KR20070026588A - Ｉｌ-21 및 단클론성 항체 요법을 이용한 암 치료 방법 - Google Patents

Abstract

치료적 단클론성 항체와 IL-21을 공동-투여함에 의한 암 치료 방법이 설명된다. 리툭시맵, 트라스투주맵 및 항-CTLA4 항체가 사용될 수 있는 전형적인 단클론성 항체이다. 조합 치료요법의 증진된 항-종양 활성은 단클론성 치료요법을 거부하거나, 단클론성 항체로 치료된 후 재발하거나, 또는 증진된 IL-21 항-종양 효과가 단클론성 항체를 이용한 치료와 관련된 독성을 감소시키는 경우의 환자 집단에 특히 유용하다.

단클론성 항체, IL-21, 암 치료, 리툭시맵, 트라스투주맵, 세포독성

Description

ＩＬ-21 및 단클론성 항체 요법을 이용한 암 치료 방법{METHODS OF TREATING CANCER USING IL-21 AND MONOCLONAL ANTIBODY THERAPY}

시토카인은 일반적으로 조혈 계통 세포의 증식 또는 분화를 자극하거나, 신체의 면역 및 염증 반응 기전에 참여한다. 인터루킨은 면역학적 반응을 매개하는 시토카인의 패밀리이다. 면역반응의 중심은 T 세포이며, 이것은 많은 시토카인을 생산하고, 항원에 대한 적응면역을 가져온다. T 세포에 의해서 생산된 시토카인은 TH1 및 TH2로 분류된다(Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). 1-형 시토카인은 IL-2, IFN-γ, LT-α를 포함하고, 염증반응, 바이러스 면역, 세포내 기생생물 면역 및 동종이식 거부에 관련된다. 2-형 시토카인은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 포함하고, 체액반응, 연충면역 및 알레르기 반응에 관련된다. 1-형과 2-형 간에 공유된 시토카인은 IL-3, GM-CSF 및 TNF-α를 포함한다. 1-형 및 2-형을 생산하는 T 세포 집단이 상이한 종류의 염증 조직으로 우선적으로 이동한다는 것을 시사하는 어떤 증거가 있다.

자연 세포독성(NK) 세포는 T 세포 및 B 세포와 공통 선조세포를 가지며, 면역감시에서 역할을 한다. 혈액 림프구의 15% 이하를 포함하는 NK 세포는 항원 수용체를 발현하지 않고, 선천면역의 구성요소이다. NK 세포는 종양 세포 및 바이러스 감염 세포의 인식과 사멸에 관련된다. 생체내에서 NK 세포는 활성화를 필요로 한다고 여겨지지만, 시험관내에서 NK 세포는 어떤 종류의 종양 세포를 활성화 없이 죽이는 것으로 나타났다.

IL-21은 세포독성 T 세포와 NK 세포의 효능 있는 조정인자 것으로 나타났다 (Parrish-Novak 등, Nature 408:57-63, 2000; Parrish-Novak 등, J.Leuk.Bio. 72: 856-863, 2002; Collins 등 Immunol.Res. 28:131-140, 2003; Brady 등, J.Immunol. 2048-58, 2004). IL-21은 NK 세포의 확장을 보조-자극하는 것으로 나타났으며, 이들 세포의 이펙터 기능을 증진시킨다는 것이 증명되었다. T 세포 반응은 기억 T 세포 기능의 조정에 따른 1차 항원 반응의 증진을 포함한다(Kasaian 등, Immunity 16:559-569, 2002).

항체 요법은 어떤 세포 종류에 대해 선택적으로 발현되는 항원을 이용한다. 항체 요법은 암 치료에서 특히 성공적이었는데, 이는 어떤 종양들은 특이적 항원, 계통-특이적 항원, 또는 정상 세포에 비해 과량으로 존재하는 항원을 나타내기 때문이다. 단클론성 항체(MAb) 요법의 개발은 마우스 하이브리도마 기술(Kohler 등, Nature 256:495-497, 1975)으로부터 발전하였는데, 이 기술은 사람 면역 이펙터 세포 활성을 자극할 수 없고, 사람 항-마우스 항체가 생산되기(HAMA; Khazaeli 등, J. Immunother. 15:42-52, 1994) 때문에 치료적 유용성이 제한적이었다. 사람 불변영역과 마우스 가변영역을 사용하여 더 적은 항원성을 나타내도록 조작한 키메라 항체가 달성되었다. 이들 항체는 증가된 이펙터 기능과 감소된 HAMA 반응을 가졌다(Boulianne 등, Nature 312:643-646, 1984). 파지 디스플레이 기술(MaCafferty 등, Nature 348:552-554, 1990)을 이용하여 사람 단클론성 항체가 개발되었고, 더 욱 최근에는 사람 Ig 유전자좌를 지닌 트랜스젠 마우스를 사용하여 완전한 사람 단클론성 항체를 생산해 내었다(Green, J. Immunol. Methods 231:11-23, 1999). 단클론성 항체 요법에 대해서 Brekke 등, Nat.Rev.Drug Discov.(2:52-62, 2002)를 참조한다.

본 발명은 IL-21을 사용한 단클론성 항체 요법의 항-종양 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. IL-21과 치료적 단클론성 항체의 조합이 단클론성 항체 요법 단독사용에 비해 개선점을 제공하며, 특히 단클론성 항체 요법 단독사용이나 다른 치료 섭생과의 조합사용에 반응하지 않는 환자에 대해 개선점을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은, 치료적 유효량의 단클론성 항체와, 치료적 유효량의 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편을 공동-투여하는 것을 포함하는, 대상자, 특히 사람 대상자에서의 암 치료 방법을 제공한다. 한 구체예에서 단클론성 항체는 항-CD20 단클론성 항체이다. 다른 구체예에서 단클론성 항체는 리툭시맵(rituximab)이다. 다른 구체예에서 본 발명의 방법은 비-호지킨 림프종을 치료한다. 본 발명의 또 다른 구체예는 단클론성 항체 리툭시맵과 IL-21 폴리펩티드가 연속 8주까지 매주 1회 투여되는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서는, 리툭시맵이 연속 8주까지 매주 1회 투여되고, IL-21 폴리펩티드는 매주 5회까지 투여된다. 본 발명의 다른 구체예는 IL-21 폴리펩티드 용량이 10 내지 500㎍/kg/용량인 것을 제공한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 환자는 리툭시맵으로 이전에 치료된 적이 있고, 감지할 정도의 종양 완화나 퇴행을 나타내지 않았던 환자이다. 다른 구체예에서, 환자는 리툭시맵 치료를 받은 후에 재발한 환자이다.

다른 양태로서, 본 발명은, 치료적 유효량의 항-CD20 단클론성 항체와, 치료적 유효량의 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편을 공동-투여하는 것을 포함하는, 대상자에서의 암 치료 방법을 제공하며, 여기서 IL-21의 투여는 최적의 면역학적 반응을 가져온다.

다른 양태로서, 본 발명은 Her-2/neu 수용체 결합 단클론성 항체와, 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편을 공동-투여하는 것을 포함하는, 대상자에서의 암 치료 방법을 제공한다. 한 구체예에서 대상자는 사람 환자이다. 더 이상의 구체예에서 단클론성 항체는 트라스투주맵(trastuzumab)이다.

본 발명의 한 양태는, 세포독성 T 림프구-관련 항원 4(CTLA-4) 결합 단클론성 항체와, 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편을 공동-투여하는 것을 포함하는, 대상자에서의 암 치료 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서 대상자는 사람 환자이다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 항-CTLA-4 단클론성 항체가 4회 사이클 동안 3주마다 3mg/kg의 용량으로 투여되고, IL-21 폴리펩티드 또는 단편은 8주까지 매주 1회 내지 5회 투여된다. 또한, 본 발명은 IL-21 폴리펩티드 용량이 10 내지 500㎍/kg/용량인 구체예를 제공한다.

도 1은 대식세포-고갈 마우스에 대한 생존 곡선이 비-고갈 마우스와 매우 달랐음을 설명한다.

도 2는 항-Gr-1 MAb 주입에 의해 과립구가 고갈된 마우스가 비-고갈 마우스에 비해 감소된 생존을 나타냄을 설명한다.

도 3은 항-CTLA4 + IL-21 조합이 RENCa 모델에서 항-종양 효과를 가짐을 설명한다.

발명의 설명

본 발명을 상세히 서술하기 전에 다음의 용어들을 정의하는 것이 발명의 이해를 도울 수 있을 것이다.

본원에서 사용된 용어 "친화성 태그"는 제 2 폴리펩티드의 정제나 검출을 제공하거나, 또는 제 2 폴리펩티드의 기질 부착 부위를 제공하기 위해 제 2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 조각을 나타낸다. 주로, 항체 또는 다른 특이적 결합체가 이용될 수 있는 어떤 펩티드나 단백질이 친화성 태그로 사용될 수 있다. 친화성 태그는, 폴리히스티딘 트랙, 단백질 A(Nilsson 등, EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson 등, Methods Enzymol. 198:3, 1991), 글루타티온 S 트랜스페라제(Smith 및 Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu 친화성 태그(Grussenmeyer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), 섭스턴스 P, Flag^TM 펩티드(Hopp 등, Biotechno- logy 6:1204-10, 1988), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원 에피토프나 결합 도메인을 포함한다. Ford 등, Protein Expression and Purification(2:95-107, 1991)을 일반적으로 참조한다. 친화성 태그를 암호화하는 DNA는 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다(예를 들어, Pharmacia Biotech, 뉴저지 피스카타웨이).

본원에서 사용된 용어 "대립유전자 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 점유하는 유전자의 2개 이상의 다른 형태 중 어느 것을 나타낸다. 대립유전자 변형은 돌연변이를 통해 자연적으로 일어나며, 집단 내에 표현형적 다형태를 가져올 수 있다. 유전자 돌연변이는 무반응성(암호화된 폴리펩티드에 변화 없음)일 수 있거나, 또는 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 대립유전자 변이체라는 용어는 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "아미노-말단" 및 "카르복실-말단"은 폴리펩티드 내의 위치를 나타낸다. 문맥이 허용하는 경우, 이들 용어는 근접성 또는 상대적 위치를 나타내기 위해 폴리펩티드의 특정 서열 또는 부분과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드 내의 기준 서열에 대해 카르복실-말단에 위치한 어떤 서열은 이 기준 서열의 카르복실 말단에 근접하여 위치하면 되고, 반드시 완전한 폴리펩티드의 카르복실 말단에 있을 필요는 없다.

본원에서 사용된 용어 "암" 또는 "암 세포"는 정상 조직이나 조직 세포로부터 분화되는 특성을 지닌 신생물에서 발견된 조직 또는 세포를 나타낸다. 그러한 특성 중에는 퇴화도, 형태의 변칙성, 뚜렷하지 않은 세포 윤곽, 핵 크기, 핵 또는 세포질 구조의 변화, 다른 표현형적 변화, 암성 또는 전-암성 상태를 암시하는 세포 단백질의 존재, 유사분열 수의 증가, 및 전이 능력이 포함되나, 이들에 제한되지는 않는다. "암"에 해당하는 단어로는 암종, 육종, 종양, 상피종, 백혈병, 림프종, 폴립, 및 사이러스, 형질전환, 신생물 등이 있다.

본원에서 사용된 용어 "공동-투여"는 IL-21 폴리펩티드 또는 단백질 및 치료적 단클론성 항체가 동시에 또는 상이한 시기에 제공될 수 있다는 것을 나타낸다. 공동-투여는 IL-21과 단클론성 항체 둘 다의 단 한 번의 공동-투여이거나, 여러 사이클의 공동-투여일 수 있다. 공동-투여는 IL-21 또는 단클론성 항체가 환자에게 투여되는 바로 그 때일 필요는 없고, 어느 한쪽 제제가 단독으로 투여되거나, IL-21 이외의 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "조합 치료요법"은 대상자에게 IL-21 조성물("IL-21")과 치료적 단클론성 항체를 적어도 1회의 치료적 유효 용량으로 투여하는 것을 나타낸다. IL-21 조성물은 IL-21의 생물학적 활성을 나타내는 성숙 폴리펩티드, 그것의 단편, 융합체 또는 접합체일 수 있다.

용어 "분리된"은 폴리뉴클레오티드에 적용되었을 때, 폴리뉴클레오티드가 그것의 자연적인 유전환경으로부터 제거됨으로써, 다른 외부적인 또는 원치 않는 암호화 서열을 갖지 않게 되고, 유전조작 단백질 생산 시스템 내에 사용하기에 적합한 형태로 되는 것을 나타낸다. 그러한 분리된 분자는 그들의 자연적 환경으로부터 격리되고 cDNA와 게놈 클론을 포함하는 것들이다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 그들이 보통 관련되는 다른 유전자들은 갖지 않지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연발생한 5' 및 3' 미번역 영역을 포함할 수는 있다. 관련 영역의 확인은 당업자에게 자명할 것이다(예를 들어, Dynan 및 Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

"분리된" 폴리펩티드 또는 단백질은 그것의 자생 환경 이외의 다른 조건에서 발견되는, 예를 들어 혈액 및 동물 조직과 떨어져 발견되는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직한 형태에서, 분리된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드를 실질적으로 갖지 않는다. 고도로 정제된 형태, 즉 95% 이상 순수한 폴리펩티드를 제공하는 것이 바람직하며, 더 바람직한 것은 99% 이상 순수한 것이다. 이런 문맥에서 사용될 때, 용어 "분리된"은, 다이머나 또는 달리 글리코실화 또는 유도체화된 형태 같은, 다른 물리적 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재를 배제하지 않는다.

본원에서 용어 "수준"이 NK 세포, T 세포, 특히 세포독성 T 세포, B 세포 등과 같은 면역세포에 관해 언급되었을 때, 증가된 수준은 세포 수의 증가나 세포 기능 활성의 증진을 의미한다.

본원에서 용어 "수준"이 바이러스 감염에 관해 언급되었을 때, 이 용어는 바이러스 감염 수준의 변화를 말하는 것이며, CTL 또는 NK 세포(상기 설명된) 수준의 변화, 바이러스 부담의 감소, 항-바이러스 항체 역가의 증가, 알라닌 아미노트랜스페라제의 혈청학적 수준 감소 또는 표적 조직이나 기관의 조직학적 시험에 의해 측정된 개선을 포함하나, 이들에 제한되지는 않는다. 수준에 있어서의 이러한 변화들이 유의한 차이인지 아니면 진정한 변화인지에 대해 결정하는 것은 당업자의 기술범위 내이다.

세포에 관해 언급되었을 때, 용어 "신생"은 새로운 비정상적인 증식을 겪고, 그 결과 신생물을 생성하는 세포를 나타내며, 특히 증식이 제어되지 않고 진행중인 조직에서 그러한 세포를 나타낸다. 신생 세포는 악성, 즉 침습성 및 전이성일 수도 있고, 양성일 수도 있다.

용어 "최적 면역학적 용량"은 최적의 면역학적 반응을 달성하는 IL-21 또는 단클론성 항체와 조합된 IL-21의 용량으로 정의된다.

용어 "최적의 면역학적 반응"은 IL-21 또는 IL-21+MAb 조합의 투여 후, MAb만 단독 투여되었을 때 나타난 것을 능가하는 면역학적 반응에 있어서의 변화를 말하며, 이것은 (1) 활성화 또는 종양-특이적 CD8 T 세포 수의 증가, (2) 더 높은 수준으로 그란자임-B, 퍼포린 또는 IFNγ를 발현하는 활성화 또는 종양-특이적 CD8 T 세포 수의 증가, (3) NK 세포, 단핵구, 또는 호중구 상의 Fcγ 수용체(CD16, CD32, 또는 CD64)의 상향조절, (4) 혈청에서 가용성 CD25의 증가, (5) 종양 세포에 의해 유리된 단백질(Taro 등, J. Cell Physiol 203(1):1-5, 2005 참조), 예를 들어 암배아성 항원(CEA), IgG, CA-19-9 또는 난소 암 항원(CA125)의 혈청 수준의 감소, (6) 더 높은 수준으로 그란자임-B, 퍼포린, 또는 IFNγ를 발현하는 NK 세포 수의 증가, (7) IL-18, IL-15, IFNγ 같은 활성화 시토카인 및 IP-10, RANTES, IL-8, MIP1a 또는 MIP1b와 같은 이펙터 세포를 종양으로 돌아오게 할 수 있는 케모카인 수준의 증가, (8) 종양 부위 주변이나 종양 부위에서 활성화 대식세포 수의 증가, 여기서 활성화는 I-류 또는 II-류 MHC의 발현 증가, IL-15, IL-18, IFNγ 또는 IL-21의 생산에 의해 검출될 수 있음, 또는 (9) 적혈구 총수의 하락에 의해 암시되는 대식세포 활성(빈혈의 중증도)일 수 있다.

"폴리뉴클레오티드"는 5'에서 3'-단부를 향해 판독되는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머이다. 폴리뉴클레오티드는 RNA와 DNA를 포함하며, 자연 공급원으로부터 분리되거나, 시험관내 합성되거나, 또는 자연 분자와 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 크기는 염기쌍("bp"로 약기), 뉴클레오티드("nt") 또는 킬로베이스("kb")라고 표시된다. 문맥이 허용하는 경우, 나중의 두 용어는 단일-가닥 또는 이중-가닥인 폴리뉴클레오티드를 설명할 수 있다. 이 용어가 이중-가닥 분자에 적용되었을 때, 이 용어는 전체 길이를 나타내기 위해 사용된 것이고, "염기쌍"이란 용어와 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개 가닥은 길이가 약간 다를 수 있고, 그것의 단부는 효소 절단의 결과로서 엇갈린 모양을 할 수 있으며, 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드가 쌍을 이루지 않을 수 있다는 것을 당업자는 인정할 것이다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들의 폴리머이며, 자연 생산된 것이든지 합성 생산된 것이든지 무관하다. 약 10개 미만의 아미노산 잔기로 된 폴리펩티드는 통상 "펩티드"라고 한다.

"단백질"은 1개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 탄수화물 기 같은 비-펩티드 구성요소를 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환기는 그 단백질을 생산하는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있으며, 세포의 종류에 따라 변할 것이다. 본원에서 단백질은 그들의 아미노산 백본 구조에 의해 정의되며, 일반적으로 탄수화물 기와 같은 치환기는 나타내지 않지만, 그래도 존재할 수는 있다.

본원에서 용어 "수용체"는 생물학적 활성 분자(즉, 리간드)에 결합하여 세포에 대한 리간드의 효과를 매개하는 세포-관련 단백질을 나타낸다. 막-결합 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인 및 일반적으로 신호변환에 관련되는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 다중-펩티드 구조를 특징으로 한다. 리간드와 수용체의 결합은 수용체에 입체형태적 변화를 가져오고, 이것은 세포에서 이펙터 도메인과 다른 분자(들) 간에 상호작용을 일으킨다. 이 상호작용은 이어서 세포 대사의 변경을 이끈다. 수용체-리간드 상호작용과 연결되는 대사 사건은 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 고리형 AMP 생산 증가, 세포 칼슘 대사, 막 지질 대사, 세포유착, 이노시톨 지질 가수분해 및 인지질 가수분해를 포함한다. 일반적으로, 수용체는 막 결합 세포질 또는 핵일 수 있으며, 모노머(예를 들어, 갑상선 자극호르몬 수용체, 베타-아드레날린 수용체)거나 멀티머(예를 들어, PDGF 수용체, 성장호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 적혈구생성인자 수용체 및 IL-6 수용체)일 수 있다.

용어 "치료적 유효량"은 완전한 반응, 부분적 반응, 또는 IL-21을 사용하지 않은 단클론성 항체 요법에서의 중간 반응지속기간 이상으로 진행까지의 시간이 증가된 안정한 질환을 가져오는 IL-21 조성물 또는 단클론성 항체와 조합된 IL-21 조성물의 양으로 정의된다.

용어 "종양-관련 항원"은 비-종양 세포 상에서 발견된 항원과는 상이한 발현 프로파일을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 복합체를 말한다. 예를 들어, 비-종양 항원은 비-종양 세포에 의해서보다 종양 세포에 의해 더 높은 빈도나 밀도로 발현될 수 있다. 종양 항원은 비-종양 항원과 구조적으로 다를 수 있는데, 예를 들어 종양 항원은, 절단 폴리펩티드로서 발현될 수 있거나, 항원을 암호화하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 어떤 돌연변이를 가질 수 있거나, 미스폴링될 수 있거나, 또는 번역 후에 부적합하게 변형될 수 있다. 숙주 생물의 정상 비-종양 세포에 존재하는 항원과 유사하게, 종양 세포가 숙주의 면역학적 감시 기작을 벗어나도록 한다.

정확하지 않은 분석법(예를 들어, 겔 전기영동)에 의해 측정된 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로 이해될 것이다. 그러한 값이 "약" X 또는 "대략" X로 표현될 때, 기재된 X 값은 정확히 말해서 ±10%인 것으로 이해될 것이다.

본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고자료로 포함된다.

본 발명은 치료적 단클론성 항체와 조합된 IL-21의 투여가 단클론성 항체의 단독 투여보다 더욱 효능 있는 항-종양 활성을 가져온다는 발견에 근거한 것이다.

A. IL-21에 대한 설명

사람 IL-21(SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2)은 원래 zalpha11 리간드라고 불렸으며, 공동소유의 미국특허 No. 6,307,024 및 6,686,178에 설명되는데, 이들이 본원에 참고자료로 포함된다. IL-21 수용체(이전에 zalpha11이라고 불렸던)는 지금 IL-21R(SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6)라고 불리고, 헤테로다이머 수용체 IL-21R/IL-2Rγ가 공동소유의 WIPO 공보 No. WO 0/17235 및 WO 01/77171에 설명되며, 이들이 본원에 참고자료로 포함된다. 이들 공보에 설명된 바에 따르면, IL-21은 CD3에 대해 선택된 사람 말초혈구(hPBC)로부터 생성된 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. CD3는 림프계 기원의 세포, 특히 T 세포에 특이적인 세포 표면 마커이다.

IL-21R의 아미노산 서열은 암호화된 수용체가 I-류 시토카인 수용체 서브패밀리에 속한다는 것을 암시했고, 이것은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF 및 G-CSF의 수용체를 포함하나, 이들에 제한되지는 않는다(이 내용에 대해서는 Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily", Cytokine 5(2):95-106, 1993를 참조한다). IL-21 수용체는 NK 세포, T 세포 및 B 세포 상에서 확인되었는데, 이것은 IL-21이 조혈 계통 세포, 특히 림프계 선조세포 및 림프계 세포에 작용한다는 것을 암시한다. 림프계 세포에 작용하는 다른 공지의 4-나선-번들 시토카인은 IL-2, IL-4, IL-7 및 IL-15를 포함한다. 4-나선-번들 시토카인에 대해서는 Nicola 등, Advances in Protein Chemistry, 52:1-65, 1999 및 Kelso, A., Immunol. Cell Biol., 76:300-317, 1998을 참조한다.

IL-21에서, 분비신호 서열은 아미노산 잔기 1(Met) 내지 29(Ser)로 이루어지고, 성숙 폴리펩티드는 아미노산 잔기 30(Gln) 내지 162(Ser)로 이루어진다(SEQ ID NO:2에 나타낸 서열에서). 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1에 나타낸다. SEQ ID NO:1에 개시된 서열이 사람 IL-21의 단 하나의 대립유전자를 표시하며, 대립유전자 변형 및 다른 스플라이싱이 일어날 것이 예상된다는 것을 당업자는 인정할 것이다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드에 대해 실질적으로 유사한 서열 동일성을 갖는 분리된 IL-21 폴리펩티드, 또는 이들의 오르토로그를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 SEQ ID NO:2에 나타낸 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 오르토로그를 나타낸다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1 내지 162 또는 30 내지 162의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 더 이상으로, 본 발명은 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 동일성 퍼센트를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

일반적으로, 분자에 대해 변형을 설계하거나 특정한 단편을 확인하는 경우에는 변형된 분자의 활성을 평가함으로써 구조를 결정하는 것이 수반될 것이다. IL-21 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변형에 대한 광범한 논의는 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 No. 6,307,024 및 6,686,178을 참조한다.

또한, 본 발명은 IL-21의 기능적 활성을 갖는 분자의 투여를 포함한다. 따라서, IL-21 폴리펩티드의 기능적 단편 및 기능적 변형된 폴리펩티드 그리고 그러한 기능적 단편 및 변형된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 본 발명에 포함된다. 본원에 정의된 "기능적" IL-21 또는 그것의 단편은 증식 또는 분화 활성, 특수한 세포 기능을 유도 또는 저해하는 능력을 특징으로 하며, 특히 NK 세포, T 세포, B 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 이펙터 세포에서 그러하다. 또한, 기능적 IL-21은 시험관내 또는 생체내에서 항암 효과 및 항-바이러스 효과를 나타내는 능 력, 또는 항-IL-21 항체 또는 IL-21 수용체(가용성 또는 고정된 것)에 특이적으로 결합하는 능력을 포함한다.

또한, 다양한 폴리펩티드 융합체(및 1개 이상의 폴리펩티드 융합체를 포함하는 관련된 멀티머 단백질)가 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-21 폴리펩티드는 미국특허 No. 5,155,027 및 5,567,584에 개시된 대로, 다이머화 단백질과의 융합체로서 제조될 수 있다. 이와 관련하여, 바람직한 다이머와 단백질은 면역글로불린 불변영역 도메인을 포함한다. 면역글로불린-IL-21 폴리펩티드 융합체는 유전조작 세포(다양한 멀티머 IL-21 유사체를 생산하도록)에서 발현될 수 있다. IL-21 폴리펩티드를 특정 세포, 조직 또는 거대분자에 표적화하기 위한 보조 도메인이 IL-21 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들어, IL-21 폴리펩티드 또는 단백질은, IL-21 폴리펩티드와 표적 세포의 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 단클론성 항체를 융합함으로써 정해진 세포 종류에 표적화될 수 있다. 이 방식에서, 폴리펩티드 및 단백질은 치료나 진단 목적을 위해 표적화될 수 있다. IL-21 폴리펩티드는 2개 이상의 부분과 융합될 수 있는데, 예를 들어 정제를 위한 친화성 태그 및 표적화 도메인과 융합될 수 있다. 폴리펩티드 융합체는 또한 절단 부위를 1개 이상 포함할 수 있으며, 특히 도메인 사이에 포함할 수 있다. Tuan 등 Connective Tissue Research 34:1-9, 1996을 참조한다.

변이체 IL-21 폴리뉴클레오티드의 특정한 뉴클레오티드 서열과 관계없이, 이 폴리뉴클레오티드는 증식 또는 분화 활성, 특수한 세포 기능을 유도 또는 저해하는 능력, 또는 항-IL-21 항체 또는 IL-21 수용체에 특이적으로 결합하는 능력을 특징 으로 하는 폴리펩티드를 암호화한다. 더 구체적으로, 변이체 IL-21 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2에 나타낸 폴리펩티드의 활성의 적어도 50%, 어떤 구체예에서는 70%, 80% 또는 90% 이상을 나타내는 폴리펩티드를 암호화할 것이다.

변이체 및 융합 단백질을 포함하는 어떤 IL-21 폴리펩티드에 대해서, 당업자는 유전암호와 본 분야에 공지된 방법을 이용하여, 그 변이체를 암호화하는 완전히 퇴화한 폴리뉴클레오티드 서열을 쉽게 생성할 수 있다.

본 발명에 사용된 IL-21 폴리펩티드는 종래 기술에 따라서 유전조작된 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 외인성 DNA로 형질전환되거나 트랜스펙트될 수 있고 배양시 성장될 수 있는 종류의 세포들이며, 박테리아, 진균세포, 및 배양된 고등 진핵세포를 포함한다. 진핵세포, 특히 다세포 생물의 배양 세포가 바람직하다. 클로닝된 DNA 분자를 조작하고 다양한 숙주 세포로 외인성 DNA를 도입하는 기술은, Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕 콜드 스프링 하버, 1989), 및 Ausubel 등의 편저의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., 뉴욕, 1987)에 개시된다. IL-21을 생산하는 발현 구성물과 방법은 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 No 6,686,178 및 PCT US/03/39764에 설명된다.

치료에 사용되는 IL-21 접합체는 제약학적으로 허용되는 수용성 폴리머 부분을 포함할 수 있다. 적합한 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 모노(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 폴리-(N-비닐피롤리돈)-PEG, 트레실 모노메톡시-PEG, PEG 프로피온알데히드, 비스-숙신이미딜 카보네이트-PET, 프로필 렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 다른 탄수화물-기재의 폴리머를 포함한다. 적합한 PEG는 분자량이 약 600 내지 약 60,000일 수 있고, 예를 들어 5000, 12,000, 20,000 및 25,000을 포함한다. 또한, IL-21 접합체는 그러한 수용성 폴리머의 혼합물을 포함할 수 있다.

B. 조합 치료요법에서 IL-21과 단클론성 항체의 사용

단클론성 항체 요법의 항-종양 활성과 관련된 기작들 중의 하나는 항체-의존 세포 세포독성(ADCC)이다. ADCC에서는, 단클론성 항체가 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에 결합하고, 단클론성 항체에 대한 수용체를 발현하는 특이적 이펙터 세포(예를 들어, NK 세포, 단핵구 및 과립구)가 단클론성 항체/표적 세포 복합체에 결합하여 표적 세포를 죽인다. IL-21은 이펙터 세포 기능을 증진시킴으로써, 단클론성 항체 요법의 효능을 증가시킨다. MAb와 조합된 IL-21 투여의 용량 및 일정은, NK 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하나 이들에 제한되지는 않는, ADCC를 매개하는 세포집단의 분화 및 기능적 활성과 관련된 변수들을 상승시키는 IL-21의 능력을 기초로 한다. 이들 변수는 NK, 대식세포 및 호중구 세포 세포독성, ADCC(NK 세포 부분 또는 전체 단핵세포), 또는 ADCC를 이행하는 세포의 능력에 필수적인 이펙터 분자(예를 들어, FasL, 그란자임 및 퍼포린)에 대한 분석을 이용하여 평가될 수 있다. IL-21은 또한 MAb 및 종양 세포(예를 들어, IFNγ)와 조합되었을 때 NK 세포에 의한 시토카인 및 케모카인 생산을 증가시킨다. 또, 리툭시맵-코팅 B 세포의 "클리어런스"를 위한 Kupffer 세포의 중요성이 증명되었다(Gong 등, J.Immunol. 174:817-826, 2005). 항-종양 활성과 관련된 또 다른 기작은 MAb-코팅 종양 세포의 포식작용이다. 이것은 또한 Fc 수용체-의존성이며, 항-CD20 항체에 의한 B 고갈에 영향을 미치는 것으로 나타났다(Uchida 등, J. Exp. Med. 199(12):1659-69, 2004). MAb의 용량 및 일정은 공동-투여된 특이적 항체로 인해 야기되는 약물동태적 및 독성동태적 특성을 기초로 하며, 이들 효과를 최적화하면서 동시에 IL-21 투여와 관련될 수 있는 어떤 독성을 최소화해야 한다.

본원에 상세히 설명된 리툭시맵 및 트라스투주맵을 사용한 결과에 근거하면, 항-종양 활성을 위해 면역 이펙터 세포-매개 기작을 이용하는 다른 단클론성 항체도 역시 IL-21이 이 항체와 조합하여 사용될 때 증진될 것이다. 더욱이, IL-21이 면역 이펙터 세포-매개 항-종양 활성을 증진시키기 때문에, 단독으로 사용했을 때 제한적인 항-종양 효능을 가졌던 어떤 단클론성 항체가 IL-21과의 조합 치료요법의 좋은 후보가 될 것이다.

IL-21과 단클론성 항체를 사용한 조합 치료요법은 1차 라인 치료제에 실패하고 2차 라인 치료제를 고려하고 있는 경우 처방될 수 있다. 그러나, 단클론성 항체와 조합된 IL-21의 증진된 항-종양 활성에 근거해서, 본 발명은 또한, 이전에 항암제로 치료된 적이 없는 최근에 진단된 환자 집단("드 노보 환자") 및 이전에 어떤 단클론성 항체 요법도 받은 적이 없는 환자("나이브 환자")에서 이 조합을 1차 라인 치료제로서 이용하는 것을 제공한다.

또한, IL-21은 종양 세포의 어떤 직접적인 항체-매개 ADCC가 없을 때도 단클론성 항체와의 조합 치료요법에 유용하다. 면역 시스템에서 저해신호를 차단하는 항체는 증대된 면역반응을 가져올 수 있다. 예들은, (1) 세포독성 T 림프구-관련 항원 4(CTLA-4), 프로그램된 사멸-1(PD-1), B 및 T 림프구 감쇠인자(BTLA)와 같은 저해 기능을 갖는 B7R 패밀리의 분자에 대한 항체; (2) IL-10, TGFβ 같은 저해 시토카인에 대한 항체; 및 (3) 항-CD25 또는 CTLA-4와 같은 억제세포의 기능을 고갈 또는 저해하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 항-CTLA4 MAb는 마우스와 사람 모두에서 면역-억제 조절 T 세포(Treg)의 기능을 억제하거나, 또는 T 세포 상의 CTLA-4와 APC 또는 종양 세포 상의 B7-1이나 B7-2 분자의 결합을 통해 전달된 억제신호를 저해한다고 생각된다. CTLA-4는 활성화 T 세포의 표면에서 일시적으로 발현되고, Treg 세포 상에서 구성적으로 발현된다. 교차결합 CTLA-4는 활성화 T 세포에 대한 저해신호를 이끌어 내고, CTLA-4에 대한 항체는 T-세포에 대한 저해신호를 차단하여 지속적인 T 세포 활성화를 가져온다(Phan 등, PNAS, 100:8372-8377, 2003). 마우스 모델에서 항-CTLA-4 치료는 활성화된 종양-특이적 CD8 T 세포와 NK 세포의 수를 증가시키며, 그 결과 효능 있는 항-종양 반응을 가져온다. IL-21에 대한 수용체(IL-21R)가 이들 이펙터 세포 상에서 발현되며, IL-21은 IL-21R을 통해 이들 세포를 활성화함으로써 그들의 이펙터 기능을 더 증대시킬 수 있다. 이것은 더욱 효능 있는 항-종양 활성을 가져올 수 있다. CTLA-4에 대한 차단 항체를 환자에게 투여하는 임상 시험이 흑색종, 난소암 및 전립선암에서 진행중이다. 그러나, 효능이 심각한 부작용들과 서로 관련되었으므로(US 2004/0241169 참조), 덜 독성인 치료를 얻는 조합 치료요법이 유리할 것이다.

표 1은 승인되거나 또는 IL-21과의 조합 치료요법이 가능한지 시험중인 단클 론성 항체의 비-배타적 리스트이다.

1. IL-21 및 항- CD20 단클론성 항체

CD20은 사람 B 림프구 제한 분화 항원이고, 35kD 단백질인 B 세포 표면 항원 Bp35로 발현된다. CD20은 말초 B 세포 상에서 발견되며, 혈장세포 단계까지 성숙한 B 세포 상에서 확인될 수 있다(Reff 등, Blood 83:435-445, 1994). 항-CD20 단클론성 항체(MAb)가 임상에서 시험되었으며, 비-호지킨 림프종(NHL)의 치료를 위해 적어도 1개의 사람화 항-CD20 MAb, 리툭시맵이 승인되었다. 리툭시맵(RITUXAN

)은 림프종 세포에 결합하며, 시험관내에서 직접 세포자살을 유도할 수 있고, 또 보체 의존 세포독성 및 항체 의존 세포-매개 세포독성 같은 다양한 이펙터 기작을 유도할 수 있다(Shan 등, Blood 91:1644-1652, 1998). 리툭시맵은 일반적으로 NHL의 1차 라인 치료제로 사용된다(Maloney 등, Blood 90:2188-2195, 1997; 미국특허 No. 5,736,137).

리툭시맵은 뮤린 경쇄 및 중쇄 가변영역과 사람 감마 I 중쇄 및 kappa 경쇄 불변영역을 갖는 유전조작된 MAb이다(미국특허 No. 6,455,043). 이 키메라 항체는 451개 아미노산의 2개 중쇄와 213개 아미노산의 2개 경쇄로 이루어지고, 대략적인 분자량이 145kD이다. 전임상 실험에서 이 항체는 용량-의존 방식으로, B 세포 라인 FL-18, Ramos 및 Raji에서 세포성장을 저해했고, DHL-4 사람 B 세포 림프종 라인에서 세포자살을 유도했다(Demidem, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 12:177-186, 1997). 이 MAb는 혈청에서 비교적 긴 반감기를 갖는 것으로 나타났으며, 독성 프로파일은 비교적 낮다.

그러나, 상당한 환자 집단이 시간의 경과에 따라 항-CD20 항체를 사용한 치료에 대해 불응하거나 내성이 되며, 심지어 골수 또는 줄기세포 이식, 방사선요법 및 화학요법과 같은 다른 치료와 조합되었을 때도 그러하다. 이들 환자는 일반적으로 항-CD20 항체의 투여 후에 감지할 정도의 종양 완화나 퇴행을 나타내지 않으므로, 항체에 대한 반응성을 증진시키는 새로운 치료요법이 이로울 것이다. 게다가, 증진된 항-종양 활성은, 이전에 항암제로 치료된 적이 없는 최근에 진단된 환자 집단("드 노보 환자") 및 이전에 어떤 단클론성 항체 요법도 받은 적이 없는 환자("나이브 환자")에도 역시 이로울 것이다.

앞서 말한 대로, IL-21은 NK 세포 수를 늘리고 NK 세포와 T 세포의 세포독성 효과를 강화하는 것으로 나타났다. 더욱이, IL-21에 대한 수용체가 단핵구, 수지상 세포, B 세포, T 세포 및 NK 세포 상에서 확인되었다(Parrish-Novak, J. Leuk. Biol. 72:856-863, 2002). IL-21이 생체내 T 세포 및 B 세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 미친다는 것이 추가의 증거에 의해 증명되었다. 많은 사람 B 세포 종양 라인이 SCID 마우스에 접목되어 국소 또는 파종성 방식으로 성장될 수 있다. 이들 모델에서 숙주 마우스의 종양 성장 또는 생존 시간을 측정하는 것이 B 세포 암에 대한 잠재적인 치료 효능을 평가하는 수단을 제공한다(Bonnefoix 등, Leukemia and Lymphoma 25:169-178, 1997).

면역-기반 세포(NK 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하는)에 의한 ADCC를 통해 항체가 항-종양 효과를 매개할 때, 항체 복합체에 의해 결합된 암 세포가 면역 이펙터 세포에 의해 사멸된다. IL-21을 사용하여 항체 요법의 유효성을 증진시킬 수 있으며, 이는 부분적으로 그것의 면역조정 활성 때문이다. 리툭시맵과 시토카인을 사용한 조합 치료요법이 IL-2, IL-12, 또는 INFα를 이용하여 호지킨 림프종과 비-호지킨 림프종의 치료에 대해 조사되었다(Keiholz 등 Leuk. Lymphoma 35:641 -2, 1999; Ansell 등 Blood 99:67-74, 2002; Carson 등, Eur. J. Immunol. 31:3016 -25, 2001; 및 Sacchi 등, Haematologica 86:951-8, 2001).

ADCC의 이펙터, 특히 NK 세포를 활성화하고 분화하는 IL-21의 능력에 근거해서, IL-21과 항체를 조합하고, 시토카인 생산, 세포독성 및 종양 클리어런스를 평가하는 시험관내 및 생체내 연구가 수행되었다. 시험관내 연구에서는 IL-21 및 항체에 노출한 후 사람 NK 세포에 의한 시토카인 생성과 종양 세포 용해를 분석했다. 예를 들어, 말초혈액 백혈구로부터 분리된 NK 세포를 이용하여 종양 세포의 용해를 평가할 수 있다. DOHH2, Raji 또는 Ramos 같은 사람 B 세포 림프종 셀라인을 칼세인-AM 또는 ⁵¹Cr로 로딩하고 IL-21에 1-7일간 노출한 다음 NK 세포-매개 세포용해를 측정한다. 다른 분석은 시토카인 생산을 측정하는 것이다. 이들 분석에서는 전형적으로 정제된 NK 세포를 IL-21에 노출하고 평판 부착 IgG와 함께 시험관내 배양한다. INFγ, TNFα 및 IL-10과 같은 시토카인의 존재가 측정된다. 이런 종류의 분석들에 대한 상세한 설명은 실시예 부문에서 찾을 수 있다. 본원에서는 종양 시험감염 후 마우스의 생존을 모니터하는 생체내 연구가 교시된다. 생체내 연구의 다른 가능한 종점은 체중손실, 종양 덩어리 축소 또는 뒷다리 마비(HLP)를 포함한다. 실시예 부문에 상세히 나타낸 대로, 이들 실험의 결과는 CD20+ B 세포 종양에 대한 항-종양 활성이, 리툭시맵 또는 IL-21의 단독사용보다 리툭시맵과 IL-21의 조합사용시에 상당히 더 컸다는 것을 증명했다. 영장류를 포함하는 추가 동물 모델에서의 더 이상의 실험은 리툭시맵-매개 효과의 IL-21 증진에 대한 추가 증거를 제공하며, 이것은 림프종 환자에서 이 조합을 시험하는 근거가 된다.

B 세포, T 세포, NK 세포 및 수지상 세포와 이들의 선조를 포함하는 림프구는 여러 림프계 및 비-림프계 조직을 여기저기 이동하는 것을 포함하는 라이프 사이클을 가진다. 모든 림프구는 골수에 주재하는 다-효능 림프계 선조로부터 성숙한다고 여겨진다. 나이브 림프구는 이 세포가 죽거나 항원에 의해서 활성화될 때까지 혈액과 2차 림프계 조직 사이를 순회한다. B 또는 T 세포가 항원에 의해 활성화되었을 때, 활성화된 세포는 혈액으로 재순환된다. 림프구가 왕래하는데 케모카인이 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 증거가 있다. CXCR3 같은 특이적 케모카인의 발현이 악성 B 세포가 한 부위에서 다른 부위로 왕래하는 것을 촉진한다고 생각되며, 이로써 B 세포 림프종이 말초혈액, 림프절, 골수 및 다른 기관들로 이동하는데 역할을 한다(Trentin 등, J. of Clinical Invest. 104:115-121, 1999). 리툭시맵은 말초혈액과 말초 림프절에 존재하는 B 세포를 고갈시키는 것으로 나타났으며(Reff 등, Blood 83:435-445, 1994), CD20+ 세포를 이들 조직으로 보내는 제제의 투여는 이전에 접근하기 어려웠던 악성 세포를 리툭시맵-매개 사멸에 더욱 민감하게 하는 기작을 제공할 것이다. IL-21은 B 세포에 대해 직접 효과와 간접 효과를 모두 갖는 것으로 나타났고(Parrish-Novak 등, J. Leukoc. Biol. 72:856-863, 2002; Mehta 등, J. Immunol. 170:4111-4118, 2003; Ozaki 등, J. Immunol. 173: 5361-5371, 2004), 어떤 면역세포에서 성숙 과정에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다(Sivakumar 등, Immunol. 112:177-182, 2004).

본원에 개시된 실험은, IL-21의 투여가 초기에 순환하는 B 세포, T 세포 및 NK 세포를 감소시켰으며, 그 후 다음번 투약 사이클 전까지 지속적인 증가 및 용해가 있었다는 본 출원인의 발견을 설명한다. 림프구 감소증과 림프소절 고갈의 빠른 역전현상은 림프계 조직에서 혈액으로의 재순환 증가와 조합된 활성화 림프구의 일시적 변연화(margination)로서 이해될 수 있다. 말초 B 세포에서의 이런 증가는 IL-21과 리툭시맵이 투여되었을 때 완화되었으며, 이와 일치하여 IL-21이나 리툭시맵 중 어느 하나만 투여했을 때 보였던 것보다 더 낮은 B 세포 최하점이 관찰되었다. 따라서, IL-21은 리툭시맵에 의한 B 세포 고갈의 잠재력을 증진시키며, 이로써 고갈에 민감한 B 세포의 재순환을 촉진한다. 더욱이, IL-21의 투여는 ADCC 활성을 증진시켰고, NK 세포 및 ADCC 분석을 수행했을 때 드러난 FcγRI와 FcγRIII를 발현하는 포식세포의 수를 증가시켰다.

호중구는 이종 B 림프종 모델에서 리툭시맵의 항-종양 활성에 중요한 것으로 나타났다(Hernandez-Ilizaliturri, Clin. Cancer Res. 9(16 Pt.1):5866-73, 2003). mIL-21+리툭시맵의 항-종양 활성에서 과립구의 역할은 항-GR-1 MAb로 고갈시킴으로써 나타난다. 실시예 10에 설명된 대로, 과립구-고갈 및 비-고갈 SCID 마우스 그룹을 Raji 세포로 시험감염시킨 다음, 리툭시맵만 사용하여 치료하거나, 리툭시맵+mIL-21을 사용하여 치료했다. 과립구 고갈은 리툭시맵 단독 치료된 SCID 마우스와 리툭시맵+mIL-21로 치료된 SCID 마우스의 생존을 감소시켰다. 조합 치료요법으로 치료된 군들을 비교하면, 과립구-고갈 동물에서 125일 후 생존 비율은 0.67에서 0.0으로 감소하였다. 그러나, 부형제 대조표준에 비해 사망까지의 평균시간(TTD)이 상당히 지연되는 것이 분명하므로, 과립구 고갈이 IL-21+리툭시맵의 생존 이익을 전부 없앤 것은 아니었다.

대식세포가 IL-21 수용체를 발현하고(Pelletier, J. Immunol. 173(12):7521-30, 2004), 항-CD20 MAb에 의한 B 세포 고갈에서 역할을 한다(Uchida 등, J. Exp. Med. 199(12):1659-69, 2004)는 것이 최근에 밝혀졌다. 클로드로네이트 리포솜을 이용하여 SCID 마우스에서 대식세포를 고갈시켰고, IL-21+리툭시맵을 파종성 Raji 림프종 모델에서 시험했다. 클로드로네이트 리포솜을 사용하여 고갈시킨 결과 간에 있는 F4/80+ 세포의 95%와 비장의 적색속질에 있는 F4/80+ 세포의 90%가 제거되었다. Raji 세포를 주입하고 3일 후에 대식세포를 고갈시켰고, 클로드로네이트 리포솜 주사를 반복하여 종양 세포 주입 후 적어도 27일까지 대식세포 고갈을 유지하였다. 대식세포 고갈은 역시 mIL-21+리툭시맵의 효능을 감소시켰다. 클로드로네이트 리포솜 치료 그룹에서 평균 TTD가 상당히 줄어들었다. 또한, 상응하는 비-고갈 마우스 군과 비교했을 때, 리툭시맵만으로 치료된 대식세포-고갈 SCID 마우스에서 중간 생존 시간에 극적인 하강이 있었다.

항-Gr-1을 사용한 호중구 고갈은 다른 연구자들에 의해 보고된 것과 마찬가지로 리툭시맵 단독사용의 효능을 극적으로 감소시켰으며(Hernandez-Ilizaliturri, 상동, 2003), 실험은 IL-21+리툭시맵 치료 후 마우스 생존 비율이 0.67에서 0.0으로 감소했다는 것을 나타냈다. IL-21은 직접 작용하여 마우스 호중구에 영향을 미치고, 차례로 종양 세포에 포식작용을 하거나, ADCC를 이행하거나, 또는 세포독성 산소 중간체를 생산할 수 있다. 그러나, 호중구에 대한 IL-21의 직접 작용이 사람 호중구의 연구(Pelletier, 상동)에 의해 뒷받침된 것은 아닌데, 이 연구에서는 IL-21Rα가 검출되지 않았고, IL-21이 슈퍼옥시드 생산, 포식작용, 화학주성 및 시토카인 생산을 포함하는 호중구 반응을 조정하지 않았다. 대신, 이 저자들은 IL-21이 호중구 화학주성 및 활성화를 가져올 수 있는 사람 대식세포에 의한 IL-8 생산을 유도했다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 본 발명을 뒷받침하는 실험이 수행되었을 때, 클로드로네이트 리포솜을 사용한 대식세포 고갈은 IL-21과 리툭시맵에 의해 나타난 상승작용적 항-종양 활성의 부분적인 손실만을 가져왔을 뿐이다. 이런 결과는, SCID 마우스에서 호중구와 대식세포가 모두 조합 치료요법으로 생존을 연장하는데 역할을 한다는 것을 시사했다. 또한, 항-CD20 MAb로 정상 B 세포를 고갈시킨 최근 연구(Uchida 등, 상동)가, 마우스 대식세포가 필수적인 주요 이펙터 세포이고 NK 세포는 필수적인 것이 아님을 밝혀냈지만, 이 연구에서 호중구는 조사되지 않았다.

이들 발견은, 리툭시맵과 조합된 IL-21이 이종 B 림프종 모델에서 상승작용적 항-종양 활성을 가지며, 선천적인 면역 이펙터 세포가 IL-21와 리툭시맵의 상승작용적 효과를 매개하는 것을 돕는다는 것을 증명한다. 이들 결과는 SCID 마우스에서 호중구와 대식세포가 모두 조합 치료요법으로 생존을 연장하는데 역할을 한다는 것을 시사한다. IL-21은 NHL에 대한 리툭시맵의 항-종양 활성을 촉진하고, 대식세포, NK 세포, T 세포 및 림프종 종양 자체에 대한 IL-21의 작용은 리툭시맵 치료에 대한 반응을 개선한다.

따라서, 본 발명은, 환자에게 리툭시맵과 조합하여 IL-21을 투여함으로써 림프종을 가진 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이 경우 조직으로부터 악성 세포의 유리가 리툭시맵-매개 항-종양 활성에 필요하다. 더욱이, 환자의 말초혈액에 리툭시맵이 존재하는 동안 IL-21의 수준을 유지하는 투약 섭생이 유리할 것이며, 이것은 본 발명에 포함된다. 어떤 구체예에서, 본 발명은, 사람의 말초혈액에 리툭시맵이 존재할 것으로 측정된 치료기간 동안 IL-21을 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 환자에서 림프종을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은, 환자가 리툭시맵 치료를 받는 동안 매주 1회 내지 3회 IL-21을 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 환자에서 림프종을 치료하는 방법을 제공한다.

가장 일반적으로 사용되는 비-호지킨 림프종의 분류법은 REAL 분류 시스템이다(Ottensmeier, Chemico-Biological Interactions 135-136:653-664, 2001). 림프종들을 분류하기 위한 특이적 면역학적 마커들이 확인되었다. 예를 들어, 여포성 림프종 마커는 CD20+, CD3-, CD10+, CD5-를 포함하고; 소 림프구성 림프종 마커는 CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+를 포함하고; 변연부 B세포 림프종 마커는 CD20+, CD3-, CD10-, CD23-를 포함하고; 미만성 대 B세포 림프종 마커는 CD20+, CD3-를 포함하고; 외투세포 림프종 마커는 CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+를 포함하고; 말초 T 세포 림프종 마커는 CD20-, CD3+를 포함하고; 원발성 종격동 대 B 세포 림프종 마커는 CD20+, CD3-를 포함하고; 림프모구성 림프종 마커는 CD20-, CD3+, Tdt+를 포함하고; 버킷 림프종 마커는 CD20+, CD3-, CD10+, CD5-를 포함한다(Decision Resoures, Non-Hodgkins Lymphoma, 매사츄세츠 월덤, 2002년 2월).

인터내셔날 워킹 포뮬레이션(International Working Formulation)에 의한 비-호지킨 림프종(NHL)의 임상 분류는 질환을 다음의 서브타입으로 분류한다: (1) 낮은 등급(무통성)질환, 이것은 소 림프구성, 만성 림프구성 백혈병과 유사(SC); 여포성, 주로 소분할 세포(FSC); 여포성, 소분할 및 대세포 혼합(FM)을 포함; (2) 중간 등급 질환, 이것은 여포성, 주로 대세포(FL); 미만성, 소분할 세포(DSC); 미만성, 소 및 대세포 혼합(DM); 미만성, 대분할 또는 비분할 세포(DL)을 포함; 및 (3) 높은 등급 질환, 이것은 면역모세포성, 대세포(IBL); 림프모구성, 회선형 및 비회선형 세포(LL); 및 소 비분할 세포, 버킷 또는 비-버킷(SNC)을 포함한다(The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project, Cancer 49(10):2112-35, 1982). Ann Arbor 병기분류 시스템이 NHL을 갖는 환자의 병기를 나누는데 일반적으로 사용된다. I 기는 단일 림프절 영역의 병발 또는 단일 림프외 기관이나 부위의 국소적 병발을 의미한다. II 기는 횡경막의 동일면 상에서 두 군데 이상의 림프절 영역의 병발 또는 절외 부위나 기관과 횡경막의 동일면 상에서 한 군데 이상의 림프절 영역의 국소적 병발을 의미한다. III 기는 횡경막의 양쪽 면 상에서 림프절 영역의 병발을 의미하며, 절외 기관이나 부위의 국소적 병발을 수반할 가능성이 있다. IV 기는 한 군데 이상의 먼 절외 기관의 미만성 또는 파종성 병발을 의미하며, 관련된 림프절의 병발이 있을 수도 있다("Lymphoid neoplasms.", American Joint Committee on Cancer.: AJCC Cancer Staging Manual. 6판. New York, NY: Springer, 2002, pp 393-406). 리툭시맵은 무통성 및 여포성 림프종을 치료하는데 효과적이라고 알려졌다(Boye 등, Annals of Oncol. 14:520-535, 2003).

사람의 혈액종양질환으로부터 유래된 종양 세포의 성장 및 파종에 대한 항-CD20 항체와 조합된 IL-21의 활성이 생체내에서 측정될 수 있다. 면역결핍 마우스에 사람 종양 세포를 이식한 몇몇 마우스 모델이 개발되었다(집합적으로 이종이식 모델이라고 한다); 예를 들어, Cattan 등, Leuk.Res. 18:513-22, 1994 및 Flavell, Hematological Oncology 14:67-82, 1996를 참조한다. 이 질환 모델의 특성은 마우스에 송달된 세포의 종류와 양에 따라 변화하며, 몇몇 질환 모델이 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, SCID 마우스에서 성장되고 파종된 사람 B 세포 림프종(예를 들어, RL, Raji, TU2C)은 당업자에게 공지된 모델을 이용하여 MAb와 IL-21로 치료됨으로써 생존이 연장될 수 있다. 전형적인 모델에 대해서는, Funakoshi 등, J. Immunotherapy 19:93-101, 1996; Funakoshi 등, Blood 83:2787-94, 1994; Cattan 등, Leukemia Res. 18:513-522, 1994를 참조한다. 또는 달리, 마우스 B 세포 림프종 셀라인(A20, BCL, A31)이 이식되고, MAb와 IL-21로 치료됨으로써 생존이 연장될 수 있다(French 등, Nat. Medicine 5:548-553, 1999; Tutt 등, J. Immunol. 161: 3176-3183, 1998). 한 모델에서, 종양 세포(예를 들어, Raji 세포(ATCC No. CCL-86))는 배양을 거쳐 약 1x10¹⁶ 세포로 중증 복합형 면역결핍(SCID) 마우스에 정맥내 주사되었다. 그러한 종양 세포는 동물 안에서 빨리 증식하며, 혈액 내를 순환하고 수많은 기관 시스템에 자리 잡은 것을 발견할 수 있다. 종양 세포를 지닌 마우스에 IL-21과 MAb를 투여함으로써 IL-21과 항-CD20 MAb를 이용하여, 종양 세포를 죽이거나 성장을 감소시키도록 설계된 치료요법을 시험한다. 시간 경과에 따른 치료 집단 내에서의 생존 증가로서 치료 효능을 측정하고 통계적으로 평가한다. 또한, 유세포분류법(또는 PCR)과 같은 공지의 방법을 이용해서 시간 경과에 따른 종양 부하를 모니터하여 말초혈액 샘플에 존재하는 종양 세포의 수를 정량한다.

IL-21과 항-CD20 MAb를 사용하는 조합 치료요법의 효능을 증명하는데 사용될 수 있는 동물 모델은 B-세포가 고갈된 비-사람 영장류 모델을 포함한다. 예를 들어, 부형제, 0.05mg/kg 또는 10.0mg/kg 리툭시맵으로 사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이를 치료함으로써, 항-CD20 치료법을 연구하는데 다양한 B 세포 CD20, CD40 및 CD21 집단이 유용한 것으로 확인되었다(Vugmeyster 등, Intemat. Immunol. 3:1477-1481, 2003.

무통성 질환을 위한 리툭시맵 치료는 일반적으로 375mg/m²을 매주 1회씩 4번 주입하는 것으로 구성된다. 초기 주입속도는 50mg/hr이고, 30분 마다 50mg씩 증가시키면서 최대 400mg/hr까지 차츰 확대한다(McLaughlin 등, Clinical Oncol. 16: 2825-2833, 1998). 그러나, 8주까지 연장된 치료가 불응성이거나 재발된 낮은 등급 NHL이나 여포성 NHL 치료에서 어떤 효능을 나타냈다(Piro 등, Ann. Oncol. 10: 619-621, 1999).

IL-21과 항-CD20 MAb 조합 치료요법에 대한 최적의 용량 수준과 일정을 확립하는 것은, 이 조합의 약물동태학 및 약물역학, IL-21과 항-CD20 MAb의 조합에 대한 사람 B 세포 림프종 라인 및 원발성 림프종 견본의 시험관내 민감도, 동물 모델에서의 효과적인 용량 및 이 조합의 독성을 포함하는 많은 수단을 이용하여 행해진다. 직접적인 약물동태 측정이 영장류에서 행해질 수 있다. 게다가, IL-21 및 항-CD20 MAb는 정상 림프구에서도 다양한 반응을 자극하므로, 정상 동물 모델에서도 임상 효능이 측정될 수 있다. 더욱이, 대용 마커를 이용하여, 환자에서 이펙터 세포에 대한 IL-21과 항-CD20 MAb 조합의 생물학적 활성을 측정할 수 있다. 대용 마커는 B 세포 집단의 현저한 감소, NK 세포 집단의 증가, 단핵구/대식세포 활성화, FcRIII 증가, 항-CD20 항체의 존재하에 CD20+ 세포 상에서 NK 또는 T 세포의 세포독성 증가를 포함하며, 이들에 제한되지는 않는다. 생존 증가와 같은 치료적 종양 반응은 측정되기까지 수개월 내지는 수년이 필요할 수 있기 때문에, 대용물은 효능의 징표로서 가치가 있다.

IL-21과 리툭시맵의 조합을 사용한 NHL 또는 만성 림프모구성 백혈병(CLL)과 같은 림프종의 치료는 안전성 및 효능이 조사되는 임상 연구를 이용하여 증명된다. 초기에, 안정성은 최대 내용량(MTD) 또는 최적 면역학적 용량이 확인될 때까지 용량을 차츰 확대하는 개방형 임상 연구(open-label study)인 I 단계 연구에서 증명된다. 최적 면역학적 용량은 최적의 면역학적 반응을 달성하는 IL-21 또는 단클론성 항체와 조합된 IL-21의 용량으로서 확인된다. 최적의 면역학적 반응이란 IL-21 또는 IL-21+MAb 조합의 투여 후, MAb만 단독 투여되었을 때 나타난 것을 능가하는 면역학적 반응에 있어서의 변화를 말하며, 본원에 설명된 대로 측정될 수 있다.

초기 I 단계 연구의 참가자들은 재발된 또는 불응성 CD20+ NHL을 가진 대상자들이다. 기본 3명+3명으로 용량의 단계적 확대안에 따라서, 3 내지 6명 대상자의 코호트들에서 용량의 단계적 확대가 평가된다. 대상자 3명의 코호트는 14주가 끝날 때까지 발생하는 어떤 용량-제한 독성(DLT)에 대해서 평가된다. DLT이 없을 때에는 용량의 단계적 확대를 진행한다. 대상자 3명 중 1명에서 용량-제한 독성이 관찰되었다면, 추가 대상자 3명은 그 용량 수준으로 기록된다. 제공된 코호트에서 1명을 초과하는 대상자가 용량-제한 독성을 경험한 경우, 용량의 단계적 축소를 진행하고, 3명 대상자는 안전성 모니터링 위원회(SMC: Safety Monitoring Committee)에 의해 지정되는 중간 용량으로 치료된다. 이 용량은 DLT를 도출했던 용량과 그 다음 낮은 용량 사이에 있을 것이다. 3명의 대상자 중 아무도 중간 용량에서 DLT를 경험하지 않은 경우, 기록을 멈추고 이 중간 용량을 MTD로 선언한다. 3명의 대상자 중 1명 이상이 중간 용량에서 DLT를 경험한다면, 기록을 멈추고 그 이하의 용량 수준을 MTD로 선언한다.

대상자에게는 매주 1회 375mg/m²의 리툭시맵이 정맥내(IV) 투여되고, 4주 또는 8주 연속 투여된다. IL-21은 IV, 또는 근육내(IM) 또는 피하(SC) 투여 경로에 의해 주사에 의해서 제공된다. 처음에 코호트에는 적어도 1㎍/kg을 제공하고, MTD 또는 최적 면역학적 용량까지 단계적 방식으로 용량을 차츰 확대하는데, 예를 들어 매주 1회 내지 5회 3-10, 10-100, 100-300, 300-500, 500-900 및 1000㎍/kg까지 증가시킨다. 본 발명은, 각 용량이 약 1㎍/kg 내지 1000㎍/kg의 범위에 있는 IL-21 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서 IL-21 용량은 10 내지 300㎍/kg의 범위 내에 있다.

1차 임상 활성을 평가하는데 종양 반응이 이용된다. 항-종양 반응을 평가하기 위해서, 예를 들어 비-호지킨 림프종에 대한 반응 기준을 표준화하기 위한 국제 워크숍(Cheson 등, J. Clin. Oncol. 17:1244-1253, 1999)을 이용하여, 4주, 8주 및 12주에서 병기분류를 다시 진행한다. IL-21의 약물역학적 마커가 임상 활성의 2차 징표로 사용된다.

부작용 및 2차 안정성의 실험실 평가를 이용하여 안정성을 평가한다. 면역원성을 평가하기 위해 IL-21에 대한 항체의 혈청 분석을 수행한다.

용량-제한 독성은 Common Terminology Criteria for Adverse Events(CTCAE), 버전 3(2003년 12월 12일)을 이용하여 다음 중 어느 것으로 정의된다:

* 어떤 4 또는 5 등급 부작용, 제제를 연구하는데 관련될 가능성이 있거나 확실히 관련됨.

* 비-혈액성 3 등급 부작용, 제제를 연구하는데 관련될 가능성이 있거나 확실히 관련됨, 단 7일 이하의 지속기간을 갖는 림프구 감소증, 종양 발적, 열, 권태감, 또는 임상적으로 중요하지 않은 3 등급의 생명을 위협하지 않는 실험실적 비정상성에 관련된 것들은 제외.

II 단계 및 III 단계 임상 연구에서는 효능 및 안정성이 더 평가된다. 이들 연구에서 추가로 약물동태학, 약물역학, 약물유전학, 약물유전체학, 면역원성이 특성화될 수 있다. 비-호지킨 림프종에 대한 반응 기준을 표준화하기 위한 국제 워크숍(Cheson 등, 상동) 및 규제 지침서에 따라 1차 종점이 확인된다. 2차 종점은 부작용의 발생빈도 및 심한정도, 진행까지의 시간, 완전 반응자에 대해 재발까지의 시간, 전체적인 생존, 및 IL-21에 대한 어떤 항체 발생의 발생빈도를 포함할 수 있다. 이 연구는 화학요법을 견딜 수 없거나 화학요법을 받도록 선택되지 않은 환자에서 리툭시맵 단독 치료요법과 리툭시맵과 IL-21의 조합을 비교하는 무작위, 2-부문 연구일 수 있다. 대상자들은 리툭시맵을 받는데, 이것은 매우 1회 375mg/m²으로 정맥내 투여되고, 4주 또는 8주 연속하여 투여될 것이다. IL-21은 동일한 날짜에 후속 주입하기 시작해서 5일까지 연속하여 정맥내 또는 피하 투여되며, IL-21 용량은 1-3, 3-10, 10-100, 100-300, 300-500, 500-900 및 1000㎍/kg의 범위일 것이다. 또는 달리, 시험 설계에 대해서 유사한 기준을 이용하여 IL-21과 리툭시맵의 조합사용 대 IL-21 단독사용 대 리툭시맵 단독사용의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 무작위 3-부문 연구가 개시될 수 있다. 임상 시험의 설계에 대한 것은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 식품의약국(FDA)에 의해, 예를 들어 FDA 종양학 툴 웹사이트에 가이드라인이 제공된다.

IL-21과 IL-15 또는 IL-2는 IFN-γ 생산 세포독성 및 증식과 관련하여 시험관내에서 NK 세포에 대한 그들의 효과에 상승작용을 나타낸다(Parrish-Novak 등 J. Leuk. Biol. 72:856-863, 2002). 그러나, 고용량 IL-2 치료요법은 매우 독성이며 오랜 입원을 요한다. IL-2의 많은 저용량 섭생이 시험되었고, 더욱 잘 견딜 수 있다고 밝혀졌지만, 항-종양 효과에 대한 증거는 거의 없었다(Atkins, Semin. Oncol. 29(3 Suppl. 7):12, 2002). IL-2과 리툭시맵 조합 치료요법은 WO 03/049694에서 설명되며, 여기서 IL-2은 높은 "부하" 용량으로 투여되고, 이어서 1회 이상의 낮은 "유지" 용량이 투여된다. IL-2의 투약을 계속할 필요는 NK 세포 수준이 정상 수준보다 높게 유지되는가에 기초하지만, IL-2의 독성으로 인해, IL-2가 투여되지 않는 휴지기가 필요할 수 있다. 항-CD20 MAb에 더하여, IL-2과 IL-21의 조합의 투여는 NK 세포를 유지하고 IL-2의 더 낮은 또는 덜 빈번한 투약을 허용할 것이다. 고용량 IL-2에서 보인 어떤 부작용은 IL-21이 투여되었을 때는 나타나지 않았다. 예를 들어, 마우스에서 혈관누출 증후군을 일으킨다고 보고된 IL-2의 용량 및 일정으로 IL-21이 마우스에 투여되었을 때, 혈관누출 증후군은 존재하지 않았다. 이 결과는 IL-21이 마우스에서 rIL-21의 동등한 질량-기준 용량과 관련된 시토카인 방출 및 혈관염을 도출하지 않았다는 것을 분명히 나타낸다(Heipel 등, Blood 102(11): No. 2845, 2003). 따라서, 저용량 IL-2와 IL-21 및 항-CD20 MAb의 조합은 고용량IL-2에 의해 일어나는 어떤 부작용 없이 저용량 IL-2의 면역 시스템 자극을 증대시킴으로써 임상적으로 유용할 수 있다.

본 발명의 방법을 사용한, 리툭시맵 같은 항-CD20 MAb와 조합된 IL-21의 투여는, 종양 반응이라고도 하는 항-종양 효과를 가져올 것이다. NHL의 치료요법에 대한 반응을 평가하는데 있어서의 표준화된 가이드라인이 당업자에게 공지되어 있다. 전형적인 세트의 일률적인 기준이 Cheson 등 J. of Clinical Oncol. 17:1244-1253, 1999에 설명된다. 국제 연구 그룹은 반응 측정에 대한 권장사항 및 정의를 제시한다. 표 2에 반응 기준을 요약한다.

또한, 증진된 항-종양 활성을 암시하는 대용 마커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈청 효소의 변화와 생체검사가 종양 부하를 나타낼 수 있다.

항-종양 효과의 대용물로서 사용될 수 있는 생물학적 활성의 한 가지 척도는 항-CD20 MAb의 항-종양 효과를 증진시키는 수준에서 NK 세포 수준이 유지되는 것이다(Friedberg 등, Br. J. Hematol. 117:828-834, 2002). 다른 대용물은 T 세포 수 증가이다(Parrish-Novak 등, 상동, 2002). 특히, T 세포 서브셋에서 세포 수의 증가는 증가된 세포독성 활성 또는 항-종양 효과와 서로 관련된다. 항-종양 효과의 대용물로서 사용될 수 있는 생물학적 활성의 또 다른 척도는 B 세포 고갈이다(Reff 등, Blood 83:435-445, 1994).

2. 조합 치료요법에서 IL-21과 항-Her-2/ neu 단클론성 항체의 사용

Her-2/neu 유전자 산물은 상피 성장인자 수용체와 관계있는 185kDa 인산화당단백질(phosphosglycoprotein)이다. Her-2/neu은 성장인자 수용체로 기능하며, 유방암, 난소암 및 폐암과 같은 종양에 의해 주로 발현된다. Her-2/neu 수용체는 사람 유방암의 25-30%에서 과발현되고(Slamon 등 Science 235:177-182, 1987; Slamon 등, Science 244:707-712, 1989), 이들 환자에서의 불량한 예후에 관련된다.

Her-2/neu을 표적화하는 많은 단클론성 항체가 있지만, 트라스투주맵의 상표명인 HERCEPTIN

(Genentech, Inc., 캘리포니아 샌프란시스코)만이 Her-2/neu 양성 암 환자의 치료를 위해 현재 유일하게 승인된 치료제이다. 소량의 Her-2/neu는 많은 정상 세포 종류에서 발견될 수 있으며, 암 세포가 발현을 변경시킴으로써 과발현, 증가된 세포 증식 및 암 세포 표현형에 관련된 분화를 가져온다. 그러나, 트라스투주맵으로의 성공적인 치료를 위해서는 Her-2/neu가 고도로 과발현될 필요가 있다. Her-2/neu 발현 수준은 고정되어 면역조직학적으로 염색된 생체검사 샘플을 사용하여 측정될 수 있다. 이런 종류의 분석들은 본 분야에 공지이며, 4D5 단클론성 항체(LabCorp, Research Triangle Park, 노스캘리포니아), HerceptTest

(DAKO, Glostrup, 덴마크) 및 Vysis Path Vysion^TM HER-2 DNA 프로브 키트(Fujisawa Health Care, Inc., 일리노이 노스디어필드)를 이용하는 면역조직화학적 평가를 포함한다. Her-2/neu 수준은 일반적으로 0(정상) 내지 3+이고, 트라스투주맵 치료는 2+ 이상의 발현 수준을 갖는 환자에서 유효한 것으로 나타났다.

IL-21은 Her-2/neu 수용체를 높은 수준 또는 낮은 수준으로 발현하는 사람 유방암 셀라인을 갖는 시험관내 및 생체내 모델 모두에서 면역 이펙터 T 세포 및 NK 세포에서의 용해 활성을 촉진하는 것으로 나타났다(예를 들어, 실시예 6). IL-21 매개된 이펙터 기능의 증진 결과, 암 세포가 Her-2/neu 수용체를 낮은 수준으로 발현한 경우에서도 트라스투주맵 치료가 유효하게 되었다. 예를 들어, IL-21과 트라스투주맵으로 치료된 1+ 또는 2+의 과발현 수준의 환자가 치료 후보인데, 이것은 이전에 치료된 적이 없는 환자 집단을 위한 가치 있는 치료요법을 제공한다. Her-2/neu를 발현하는 뮤린 암종을 지닌 마우스를 사용하여 항-Her-2/neu MAb와 조합된 IL-21을 시험할 수 있다(Penichet, 등, Lab Anim. Sci. 49:179-188, 1999).

각 프로토콜은 종양 반응 평가를 상이하게 규정할 수 있으며, 전형적인 가이드라인은 Clinical Research Associates Manual(Southwest Oncology Group, CRAB, 워싱턴 시애틀, 1998년 10월 6일, 1999년 8월에 업데이트)에서 찾을 수 있다. CRA 매뉴얼(7장 "반응 평가" 참조)에 따르면, 종양 반응은 모든 측정가능한 병소 또는 전이의 감소나 제거를 의미한다. 의학사진 또는 X-선, 컴퓨터 체축단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 또는 촉진에 의해 측정되는 명확히 한정된 경계를 갖는 2차원 병소를 포함하는 경우, 질환은 일반적으로 측정가능하다고 여겨진다. 평가가능한 질환은, 측정가능한 1차원 병소, 불명확한 경계를 갖는 덩어리, 0.5cm 미만의 양쪽 직경을 갖는 병소, 스캔 상에서 커트 간 거리보다 적은 직경의 병소, 직경 2cm 미만의 촉진 병소, 또는 뼈질환을 포함하는 질환을 의미한다. 평가 불가능한 질환은 흉막삼출, 복수, 및 간접적인 증거에 의해 증명된 질환을 포함한다. 또한, 진행중이 아닌 이전에 방사선 치료된 병소도 일반적으로 평가 불가능한 것으로 여겨진다.

객관적 상태에 대한 기준이 고상 종양 반응을 평가하는 프로토콜을 위해 필요하다. 대표적인 기준은 다음을 포함한다: (1) 완전 반응(CR), 모든 측정가능하고 평가가능한 질환의 완전한 소실로 정의, 질환 관련 증상이 없음, 평가 불가능한 질환의 증거 없음; (2) 부분 반응(PR), 모든 측정가능한 병소의 수직 직경의 곱의 합에서 베이스라인으로부터 50% 이상 감소로 정의, 평가가능한 질환의 진행 없음, 새로운 병소 없음, 적어도 하나의 측정가능한 병소를 갖는 환자에 적용; (3) 진행, 베이스라인으로서 동일한 기술을 이용하여 관찰된 최소 합에 비하여 측정가능한 병소의 곱의 합에서 50% 또는 10cm²의 증가, 또는 어떤 평가가능한 질환의 분명한 악화, 또는 소실되었던 병소의 재출현, 또는 어떤 새로운 병소의 출현, 또는 사망이나 상태 악화로 인한 평가 복귀 실패(이 암과 무관한 것이 아닌 경우); (4) 안정 또는 반응 없음, CR, PR, 또는 진행에 대한 자격 없음으로 정의(Clinical Research Associates Manual(상동)을 참조한다).

본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 더 예시된다.

실시예 1

IL-21은 항체-의존 NK 세포 활성을 증진시킨다

A.

말초혈액을 얻어서 피콜 원심분리에 의해 단핵세포(MNC)를 제조했다. Stem Sep^TM(Human NK Cell Stem Cell Technologies, 브리티쉬 콜롬비아 밴쿠버) 사람 NK 세포 네가티브 증균 키트를 이용하여, 네가티브 증균에 의해 MNC 집단으로부터 자 연 세포독성(NK) 세포를 정제했다. 간단히 말해서, MNC를 계통-특이적 항체(NK 계통을 배제하는)로 표지한 다음 차례로 자성 표지했다. 다음에, 표지된 MNC를, 표지된 세포는 체류하고 비-표지 NK 세포는 통과하여 흐르는 자성 칼럼에 걸었다.

NK 세포를 5x10⁵세포/mL 밀도로 플레이팅하고, Fc 자극의 존재 또는 부재하에 전부, αMEM/10% 자가혈청/50μM β-메르캅토탄올에서 0, 1, 10 또는 100ng/mL hIL-21(A794F) 또는 10ng/mL IL-21(양성 대조표준)과 함께 3일간 배양했다. 37℃에서 1시간 동안 플라스틱 위에 PBS 중의 100㎍/mL hIgG를 플레이팅함으로써 Fc 자극을 제공한 다음, PBS/항체 용액을 제거하고 그 표면에서 NK를 배양했다. 3일간 배양한 후 상청액을 수집했다. 상청액 중의 IFNγ를 BD OptEIA 사람 IFNγ ELISA 키트(BD Biosciences, 캘리포니아 산조세)를 이용하여 수집했다. 막대 차트 형태로 결과를 도시했으며, 샘플 당 ng/mL IFNγ로 표현했다.

Fc 자극이 있을 때 IFNγ 생산에서 IL-21은 용량-의존 증가를 야기했다. 이 실험에서 시험된 IL-21의 최대 용량에서는 바탕값에 비해 대략 18배 증가했다. Fc 자극이 없을 때에는 IL-21의 존재 하에서 IFNγ 생산은 증가하지 않았다.

B.

도너 프로그램으로부터 류코포레시스하여 말초혈액 림프구를 얻었다. 피콜 원심분리에 의해 어페레스드 혈액으로부터 단핵세포(MNC)를 제조했다. Stem Cell Technologies의 사람 NK 세포 네가티브 증균 키트를 이용하여, 네가티브 증균에 의해 MNC 집단으로부터 자연 세포독성(NK) 세포를 정제했다. 간단히 말해서, MNC를 계통-특이적 항체(NK 계통을 배제하는)로 표지한 다음 차례로 자성 표지했다. 다음에, 표지된 MNC를, 표지된 세포는 체류하고 비-표지 NK 세포는 통과하여 흐르는 자성 칼럼에 걸었다.

NK 세포를 1x10⁶/mL 밀도로 플레이팅하고, 0.2, 1, 5, 25 또는 100ng/mL 사람 IL-21의 존재 또는 부재하에, αMEM/10% 열-불활성화된 사람 AB 혈청/50μM β-메르캅토에탄올/ITS(Invitrogen GibcoBRL, 캘리포니아 칼스배드)/150㎍/mL 보충 트랜스페린/5mg/mL BSA에서, 1, 2, 3, 4, 6 또는 7일간 배양했다. 각 배양기간 말미에 NK 세포를 수집 세척 계수하고, 세포용해 표적으로서 림프종 셀라인(Ramos, CRL 1596, American Type Culture Collection, 버지니아 매너사스)을 이용하여, 항체-의존 세포 세포독성 세포용해(ADCC) 분석을 수행했다. 10μM 칼세인-AM(Molecular Probes, cat no. C1430)이 들어 있는 5% FBS Hanks 완충 식염수 용액(HBSSF)(Ca나 Mg가 없는)에서 37℃에서 60분간 인큐베이션하여 분석 전에 표적 세포를 표지했다. 표적 세포는 형광염료(칼세인-AM)을 흡수하여, 용해시에 세포로부터 방출되는 활성 형광색소로 세포질적으로 전환한다. 용해된 세포는 상청액에 형광색소를 방출하는데, 그 후 이것을 수집하여 형광측정기에서 형광물질의 양을 정량한다. 다양한 양의 NK 세포(이펙터)의 존재 또는 부재하에 3시간 인큐베이션한 후, 상청액에 존재하는 형광물질의 양으로부터 세포용해 퍼센트를 계산했다. ADCC 분석에서는 표적이, 부가된 항체 없이, 1㎍/mL 무관계 IgG, 또는 1㎍/mL 리툭시맵과 함께 사용되었다.

2명의 도너를 시험했다. 도너 A의 NK 세포는 0, 1, 5, 25 또는 100ng/mL 사람 IL-21에서 배양했으며, 1, 2, 3, 4 및 7일의 타임포인트를 가졌다. 도너 B의 NK 세포는 0, 0.2, 1, 5 또는 25ng/mL 사람 IL-21에서 배양했으며, 1, 2, 3, 4, 6 및 7일의 타임포인트를 가졌다. 두 도너 모두에서, 무관계 IgG 대조표준과 비교했을 때, 리툭시맵의 존재 하에서는 표적 세포에 대한 세포용해 활성의 증진(3-10배)이 있었다. 세포용해 활성의 이런 증진은 분석 전에 NK 세포가 IL-21의 존재하에 배양되었을 때 더 증가(2-10배)되었다.

도너 A의 배양물은, 7일에 1ng/mL IL-21 NK 배양물이 나머지 다른 용량들보다 상당히 적은 ADCC 증진 활성을 가졌던 때를 제외하고는, ADCC 증진에 있어서 시험된 IL-21 용량들(0, 5, 25 또는 100ng/mL) 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 0.2ng/mL IL-21를 함유하는 배양물이 나머지 다른 시험된 IL-21 용량들보다 상당히 적은 ADCC 증진 활성을 나타냈던 4일(그리고 나머지 타임포인트까지 계속)까지, 도너 B의 배양물은 ADCC 증진에서 시험된 IL-21 용량들(0.2, 1, 5 또는 25ng/mL) 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 두 도너는 모두 시험된 모든 타임포인트에서 IL-21 ADCC 증진을 나타냈으며, 이때 무관계 IgG와 비교하여 최대 증진은 6일 또는 7일에 나타났다.

C.

실시예 1A에 설명된 대로 도너 프로그램으로부터 말초혈액을 얻었다. NK 세포를 8.1~11x10⁵/mL 밀도로 플레이팅하고, 20ng/mL 사람 IL-21의 존재 또는 부재하 에 αMEM/10% 자가혈청/50μM β-메르캅토에탄올에서 3일간 배양했다. 배양기간의 말미에 NK 세포를 수집 세척 계수하고, 세포용해 표적으로서 림프종 셀라인 DOHH2 (Kluin-Nelemans, H. C. 등, Leukemia 5:221-224, 1991; Drexler, H. G. 등, DSMZ Catalogue of Cell Lines, 7판, 1999, 독일 브라운슈바빅)을 이용하여, 항체-의존 세포 세포독성 세포용해(ADCC)를 수행했다. 25μM 칼세인-AM(Molecular Probes)이 들어 있는 5% FBS Hanks 완충 식염수 용액(HBSSF)에서 30분간 인큐베이션하여 분석 전에 DOHH2 세포를 표지했다. 표적 세포는 형광염료(칼세인-AM)을 흡수하여, 용해시에만 세포로부터 방출되는 활성 형광색소로 세포질적으로 전환한다. 용해된 세포는 상청액에 형광색소를 방출하는데, 그 후 이것을 수집하여 형광측정기에서 형광물질의 양을 정량한다. 다양한 양의 NK 세포(이펙터)의 존재 또는 부재하에 3시간 인큐베이션한 후, 상청액에 존재하는 형광물질의 양으로부터 세포용해 퍼센트를 계산했다. ADCC 분석에서는 표적이, 부가된 항체 없이, 2㎍/mL 무관계 IgG, 또는 0.002, 0.02, 0.2 또는 2㎍/mL 리툭시맵과 함께 사용되었다.

2명의 도너로부터 결과를 산출하였고, 이펙터:표적(E:T) 비 대 용해 퍼센트로 표현했다. 2명의 도너 모두에서, 항체를 부가하지 않은 것이나 무관계 IgG 대조표준과 비교했을 때, 2㎍/mL의 리툭시맵의 존재 하에서는 DOHH2 세포에 대한 세포용해 활성의 증진(E:T=3에서 6-11배)이 있었다. 리툭시맵 증진은 2㎍/mL와 0.2㎍/mL에서 동일했고, 0.02㎍/mL에서는 시험된 최고 E:T(4 또는 6)에서 하강하기 시작했으며, 0.002㎍/mL에서는 시험된 모든 E:T에서 분명하게 저하되었다. 세포용해 분석 전에 IL-21의 존재하에 NK 세포를 3일간 배양했을 때, 리툭시맵-의존 세포용 해 활성 증진은 시험된 모든 리툭시맵 용량에서 증가되었다(E:T=3에서의 리툭시맵 증진 활성을 1.5-3배 능가한다).

실시예 2

IL-21은 사람 NK 세포에서 그란자임 -B 발현을 상향조절한다

자기비드 분리 키트(Miltenyi Biotech, 캘리포니아)를 이용한 네가티브 선택에 의해 Ficoll-Paque 정제된 단핵세포로부터 사람 NK 세포를 분리했다. 그 다음, 정제된 NK 세포를 배지만 사용하거나 또는 20ng/mL 사람 IL-21에서 48시간 배양했다. 세포를 수집 세척한 다음 표면 마커로 염색했다. 표면 마커 염색 후, 세포를 세척한 다음, Cytofix/Cytoperm^TM 완충액(BD Biosciences, 캘리포니아 산조세)으로 20분간 투과성으로 만들었다. 그 다음, 세포를 Perm/Wash 완충액 중에서 APC-표지 항-사람 그란자임-B나 이소타입 대조표준 항체(Caltag, 캘리포니아 벌링검)로 염색했다. 다음에, 세포를 세척하고, FACSCalibur^TM 유세포분류기 상에서 판독했다.

도 1은 IL-21의 존재하에 인큐베이션한 사람 NK가 NK 세포 사멸의 중요한 매개인자인 그란자임-B 발현에 큰 증가를 야기한다는 것을 나타낸다. 이것은 그란자임-B를 상향조절함으로써 IL-21이 그들의 표적 세포를 죽이는 NK 세포의 능력을 증진시킨다는 것을 시사한다.

실시예 3

IL-21+ 리툭시맵은 HS-Sultan 림프종 세포가 주사된 마우스의 생존을 증가시킨다

리툭시맵, 마우스 IL-21(mIL-21) 또는 mIL-21과 리툭시맵의 조합으로 치료한 HS-Sultan 세포를 주사한 CB-17 SCID 마우스에서 종양 성장이 지연되었는지를 평가하기 위한 연구를 행했다. 이 연구는 다양한 치료 그룹 내에서 HS-Sultan를 지닌 마우스의 생존을 특성화하도록 설계되었다.

프로토콜은 당업자에게 공지된 것과 유사했다(Cattan 등, Leuk Res. 18(7): 513-522, 1994; Ozaki 등, Blood 90(8):3179-86, 1997 참조). CD17-SCID 마우스에게는 리툭시맵 20㎍(총 5회 주사로 4일마다 투약), mIL-21 100㎍(5일 투약) 또는 리툭시맵과 mIL-21 조합을 복강내 주사를 통해 제공했다(각 치료 당 5회 투약).

마비 또는 급격한 체중손실과 같은 거의 죽어가거나 또는 살 수 없는 상태에 대해 마우스를 모니터했다. 연구 동안 체중은 일주일에 2번 조사했다. 모든 마우스에 대해 생존 시간을 기록했고, Kaplan-Meier 생존 곡선을 작성하고 로그순위 통계법으로 계산하여 치료 그룹들을 비교했다(Statview, SAS Institute, 노스캘리포니아 캐리).

다음의 그룹이 사용되었다:

그룹 1 (n=10) 4일마다 리툭시맵 20㎍을 1일에 시작하여 총 5회 주사

그룹 2 (n=10) 4일마다 리툭시맵 20㎍을 3일에 시작하여 총 5회 주사

그룹 3 (n=10) 4일마다 리툭시맵 20㎍을 6일에 시작하여 총 5회 주사

그룹 4 (n=10) 부형제 대조표준(PBS)을 1-5일 복강내 경로로 제공

그룹 5 (n=10) mIL-21 100㎍을 1일에 시작하여 5일간 매일 복강내 주사

그룹 6 (n=10) mIL-21 100㎍을 1일에 시작하여 5일 동안 주사

+ 4일마다 리툭시맵 20㎍을 3일에 시작하여 총 5회 주사

마우스(암컷, C.B-17 SCID, 9주령; Harlan, 위스콘신 매디슨)을 6개 그룹으로 나누었다. 0일에 HS-Sultan 세포(ATCC No. CRL-1484)를 배양물로부터 수집하여 꼬리 정맥을 통해 정맥내 경로로 모든 마우스에 주사했다(마우스 당 1,000,000 세포). 다음에, 마우스를 상기 치료 그룹 설명에 설명된 용량 및 일정에 따라, 리툭시맵, mIL-21, 또는 이 두 제제의 조합으로 치료했다. 모든 치료제는 0.1mL의 부피로 복강내 주사에 의해 투여했다.

리툭시맵으로 치료된 마우스 그룹에서 투약이 1일 또는 3일에 개시되었을 때는 상당한 생존 이익이 관찰되었지만 6일에 시작되었을 때는 그렇지 않았다. 뮤린 IL-21의 단독사용은 종양을 지닌 마우스에게 생존 이익을 제공하지 않았다. mIL-21(100ug/일, 1-5일)과 리툭시맵(20ug/일, 3, 7, 11, 15, 19일)의 조합으로 치료된 마우스는 아주 현저한 생존 이익을 가졌다(부형제 대조표준과 비교 P<0.0001, 3일에 시작한 리툭시맵과 비교 P<0.02; 로그순위 시험). 연구 120일에 mIL-21+리툭시맵 그룹의 누적 생존은 70%였고, 리툭시맵 단독사용 그룹에서는 20%였다.

실시예 4

IL-21+ 리툭시맵은 Raji 종양 세포가 주사된 마우스의 생존을 증가시킨다

리툭시맵, mIL-21 또는 mIL-21과 리툭시맵의 조합으로 치료한 Raji 세포를 주사한 CD-17 SCID 마우스에서 종양 성장이 지연되었는지를 평가하기 위한 연구를 행했다. 이 연구는 다양한 치료 그룹 내에서 Raji를 지닌 마우스의 생존을 특성화하도록 설계되었다.

프로토콜은 실시예 3에 설명된다.

다음의 그룹이 사용되었다:

그룹 1 (n=8) 부형제 대조표준 PBS, 3-7일 복강내 경로

그룹 2 (n=8) mIL-21 100㎍, 1일에 시작하여 5일간 매일 복강내 경로

그룹 3 (n=8) mIL-21 100㎍, 3일에 시작하여 5일 동안

그룹 4 (n=9) 4일마다 리툭시맵 20㎍, 3일에 시작하여 총 5회 주사

그룹 5 (n=9) 4일마다 리툭시맵 20㎍, 5일에 시작하여 총 5회 주사

그룹 6 (n=9) mIL-21 100㎍을 1일에 시작하여 5일 동안 매일 복강내 주사

+ 4일마다 리툭시맵 20㎍을 3일에 시작하여 총 5회 주사

그룹 7 (n=9) mIL-21 100㎍을 3일에 시작하여 5일 동안 매일 복강내 제공

+ 4일마다 리툭시맵 20㎍을 5일에 시작하여 총 5회 주사

마우스(암컷, C.B-17 SCID, 9주령; Harlan, 위스콘신 매디슨)을 7개 그룹으로 나누었다. 0일에 Raji 세포(ATCC No.CCL-86)를 배양물로부터 수집하여 꼬리 정맥을 통해 정맥내 경로로 모든 마우스에 주사했다(마우스 당 1,000,000 세포). 다음에, 마우스를 상기 치료 그룹 설명에 설명된 용량 및 일정에 따라서, 리툭시맵, mIL-21, 또는 이 두 제제의 조합으로 치료했다. 모든 치료제는 0.1mL의 부피로 복강내 주사에 의해 투여했다.

리툭시맵으로 치료된 마우스 그룹에서 투약이 3일 또는 5일에 개시되었을 때는 상당한 생존 이익이 관찰되었지만 6일에 시작되었을 때는 그렇지 않았다. 뮤린 IL-21의 단독사용은 종양을 지닌 마우스에게 생존 이익을 제공하지 않았다. mIL- 21(100ug/일, 3-7일)과 리툭시맵(20ug/일, 5, 9, 13, 17, 21일)의 조합으로 치료된 마우스는 아주 현저한 생존 이익을 가졌다(부형제 대조표준과 비교 P<0.0001, 5일에 시작한 리툭시맵과 비교 P<0.03; 로그순위 시험). 연구 100일에 mIL-21+리툭시맵 그룹의 누적 생존은 55%였고, 리툭시맵 단독사용 그룹에서는 10%였다.

실시예 5

비-사람 영장류에서의 IL-21+ 리툭시맵 연구

용량 주기 당 1주일로 구성된 3번의 투약 주기 동안, 리툭시맵과 rIL-21을 3마리의 수컷 사이노몰거스 원숭이로 구성된 그룹에 정맥내 경로에 의해 공동-투여했다. 투약 2주차와 3주차 사이에 1주일간은 투약하지 않았다. 리툭시맵은 각 투약 주기의 제1일에 투약했고, rIL-21은 각 주약 주기의 제1일에 시작하여 3일 동안 투약했다. 대조표준 항목으로 0.9% 염화나트륨을 투약한 대조표준 대조 그룹, 리툭시맵만 투약한 그룹 3, 및 rIL-21만 받은 그룹 2가 투약 예외였다. 그룹 5는 각 투약 주기의 제1일에만 rIL-21을 투약받았지만, 1주일 간의 총 용량은 rIL-21을 받은 다른 그룹과 동등했다. 그룹 7은 rIL-21을 정맥내 경로가 아닌 피하 경로에 의해 투약받았다. 그룹 4는 3차 투약 주기 동안에는 투약받지 않았고, 마지막 용량을 10일에 받았다. 모든 다른 그룹에는 마지막 용량을 24일에 주었다. 동물들은 뇌, 복재, 또는 다른 적합한 정맥으로의 정맥내 주사; 견갑내 영역이나 다른 적합한 부위로의 피하 주사를 이용하여 투약받았다.

유세포분류법을 이용하여 말초혈액세포 서브셋을 분석했다. 채혈한 혈액 약 1.3mL를, -8일의 순화 도중에 1번, 1일, 8일 및 22일에 투약 전과 투약-6시간 후에 EDTA-2K로 처리한 튜브에 두었다. 투약-전 샘플을 3일, 10일 및 24일에 채취했다. 샘플을 7, 14, 17 및 42일에 1번 채취했다. 샘플 약 0.5mL를 혈액학적 분석을 위해 취했고, 남은 샘플은 유세포분류 분석을 진행할 때까지 실온에 보관했다.

전혈 약 2.0mL를 -8 및 -4일에 순화 도중에 리튬 헤파린을 함유하는 튜브에 채혈했다. 또, 3, 10, 22 및 24일에 투약 전에 그리고 7 및 14일에 1번 채취했다. 샘플은 유세포분류 분석 및 ADCC 활성 분석을 진행할 때까지 실온에 보관했다.

IL-21 치료는 순환 백혈구의 표현형과 개수에 대해 두드러진 효과를 가졌다. IL-21로 치료한 후 얼마 안 있어 모든 림프구 집단이 감소하였다. B 세포는 T 세포 및 NK 세포보다 더 빨리 회수되었다. T 세포는 투약 후 4-6일에는 베이스라인 수준을 회복하였고, T 헬퍼 세포는 IL-21 치료의 2차 사이클 후 4-6일까지 약간 상승하였다. NK 세포는 모든 그룹에서 감소하였고, 투약 사이클 사이에는 단지 부분적으로만 회수되었다. 순환 단핵구의 수는 IL-21 치료 후에 증가하였고, 단핵구와 과립구 모두 Fc 수용체 발현이 증가하였다.

A. 림프구 효과

리툭시맵의 준-임상 용량은 순환 B 세포의 수를 투약 6시간 이내에 베이스라인의 최하 70% 이하까지 감소시켰다. rIL-21만을 사용한 치료는 초기에 순환 B 세포, T 세포 및 NK 세포를 감소시켰으나, 그 후 다음번 투약 사이클 전까지 지속적인 증가 및 용해가 있었다. 이전에 관찰된 rIL-21을 사용한 림프구 감소증과 림프소절 고갈의 빠른 역전현상에 근거하여, 이 효과는 림프계 조직에서 혈액으로의 재순환 증가와 조합된 활성화 림프구의 일시적 변연화(margination)라고 해석되었다. 리툭시맵이나 rIL-21로만 치료된 그룹에 비하여, rIL-21과 리툭시맵 두 가지로 치료된 동물에서는 말초 B 세포의 증가가 대단히 완화되었고, 이와 일치하여 더 낮은 B 세포 최하점이 관찰되었다. rIL-21에 의해 유도되는 다른 림프구 서브셋의 변화는 리툭시맵 치료에 의해서 변경되지 않았다.

B. ADCC 효과

Ficoll 밀도 구배를 이용하여 MNC 집단을 만들었다. 이 연구를 진행하는 동안 모든 치료된 동물로부터의 MNC 집단을 면역표현형 및 생체외 ADCC 활성에 대해 특성화했다. 분석 전에 표적 세포를 칼세인-AM으로 로딩했으며, 3시간 인큐베이션 도중 세포내 염색의 특이적 방출을 분석 종점으로 하였다.

사이노몰거스 원숭이의 rIL-21 치료는 MNC 집단에서 말초혈액 내 NK 세포의 총수와 NK 세포의 퍼센트를 변화시켰다. NK 세포는 치료 후 초기에는 감소하였으나, 투약 사이클 사이에 베이스라인 값으로 향하려는 경향이 있었다.

rIL-21, 또는 rIL-21과 조합된 리툭시맵으로 치료된 사이노몰거스 원숭이로부터의 MNC는, 부형제 대조표준 및 리툭시맵 단독 치료된 동물로부터의 MNC와 비교했을 때 생체외 ADCC 활성이 증가한 것으로 나타났다. 세포용해 활성은 3일에 저하되었는데, 이것은 MNC 집단의 매우 적은 NK 세포와 서로 관련된다. 7 및 10일에 ADCC는 rIL-21 치료된 동물에서의 베이스라인을 넘어 증가하였고, rIL-21+리툭시맵으로 치료된 동물에서와 유사한 경향을 보였다. MNC 집단에서 적은 NK 세포 수에도 불구하고 NK 세포 당 세포용해 활성은 14일까지 계속 유지되었다.

C. 추가 종점

면역 활성화 마커인 가용성 IL-2Rα(sCD25)은 rIL-21 투약시 빠르게 증가하였고, 세포용해 과립효소인 세포내 퍼포린은 더 느리게 증가하였고, 두 번째 투약 휴지기 후에 최고 발현이 있었다. FcγRI(CD64)와 FcγRIII(CD16)은 단핵구와 과립구에서 모두 상향조절되었다.

MNC 집단에서 유세포분류법에 의해 퍼포린을 측정했다. sCD25의 측정을 위해서 -8일의 순화 도중에 1번 그리고 17, 29, 37 및 42일에 1번 혈액을 채혈했다. 또, 투약 전 1, 8 및 22일에, 그리고 투약 5분, 30분, 2시간, 및 6시간 후에 채혈했다. 3, 10 및 24일에는 투약 30분 후에 혈액을 채혈했다.

혈액 약 0.75mL를 SST 응혈 튜브로 옮겼다. 실온에서 약 40-60분간 샘플을 응고시켰다. 2-8℃에서 약 15분간 원심분리(2000xg)하여 혈청을 얻은 다음, 이것을 -70℃의 냉동고에 보관했다. 혈청에 존재하는 가용성 CD25를 뮤린 단클론성 항-sCD25 항체를 이용해서 포착한 다음, 비오티닐화 염소 다클론성 항-sCD25 항체를 사용하여 검출했다. 스트랩타비딘-HRP와 기질 TMB로 샘플 및 표준물질에 존재하는 sCD25를 정량했다.

실시예 6

Her-2/ neu 발현 유방암 셀라인의 IL-21 및 트라스투주맵 -매개 사멸

A.

200mL 사람 혈액을 도너 프로그램으로부터 얻었다. 혈액 180mL는 산 시트레이트 덱스트로스 튜브에 채혈했고, 동일한 도너로부터의 20mL는 응혈 튜브(BD Bio sciences)에 채혈했다. 응혈 튜브의 혈액은 2800rpm으로 30분 원심분리했다. 상층의 혈청을 수집하여 배양 배지로 사용했다(아래 참조). ACD 튜브의 혈액 180mL는 모아서 포스페이트 완충 식염수(PBS), 2% 태아 소 혈청(FBS) 중에 1:2로 희석했다. 혈액 30mL씩의 알리쿼트를 50mL 튜브에 넣었다. 50mL 혈액 튜브 각각의 바닥에 12mL Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences)의 층을 만들었다. 혈액 튜브를 1800rpm으로 30분 원심분리했다. 각 50mL 튜브로부터 백혈구 연층(buffy coat) 계면을 수집하여 모았다. 이 풀을 총 100x 세포 부피의 PBS, 2% FBS로 2-3회 세척했다. 마지막으로 세척한 펠릿을 2mL PBS, 2% FBS에 다시 현탁했다. 혈구계로 세포를 계수했다.

상기 설명한 대로 정제한 MNC 세포를, 37℃에서 4일 동안, 20ng/mL 사람 IL-21을 첨가하거나 첨가하지 않은, 4% 자가혈청이 들어 있는 SF Complete(뉴클레오시드를 갖는 αMEM, 50μM B-메르캅토에탄올, 1:100 인슐린, 트랜스퍼링, 셀레늄 스톡(Invitrogen), 150㎍/mL 추가 트랜스페린, 5mg/mL 소 혈청 알부민)에서 0.5x10⁶세포/mL로 배양했다. 4일째에 세포를 수집하여 혈구계로 계수했고, 5% 태아 소 혈청 (FBS)이 들어 있는 Hank 완충 염 용액(Ca 또는 Mg가 없는 HBSS)(이후 HBSSF라고 한다)으로 세척했다. 세포 펠릿을 0.5x10⁶세포/mL로 HBSSF에 다시 현탁했다.

BT-474(ATCC No. HTB-20), SK-BR-3(ATCC No. HTB-30), 또는 MCF-7(ATCC No. HTB-22)를 포함하는 유방암 표적 셀라인을 37℃에서 1시간 동안 HBSSF 중에서 10μM 칼세인으로 표지했다. 다음에, 표적을 1100rpm에서 8분간 10부피의 HBSSF 중에서 세척했다. 세포 펠릿을 50,000세포/mL로 HBSSF에 다시 현탁했다. 상기 설명한 대로 사람 IL-21과 함께 또는 이것 없이 4일간 전처리한 MNC 이펙터 세포를 8분간 1100rpm으로 원심분리했고, 세포 펠릿을 약 0.5x10⁶세포/mL로 HBSSF에 다시 현탁했다. 이펙터를 2개의 96-웰 둥근바닥 플레이트에서 똑같이 1:3으로 연속 희석했다. 2㎍/mL 사람 IgG 또는 2.5㎍/mL 트라스투주맵의 존재하에 각 웰에 100㎕ 표적을 첨가했다. 96-웰 플레이트를 500rpm으로 3분간 원심분리했다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고 1000rpm으로 5분간 원심분리했다. 각 웰로부터 상청액 100㎕를 96-웰 평면바닥 플레이트로 옮겨서, Wallac 형광측정기 상에서 485/535에서 1초 간격으로 판독했다.

높은 수준으로 Her-2/neu 항원을 발현하는 BT-474 셀라인과 비교하여, MCF-7 유방암 셀라인은 낮은 수준으로 Her-2/neu 항원을 발현한다. 상기 설명된 ADCC 분석에서, 이펙터:표적(E:T) 비 3으로 MCF-7 표적이 사용되었을 때, 트라스투주맵의 존재 하에서 미처리 이펙터는, 이 분석에서 IgG를 사용한 경우의 미처리 이펙터보다 세포용해 활성이 더 크지 않았다. E:T 10에서 IgG의 존재하에서는, IL-21 전처리 이펙터가 미처리 이펙터에 비해 세포용해 활성이 0.5-배 증가했다. BT-474 세포가 표적이었을 때, E:T 10에서 트라스투주맵의 존재 하에서는, 미처리된 것들 및 이 분석에서 IgG가 존재했을 때의 미처리 이펙터에 비해 세포용해 활성이 7-배 증가했다. E:T 10에서 IL-21 전처리는 세포용해 활성을 2-배 증가시킨다. 이들 결과는 MCF-7 셀라인이 낮은 항원 발현체이며, 때문에 이 셀라인에 대한 이펙터 세포용해 활성을 증진시키는데 있어 트라스투주맵의 단독사용은 비효과적이라는 사실을 뒷받침한다. 더 나아가, IL-21 전처리는 이들 두 셀라인 모두에 대한 이펙터의 세포용해 활성을 증가시킨다.

B.

200mL 사람 혈액을 도너 프로그램으로부터 얻었다. 혈액 180mL는 산 시트레이트 덱스트로스 튜브에 채혈했고, 동일한 도너로부터의 20mL는 응혈 튜브(BD Bio sciences)에 채혈했다. 응혈 튜브의 혈액은 2800rpm으로 30분 원심분리했다. 상층의 혈청을 수집하여 배양 배지로 사용했다(아래 참조). ACD 튜브의 혈액 180mL는 모아서 포스페이트 완충 식염수(PBS), 2% 태아 소 혈청(FBS) 중에 1:2로 희석했다. 혈액 30mL씩의 알리쿼트를 50mL 튜브에 넣었다. 50mL 혈액 튜브 각각의 바닥에 12mL Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences)의 층을 만들었다. 혈액 튜브를 1800rpm으로 30분 원심분리했다. 각 50mL 튜브로부터 백혈구 연층(buffy coat) 계면을 수집하여 모았다. 이 풀을 총 100x 세포 부피의 PBS, 2% FBS로 2-3회 세척했다. 마지막으로 세척한 펠릿을 2mL PBS, 2% FBS에 다시 현탁했다. 혈구계로 세포를 계수했다.

MNC를 PBS,2% FBS로 5-10x10⁷세포/mL로 희석했다. NK 세포를 Human NK Cell 키트의 StemCell 기술 증균법을 이용하여 정제했다. NK 세포를 1100rpm으로 8분간 원심분리한 다음 0.5mL PBS, 2% FBS에 다시 현탁하여 혈구계 상에서 계수했다.

BT-474 세포(ATCC No. HTB-20)를 DMEM(Gibco), 10% FBS 중에서 12-웰 플레이트에 0.125x10⁶세포/mL로 플레이팅하고 부착되도록 3시간 동안 두었다. 상기와 같이 정제한 NK 세포를, 4% 열 불활성화 사람 AB 혈청이 더해진 SF Complete(뉴클레오시드를 갖는 αMEM, 50μM B-메르캅토에탄올, 1:100 인슐린, 트랜스퍼링, 셀레늄 스톡(Invitrogen), 150㎍/mL 추가 트랜스페린, 5mg/mL 소 혈청 알부민)으로 1-2x10⁶세포/mL로 희석했다. 배지로부터 BT-474 세포를 흡인하고, 이 BT-474 세포에 희석 NK 세포 2mL를 첨가하여 공동-배양물을 만들었다. 이 공동-배양물에 아무것도 첨가하지 않거나, 또는 2㎍/mL 트라스투주맵, 20ng/mL 사람 IL-21, 또는 2㎍/mL+20ng /mL 사람 IL-21을 첨가했다. 공동-배양물을 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 하룻밤 공동-배양한 후, 세포를 수집하여 혈구계 상에서 계수했다. 세포를 HBSSF(하기 참조) 중에서 세척했고, 세포 펠릿을 1mL HBSSF에 다시 현탁했다.

20㎍/mL 마우스 감마 글로불린(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 펜실베니아 웨스트그로브)과 1:100 접합 항체를 100㎕ HBSSF 중의 100,000-200,000 NK 세포에 첨가했다. 이 항체 조합은 CD25FITC, CD56PE, CDl6Cychrome 및 CD8APC (BD Pharmingen)를 포함했다. 이소타입 대조표준은 각 접합 항체만을 갖는 NK-공동-배양물로부터 모은 100,000-200,000 세포를 포함했다. 세포를 암소에서 4℃에서 30분간 인큐베이션했다. 세포를 PBS, 2% FBS로 1회 세척한 후, 200㎕ PBS, 2% FBS 중에 두었다. 0.2% 파라포름알데이드를 첨가하여 세포를 고정시켰고, FACS 분석이 준비될 때까지 세포를 4℃로 유지했다. 고정하고 3-4일 이내에 FACS 분석을Becton Dickinson FACS Calibur 상에서 행했다. Cellquest 소프트웨어를 사용하여 유동 데이타를 분석했다. mL 당 세포 수와 배양 부피를 곱하여 총 세포 수를 계산했다.

NK 세포와 유방암 셀라인 BT-474의 공동-배양물에 트라스투주맵 및 IL-21이 있었을 때, 시험된 4명의 도너 전부에서 세포의 CD56+/CD25+ 집단이 증가했다. 구체적으로, 배지만 들어 있는 공동-배양물(상기 설명된)과 비교했을 때, 트라스투주맵 단독사용은 2-10배 증가를 가져왔고, IL-21 단독사용은 2-4배 증가를 가져왔으며, IL-21과 트라스투주맵이 존재했을 때는 CD56+/CD25+ 집단에 4-50배 증가가 있었다. 모든 다른 공동-배양물 조건에 비해, IL-21과 트라스투주맵이 존재했을 때는 모든 도너에서 CD56+/CD25+ 집단이 증가했다.

C.

200mL 사람 혈액을 조직내 도너 프로그램에서 얻었다. 혈액 180mL는 ACD 튜브에 채혈했고, 동일한 도너로부터의 20mL는 응혈 튜브에 채혈했다. 응혈 튜브의 혈액은 2800rpm으로 30분 원심분리했다. 상층 혈청을 수집하여 배양 배지로 사용했다(아래 참조). ACD 튜브의 혈액 180mL는 모아서 포스페이트 완충 식염수(PBS), 2% 태아 소 혈청(FBS) 중에 1:2로 희석했다. 혈액 30mL씩의 알리쿼트를 50mL 튜브에 넣었다. 50mL 혈액 튜브 각각의 바닥에 12mL Ficoll-Paque PLUS(Amersham Bio sciences cat. No. 17-1440-03)의 층을 만들었다. 혈액 튜브를 1800rpm으로 30분 원심분리했다. 각 50mL 튜브로부터 백혈구 연층(buffy coat) 계면을 수집하여 모았다. 이 풀을 총 100x 세포 부피의 PBS, 2% FBS로 2-3회 세척했다. 마지막으로 세척한 펠릿을 2mL PBS, 2% FBS에 다시 현탁했다. 혈구계로 세포를 계수했다.

상기 설명한 대로 정제한 MNC 세포를, 37℃에서 4일 동안, 20ng/mL 사람 IL-21을 첨가하거나 첨가하지 않은, 4% 자가혈청이 들어 있는 SF Complete(뉴클레오시드를 갖는 αMEM, 50μM B-메르캅토에탄올, 1:100 인슐린, 트랜스퍼링, 셀레늄 스톡(Invitrogen), 150㎍/mL 추가 트랜스페린, 5mg/mL 소 혈청 알부민)에서 0.5x10⁶세포/mL로 배양했다. 4일째에 세포를 수집하여 혈구계로 계수했고, 5% 태아 소 혈청 (FBS)이 들어 있는 Hank 완충 염 용액(Ca 또는 Mg가 없는 HBSS)(이후 HBSSF라고 한다)으로 세척했다. 세포 펠릿을 0.5x10⁶세포/mL로 HBSSF에 다시 현탁했다.

BT-474, 또는 MCF-7을 포함하는 유방암 표적 셀라인을 37℃에서 1시간 동안 HBSSF 중에서 10μM 칼세인으로 표지했다. 다음에, 표적을 1100rpm에서 8분간 10부피의 HBSSF 중에서 세척했다. 세포 펠릿을 50,000세포/mL로 HBSSF에 다시 현탁했다. 상기 설명한 대로 사람 IL-21과 함께 또는 이것 없이 4일간 전처리한 MNC 이펙터 세포를 8분간 1100rpm으로 원심분리했고, 세포 펠릿을 약 0.5x10⁶세포/mL로 HBSSF에 다시 현탁했다. 표적을 2개의 96-웰 둥근바닥 플레이트에서 똑같이 1:3으로 연속 희석했다. 2㎍/mL 사람 IgG, 또는 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31㎍/mL 헤르셉틴(Herceptin)의 존재하에 각 웰에 100㎕ 표적을 첨가했다. 96-웰 플레이트를 500rpm으로 3분간 원심분리했다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고 1000rpm으로 5분간 원심분리했다. 각 웰로부터 상청액 100㎕를 96-웰 평면바닥 플레이트로 옮겨서, Wallac 형광측정기 상에서 485/535에서 1초 간격으로 판독했다.

ADCC 분석에서 표적으로서 BT-474 또는 MCF-7 셀라인을 사용한 경우, IL-21로 전처리된 MNC는, 미처리 MNC 또는 이 분석에서 IgG가 존재했을 때보다, 시험된 트라스투주맵의 모든 농도에서 활성이 더 높았다. 3의 이펙터:표적(E:T)에서, BT-474가 사용되었을 때, 세포용해 활성은 5㎍/mL 트라스투주맵에서 최대이다. E:T 3에서, MCF-7이 사용되었을 때는 세포용해 활성이 1.25㎍/mL에서 최대이다.

D.

사이노몰거스 원숭이로부터 리튬 헤파린이 들어 있는 5mL 튜브에 말초혈액을 채혈하고 샘플 프로세싱까지 실온에서 보관했다. 샘플을 1mM EDTA를 함유하는 PBS로 희석한 다음, 95% Ficoll 위에서 원심분리하여 단핵세포(MNC) 부분을 수집했다. 세척 후에 세포를 rIL-21 20ng/mL를 함유하는 성장 배지 또는 대조표준 배지에서 3일간 배양했다. 인큐베이션 후, 세포를 세척 계수했고, 유세포분류법에 의한 면역표현형화를 위해 알리쿼트들을 염색했다. 세포의 한 알리쿼트를 사용하여 다음과 같이 항체-의존 세포 세포독성 분석을 수행했다. BT-474 유방암 표적 세포를 37℃에서 60분간 칼세인-AM 염료로 로딩한 다음 세척하고, 1000개 표적 세포를 2㎍/mL 헤르셉틴 및 50,000, 25,000, 12,500, 6250, 3125, 1563, 또는 781개 MNC를 함유하는 웰에 두었다. 이 분석물을 37℃ 암소에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 이 인큐베이션 후, 상청액으로 칼세인-AM의 방출을 측정했고, 총 (세제) 세포용해에 의한 방출 및 어떤 MNC 이펙터 세포도 없을 때의 비-특이적 방출에 기초하여 특이적 세포용해를 계산했다. 이 실험을 각각 8마리의 사이노몰거스 원숭이 도너에 대해 2번 반복했다. E:T 비 25에서 MNC 당 특이적 세포용해 퍼센트로 데이터를 나타냈거나, 또는 유세포분류 분석에 기초한 MNC 제제 중의 실제 NK 세포 수를 반영하도록 이 데이터를 정규화했다. NK-조정 데이터에 대하여, 4-변수 S자형 곡선을 이용해서 용해된 퍼센트에 대하여 E:T 비를 피팅했고, Hill 방정식을 사용하여 BT-474 표적 당 3개 NK의 E:T 비에서의 용해된 퍼센트를 측정했다.

사이노몰거스 원숭이의 MNC를 rIL-21로 시험관내 처리한 것은 BT-474 유방암 표적을 이용한 헤르셉틴-매개 ADCC 분석에서 활성을 증가시켰다. 어떤 동물은 다른 동물보다 rIL-21에 대해 큰 반응을 가졌는데, 이런 가변적인 반응은 반복 실험에서 동물에 따라 일관되었다. 도너에 대한 고정 효과 및 무작위 효과에 따른 처리와 도너 상호작용에 의한 처리를 사용하는 SAS

의 Proc MIXED(Littell 등, 혼성 모델용 SAS 시스템; SAS Institute, 1996)를 이용하여 혼성 효과 모델을 피팅했다. SAS

의 Kenward Roger 옵션을 사용해서 자유도 분모를 결정하여, 처리에 대한 P-값을 계산했다. 처리 항목은 매우 유의했다.

실시예 7

CD4 / CD8 고갈 마우스 모델

면역기작에서 이들 세포의 특이적 역할을 이해하기 위해서 세포 표면 수용체에 대한 항체를 이용하여 세포를 고갈시키는 것이 수년 동안 사용되어 왔다. T 림프구 상의 CD4 및 CD8 항원에 대한 항체는 마우스에 주사되었을 때, ADCC와 보체가 관련된 기작에 의해서 특이적 T 세포 서브셋을 고갈시킨다. 저용량 항체를 마우스에 주사하여 CD4 또는 CD8 T 세포의 20~50%를 고갈시킨다. IL-21을 마우스 그룹에 제공하고, 고갈을 증진시키는 그것의 능력을 유세포분류법에 의해 T 세포를 추적하여 연구한다. IL-21을 사용했을 때 T 세포의 증가된 고갈은 생체내에서 세포의 항체-매개 고갈의 증진시키는 IL-21의 능력을 암시한다.

고갈 연구에는 래트 항-마우스 CD4(클론 GK1.5, ATCC) 또는 래트 항-마우스 CD8(클론 53-6.72, ATCC)를 사용한다. 8-12주령의 C57BL/6 마우스(Charles River Laboratories) 그룹에 대조표준 항체, 5-50㎍ 항-CD4 또는 항-CD8 MAb를 0일에 복강내 주사한다. 마우스 그룹은 채혈 전 2일에 시작하여 1일까지 PBS나 25㎍ mIL-21 중 어느 하나를 복강내 경로로 받았다. 마우스는 1, 4 및 7일에 채혈한다. 유세포분류법에 의해 혈액 CD4 및 CD8 T 세포 수를 분석한다.

IL-21을 사용했을 때 T 세포의 증가된 고갈은 생체내에서 세포의 항체-매개 고갈을 증진시키는 IL-21의 능력을 암시하며, 이것은 IL-21이 항체-매개 효과를 증진시킬 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 8

폐 클리어런스 분석

폐 클리어런스 분석을 사용하여 생체내에서 NK 세포의 기능을 연구했다. 크롬-51(⁵¹Cr)로 표지한 Raji 세포를 마우스에 정맥내 주사한다. 마우스 그룹은 PBS, mIL-21, 리툭시맵 단독 또는 리툭시맵+IL-21을 받는다. 정맥내 주사하고 5-8시간 후에 마우스를 죽이고, 감마-계수기로 방사능의 양에 대해 폐를 분석했다. 폐에서 방사능의 감소가 NK 세포에 의한 종양 세포의 클리어런스(사멸)의 징표이다. 리툭시맵의 존재하에 종양 세포의 클리어런스를 증진시키는 IL-21의 능력은 생체내에서 항체-매개 세포용해 활성을 증진시키는 IL-21의 능력을 암시한다.

Raji 세포를 37℃에서 2시간 동안 100μCi ⁵¹Cr로 표지한다. 세포를 PBS로 2번 세척하고, pH 7.2의 멸균 PBS에 다시 현탁한다. 0시간(t=0)에서 10,000,000개의 표지된 Raji 세포를 마우스에 정맥내 주사했다. 마우스 그룹은 t=10분에서 20㎍의 대조표준 항체 또는 리툭시맵을 복강내 경로로 받았다. 마우스 그룹은 t=-24시간, t=0시간 및 t=4시간에서 PBS 또는 25㎍ mIL-21을 받았다. 종양 주입 5-8시간 후에 마우스를 죽이고, 폐를 분리하여 감마-계수기 상에서 계수했다. 방사능을 대조표준 주사(표지된 세포 단독)에 대한 퍼센트로서 도시한다.

폐에서 감소된 방사능이 NK 세포에 의한 종양 세포의 증가된 클리어런스(사멸)의 징표이다. 리툭시맵의 존재하에 종양 세포의 클리어런스를 증진시키는 IL-21의 능력은 생체내에서 항체-매개 세포용해 활성을 증진시키는 IL-21의 능력을 암시한다.

실시예 9

Raji / SCID 대식세포 고갈 연구

IL-21+리툭시맵(rituximab)의 조합은 파종성 Raji/SCID 종양 모델에서 상승작용적 항-종양 활성을 가졌다. ADCC가 생체내에서 리툭시맵의 항-종양 활성에 중요한 역할을 한다고 생각되며, 대식세포는 이 과정에서의 중요한 이펙터 세포이다. IL-21은 마우스에서 대식세포의 ADCC 활성에 영향을 미칠 수 있으며, 이에 의해 리툭시맵과의 상승작용을 일으킨다. IL-21+리툭시맵의 항-종양 효과에서 대식세포의 중요성을 시험하기 위해서, 클로드로네이트 리포솜(Sigma, 미주리 세인트루이스)를 사용하여 마우스에서 대식세포를 고갈시킨다. 이 세포 집단이 고갈된 마우스는 비-고갈 마우스에 비해서 생존이 단축되었다는 것을 증명함으로써, IL-21+리툭시맵의 상승작용적 항-종양 활성에 대식세포가 중요하다는 것이 이 실험에서 증명된다.

SCID 마우스에서 Raji 세포에 대한 IL-21+리툭시맵의 항-종양 활성에서 대식세포의 중요성을 연구하기 위해서 다음의 실험을 수행했다. 리툭시맵 치료를 지연시켜 그것의 효능을 감소시켰고(Funakoshi, Longo 등, Blood, 83(10):2787-94), 최초 리툭시맵 주사는 제외하고 5일 동안 연속해서 mIL-2를 주사했다. HS-Sultan 및 Raji 세포는 STAT1이나 STAT3에 의한 신호가 없고, 시험관내 또는 생체내에서 IL-21에 의해 성장이 억제되지 않기 때문에 이들 세포를 사용했다.

1x10⁶ Raji 세포를 연구 0일에 정맥내 주사

100㎍ IL-21을 3-7일에 복강내 경로에 의해 제공

20㎍ 리툭시맵을 5일, 9일, 13일, 17일 및 21일에 복강내 경로에 의해 제공

리포솜을 정맥내 경로로 제공:

3일 - 0.2mL 100% 리포솜

9일 - 0.2mL 50% 리포솜

15일 - 0.2mL 50% 리포솜

21일 - 0.2mL 50% 리포솜

도 1은 클로드로네이트 리포솜(예를 들어 Clod.IL21R)을 사용한 대식세포 고갈이 PBS 리포솜을 주사한 마우스와 비교했을 때 Raji 림프종 세포를 지닌 SCID 마우스의 생존 이익을 극적으로 감소시켰다는 것을 나타낸다. IL-21+리툭시맵(Clod. IL21R) 또는 리툭시맵(Clod.R)로 치료된 대식세포 고갈 마우스는 비-고갈 마우스(각각 PBS.IL21+R 및 PBS.R)와 비교하여 생존(사망까지의 평균시간)이 상당히 단축되었다.

실시예 10

과립구 고갈된 SCID 마우스에서 IL-21+ 리툭시맵 후의 종양 클리어런스

IL-21은 리툭시맵과 함께, 리툭시맵을 단독으로 사용했을 때보다 생체내에서 Raji 종양 세포를 더욱 효과적으로 제거할 수 있다. Raji 세포를 과립구를 고갈시킨 CB17 SCID 마우스에 주사한다. 리툭시맵 단독 또는 IL-21과 조합된 리툭시맵의 효과를 연구했다.

CB17-SCID 마우스에 1x10⁶ Raji 세포를 정맥내 주사했다. 또, 일부 마우스에는 단클론성 항체 Gr-1(BD Biosciences, 캘리포니아 팔로알토)를 주사했다. 마우스를 20㎍ 리툭산(Rituxan), 100㎍ mIL-21 또는 리툭산과 mIL-21의 조합을 복강내 주사하여 치료한다.

마우스를 다음의 상태에 대해 모니터했다: 1) 20%의 일정한 또는 빠른 체중 손실, 2) 마비 또는 직립자세를 유지하거나 이동할 수 없음, 3) 호흡 곤란 - 특히 콧소리를 내거나 청색증이 동반되는 경우, 4) 기면상태 또는 부드러운 자극에 반응하지 못함. 상기 기준을 충족하는 마우스를 안락사시켰다.

5, 9, 13, 17 및 21일에 그룹 1 내지 6에 Ab 치료제를 투약했다. 그룹 7 내지 10은 12, 19, 26, 33 및 40일에 치료했다. 그룹 1 내지 6에는 3-7일에 그리고 그룹 7 내지 10에는 10-14일에 단백질을 투약했다.

도 2는 IL-21+리툭시맵의 상승작용적 항-종양 활성이 항-Gr-1 MAb를 사용한 과립구 고갈에 의해 약화된 것을 나타낸다. 비-고갈 마우스(실선)와 비교했을 때, Raji를 지닌 SCID 마우스의 생존(100일에 살아남은 비율)은 과립구-고갈 SCID 마우스(점선)에서 현저히 감소한다.

실시예 11

항- CTLA4 항체와 조합된 IL-21

A. RENCA 세포 종양 모델

항-CTLA4 MAb와 조합된 IL-21이 마우스에서 종양 성장에 효과를 갖는지를 시험하기 위해서 RENCA 세포 종양 모델을 사용했다. RENCA 세포 주사를 이용하면 신장세포 암종 마우스 모델에 IL-12 및 IL-2와 같은 면역치료제를 사용한 치료에 반응하는 신장세포 전이성 종양이 확립된다는 것이 알려져 있다(Wigginton 등, J. of Nat. Cancer Inst. 88:38-43, 1996). 마우스 그룹에 RENCA 종양을 0일에 피하 주사했다. 다음, 마우스에 부형제 단독, 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb(클론 9H10, eBiosciences, 캘리포니아 샌디에고), 25ug mIL-21 단독, 또는 25ug mIL-21과 조합된 50ug 또는 100ug 항-CTLA4를 주사했다. 이 모델에서 일반적으로 효능 있는 항-종양 효과를 갖지 않는 저용량인 25ug mIL-21을 사용했다.

10주령의 암컷 BALB/c 마우스(Charles River Laboratories)에 0.1x10⁶ RENCA 세포를 0일에 우측 옆구리에서 피하 주사했다. 마우스 그룹은 5-9, 19-23일에 부형제(PBS, pH 7.2)만을 받거나, 또는 25ug mIL-21을 받았다. 개별 그룹들은 0, 4 및 8일에 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb만을 받거나, 또는 0, 4 및 8일에 항-CTLA4 MAb(50ug 또는 100ug)를 받고 5-9, 19-23일에 25ug mIL-21을 받았다. 모든 주사는 복강내 투여되었다. 5주 동안 매주 3번 캘리퍼스로 측정하여 종양 성장을 모니터했다. 1/2*(B)²*L(mm³)의 식을 이용하여 종양 부피를 계산했다.

mIL-21만을 주사하거나 또는 두 농도의 항-CTLA4 MAb만을 주사한 것은 종양 성장에 실질적인 효과를 갖지 않았다. 반대로, 두 농도의 항-CTLA4 MAb와 mIL-21의 조합은 대조표준과 비교하여 종양 부피에 현저한 감소를 나타냈다(도 1). 이들 데이터는 IL-21과 항-CTLA4 MAb의 조합이 상승작용적 항-종양 활성을 가지며, 암에 대한 가능한 조합 치료법이라는 것을 시사한다.

B. 항-마우스 CTLA4와 조합된 마우스 IL-21의 치료적 투여는 RENCA 모델에서 종양 성장을 억제한다

치료 섭생을 이용하여 투여되었을 때 IL-21과 항-CTLA4 MAb의 조합이 마우스에서 종양 성장에 효과를 가지는지를 시험하기 위해서, 마우스 그룹에 RENCA 종양을 0일에 피하 주사한다. 다음, 60-80mm³의 종양 부피에서 시작하여, 부형제 단독, 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb(클론 9H10, eBiosciences), 25ug mIL-21 단독, 또는 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb와 25ug mIL-21의 조합을 마우스에 주사한다. 이 모델에서 일반적으로 효능 있는 항-종양 효과를 가지지 않는 저용량인 25ug mIL-21을 사용한다. 종양 부피가 60-80mm³에 도달한 후, 1, 5, 9 및 13일에 항-CTLA4 MAb를 투여한다. mIL-21은 종양 부피가 60-80mm³에 도달한 후 5-9, 19-23일에 주사하거나 또는 1-10일에 주사한다. mIL-21과 항-CTLA4 MAb를 조합한 그룹에서 보여진 항-종양 효과는 치료 섭생으로 투여되었을 때 이 모델에서의 상승작용적 항-종양 효과를 시사한다.

10주령의 암컷 BALB/c 마우스(Charles River Laboratories)에 0.1x10⁶ RENCA 세포를 0일에 우측 옆구리에서 피하 주사했다. 종양 부피가 60-80mm³에 도달한 후 5-9, 19-23일 또는 1-10일에 마우스 그룹은 부형제(PBS, pH 7.2)만을 받거나, 또는 25ug mIL-21을 받았다. 개별 그룹들은 종양 부피가 60-80mm³에 도달한 후 1, 5, 9 및 13일에 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb만을 받거나, 또는 1, 5, 9 및 13일에 항-CTLA4 MAb(50ug 또는 100ug)를 받고 5-9, 19-23일 또는 1-10일에 25ug mIL-21을 받았다. 모든 주사는 복강내 투여되었다. 5주 동안 매주 3번 캘리퍼스로 측정하여 종양 성장을 모니터했다. 1/2*(B)²*L(mm³)의 식을 이용하여 종양 부피를 계산했다.

mIL-21과 항-CTLA4 MAb를 조합한 그룹에서 보여진 항-종양 효과는 치료 섭생으로 투여되었을 때 이 모델에서의 상승작용적 항-종양 효과를 시사한다. 이들 데이터는 IL-21과 항-CTLA4 MAb의 조합이 상승작용적 항-종양 활성을 가지며, 암에 대한 가능한 조합 치료법이라는 것을 시사한다.

C. mIL-21과 항-마우스 CTLA4를 사용한 조합 치료는 E.G7 흉선종 모델에서 종양 성장을 억제한다

mIL-21과 항-CTLA4 MAb의 조합이 항-종양 활성을 유도하는지를 시험하기 위해서 마우스 그룹에 E.G7 종양을 0일에 피하 주사한다(Shrikant, P 및 Mescher, M. J. Immunology 162:2858-2866, 1999). 다음에, 마우스에 부형제 단독, 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb(클론 9H10, eBiosciences), 25ug mIL-21 단독, 또는 25ug mIL-21과 조합된 50ug 또는 100ug 항-CTLA4를 주사했다. 이 모델에서 일반적으로 효능 있는 항-종양 효과를 갖지 않는 저용량인 25ug mIL-21을 사용했다. 항-CTLA4 MAb는 0, 4 및 8일에 투여한다. mIL-21은 5-9일, 19-23일 또는 2-20일에 격일(EOD)로 주사한다. mIL-21과 CTLA4를 조합한 그룹에서 보여진 항-종양 효과는 이 모델에서의 상승작용적 항-종양 효과를 시사한다.

10주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Charles River Laboratories)에 0.4x10⁶ E.G7 세포를 0일에 우측 옆구리에서 피하 주사했다. 다음, 마우스에 부형제 단독, 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb(클론 9H10, eBiosciences), 25ug mIL-21 단독, 또는 25ug mIL-21과 조합된 50ug 또는 100ug 항-CTLA4를 주사했다. 이 모델에서 일반적으로 효능 있는 항-종양 효과를 갖지 않는 저용량인 25ug mIL-21을 사용했다. 항-CTLA4 MAb는 0, 4 및 8일에 투여한다. mIL-21은 5-9일, 19-23일 또는 2-20일에 격일(EOD)로 주사한다. 복강내 주사는 200uL의 총 부피로 제공되었다. 모든 시제는 복강내 주사에 의해 제공된다. 4주 동안 매주 3번 캘리퍼스로 측정하여 종양 성장을 모니터했다. 1/2*(B)²*L(mm³)의 식을 이용하여 종양 부피를 계산했다.

mIL-21과 항-CTLA4 MAb를 조합한 그룹에서 보여진 항-종양 효과는 이 모델에서의 상승작용적 항-종양 효과를 시사한다. 이들 데이터는 IL-21과 항-CTLA4 MAb의 조합이 상승작용적 항-종양 활성을 가지며, 암에 대한 가능한 조합 치료법이라는 것을 시사한다.

D. mIL-21과 항-마우스 CTLA4 MAb의 조합 치료는 B16 흑색종 모델에서 종양 성장을 억제한다

mIL-21과 항-CTLA4 MAb의 조합이 다른 종양들에서 항-종양 활성을 유도하는지를 시험하기 위해서 마우스 그룹에 B16-F10 흑색종 세포(ATCC No. CRL-6475)를 0일에 피하 주사한다. 다음, 마우스에 부형제 단독, 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb (클론 9H10, eBiosciences), 25ug mIL-21 단독, 또는 25ug mIL-21과 조합된 50ug 또는 100ug 항-CTLA4를 주사한다. 항-CTLA4 MAb는 0, 4 및 8일에 투여한다. mIL-21은 5-9일, 19-23일 또는 2-20일에 격일(EOD)로 주사한다. mIL-21과 CTLA4를 조합한 그룹에서 보여진 항-종양 효과는 이 모델에서의 상승작용적 항-종양 효과를 시사한다.

10주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Charles River Laboratories)에 0.5x10⁶ B16 흑색종 세포를 0일에 우측 옆구리에서 피하 주사했다. 다음, 마우스에 부형제 단독, 50ug 또는 100ug 항-CTLA4 MAb(클론 9H10, eBiosciences), 25ug mIL-21 단독, 또는 25ug mIL-21과 조합된 50ug 또는 100ug 항-CTLA4를 주사했다. 항-CTLA4 MAb는 0, 4 및 8일에 투여한다. mIL-21은 5-9일, 19-23일 또는 2-20일에 격일(EOD)로 주사한다. 복강내 주사는 200uL의 총 부피로 제공되었다. 모든 시제는 복강내 주사에 의해 제공된다. 4주 동안 매주 3번 캘리퍼스로 측정하여 종양 성장을 모니터했다. 1/2*(B)²*L(mm³)의 식을 이용하여 종양 부피를 계산했다.

mIL-21과 항-CTLA4 MAb를 조합한 그룹에서 보여진 항-종양 효과는 이 모델에서의 상승작용적 항-종양 효과를 시사한다. 이들 데이터는 IL-21과 항-CTLA4 MAb의 조합이 상승작용적 항-종양 활성을 가지며, 암에 대한 가능한 조합 치료법이라는 것을 시사한다.

본원에서는 예시를 위해 본 발명의 특정한 구체예들이 설명되었지만, 전술한 것으로부터 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 다양한 변형들이 만들어질 수 있다는 것이 인정될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 것을 제외하면 제한되지 않는다.

<110> ZYMOGENETICS, INC. <120> METHODS OF TREATING CANCER USING IL-21 AND MONOCLONAL ANTIBODY THERAPY <150> US 60/572,973 <151> 2004-05-20 <150> US 60/635,380 <151> 2004-12-10 <150> US 60/671,281 <151> 2005-04-14 <150> US 60/680,447 <151> 2005-05-12 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)..(532) <400> 1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc 55 Met Arg Ser 1 agt cct ggc aac atg gag agg att gtc atc tgt ctg atg gtc atc ttc 103 Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe 5 10 15 ttg ggg aca ctg gtc cac aaa tca agc tcc caa ggt caa gat cgc cac 151 Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His 20 25 30 35 atg att aga atg cgt caa ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat 199 Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn 40 45 50 tat gtg aat gac ttg gtc cct gaa ttt ctg cca gct cca gaa gat gta 247 Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val 55 60 65 gag aca aac tgt gag tgg tca gct ttt tcc tgt ttt cag aag gcc caa 295 Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln 70 75 80 cta aag tca gca aat aca gga aac aat gaa agg ata atc aat gta tca 343 Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser 85 90 95 att aaa aag ctg aag agg aaa cca cct tcc aca aat gca ggg aga aga 391 Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg 100 105 110 115 cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tct tat gag aaa aaa 439 Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys 120 125 130 cca ccc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt ctc caa aag atg 487 Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met 135 140 145 att cat cag cat ctg tcc tct aga aca cac gga agt gaa gat tcc 532 Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser 150 155 160 tgaggatc taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt 590 catttctttg tattccaagt ggaggagccc tattaaatta tataaagaaa ta 642 <210> 2 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met 1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser

Claims (18)

1. 치료적 유효량의 단클론성 항체와, 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편의 치료적 유효량을 공동-투여하는 것을 포함하는 대상자에서의 암 치료 방법.
2. 치료적 유효량의 항-CD20 단클론성 항체와, 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편의 치료적 유효량을 공동-투여하는 것을 포함하는 대상자에서의 암 치료 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 단클론성 항체는 리툭시맵인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 암은 비-호지킨 림프종인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2 항에 있어서, 대상자는 사람 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 3 항에 있어서, 리툭시맵 및 IL-21 폴리펩티드를 연속 8주까지 매주 1회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 3 항에 있어서, 연속 8주까지 동안 리툭시맵은 매주 1회 투여하고 IL-21 폴리펩티드는 매주 5회까지 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 3 항에 있어서, IL-21 폴리펩티드 용량은 10 내지 500㎍/kg/용량인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 5 항에 있어서, 환자는 리툭시맵으로 이전에 치료된 적이 있고 감지할 정도의 종양 완화나 퇴행을 나타내지 않았던 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 5 항에 있어서, 환자는 리툭시맵 치료를 받은 후 재발한 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 치료적 유효량의 항-CD20 단클론성 항체와, 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편의 치료적 유효량을 공동-투여하는 것을 포함하며, IL-21의 투여가 최적의 면역학적 반응을 가져오는 것을 특징으로 하는 대상자에서의 암 치료 방법.
12. Her-2/neu 수용체에 결합하는 단클론성 항체와, 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편을 공동-투여하는 것을 포함하는 대상자에서의 암 치료 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 대상자는 사람 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 단클론성 항체는 트라스투주맵인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 세포독성 T 림프구-결합 항원 4(CTLA-4)에 결합하는 단클론성 항체와, 아미노산 잔기 30에서 잔기 162로 SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 폴리펩티드의 단편을 공동-투여하는 것을 포함하는 대상자에서의 암 치료 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 대상자는 사람 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 항-CTLA-4 단클론성 항체는 4회 사이클 동안 3주마다 3 mg/kg의 용량으로 투여하고, IL-21 폴리펩티드 또는 단편은 8주까지 매주 1 내지 5회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, IL-21 폴리펩티드 용량은 10 내지 500㎍/kg/용량인 것을 특징으로 하는 방법.

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