KR20060114011A - Ｔｏｌｌ-유사 수용체 유도성 사이토킨 및 케모킨 분비의샤페로닌 10 조절 - Google Patents

Abstract

본원은 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 Toll-유사 수용체 유도성 면역조절자 분비를 조절하기 위한 샤페로닌 10 (Cpn10)의 사용 방법에 관한 것이다. Cpn10은 Toll-유사 수용체 작용제-유도된 프로-염증성 사이토킨 및 케모킨, 예를 들어 각각 IL-6 및 RANTES의 분비를 네가티브하게 조절한다. Cpn10은 Toll-유사 수용체 작용제-유도된 소염성 사이토킨 및 케모킨, 예를 들어 IL-10의 분비를 포지티브하게 조절한다. Cpn10의 이러한 면역조절 활성은 과도한 프로-염증성 사이토킨 및 케모킨 분비로부터 발병하는 질환, 장애 및 상태를 조절하는데 유용할 수 있다. 또한, 본 발명은 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 Toll-유사 수용체 유도성 면역조절자 분비를 조절할 능력에 따라 Cpn10 작용제 및 길항제를 생성, 디자인 및/또는 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

샤페로닌, Cpn10, Toll-유사 수용체

Description

Ｔｏｌｌ-유사 수용체 유도성 사이토킨 및 케모킨 분비의 샤페로닌 10 조절{Charperonin 10 modulation of toll-like receptor-inducible cytokine and chemokine secretion}

본 발명은 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 Toll-유사 수용체 유도성 면역조절자의 생성 및/또는 분비를 조절하기 위한 샤페로닌 10의 이용에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 과다한 면역조절자 분비로부터 발병하는 질환, 장애 및 상태를 치료하기 위한 Toll-유사 수용체 유도성 사이토킨 및 케모킨 분비의 조절에 관한 것이다. 또한 본 발명은 샤페로닌 10의 작용제 (agonist) 및 길항제의 생성, 디자인 및/또는 스크리닝에 관한 것이다.

Toll-유사 수용체 부류는 곤충, 동물 및 식물에서 염증 및 면역에 중요한 역할을 한다. Toll-유사 수용체 (TLR)은 림프구, 대식구 및 수지상 세포를 포함한 단핵구계의 세포에 의해 발현된다.

TLR2는 특정 세균의 외벽 성분일 수 있는 리포테이초산 및 지펩티드 (lipopeptide)와 같은 TLR2 작용제에 의해 활성화된다. TLR3은 바이러스로부터 유 도되는 이중쇄 RNA와 같은 작용제에 의해 활성화된다.

TLR4는 그람-네가티브 세균의 외벽 성분인 지단백질, 지다당류 (LPS) 또는 내독소에 의해 활성화된다.

병원체, 또는 이로부터 유도되는 분자에 의한 TLR 활성화는 세포내 시그널화를 유도하여 주로 전사 인자 NF-κB [Beg, 2002, Trends Immunol. 2002 23 509-12]를 활성화하고 사이토킨 생성을 조절한다. 그러나, 또한 p38 미토겐 활성화된 키나제, c-Jun-N-말단 키나제 및 세포외 시그널 관련된 키나제 경로 [Flohe, et al., 2003, J Immunol, 170 2340-2348; Triantafilou & Triantafilou, 2002, Trends Immunol, 23 301-304]를 포함한 일련의 다른 경로도 촉발될 수 있다. 상이한 TLR의 결합에 의해 유도되는 유전자 조절의 패턴은 상이하나 종종 겹친다. 예를 들어, TLR3 작용제 및 이본쇄 RNA에 의해 상향조절되는 큰 비율의 유전자가 TLR4 작용제 및 LPS에 의해서도 상향조절된다 [Doyle et al., 2002, Immunity, 17 251-263]. 대식구에서 LPS에 의한 TLR4의 활성화로 TNF-α, IL-12 IL-lß, RANTES 및 MIP1β가 분비된다 [Flohe et al., 상기 참조; Jones et al., 2002, J Leukoc Biol, 69 1036-1044].

포유동물 샤페로닌 10 (또한 열 쇽 단백질 10으로도 공지됨)은 처음에는 단백질 접힘에 수반되는 미토콘드리아 단백질로서 기술되었으며, 세균 단백질 GroES의 상동체이다. GroEs 및 샤페로닌 10 (Cpn10)은 GroEL 또는 Hsp60 분자를 포함하는 컵-유사 구조에 뚜껑과 같이 결합하는 7원환으로 올리고머화하여, 변성된 단백질을 복합체로 묶는다 [Bukau & Horwich, 1998, Cell, 92 351-366; Hartl & Hayer- Hartl, 2002, Science, 295 1852-1858]. 또한, Cpn10은 종종 세포 표면 [Belles et al., 1999, Infect Immun, 67 4191-4200; Feng et al., 2001, Blood, 97 3505-3512] 및 세포외 유체 [Michael et al., 2003, J Biol Chem, 278 7607-7616; Johnson et al., 2003, Cir Rev Immunol, 23 15-44]에서 발견된다.

또한, Cpn10은 임신 시에 초기에 존재하는 억제 인자인 것으로 밝혀졌으며, 실험적 자가면역 뇌척수염, 지연형 과민성 및 동종이식 거부 모델에서 면역억제 활성을 나타내었다 [Zhang et al., 2003, J Neurol Sci, 212 37-46; Morton et al., 2000, Immunol Cell Biol, 78 603-607].

국제 출원 공개 제WO 02/40038호에 기술된 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) Cpn10을 사용한 최근의 연구는, 이러한 분자가 암, 알러지 반응 및/또는 Th2-타입 면역 반응에 의해 매개되는 상태와 같은 장애를 치료하는데 효능을 가질 수 있다는 것을 제시한다. 이는 TNF-α 및 IL-6와 같은 사이토킨의 유도를 통해 달성될 수 있다는 것을 제시한다.

그러나, Cpn10, 특히 포유동물 Cpn10이 이의 면역조절 효과를 발휘하는 작용의 메카니즘은 불명확하게 남아있었다.

발명의 요지

놀랍게도, 본 발명자는 Cpn10이 면역조절자 분비의 Toll-유사 수용체 작용제-매개된 자극을 조절한다는 것을 입증하였다.

보다 특히, Cpn10은 프로-염증성 면역조절자의 Toll-유사 수용체 매개된 유 도를 하향조절하고 소염성 면역조절자 분비의 Toll-유사 수용체 매개된 유도를 포지티브하게 조절한다.

따라서, 본 발명은 광범위하게는 샤페로닌 10 (Cpn10)에 의한 Toll-유사 수용체 시그널화의 조절에 관한 것이다.

제 1 양상으로, Cpn10 또는 Cpn10의 유도체를 동물, 세포, 조직 또는 기관에 투여하여 Toll-유사 수용체 시그널화를 조절하는 단계를 포함하여, 상기 동물, 또는 하나 이상의 세포, 또는 이로부터 유도된 조직 또는 기관에서 Toll-유사 수용체 시그널화를 조절하는 방법을 제공한다.

제 2 양상으로, 본 발명은 Cpn10 또는 Cpn10의 유도체를 동물, 세포, 조직 또는 기관에 투여하여 Toll-유사 수용체-유도성 면역조절자 생성 및/또는 분비를 조절하는 단계를 포함하여, 상기 동물, 또는 하나 이상의 세포, 또는 이로부터 유도된 조직 또는 기관에서 면역조절자 분비를 조절하는 방법을 제공한다.

이러한 양상에 따라, 본 발명은 질환, 장애 또는 상태를 예방학적으로나 치료학적으로 처리하기 위해 동물에서 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 면역조절자 생성 및/또는 분비를 조절하여 면역 반응을 조정하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 질환, 장애 또는 상태는 급성 또는 만성 염증 질환, 예를 들어 폐혈성 쇽, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 심장병, 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐 질환, 악액질, 다발성 경화증, GVHD, 이식 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택된다.

본 발명에 따라, Cpn10은 바람직하게는 TLR2, TLR3 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택되는 Toll-유사 수용체를 조절한다.

보다 바람직하게는, Toll-유사 수용체는 TLR2 및 TLR4 중에서 선택된다.

보다 더 바람직하게는, Toll-유사 수용체는 TLR4이다.

적합하게는, Cpn10은 Toll-유사 수용체 작용제에 의해 자극되거나 활성화되거나 유도되는 Toll-유사 수용체 시그널화 및 면역조절자 생성 및/또는 분비를 조절한다.

Toll-유사 수용체 작용제는 병원체, 병원체로부터 유도되거나 이에 의해 생성되는 분자, 또는 합성 Toll-유사 수용체 작용제일 수 있다.

바람직하게는, Toll-유사 수용체 작용제는 LPS, 지펩티드 및 이본쇄 RNA로 이루어진 군 중에서 선택된다.

하나의 양태에서, Toll-유사 수용체는 TLR4이고 작용제는 바람직하게는 LPS이다.

또 다른 양태에서, Toll-유사 수용체는 TLR3이고 작용제는 바람직하게는 이본쇄 RNA이다.

여전히 또 다른 양태에서, Toll-유사 수용체는 TLR2이고 작용제는 바람직하게는 지펩티드이다.

특정 양태에서, 지펩티드는 PAM₃CysSK₄일 수 있다.

적합하게는, 동물 또는 세포, 이로부터 유도되는 조직 또는 기관은 하나 이상의 Toll-유사 수용체를 발현하는 세포를 포함한다.

적합하게는, 세포는 면역 세포이다.

보다 바람직하게는, 면역 세포는 단구, 대식구, 수지상 세포 또는 림프구이다.

바람직하게는, 동물은 포유동물이다.

보다 바람직하게는, 동물은 사람이다.

상술한 양상에 따라, 하나의 양태에서, 면역조절자는, 이로 제한됨이 없이, 프로-염증성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α 또는 인터루킨 6 (IL-6), 또는 프로-염증성 케모킨, 예를 들어 RANTES이다.

또 다른 양태에서, 면역조절자는, 이로 제한됨이 없이, 소염성 사이토킨, 예를 들어 인터루킨-10 (IL-10), 또는 소염성 케모킨, 예를 들어 TGF-ß이다.

면역조절자가 프로-염증성 사이토킨 또는 케모킨인 양태에서, Cpn10의 투여는 바람직하게는 면역조절자의 생성 및/또는 분비를 억제, 저해 또는 감소시킨다.

면역조절자가 소염성 사이토킨 또는 케모킨인 양태에서, Cpn10의 투여는 바람직하게는 면역조절자의 생성 및/또는 분비를 증대, 촉진, 증진 또는 증가시킨다.

제 3 양태에서, 본 발명은 Toll-유사 수용체, Toll-유사 수용체 작용제 및 Cpn10을 포함하는 분리된 분자 복합체를 제공한다.

바람직하게는, Toll-유사 수용체는 TLR2, TLR3 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택된다.

보다 바람직하게는, Toll-유사 수용체는 TLR2 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택된다.

보다 더 바람직하게는, Toll-유사 수용체는 TLR4이다.

하나의 양태에서, Toll-유사 수용체가 TLR4인 경우 작용제는 LPS이다.

또 다른 양태에서, Toll-유사 수용체가 TLR3인 경우 작용제는 이본쇄 RNA이다.

또 다른 양태에서, Toll-유사 수용체가 TLR2인 경우 작용제는 PAM₃CysSK₄이다.

하나의 특정 양태에서, 본 발명은 TLR4, LPS 및 Cpn10를 포함하는 분리된 분자 복합체를 제공한다.

제 4 양상으로, 본 발명은 후보 작용제가 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 Toll-유사 수용체-유도성 면역조절자 생성 및/또는 분비의 Cpn10 조절을 모방하거나 증대시키는 가의 여부를 결정하는 단계를 포함하여, Cpn10 작용제를 생성, 디자인 또는 스크리닝하는 방법을 제공한다

제 5 양상으로, 본 발명은 후보 Cpn10 길항제가 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 Toll-유사 수용체-유도성 면역조절자 생성 및/또는 분비의 Cpn10 조절을 억제, 감소, 저해 또는 저하시키는 가의 여부를 결정하는 단계를 포함하여, Cpn10 길항제를 생성, 디자인 또는 스크리닝하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, Toll-유사 수용체는 TLR2, TLR3 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택된다.

보다 바람직하게는, Toll 수용체는 TLR2 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택 된다.

보다 더 바람직하게는, Toll-유사 수용체는 TLR4이다.

*제 6 양상으로, 본 발명은 상술된 양상에 따라 생성되거나 디자인되거나 스크리닝되는 Cpn10 작용제 또는 길항제를 제공한다.

본 명세서를 통해, "포함한다" 및 "포함하는"은 배타적인 것보다는 포괄적으로 사용되며, 언급된 정수 또는 일군의 정수들의 내포를 의미하기 위한 것으로서 어떠한 다른 정수 또는 일군의 정수라도 배제하고자 하는 것이 아니라는 것으로 이해될 것이다.

도 1은 Cpn10이 RAW264.7 세포의 LPS-유도된 활성화 및 프로-염증성 매개자 생성을 억제한다는 것을 나타낸다.

(A) LPS-유도된 NF-κB 활성의 Cpn10-매개된 억제. 9개의 분리된 실험에서, 100 μg/ml의 CpnlO (HsplO+) 또는 완충액 (HsplO-)을 2시간 동안 RAW264-HIV-LTR-LUC 세포와 함께 예비인큐베이션하였다. 이어서, LPS를 5, 1 및 0.2 ng/ml로 가하고, 2시간 후 루시페라제 활성을 측정하였다. 5 ng/ml의 LPS에 대해 얻어진 루시페라제의 상대적 광 단위 (RLU)를 100 % 상대적 루시페라제 활성으로 정하였으며, 0 %는 LPS의 부재 하에서 얻어진 RLU를 나타낸다. Cpn10 단독은 유의한 RLU를 자극하지 않았다 (자료 나타내지 않음). Cpn10에 의해 매개되는 RLU의 평균 감소율 (%) (± SD)을 각각의 LPS 농도에 대해 나타내었으며, 유의성은 쌍을 지은 t 시험을 이용하여 계산되었다.

(B,C) LPS-유도된 RANTES 및 IL-6 분비의 Cpn10-매개된 억제. RAW264.7 세포를 지시된 Cpn10 (Hsp10) 농축물과 함께 2시간 동안 인큐베이션한 후, 1 ng/ml의 LPS를 가하였다. 6시간 후, 3개 한조의 상등액을 ELISA로 RANTES 및 IL-6에 대해 분석하였다. 100 μg/ml Cpn10에 의해 매개되는 RANTES 및 IL-6 분비의 평균 감소율 (%)이 나타나 있다. 유의성은 쌍을 지은 t 시험을 이용하여 계사되었다.

도 2: 뮤린 시스템에서 Cpn10의 사이토킨 분비에 대한 효과.

(A) Cpn10 처리는 LPS-자극된 복막 대식구가 TNF-α를 생성하는 능력을 감소시켰다. C57BL/6 마우스 (n=3)를 Cpn10 (CpnlO+) 또는 대조군 희석액 (CpnlO-)으로 처리하였다. 복막 대식구를 6일째에 복막 세척에 의해 수거하고 처리군 내의 개별 동물로부터 푸울링하였다. 세포를 LPS (1 μg/ml)의 존재 하에 2 x 10⁵/웰로 도말하였다. 배양 상등액을 5시간째에 수집하고, TNF-α의 수준을 ELISA로 평가하였다. (LPS가 없는 웰은 검출가능한 TNF-α를 생성하지 않았다-자료 나타내지 않음). 3개 한조의 웰의 평균 ± SE를 나타내며, CD11b 염색에 기초하여 10⁵개 대식구 당 생성으로 표준화한다. 2개의 동일한 실험으로부터의 자료를 나타내며, 평균 감소율 (%)을 ANOVA에 의해 계산된 유의도와 함께 나타낸다.

(B) Cpn10 처리는 바장구로부터의 IL-10 생성을 증대시켰다. C57BL/6 마우스를 상기한 바와 같이 Cpn10 또는 대조군 희석액으로 처리하였다. 바장구를 6일 째 수거하였으며, 처리군 내의 개개 동물로부터 푸울링하고, LPS (10 μg/ml)의 존재 하에 5 x 10⁵/웰로 배양하였다. 배양 상등액을 48시간째에 수집하고, IL-10의 수준을 ELISA로 결정하였다. 3개 한조의 웰의 평균 ± SE를 나타낸다. 평균 증가율 (%)을 A에 대해서와 같이 계산되는 통계 자료로 나타낸다. (C) Cpn10 처리는 IL-10^-/- 복막 대식구로부터의 TNF-α 생성을 감소시켰다. IL-10^-/-C57BL/6 마우스를 상기한 바와 같이 Cpn10 또는 대조군 희석액으로 처리하고, 복막 대식구를 A에 대해서와 같이 수거하였다. LPS (0.1, 1 또는 10 μg/ml)의 존재 하에서의 배양 5시간 후, 배양 상등액 중의 TNF-α를 ELISA로 측정하였다. 하나의 대표적인 실험에 대한 3개 한조의 웰의 평균 ± SE를 나타낸다. TNF-α 수준을 비-매개변수적 t 시험을 이용하여 Cpn10 처리된 동물 및 대조군 동물에 대해 비교하였다.

도 3: 사람 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)의 Cpn10-처리는 LPS-유도된 TNF-α 및 IL-6 분비를 감소시키며, 내성을 유도하지 않는다. (A) Cpn10은 LPS-유도된 TNF-α 분비를 감소시켰다. CpnlO (1 및 10 μg/ml) 또는 완충액 (0)을 0.04 ng/ml의 LPS 첨가 1시간 전에 8개의 상이한 공여체로부터의 PBMC에 가하였다. 20시간 후 상등액을 제거시키고, TNF-α에 대해 분석하였다. 감소율 (%) 및 쌍을 지은 t 시험을 이용하여 계사된 유의성을 나타낸다. 모든 공여체에 대해, LPS의 부재 하에서 10 μg/ml의 CpnlO은 검출 수준 (31 μg/ml) 이상으로 TNF-α 수준을 유도하지 못했다 (자료 나타내지 않음). (B) 1시간 동안 LPS와 함께 예비-처리는 후속한 LPS-유도된 TNF-α 분비에 대해 내성을 유도할 수 없었다. PBMC를 지시된 LPS 예비-처리 농축물에 노출시켰다. 1시간 후, PBMC를 0.04 ng/ml의 LPS로 자극시키고, 20시간 후 상등액을 사이토킨에 대해 분석하였다. (C) Cpn10은 LPS-유도된 IL-6 분비를 감소시켰다. Cpn10 (1 및 10 μg/ml) 또는 완충액 (0)을 0.04 ng/ml의 LPS의 첨가 1시간 전에 8개의 상이한 공여체로부터의 PBMC에 가하였다. 20시간 후 상등액을 제거하고, IL-6에 대해 분석하였다. 감소율 (%) 및 유의성 (A에 대해서와 같이 계산됨)을 나타낸다. 모든 공여체에 대해, LPS의 부재 하에서 10 μg/ml의 CpnlO은 검출 수준 (9 pg/ml) 이상으로의 IL-6 수준을 유도하지 못했다 (자료 나타내지 않음). (D) 1시간 동안 LPS로의 예비-처리는 후속한 LPS-유도된 IL-6 분비에 내성을 유도할 수 없었다. PBMC를 LPS 예비-처리 농축물에 노출시켰다. 1시간 후, PBMC를 0.04 ng/ml의 LPS로 자극하고, 20시간 후 상등액을 사이토킨에 대해 분석하였다.

도 4: 뮤린 염증 모델에서 Cpn10 활성

(A) Cpn10은 LPS-유도된 혈청 TNF-α 및 RANTES 수준을 감소시키고 IL-10 수준을 증가시킨다. 5개의 분리된 실험에서, C57BL/6 마우스 (n=3 또는 4/그룹)에 10 μg의 LPS을 정맥 내 투여하기 30분 전에 완충액 (CpnlO^-) 또는 100 μg의 CpnlO (CpnlO⁺)을 정맥 내로 투여하였다. 1.5시간 후, 동물을 희생시키고, 혈청 TNF-α, RANTES 및 IL-10 수준을 측정하였다; (후자 2개는 3/5개 실험에서 평가되었다). 오차 막대는 각각의 실험에서의 표준 오차를 나타낸다. TNF-α 및 RANTES의 감소율 (%) 및 IL-10의 증가율 (%) (± SD)을 나타내고, 유의성은 ANOVA 시험을 이용하 여 계산한다.

(B) Cpn10으로의 예비-처리는 GVHD 사망율을 나타내며, 급성 질환의 임상적 중증도를 감소시킨다. 동계의 네가티브 조절 (n=8) (백색 원)은 동계의 B6D2F1 골수 및 T 세포로 이식된 B6D2F1 마우스를 나타낸다. 동종이계의 포지티브 대조군 (n=10) (백색 사각형)은 희석된 예비-처리된 B6 공여체 마우스로부터의 세포로 이식된 희석액 예비-처리된 B6D2F1 수령체 마우스를 나타낸다. 동종이계 + Cpn10 (n=10) (검은색 사각형)은 수령체 및 공여체 모두가 이식 전에 Cpn10으로 예비-처리되는 경우 B6 공여체 마우스로부터 골수 및 T 세포 이식물을 수령하는 B6D2F1 수령체를 나타낸다. 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 곡선 및 임상 스코어를 Cpn10의 존재 및 부재 하에 처리된 동종이계의 그룹 및 3개의 그룹에 대해, 각각 로그 랭크 통계 분석 (Log Rank Statistic) 및 비-매개변수적 t 시험으로 비교하여 나타낸다. 임상 스코어는 단지 7일째에 유의적으로 상이하였다.

도 5: (A) Cpn10으로의 처리의 존재 및 부재하에 완전 프로인트 아주방트 (CFA)가 투여된 BALB/c 마우스에 존재하는 피하 육아종의 면적. Cpn10 결과는 완충액 대조군 (보다 어둡게 음영됨, 우측 컬럼)과 비교하여 각각의 쌍의 컬럼의 좌측에 보다 밝게 음영된 컬럼으로 나타낸다. (B-E) PAM₃CysSK₄-유도된 대식구 활성화는 RAW264-HIV-LTR-LUC 세포에서 Cpn10에 의해 억제된다. (B) 2시간 동안 Cpn10 또는 희석액을 첨가한 후, 이어서 2시간 동안 PAM₃CysSK₄ 를 첨가하고, 이어서 루시페라제 검정함. (C) 2시간 동안 Cpn10 또는 희석액을 첨가하고, 이어서 Cpn10 또 는 희석액을 제거하기 위해 세척한 후, 2시간 동안 PAM₃CysSK₄를 첨가하고, 이어서 루시페라제 검정함. (D) 2시간 동안 Cpn10 또는 희석액을 첨가한 후, 이어서 2시간 동안 PAM₃CysSK₄ 를 첨가하고 루시페라제 검정함. (E) 세포가 PAM₃CysSK₄ 대신 LPS로 활성화된다는 것을 제외하고는 (B)에서와 같은 프로토콜이 이용됨. 상단 패널은 상대적 광 단위 자료를 나타내며, 하단은 Cpn10에 의해 매개되는 억제율 (%)을 나타낸다.

도 6: Cpn10은 리간드의 부재 하에 TLR4 또는 TLR2를 결합하지 않는다. 상부 패널: TLR4 포지티브 대조군. MD-2를 TLR4와 함께 (그러나 TLR2와는 아님) 공동-면역침전한다. 하부 패널: Cpn10은 이들 조건 및 리간드의 부재 하에서 TLR4 또는 TLR2와 물리적으로 상호작용하지 않는다.

도 7: Cpn10을 매일 피하 투여하면 래트에서 아주방트 관절염 동안 체중 손실을 감소시킨다. 아주방트 관절염 동안 평균 (± SEM) 중량 손실 (n=10/그룹).

도 8: LPS-자극된 RAW264.7 세포에 대한 Cpn10-매개된 활성은 LPS로의 오염 때문이 아니다. (A) Cpn10의 LPS 오염에 기인한 내성에 대한 시험으로서, LPS 자극 2시간 전 LPS 예비-처리는 LUC 활성을 억제하지 않았던 것으로 나타났다. RAW264-HIV-LTR-LUC 세포를 제시된 LPS 농축물로 이중으로 예비-처리하였다; 2시간 후 세포를 5, 1, 0.2 및 0 ng/ml의 LPS로 자극하고 2시간 후 LUC 활성을 측정하였다. (B) 트립신-처리된 Cpn10은 LPS-유도된 NF-κB 활성을 억제하지 못했다. RAW264-HIV-LTR-LUC 세포의 100 μg/ml의 CpnlO (HsplO)으로의 2시간 동안의 이중 처리는, 완충액 (대조군)으로 처리된 세포와 비교하여, 5, 1및 0.2 ng/ml의 LPS로 유도되는 RLU를 상당히 감소시켰다; 배경을 감한 후의 RLU의 감소율 (%)은 각각 29.7 ± 0.8 (SD), 50 ± 4.6, 및 71 ± 7.7이었다 (2개 인자 ANOVA에 의해 p < 0.001, LPS 농도에 대한 조건을 포함). 대조군과 비교하여, 5, 1 및 0.2 ng/ml의 LPS에 대해 각각, 트립신-처리된 Cpn10 (트립신 Hsp10)로의 처리는 0.1 ± 8. 8, 11.6 ± 4.2 및 21 ± 7.4 % 감소율을 나타내고 트립신-처리된 완충액 (트립신 완충액)으로의 처리는 1.4 ± 2.1, 5.8 ± 1.1 및 14.9 ± 2.4 % 감소율을 나타내었다; (대조군 또는 각각으로부터 유의하게 상이하지 않았다). 예상한 바와 같이, 자극하는 LPS의 트립신 처리는 LPS 활성에 영향을 끼치지 않았다 (트립신 LPS, p > 0.05). (C) LPS-유도된 활성의 Cpn10-매개된 감소는 용량 반응적이다. 실험은 Cpn10 (Hsp10) 농도가 제시된 바와 같이 변화하는 것을 제외하고는 도 1A에서와 같이 정하였다. 각각의 LPS 농도에 대해, Cpn10으로 예비-처리되지 않은 대조군 세포를 능가하는 LUC 활성의 억제율 (%)을 나타낸다.

도 9: Cpn10의 정맥 내 주입 (피하 주사는 아님)은 시험관 내에서 PBMC에 의한 LPS-유도된 TNF-α 반응의 크기 변화를 유도한다. (A) 0일 (주입 전 약 12시간) 및 1일 (주입 후 8시간)에서의 LPS-유도된 TNF-α 생성, (B) 주입 전부터 주입 후까지의 LPS-유도된 TNF-α 생성의 변화를 그래프화한 도 9A로부터의 자료, (C) 0일 (주입 전 약 12시간) 대 1일 (Cpn10/위약 피하주입 후 8시간)에서의 LPS-자극된 TNF-α 생성.

도 10: 5일 동안 매일 Cpn10의 정맥 내 주입은 시험관 내에서 PBMC에 의한 LPS-유도된 TNF-α 반응의 크기 변화를 유도한다. 1, 4 및 5일 (주입 후 약 8시간)에 분리된 세포와 비교하여 0일 (주입 전 약 12시간)에 분리된 PBMC로부터 LPS-유도된 TNF-α 생성. 또한, 8일 및 12일 (즉, 최종 5일 Cpn10 주입 후 각각 3일 및 7일)에 분리되는 PBMC를 0일의 LPS-자극된 반응과 비교하였다. 또한, 세포 배양 상등액을 IL-6의 생성에 대해 시험하고, TNF-α에 대해 서술된 바와 동일한 전체적인 경향을 입증하였다.

본 발명은, 적어도 부분적으로는, 많은 상이한 사람 및 뮤린의 시험관 내 및 생체 내 시스템에서 Cpn10이 단구, 대식구 및 단핵구를 포함한 세포에서 프로-염증성 사이토킨 TNF-α 및 IL-6 및 프로-염증성 케모킨 RANTES의 LPS-매개된 분비를 억제하고 소염성 사이토킨 IL-10의 LPS-유도된 분비를 증가시킨다는 발견에 기인하였다.

이는 미코박테리아 Cpn10이 TNF-α 및 IL-6와 같은 사이토킨의 발현을 증가시켜 TH2-매개된 면역 반응을 억제하도록 작용한다는 것을 제시하는 국제 공개 제WO 02/40038호와 대조된다.

특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명에 있어, Cpn10은 TH1- 및 TH2-의존적 메카니즘으로는 작용하지 않는다.

놀랍게도, 본 발명자는 Cpn10이 Toll-유사 수용체 작용제에 반응하여 Toll-유사 수용체 시그널화 및 그에 따른 면역조절자 분비에 영향을 끼친다는 것을 입증하였다.

보다 특히, Cpn10은 용량-의존적 방식으로 Toll-유사 수용체 작용제-자극된 NF-κB 활성화 및 TNF-α 및 RANTES 분비는 감소시키고 IL-10 분비는 증가시킨다.

또한, 본 발명자는 Toll-유사 수용체 및 Toll-유사 수용체 작용제가 분자 복합체를 형성한다는 것을 입증하였다. FRET 분석 결과, TLR 리간드 (예: LPS)의 존재 하에서, Cpn10과 Toll-유사 수용체 사이에 직접적 상호작용이 있을 수 있거나 적어도 이들이 매우 가까이 공간적으로 근접 (서로 1 내지 10 nm 이내)한다고 제시된다.

Toll-유사 수용체 작용제는 병원체 (예: 세균 또는 바이러스), 병원체로부터 유도되거나 이에 의해 생성되는 분자 (예: 세균성 LPS, 세균성 내독소, 미코박테리아 리포아라비노만난, 리포테이초산, 지펩티드 또는 바이러스성 이본쇄 RNA)이거나, 합성적 지펩티드 Toll-유사 수용체 작용제, 예를 들어 장쇄 아실화된 포화 지방산 (예: 라우르산 또는 팔미트산)에 연결되는 펩티드/아미노산, 예를 들어 TLR2 작용제 PAM₃CysSK₄일 수 있다.

본 발명의 목적 상, 용어 "면역조절자"는 면역계의 세포에 의해 분비되는 분자 매개자 또는 면역 반응의 활성화, 유지, 성숙, 억제, 저해 또는 증대 역할을 하는 면역계의 세포와 상호작용하는 분자 매개자를 의미한다.

용어 "사이토킨"은 면역반응의 활성화, 유지, 성숙, 억제, 저해 또는 증대 역할을 하는 면역계의 세포에 의해 분비되는 분자 매개자를 의미한다. 사이토킨의 비제한적 예는 TNF-α, 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-1ß (IL-1ß) 및 인터루킨-10 (IL-10)이다.

용어 "케모킨"은 세포 이동 및 활성화를 증진 및/또는 조절하는 작용을 하는 분자 매개자를 의미한다. 케모킨의 비제한적 예는 MIP1α, MIP1β, RANTES 및 TGF-β이다.

용어 "프로-염증성 면역조절자"는 염증 과정 또는 염증 반응에 관여하거나 이에 일부 관여하는 사이토킨 또는 케모킨을 의미한다.

프로-염증성 면역조절자의 비-제한적 예는 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-lß, RANTES 및 MIPlß이다.

용어 "소염성 면역조절자"는 염증 반응을 억제, 저해 또는 저하시키는 역할을 하는 사이토킨 또는 케모킨을 의미한다.

소염성 면역조절자의 비제한적 예는 IL-10 및 TGF-ß이다.

용어 "분리된"은 이의 천연 상태로부터 떼어내거나 사람이 조작한 물질을 의미한다. 분리된 물질은 통상적으로 천연 상태에서 이와 동반하는 성분이 실질적으로나 본질적으로 포함되지 않거나 통상적으로 천연 상태에서 이와 동반하는 성분과 함께 인공 상태에서 있을 수 있도록 조작될 수 있다. 분리된 물질은 천연, 화학적 합성 또는 재조합 형태일 수 있다.

용어 "단백질"은 아미노산 중합체를 의미한다. 아미노산은 당해 기술 분야에서 널리 이해되는 바와 같이 천연 또는 비-천연 아미노산 D- 및 L-아미노산일 수 있다.

용어 "펩티드"는 50개 이하의 아미노산을 갖는 단백질이다.

용어 "폴리펩티드"는 50개 초과의 아미노산을 갖는 단백질이다.

본원에 사용된 용어 "핵산"은 일- 또는 이-본쇄 mRNA, RNA, RNAi 및 DNA (cDNA 및 게놈성 DNA 포함)을 나타낸다.

CpnlO 및 CpnlO 단편, 변이체 및 유도체

본 발명에 따라, 용어 "Cpn10" 또는 "샤페로닌 10"은 사람, 마우스, 래트와 같은 포유동물의 Cpn10을 포함한 임의의 진핵생물 Cpn10 및 다른 형태의 Cpn10을 언급한다.

바람직하게는, Cpn10은 포유동물 Cpn10이다.

보다 바람직하게는, Cpn10은 사람 Cpn10이다.

Cpn10 단백질은 글리코실화 또는 아세틸화와 같은 천연 발생 변형을 포함하고/거나 천연, 합성 또는 재조합 형태이다. 또한, Cpn10은 "Hsp10"으로도 언급될 수 있다. 이는 동일한 단백질을 언급하는 것으로 처리되어야 한다.

본 발명에 따라, Cpn10의 단편도 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 용어 "단편"은 Cpn10 단백질의 100 % 미만, 그러나 적어도 30 %, 바람직하게는 적어도 50 %, 보다 바람직하게는 적어도 80 %, 보다 더 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 또는 98 %를 구성하는 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "단편"은 Cpn10 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 "생물학적 활성 단편"을 포함한다. 예를 들어, Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 면역조절자 분비를 조절할 수 있는 Cpn10의 생물학적 활성 단편이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 생물학적 활성 단편은 전체 Cpn10 단백질의 적어도 50 % 초과의 생물학적 활성, 바람직하게는 적어도 60 % 초과의 생물학적 활성, 보다 바람직하게는 적어도 75 % 초과의 생물학적 활성, 보다 더 바람직하게는 적어도 80 % 초과의 생물학적 활성, 유리하게는 Cpn10의 적어도 90 % 또는 95 %의 생물학적 활성을 구성한다.

본원에 사용된 용어 "변이체" 단백질은 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 대체된 단백질이다. 천연 또는 야생형 Cpn10의 생물학적 활성을 보유하는 Cpn10의 단백질 변이체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 아미노산은 단백질의 활성 특징을 변화시키지 않으면서 (보존적 치환) 광범위하게 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 변화될 수 있다는 것이 당해 기술 분야에서 널리 이해된다. 일반적으로, 폴리펩티드의 특성을 가장 크게 변화시킬 것 같은 치환은, (a) 친수성 잔기 (예: Ser 또는 Thr)를 소수성 잔기 (예: Leu, Ile, Phe 또는 Val) 대신 또는 상기 잔기에 의해 치환하는 것; (b) 시스틴 또는 프롤린을 임의의 다른 잔기 대신 또는 상기 잔기에 의해 치환하는 것; (c) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기 (예: Arg, His 또는 Lys)를 전기음성 잔기 (예: Glu 또는 Asp) 대신 또는 상기 잔기에 의해 치환하는 것; (d) 벌크 측쇄를 갖는 잔기 (예: Phe 또는 Trp)를 보다 작은 측쇄를 갖는 잔기 (예: Ala, Ser) 또는 측쇄가 없는 잔기 (예: Gly) 대신 또는 상기 잔기에 의해 치환하는 것이다.

Cpn10 변이체와 관련하여, 이들은 Cpn10 단백질을 돌연변이유발시키거나, 암호화 핵산을 예를 들어 무작위 돌연변이생성 또는 부위-지시된 돌연변이생성에 의해 돌연변이유발시켜 생성될 수 있다. 핵산 돌연변이유발 방법의 예가 문헌 [Chapter 9 of CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., 상기 참조, 본원에 참조로 삽입됨]에 제공된다.

본원에 사용된 본 발명의 "유도체" Cpn10 단백질은 당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 예를 들어 다른 화학적 잔기와 접합 또는 복합체화에 의하거나 전사-후 변형 기술에 의해 변형된 Cpn10 단백질 (융합 파트너 단백질을 포함)을 포함한다.

본 발명에 따라 고려되는 기타 유도체는, 이로 제한됨이 없이, 페길화, 측쇄의 변형, 단백질 합성 동안 비천연 아미노산 및/또는 이들의 유도체의 삽입 및 가교제의 사용 및 Cpn10 단백질에 구조적 제한을 부여하는 기타 방법을 포함한다. 본 발명에 따라 고려되는 측쇄 변형의 예는, 예를 들어 아세트산 무수물로의 아실화; 숙신산 무수물 및 테트라히드로프탈산 무수물로의 아미노기의 아실화; 메틸아세트이미데이트로의 아미딘화 (amidination); 시아네이트로의 아미노기의 카바모일화; 리신의 피리독살-5-포스페이트로의 피리독실화에 이어 NaBH₄로의 환원; 알데히드와의 반응에 의한 환원적 알킬화에 이어 NaBH₄로의 환원; 및 아미노기의 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS)으로의 트리니트로벤질화에 의한 아미노산의 변형을 포함한다.

카복실기는 O-아실이소우레아 형성을 통한 카보디이미드 활성화에 이어서 예를 들어 상응하는 아미드로의 후속한 유도체화에 의해 변형될 수 있다.

아르기닌 잔기의 구아니딘기는 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약을 사용한 헤테로사이클릭 축합 생성물의 형성에 변형될 수 있다.

술프히드릴기는 시스테산 (cysteic acid)로의 과포름산 산화; 4-클로로머큐리페닐술폰산, 4-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 페닐머큐리 클로라이드 및 기타 수은제를 사용한 수은 유도체의 형성; 기타 티올 화합물과의 혼합된 디술파이드의 형성; 말레이미드, 말레산 무수물 또는 기타 치환된 말레이미드와의 반응; 요오도아세트산 또는 요오도아세트아미드를 사용한 카복시메틸화; 및 알칼리 pH에서 시아네이트를 사용한 카바모일화와 같은 방법에 의해 변형될 수 있다.

트립토판 잔기는, 예를 들어 인돌 환을 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 술포닐 할라이드를 사용한 알킬화에 의하거나 N-브로모숙신이미드를 사용한 산화에 의해 변형될 수 있다.

티로신 잔기는 3-니트로티로신 유도체를 형성하도록 테트라니트로메탄을 사용한 니트로화에 의해 변형될 수 있다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 환은 디에틸피로카보네이트를 사용한 N-카브에톡실화에 의하거나 요오도아세트산 유도체를 사용한 알킬화에 의해 변형될 수 있다.

펩티드 합성 동안 비천연 아미노산 및 유도체의 삽입에 대한 예는, 이로 제한됨이 없이, 4-아미노 부티르산, 6-아미노헥사노산, 4-아미노-3-히드록시-5-페닐펜타노산, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵타노산, t-부틸글리신, 노르루이신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성체의 사용을 포함한다.

또한, 유도체는 융합 파트너 및 에피토프 택을 포함할 수 있다. 융합 파트너에 대한 널리 공지된 예는, 이로 제한됨이 없이, 글루타티온-S-트란스페라제 (GST), 사람 IgG의 Fc 부분, 말토즈 결합 단백질 (MBP) 및 헥사히스티딘 (HIS₆) (이는 친화성 크로마토그래피로 융합 단백질을 분리하는데 특히 유용하다)을 포함한다. 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩티드 정제의 목적상, 친화성 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스는 각각 글루타티온-, 아밀로즈- 및 니켈- 또는 코발트-결합된 수지이다. 많은 이러한 매트릭스가 "키트" 형태, 예를 들어 (HIS₆) 융합 파트너와 함께 유용한 QIAexpress^TM 시스템 (Qiagen) 및 파마시아 (Pharmacia) GST 정제 시스템과 같은 "키트" 형태로 입수될 수 있다.

융합 파트너에 대한 하나의 특정 예는, 예를 들어 문헌 [Morton el al., 2000, Immunol Cell Biol 78 603-607]에 기술된 바와 같은 GST이다. 일부 예에서, 융합 파트너는 또한 관련 프로테아제가 본 발명의 융합 폴리펩티드를 부분적으로 분해하여 이로부터 재조합 Cpn10 단백질을 방출하게 하는 인자 Xa 또는 트롬빈과 같은 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 이어서, 방출된 Cpn10 단백질은 후속한 크로마토그래피 분리에 의해 융합 파트너로부터 분리될 수 있다. GST-Cpn10의 트롬빈으로의 절단 시, 유도체 GSM-Cpn10 단백질이 생성된다.

또한, 본 발명에 따른 융합 파트너는, 이들의 범위 내에, 특이적 항체가 이용가능한 통상 짧은 펩티드인 "에피토프 택"을 포함한다. 특이적 단일클론 항체가 쉽게 이용가능한 에피토프 택에 대한 널리 공지된 예는 c-myc, 혈구응집소 (haemagglutinin) 및 FLAG 택을 포함한다.

본 발명에 따른 Cpn10 단백질 (단편, 변이체, 유도체 및 상동체를 포함)은 화학적 합성 및 재조합 발현을 포함한 당업자에게 공지된 어떠한 적합한 절차에 의해서도 제조될 수 있다.

바람직하게는, Cpn10은 재조합 Cpn10이다.

예를 들어, 재조합 Cpn10 단백질은

(i) 발현 벡터에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 Cpn10을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 발현 제작물을 제조하는 단계;

(ii) 적합한 숙주 세포를 상기 발현 제작물로 트랜스팩션 또는 형질전환시키는 단계; 및

(iii) 상기 재조합 단백질을 상기 숙주 세포에서 발현하는 단계를 포함하는 절차에 의해 제조될 수 있다.

문헌 [Morton et al., 2000, 상기 참조]에 기술된 방법이 재조합 Cpn10 단백질 생성 방법의 예이다.

치료 방법 및 제약학적 조성물

본 발명은 Toll-유사 수용체 시그널화 및 보다 특히 면역조절자 분비의 Cpn10-매개된 조절이 반응성 질환, 장애 또는 상태를 예방학적으로나 치료학적으로 처리하는데 사용될 수 있는 방법을 제공한다.

이러한 질환, 장애 또는 상태는 과도한 수준의 프로-염증성 사이토킨 및 케모킨에 의해 유발될 수 있으며, 따라서 Toll-유사 수용체 시그널화를 억제, 저해 또는 감소시키는 것에 반응적일 수 있다.

달리 또는 추가로, 이러한 질환, 장애 또는 상태는 Toll-유사 수용체 시그널화 및 소염성 사이토킨 및 케모킨 분비를 증대, 촉진, 증진 또는 증가시키는 것에 반응적일 수 있다,

예를 들어, Cpn10은 생체 내의 비-치명적 내독소혈증 마우스 모델에서 TNF-α 및 RANTES 생성을 감소시키고 IL-10 생성을 증가시킨다. 또한, Cpn10은 생체 내 마우스 이식 모델에서 상당한 면역억제 활성을 가지며, Cpn10 처리는 이식편 대 숙주 질환을 앓는 마우스의 생존율을 증가시킨다.

또한, Cpn10은 아주방트-유도된 관절염을 앓는 래트에서 악액질을 감소시킨다. 증가된 수준의 염증 사이토킨은 많은 질환, 예를 들어 암 및 류마티스성 관절염에서 악액질과 관련된다.

또한, Cpn10은 생체 내 마우스 모델에서 상처 치유를 개선한다.

생체 내에서 사람에 대해 단일 정맥 내 용량으로 투여되는 Cpn10은 용량-반응적 방식으로 생체 외에서 LPS-자극 후 프로-염증성 사이토킨 반응을 현저히 감소시키며, Cpn10이 사람 임상 시도 피검물에서 면역조절 효과를 갖는다는 것을 분명히 입증한다.

과도한 염증 또는 축소되지 않은 면역 반응은 숙주에 대해 치명적이므로 프로-염증성 매개자의 생성을 약하게 하기 위해 많은 네가티브 피드백 시스템을 전개시켰다. 하나의 이러한 네가티브 피드백 메카니즘은 단핵구 및 단구에 의해 분비되는 중요한 면역조절 사이토킨인 IL-10을 포함하며, 이는 염증 반응의 제한 및 면역 내성의 유도에 수반된다.

Cpn10은 TNF-α, IL-6 또는 RANTES 분비를 억제하나 파괴하지는 않는다. 이는, 완전한 TNF-α 제거 (예를 들어 항-TNF-α 항체에 의한 제거)는 손상된 면역을 일으켜 환자를 감염에 걸리게 쉽게 하고 환자를 증가된 종양 빈발에 걸리게 할 수 있는 감소된 종양 감독을 겪게 할 수 있기 때문에 바람직한 특성이다.

*프로-염증성 면역조절자의 생성 및/또는 분비를 감소시키는 Cpn10의 능력은 과도한 프로-염증성 면역조절자 분비가 질환을 이끄는 상태에서 치료학적 적용을 발견할 것이다.

많은 질환이 과도하거나 만성인 염증과 관련되므로, 사이토킨 분비를 조절하는 TLR 수용체 시그널화의 조절은 광범위한 임상적 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로-염증성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α의 과도한 분비는 급성 상태, 예를 들어 패혈증 쇽에서 죽음에 대한 선도적 원인 중의 하나이며, 만성 염증성 질환, 예를 들어 염증성 장 질환 (IBD), 관절염, 건선, 울혈성 심장병, 다발성 경화증 및 만성 폐색성 폐 질환에서 진행성 조직 손상에 기여하는 주요 요인 중의 하나이다.

조직 또는 기관 이식에서, 숙주 또는 공여체 림프구는 공여체 또는 숙주 세포 항원을 각각 외래 및 방출 사이토킨으로 인식하여 고유한 면역계의 세포를 활성화시킴으로써 이식된 조직 또는 기관의 거부 또는 이식편 대 숙주 질환을 발병시킬 수 있다. 면역억제 약물은 이식 거부 및 이식편 대 숙주 질환의 치료학적 처리 및 관리에서 커다란 역할을 한다. 그러나, 이러한 약물은 환자에서 심각한 부작용을 일으키며, 매우 비싸고, 일부 환자에서는 효과가 좋지 않다.

Cpn10 (Cpn10의 변이체, 단편 및 유도체 포함)은 생체 내에서 동물에 투여될 수 있거나 동물로부터 수득된 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관에 시험관 내에서 투여될 수 있어 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 Toll-유사 수용체-유도성 면역조절자 생성 및/또는 분비를 조절할 수 있다.

전형적으로, 비록 배타적이지는 않지만, Cpn10 (이의 변이체, 유도체 단편을 포함)은 적합한 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 제약학적 조성물로서 전달될 수 있다.

용어 "제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 전신계 투여에 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 투여의 특정 경로에 의존하여, 당해 기술 분야에 널리 공지된 다양한 담체가 사용될 수 있다. 이들 담체는 슈가, 전분, 셀룰로즈 및 이의 유도체, 맥아, 젤라틴, 활석, 황산칼슘, 식물성유, 합성유, 폴리올, 알긴산, 포스페이트 완충된 용액, 유화제, 등장성 염수 및 염, 예를 들어 무기산염,예를 들어 히드로클로라이드, 브로마이드 및 술페이트, 유기산, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트 및 발열물-비함유 물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 기술하는 유용한 참조문은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991), 본원에 참조로 삽입됨]이다.

어떠한 안정한 투여 경로도 본 발명의 조성물을 환자에게 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 설하, 구강, 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 피 내, 피하, 흡입, 안 내, 복강 내, 뇌실 내, 경피 등이 이용될 수 있다. 근육 내 및 피하 주사가 예를 들어 면역원성 조성물, 백신 및 DNA 백신의 투여에 대해 적합하다.

투여 형태는 정제, 분산제, 현탁제, 주사제, 용액제, 시럽제, 트로키제, 캡슐제, 좌제, 에어로졸제, 경치 패치제 등을 포함한다. 또한, 이들 투여 형태는 이러한 목적을 위해 특별히 고안된 조절된 방출 디바이스 또는 추가적으로 이러한 방식으로 작용하도록 변형되는 이식물의 다른 형태의 주입 또는 이식을 포함할 수 있다. 치료제의 조절된 방출은 치료제를 예를 들어 아크릴성 수지, 왁스, 고급 지방족 알콜, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 특정한 셀룰로즈 유도체, 예를 들어 히드록시프로필메틸 셀룰로즈를 포함한 소수성 중합체로 코팅함으로써 수행될 있다. 또한, 조절된 방출은 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 마이크로스피어를 사용하여 수행될 수 있다.

상기 조성물은 투여 제형물과 적합한 방식으로 제약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명과 관련하여 환자에게 투여되는 용량은 적합한 기간에 걸쳐 환자에게 유리한 반응을 끼치기에 충분해야 한다. 투여되는 제제(들)의 양은 처리되는 대상 (나이, 성별, 체중 및 일반적 건강 상태를 포함), 의사의 판단에 따른 요소들에 의존할 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물 및 치료 방법은 의학적 및/또는 수의학적 이용에 적합할 수 있어, 포유동물, 예를 들어 사람, 가축 (livestock 또는 domestic animal) 및 곡예 동물을 포함한 사람 및 비-사람 동물 (이로 제한되지 않음)에서 사용될 수 있다.

Cpn10 작용제 및 길항제

본 발명은 Cpn10 작용제 또는 길항제를 조작, 디자인, 스크리닝 또는 생성하는 방법을 고려한다.

Toll-유사 수용체 시그널화 및 면역조절자 분비에 대한 Cpn10의 효과의 설명은 새롭고 예기치 못한 기회를 제공하여 이로써 Cpn10 작용제 및 길항제는 Toll-유사 수용체 시그널화 및 면역조절자 분비 시 이들의 효과에 따라 특별히 디자인되거나 스크리닝될 수 있다. 원칙적으로, 이러한 면역조절 활성은 Cpn10에 의해 보유되는 샤페론 활성에 대해 독립적일 수 있다.

용어 "작용제"는 또 다른 분자 또는 수용체 부위의 활성을 증진시키는 분자를 언급한다.

전형적으로, Cpn10 작용제는 통상적으로 Toll-유사 수용체 작용제에 의해 유발되는 프로-염증성 사이토킨 또는 케모킨 분비를 저해, 감소 또는 억제시킨다.

전형적으로, Cpn10 작용제는 Toll-유사 수용체 작용제에 의해 유도되는 소염성 사이토킨 또는 케모킨을 증대, 촉진 또는 증가시킨다.

용어 "길항제"는 또 다른 분자 또는 수용체 부위의 활성을 차단 또는 억제하는 분자를 언급한다.

전형적으로, Cpn10 길항제는 Toll-유사 수용체 작용제에 의해 유도되는 프로-염증성 사이토킨 또는 케모킨 분비를 네가티브하게 조절하도록 Cpn10의 능력을 저해, 감소 또는 억제시킨다.

전형적으로, Cpn10 길항제는 Toll-유사 수용체 작용제에 의한 소염성 사이토킨 또는 케모킨 분비의 유도를 포지티브하게 조절하도록 Cpn10의 능력을 억제시킨다.

하나의 양태에서, 작용제 또는 길항제는, 비록 본 발명이 Cpn10과 구조적 유사성을 갖는 작용제 및/또는 길항제로 제한되지는 않지만, Cpn10의 모방체 (mimetic)일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "모방체"는 Cpn10의 하나 이상의 특정 구조적 및/또는 기능적 영역 또는 도메인을 닮은 분자를 언급하며, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는 Cpn10의 변형된 형태를 포함한다.

하나의 특정 형태로서, 본 발명은 후보 Cpn10 작용제 또는 길항제가 Toll-유사 수용체 시그널화 및/또는 Toll-유사 수용체-유도성 면역조절자 분비를 조절하는지의 여부를 결정함으로써 Cpn10 작용제 및/또는 길항제가 조작, 디자인, 스크리닝 또는 생산될 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라, Toll-유사 수용체 시그널화 및 면역조절자 생성 및/또는 분비가 세포 내 또는 세포 외 분비 단백질을 측정 또는 검출, 리포터 유전자 검정 및 세포 내 시그널화 분자를 검출하거나 측정하는 검정에 의해 유전자 발현 (예를 들어, 내인성 사이토킨 또는 케모킨 RNA의 생성)의 수준에서 측정되거나 검출될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

하나의 특정 양태에서, 본 발명은 Toll-유사 수용체 시그널화가 시험관 내에서 NF-κB 활성에 따라 측정되거나 검출되는 방법을 제공한다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 Toll-유사 수용체 시그널화가 하나 이상의 면역조절자의 분비, 예를 들어 IL-6, TNF-α, RANTES, IL-10, IL-12 및 IL-lα 생성 및/또는 분비에 따라 측정되거나 검출되는 방법을 제공한다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 Toll-유사 수용체 시그널화가 c-Jun-N-말단 키나제 및/또는 세포외 시그널 관련된 키나제 시그널화에 따라 측정되거나 검출되는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라, Cpn10, Toll-유사 수용체 및 Toll-유사 수용체 작용제를 포함하는 분리된 분자 복합체는 Cpn10 작용제 또는 길항제를 생성, 디자인 또는 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

특정 형태에서, 분리된 분자 복합체는 Cpn10, TLR-4 및 LPS를 포함한다.

단지 예시로써, 후보 작용제는 Toll-유사 수용체 및 Toll-유사 수용체 작용제와 분자 복합체를 형성하는 능력에 의해 확인될 수 있다.

단지 예시로써, 후보 길항제는 Cpn10, Toll-유사 수용체 및 Toll-유사 수용체 작용제를 포함하는 분자 복합체의 형성을 방지 또는 파괴하는 능력에 의해 확인될 수 있다.

*전술한 바에 비추어, 본 발명에 따른 Cpn10 작용제 및/또는 길항제의 생성을 촉진할 수 있는 수개의 기술이 있다는 것이 이해될 것이다.

비제한적 예는, 문헌 [Nestler & Liu, 1998, Comb. Chem. High Throughput Screen. 1,113 and Kirkpatrick et al., 1999, Comb. Chem. High Throughput Screen 2 211]에 기술된 바와 같은 방법에 의해 합성 화학 라이브러리 (조합적 라이브러리를 포함)과 같은 분자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다.

또한, 천연 발생 분자의 라이브러리는 문헌 [Kolb, 1998, Prog. Drug. Res. 51 185]에서 검토되는 바와 같은 방법에 의해 스크리닝될 수 있는 것으로 고려된다.

보다 구조적인 접근은 당해 기술 분야에서 널리 공지되어 있는 바와 같이 구조적 데이타베이스에 대한 컴퓨터 조력된 스크리닝, 컴퓨터-조력된 모델링 및/또는 디자인, 분자 결합 상호작용을 검출하는 보다 전통적인 생물물리학적 기술을 이용할 수 있다.

컴퓨터-조력된 구조적 데이터베이스의 조사, 모델링 및 디자인이 작용제 및 길항제 분자를 조작하기 위한 절차로서 그 이용이 증가되고 있다. 데이터베이스 조사 방법의 예를 문헌 [국제 출원 공개 제WO 94/18232호 (HIV 항원 모방체 생성에 관련됨), 미국 특허 제5,752,019호 및 국제 출원 공개 제WO 97/41526호 (EPO 모방체의 확인에 관련됨), 각각이 본원에 참조로 삽입됨]에서 찾을 수 있다.

일반적으로, 다른 적용가능한 방법은 분자 상호작용을 확인하는 다양한 생물물리학적 기술을 포함한다. 경쟁적 방사성리간드 결합 검정, 분석적 초원심분리, 마이크로열량법, 표면 플라스몬 공명 및 광학 바이오센서-기초된 방법과 같은 잠재적으로 유용한 기술에 적용가능한 방법이 문헌 [Chapter 20 of CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, 1997), 본원에 참조로 삽입됨]에 제공된다.

본 발명이 보다 용이하게 이해되고 실제 효과와 관련될 수 있도록, 하기 비제한적 실시예가 기술된다.

실시예 1: LPS -자극된 사이토킨 및 케모킨의 Cpn10 조절

재료 및 방법

Cpn10의 생성 및 정제

재조합 사람 Cpn10 (GenBank 입수 번호 X75821)을 본질적으로 문헌 [Ryan et al., Ryan et al. , 1995, J Biol Chem, 270 22037-22043]에 기술되어 있는 바와 같이 이. 콜라이에서 생성하였다. 또한, 마크로-프렙 하이 Q (Macro-Prep High Q) (BioRad)를 결합하지 않았던 물질을 에스-세파로즈 (S-Sepharose) 및 이어서 겔-필트레이션 (Gel-Filtration) (Superdex 200, Amersham Biosciences)으로 더욱 정제하였다. 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 및 150 mM NaCl 완충액 중의 정제된 Cpn10을 제작자 (Pall Corporation, Ann Arbor, MI. Cat No. MSTG5E3)의 교시에 따라 0.2 mm 무스탕 E (Mustang E) 막을 사용하여 아크로디스크 (Acrodisc)를 통해 여과하여 잔류 내독소를 제거하였으며, -70 ℃에서 보관하였다. Cpn10의 순도는 SDS-PAGE에 의해 97 %를 초과하는 것으로 측정되었다. 사용하기 전에 분취물을 일단 해동하였다. Cpn10의 모든 배치는 GroEL-매개된 로다네즈 재접힘 검정에서 이. 콜라이 GroES와 동일한 몰 (molar) 활성을 나타내었다 [Brinker et al., 2001, Cell, 107 223-233] (데이터 나타내지 않음). Cpn10의 LPS 오염은 리물루스 아메바상 용해물 검정 (Limulus Amebocyte Lysate assay) (BioWhittaker, Walkersville, MD)에 의해 정제된 Cpn10 단백질 mg 당 1 EU 미만인 것으로 측정되었다.

종양 세포주

K562 (사람 적백혈병), Mono Mac 6 (사람 단세포주), U937 (사람 조직구 림프종), P815 (마우스 비만세포종), EL4 (마우스 T 세포 림프종), Jurkat (사람 T 세포 백혈병), RAW 264.7 (ATCC TIB 71, 마우스 대식구), L929 (마우스 섬유육종), B16 (마우스 흑색종), HeLa (사람 경부암) 및 MCA-2 (마우스 섬유육종) 세포주는 미코플라스마 음성인 것을 밝혀졌다. 세포들을 RPMI 1640 (Gibco Labs, Life Technologies, Grand Island, N. Y., USA), 10 % 우태혈청 (Life Technologies), 2 mM 글루타민 (Sigma), 10 mM HEPES (Sigma), 100 g/ml의 스트렙토마이신 및 100 IU/ml의 페니실린 (CSL Ltd, Melbourne, Australia)를 포함하는 내독소-비함유 배지에서 성장시켰다.

RAW264 -HIV- LTR -LUC 생검정

RAW264-HIV-LTR-LUC 세포를 액체 질소로부터 회수한 후 1주일 동안 G418 (200 μg/ml)의 존재 하에서 배양하고, 25 cm³ 플라스크 (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Germany)에서 현탁 배양으로 성장시켰다. RAW264-HIV-LTR-LUC 세포를 반복된 피펫팅으로 분해시키고, 24-웰 평판에 2.5 x 10⁵개 세포/웰로 도말한 후, 밤새 인큐베이션하였다 (37 ℃ 및 5 % CO₂). 이. 콜라이로부터의 LPS (Sigma L-6529. Strain 055 : B5, Sigma)를 멸균 증류수에 용해시키고, 유리 바이알에 1 mg/ml로 4 ℃에서 저장하였다. 분취량을 취해 사용하기 바로 직전에 용액을 격렬히 와류시켰다. Cpn10은 2시간 동안 세포 배양물에 가하고, 이어서 지시된 농도의 LPS를 첨가하며, 추가의 2시간 후 유착 세포를 루시페라제 검정 (Luciferase Assay System, Promega, Madison, WI)하였다. 루시페라제 활성을 터너 디자인 루미노미터 TD 20/20 (Turner Designs Luminometer TD 20/20)에서 15초 동안 판독하였다.

RAW264 .7 IL-6 및 RANTES 검정

RAW264.7 세포를 24-웰 평판에 2.5 x 10⁵개 세포/웰로 도말한 후, (37 ℃ 및 5 % CO₂에서 밤새 배양하였다. Cpn10 또는 완충액을 2시간 동안 삼중으로 세포에 가하고, 이어서 LPS (1 ng/ml)를 가하였다. 6시간 후 상등액을 수집하고, 듀오세트 ELISA 키트 (Duoset ELISA kit) (R & D Systems)로 RANTES 및 IL-6의 생성에 대해 삼중으로 분석하였다. 각각의 샘플의 흡광도 (450 nm)를 마이크로평판 판독기 (Magellan 3, Sunrise-Tecan, Durham, NC)를 사용하여 측정하였다.

Cpn10 처리된 동물로부터 유도된 비장구 및 대식구로부터 사이토킨 생성

C57BL/6 (H-2^b, Ly-5.2⁺) 마우스를 호주 연구소 (Australian Research Centre, Perth, Western Australia, Australia)로부터 구입하였으며, C57BL/6 IL-10^-/- 마우스 (H-2b, Ly-5.2⁺)는 호주 국립대학교 (Australian National University, Canberra, Australia)에 의해 공급되었다. 사용된 배양 배지는 50 유니트/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 비필수 아미노산, 0.02 mM 13-머캅토에탄올 및 10 mM HEPES로 보충된 10 % FCS/IMDM (JRH Biosciences, Lenexa, KS)이었으며, 세포를 pH 7.75, 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 배양하였다. C57BL/6 마우스 (그룹 당 n=3)를 5일 동안 매일 Cpn10 (100 μg) 또는 희석제의 피하 주사로 처리하고, 다음날 복막 세척에 의해 복막 대식구를 수거한 후, 처리 그룹 내의 각각의 동물로부터 푸울링하였다. 세포를 LPS (1 μg/ml)의 존재 하에 2x10⁵ 개/웰로 삼중으로 도말하였다. 배양 상등액을 5시간째에 수집하고, TNF-α의 수준을 ELISA (하기 참조)로 평가하였다. 그 결과를 도입 세포의 FACS 분석에 의해 CDl1b 염색을 토대로 10⁵개 대식구 당 생성으로 표준화하였다. IL-10 측정을 위해 비장구를 동일한 동물로부터 수거하고, 상기한 바와 같이 푸울링한 다음 LPS (10 μg/ml)의 부재 (나타내지 않음) 또는 존재 하에 5 x 10⁵/웰로 삼중으로 배양하였다. 배양 상등액을 48시간에 수집하고 IL-10의 수준을 ㄸ ELISA로 측정하였다 (하기 참조).

LPS 로 시험관 내에서 자극된 뮤린 세포에 대한 사이토킨 검정

TNF-α 및 IL-10 ELISA 검정에 사용된 단일클론 항체쌍은 파밍겐 (PharMingen, San Diego, CA)으로부터 구입하였으며, 제작자에 의해 권장되는 농도로 사용되었다. 상등액을 배양 배지에 1:1로 IL-10 및 TNF-α를 희석하였다. 사이토킨을 포획 항체로 포획하고 직접적 바이오틴-표지된 검출 항체로 검출하였다. 이어서, 스트렙트아비딘-표지된 서양고추냉이 퍼옥시다제 (Kirkegaard and Perry laboratories, Gaithersburg, MD) 및 기질 (Sigmafast OPD)을 사용하여 고정화된 바이오틴을 측정하였다. 평판을 스펙트라플로르 플러스 마이크로평판 판독기 (Spectraflour Plus microplate reader, Tecan)를 사용하여 492 nm에서 판독하였다. 재조합 사이토킨 (PharMingen)을 ELISA 검정을 위한 표준물로 사용하였다. 기준을 이중으로 진행하였으며, 검정의 감도는 IL-10 및 TNF-α에 대해 15 pg/ml이었다.

사람 PBMC TNF -α 및 IL-6 검정

사람 말초혈 단핵구 (PBMC)를 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque)에서의 부양성 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 지원자로부터의 헤파린 처리된 혈액으로부터 분리하였다. PBMC는 10⁶개 생존 세포/ml로 96-웰 조직 배양 평판 (Greiner) 중 200 μl로 분배하였다. 이어서, Cpn10을 가하고, 평판을 1시간 동안 인큐베이션하며, LPS를 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂에서 추가의 20시간 동안 인큐베이션한 후, 상등액을 수집하여 이중 샘플을 TNF-α 및 IL-6 생성에 대해 분석하였다 (Duoset ELISA kits; R & D Systems). 이들 검정의 감도는 31 μg/ml TNF-α 및 9 pg/ml IL-6이었다.

LPS 주사 후 마우스 혈청 TNF -α, RANTES 및 IL-10 검정

8 내지 10주령의 암컷 BALB/c 마우스 (Animal Resource Centre, Perth, Australia)를 약 10분 동안 가열 램프 하에 두고, 제지한 후, Cpn10을 특정 용량으로 정맥 내 주사하였다. 30분 후, 10 μg의 LPS를 동일한 프로토콜을 이용하여 정맥 내 주사하였다. LPS 주사한 지 1.5시간 후, 혈액을 심장천자에 의해 1 ml의 응고 가속화 튜브 (MiniCollect, Interpath)에 수집한 후, ELISA 키트 (R & D Systems)를 사용하여 혈청 TNF-α 및 RANTES를 분석하기 위해 4 ℃에서 보관하였다. 혈청 중 IL-10 생성을 마우스 OptEIA IL-10 특이적 ELISA (BD Biosciences Pharmingen)로 측정하였다.

골수 이식 및 이식편 대 숙주 질환 ( GVHD )

8 내지 14주령의 암컷 C57BL/6 (B6, H-2^b, Ly-5.2⁺), B6 Ptprc^a Ly-5a (H-2^b, Ly-5.1⁺) 및 B6D2F1 (H-2^b/d, Ly-5.2⁺) 마우스를 호주 연구소 (Australian Research Centre, Perth, Western Australia, Australia)에서 구입하였다. CpnlO (100 μg/동물) 또는 대조군 희석액을 이식하기 전에 공여체 및 수령체 동물에 5일 동안 매일 피하 주사하였다. 마우스를 멸균된 마이크로분리 우리에 가두고, 이식 후 처음 2주 동안 산성화되고 오토클레이브한 물 (pH 2.5) 및 정규식을 주었다. 마우스를 문헌 [Hill et al., 1997, Blood, 90 3204-3213; Hill et al., 1998, J Clin Invest, 102, 115-123]에 기술된 표준 프로토콜에 따라 이식하였다. 간단히 설명하며, 1일째에 B6D2F1 마우스에 1300 cGy의 총 신체 조사 (^l37Cs 공급, 108 cGy/분)를 수행하였으며, 위장 독성을 최소화하기 위해 3시간 차이로 분리된 2회 용량으로 나누었다. 공여체 골수 (5 x 10⁶) 및 공여체 나일론 울 정제된 비장 T 세포 (2 x 10⁶)를 0.25 ml의 레이보비츠 L-15 배지 (Leibovitz's L-15 media, Gibco BRL, Gaithersburg MD)에 재현탁시키고, 각각의 수령체에 정맥 내로 주사하였다. 매일 생존을 모니터링하고, GVHD 임상 스코어를 매주 측정하였다. 체계적인 GVHD의 정도는 5개의 임상 변수 (체중 감량, 자세 (구부림: hunching), 활동, 모피 조직 및 피부의 온전함)의 변화 (최대 지수 = 10)를 합산하는 점수화 시스템으로 평가하였다 [Hill et al., 1997, supra ; Hill et al., 1998, J Clin Invest, 102 115-123; Cook et al., 1996, Blood, 88 3230-3239]. 각각의 마우스의 귀에 꼬리표를 붙이고 처리 그룹에 대한 지식 없이 각각의 기준에 대해 0 내지 2로 등급을 나누었다. 심각한 임상적 GVHD (스코어 > 6)를 갖는 동물을 윤리 지침에 따라 희생시키고, 희생일을 다음날로 간주하였다.

통계학 분석

통계학적 분석 (차이의 단변량 분석-ANOVA, 스튜던츠 t 시험 또는 로그 랭크 통계치)을 윈도우즈 11.5.0 (Windows 11.5.0; SPSS Inc.)를 위한 SPSS를 이용하여 수행하였다.

결과

RAW264 -HIV- LTR -LUC 지시자 세포를 사용한 CpnlO 에 의한 LPS 시그널화의 억제

면역억제제로서의 Cpn10의 역할을 조사하기 위해, LPS-매개된 NF-κB 활성화를 억제하는 Cpn10의 능력을 조사하였다. RAW264-HIV-LTR-LUC 세포는 HIV 장말단 반복 프로모터를 갖는 루시페라제 리포터 유전자를 안정하게 발현하는 마우스 대식구 세포주 (RAW264.7)이며, 이는 NF-κB 자극에 신속하고 고도로 반응한다. 이들 세포를 세균성 LPS로 자극된 대식구에서 TLR4 시그널화 경로의 분석을 위한 민감한 생물검정을 제공한다 [Sweet & Hume, 1995, J Inflamm, 45 126-135]. LPS의 생리학적 수준을 초과한 이용을 피하기 위해, LPS 농도에 대한 적정 범위를 확립하였으며, 이는 최대 LPS-자극된 루시페라제 활성의 약 80 %, 50 % 및 20 % (각각 5, 1 및 0.2 ng)을 나타내었다 (자료 나타내지 않음). 2시간 동안 리포터 세포를 100 μg/ml의 CpnlO와 함께 예비인큐베이션함으로써 이러한 농도의 LPS에서 LPS-자극된 루시페라제 활성을 30 내지 50 % 억제할 수 있었다 (도 1A). 보다 짧은 예비인큐베이션 시간은 약한 재생 억제를 제공하였으며, 18시간 이상의 예비인큐베이션 시 간은 억제를 제공하지 않았다 (자료 나타내지 않음).

LPS -자극된 RA W264 .7 세포에서 IL-6 및 RANTES 생성의 CpnlO - 매개된 억제

LPS-유도된 NF-κB 활성화의 Cpn10-매개된 억제로 프로-염증성 매개자의 분비가 감소된다는 것을 설명하기 위해, 프로-염증성 사이토킨 IL-6 및 프로-염증성 케모킨 RANTES의 LPS-유도된 생성을 억제하는 Cpn10의 능력을 조사하였다. 1 ng의 LPS 용량이 사용되었으며, 이는 이러한 검정에서 최대 RANTES 생성의 약 50 %를 유도하였다 (자료 나타내지 않음). 2시간의 예비인큐베이션 기간 (상기에 이용된 것과 유사)은 사용된 LPS의 용량에 관계없이 이들 검정에서 내성을 유도할 수 없었다 (자료 나타내지 않음). Cpn10은 LPS-유도된 RANTES (도 1B) 및 IL-6 (도 1C) 모두에서 용량 관련된 감소를 매개하였으며, 이는 이러한 시스템에서 NF-κB 활성화의 억제가 프로-염증성 매개자 분비를 감소시킨다는 것을 설명한다.

LPS -유도된 TNF -α의 Cpn10 - 매개된 억제가 IL-10과 독립적이다

보다 생리학적인 세포 집단에서 Cpn10의 효과를 측정하기 위해, 마우스를 Cpn10으로 처리하고, 이들의 복막 대식구를 분리시킨 후, 시험관 내에서 LPS로 자극하였다. Cpn10 처리는 이들 세포로부터 TNF-α의 LPS-유도된 분비를 상당히 감소시켰으며 9도 2A), 이는 시험관 내에서 처리된 RAW264.7에서 보여지는 바와 같이, Toll-유사 수용체가 생체 내에서 처리된 대식구에 유사한 효과를 매개한다는 것을 설명한다.

IL-10은 TLR4 시그널화를 억제할 수 있는 강력한 면역억제 사이토킨이며 [Berlato et al., 2002, J Immunol, 168 6404-6411; Suhrbier & Linn, 2003, Trends Immunol, 24 165-168], Cpn10 처리된 동물로부터의 비장세포를 LPS로 자극하는 경우, 대조군 동물과 비교하여 상당히 증가된 IL-10 생성이 관측되었다 (도 2B). 그러나, Cpn10 처리된 IL-10^-/- 마우스로부터의 복막 대식구가 시험관 내에서 LPS로 자극되었을 때 TNF-α 분비에 있어 유사한 감소가 관측되었기 때문에 (도 2C), LPS-유도된 TNF-α 생성에서 Cpn10-매개된 감소 (도 2A)는 IL-10을 필요로 하지 않았다. 따라서, 감소된 TNF-α 분비 및 증가된 IL-10 생성은 Cpn10 처리의 독립적 결과인 것으로 보인다.

사람 말초혈 단핵구 세포 ( PBMC )의 CphlO -처리

Cpn10이 또한 1차 사람 세포에서 활성인지의 여부를 결정하기 위해, 건강한 공여체로부터의 PBMC를 1시간 동안 Cpn10 또는 완충액으로 예비처리한 후, 20시간 동안 0.04 ng/ml의 LPS로 자극하였다. 가장 낮은 용량이 유의한 TNF-α 분비를 신뢰성 있게 자극할 수 있고 [Johnson et al., 2004, J Biol Chem, in press]임상적 폐혈증과 유사한 가벼운 일시적 증후군을 유도하는 사람에서의 용량에 상응하기 때문에 [Granowitz et al., 1993, J Immunol, 151 1637-1645; Lynn et al., 2003, J Infect Dis, 187 631-639], 이러한 용량의 LPS를 확립하였다. 8명의 공여체로부터의 PBMC에서, LPS-induced TNF-α 분비에 있어 1 μg/ml의 CpnlO는 평균 23.7 % 감 소를 매개하고 10 μg/ml는 평균 23.3 % 감소를 매개하였으며 (도 3A), 이는 Cpn10이 PBMC로부터 LPS-유도된 TNF-α 분비도 감소시킨다는 것을 설명한다. 0.1 μg/ml의 CpnlO이 사용되는 경우 TNF-α 분비에 있어 어떠한 유의한 감소도 관측되지 않았다 (자료 나타내지 않음). 이러한 시스템에서 내성 유도가 작용하지 않는다는 것을 설명하기 위해, PBMC를 일정 범위의 LPC 농축물로 예비처리하고, 1시간 후 이들을 20시간 동안 0.04 ng/ml의 LPS로 자극하였다. 1시간 동안의 LPS 예비처리는 제 2의 LPS 처리에 의해 자극되는 TNF-α 분비를 억제하지 않았으며 (도 3B), 이는 LPS 내성이 Cpn10의 활성의 원인이 되지 않는다는 것을 설명한다.

IL-6은 LPS에 의해 유도되는 또 다른 널리 공지된 염증성 사이토킨이다. Cpn10이 LPS-유도된 IL-6 분비를 억제하는지의 여부를 결정하기 위해, 8명의 공여체로부터의 PBMC를 1시간 동안 1 또는 10 μg/ml의 CpnlO 또는 완충액으로 처리한 후, 20시간 동안 0.04의 ng/ml LPS로 자극하였다. LPS-유도된 IL-6 분비에 있어 평균 18.6 및 24.4 %의 감소가 각각 1 또는 10 μg/ml의 Cpn10에 대해 관측되었다 (도 3C). 0.1 μg/ml의 CpnlO가 사용되는 경우 IL-6 분비에 있어 어떠한 유의한 감소도 관측되지 않았다 (자료 나타내지 않음). 1시간 동안 LPS 예비처리는 제 2의 LPS 처리에 의해 자극되는 IL-6 분비를 억제하지 않았으며, 이는 내성 유도가 이러한 시스템에서 작용하지 않는다는 것을 재차 설명한다 (도 3D).

Cpn10 -처리가 생체 내에서 LPS -유도된 TNF -α 분비를 억제하였다

*변형된 내독소혈증 모델을 사용하여 생체 내로 전달된 Cpn10이 생체 내에서 LPS-유도된 TNF-α 분비를 억제할 수 있는지의 여부를 결정하였다. BALB/c 마우스에 10 μg의 LPS를 정맥 내 주사하기 30분 전에 100 μg의 CpnlO를 정맥 내로 투여하고, 1.5시간 후 채혈하였다. Cpn10 처리는 수개의 반복된 실험에서 혈청 TNF-α를 평균 47.6 % 감소시키고, 혈청 RANTES를 평균 40.1 % 감소시켰다 (도 4A). 5일 동안의 매일 Cpn10 예비처리는 TNF-α 억제에 대한 이러한 수준을 유의하게 향상시키지 못했다 (자료 나타내지 않음). 이들 자료는 이전의 조직 배양 실험과 일치하며, LPS로 챌린지한 후 TNF-α를 감소시키고 IL-10 생성을 증가시키는 Cpn10의 생체 내 효능을 설명한다.

CpnlO 이 이식편 대 숙주 질환 ( GVHD )의 급성 증후군을 감소시켰다

동종이계 골수 이식 (BMT) 후 급성 GVHD는 공여체 T 세포가 수령체 알로-항원을 인지하고 Th1 우세 방식으로 분화하는 T 세포-매개된 질환이다. 생성된 T 세포-유도된 Th1-사이토킨 (주로 IFN-γ)는, 방사선-손상된 위장 점막을 통해 누출되는 LPS로 자극되었을 때, 공여체 단핵구가 세포병리학적 양의 염증성 사이토킨 (예: TNF-α)의 방출하게 프라이밍한다. 이들 사이토킨 및 알로-반응성 T 세포는 증가하는 위장 손상 및 LPS 누출에 기여한다. BMT 모델에서 GVHD 사망율은 공여체 단핵구가 TLR4가 결여되는 경우 방지된다. LPS는 (치료학적 길항제에 의해) 효과적으로 차단되거나 [Cooke et al., 2001, J Clin Invest, 107 1581-1589], TNF-α 자체는 중화된다. 따라서, 대략적인 이식 기간 (peri-transplant period) 동안의 Cpn10 투여의 GVHD를 개선 능력을 조사하였다. 이식 전 이식 공여체 및 수령체의 Cpn10 처리는 GVHD 사망을 상당히 지연시켰다 (도 4B). 또한, 임상적 스코어로 측정되는 GVHD의 중증도도 BMT 후 초기에 감소하였다 (도 4B). Cpn10이 GVHD를 지연시키고 조기 사망율을 감소시킬 수 있기 때문에, 결국 GVHD로 쓰러졌으며, 이는 Cpn10이 TNF-α 분비를 못하게 하거나 T 세포 증식 및 IFNy 분비를 수행하는 능력이 없다는 것과 일치한다 (자료 나타내지 않음). 이식 후 동물의 Cpn10으로로 처리가 GVHD에 유의하게 영향을 끼치지 못했다 (자료 나타내지 않음).

토론

CpnlO는 사용되는 시스템 및 LPS 및 Cpn10의 용량에 의존하여 TNF-α 분비를 23 내지 56 % 억제를 매개하였다. Cpn10은 시스템에 의존하여 LPS-유도된 IL-10 분비를 약 40 내지 200 % 증가시켰으나, TNF-α 분비의 억제는 IL-10의 생성의 증가에 의존적이지 않았다.

이. 콜라이-유도된 LPS는 TLR4에 대한 널리 기술된 작용제이기 때문에, 상기 실험은 Cpn10이 NF-κB 경로를 통해 TLR4 시그널화를 조절한다는 것을 나타낸다. 그러나, Cpn10은 TLR4 및 TLR2 복합체에 의해 자극되는 다른 경로를 통해 사이토킨 분비를 조절함직 하다.

*Cpn10의 억제 효과는 30분 (도 4A) 내지 2시간 (도 1A)내에 매우 신속히 조절된다. 이는 IRAK 또는 SOCS를 수반하는 후기 피드백 메카니즘 보다는 PI3K와 같 은 신속한 네가티브 피드백 메카니즘의 조기 시그널화 또는 활성화의 억제를 의미한다 [Fukao & Koyasu, 2003, Trends Immunol, 24 358-363].

특정한 PI3K 억제제인 워트만닌은 Cpn10 활성에 검출가능한 효과가 없으며 (자료 나타내지 않음), 이는 Cpn10이 PI3K 경로에 영향을 끼치지 않는다는 것을 제시한다.

*실시예 2: CpnlO 및 TLR2

재료 및 방법

BALB/c 마우스를 CFA (Sigma)에 유화된 오브알부민 (10 μg) (Sigma)로 피하 주사하였다. CFA는 미코박테리아 세포벽 추출물을 포함하며, 이는 TLR2의 지펩티드 작용제를 포함하는 것으로 믿어진다 [Lim et al., 2003, Int Immunophannacol, 3 115-118; Tsuji et al., 2000, Infect Immun ; 68 6883-6890; Kirschning & Schumann, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 270 121-44]. CFA는 육아종을 유발하는 것으로 널리 공지되어 있다 [Bergeron et al., 2001, Eur Respir J, 18 357-361 ; Shah et al. 2001, J Assoc Physicians India, 49 366-368].

CFA의 2회 용량의 사전 주사와 함께 CpnlO (100 μg)을 5일 동안 매일 2회 투여하였다. 지정된 시간에 피하 육아종을 측정하였다.

결과

Cpn10이 CFA의 육아종 형성 활성에 영향을 줄 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 Cpn10-처리 및 완충액 대조물-처리된 마우스를 CFA와 함께 주사하였다. Cpn10 처리는 육아종 유도의 크기를 상당히 감소시켰다 (도 5A).

결론

CFA는 TLR2를 자극하고, CFA는 육아종 형성을 유도하며, Cpn10 처리에 의해 매개되는 육아종 형성의 감소는 Cpn10이 또한 TLR2 시그널화를 억제한다는 증거를 제공한다.

실시예 3: CpnlO 은 TLR2 작용제 PAM ₃ CYS - SK ₄ 에 의한 NF -κB의 활성화를 억제한다

PAM₃CysSK₄ (지펩티드)는 TLR2에 대한 공지된 작용제이고 [Agrawal et al., J hnmunol, 2003, 171 4984-9], HIV LTR을 자극할 수 있으며 (도 5B-D), 이는 NF-κB와 같은 전사 인자를 활성화시키는 것으로 생각된다 [Lee et al., J Immunol. 2002,168 4012-4017].

재료 및 방법

PAM₃CysSK₄를 EMC 마이크로컬렉션 게엠베하 (EMC Microcollection GmbH)로부터 구입하였으며, 물 중에 1 mg/ml의 작업 스톡 희석물로 희석하였다. CpnlO 및 RAW264-HIV-LTR-LUC 검정 시스템을 LPS에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 간 단히 설명하면, RAW-LUC 세포를 24웰 평판에 2.5 x 10⁵개 세포/ml로 시딩하고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. CpnlO을 120 μg/ml로 세포에 가하고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 루시페라제 검정 수행 2시간 전에 PAM₃Cys-SK₄ (10 ng/ml 또는 2 ng/ml 또는 0 ng/ml)를 가하였다. 1 ng/ml 또는 0.2 ng/ml의 LPS를 포지티브 대조군으로 사용하였다.

결과

CpnlO은 TLR2 작용제 PAM₃CysSK₄에 의해 HIV LTR 활성화를 억제하였다 (도 5B). 이러한 억제는 배지가 CpnlO 첨가 전 (도 5C) 또는 PAM₃CysSK₄ 첨가 전 (도 5D)에 변화되는 지의 여부와 무관하게 유지되었다.

결론

CpnlO은 TLR2 작용제에 의해 자극되는 대식구에서 프로-염증성 매개자 활성화 시그널을 억제할 수 있다.

*실시예 4: 리간드의 존재 하에 Cpn10 의 Toll-유사 수용체와의 면역침전

재료 및 방법

면역침전

TLR4는 분비 세포로부터의 조건조절된 배지 (10 ml/포인트)에 TLR4 세포외 도메인 (ECD)과 마우스 Fc 중쇄 (T4:Fc)와의 융합물로서 제공되었다. T4:Fc를 20 μl의 패킹된 단백질 A 비드 (PAS, CL4B, Sigma)를 사용하여 원심분리시켜 수집하였으며, 펠렛을 SDS-PAGE에 의해 분리시키기 전에 용해 완충액으로 3회 세척하였다. 단백질을 하이본드-C (Hybond-C) 니트로셀룰로즈 막에 전기전달하였다. 막을37 ℃에서 30분 동안 PBS 및 0.1 % 트윈 20중의 5 % 분유로 차단하고, 37 ℃에서 추가의 30분 동안 HRP 결합된 항-마우스 항체로 탐침하였다 [Visintin et al., 2003, J. Biol. Chem. 278 48313-48320].

결합시키기 위해, 1 μg의 배큘로바이러스 MD-2 또는 10 μg의 CpnlO을 T4:Fc/PAS 혼합물에 가하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. TLR2를 대조군 바이틀서 사용하였다. 또한, 10 μg의 CpnlO을 2 μg의 항-Cpn10 다중클론 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 대조군으로서, (항체의 비-특이적 배경 밴딩을 검출하기 위해) 어떠한 Cpn10도 IP에 가하지 않았다. MD-2 (1 μg) 및 CpnlO (10 μg) 모두 레인에 로딩하여 로딩된 전체 양을 나타내었다 (INPUT).

결과

공동-면역침전 실험은 재조합 Cpn10이 재조합 TLR2: 또는 TLR4:Fc 융합 단백질과 직접적으로 상호작용하는지의 여부를 결정하기 위해 수행되었다. 재조합 MD-2를 (TLR2가 아닌 TLR4와 상호작용하는) 대조군으로서 사용하였다.

도 6 (상단 패널)은 (TLR2가 아닌) TLR4와의 MD-2 공동-면역침전을 입증한 다. 도 6의 하단 패널은 Cpn10이 리간드의 부재 하에 TLR4 또는 TLR2와 물리적으로 상호작용하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 5: 리간드의 존재 하에 Cpn10 의 Toll-유사 수용체와의 상호작용에 대한 FRET 분석

도입

세포의 혈장막은 측부 이질물, 패치 및 마이크로도메인으로 구성된다. 이들 막 마이크로도메인 또는 리피드 래프트는 글리코스핑고지질 및 콜레스테롤이 농축되며, 막 분류 및 시그널 전환과 같은 세포 과정에 연루되었다. 세균의 고유한 면역 인지 시 지질 래프트 형성의 중요성이 생화학적 및 형광 영상 기술을 이용하여조사되었다. CD14, Hsp70, Hsp90, 케모킨 수용체 4 (CXCR4), 성장 분화 인자 5 (GDF5) 및 TLR4를 포함한 LPS-세포 활성화에 연루된 수용체 분자가 LPS 자극 후 마이크로도메인에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 리피드 래프트 통합성은 래프트-파괴 약물, 예를 들어 니스타틴 또는 MCD이 LPS-유도된 TNF-α 분비를 억제하기 때문에 LPS-세포 활성화에 필수적이다. 이러한 결과는 전체 세균 인지 시스템이 지질 래프트 내의 CD14-LPS 연결 부위에서 세균 성분 및 다수 시그널화 분자, 예를 들어 Hsp70, Hsp90, CXCR4, GDF5 및 TLR4의 소환에 의해 CD14의 결합물 주위에 배치된다는 것을 제시한다 [Triantafilou et al., 2002, J Cell Sci 115 2603].

Cpn10은 생체 내 및 시험관 내에서 사람 및 마우스 세포의 LPS-자극의 시그널 강도를 용량-의존적으로 감소시킨다. 따라서, Cpn10이 직접적으로 TLR4에 결합 하거나 시그널화를 파괴하기 위한 클러스터의 다른 참여물 중 하나에 결합함으로써 LPS 시그널 클로스터링 동안 리피트 래프트에 국지화할 수 있다고 제시되었다.

본원에 나타낸 결과는 Cpn10 및 래비트 다중클론 항-Cpn10 항체를 사용한 FRET 검정으로부터 수득된 자료를 나타낸다.

재료 및 방법

FRET 측정

형광 공명 에너지 전달 (FRET)은 분자 근접성을 측정하는데 이용된다. FRET는 1 내지 10 nm 거리에 걸쳐 발생할 수 있으며 광학 현미경의 해상도를 분자 수준으로 효과적으로 증가시킨다. 이는 공여체 분자의 여기 상태로부터 적합한 수용체로 에너지의 비방사성 전달을 수반한다. 에너지 전달율은 공여체와 수용체 사이의 거리의 6승에 역으로 비례한다.

이러한 FRET 조사에서, 샘플을 공여체- 및 수용체-접합된 항체로 표지하였으며, 에너지 전달은 수용체 분자의 완전한 광표백 후 공여체 형광 (탈퀀칭)의 증가로서 검출되었다. FRET 이미지는 수용체 광표백 후 공여체 형광의 증가로부터 계산되었다. FRET는 리피드 래프트에서 LPS-유도된 세포 활성화 (MonoMac6 세포)에 수반되는 수용체 분자의 농도를 측정하는데 이용되었다.

결과

FRET 실험을 수행함으로써 Cpn10이 지질 래프트와 함께 공동-국지화되는 지 의 여부를 조사할 수 있었다. FRET는 수용체 플루오로포어의 완전한 광표백 후 공여체 플루오로포어를 탈퀀칭하는 것에 대해서 측정되었다. 수용체의 파괴 후 증가된 공여체 형광은 공여체 형광이 에너지 전달 때문에 수용체의 존재 하에 퀀칭된다는 것을 나타내었다.

포지티브 대조군, 즉 GM1 (강글리오사이드, 래프트-관련된 분자) 분자 상의 상이한 에피토프에 대한 단일클론 항체 사이의 에너지 전달을 사용하여 에너지 전달 효율을 시험함으로써, 최대 에너지 전달 효율 (E %)이 37 ± 1.0인 것으로 나타났다.

또한, FITC-GM1과 로다민-MHC 사이의 네가티브 조절이 이용되었으며, 이는 어떠한 유의한 에너지 전달 (3 ±0.4)도 나타내지 않았다. 이러한 배경 FRET 값은 2개의 종이 고농도로 존재하기 때문에 무작위 FRET에 의해 유발되는 것으로 생각된다.

표 1에 제시된 자료는 최근 공개문 [Triantafilou et al., J Cell Science 2002, 상기 참조]에서 기술되는 바와 같이 CD14는 리피드 래프트에 존재하나 TLR4 및 Cpn10은 LPS 자극 전에 리피트 래프트와 관련되는 것으로는 밝혀지지 않았으며 LPS 자극 후 분명히 재소환된다는 것을 입증한다.

표 2의 자료는 FRET를 사용하여 Cpn10의 TLR4 클러스터에의 인접을 재차 기술하며, 포지티브 대조군은 TLR4였으며 36 ± 2.0의 최대 에너지 전달 효율 (E %)을 제공하였다.

표 2에서 보여지는 바와 같이, Cpn10은 LPS의 부재 하에 Hsp70, Hsp90 또는 CXCR4와 결합하지 않으나, LPS 자극 후 LPS-활성화 클러스터의 이러한 일원들과 결합을 입증하였다. LPS 자극 전에 Cpn10이 TLR4와 결합하는 지에 대한 여부를 입증하는 자료가 제시되지는 않지만, LPS 자극 시 Cpn10과 TLR4와의 강한 결합이 있다.

실시예 6: CpnlO 및 악액질

재료 및 방법

아주방트 -유도된 악액질의 유도

본 연구의 목적은 아주방트 관절염의 발병 동안 래트에게 Cpn10의 투여가 체중을 감량시키는 가의 여부를 결정하기 위한 것이었다. 암컷 다크 아구티 래트 (Female Dark Agouti rat) (n=30, 150 내지 160 g)에 꼬리의 기부에 0.1 ml의 CFA와 동시에 주사하였다. 아주방트는 불완전 프로인트 아주방트 (Difco, Michigan, USA)로 이루어졌으며, 이에 10 mg/ml의 열-사멸된 미코박테륨 튜베로쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) H37RA (Difco)를 가하였다. 이러한 모델에서 검출가능한 관절염 질환의 발병은 일반적으로 CFA 주사한 지 8 내지 10일이다.

CpnlO 처리

래트에 0.25 mg/kg (n=10) 또는 2.5 mg/kg CpnlO (n=10) 또는 희석액 대조물 (Tris/염수 완충액) (n=10)을 2일째부터 13일째까지 매일 피하로 주사하고 매일 중량을 측정하였다.

통계학 분석

Cpn10 또는 희석액 대조물이 주사된 래트에서 관측되는 중량의 차이를 차이의 단변량 분석 (ANOVA)을 이용하여 유의성에 대해 시험하였다.

결과

CFA의 투여 후 모든 그룹에서 순수 체중 감량이 있었으며, 이는 대조군에서 보다 뚜렷한 것으로 나타났다 (도 7).

0.25 및 2.5 mg/kg의 CpnlO 처리 그룹에 대한 체중 손실 자료를 모아 대조군과 비교하는 경우, 체중 손실에 통계학적으로 유의한 차이 (p=0.027)가 있었다. 2개의 처리 그룹으로부터의 자료의 수집은 시간에 걸쳐 2개의 그룹에서의 유사한 체중 감량 값 (p=0.94) 때문에 이러한 경우에 정당화된다.

결론

아주방트 관절염은 신체 조성물 및 사이토킨 생성에 변화를 유도하며 이는 만성 염증 관절염에서 프로-염증성 사이토킨-유도된 악액질을 모방한다 [Mayer, 1997, Arthritis Rheum, 40 534-539]. 생체 내 또는 시험관 내 Cpn10 투여는 LPS 및 다른 작용제에 의해 자극되는 세포에 의한 프로-염증성 사이토킨의 생성을 감소시킨다.

Cpn10의 효과는 CFA의 단일 주입으로 악액질이 실험적으로 유발된 래트에서 2개의 용량에서 시험하였다. 희석액 대조물 및 Cpn10을 유사한 체중 및 나이의 동 물에게 동시에 투여하였다. CFA의 투여는 체중을 상당히 감소시켰다. Cpn10 처리된 그룹 대 대조군 처리된 그룹의 비교에 있어, Cpn10-처리된 래트에서 체중 감량은 통계학적으로 유의한 감소였다.

TNF-α, IL-lβ 및 IL-6를 포함한 염증성 사이토킨의 증가된 수준은 암 및 류마티스성 관절염을 포함한 많은 질환에서 악액질과 관련 있는 것으로 공지되어 있다 [Argiles, 2003. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 6 401-406; Walsmith, 2002, Int J Cardiol, 85 89-99]. 본 발명자는 내독소혈증 및 이식편 대 숙주 질환의 뮤린 모델 및 새로이 분리된 PBMC 및 단구 세포주의 시험관 내 LPS-자극에서 Cpn10의 투여가 TNF-α, IL-6 및 RANTES의 생성을 감소시키고, 소염성 사이토킨 IL-10의 생성을 증가시킨다는 것을 밝혔다.

실시예 7: CpnlO 은 내성을 유도하지 않는다

재료 및 방법

RA W264 -HIV- LTR -LUC 생물검정

RAW264-HIV-LTR-LUC 세포를 배양하고 상술한 바와 같은 검정을 위해 도말하였다. 세포를 LPS, Cpn10 또는 대조 완충액과 함께 2시간 동안 인큐베이션한 후, 자극성 LPS를 지시된 농도로 첨가하였다. 추가로 2시간 동안 인큐베이션한 후, 유착 세포를 루시페라제 검정 (Luciferase Assay System, Promega, Madison, WI)을 수행하였다. 루시페라제 활성을 터너 디자인스 루미노미터 TD 20/20 (Turner Designs Luminometer TD 20/20)에서 15초 동안 판독하였다.

CpnlO 의 생성 및 정제

재조합 사람 CpnlO를 상술한 바와 같이 생성하고 정제하였다.

CpnlO 의 트립신 처리

2.5 % 트립신 (Gibco)을 상술한 바와 같이 아크로디스크를 통해 2회 여과시키고, Cpn10 (2 내지 3 mg/ml)에 40 μg/ml로 첨가하였다. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 트립신/Cpn10 용액을 15분 동안 90 ℃로 가열하여 생물검정물에 첨가하기 전에 트립신 활성을 파괴하였다. 트립신 처리 후, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 어떠한 Cpn10도 검출되지 않았으며, 상기 물질은 로데네즈 재접힘 검정에서 불활성이었다 (자료 나타내지 않음).

통계학 분석

통계학적 분석 (차이의 단변량 분석-ANOVA, 스튜던츠 t 시험 또는 로그 랭크 통계치)을 윈도우즈 11.5.0 (Windows 11.5.0; SPSS Inc.)를 위한 SPSS를 이용하여 수행하였다.

결과

내성 유도는 RAW264 -HIV- LTR -LUC 세포에서 LPS 시그널화의 억제에 반응적이지 않았다

LPS 내성은 잘-알려진 현상이며, 이로써 LPS로의 제 2 자극에 대한 반응이 감소된다. LPS 내성은 2개의 LPS 노출 사이의 시간 간격이 3시간을 초과하고 초기 노출 동안 LPS의 농도가 대식구를 자극하기에 충분히 높으면 정상으로 감소된다 [West & Heagy, 2002, Crit Care Med 30 S64-S73 ; Fujihara et al., 2003, Pharmacol. Ther. 100 171-194].

내성 유도가 도 1A에서의 관측에 책임이 있는 것으로 정식적으로 감하기 위해서 RAW264-HIV-LTR-LUC 세포를 2시간 동안 일정 범위의 LPS 농축물로 예비처리하고, 5, 1 및 0.2 ng/ml의 LPS로 자극하였다. 1 내지 0.0005 ng/ml 범위의 LPS 농축물로의 예비-처리는 제 2 LPS 노출에 의한 LUC 활성의 유도를 억제하지 않았다 (도 8A). 따라서, RAW264-HIV-LTR-LUC 시스템에 대해, 2시간의 예비-처리 기간은 내성 유도에 불충분한 것으로 보였다. 또한, 잠정적으로 Cpn10 제제에서 밝혀진 것과 유사한, 서브-자극 용량 (0.005 내지 0.0005 ng/ml)은 LPS-매개된 LUC 활성을 억제하지 못했다. 따라서, LPS 내성은 (i) LPS 노출 사이의 2시간 간격이 RAW-264-HIV-LTR-LUC 시스템에서 LPS 내성 유도에 불충분하였고 (ii) 잠정적으로 Cpn10 제제를 오염시키는 LPS의 비검출 (또는 서브-자극) 수준이 LPS 내성을 매개할 수 없었기 때문에 도 1A에서의 관측에 책임이 없음직 하였다.

Cpn10 은 트립신-분해에 민감하다

Cpn10의 억제 활성 (도 1A)이 단백질용해적 분해 후 상실된다는 것을 설명하기 위해, Cpn10을 트립신으로 분해하고, 생물검정물에 첨가하기 전에 가열함으로써 트립신 활성을 파괴하였다. 트립신에 의한 Cpn10의 파괴는 SDS-PAGE/웨스턴 블롯팅 및 로다네즈 재점힘 검정에 의해 확인하였다 (자료 나타내지 않음). (가열 단독으로는 LUC 또는 로다네즈 재접힘 검정에서 유의한 Cpn10 활성에 영향을 끼치지 못했다-자료 나타내지 않음). Cpn10 예비처리는 LPS-매개된 루시페라제 활성을 재차 유의하게 억제하였다 (도 8B, 대조군 대 Hsp10, p<0.001, 도의 설명을 참조). 그러나, 트립신/열-처리된 Cpn10은 LPS 시그널화를 억제하지 못하였으며 (도 8B, 트립신 Hsp10), 트립신/열-처리 완충액 대조군과 유사한 값을 제공하였다 (도 8B, 트립신 완충액). 예측되는 바와 같이, 트립신 처리 (이어서 15분 동안 90 ℃에서 가열)는 이. 콜라이 LPS의 활성에 유의하게 영향을 끼치지 못하였다 (도 8B, 트립신 LPS). 따라서, Cpn10의 단백질용해적 분해는 Cpn10 제제의 억제 활성을 상실시켰으며, 이는 Cpn10 제제의 트립신-내성 오염물 (예: LPS)가 억제 활성에 책임이 없었음을 설명한다.

RAW264 HIV- LTR -LUC 세포에서 LPS -자극된 활성의 CpnlO - 매개된 감소는 용량 의존적이었다

도 1A에 나타낸 LUC 활성의 감소율 (%)을 100 μg/ml의 CpnlO을 사용하여 수득하였다. Cpn10의 활성이 용량 반응적인지의 여부를 측정하기 위해, RAW264-HIV-LTR-LUC 세포를 LPS의 첨가 전에 일정 범위의 Cpn10 농축물로 처리하였다. (따라서 100 μg/ml로의 처리는 도 1A에 나타난 바와 같은 실험의 반복을 나타낸다). 명백한 용량 반응은 2 내지 100 μg의 CpnlO로부터 명백한 증가하는 수준의 억제와 함께 나타났으며, 100 μg/ml 이후부터는 억제가 안정화되는 것으로 보였다 (도 8C).

실시예 8-사람 임상 시도 퍼검물에서 Cpn10 의 효과

제 Ia 상 임상 시도

재료 및 방법

18 내지 55세의 19명의 건강한 표준 지원자를 Cpn10의 14-일의 제 I 상 시도에 올려 이중-맹검 위약 대조 프로토콜에서 단일 정맥 내 주입 또는 피하 주사로서 투여되는 Cpn10의 약물동태학 및 안전성을 평가하였다. 스크리닝 및 서면으로 알린 동의 후, 투여하기 전 밤새 단식시키고, 1,2. 5, 5 또는 10 mg의 Cpn10을 10분 정맥 내 주입하고 5 mg의 Cpn10을 피하 주사하였다. PBMC 분리를 위한 혈액 샘플 (50 ml)을 투여 전 (투여하기 약 12시간 전), 투여 후 8시간 및 투여 후 6일에 수집하였다. 처리 후 14일 동안 불리한 사건에 대해 피검체를 모니터링하였으며, 간격을 두고 수집된 혈액에 대해 표준 혈액학 및 생화학 평가 및 항-Cpn10 항체의 전개를 관측하였다.

PBMC 분리 및 저장

PBMC를 제작자의 프로토콜을 이용하면서 피콜-하이파큐 플러스 (Ficoll-Hypaque Plus, Amersham)에서 밀도 구배 원심분리하여 헤파린처리된 혈액으로부터 분리하였다. 2번의 세척 단계 후, 동결 배지 (우태혈청 중의 10 % DMSO) 중에 세 포를 재현탁시키고 낮춤 (step-down) 동결법을 이용하여 -70 ℃로 동결시켰다. 세포를 드라이 아이스에 옮긴 후, 사용할 때까지 액체 질소에 보관하였다.

PBMC 자극

*PBMC를 해동시키고, FBS를 통해 원심분리시킨 후, 세척 및 10 % FBS를 갖는 RPMI에 재현탁시켰다. 세포를 LPS의 존재 또는 부재 하에 24-웰 조직 배양 평판에 1 x 10⁶개 생존 세포/ml의 최종 밀도로 등분하였다. 20시간 후, 5 % CO₂와 함께 37 ℃에서 인큐베이션하고, 세포 배양 상등액을 수집하여 시판되는 사람 TNF-α ELISA (R&D Systems)을 사용하여 TNF-α 수준을 시험하였다.

결과

본 발명자는 1 mg (n=l), 2.5 mg (n=3), 5 mg (n=3) 및 10 mg Cpn10 (n=3) 또는 위약 (n=3)이 투여된 지원자 그룹에서 0일째 (즉 Cpn10 투여 후 대 Cpn10 투여 전)와 대비한 1일째의 LPS-유도된 반응을 비교하였다. (주: 피검체 001 및 004 (1 mg CpnlO 그룹)로부터의 PBMC는 혈액 샘플의 용혈에 의해 생존할 수 없었다. 따라서, 이들 그룹으로부터의 PBMC로부터의 자료는 단지 1명의 피검체를 포함한다) 도 9A 및 9B는 시험관 내에서 일련의 범위의 LPS 농축물로 자극된 PBMC에 의한 TNF-α 생성의 용량-반응적 TNF-α-매개된 변화를 입증한다. 즉, 0일째와 대비한 1일째의 LPS-유도된 반응은 2.5 mg 그룹에서 3명의 피검체 중 1명, 5 mg 그룹에서 3명의 피검체 중 3명 및 10 mg 그룹에서 3명의 피검체 중 1명으로 감소되었다. 작은 그룹 크기 때문에 확정적이지는 않지만, 상기 자료는 용량이 10 mg으로 증가되는 경우 5 mg 그룹에서 보여진 경향에 대해 약간의 반전을 나타내는 것으로 보인다. 피하 주사를 통해 5 mg Cpn10이 투여된 피검체에서, 이것이 TNF-α 생성 (도 9C)에 대한 Cpn10-매개된 효과인 것으로 보이지는 않으나 그룹 크기가 너무 작아 확정적인 자료를 제공할 수 없다.

결론

본 발명자는, 제 1 상 임상 시도 동안 면역 활성의 Cpn10-매개된 변화의 예측자로서, Cpn10 (또는 위약)의 정맥 내 주입 또는 피하 주사한 지 약 12시간 전 및 8시간 후에 PBMC를 수집하였다. 이들 세포를 외래성 Cpn10의 부재 하에 시험관 내에서 일정 범위의 LPS 농축물로 자극하여 TNF-α 생성의 수준을 평가하였다. 상기 자료는 2.5 내지 10 mg의 용량 범위로 투여되는 경우 프로-염증성 반응을 감소시키는데 Cpn10이 효과가 있을 수 있다는 것을 제시한다. 그러나, 이러한 조사에서 그룹이 너무 작았으므로, 생체 내에서 Cpn10의 생물학적 효과에 대한 가설을 지지하기 위해 보다 많은 자료가 축적될 것이다. 작은 그룹 크기가 이들 자료를 추측 이상으로의 어떠한 분석도 금하지만, 10 mg 용량 그룹으로부터의 자료는 2.5 및 5 mg의 CpnlO이 투여된 그룹으로부터의 TNF-α 반응 경향과 일치하지 않는 것으로 보인다.

5 mg의 Cpn10이 피하로 투여된 피검체로부터 분리된 PBMC로부터 이러한 시험관 내 검정에서의 효과 결여는 필시 ELISA에 의한 순환에서 검출가능한 (따라서 생물학적 이용성이 있는) 비교적 소량의 단백질에 관련된다.

본 발명자는 PBMC가 혈청 중에서 Cpn10을 더 이상 측정할 수 없는 시점 (투여 후 8시간)에서 분리되었으며, 이것이 이러한 재조합 단백질의 t_{l /2}이 짧으나 (약 1시간) 이의 생물학적 효과는 보다 길 수 있다는 관점을 지지한다는 것에 주목한다. 또한, (예를 들어 위약 피검체에서) 0일째와 대비한 1일째의 LPS 반응 변화가 설치류 및 사람에서 널리-기록된 현상이며 스트레스 반응에 관련되는 것으로 고려된다는 것을 지적하는 것이 중요하다 [Granowitz et al., 1993. J Immunol 151 1637]. 즉, 0일째와 대비한 1일째의 PBMC에 의한 증가된 LPS-유도된 반응은 시도의 스트레스, 즉 비시험되는 약물의 투여, 다수의 채혈 등에 기인할 수 있다. Cpn10 (스트레스 단백질군의 일원)은 염증 반응에서 스트레스-관련된 악화를 감소시키는데 수반될 수 있다.

제 lb 상 임상 시도

재료 및 방법

다발성 경화증을 앓으나 최근에 면역조절 치료를 받지 않은 18 내지 65세의 10명의 지원자를 Cpn10의 28-일의 제 Ib 상 시도에 올려 다수의 정맥 내 주입으로 투여되는 Cpn10의 안전성, 내성 및 약물동태학을 평가하였다. 이는 위약-조절된 이중 맹검 다수 용량 증대 조사였다. 제 1a 상의 디자인과 유사하게, 피검체에게 정맥 내 주입으로 5 또는 10 mg의 Cpn10 (또는 위약)을 투여하였다. PBMC 분리로부터의 혈액을 1일째 및 5일째에 투여한 지 약 12시간 후 및 8시간 후에 수집하였다. Cpn10의 생물학적 효과의 수명을 평가하기 위해, (5일째에) 화합물을 마지막 주입한 후 3일 및 7일째에 PBMC 분리를 위해 채혈하였다.

제 Ia 임상 시도에 대해 기술된 바와 같이 PBMC를 분리하고, 저장하며 자극하였다.

결과

본 발명자는 2.5 (n=4) 또는 5 mg의 CpnlO (n=4) 또는 위약 (n=2)이 5일간 매일 정맥 내 주입된 지원자 그룹에서 0일째에 대비한 1, 4, 5, 8 및 12일째 (즉 Cpn10 투여 후 때 Cpn10 투여 전)의 LPS-유도된 반응을 비교하였다. 도 10은 시험관 내에서 LPS로 자극된 PBMC에 의한 TNF-α 생성 시 용량-반응적 Cpn10-매개된 반응의 변화를 입증한다. 자료는 D0에 대해 D1에서 및 D0에 대해 D4에서의 LPS 자극에 반응하여 생성된 TNF-α의 차등률 (%)로서 기술된다. 즉, D0에 대한 D1에서의 LPS-유도된 반응은 5 mg의 Cpn10-처리된 그룹의 4명의 피검체 모두에서 38 내지 94 % 감소되었다. 이러한 그룹에서 D0에서의 TNF-α 값에 대한 D4의 값을 비교하는 경우, DO에서의 TNF-α 생성에 대해 D5를 비교 시, TNF-α 생성의 감소율 (%)은 36 내지 72 % 및 38 내지 59 %이었다. '약물 처리 중', 즉 1, 4 및 5일째의 시도 동안 임의의 시점에서 2.5 mg의 Cpn10 처리 그룹에서 LPS-자극된 TNF-α에 감소가 없었다.

결론

다발성 경화증을 앓는 지원자의 제 Ib 상 임상시도 동안 면역 활성의 Cpn10-매개된 변화의 예측자로서, 본 발명자는 5일간의 매일 주입 프로토콜 동안 1, 4 및 5일째 Cpn10 (또는 위약)의 정맥 내 주입 약 12시간 전 및 주입 약 8시간 후에 PBMC를 수집하였다. 또한, PBMC를 Cpn10의 최종 주입한 지 3 및 7일째에 분리하였다. 이들 세포를 TNF-α 생성 수준을 평가하기 위해 외래성 Cpn10의 부재 하에 시험관 내에서 LPS로 자극하였다. 상기 자료는 5 mg/일으로 투여될 때 프로-염증성 반응의 감소에 Cpn10이 효과가 있을 수 있다는 것을 제시한다. 즉, 5 mg/일의 CpnlO이 투여된 그룹 B의 4명의 피검체 모두에서, 1, 4 및 5일째에 LPS-자극된 TNF-α가 현저히 감소되었다. 이와는 반대로, 2.5 mg/일의 CpnlO이 투여된 피검체에서, '약물 처리중', 즉 1, 4 및 5일째에 LPS-유도된 TNF-α 생성에 주목되는 감소가 없었다. 또한, 위약 (Cpn10 비히클)으로 주입된 2명의 피검체로부터의 세포에서 LPS-자극된 TNF-α 생성이 감소되지 않았다. 그러나, 이러한 조사에서의 2개의 그룹은 매우 작으므로, 생체 내에서의 Cpn10의 생물학적 효과에 대한 가설을 지지하기 위한 보다 많은 자료가 축적될 것이다

제 Ia 상 시도에서와 같이, 본 발명자는 혈청 중에서 Cpn10을 더 이상 측정할 수 없는 시점 (투여 후 8시간)에서 PBMC가 분리되었으며, 이것이 이러한 재조합 단백질의 t_{l /2}이 짧으나 (약 1시간) 이의 생물학적 효과는 보다 길 수 있다는 관점을 지지한다는 것에 주목한다. 그러나, 이들 일부의 자료로부터는, 12 시간 보다 길게 지속하는 염증성 사이토킨 생성에 대한 Cpn10의 효과의 탓으로 할 수 없다.

제 Ia 상 시도 동안 주목되는 바와 같이, 또한 (예를 들어, 위약 피검체에서) 0일째에 대비한 1일째의 LPS 반응의 변화 (즉 증가)가 설치류 및 사람 모두에서 널리-보고된 현상이라는 것을 주목하는 것이 중요하며, 스트레스 반응에 관련되는 것으로 여겨진다 [Granowitz et al., 상기 참조].

위약 피검체 및 Cpn10이 투여된 일부 피검체로부터 8 및 12일째에 분리된 세포에 의한 TNF-α 생성은 피검체가 이러한 시점에서 환자가 아니어서 덜 신경질적이고 덜 스트레스를 받을 수 있다는 사실과 관련될 수 있다. 앞서 제시된 바와 같이, Cpn10 (스트레스 단백질 그룹 중의 일원)은 염증 반응에서 스트레스-관련된 악화를 감소시키는데 수반될 수 있다.

요약

Cpn10은 미토콘드리아 내에서 단백질 접힘에 대한 이의 중요한 역할 이외에, 특정 염증 과정의 조절에서 세포외 역할을 갖는 것으로 보인다. 많은 상이한 사람 및 뮤린 시험관 내 시스템 및 2개의 뮤린 질환 모델에서, Cpn10은 일관되게 프로-염증성 사이토킨 TNF-α 및 IL-6 및/또는 프로-염증성 케모킨 RANTES의 LPS-유도된 분비를 억제하고 소염성 사이토킨 IL-10의 LPS-유도된 분비를 증가시켰다. TNF-α 분비의 Cpn10-매개된 감소는 절대적이 아니었으며; 대신 Cpn10은 시스템 및 LPS 및현수긔 요량에 의존하면서 TNF-α 수준을 약 25 % 내지 60 %로 감소시키는 것을 매개하였다. Cpn10은 시스템에 의존하면서 LPS-유도된 IL-10 분비를 약 40 내지 200 % 증가시켰으나, TNF-α 분비의 감소는 IL-10의 이러한 증가에 의존적이지 않았다.

이. 콜라이-유도된 LPS가 TLR4에 대해 널리-기술된 작용제임을 고려하면, 본원에 기술된 실험은 Cpn10이 TLR4 시그널화를 하향-조절할 수 있다는 것을 나타낸다. Cpn10이 30분 (도 4A) 내지 2시간 (도 1A) 내에 매우 빠르게 억제를 수행하는 것으로 보이지만, 정확히 Cpn10이 어떻게 억제 활성을 매개하는 지는 불명하다. 이는 초기 시그널화 사건의 억제 또는 신속한 네가티브 피드백 메카니즘 (예: 포스포이노시티드 3-키나제: PI3K)의 활성화를 연루시킬 수 있다. 그러나, 특정 PI3K 억제제인 워트만닌으로 Cpn10 활성을 방지할 수 없었으며, 이는 이러한 경로가 Cpn10의 작용 메카니즘에 수반되지 않는다는 것을 제시한다.

완전히 억제하지는 않지만 Cpn10 분비를 감소시키는 능력이 Cpn10을 다른 소염 치료, 특히 TNF-α의 효과적인 제거를 달성할 수 있는 항-TNF-α 항체에 기초한 치료로부터 구별짓는다. 그러나, 이러한 제거가 항상 바람직한 것은 아닐 수 있다. 예를 들어, TNF-α 항체 치료는 결국에는 다발성 경화증 (MS)의 중증도를 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [Wiendl & Hohlfeld, 2002, BioDrugs 16, 183-200]. Cpn10이 MS의 뮤린 모델 (실험적 자가면역 뇌척수염) [Zhang et al., 2003, J Neurol Sci 212,37-46]에서 임상적 사인을 감소시키고 질환 개시를 지연시키는 것 으로 보고되므로, MS가 Cpn10에 대한 가능한 치료학적 표적으로 제시되었다.

본원에 기술된 바와 같이, 염증성 매개자의 발현을 감소시킬 Cpn10의 능력은 LPS, TLR4 및/또는 TLR2 시그널화가 병상을 이끄는 상태에서 Cpn10이 치료학적 적용을 발견할 수 있다는 것을 나타낸다.

또한, 이러한 작용 방식은 Th1/Th2 반응의 허용, 유도 또는 선택적인 활성화/억제를 통하는 것이 아니다.

명세서 전반을 통해 본 발명을 임의의 하나의 양태 또는 특정 주안점의 수집에 제한함이 없이 발명의 바람직한 양태를 기술하고자 하였다. 따라서, 당업자는 본 기술에 비추어 본 발명의 범위를 이탈하지 않으면서 예시된 특정 양태에 다양한 변형 및 변화를 가할 수 있는 것을 알 수 있을 것이다.

본원에 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리듬, 특허 및 과학 문헌이 본원에 참조로 삽입된다.

공여체-수용체 쌍 사이의 에너지 전달 효율값

공여체 (Cy3)	수용체 (Cy5)	E ± △E (%)
자극되지 않은 MM6 세포
GM1	GM1	37 ± 1.0
GM1	MHC 부류 I	3 ± 0.4
GM1	CD14	34 ± 2.0
GM1	TLR4	5 ± 1.5
GM1	Cpn10	15 ± 2.0
LPS로 자극된 MM6 세포
GM1	MHC 부류 I	3 ± 0.5
GM1	CD14	35 ± 1.5
GM1	TLR4	32 ± 1.8
GM1	Cpn10	28 ± 2.0

상이한 쌍 사이의 에너지 전달은 수용체 광표백 후 공여체 형광의 증가로부터 검출되었다. 자료는 많은 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.

공여체-수용체 쌍 사이의 에너지 전달 효율값

공여체 (Cy3)	수용체 (Cy5)	E ± △E (%)
자극되지 않은 MM6 세포
TLR4	TLR4	36 ± 2.0
Cpn10	CD14	12 ± 0.5
Cpn10	Hsp70	9 ± 1.0
Cpn10	Hsp90	6 ± 2.0
Cpn10	CXCR4	3 ± 1.0
LPS로 자극된 MM6 세포
Cpn10	TLR4	36
Cpn10	CD14	32 ± 0.5
Cpn10	Hsp70	24 ± 1.0
Cpn10	Hsp90	18 ± 12.0
Cpn10	CXCR4	12 ± 1.0

상이한 쌍 사이의 에너지 전달은 수용체 광표백 후 공여체 형광의 증가로부터 검출되었다. 자료는 많은 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.

Claims (39)

1. Cpn10 (chaperonin 10)을 동물, 세포, 조직 또는 기관에 투여하여 작용제-유도된 Toll-유사 수용체 시그널화를 조절하는 단계를 포함하여, 상기 동물, 또는 하나 이상의 세포, 또는 이로부터 유도된 조직 또는 기관에서 Toll-유사 수용체 시그널화를 조절하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 Toll-유사 수용체가 TLR2 (Toll-like receptor 2) 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 작용제가 병원체이거나 이로부터 유도되는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 작용제가 LPS (lipopolysaccharide) 또는 지펩티드 중에서 선택되는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 동물인 포유동물인 방법.
6. 제 6항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인 방법.
7. Cpn10 또는 이의 유도체를 동물, 세포, 조직 또는 기관에 투여하여 Toll-유 사 수용체 작용제-유도된 면역조절자 생성 및/또는 분비를 조절하는 단계를 포함하여, 상기 동물, 또는 하나 이상의 세포, 또는 이로부터 유도된 조직 또는 기관에서 면역조절자 분비를 조절하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 Toll-유사 수용체가 TLR2 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 작용제가 병원체이거나 이로부터 유도되는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 작용제가 LPS 또는 지펩티드 중에서 선택되는 방법.
11. 제 7항에 있어서, 상기 면역조절자의 생성 및/또는 분비가 Cpn10에 의해 네가티브하게 조절되는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 면역조절제가 프로-염증성 사이토킨 또는 케모킨인 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 프로-염증성 사이토킨이 IL-6 또는 TNFα인 방법.
14. 제 1항에 있어서, 상기 프로-염증성 케모킨이 RANTES인 방법.
15. 제 7항에 있어서, 상기 면역조절자의 생성 및/또는 분비가 Cpn10에 의해 포지티브하게 조절되는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 면역조절자가 소염성 사이토킨 또는 케모킨인 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 소염성 사이토킨이 IL-10 또는 TGF-β인 방법.
18. 제 7항에 있어서, 상기 동물이 포유동물인 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인 방법.
20. Cpn10을 동물에 투여하여 상기 동물에서 작용제-유도된 Toll-유사 수용체 시그널화를 조절하는 단계를 포함하여, 상기 동물에서 Toll-유사 수용체 시그널화의 조절에 반응하는 질환, 장애 또는 상태를 예방학적으로나 치료학적으로 처리하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태가 급성 또는 만성 염증 질환, 예를 들어 폐혈성 쇽, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 심장병, 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐 질환, 악액질, 다발성 경화증, GVHD (graft versus host disease), 이식 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
22. 제 20항에 있어서, 상기 작용제가 병원체이거나 이로부터 유도되는 방법.
23. 제 20항에 있어서, 상기 동물이 포유동물인 방법.
24. 제 23항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
25. Cpn10을 동물에 투여하여 상기 동물에서 Toll-유사 수용체 작용제-유도된 면역조절자 생성 및/또는 분비를 조절하는 단계를 포함하여, 상기 동물에서 Toll-유사 수용체 유도된 면역조절자 생성 및/또는 분비의 조절에 반응하는 질환, 장애 또는 상태를 예방학적으로나 치료학적으로 처리하는 방법.
26. 제 25항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태가 급성 또는 만성 염증 질환, 예를 들어 폐혈성 쇽, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 심장병, 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐 질환, 악액질, 다발성 경화증, GVHD, 이식 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
27. 제 25항에 있어서, 상기 효능제가 병원체이거나 이로부터 유도되는 방법.
28. 제 25항에 있어서, 상기 동물이 포유동물인 방법.
29. 제 28항에 있어서, 상기 동물이 사람인 방법.
30. Toll-유사 수용체 및 Toll-유사 수용체 작용제 및 Cpn10을 포함하는 분리된 분자 복합체.
31. 제 30항에 있어서, 상기 Toll-유사 수용체가 TLR2 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택되는 분리된 분자 복합체.
32. 제 31항에 있어서, 상기 Toll-유사 수용체가 TLR4이고 상기 작용제가 LPS인 방법.
33. 제 31항에 있어서, 상기 Toll-유사 수용체가 TLR2이고 상기 작용제가 지펩티드인 방법.
34. 후보 Cpn10 작용제가 Toll-유사 수용체 시그널화의 Cpn10 조절을 모방하거나 증대시키는 가의 여부를 결정하는 단계를 포함하여, Cpn10 작용제를 생성, 디자인 또는 스크리닝하는 방법.
35. 후보 Cpn10 작용제가 Toll-유사 수용체-유도성 면역조절자 생성 및/또는 분비의 Cpn10 조절을 모방하거나 증대시키는 가의 여부를 결정하는 단계를 포함하여, Cpn10 작용제를 생성, 디자인 또는 스크리닝하는 방법.
36. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 상기 Toll-유사 수용체가 TLR2 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
37. 후보 Cpn10 길항제가 Toll-유사 수용체 시그널화의 Cpn10 조절을 억제, 감소, 저해 또는 저하시키는 가의 여부를 결정하는 단계를 포함하여, Cpn10 길항제를 생성, 디자인 또는 스크리닝하는 방법.
38. 후보 Cpn10 길항제가 Toll-유사 수용체-유도성 면역조절자의 생성 및/또는 분비의 Cpn10 조절을 억제, 감소, 저해 또는 저하시키는 가의 여부를 결정하는 단계를 포함하여, Cpn10 길항제를 생성, 디자인 또는 스크리닝하는 방법.
39. 제 37항 또는 제38항에 있어서, Toll-유사 수용체가 TLR2 및 TLR4로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.

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