위해 사용하였다. 본 논의가 SNV G1/SOD 융합의 생산을 상술하지만, 나머지 융합도 동일한 방식으로 생산되었다. 전장 G1의 긴 부분의 발현은 불안정성 및 가변적 발현에 의해서 위협받았기 때문에, SNV G1의 작은(82 아미노산) 부분(분리물 NM H10의 개시 메티오닌에 비교하여 잔기 35 내지 117)을 도 19에 나타낸 인간 퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 서열과의 융합에 사용하였다. 작은 G1 단편은 5'-단부 상의 NcoI 위치 및 SalI 위치, 및 3'-단부 상의 두 개의 정지 코돈을 도입하는 프라이머를 사용하여 pFCV-M-1275(Yamada et al., J. Virol (1995) 69:1939-1943)로부터 PCR에 의해서 합성하였다. 268 염기쌍 NcoI/SalI-분해된 단편을 pSOD/HIV2PR113(Pichuantes et al., J. Biol . Chem . (1990) 265:13890-13898)의 347 염기쌍 삽입을 교체하는데 사용하여, 구조체 pSOD/G1을 형성하였다. pSOD/G1의 603 염기쌍 Stul/Sall 단편이 ADH2/GAPDH 프로모터를 제공하기 위해서 pSIl/PR179 벡터 내로 결찰되었다 (Pichuantes et al., Proteins Struct . Funct . Genet . (1989) 6:324-327). 그리고나서, 결과된 구조체의 2093 염기쌍 BamHI/SalI 카세트를 최종 발현 구조체 pSOD/SNV-G1를 생성하기 위해 효모 발현벡터 pBS24.1 내로 도입하였다. 단백질은 프로테아제-결핍(prbl 1122, pep 4-3) Saccharomyces cerevisiae 세포주 AB122(Pichuantes et al., Protein Engineering Principles and Practice (1996) Chapter 5, pp. 129-161, Cleland and Craik, eds. Wiley-Liss, Inc., New York) 내에서 23kD SOD-G1 융합으로 발현되었다. 이 구조체 내에 발현된 G1의 82-아미노산 부분은 면역우성 에피톱에 놓이고 일부 추가 측면서열을 포함한다. 항원의 SNV G1 부분의 서열은 도 11B에 나타냈다.
Figure 112007003316004-PCT00003
실시예 2
한타바이러스 재조합 N 단백질의 클로닝 및 발현
표 3에 나타낸 한타바이러스 N 항원은 다음과 같이 제조하였다. PUUV, SEOV, SNV 및 ANDV의 한타바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 유전자는 한타바이러스 재조합 플라스미드 유래의 DNA를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭하였다. 재조합 단백질 내의 한타바이러스 N 단백질 서열의 부분을 표 3에 나타냈다. HTNV 및 DOBV의 뉴클레오캡시드 유전자는 화학적으로 합성하였다. 클로닝과 발현은 본질적으로 상기에 기술된 바와 같이 수행하였다. 생산된 다양한 N 항원은 도 13 내지 18에 나타냈고, N 항원/SOD 융합의 N-말단에 직접 연속적으로 존재하는 SOD 서열은 도 19에 나타냈다.
Figure 112007003316004-PCT00004
실시예 3
한타바이러스 재조합 단백질의 정제
한타바이러스 단백질, 상기에 기술된 바와 같이 생산된 재조합물은 Dino-Mill 장치를 사용하여 분해 완충액(50 mM Tris, 0.15M NaCl, 1mM EDTA, pH 8) 내의 형질전환된 S. cerevisiae 세포를 분해하는 것에 의하여 정제하였다. 분해물을 분해 완충액 내의 1 내지 3M 요소로 여러번 세척하고, 단백질을 pH를 11.5로 상승하여 용해화하고, 그리고나서 겔여과 크로마토그래피를 수행하였다. 제조합 ANDV G 및 DOBV G 단백질의 정제는 또한 황산암모늄 침전 및 PBS, 0.1% SDS, 1mM EDTA와의 용해화를 포함하였다.
실시예 4
한타바이러스 재조합 단백질을 사용한 폴리클론 항체 생산
HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 G1 항원과 융합된 정제된 재조합 SOD 및 SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 재조합 비융합 N 단백질(상기 표 2 및 3 참조)을 토끼 폴리클론 항체를 생산하기 위해 사용하였다. 두 마리의 토끼를 면역화하여 50ml의 항혈청을 생산하였다. 그리고나서 폴리클론 항체는 4 내지 20% Tris 글리신 겔상의 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 재조합 단백질에 대하여 검사하였다. 각각의 여섯 G1 항원에 대하여 생산된 항체는 다른 하위형태의 G1 항원과 교차-반응성인 것으로 나타났다. 유사하게, 각각의 네 N 항원에 대해 생산된 항체는 다른 하위형태의 N 항원과 교차-반응성인 것으로 나타났다.
실시예 5
스트립 면역블롯 분석( SIA )
상기에 기술된 바와 같은, 여섯 항원형으로부터의, SOD 서열이 있거나 없는, 재조합 G1 항원 및 N 항원이 RIBA® 검사(Chiron Corp., Emeryville, CA)와 같은 SIA에 사용된다. 막은 지지물로서 불활성 플라스틱 지지체를 지닌 니트로셀룰로오스로 구성된다. HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV 각각으로부터 하나인 여섯 개의 G1 항원, 및 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV 각각으로부터 하나인 여섯 개의 N 항원을 75 내지 150ng/스트립의 농도로 니트로셀룰로오스 스트립과 분리된 밴드에 가한다. 내부 대조로서, 추가 밴드는 낮은 레벨, Level I (50 내지 150ng/스트립) 및 높은 레벨, Level II (250 내지 350ng/스트립)에서 정제된 인간 IgG를 포함한다.
분석 과정은 제조사의 지시사항에 따라서 수행한다. 모든 단계는 실온에서 수행한다. 각 스트립은 번호부여되고, 그리고나서 샘플 희석 완충액(소 단백질 안정화제 및 세제가 있는 인산염-완충된 염수(PBS), 보존제로서 0.1% 나트륨 아지드 및 0.05% 겐타마이신 술페이트)내의 1:50 인간 혈청의 희석이 첨가되는 개별 튜브에 위치된다. 튜브는 4 내지 4.5 시간 동안 부드럽게 흔들고, 용액은 흡인에 의해 제거하여, 1ml의 신선한 희석제를 각 튜브에 첨가한다. 튜브를 30분간 흔들고, 용액을 흡인에 의해 제거하여, 세척 완충 농축액(50X)(보존제로서 0.01% 티메로살이 있는 인산염-완충된 세제용액)으로부터 만들어진 1ml의 세척 완충액을 각 튜브에 첨가한다. 각 튜브의 내용물을 단일 세척 용기 내로 붓고, 스트립은 20초간 회전시켜서 세척한다. 세척 완충액을 따르고, 30ml의 신선한 완충액을 첨가하여, 과정을 반복한다. 잔류 용액을 흡인에 의해 제거하고, 20ml의 컨쥬게이트 용액(보존제로서 0.01% 티메로살을 포함하는, 소 단백질 안정제가 있는, 퍼옥시다제-표지된 염소 항-혈청 IgG(중쇄 및 경쇄))을 첨가한다. 용기를 9 내지 11분간 110rpm에서 회전하고, 컨쥬게이트 용액을 따르고, 세척 단계를 세 번 반복한다. 잔류 용액을 흡인에 의해서 다시 제거하고, 20ml의 기질/현상액(메탄올/인산염-완충된 과산화수소 내의 4-클로로-1-나프톨)을 첨가한 후, 이를 15 내지 20분간 110rpm에서 회전한다. 용액을 따르고, 스트립을 멸균수에서 두 번 세척한다. 현상된 스트립을 흡수지로 향하도록 위치시키고 30분간 암실에서 건조하도록 허용한다.
반응성이, 1+ 반응성을 나타내는 것으로 정의되는, 레벨 I IgG 대조 밴드와 동일 또는 그 이상인 경우에만 혈청은 주어진 항원에 대해 반응성인 것으로 간주된다. 레벨 II IgG 대조 밴드와 동등한 반응성은 3+의 반응성을 나타내는 것으로 간주된다. 레벨 I 및 레벨 II IgG 대조 밴드 사이의 중간 강도 반응성은 2+로 간주되며, 레벨 II 밴드보다 강한 반응성은 4+로 간주된다.
따라서, 한타바이러스 감염 검출을 위한 신규 방법이 개시된다. 본 발명의 바람직한 구체예가 일부 구체적으로 개시되었으나, 여기에 기술된 본 발명의 정신과 범위로부터 이탈하지 않은 채 자명한 변형을 할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
한타바이러스 감염의 검출을 위한 새로운 방법과 면역진단 검사 키트가 개시된다. 본 방법은 고도로 정밀한 결과를 제공하고 감염의 검출을 허용하여, 치료가 수행되고 사망이 방지되도록 한다.
<110> Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. <120> METHODS AND REAGENTS FOR DIAGNOSING HANTAVIRUS INFECTION <130> PP022009.0002 (2300-22009.40) <150> 60/581,027 <151> 2004-06-18 <160> 53 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3616 <212> DNA <213> Hantaan virus <400> 1 tagtagtaga caccgcaaaa gaaagcagtc aatcagcaac atggggatat ggaagtggct 60 agtgatggcc agtttagtat ggcctgtttt gacactgaga aatgtctatg acatgaaaat 120 tgagtgcccc catacagtaa gttttgggga aaacagtgtg ataggttatg tagaattacc 180 ccccgtgcca ttggccgaca cagcacagat ggtgcctgag agttcttgta acatggataa 240 tcaccaatcg ttgaatacaa taacaaaata tacccaagta agttggagag gaaaggctga 300 tcagtcacag tctagtcaaa attcatttga gacagtgtcc actgaagttg acttgaaagg 360 aacatgtgtt ctaaaacaca aaatggtgga agaatcatac cgtagtagga aatcagtaac 420 ctgttacgac ctgtcttgca atagcactta ctgcaagcca acactataca tgattgtacc 480 aattcatgca tgcaatatga tgaaaagctg tttgattgca ttgggaccat acagagtaca 540 ggtggtttat gagagaagtt actgtatgac aggagtcctg attgaaggga aatgctttgt 600 cccagatcaa agtgtggtca 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Val Gly Pro Ala Asn Ala Lys Val Pro His 290 295 300 Ser Ala Ser Ser Asp Thr Leu Ser Leu Ile Ala Tyr Ser Gly Ile Pro 305 310 315 320 Ser Tyr Ser Ser Leu Ser Ile Leu Thr Ser Ser Thr Glu Ala Lys His 325 330 335 Val Phe Ser Pro Gly Leu Phe Pro Lys Leu Asn His Thr Asn Cys Asp 340 345 350 Lys Ser Ala Ile Pro Leu Ile Trp Thr Gly Met Ile Asp Leu Pro Gly 355 360 365 Tyr Tyr Glu Ala Val His Pro Cys Thr Val Phe Cys Val Leu Ser Gly 370 375 380 Pro Gly Ala Ser Cys Glu Ala Phe Ser Glu Gly Gly Ile Phe Asn Ile 385 390 395 400 Thr Ser Pro Met Cys Leu Val Ser Lys Gln Asn Arg Phe Arg Leu Thr 405 410 415 Glu Gln Gln Val Asn Phe Val Cys Gln Arg Val Asp Met Asp Ile Val 420 425 430 Val Tyr Cys Asn Gly Gln Arg Lys Val Ile Leu Thr Lys Thr Leu Val 435 440 445 Ile Gly Gln Cys Ile Tyr Thr Ile Thr Ser Leu Phe Ser Leu Leu Pro 450 455 460 Gly Val Ala His Ser Ile Ala Val Glu Leu Cys Val Pro Gly Phe His 465 470 475 480 Gly Trp Ala Thr Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Cys Phe Gly Trp Val 485 490 495 Leu Ile Pro Ala Ile Thr 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Ile Gly Val Asp Val His Ala Leu Gly 705 710 715 720 His Trp Phe Asp Gly Arg Leu Asn Leu Lys Thr Ser Phe His Cys Tyr 725 730 735 Gly Ala Cys Thr Lys Tyr Glu Tyr Pro Trp His Thr Ala Lys Cys His 740 745 750 Tyr Glu Arg Asp Tyr Gln Tyr Glu Thr Ser Trp Gly Cys Asn Pro Ser 755 760 765 Asp Cys Pro Gly Val Gly Thr Gly Cys Thr Ala Cys Gly Leu Tyr Leu 770 775 780 Asp Gln Leu Lys Pro Val Gly Ser Ala Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Arg 785 790 795 800 Tyr Ser Arg Arg Val Cys Val Gln Phe Gly Glu Glu Asn Leu Cys Lys 805 810 815 Ile Ile Asp Met Asn Asp Cys Phe Val Ser Arg His Val Lys Val Cys 820 825 830 Ile Ile Gly Thr Val Ser Lys Phe Ser Gln Gly Asp Thr Leu Leu Phe 835 840 845 Phe Gly Pro Leu Glu Gly Gly Gly Leu Ile Phe Lys His Trp Cys Thr 850 855 860 Ser Thr Cys Gln Phe Gly Asp Pro Gly Asp Ile Met Ser Pro Arg Asp 865 870 875 880 Lys Gly Phe Leu Cys Pro Glu Phe Pro Gly Ser Phe Arg Lys Lys Cys 885 890 895 Asn Phe Ala Thr Thr Pro Ile Cys Glu Tyr Asp Gly Asn Met Val Ser 900 905 910 Gly Tyr Lys Lys Val Met Ala Thr Ile Asp Ser Phe Gln Ser Phe Asn 915 920 925 Thr Ser Thr Met His Phe Thr Asp Glu Arg Ile Glu Trp Lys Asp Pro 930 935 940 Asp Gly Met Leu Arg Asp His Ile Asn Ile Leu Val Thr Lys Asp Ile 945 950 955 960 Asp Phe Asp Asn Leu Gly Glu Asn Pro Cys Lys Ile Gly Leu Gln Thr 965 970 975 Ser Ser Ile Glu Gly Ala Trp Gly Ser Gly Val Gly Phe Thr Leu Thr 980 985 990 Cys Leu Val Ser Leu Thr Glu Cys Pro Thr Phe Leu Thr Ser Ile Lys 995 1000 1005 Ala Cys Asp Lys Ala Ile Cys Tyr Gly Ala Glu Ser Val Thr Leu Thr 1010 1015 1020 Arg Gly Gln Asn Thr Val Lys Val Ser Gly Lys Gly Gly His Ser Gly 1025 1030 1035 1040 Ser Thr Phe Arg Cys Cys His Gly Glu Asp Cys Ser Gln Ile Gly Leu 1045 1050 1055 His Ala Ala Ala Pro His Leu Asp Lys Val Asn Gly Ile Ser Glu Ile 1060 1065 1070 Glu Asn Ser Lys Val Tyr Asp Asp Gly Ala Pro Gln Cys Gly Ile Lys 1075 1080 1085 Cys Trp Phe Val Lys Ser Gly Glu Trp Ile Ser Gly Ile Phe Ser Gly 1090 1095 1100 Asn Trp Ile Val Leu Ile Val Leu Cys Val Phe Leu Leu Phe Ser Leu 1105 1110 1115 1120 Val Leu Leu Ser Ile Leu Cys Pro Val Arg Lys His Lys Lys Ser 1125 1130 1135 <210> 3 <211> 3682 <212> DNA <213> Puumala virus <400> 3 tagtagtaga ctccgcaaga agaagcaaac acagatcaat atgggagaac ttagtccagt 60 ttgtctgtat ctgcttctcc agggtctatt actatgtaat acaggggctg ccagaaacct 120 taatgagctt aaaatggaat gtccacatac tattagatta gggcagggtc ttgttgtggg 180 ttcagtagaa ttgccatctc ttccaataca gcaggtcgag acactaaagc tggagagttc 240 ttgtaatttt gatctacata ccagtacagc aggacaacaa tcattcacaa aatggacatg 300 ggaaattaaa ggtgatcttg cagagaacac acaggcatca tcaacaagtt ttcaaacaaa 360 aagcagtgaa gtgaatttga gaggattatg tttgatccct actttagtgg ttgaaacagc 420 agcaagaatg cgaaaaacaa tagcatgtta tgacctgtca tgcaatcaaa cagtgtgtca 480 gcctactgtc tatttaatgg gacctatcca gacttgtata acaactaaaa gttgtctctt 540 gagtttaggt gatcaaagga ttcaagtaaa ttatgaaaaa acatactgtg tttctgggga 600 ccttgttgaa ggtatctgtt ttaatccaat acatacaatg gcactctctc aacctagtca 660 tacatatgat ataatgacca tgatggttcg ctgtttcttg gtaataaaga aagtgacttc 720 tggtgacagt atgaagattg aaaagaactt tgagactctt gttcaaaaaa atggctgcac 780 agctaataac ttccaagggt attatatctg tcttataggg agtagttcag agcccttata 840 tgttccagca ttagatgatt atcgttcagc tgaagttctt tcaaggatgg catttgcacc 900 acatggtgaa gatcatgata ttgagaaaaa tgcagtgagt gcaatgcgta ttgctggaaa 960 ggtgacagga aaggtgccat caacagaatc atcagataca gtacagggga ttgcattttc 1020 aggtagtcct ctttatacat ctactggtgt cttgacatca aaagatgatc ctgtctacat 1080 ttgggctcct ggaatcataa tggaaggaaa ccattctatt tgtgaaaaga agaccttacc 1140 ccttacatgg actggtttta tttcattgcc tggagagatt gaaaaaacaa cacaatgtac 1200 agtattttgt acattggctg gaccaggtgc agattgtgaa gcttactctg aaacaggcat 1260 cttcaacata agttcaccta cttgcttaat aaatcgtgtc cagagattcc gtggttcaga 1320 acagcaaata aagtttgtgt gccagagagt ggacatggat atcactgttt actgtaatgg 1380 gatgaagaaa gtcattctca ccaagaccct agttattgga caatgcattt atacttttac 1440 tagtattttc tctctaatcc ctggtgttgc acattccctt gctgttgaat tatgtgtacc 1500 tggtcttcat ggttgggcaa ctatgctatt attactaaca ttttgttttg gctgggtctt 1560 aataccaact ataacaatga tcctgctaaa gatattgatt 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ggaaaggttt tcaaaattgt 2460 gtccttaaga tacacaagga aagtatgcat tcagttgggc acagaacaaa catgtaagac 2520 tgttgatagt aatgactgtc tcattaccac ttcagttaaa gtgtgcttga tagggaccat 2580 atcaaaattc caaccatctg acactttgct atttctaggt ccactacagc agggtggtct 2640 gatatttaaa caatggtgca ctacaacatg ccagtttggc gatcccgggg acataatgag 2700 cacacctaca ggcatgaagt gcccagaatt aaatggttct tttagaaaga aatgtgcatt 2760 tgcaacaact ccagtttgcc agtttgatgg aaatacaatt tcaggctata agaggatgat 2820 tgccacaaag gattcatttc aatctttcaa tgtgacagaa ccccatattt ctacaagtgc 2880 acttgaatgg attgatcctg acagctcact tagggaccat attaatgtaa ttgtgagtcg 2940 tgatctatcc ttccaagacc taagtgaaac accatgtcaa attgatttag caacagcctc 3000 tatagatgga gcatggggtt caggagttgg ttttaatctg gtttgtactg ttagtttaac 3060 agaatgttct gcatttctga catcaatcaa ggcctgtgat gctgcaatgt gttatgggtc 3120 caccacagcc aatctagttc gagggcaaaa taccattcat atcgtcggta agggtgggca 3180 ttctggttca aaatttatgt gttgtcatga cacaaaatgt tctagcaccg gtctagttgc 3240 agctgcacca cacttagatc gtgtgacacc atacaatcag 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tagtagtaga ctccgcaaga aacagcagtt aaataacagc atgatcatgt ggggtctact 60 attgacaatg attttgatcg attttggggc atccttaagg aatgtttatg acatgaagat 120 agaatgccca cattcaatca actttgggga gagcagtgta acaggtaagg tggaattacc 180 accccttctg ctcacagatg cagaggcctt ggtcccggag agttcttgta acatggacaa 240 ccatcagtct atgtcaatta tacaaaaagt gacaaaagtg agttggagaa aaaaggcaga 300 caaagcccaa gctgccaagg actcatttga gacaacatca agcgaggtta atctgaaggg 360 gacatgcaca ttgagtcata ggatggttga agaatcctac aggaatagga gatcagtgat 420 atgctatgac ttgtcttgca attcaacaca ttgtaagcca acgatgcata tgattgtgcc 480 tgtgcactca tgcaacatga tgaaaagctg tctggttggg cttgggcctt atcgaatcca 540 agttgtctat gaaagaacct actgtacaac tggtatacta acagaaggga agtgttttgt 600 gccagaccag agtattgtca gtgtcatcaa gaatggggtt tttgacattg caagtgtgag 660 cattgtctgt ttttttatca gagttaaagg aactaactac aagataatgg cgagtattaa 720 aacagcaact gcaaataact gtaatgacac tgacaataag gttcaaggat attacctttg 780 tattgttggg ggaaattctt ctcctgtgta tgcaccttca accactgatt ttagatctat 840 ggaagcactt gctagccttt taagagctcc tcatggtgag gaccatgatt tatctggaga 900 agaggttgca acttattcaa ttgccgggca aattgaaggc aaaatcccac atactgcaaa 960 tgcagcaaac atgctattta ctgcattctc aggaattcct agttactctt cattgagtgt 1020 ttttattgga agtcaagatg ggcctattat ttatagccca ggattgtttc ccaagttgaa 1080 ccaatcttca tgtgataagg tcgcactacc attgatatgg gaagggtaca tagatctacc 1140 tggctattat gaaacagttc acccgtgtaa tgtcttttgt gtgctatctg gcccaggagc 1200 atcatgtgag gcattctcag aaggtggtat tttcaatatt acatccccta catgccttgt 1260 gtcaaagcaa aatcggttca gggcagctga gcagcaagtc aatttcgtat gccagcgagt 1320 cgaccaagac attattatct actgtaatgg acaaaagaag acaattttga ccaagacatt 1380 agtgattggg cagtgtattt attcagtgac tagtttgttt tcaataatgc ctggggtagc 1440 acattcaatt gcaatcgaat tatgtgtacc agggttccat ggctgggcaa ctgctgctct 1500 tctcaccaca ttctgctttg gctggatact gatcccttcc atcacattgg ctgtattggt 1560 tgtcttaaag ttttttgcag caatcttaca taatagctct caagaaaacc gttttaaaat 1620 tatcctaagg aagattaaag aagaatttga aaagactaag ggctcaatgg tttgtgaagt 1680 gtgcaagtat gagtgtgaaa 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tggcaatgcc caagaccatt 120 tatgagctta aaatggaatg cccgcacact gtgggtctcg gtcaaggtta catcattggc 180 tcaacagaac taggtttgat ctcaattgag gctgcatctg atataaagct cgagagctct 240 tgcaattttg atcttcatac aacatctatg gcccagaaga gtttcaccca agttgaatgg 300 agaaagaaaa gtgacacaac tgataccaca aatgctgcgt ccactacctt tgaagcacaa 360 actaaaactg ttaaccttag agggacttgt atactggcac ctgaactcta tgatacattg 420 aagaaagtaa aaaagacagt cctgtgctat gatctaacat gtaatcaaac acattgtcag 480 ccaactgtct atctgattgc acctgtattg acatgcatgt caataagaag ttgtatggct 540 agtgtgttta caagcaggat tcaggtgatt tatgaaaaga cacattgtgt aacaggtcag 600 ctgattgagg gtcagtgttt caacccagca cacacattga cattatctca gcctgctcac 660 acttatgata ctgtcaccct tcctatctct tgttttttca caccaaagaa gtcggagcaa 720 ctaaaagtta taaaaacatt tgaaggaatt ctgacgaaga caggttgcac ggagaatgca 780 ttgcagggtt attatgtgtg ttttttaggg agtcattcag aacctttaat tgttccgagt 840 ttggaggaca tacggtctgc tgaagttgtt agtaggatgc ttgtacaccc taggggagaa 900 gaccatgatg ccatacagaa ttcacaaagt cacttaagaa tagtgggacc 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tgataccaca 180 aatgctgcgt ccactacctt tgaagcacaa actaaaactg ttaaccttag agggacttgt 240 atactggcac cttaatag 258 <210> 24 <211> 84 <212> PRT <213> Andes virus <400> 24 Met Gly Leu Gly Gln Gly Tyr Ile Ile Gly Ser Thr Glu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ile Ser Ile Glu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Leu Glu Ser Ser Cys Asn 20 25 30 Phe Asp Leu His Thr Thr Ser Met Ala Gln Lys Ser Phe Thr Gln Val 35 40 45 Glu Trp Arg Lys Lys Ser Asp Thr Thr Asp Thr Thr Asn Ala Ala Ser 50 55 60 Thr Thr Phe Glu Ala Gln Thr Lys Thr Val Asn Leu Arg Gly Thr Cys 65 70 75 80 Ile Leu Ala Pro <210> 25 <211> 1293 <212> DNA <213> Hantaan virus <400> 25 atggcaacta tggaggaatt acagagggaa atcaatgccc atgagggtca attagtgata 60 gccaggcaga aggtgaggga tgcagaaaaa cagtatgaaa aggatccaga tgagttgaac 120 aagagaacat taactgaccg agagggcgtt gcagtatcta tccaggcaaa aattgatgag 180 ttaaaaaggc aactggcaga taggattgca actgggaaaa accttgggaa ggaacaagat 240 ccaacagggg tggagcctgg agaccatctg aaagagaggt caatgctcag ttatggtaat 300 gtgctggatt taaaccattt ggatattgat gaacctacag 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Arg Lys 325 330 335 Pro Lys His Leu Tyr Val Ser Leu Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys 340 345 350 Ala Glu Glu Ile Thr Pro Gly Arg Tyr Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu 355 360 365 Tyr Pro Ala Gln Ile Lys Ala Arg Gln Met Ile Ser Pro Val Met Ser 370 375 380 Val Ile Gly Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ile Glu 385 390 395 400 Gln Trp Leu Ile Glu Pro Cys Lys Leu Leu Pro Asp Thr Ala Ala Val 405 410 415 Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ala Thr Asn Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Arg 420 425 430 Gln Val Ala Leu Gly Asn Met Glu Thr Lys Glu Ser Lys Ala Ile Arg 435 440 445 Gln His Ala Glu Ala Ala Gly Cys Ser Met Ile Glu Asp Ile Glu Ser 450 455 460 Pro Ser Ser Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro 465 470 475 480 Thr Cys Leu Phe Ile Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser 485 490 495 Ile Leu Gln Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly 500 505 510 Thr Ser Glu Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr 515 520 525 Leu Arg Arg Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Gly Gln Arg Ile Ile 530 535 540 Val Leu Phe Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His 545 550 555 560 Leu Gly Asp Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Gln Ser Leu 565 570 575 Ile Asp Val Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 580 585 590 <210> 49 <211> 596 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD/PUUV N <400> 49 Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30 Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 40 45 His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His 50 55 60 Phe Asn Pro Leu Ser Ala Leu Ala Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg 65 70 75 80 His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala 85 90 95 Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys 100 105 110 Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly 115 120 125 Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg 130 135 140 Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln Asn Leu Glu Phe Thr Arg 145 150 155 160 Gln Asn Lys Met Ser Asp Leu Thr Asp Ile Gln Glu Glu Ile Thr Arg 165 170 175 His Glu Gln Gln Leu Val Val Ala Arg Gln Lys Leu Lys Asp Ala Glu 180 185 190 Arg Ala Val Glu Val Tyr Pro Asp Asp Val Asn Lys Asn Thr Leu Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Gln Thr Val Ser Ala Leu Glu Asp Lys Leu Ala Asp Tyr 210 215 220 Lys Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Ser Arg Lys Lys Met Asp Thr Lys 225 230 235 240 Pro Thr Asp Pro Thr Gly Ile Glu Pro Asp Asp His Leu Lys Glu Arg 245 250 255 Ser Ser Leu Arg Tyr Gly Asn Val Leu Asp Val Asn Ala Ile Asp Ile 260 265 270 Glu Glu Pro Ser Gly Gln Thr Ala Asp Trp Tyr Thr Ile Gly Val Tyr 275 280 285 Val Ile Gly Phe Thr Ile Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu 290 295 300 Ser Thr Arg Gly Arg Gln Thr Val Lys Glu Asn Lys Gly Thr Arg Ile 305 310 315 320 Arg Phe Lys Asp Asp Thr Ser Phe Glu Asp Ile Asn Gly Ile Arg Arg 325 330 335 Pro Lys His Leu Tyr Val Ser Met Pro Thr Ala Gln Ser Thr Met Lys 340 345 350 Ala Glu Glu Leu Thr Pro Gly Arg Phe Arg Thr Ile Val Cys Gly Leu 355 360 365 Phe Pro Thr Gln Ile Gln Val Arg Asn Ile Met Ser Pro Val Met Gly 370 375 380 Val Ile Gly Phe Ser Phe Phe Val Lys Asp Trp Pro Glu Lys Ile Arg 385 390 395 400 Glu Phe Met Glu Lys Glu Cys Pro Phe Ile Lys Pro Glu Val Lys Pro 405 410 415 Gly Thr Pro Ala Gln Glu Val Glu Phe Leu Lys Arg Asn Arg Val Tyr 420 425 430 Phe Met Thr Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Asn His Val Ala Asp Ile 435 440 445 Asp Lys Leu Ile Asp Tyr Ala Ala Ala Gly Asp Pro Thr Ser Pro Asp 450 455 460 Asp Ile Glu Ser Pro Asn Ala Pro Trp Val Phe Ala Cys Ala Pro Asp 465 470 475 480 Arg Cys Pro Pro Thr Cys Ile Tyr Val Ala Gly Met Ala Glu Leu Gly 485 490 495 Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser 500 505 510 Lys Thr Val Gly Thr Ala Glu Glu Lys Leu Lys Lys Lys Ser Ser Phe 515 520 525 Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp 530 535 540 Gln Arg Ile Ile Leu Leu Tyr Met Leu Glu Trp Gly Lys Glu Met Val 545 550 555 560 Asp His Phe His Leu Gly Asp Gly Met Asp Pro Glu Leu Arg Gly Leu 565 570 575 Ala Gln Ser Leu Ile Asp Gln Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu 580 585 590 Pro Leu Lys Ile 595 <210> 50 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD/SEOV N <400> 50 Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30 Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 40 45 His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His 50 55 60 Phe Asn Pro Leu Ser Ala Leu Ala Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg 65 70 75 80 His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala 85 90 95 Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys 100 105 110 Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly 115 120 125 Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg 130 135 140 Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln Asn Leu Glu Phe Thr Arg 145 150 155 160 Gln Asn Lys Met Ala Thr Met Glu Glu Ile Gln Arg Glu Ile Ser Ala 165 170 175 His Glu Gly Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Lys Asp Ala Glu 180 185 190 Lys Gln Tyr Glu Lys Asp Pro Asp Asp Leu Asn Lys Arg Ala Leu His 195 200 205 Asp Arg Glu Ser Val Ala Ala Ser Ile Gln Ser Lys Ile Asp Glu Leu 210 215 220 Lys Arg Gln Leu Ala Asp Arg Ile Ala Ala Gly Lys Asn Ile Gly Gln 225 230 235 240 Asp Arg Asp Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg 245 250 255 Ser Ala Leu Ser Tyr Gly Asn Thr Leu Asp Leu Asn Ser Leu Asp Ile 260 265 270 Asp Glu Pro Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Thr Ile Ile Val Tyr 275 280 285 Leu Thr Ser Phe Val Val Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu 290 295 300 Thr Thr Arg Gly Arg Gln Thr Ser Lys Asp Asn Lys Gly Met Arg Ile 305 310 315 320 Arg Phe Lys Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys 325 330 335 Pro Lys His Leu Tyr Val Ser Met Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys 340 345 350 Ala Glu Glu Ile Thr Pro Gly Arg Phe Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu 355 360 365 Tyr Pro Ala Gln Ile Lys Ala Arg Asn Met Val Ser Pro Val Met Ser 370 375 380 Val Val Gly Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Thr Ser Arg Ile Glu 385 390 395 400 Glu Trp Leu Gly Ala Pro Cys Lys Phe Met Ala Glu Ser Pro Ile Ala 405 410 415 Gly Ser Leu Ser Gly Asn Pro Val Asn Arg Asp Tyr Ile Arg Gln Arg 420 425 430 Gln Gly Ala Leu Ala Gly Met Glu Pro Lys Glu Phe Gln Ala Leu Arg 435 440 445 Gln His Ser Lys Asp Ala Gly Cys Thr Leu Val Glu His Ile Glu Ser 450 455 460 Pro Ser Ser Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro 465 470 475 480 Thr Cys Leu Phe Val Gly Gly Met Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser 485 490 495 Ile Leu Gln Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly 500 505 510 Thr Ala Asp Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr 515 520 525 Leu Arg Arg Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Arg Ile Ile 530 535 540 Val Met Phe Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His 545 550 555 560 Leu Gly Asp Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Ser Leu Ala Gln Ile Leu 565 570 575 Ile Asp Gln Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Met Lys Leu 580 585 590 <210> 51 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD/DOBV N <400> 51 Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30 Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 40 45 His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His 50 55 60 Phe Asn Pro Leu Ser Ala Leu Ala Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg 65 70 75 80 His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala 85 90 95 Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys 100 105 110 Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly 115 120 125 Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg 130 135 140 Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln Asn Leu Glu Phe Thr Arg 145 150 155 160 Gln Asn Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Leu Gln Lys Glu Ile Asn Asn 165 170 175 His Glu Gly Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Lys Asp Ala Glu 180 185 190 Lys Gln Tyr Glu Lys Asp Pro Asp Asp Leu Asn Lys Arg Ala Leu Ser 195 200 205 Asp Arg Glu Ser Ile Ala Gln Ser Ile Gln Gly Lys Ile Asp Glu Leu 210 215 220 Arg Arg Gln Leu Ala Asp Arg Val Ala Ala Gly Lys Asn Ile Gly Lys 225 230 235 240 Glu Arg Asp Pro Thr Gly Leu Asp Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Lys 245 250 255 Ser Met Leu Ser Tyr Gly Asn Val Ile Asp Leu Asn His Leu Asp Ile 260 265 270 Asp Glu Pro Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Ser Ile Val Ile Tyr 275 280 285 Leu Thr Ser Phe Val Val Pro Ile Leu Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu 290 295 300 Thr Thr Arg Gly Arg Gln Thr Thr Lys Asp Asn Lys Gly Met Arg Ile 305 310 315 320 Arg Phe Lys Asp Asp Ser Ser Phe Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys 325 330 335 Pro Lys His Leu Phe Leu Ser Met Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys 340 345 350 Ala Asp Glu Ile Thr Pro Gly Arg Phe Arg Thr Ala Ile Cys Gly Leu 355 360 365 Tyr Pro Ala Gln Val Lys Ala Arg Asn Leu Ile Ser Pro Val Met Ser 370 375 380 Val Ile Gly Phe Val Ala Leu Ala Lys Asn Trp Thr Glu Arg Val Glu 385 390 395 400 Glu Trp Leu Asp Leu Pro Cys Lys Leu Leu Ser Glu Pro Ser Pro Thr 405 410 415 Ser Leu Thr Lys Gly Pro Ser Thr Asn Arg Asp Tyr Leu Asn Gln Arg 420 425 430 Gln Gly Ala Leu Ala Lys Met Glu Thr Lys Glu Ala Gln Ala Val Arg 435 440 445 Lys His Ala Ile Asp Ala Gly Cys Asn Leu Ile Asp His Ile Asp Ser 450 455 460 Pro Ser Ser Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro 465 470 475 480 Thr Cys Leu Phe Ile Ala Gly Met Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ala 485 490 495 Cys Leu Gln Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Ile Gly 500 505 510 Thr Ser Glu Glu Lys Leu Lys Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr 515 520 525 Leu Arg Arg Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Arg Ile Ile 530 535 540 Val Leu Phe Met Val Asp Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Ser Phe His 545 550 555 560 Leu Gly Asp Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala Gln Ala Leu 565 570 575 Ile Asp Gln Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 580 585 590 <210> 52 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD/SNV N <400> 52 Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30 Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 40 45 His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His 50 55 60 Phe Asn Pro Leu Ser Ala Leu Ala Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg 65 70 75 80 His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala 85 90 95 Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys 100 105 110 Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly 115 120 125 Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg 130 135 140 Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln Asn Leu Glu Phe Thr Arg 145 150 155 160 Gln Asn Lys Met Ser Thr Leu Lys Glu Val Gln Asp Asn Ile Thr Leu 165 170 175 His Glu Gln Gln Leu Val Thr Ala Arg Gln Lys Leu Lys Asp Ala Glu 180 185 190 Arg Ala Val Glu Leu Asp Pro Asp Asp Val Asn Lys Ser Thr Leu Gln 195 200 205 Ser Arg Arg Ala Ala Val Ser Ala Leu Glu Thr Lys Leu Gly Glu Leu 210 215 220 Lys Arg Glu Leu Ala Asp Leu Ile Ala Ala Gln Lys Leu Ala Ser Lys 225 230 235 240 Pro Val Asp Pro Thr Gly Ile Glu Pro Asp Asp His Leu Lys Glu Lys 245 250 255 Ser Ser Leu Arg Tyr Gly Asn Val Leu Asp Val Asn Ser Ile Asp Leu 260 265 270 Glu Glu Pro Ser Gly Gln Thr Ala Asp Trp Lys Ser Ile Gly Leu Tyr 275 280 285 Ile Leu Ser Phe Ala Leu Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu 290 295 300 Ser Thr Arg Gly Arg Gln Thr Ile Lys Glu Asn Lys Gly Thr Arg Ile 305 310 315 320 Arg Phe Lys Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Glu Val Asn Gly Ile Arg Lys 325 330 335 Pro Arg His Leu Tyr Val Ser Met Pro Thr Ala Gln Ser Thr Met Lys 340 345 350 Ala Asp Glu Ile Thr Pro Gly Arg Phe Arg Thr Ile Ala Cys Gly Leu 355 360 365 Phe Pro Ala Gln Val Lys Ala Arg Asn Ile Ile Ser Pro Val Val Gly 370 375 380 Val Ile Gly Phe Ser Phe Phe Val Lys Asp Trp Met Glu Arg Ile Asp 385 390 395 400 Asp Phe Leu Ala Ala Arg Cys Pro Phe Leu Pro Glu Gln Lys Asp Pro 405 410 415 Arg Asp Ala Ala Leu Ala Thr Asn Arg Ala Tyr Phe Ile Thr Arg Gln 420 425 430 Leu Gln Val Asp Glu Ser Lys Val Ser Asp Ile Glu Asp Leu Ile Ala 435 440 445 Asp Ala Arg Ala Glu Ser Ala Thr Ile Phe Ala Asp Ile Ala Thr Pro 450 455 460 His Ser Val Trp Val Phe Ala Cys Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr 465 470 475 480 Ala Leu Tyr Val Ala Gly Met Pro Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ala Ile 485 490 495 Leu Gln Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Ser Val Gly Thr 500 505 510 Ser Glu Glu Lys Leu Lys Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu 515 520 525 Arg Arg Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Lys Ile Ile Ile 530 535 540 Leu Tyr Met Ser His Trp Gly Arg Glu Ala Val Asn His Phe His Leu 545 550 555 560 Gly Asp Asp Met Asp Leu Glu Leu Arg Glu Leu Ala Gln Thr Leu Val 565 570 575 Asp Ile Lys Val Arg Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 580 585 590 <210> 53 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD/ANDV N <400> 53 Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30 Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 40 45 His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His 50 55 60 Phe Asn Pro Leu Ser Ala Leu Ala Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg 65 70 75 80 His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala 85 90 95 Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys 100 105 110 Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly 115 120 125 Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg 130 135 140 Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln Asn Leu Glu Phe Thr Arg 145 150 155 160 Gln Asn Lys Met Ser Thr Leu Gln Glu Leu Gln Glu Asn Ile Thr Ala 165 170 175 His Glu Gln Gln Leu Val Thr Ala Arg Gln Lys Leu Lys Asp Ala Glu 180 185 190 Lys Ala Val Glu Val Asp Pro Asp Asp Val Asn Lys Ser Thr Leu Gln 195 200 205 Asn Arg Arg Ala Ala Val Ser Thr Leu Glu Thr Lys Leu Gly Glu Leu 210 215 220 Lys Arg Gln Leu Ala Asp Leu Val Ala Ala Gln Lys Leu Ala Thr Lys 225 230 235 240 Pro Val Asp Pro Thr Gly Leu Glu Pro Asp Asp His Leu Lys Glu Lys 245 250 255 Ser Ser Leu Arg Tyr Gly Asn Val Leu Asp Val Asn Ser Ile Asp Leu 260 265 270 Glu Glu Pro Ser Gly Gln Thr Ala Asp Trp Lys Ala Ile Gly Ala Tyr 275 280 285 Ile Leu Gly Phe Ala Ile Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu 290 295 300 Ser Thr Arg Gly Arg Gln Thr Val Lys Asp Asn Lys Gly Thr Arg Ile 305 310 315 320 Arg Phe Lys Asp Asp Ser Ser Phe Glu Glu Val Asn Gly Ile Arg Lys 325 330 335 Pro Lys His Leu Tyr Val Ser Met Pro Thr Ala Gln Ser Thr Met Lys 340 345 350 Ala Glu Glu Ile Thr Pro Gly Arg Phe Arg Thr Ile Ala Cys Gly Leu 355 360 365 Phe Pro Ala Gln Val Lys Ala Arg Asn Ile Ile Ser Pro Val Met Gly 370 375 380 Val Ile Gly Phe Gly Phe Phe Val Lys Asp Trp Met Asp Arg Ile Glu 385 390 395 400 Glu Phe Leu Ala Ala Glu Cys Pro Phe Leu Pro Lys Pro Lys Val Ala 405 410 415 Ser Glu Ala Phe Met Ser Thr Asn Lys Met Tyr Phe Leu Asn Arg Gln 420 425 430 Arg Gln Val Asn Glu Ser Lys Val Gln Asp Ile Ile Asp Leu Ile Asp 435 440 445 His Ala Glu Thr Glu Ser Ala Thr Leu Phe Thr Glu Ile Ala Thr Pro 450 455 460 His Ser Val Trp Val Phe Ala Cys Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr 465 470 475 480 Ala Leu Tyr Val Ala Gly Val Pro Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile 485 490 495 Leu Gln Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Ser Val Gly Thr 500 505 510 Ala Glu Glu Lys Leu Lys Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu 515 520 525 Arg Arg Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Lys Ile Ile Ile 530 535 540 Leu Tyr Met Leu Ser Trp Gly Lys Glu Ala Val Asn His Phe His Leu 545 550 555 560 Gly Asp Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Gln Leu Ala Gln Ser Leu Ile 565 570 575 Asp Thr Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 580 585 590

Claims (44)

  1. 생물학적 샘플에서 한타바이러스 항체를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 적어도 6개의 한타바이러스 재조합 항원과 접촉시키는 단계, 여기서 적어도 6개의 한타바이러스 재조합 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 각 항원형으로부터의 적어도 하나의 재조합 항원이 존재하고, 여기서 상기 접촉은 한타바이러스 항체가 생물학적 샘플 내에 존재할 때, 적어도 하나의 상기 G1 또는 N 항원과 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서 수행된다; 및
    (b) 상기 항체/항원 복합체의 존재 또는 부존재를 검출하여, 상기 샘플 내에서 한타바이러스 항체의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부 터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원이고, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 G1 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하고, 적어도 하나의 N 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 적어도 하나의 N 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 한타바이러스 감염을 검출하기 위한 면역진단 검사 키트로서, 상기 검사 키트는:
    (a) 적어도 6개의 한타바이러스 재조합 항원, 여기서 적어도 6개의 한타바이러스 재조합 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 각 항원형으로부터의 적어도 하나의 항원이 존재한다; 및
    (b) 면역진단 검사를 수행하기 위한 지시사항
    을 포함하는 면역진단 검사 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원이고, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  17. 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 G1 항원이 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하고, 적어도 하나의 N 항원이 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하는 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  18. 제 10 항, 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 적어도 하나의 N 항원이 한타 바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하는 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  19. 생물학적 샘플에서 한타바이러스 항원을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 생물학적 샘플을 적어도 6개의 다른 항체와 접촉하는 단계, 여기서 상기 항체의 각각은 6개 한타바이러스 항원 중 적어도 하나에 대해 특이적이고, 여기서 6개의 한타바이러스 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신 놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 각 항원형으로부터의 적어도 하나의 항원에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체가 존재하고, 여기서 상기 접촉은 한타바이러스 항원이 생물학적 샘플 내에 존재할 때, 상기 항체와 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서 수행된다; 및
    (b) 상기 항체/항원 복합체의 존재 또는 부존재를 검출하여, 상기 샘플 내에서 한타바이러스 항원의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 항체는 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 한타바이러스 감염을 검출하기 위한 면역진단 검사 키트로서, 상기 검사 키트는:
    (a) 적어도 6개의 다른 항체, 여기서 상기 항체의 각각은 6개 한타바이러스 항원 중 적어도 하나에 대해 특이적이고, 6개의 한타바이러스 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하며, 각 항원형으로부터의 적어도 하나의 항원에 특이적인 적어도 하나의 항체가 존재한다; 및
    (b) 면역진단 검사를 수행하기 위한 지시사항
    을 포함하는 키트.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 항체는 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 면역진단 검사 키트.
  23. 적어도 6개의 한타바이러스 재조합 항원을 포함하는 고체 지지물로서, 여기서 적어도 6개의 한타바이러스 재조합 항원은 한타바이러스 항원형 한탄(HTNV), 푸말라(PUUV), 서울(SEOV), 도브라바(DOBV), 신놈브르(SNV) 및 안데스(ANDV)로부터의 G1 및/또는 N 항원의 조합을 포함하고, 각 항원형으로부터의 적어도 하나의 항원이 존재하는 고체 지지물.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  28. 제 23 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 G1 항원(들)은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:47로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원이고, 상기 N 항원(들)은 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원인 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  30. 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 G1 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하고, 적어도 하나의 N 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  31. 제 23 항, 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 적어도 하나의 N 항원은 한타바이러스 항원형 HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV 및 ANDV의 각각으로부터 존재하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  32. 제 23 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항-인간 면역글로불린 항체를 더 포함하고, 여기서 한타바이러스 항원 및 항-인간 면역글로불린 항체는 고체 지지물 상의 분리된 위치에 고정되는 것을 특징으로 하는 고체 지 지물.
  33. 제 32 항에 있어서, 적어도 하나의 항-인간 면역글로불린 항체는 항-인간 IgM 항체, 항-인간 IgG 항체 및 항-인간 IgA 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  34. 제 33 항에 있어서, 고체 지지물은 그 위의 분리된 위치에 고정된 항-인간 IgM 항체 및 항-인간 IgG 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  35. 제 34 항에 있어서, 고체 지지물은 고체 지지물 상의 분리된 위치에 고정된 항-인간 IgA 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  36. 제 23 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 내부 대조기준을 더 포함하고, 여기서 하나의 대조기준은 고체 지지물을 사용하는 면역분석에서 양성 결과에 대한 낮은 검출 한계를 정의하고, 나머지 다른 대조기준은 고체 지지물을 사용하는 면역분석에서 고도로 양성인 결과를 정의하는 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  37. 제 23 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지물은 니트로셀룰로오스 스트립인 것을 특징으로 하는 고체 지지물.
  38. 한타바이러스를 검출하는 면역진단 검사 키트로서, 상기 키트는
    (a) 제 23 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 따른 고체 지지물; 및
    (b) 면역진단 검사를 수행하기 위한 지시사항
    을 포함하는 면역진단 검사 키트.
  39. 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항체의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 제 23 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 따른 고체 지지물을 제공하는 단계;
    (c) 한타바이러스 항체가, 만약 생물학적 샘플 내에 존재한다면, 적어도 하나의 한타바이러스 항원과 결합하여 항체/항원 복합체를 형성하도록 허용하는 조건하에서, 상기 생물학적 샘플을 상기 고체 지지물과 접촉시키는 단계; 및
    (d) 항체/항원 복합체의 존재를 검출하여, 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항체의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    (e) 비결합된 한타바이러스 항체를 제거하는 단계;
    (f) 상기 항체/항원 복합체와 연합하는 능력이 있는 하나 이상의 부문을 제공하는 단계; 및
    (g) 상기 하나 이상의 부분의 존재를 검출하여, 생물학적 샘플 내에서 한타바이러스 항체의 존재를 검출하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 하나 이상의 부분은 검출가능하게 표지된 한타바이러스 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 검출가능한 표지는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 9 항, 제 19 항, 제 20항 및 제 39 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 인간 혈액 샘플로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  44. (a) 제 1 항 내지 제 9 항, 제 19 항, 제 20 항 및 제 39 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수집된 혈액 샘플로부터의 전혈, 혈소판, 혈장 또는 혈청의 알리쿼트를 스크리닝하는 단계;
    (b) 한타바이러스 항원 또는 한타바이러스 항체가 검출된 어떤 샘플을 제거하는 단계; 및
    (c) 한타바이러스가 실질적으로 없는 혈액 공급을 제공하기 위하여 한타바이러스 항원 또는 한타바이러스 항체가 검출되지 않은 샘플들을 합하는 단계
    를 포함하는, 한타바이러스가 실질적으로 없는, 전혈, 혈소판, 혈장 또는 혈청을 포함하는 혈액 공급을 제조하는 방법.
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