KR20060072122A - Ｎｏｇｏ 수용체 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드, Nogo 수용체-1 항체, 그의 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체 및 그의 융합 단백질과 이들을 코딩하는 핵산을 개시한다. 또한 본 발명은 이러한 Nogo 수용체-1 항체, 그의 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체 및 그의 융합 단백질과 이들을 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물과, 그의 제조 및 사용 방법을 개시한다.

면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드, 항체, 뉴런, 성장 원추

Description

ＮＯＧＯ 수용체 길항제{NOGO RECEPTOR ANTAGONISTS}

본 발명은 신경 생물학 및 분자 생물학에 관한 것이다. 더 특별하게는, 본 발명은 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드, Nogo 수용체-1 항체, 그의 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체 및 그의 융합 단백질과 그를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 Nogo 수용체 항체, 그의 항원 결합 단편, 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드, 용해성 Nogo 수용체 및 그의 융합 단백질과 그를 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물과, 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

뉴런의 축삭 및 수상 돌기는 뉴런으로부터의 긴 세포 연장체이다. 연장 축삭 또는 신경 돌기의 말단부 (distal tip)는 성장 원추 (growth cone)으로 알려져 있는 특수 영역을 포함한다. 성장 원추는 국소 환경을 감지하고 뉴런의 표적 세포를 향한 축삭 성장을 안내한다. 성장 원추는 여러 환경적 계기 자극 (cue), 예를 들어 표면 점착성, 성장 인자, 신경 전달 물질 및 전기장에 응답한다. 성장 원추에서의 성장의 안내는 다양한 점착 분자류, 세포간 신호와, 성장 원추를 자극 및 억제하는 인자를 포함한다. 성장하는 신경 돌기의 성장 원추는 다양한 속도로, 그러나 일반적으로는 일일 1 내지 2 밀리미터의 속도로 전진한다.

성장 원추는 손 형상이며 배아에 있어서 표면에 차별적으로 점착하며, 넓고 평평하게 확장한다 (마이크로스파이크 (microspike) 또는 사상가족 (filopodia)). 사상가족은 끊임없이 활성을 가지며, 일부 사상가족은 성장 원추 내로 다시 수축하며, 반면 다른 것은 계속하여 기층을 통하여 연장된다. 다른 사상가족 사이의 연장에 의해 라멜리포디아 (lamellipoida)가 형성된다.

성장 원추는 그의 앞 및 그의 라멜리포디아 또는 사상가족을 포함하는 면 상에 있는 지역을 답사한다. 연장체가 성장에 알맞지 않은 표면에 접촉하면 연장체는 움츠러든다. 연장체가 유리한 성장 표면과 접촉하면, 연장체는 계속하여 연장하여 이 방향으로 성장 원추를 안내한다. 성장 원추는 기질의 표면 특성에서의 작은 변이에 의해 안내될 수 있다. 성장 원추가 적당한 표적 세포에 도달할 경우 시냅스 연결부가 생성된다.

신경 세포 기능은 뉴런과, 그의 바로 이웃의 환경의 다른 세포 사이의 접촉에 의해 크게 영향을 받는다 (문헌[U. Rutishauser, T. M. Jessell, Physiol. Rev. 1988,68, p. 819]). 상기 세포는 특수 아교 세포, 중추 신경계 (CNS)의 희소돌기아교세포, 및 뉴런 축삭을 마이엘린으로 덮는 (다층형 막의 절연 구조) 말초 신경계 (PNS)의 슈반 세포를 포함한다 (문헌[G. Lemke, in An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall, Ed. [Sinauer, Sunderland, Mass.,1992], p. 281]).

CNS 뉴런은 손상 후에 재생하는 능력을 가지는 반면, 이 뉴런은 마이엘린에 존재하는 억제 단백질의 존재 때문에, 그리고 또한 가능하게는 그의 국소적 환경에서 보통 발견되는 다른 유형의 분자에 의해 그렇게 하는 것이 억제된다 (문헌 [Brittis and Flanagan, Neuron 2001, 30, pp. 11-14; Jones et al., J. Neurosci. 2002,22, pp. 2792-2803]; 문헌[Grimpe et al., J. Neurosci. 2002, 22, pp. 3144- 3160]).

희소돌기아교 세포 상에서 발견되는 여러 마이엘린 억제 단백질, 예를 들어 NogoA (문헌[Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439]; 문헌[Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444]), 마이엘린 결부 당단백질 (myelin associated glycoprotein, MAG, 문헌[McKerracher et al, Neuron 1994,13, 805-811; Mukhopadhyay et al, Neuron 1994,13, 757-767]) 및 희소돌기아교 세포 당단백질 (oligodendrocyte glycoprotein, OM-gp, 문헌[Mikol and Stefansson, J. Cell. Biol. 1988, 106,1273-1279])이 특성화되었다. 상기 단백질 각각은 뉴런 Nogo 수용체-1의 리간드인 것으로 개별적으로 밝혀졌다 (문헌[Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944]; 문헌[Liu et al., Science, 2002, 297, 1190-93]; 문헌[Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444]; 문헌[Chen etal., Nature, 2000, 403, 434-439]; 문헌[Domeniconi et al., Neuron, 2002, 35, 283-90]).

Nogo 수용체-1은 8개의 류신 풍부 반복체를 포함하는 GPI-고착 막 단백질이다 (문헌[Fournier et al., Nature 2001, 409, 341-346]). 억제 단백질 (예를 들어 NogoA, MAG 및 OM-gp)과 상호 작용시, Nogo 수용체-1 복합체는 성장 원추 쇠약 및 신경 돌기 생장의 억제로 이어지는 신호를 전달한다.

Nogo 수용체-1이 그의 리간드에 결합하는 것을 억제하며 마이엘린에 의해 매개되는 성장 원추의 쇠약 및 신경 돌기 생장의 억제를 약화시키는 분자가 긴급히 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 그를 포함하는 융합 단백질과, Nogo 수용체-1의 특정 면역원성 영역에 대하여 유도되는 항체 및 그의 항원성 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체에 결합하는 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 Nogo 수용체-1에 결합하는 모노클로날 항체에 의해 결합된 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 그러한 폴리펩티드는 면역원으로서 또는 본 발명의 항체에 대해 유사한 특이성을 갖는 것들을 확인하기 위해 항체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있다. 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포와 본 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체, 용해성 수용체 및 수용체 융합 단백질은 Nogo 수용체-1을 길항하거나 차단하며, Nogo 수용체-1의 그의 리간드에의 결합을 억제하고 뉴런에서의 성장 원추의 쇠약을 억제하며 뉴런에서의 신경 돌기의 생장 또는 발아(sprouting)의 억제를 감소시키는 데에 유용하다

일부 실시 형태에 있어서 본 발명은 AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (서열 번호 26); LDLSDNAQLR (서열 번호 27); LDLSDDAELR (서열 번호 29); LDLASDNAQLR (서열 번호 30); LDLASDDAELR (서열 번호 31); LDALSDNAQLR (서열 번호 32); LDALSDDAELR (서열 번호 33); LDLSSDNAQLR (서열 번호 34); LDLSSDEAELR (서열 번호 35); DNAQLRVVDPTT (서열 번호 36); DNAQLR (서열 번호 37); ADLSDNAQLRVVDPTT (서열 번호 41); LALSDNAQLRVVDPTT (서열 번호 42); LDLSDNAALRVVDPTT (서열 번호 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (서열 번호 44); 및 LDLSDNAQLAVVDPTT (서열 번호 45)로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 제공한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서, 핵산은 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된다. 일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하거나 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 핵산을 포함하거나 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포로 숙주를 면역화시키는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 방법으로 생성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 하이브리도마 세포주 HB 7E11 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4587)가 생성하는 모노클로날 항체는 아니다.

본 발명의 일부 실시 형태에서, 항체 또는 이의 합원 결합 단편은 (a) 뉴런 의 성장 원추 쇠약을 억제하고; (b) 뉴런에서 신경 돌기 생장 및 발아의 억제를 감소시키고; (c) 리간드에 대한 Nogo 수용체-1 결합을 억제한다. 일부 실시 형태에서, 신경 돌기 생장 및 발아는 축상 성장이다. 일부 실시 형태에서, 뉴런은 중추신경계 뉴런이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 모노클로날이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 쥐과 항체이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체, 키메라 항체 및 단쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 Nogo 수용체-1을 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, Nogo 수용체-1의 리간드에의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서, 리간드는 NogoA, NogoB, NogoC, MAG 및 OM-gp로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 뉴런을 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서의 성장 원추 쇠약의 억제 방법을 제공한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 뉴런을 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 신경 돌기의 생장 또는 발아의 억제를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서 신경 돌기 생장 또는 발아는 축삭 성장이다. 일부 실시 형태에 있어서, 뉴런은 중추 신경계 뉴런이다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어 서, 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제를 더 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 뉴런을 유효량의 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 사멸 위험 상태의 뉴런의 생존을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서, 뉴런은 시험관내에 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 뉴런은 포유류 내에 있다. 일부 실시 형태에 있어서, 포유류는 다발성 경화증, ALS, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 당뇨성 신경병증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 또는 척수 손상의 징후 또는 증상을 나타낸다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하는 배양된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 포유류에 존재하는 사멸 위험 상태의 뉴런 부위 또는 상기 뉴런 부위 근처에서 포유류 내로 숙주 세포를 도입하는 단계를 포함하는, 포유류에 존재하는 사멸 위험 상태의 뉴런의 생존을 촉진하는 방법을 제공한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사멸 위험 상태의 포유류의 뉴런 부위 또는 상기 뉴런 부위 근처에 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 사멸 위험 상태인 뉴런의 생존을 촉진하는 유전자 요법을 제공하며, 여기서 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편은 뉴런의 생존을 촉진하기에 충분한 양으로 포유류에서 상기 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다.

도 1은 Nogo 수용체-1의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. 인간 sNogoR310은 잔기 26-310을 포함하며 sNogoR344는 잔기 26-344를 포함한다. 쥐(rat) sNogoR310은 잔기 27-310을 포함하며 sNogoR344는 잔기 27-344를 포함한다.

도 2는 Vector Nti (상표명) 소프트웨어를 사용한 Nogo 수용체-1 단백질에 있어서의 항원성 플롯을 도시한다. 쥐 P-617은 서열 번호 10의 서열이며 쥐 P-618은 서열 번호 11의 서열이다.

도 3a는 항-Nogo 수용체-1 항체인 7E11의 결합 활성을 도시하는 그래프이다. 이 그래프는 Nogo66이 Nogo 수용체-1에 결합하는 것에 대한 7E11의 농도의 영향을 나타낸다. 도 3b는 항-Nogo 수용체-1 항체인 1H2의 결합 활성을 도시한다. 이 그래프는 Nogo66이 sNogoR344-Fc (본 명세서 및 미국 특허 출원 제60/402,866호에서는 Fc-sNogoR344 또는 Ig-sNogoR344로도 칭해짐)에 결합하는 것에 대한 1H2 농도의 영향을 나타낸다. Fc-MAG는 sNogoR344-Fc에 대한 결합에 있어서 Nogo66과 경쟁하지 않았다.

도 4는 항-Nogo-R-1 항체인 1H2, 3G5 및 2F7에 있어서의 ELISA의 결과를 도시한다. 고정화 항원의 존재 하에서의 상기 항체의 OD450에 대한 영향을 측정하였다. 고정화 항원은 sNogoR310-Fc (본 명세서 및 미국 특허 출원 제60/402,866호에서 Fc-sNogoR310 또는 Ig-sNogoR310으로도 칭해짐), sNogoR344-Fc, p-617, p-618, p-4, p-5 및 난알부민과 BSA이었다.

도 5는 다양한 양의 마이엘린의 존재 하에서 쥐 DRG 신경 돌기의 생장에 대한 모노클로날 항체 7E11의 영향을 도시하는 그래프이다.

도 6a는 하기 경쟁자: Nogo66, Nogo40 및 항-Nogo 수용체-1 모노클로날 항체 상청액의 존재 하에서 sNogoR310의 ¹²⁵I-Nogo66 및 ¹²⁵I-Nogo40에의 결합 효과를 도시하는 그래프이다. 도 6b는 ¹²⁵I-Nogo66의 sNogoR310에의 결합 활성을 도시한다.

도 7은 ¹²⁵I-Nogo40이 sNogoR310에 결합하는 것에 대한 sNogoR310-Fc의 영향을 도시하는 그래프이다.

도 8은 sNogoR310-Fc의 ¹²⁵I-Nogo40에의 결합 활성을 도시하는 그래프이다.

도 9a는 마이엘린의 존재 또는 부재 하에서의 신경 돌기 생장/세포에 대한 sNogoR310의 영향을 나타내는 그래프이다. 도 9b는 마이엘린의 존재 또는 부재 하에서의 신경 돌기 생장에 대한 sNogoR310의 영향을 나타내는 그래프이다.

도 10a는 증가하는 양의 마이엘린의 존재 또는 부재 하에서의 P4 쥐 DRG 신경 돌기 생장에 대한 sNogoR310-Fc의 영향을 도시하는 그래프이다. 도 1Ob는 PBS, PBS + sNogoR310-Fc, 20 ng의 마이엘린 및 마이엘린 + sNogoR310-Fc를 이용한 처리 이후의 신경 돌기의 갯수/세포를 도시한다.

도 11은 증가하는 양의 마이엘린의 존재 하에서의 DRG 신경 돌기 생장/세포에 대한 모노클로날 항체 5B10의 영향을 도시하는 그래프이다.

도 12는 쥐 척수 가로 절단 모델에서 손상을 유도한 이후 30일까지의 BBB 점수에 대한 sNogoR310-Fc의 영향을 도시하는 그래프이다.

도 13a 및 13b는 주 08 또는 주 01 유래의 야생형 (WT) 또는 트랜스제닉 생 쥐에 있어서의 배면 반절단 후의 시간의 함수로서의 운동 BBB 점수를 보고하고 있다. 도 13c는 야생형 및 트랜스제닉 생쥐에 있어서 손상 후의 시간의 함수로서 최대로 용인되는 빗면각을 도시한다. 도 13d는 손상 후 시간의 함수로서 경사 그리드 등반 (climbing) 동안의 뒷다리 (hindlimb) 오류를 도시한다. 모든 그래프에 있어서 각각의 군에 있어서 7-9마리의 생쥐로부터의 평균 ± s.e.m.이 보고되어 있다. 트랜스제닉 군으로부터의 값은 야생형 생쥐와는 통계학적으로 다르다 (이중 별표, P < 0.01; 스튜던트 t-검정 (Student's t-test)).

도 14a는 비히클 또는 sNogoR310-Fc 처리 동물에 있어서 배면 반절단 후의 시간의 함수로서 운동 BBB 점수를 도시한다. 도 14b는 손상 후의 시간의 함수로서 그리드 보행 동안의 뒷다리 오류를 도시한다. 도 14c는 미손상 또는 손상 + sNogoR310-Fc 쥐보다 대조 생쥐에서 활보 길이가 더 짭고 활보 폭이 더 큼을 나타내는 족적 분석을 도시한다. 모든 그래프에 있어서 각각의 군에 있어서 7-9마리의 쥐로부터의 평균 ± s.e.m.이 보고되어 있다. sNogoR310-Fc 군의 값은 대조와는 통계학적으로 다르다 (도 14a-b). 대조 값은 도 14c에 있어서 SCI 없음 또는 SCI + sNogoR310-Fc 쥐와는 통계학적으로 다르다 (별표, p < 0.05 ; 이중 별표, p < 0.01 ; 스튜던트 t-검정).

정의 및 일반적인 기술

달리 정의되지 않는 한 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 모순되는 경우에는 정의를 포함하는 본 출원이 좌우한다. 또한 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한 단수형의 용어는 복수형을 포함하며 복수형의 용어는 단수형을 포함한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 기타 참고 문헌은 모든 목적에 있어서 그의 전체 내용이 참고로 인용된다.

본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 그에 상당하는 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만 적합한 방법 및 재료는 이하에 기술되어 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 자명하다.

본 명세서 및 청구의 범위 전반에 걸쳐 "포함하는", 또는 "포함하다" 또는 "포함하고 있는"과 같은 변화된 용어는 언급된 완전체 (integer) 또는 완전체의 군을 포함하려는 것이며 임의의 기타 완전체 또는 완전체의 군을 배제하려는 것은 아님을 알 것이다.

본 발명을 추가로 정의하기 위하여 하기 용어 및 정의가 본 명세서에 제공된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "항체"는 온전한 면역글로불린 또는 그의 항원 결합 단편을 의미한다. 본 발명의 항체는 임의의 이소형 또는 클래스 (예를 들어 M, D, G, E 및 A) 또는 임의의 서브클래스 (예를 들어 G1-4, A1-2)일 수 있으며 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄를 가질 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Fc"는 파파인 절단에 의해 수득될 수 있는 항체의 중쇄 불변 영역의 일부를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "NogoR 융합 단백질"은 이종성 폴리펩티드에 융합된 용해성 Nogo 수용체-1 부분을 포함하는 단백질을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "인간화 항체"는 비인간 서열의 적어도 일부가 인간 서열로 대체된 항체를 의미한다. 인간화 항체를 어떻게 제조하는지에 대한 예는 미국 특허 제6,054,297호, 동 제5,886,152호 및 동 제5,877, 293호에서 발견할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "키메라 항체"는 첫번째 항체로부터 유래되는 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터 유래되는 하나 이상의 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 첫번째 항체 및 추가의 항체는 동일하거나 다른 종으로부터 유래될 수 있다.

본 명세서 및 미국 특허 출원 제60/402,866호에서 사용되는 바와 같이 "Nogo 수용체, ""NogoR,""NogoR-1," "NgR" 및 "NgR-1" 각각은 Nogo 수용체-1을 의미한다.

Nogo 수용체-1 폴리펩티드

본 발명은 하나의 태양에 있어서 면역원성인 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 면역원성 폴리펩티드는 LDLSDNAQLRVVDPTT (쥐) (서열 번호 1); LDLSDNAQLRSVDPAT (인간) (서열 번호 2); AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA (쥐) (서열 번호 3); AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA (인간) (서열 번호 4); 및 CRLGQAGSGA (생쥐) (서열 번호 5)로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 본질적으로 구성된다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 Nogo 수용체-1에 결합한 모노클로날 항체에 의해 결합된 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 7E11 모노클로날 항체가 인식한다. 일부 실시 형태에 있어서, 폴리펩티드는 LDLSDNAQLR (서열 번호 28); LDLSDDAELR (서열 번호 30); LDLASDNAQLR (서열 번호 31); LDLASDDAELR (서열 번호 32); LDALSDNAQLR (서열 번호 33); LDALSDDAELR (서열 번호 34); LDLSSDNAQLR (서열 번호 35); LDLSSDEAELR (서열 번호 36); DNAQLRVVDPTT (서열 번호 37); DNAQLR (서열 번호 38); ADLSDNAQLRVVDPTT (서열 번호 42); LALSDNAQLRVVDPTT (서열 번호 43); LDLSDNAALRVVDPTT (서열 번호 44); LDLSDNAQLHVVDPTT (서열 번호 45); 및 LDLSDNAQLAVVDPTT (서열 번호 46)로 구성된 군에서 선택된다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 1-5, 26-27, 29-37 및 41-45의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 핵산 분자는 발현 제어 서열(예를 들어 pCDNA(I))에 결합된다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 벡터는 클로닝 벡터이다. 본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 벡터는 발현 벡터이다. 본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 숙주 세포의 배양 단계를 포함하는 본 발명의 면역원성 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에 있어서 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시 형태에 있어서 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시 형태에 있어서 숙주 세포는 효모이다.

항체

본 발명은 또한 본 발명의 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 일부 실시 형태에 있어서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1-5, 26-27, 29-37 및 41-45의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드에 결합한다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 생체내 또는 시험관내에서 생성될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편의 생성은 이하에서 논의된다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Nogo 수용체-1이 리간드 (예를 들어 NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM-gp)에 결합하는 것을 억제하여 신경 돌기의 생장 및 발아, 특히 축삭의 성장의 마이엘린-매개된 억제를 감소시키며, 마이엘린에 의해 매개되는 성장 원추의 쇠약을 약화시킨다.

일부 실시 형태에 있어서 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 쥐과의 것이다. 일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1은 쥐로부터 유래된다. 다른 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1은 인간의 것이다. 일부 실시 형태에 있어서 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 재조합, 조작, 인간화 및/또는 키메라 항체 또는 항원 결합 단편이다.

일부 실시 형태에 있어서 항체는 모노클로날 7E11 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4587); 모노클로날 1H2 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA- 4584); 모노클로날 2F7 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4585); 모노클로날 3G5 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4586); 및 모노클로날 5B10 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4588)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에 있어서 항체는 다클론 항체 46이다.

예시적인 항원 결합 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb와, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편을 포함하는 단편, 단쇄 항체 (scFv), 키메라 항체, 다이아바디 (diabody) 및 특이적 항원 결합성을 폴리펩티드 (예를 들어 이뮤노어드헤신 (immunoadhesin))에 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드가 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 Fd는 V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 단편을의미하며; Fv는 항체의 단일 팔 (arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 단편을 의미하며; dAb는 V_H 도메인으로 구성된 단편을 의미한다 (문헌[Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989). 본 명세서에 사용되는 바와 같이 단쇄 항체 (single- chain antibody, scFv)는 V_L 영역 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 이들이 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커를 통하여 일가 분자를 형성하는 항체를 의미한다 (문헌[Bird et al., Science 242: 423-426, 1988] 및 문헌[Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988]). 본 명세서에 사용되는 바와 같이 다이아바디는 V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만 동일 사슬 상에서 두 도메인 사이에 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧아서 도메인이 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 하는 2특이성 항체를 의미한다 (예를 들어 문헌[Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993], 및 문헌[Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1121-1123, 1994] 참조). 본 명세서에 사용되는 바와 같이 목적 항원에 특이적으로 결합되는 이뮤노어드헤신은 하나 이상의 CDR이 공유 결합 또는 비공유결합에 의해 혼입될 수 있는 분자를 의미한다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 Nogo 수용체-1 항체의 서브유닛 폴리펩티드를 제공하는데, 서브유닛 폴리펩티드는 (a) 중쇄 또는 그의 가변 영역; 및 (b) 경쇄 또는 그의 가변 영역으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 Nogo 수용체-1 항체의 서브유닛 폴리펩티드의 중쇄 또는 그의 가변 영역, 또는 경쇄 또는 그의 가변 영역을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 Nogo 수용체-1 항체의 과변이 영역 (CDR) 또는 CDR을 코딩하는 핵산을 제공한다.

면역화

본 발명의 항체는 적합한 숙주 (예를 들어 인간을 포함하는 척추 동물, 생쥐, 쥐, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 파충류, 어류, 양서류와, 조류, 파충류 및 어류의 알 (egg)에서)의 면역화로 생성시킬 수 있다. 이러한 항체는 다클론 또는 모노클로날일 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서 숙주를 본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드로 면역화한다. 다른 실시 형태에 있어서 숙주는 온전하거나 붕괴된 세포의 세포막과 결부된 Nogo 수용체-1으로 면역화하며 본 발명의 항체는 본 발명의 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에의 결합에 의해 확인한다.

일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1 항원은 면역 응답의 촉진을 위하여 항원 보강제 (adjuvant)와 함께 투여된다. 항원 보강제는 항원에 대한 면역 응답의 유도를 위하여 항원에 더하여 투여할 필요가 종종 있다. 이러한 항원 보강제는 일반적으로 면역화 부위에 단핵 식세포가 모집되게 하며 비특이적 염증을 촉진하는 불용성 또는 비분해성 물질이다. 면역 보강제의 예는 프로인트 면역 보강제 (Freund's adjuvant), RIBI (무라밀 디펩티드), ISCOM (면역 자극 복합체 (immunostimulating complexes)) 또는 그의 단편을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다.

항체의 제조 방법에 대한 개관은 문헌[Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Yelton, D. E. et al. (1981)]; 문헌[Ann. Rev. of Biochem., 50, pp. 657-80.], 및 문헌[Ausubel et al. (1989); Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons)] 참조. 본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드를 이용한 면역 반응성의 측정은 예를 들어 면역블롯 분석 및 ELISA를 포함하여 당 업계에 잘 알려진 여러 방법 중 임의의 방법으로 행할 수 있다.

항체 및 항체 생성 세포주의 제조

본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌[Harlow and Lane (1988), supra]에 기술되어 있는 표준 절차로 제조할 수 있다.

간략하게는, 적당한 시점에서 동물을 희생시키고 림프절 및/또는 비장 B-세포를 예를 들어 EBV를 이용한 형질전환 또는 불멸화 (immortalized) 세포주, 예를 들어 골수종 세포와의 융합을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 당 업계에 잘 알려진 여러 기술 중 임의의 하나의 기술로 불멸화한다. 그 후 이 세포를 클론에 의하여 분리하고 각각의 클론의 상청액을 본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 특이적인 항체의 생성에 대하여 시험한다. 하이브리도마의 선발, 클로닝 및 확장 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 이와 유사하게, 면역글로불린 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 확인 방법이 당 업계에 공지되어 있다.

본 발명의 항체를 생성하는 다른 적합한 기술은 본 발명의 Nogo 수용체-1 또는 면역원성 폴리펩티드에 림프구를 시험관내에서 노출시키거나 대안적으로는 파지 또는 유사한 벡터에서 항체의 라이브러리를 선발하는 것을 포함한다. 문헌[Huse et al., Science, 246, pp. 1275-81 (1989)] 참조. 본 발명에 유용한 항체는 변형하거나 변형하지 않고 이용할 수 있다.

항원 (상기의 경우 본 발명의 Nogo 수용체-1 또는 면역원성 폴리펩티드) 및 항체는 탐지가능한 신호를 제공하는 물질을 공유 결합에 의해 또는 비공유 결합에 의해 결합함으로써 표지할 수 있다. 다양한 표지체 및 콘쥬게이션 기술이 당 업계에 공지되어 있으며 본 발명의 실행에 있어서 이용될 수 있다. 적합한 표지체는 방사능성 뉴클레오티드, 효소, 기질, 보조 인자, 억제제, 형광성 제제 (agent), 화학발광성 제제, 자성 입자 등을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 이러한 표지체의 용도를 교시하는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 동 제3,850,752호; 동 제3,939,350호; 동 제3,996,345호; 동 제4,277,437호; 동 제4,275,149호 및 동 제4,366,241호를 포함한다. 또한 재조합 면역글로불린이 제조될 수 있다 (미국 특허 제4,816,567호 참조).

본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 항체는 다수의 결합 특이성을 가지는데, 예를 들어 하이브리드 하이브리도마의 생성, 다이설파이드 교환, 화학적 가교 결합, 2개의 모노클로날 항체 사이에 펩티드 링커를 부가하는 것, 2개의 세트의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 특정 세포주에 도입하는 것 등을 포함하는 당 업계의 숙련자에게 공지된 다수의 기술 중 임의의 하나의 기술로 2작용성 항체가 제조된다 (더욱 상세한 논의에 대해서는 이하를 참조).

본 발명의 항체는 또한 모노클로날 항체, 예를 들어 "인간" 항체를 생성할 수 있는 SCID-hu 생쥐 또는 기타 비인간 동물에 의해 불멸화 인간 세포로 생성되는 것일 수 있다.

파지 디스플레이 라이브러리

본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체는 조합성 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리할 수 있다. 예시적인 조합성 라이브러리는 본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드로 면역화한 동물로부터 유래되는 mRNA로부터 제조한 V_L 및 V_H cDNA를 사용하여 제조한 scFv 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 결합하는 것이다. 이러한 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리의 생성을 위한 구매가능한 방법 및 재료가 있다 (예를 들어 파마시아 (Pharmacia) 재조합 파지 항체 시스템, 카탈로그 번호 27-9400-01; 스트라타진 (Stratagene) SurfZAP (상표명) 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612; 및 모르포시스 (MorphoSys)제의 기타의 것). 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약도 있다 (예를 들어 라드너 (Ladner) 등의 미국 특허 제5,223,409호; 강 (Kang) 등의 PCT 공보 제WO 92/18619호; 도워 (Dower) 등의 PCT 공보 제WO 91/17271호; 윈터 (Winter) 등의 PCT 공보 제WO 92/20791호; 마크랜드 (Markland) 등의 PCT 공보 제WO 92/15679호; 브레이틀링 (Breitling) 등의 PCT 공보 제WO 93/01288호; 맥카페르티 (McCafferty) 등의 PCT 공보 제WO 92/01047호; 가라드 (Garrard) 등의 PCT 공보 제WO 92/09690호; 문헌[Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372]; 문헌[Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85]; 문헌[Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281]; 문헌[McCafferty etal., Nature (1990) 348: 552-554]; 문헌[Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734]; 문헌[Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896]; 문헌[Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]; 문헌[Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580]; 문헌[Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377]; 문헌[Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137]; 및 문헌[Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982]) 참조.

재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체를 스크리닝 및 단리한 후 선발된 항체를 코딩하는 핵산을 디스플레이 패키지 (package) (예를 들어 파지 게놈으로부터의 것)로부터 회수하고 표준 재조합 DNA 기술에 의해 다른 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 하기되어 있는 바와 같이 원할 경우 핵산을 추가로 조작하여 본 발명의 다른 항체 형태를 생성할 수 있다. 상기한 바와 같이, 조합형 라이브러리의 스크리닝으로 단리한 항체의 발현을 위하여 이 항체의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터 내로 클로닝하고 포유류 숙주 세포 내로 도입한다.

클래스 스위칭

본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체는 임의의 이소형의 것일 수 있다. 임의의 원하는 이소형의 항체를 클래스 스위칭으로 제조할 수 있다. 클래스 스위칭에 있어서 V_L 또는 V_H를 코딩하며 C_L 또는 C_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 전혀 포함하지 않는 핵산을 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 단리한다. 이어서 V_L 또는 V_H를 코딩하는 핵산을 원하는 면역글로불린 분자 클래스로부터의 C_L 또는 C_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합시킨다. 이는 상기한 바와 같이 C_L 또는 C_H 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산의 사용에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어 원래는 IgM이었던 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체는 IgG로 클래스 스위칭시킬 수 있다. 또한 클래스 스위칭을 사용하여 하나의 IgG 서브클래스를 다른 것으로, 예를 들어 IgG1을 IgG2로 전환시킬 수 있다.

돌연변이된 항체

다른 실시 형태에 있어서 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이시켜 항체의 결합 특성을 바꿀 수 있다. 예를 들어 돌연변이는 CDR 영역 중 하나 이상에서 만들어 Nogo 수용체-1에 대한 항체의 K_d를 증가 또는 감소시키거나 K_off를 증가 또는 감소시키거나 항체의 결합 특이성을 바꿀 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 생성 (site-directed mutagenesis) 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al., supra] 참조. 바람직한 실시 형태에 있어서 돌연변이는 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체의 가변 영역에서 생식 세포 (germline)에 비하여 변화되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다. 다른 실시 형태에 있어서, 돌연변이는 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체의 가변 영역에서 생식 세포에 비하여 변화되는 것으로 알려진 하나 이상의 아미노산 잔기에서 만들어진다. 다른 실시 형태에 있어서 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 이 구조 (framework) 영역 중 하나 이상에서 돌연변이된다. 돌연변이는 반감기의 증가를 위하여 구조 영역 또는 불변 도메인에서 만들어질 수 있다. 구조 영역 또는 불변 도메인에서의 돌연변이는 항체의 면역원성을 바꾸기 위하여 만들어져 다른 분자에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합시키기 위한 부위를 제공하거나 상보적인 고정과 같은 특성을 바꿀 수 있다. 돌연변이는 단일 돌연변이화 항체의 구조 영역, 불변 도메인 및 가변 영역 각각에서 만들 수 있다. 대안적으로는, 돌연변이는 단일 돌연변이화 항체의 구조 영역, 가변 영역 또는 불변 도메인 중 단지 하나에서 만들어질 수 있다.

융합 항체 및 이뮤노어드헤신

다른 실시 형태에 있어서 다른 폴리펩티드에 결합된 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체의 일부 또는 모두를 포함하는 융합 항체 또는 이뮤노어드헤신이 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서 항-Nogo 수용체-1 항체의 단지 가변 영역만이 폴리펩티드에 결합된다. 다른 실시 형태에 있어서 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체의 V_H 도메인은 제1 폴리펩티드에 결합시키며, 반면 이 항체의 V_L 도메인은 V_H 및 V_L 도메인이 서로 상호 작용하여 항체 결합 부위를 형성하도록 하는 방식으로 제1 폴리펩티드에 연합되는 제2 폴리펩티드에 결합된다. 다른 실시 형태에 있어서 V_H 도메인은 V_H 및 V_L 도메인이 서로 상호작용하게 하는 링커에 의해 V_L 도메인으로부터 분리된다 (단쇄 항체 이하의 것을 참조). 이어서 V_H - 링커 - V_L 항체는 목적 폴리펩티드에 결합된다. 융합 항체는 Nogo 수용체-1 리간드를 발현하는 세포 또는 조직으로 폴리펩티드를 인도하는 데에 유용하다. 목적 폴리펩티드는 치료제, 예를 들어 독소일 수 있거나 진단제, 예를 들어 용이하게 가시화될 수 있는 효소, 예를 들어 서양 고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 또한 2개 (또는 그 이상)의 단쇄 항체가 서로에게 결합된 융합 항체를 생성할 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 이가 또는 다가 항체를 생성하기를 원하거나 2특이성 항체를 생성하기를 원할 경우 유용하다.

단쇄 항체

본 발명은 본 발명의 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 결합하는 단쇄 항체 (scFv)를 포함한다. ScFv의 생성을 위하여 V_H- 및 V_L-코딩 DNA는 유연한 링커를 코딩하는 DNA, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly₄-Ser)₃ (서열 번호 10)을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결합시켜 V_H 및 V_L 서열이 연속성 (contiguous) 단쇄 단백질로 발현될 수 있게 하는데 V_L 및 V_H 영역은 유연한 링커에 의해 결합된다 (예를 들어 문헌[Bird et al. (1988) Science 242: 423-426]; 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883]; 문헌[McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554] 참조). 단쇄 항체는 단지 단일 V_H 및 V_L이 사용될 경우 일가이거나, 두 V_H 및 V_L이 사용될 경우 이가이거나, 2개보다 많은 V_H 및 V_L이 사용될 경우 다가일 수 있다.

키메라 항체

본 발명은 또한 하나의 특이성이 본 발명의 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 대한 것인 2특이성 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 하나의 결합 도메인을 통하여 본 발명의 Nogo 수용체-1 폴리펩티드, 그리고 제2 결합 도메인을 통하여 제2 분자에 특이적으로 결합하는 키메라 항체를 생성할 수 있다. 키메라 항체는 재조합 분자 생물학 기술을 통하여 제조될 수 있거나 물리적으로 함께 콘쥬게이션될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드와 마이엘린에 의해 매개되는 성장 원추의 쇠약 및 신경 돌기 생장 및 발아의 억제의 약화와 관련된 다른 분자에 특이적으로 결합하며 하나보다 많은 V_H 및 V_L을 포함하는 단쇄 항체를 생성할 수 있다. 이러한 2특이성 항체는 잘 알려진 기술, 예를 들어 문헌[Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994)] 및 문헌[Wright and Harris, supra.]의 기술을 사용하여 생성시킬 수 있으며 (iii)과 관련하여 예를 들어 문헌[Traunecker etal. Int. J. Cancer (Suppl.) 7 : 51-52 (1992)]을 참조.

일부 실시 형태에 있어서 키메라 항체는 본 발명의 항체 유래의 가변 영역 중 하나 이상을 사용하여 제조한다. 다른 실시 형태에 있어서 키메라 항체는 상기 항체 유래의 하나 이상의 CDR 영역을 사용하여 제조한다.

유도체화 및 표지된 항체

본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 유도체화되거나 다른 분자 (예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질)에 결합될 수 있다. 일반적으로 본 항체 또는 항원 결합 단편은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 것이 유도체화 또는 표지에 의해 악영향을 받지 않도록 유도체화된다. 예를 들어 본 발명의 항체 또는 항체의 일부는 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들어 다른 항체 (예를 들어 2특이성 항체 또는 다이아바디 (diabody), 검출제, 세포 독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항원 결합 단백질의 다른 분자 (예를 들어 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 결부를 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 (화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합에 의한 결부 또는 다른 것에 의해) 기능적으로 결합될 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서 유도체화 항체는 (예를 들어 2특이성 항체의 생성을 위하여 동일한 형태 또는 상이한 형태의) 2종 이상의 항체의 가교 결합에 의해 생성된다. 적합한 가교 결합제는 적당한 스페이서에 의해 분리되는 2개의 명백하게 반응성인 기를 갖는 이종 2작용성인 것 (예를 들어 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), 또는 동종 2작용성 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트)인 것을 포함한다. 이러한 링커는 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 케미칼 컴퍼니 (Pierce Chemical Company)로부터 입수가능하다.

일부 실시 형태에 있어서 유도체화 항체는 표지된 항체이다. 본 발명의 항체 또는 항체의 일부를 유도체화할 수 있는 검출제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 피코에리쓰린, 란타나이드 포스포르 등을 포함하는 형광성 화합물이다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소, 예를 들어 서양 고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼라인 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등으로 표지될 수 있다. 검출가능한 효소로 표지되는 실시 형태에 있어서 항체는 효소가 검출가능한 반응 생성물의 생성을 위하여 사용하는 추가의 시약의 첨가에 의해 검출된다. 예를 들어 서양 고추냉이 퍼옥시다제 + 과산화수소 및 디아미노벤지딘. 항체는 또한 바이오틴으로 표지되며 아미딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통하여 검출될 수 있다. 항체는 또한 이차 리포터 (예를 들어 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프로 표지될 수 있다.

항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 방사성 동위 원소로 표지된 아미노산으로 표지될 수 있다. 방사성 표지는 진단 및 치료 목적 둘 모두에 사용될 수 있다. 방사성 동위 원소로 표지된 항-Nogo 수용체-1 항체는 진단용으로, 예를 들어 대상에 있어서의 Nogo 수용체-1의 레벨 측정용으로 사용될 수 있다. 또한 방사성 동위 원소로 표지된 항-Nogo 수용체-1 항체는 척수 손상 치료에 있어서 치료용으로 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 표지체의 예는 하기의 방사성 동위 원소 또는 방사성 뉴클레오티드 - ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I를 포함하지만 그에 한정되지는 않는다.

항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 단편은 또한 화학적 기, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 메틸 또는 에틸기, 또는 탄수화물 기로 유도체화될 수 있다. 이러한 기는 항체의 생물학적 특성을 개선시켜 예를 들어 혈중 반감기를 증가시키거나 조직 결합을 증가시키는 데에 유용할 수 있다.

항-Nogo 수용체-1 항체의 특성화

항-Nogo 수용체-1 항체의 클래스 및 서브클래스

항-Nogo 수용체-1 항체의 클래스 및 서브클래스는 당 업계에 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있다. 일반적으로 항체의 클래스 및 서브클래스는 특정 클래스 및 서브클래스의 항체에 특이적인 항체를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 항체는 구매가능하다. 이 클래스 및 서브클래스는 ELISA, 웨스턴 블롯과 기타 기술에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로는, 클래스 및 서브클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인의 일부 또는 모두의 서열을 결정하는 단계, 그의 아미노산 서열을 다양한 클래스 및 서브클래스의 면역글로불린의 공지된 아미노산 서열과 비교하는 단계, 및 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정하는 단계로 결정할 수 있다.

항-Nogo 수용체-1 항체의 Nogo 수용체-1에의 결합 친화도

본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체의 본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에의 결합 친화도 및 해리 속도를 당 업계에 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들어 결합 친화도는 경쟁적 ELISA, RIA, BIAcore 또는 KinExA 기술로 측정할 수 있다. 해리 속도는 또한 BIAcore 또는 KinExA 기술로 측정할 수 있다. 결합 친화도 및 해리 속도는 예를 들어 BIAcore를 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정한다.

7E11 및 1H2의 K_d는 각각 1 x 10^-7 M 및 2 x 10^-8 M인 것으로 측정되었다.

항-Nogo 수용체-1 항체에 의한 Nogo 수용체-1 활성의 억제

일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Nogo 수용체-1이 리간드에 결합하는 것을 억제한다. 이러한 억제의 IC₅₀은 당 업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 ELISA, RIA 또는 기능적 길항 작용으로 측정할 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서 IC₅₀은 0.1 내지 500 nM 사이이다. 일부 실시 형태에 있어서 IC₅₀은 10 내지 400 nM 사이이다. 또다른 실시 형태에 있어서 본 항체 또는 그의 일부의 IC₅₀은 60 nM 내지 400 nM 사이이다. 7E11 및 1H2의 IC₅₀은 결합 분석에 있어서 각각 400 nM 및 60 nM인 것으로 측정되었다. 또한, 하기의 표 3 참조.

요컨대, 본 발명의 교시 내용이 제공된다면 당 업계의 숙련자에게는 주어진 항체 분자의 안정성 또는 반감기, 면역원성, 독성, 친화도 또는 수율을 증가시키거나 감소시키는 방법을 포함하여 본 발명의 항체의 생물학적 특성을 변경시키거나, 특정 용도에 더욱 적합하도록 할 수 있는 임의의 다른 방식으로 그를 변경시키기 위하여 사용할 수 있는 다양한 방법이 이용가능하다.

본 발명의 항체를 함유하는 조성물 및 그의 용도가 하기되어 있다.

용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드

단백질

전장의 Nogo 수용체-1은 신호 서열, N-말단 영역 (NT), 8개의 류신 풍부 반복체 (LRR), LRRCT 영역 (8개의 류신 풍부 반복체의 류신 풍부 반복체 도메인 C-말단), C-말단 영역 (CT) 및 GPI 앵커로 구성된다 (도 1 참조).

본 발명의 일부 실시 형태는 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드는 NT 도메인; 8개의 LRR 및 하나의 LRRCT 도메인을 포함하며 신호 서열 및 기능성 GPI 앵커가 결여되어 있다 (즉, GPI 앵커가 없거나 세포 막과 효율적으로 결부되는 능력이 결여된 GPI 앵커).

일부 실시 형태에 있어서 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드는 이종성 LRR을 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 이종성 LRR을 포함한다. 이종성 LRR은 Nogo 수용체-1 이외의 단백질로부터 수득되는 LRR을 의미한다. 이종성 LRR이 수득될 수 있는 예시적인 단백질로는 톨(toll)-유사 수용체 (TLR1.2); T-세포 활성화 류신 반복체 풍부 단백질; 데세오린 (deceorin); OM-gp; 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질의 산성 불안정성 서브유닛 슬릿 (slit) 및 로보 (robo)와; 톨-유사 수용체 4가 있다.

일부 실시 형태에 있어서 본 발명은 319개의 아미노산의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 (용해성 Nogo 수용체-1 344, sNogoR1-344, 또는 sNogoR344) (서열 번호 6 및 8의 잔기 26-344 또는 서열 번호 8의 잔기 27-344)를 제공한다. 본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 285개의 아미노산의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 (용해성 Nogo 수용체-1 310, sNogoR1-310, 또는 sNogoR310) (서열 번호 7 및 9의 잔기 26-310 또는 서열 번호 9의 잔기 27-310). 도 1 참조.

[표 1]

인간 및 쥐 Nogo 수용체-1 폴리펩티드의 서열

본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드는 리간드가 Nogo 수용체-1에 결합하는 것을 억제하는 데에 사용되며 Nogo 수용체-1 리간드의 길항제로 작용한다. 본 발명의 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드는 뉴런에 있어서 신경 돌기의 생장 및 생성, 예를 들어 축삭 성장의 억제를 감소시키며 뉴런에 있어서 마이엘린에 의해 매개되는 성장 원추 쇠약을 억제하는 데에 사용된다. 일부 실시 형태에 있어서 뉴런은 CNS 뉴런이다.

놀랍게도 sNogoR310 및 sNogoR344는 NogoA, NogoB, NogoC, MAG 및 OM-gp가 Nogo 수용체-1에 결합하는 것을 차단한다.

일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드를 더 포함하는 융합 단백질의 성분이다. 일부 실시 형태에 있어서 이종성 폴리펩티드는 면역글로불린 불변 도메인이다. 일부 실시 형태에 있어서 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 불변 도메인이다. 일부 실시 형태에 있어서 이종성 폴리펩티드는 Fc 단편이다. 일부 실시 형태에 있어서 Fc는 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드의 C-말단 말단부에 결합된다. 일부 실시 형태에 있어서 융합 Nogo 수용체-1 단백질은 이량체이다.

본 발명의 핵산 분자

본 발명은 서열 번호 1-9, 26-27, 29-37 및 41-45 중 임의의 하나의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서 핵산은 서열 번호 6 및 8에 나타내어져 있는 Nogo 수용체-1의 아미노산 잔기 26-344 또는 서열 번호 8에 나타내어져 있는 Nogo 수용체-1의아미노산 잔기 27-344로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시 형태에 있어서 핵산 분자는 서열 번호 7 및 9에 나타내어져 있는 Nogo 수용체-1의 아미노산 잔기 26-310 또는 서열 번호 9에 나타내어져 있는 Nogo 수용체-1의 아미노산 잔기 27-310으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "핵산"은 게놈 DNA, cDNA, mRNA 및 안티센스 분자와, 대안적인 골격을 기재로 하거나 천연 공급원으로부터 유도되거나 합성될 수 있는 대안적인 염기를 포함하는 핵산을 의미한다. 일부 실시 형태에 있어서 핵산은 각각이 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합되는 전사 프로모터 및 선택적으로 신호 서열을 더 포함한다.

일부 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 6 및 8에 나타내어져 있는 Nogo 수용체-1의 아미노산 잔기 26-344 또는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 27-344와 서열 번호 7 및 9에 나타내어져 있는 Nogo 수용체-1의 아미노산 잔기 26-310 또는 서열 번호 9의 아미노산 잔기 27-310으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 Nogo 수용체-1 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서, 핵산은 서열 번호 26-27, 29-37 및 41-45로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 포함하는 Nogo 수용체-1 융합 단백질을 코딩한다. 일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 전사 프로모터 및 선택적으로 신호 서열을 더 포함한다. 일부 실시 형태에 있어서 뉴클레오티드 서열은 면역글로불린의 불변 영역을 더 코딩한다. 일부 실시 형태에 있어서 면역글로불린 불변 영역은 중쇄 불변 영역이다. 일부 실시 형태에 있어서 뉴클레오티드 서열은 힌지 (hinge) 영역에 결합된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 더 코딩한다. 일부 실시 형태에 있어서 핵산은 Fc를 더 코딩한다. 일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1 융합 단백질은 Fc 단편을 포함한다.

본 발명의 코딩 핵산은 진단 및 프로브 목적의 검출가능한 표지체를 포함하도록 더 변경될 수 있다. 다양한 상기와 같은 표지체가 당 업계에 공지되어 있으며 본 명세서에 기술된 코딩 분자와 함께 손쉽게 이용될 수 있다. 적합한 표지체는 바이오틴, 방사성 동위원소 표지 뉴클레오티드 등을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 당 업자라면 당 업계에 공지된 표지체 중 임의의 것을 이용하여 표지된 코딩 핵산 분자를 수득할 수 있다.

조성물

일부 실시 형태에 있어서 본 발명은 서열 번호 1-5, 26-27, 29-37 및 41-45의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 활성 화합물을 작용 부위 전달용으로 제약적으로 사용될 수 있는 제제로 프로세싱하는 것을 돕는 보조제 및 부형제를 포함하는 적합한 제약적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형은 수용성 형태, 예를 들어 수용성 염 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한 적당한 유성의 주사용 현탁물로서의 활성 화합물의 현탁물이 투여될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 현탁물의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있는 주사용의 수성 현탁물은 예를 들어 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및 덱스트란을 포함할 수 있다. 선택적으로 현탁물은 안정제도 포함할 수 있다. 또한 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달하기 위한 본 발명의 분자를 캡슐화할 수 있다. 예시적인 "제약적으로 허용가능한 담체"로는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 현탁 매체, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성의 흡수 지연제 등, 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과, 그의 조합이 있다. 일부 실시 형태에 있어서 본 조성물은 등장제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 함유한다. 일부 실시 형태에 있어서 본 조성물은 본 발명의 항체, 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체 또는 융합 단백질의 저장성 또는 유효성을 증강시키는 제약적으로 허용가능한 물질, 예를 들어 습윤량 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 함유한다.

본 발명의 조성물은 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예를 들어 액체 용액 (예를 들어 주사가능하며 주입가능한 용액), 분산물 또는 현탁물을 포함하여 다양한 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 양식 및 치료 용도에 따라 달라진다. 하나의 실시 형태에 있어서 조성물은 주사가능하거나 주입가능한 용액의 형태, 예를 들어 다른 항체로 인간을 수동 면역하는 데에 사용되는 것과 유사한 조성물이다.

본 조성물은 용액, 미세 에멀젼, 분산물, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정연한 (ordered) 구조체로 제형화될 수 있다. 주사가능한 살균 용액은 본 항-Nogo 수용체-1 항체를 요구되는 양으로 적합한 용매 내로 상기에 열거된 하나 또는 조합된 성분과 함께 혼입시키는 단계, 필요할 경우 그 후 여과 살균 단계로 제조할 수 있다. 일반적으로 분산물은 활성 화합물을 기본적인 분산 매체 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 포함하는 살균 비히클 내로 혼입함으로써 제조한다. 주사가능한 살균 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 이전에 살균 여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분 을 생성하는 진공 건조법 및 냉동 건조법이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 주사가능한 조성물의 흡수 연장은 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 함유시킴으로써 초래할 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서 활성 화합물은 이 화합물이 급속하게 방출되는 것을 방지하는 담체와 함께, 예를 들어 이식체, 경피용 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 방출 제어형 제형으로 제조될 수 있다. 생분해성의 생체 적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 다수의 제조 방법이 특허되었거나 당 업계의 숙련자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.

보충적 활성 화합물도 본 조성물 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 제형화되고/되거나 공동 투여된다.

본 발명의 제약 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드(들), 또는 융합 단백질을 함유할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 성취하는 데에 필요한 기간 동안, 그리고 투여량으로 유효한 양을 나타낸다. Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체 융합 단백질의 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 본 항체, 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체 융합 단백질의 모든 유독하거나 해로운 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 것이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 성취하는 데에 필요한 기간 동안, 그리고 투여량에서의 유효한 양을 나타낸다. 일반적으로 예방적 용량은 질환 이전 또는 더욱 조기의 질환 기에 대상에서 사용되기 때문에 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적다.

투여 요법은 최적의 원하는 응답 (예를 들어 치료적 또는 예방적 응답)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어 단일 알약 (bolus)이 투여될 수 있거나 나뉘어진 여러 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나 긴급한 치료 상황에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성을 위하여 투여 단위 형태의 비경구용 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하며 본 명세서에 사용되는 바와 같이 균일한 투여 단위 형태는 치료할 포유류 대상에 있어서 일체 투여형으로 적합화된 물리적으로 분리된 단위를 나타내는데, 각각의 단위는 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성화합물을 요구되는 제약적 담체와 공동으로 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태의 명세 사항은 (a) 본 항체, 항원 결합 단편, 및 용해성 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체 융합 단백질의 특유의 특성 및 성취될 특정의 치료 또는 예방 효과와, (b) 개체에 있어서 민감성의 치료를 위한 항체, 항원 결합 단편, 및 용해성 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체 융합 단백질과 같은 혼성 분에 있어서의 내재적인 제한 사항에 의해, 그리고 상기에 직접적으로 의존하여 결정된다. 일부 실시 형태에 있어서 치료적으로 유효한 용량은 Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경우 일일 0.1-4 mg/Kg 범위이다. 일부 실시 형태에 있어서 치료적으로 유효한 용량은 Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경우 일일 0.2-4 mg/Kg 범위이다. 일부 실시 형태에 있어서 치료적으로 유효한 용량은 Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경우 일일 0.2 mg/Kg이다.

항체, 항원 결합 단편, 용해성 수용체 및 융합 단백질의 용도

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 항-Nogo 수용체-1 항체, 이러한 항체의 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 그를 필요로 하는 포유류에게 투여하여 Nogo 수용체-1의 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1을 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, Nogo 수용체-1이 리간드에 결합하는 것을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서 리간드는 NogoA, NogoB, NogoC, MAG 및 OM-gp로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 뉴런을 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 성장 원추의 쇠약을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 뉴런을 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 신경 돌기의 생장 또는 발아의 억제를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서 뉴런은 CNS 뉴런이다. 본 방법의 일부에 있어서 신경 돌기 생장 또는 발아는 축삭 성장이다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 (a) (i) 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 또는 (ii) 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드를 발현하는 배양된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 숙주 세포를 뉴런 부위 또는 뉴런 부위 근처에 도입하는 단계를 포함하는, 포유류에서 사멸 위험 상태에 있는 뉴런의 생존을 촉진하는 방법을 제공한다. 문헌[Almudena Ramon-Cueto, M Isabel Cordero, Fernando F Santos- Benito and Jesus Avila (2000) Functional recovery of paralegic rats and motor axon regneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells. Neuron 25,425-435].

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 (a) 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 또는 (b) 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 뉴런 부위 또는 뉴런 부위 근처에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항-Nogo 수용체-1 항체, 항원 결합 단편 또는 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드는 포유류에서 뉴런의 생존을 촉진하기에 충분한 양으로 상기 뉴클레오티드 서열로부터 발현되는, 포유류에 존재하는 사멸 위험 상태의 뉴런의 생존을 촉진하는 유전자 요법을 제공한다. 이러한 실시 형태에 유용한 바이러스 벡터 및 방법이 예를 들어 문헌[Noёl et al., Human Gene Therapy, 13, 1483-93 (2002)]에 기술되어 있다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 리간드를 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체-1 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 리간드에 Nogo 수용체-1이 결합하는 것을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1 리간드를 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체-1 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, Nogo 수용체-1 리간드의 활성의 조절 방법을 제공한다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1 리간드를 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체-1 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서의 성장 원추의 쇠약을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 Nogo 수용체-1 리간드를 본 발명의 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 Nogo 수용체-1 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 신경 돌기의 생장 또는 발아의 억제를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에 있어서 뉴런은 CNS 뉴런이다. 일부 실시 형태에 있어서 리간드는 NogoA, NogoB, NogoC, MAG 및 OM-gp로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에 있어서 신경 돌기 생장 또는 발아는 축삭 성장이다.

본 명세서에 기술된 임의의 형태의 항체 또는 수용체는 치료용으로 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서 항-Nogo 수용체-1 항체는 인간 항체이다. 일부 실시 형태에 있어서 포유류는 인간 환자이다. 일부 실시 형태에 있어서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 수의학적 용도로, 또는 인간 질환의 동물 모델로서 교차 반응 (예를 들어 영장류, 사이노몰로구스 (cynomologous) 또는 붉은털 (rhesus) 원숭이)하는 항체와 함께 Nogo 수용체-1을 발현하는 비인간 포유류에게 투여한다. 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는 데에 유용할 수 있다.

일부 실시 형태에 있어서 척수 손상을 치료하여 손상 부위 전반에 걸쳐 축삭의 성장을 돕기 위하여 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 투여를 사용한다.

본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 단독으로, 또는 특정의 병리학적 프로세스를 조절하는 다른 제제와 조합하여, 또는 상기 제제와 순차적으로 조합하여 제공할 수 있다. 예를 들어 항염증제는 뇌졸중 후에 추가의 뉴런 손상 및 축삭 재생 억제의 차단을 위한 수단으로 공동 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 항-Nogo 수용체-1 항체, 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 Nogo 수용체-1 융합 단백질은 두가지가 동시에, 연속적으로 또는 독립적으로 투여될 경우 하나 이상의 추가의 치료제와 조합되어 투여되는 것으로 한다.

본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체, 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 Nogo 수용체-1 융합 단백질은 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 평피, 흡입 또는 구강 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어 약제는 미세 주입을 통하여 손상 부위에 국소적으로 투여될 수 있다. 일반적인 부위는 손상에 의해 생기는 손상된 척수 지역을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 수령체의 연령, 건강 및 체중, 공존 치료의 종류, 만일 있다면 치료의 빈도와, 원하는 효과의 성질에 따라 달라진다.

본 발명의 화합물은 생체내에서, 보통은 포유류, 예를 들어 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐 및 생쥐에서, 또는 시험관내에서 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자 (rDNA)를 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 rDNA 분자는 분자 조작에 처해지는 DNA 분자이다. rDNA 분자의 생성 방법은 당 업계에 잘 알려져 있는데 예를 들어 문헌[Sambrook et al. , (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조. 일부 rDNA 분자에 있어서 코딩 DNA 서열은 발현 제어 서열 및 벡터 서열에 작동가능하게 결합된다.

본 발명은 일부 실시 형태에 있어서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 핵산이 작동가능하게 결합되는 벡터 및 발현 제어 서열의 선택은 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 원하는 기능적 특성 (예를 들어 단백질 발현, 및 형질전환될 숙주 세포)에 직접적으로 의존적이다. 본 발명의 벡터는 적어도 rDNA 분자에 포함되는 구조 유전자의 복제 또는 숙주 염색체 내로의 삽입, 바람직하게는 발현의 유도도 가능할 수 있다.

작동가능하게 결합된 단백질 코딩 서열의 발현을 조절하는 데에 사용되는 발현 제어 요소는 당 업계에 공지되어 있으며 유도성 프로모터, 구성 (constitutive) 프로모터, 분비 신호, 및 기타 조절 요소를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 유도성 프로모터는 손쉽게 제어되는데, 예를 들어 숙주 세포의 배지의 영양소에 응답성이다.

하나의 실시 형태에 있어서 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터는 원핵 생물 레플리콘 (replicon), 즉, 재조합 DNA 분자로 형질전환된 원핵 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 숙주 세포에서 재조합 DNA 분자의 자율 복제 및 유지를 염색체 외적으로 지시하는 능력을 가지는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 레플리콘은 당 업계에 잘 알려져 있다. 또한 원핵 생물 레플리콘을 포함하는 벡터는 발현이 약물 내성과 같은 검출가능하거나 선발가능한 마커를 부여하는 유전자도 포함할 수 있다. 전형적인 박테리아 약물 내성 유전자는 앰피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 것이다.

원핵 생물 레플리콘을 포함하는 벡터는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)에서 코딩 유전자 서열의 발현 (전사 및 번역)을 지시할 수 있는 원핵 생물 또는 박테리오파지 프로모터를 더 포함할 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라제가 결합되게 하여 전사가 일어나게 하는 DNA 서열에 의해 형성되는 발현 제어 요소이다. 박테리아 숙주와 상용성인 프로모터 서열은 일반적으로 본 발명의 DNA 절편의 삽입을 위한 편리한 제한 효소 부위를 포함하는 플라스미드 벡터에 제공된다. 이러한 벡터 플라스미드의 예로는 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329(바이오-라드(Bio-Rad)(등록 상표) 래버러토리즈(Laboratories)), pPL 및 pKK223 (파마시아)이 있다. 임의의 적합한 원핵 생물 숙주가 본 발명의 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자의 발현에 사용될 수 있다.

진핵 세포와 상용성인 발현 벡터, 바람직하게는 척추 동물 세포와 상용성인 것도 코딩 서열을 포함하는 rDNA 분자의 형성에 사용될 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당 업계에 잘 알려져 있으며 여러 구매원으로부터 입수가능하다. 일반적으로는 원하는 DNA 절편의 삽입을 위한 편리한 제한 효소 부위를 포함하는 상기와 같은 벡터가 제공된다. 이러한 벡터의 예로는 pSVL 및 pKSV-10 (파마시아), pBPV-1, pML2d (인터내셔널 바이오테크놀로지즈 (International Biotechnologies)), pTDT1 (ATCC(등록 상표) 31255)와 기타 진핵 생물 발현 벡터가 있다.

본 발명의 rDNA 분자의 제작에 사용되는 진핵 세포 발현 벡터는 진핵 세포에서 효과적인 선발가능한 마커, 바람직하게는 약물 내성 선발 마커를 더 포함할 수 있다. 바람직한 약물 내성 마커는 발현에 의해 네오마이신 내성이 생기게 하는 유전자, 예를 들어 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neo) 유전자이다 (문헌[Southern et al., (1982) J. Mol. Anal. Genet. 1, 327-341]). 대안적으로는 선발가능한 마커는 개별적인 플라스미드, 숙주 세포의 공동 트랜스펙션에 의해 도입되는 2개의 벡터, 및 선발가능한 마커를 위한 적당한 약물의 존재 하에서의 배양에 의해 선발되는 트랜스펙션체 상에 존재할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체의 일부의 발현을 위해서는 일부 길이 또는 전장의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 이 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 결합되도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, YAC, EBV-유래 에피좀 등을 포함한다. 항체 유전자는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 벡터 내로 라이게이션된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 항체의 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서 두 유전자 모두는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트 (blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다.

상기한 바와 같이, 편리한 벡터는기능적으로 완전한 인간 C_H 또는 C_L 면역글로불린 서열을 코딩하는 것인데 적당한 제한 효소 부위가 임의의 V_H 또는 V_L 서열이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 조작된다. 이러한 벡터에 있어서 스플라이싱 (splicing)은 일반적으로 삽입된 J 영역에서의 스플라이스 공여체와 인간 C 영역에 선행하는 스플라이스 수용체 부위 사이에서 일어나며 또한 인간 C_H 엑손 내에서 나타나는 스플라이스 영역에서 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역 하류의 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬의 분비를 돕는 신호 펩티드도 코딩한다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 대하여 프레임에 맞게 (in frame) 결합되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비면역글로불린 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다.

면역원성 폴리펩티드 외에도 본 발명의 Nogo 수용체-1 항체, 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 그의 발현을 제어하는 조절 서열을 지닌다. 당 업계의 숙련자라면 조절 서열의 선발을 포함하여 발현 벡터의 고안이 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 레벨 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 포유류 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 고레벨의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예를 들어 레트로바이러스 LTR 유래의 프로모터 및/또는 인핸서, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) (예를 들어 CMV 프로모터/인핸서), 시미안 (Simian) 바이러스 40 (SV40) (예를 들어 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (adenovirus major late promoter, AdMLP)), 폴리오마 및 강력 포유류 프로모터, 예를 들어 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 그의 서열에 대한 추가의 상세한 설명은 예를 들어 스틴스키 (Stinski)의 미국 특허 제5,168,062호, 벨 (Bell)의 미국 특허 제4,510,245호 및 샤프너 (Schaffner) 등의 미국 특허 제4,968,615호를 참조.

이종성 유전자 및 조절 서열 외에도 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어 복제 원점) 및 선발가능한 마커 유전자를 지닐 수 있다. 선발가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선발을 돕는다 (예를 들어 모두 악셀 (Axel) 등에게 허여된 미국 특허 제4,399,216호, 동 제4,634,665호 및 동 제5,179,017호 참조). 예를 들어 일반적으로 선발가능한 마커 유전자는 약물, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 (hygromycin) 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 벡터가 도입된 숙주 세포에게 부여한다. 바람직한 선발가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선발/증폭시키는 dhfr^- 숙주 세포에서의 사용의 경우) 및 neo 유전자 (G418 선발의 경우)를 포함한다.

본 발명의 단백질을 재조합에 의해 생성하는 숙주 세포 및 방법

본 발명의 항-Nogo 수용체-1 항체, 면역원성 펩티드, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드, 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터가 적합한 숙주 세포의 형질전환을 위하여 사용될 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 임의의 공지된 방법에 의한 것일 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며 덱스트란에 의해 매개되는 트랜스펙션, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌에 의해 매개되는 트랜스펙션, 원형질체 융합, 전기 천공법, 폴리뉴클레오티드(들)를 리포좀 내에 캡슐화하는 방법, 및 DNA의 핵 내로의 직접적인 미세 주입법을 포함한다. 또한 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포 내로 도입될 수 있다.

적당한 숙주 세포를 본 발명의 rDNA 분자로 형질전환시키는 것은 사용되는 벡터의 유형 및 이용되는 숙주 세포에 일반적으로 의존적인 잘 알려진 방법으로 성취된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환과 관련해서는 전기 천공법 및 염 처리 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어 문헌[Sambrook et al. , (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 문헌[Cohen et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114] 참조). 척추 동물 세포를 rDNA를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것과 관련해서는, 전기 천공법, 양이온성 지질 또는 염 처리 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어 문헌[Graham et al., (1973) Virology 52,456-467]; 문헌[Wigler et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1373-1376] 참조).

성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 발명의 rDNA 분자를 포함하는 세포는 선발가능한 마커에 대한 선발을 포함하여 잘 알려진 기술로 동정될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 rDNA의 도입에 의해 생기는 세포는 단일 콜로니를 생성하도록 클로닝될 수 있다. 이러한 콜로니로부터의 세포는 수확되고 용해되며 문헌[Southern, (1975) J. Mol. Biol. 98,503-517]에 기술되어 있는 것과 같은 방법을 사용하여 그의 DNA 함량을 rDNA의 존재에 대하여 조사될 수 있거나 세포로부터 생성되는 단백질을 면역학적 방법으로 분석할 수 있다.

발현용의 숙주로 이용가능한 포유류 세포주는 당 업계에 잘 알려져 있으며 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC(등록 상표))으로부터 입수가능한 다수의 불멸화 세포주를 포함한다. 이는 그 중에서도 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (baby hamster kidney, BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어 Hep G2), A549 세포, 및 다수의 기타 세포주를 포함한다. 특히 선호되는 세포주는 어느 세포주가 발현 레벨이 높은지를 결정함으로써 선발된다. 사용될 수 있는 다른 세포주로는 곤충 세포 세포주, 예를 들어 Sf9 세포가 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드, Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입될 경우 이들은 본 항체, 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드가 숙주 세포에서 발현되게 하기에 충분한 시간 동안, 또는 더 바람직하게는 본 발명의 면역원성 폴리펩티드, Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질이 숙주 세포가 배양된 배양 배지 내로 분비되게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드, Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질은 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

또한 생성 세포주로부터의 본 발명의 면역원성 폴리펩티드, Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질 (또는 그로부터의 다른 부분)의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 증강시킬 수 있다. 예를 들어 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)이 특정 조건 하에서의 발현 증강에 있어서 일반적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0 216 846호, 동 제0 256 055호, 및 동 제0 323 997호와 유럽 특허 출원 제89303964.4호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다.

숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 Nogo 수용체-1 항체, 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및/또는 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명의 단백질의 발현에 유용한 진핵 세포는 세포주가 세포 배양 방법과 상용성이며 유전자 생성물의 발현 및 발현 벡터의 증식과 상용성이기만 하다면 제한되지 않는다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효모, 곤충 및 포유류 세포, 바람직하게는 척추 동물 세포, 예를 들어 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 세포주 유래의 것을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 유용한 진핵 숙주 세포의 예는 ATCC(등록 상표)로부터 CCL61로 입수가능한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, ATCC로부터 CRL1658로 입수가능한 NIH 스위스 (Swiss) 생쥐 배아 세포 NIH-3T3, 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK) 등의 진핵 조직 배양 세포주를 포함한다.

rDNA 분자를 사용한 재조합 단백질의 제조

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 사용하여 본 발명의 Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편, 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및/또는 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 일반적으로 재조합 형태의 단백질의 제조는 대개 하기 단계를 포함한다:

첫째, 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 수득한다. 코딩 서열이 인트론에 의해 개재되어 있지 않을 경우 코딩 서열은 임의의 숙주에서의 발현에 직접적으로 적합하다.

이어서 상기한 바와 같이 핵산 분자를 임의로 적합한 제어 서열과 작동가능하게 결합시켜 단백질 개봉 판독 프레임을 포함하는 발현 단위를 형성한다. 발현 단위를 사용하여 적합한 숙주를 형질전환시키고 형질전환된 숙주를 재조합 단백질이 생성되게 하는 조건 하에서 배양한다. 선택적으로 재조합 단백질을 배지 또는 세포로부터 단리하는데, 단백질의 회수 및 정제는 일부 불순물이 용인될 수 있는 일부 경우에는 필요하지 않을 수 있다.

전술한 단계 각각은 다양한 방법으로 행해질 수 있다. 예를 들어 원하는 코딩 서열은 게놈 단편으로부터 수득될 수 있으며 적당한 숙주에서 직접적으로 사용될 수 있다. 다양한 숙주에서 작동가능한 발현 벡터는 상기한 바와 같이 적당한 레플리콘 및 제어 서열을 사용하여 제작한다. 제어 서열, 발현 벡터 및 형질전환 방법은 유전자의 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 의존적이며 이전에 상세하게 논의되었다. 적합한 제한 효소 부위는, 정상적으로는 이용가능하지 않을 경우, 코딩 서열의 말단부에 부가되어 절제될 수 있는 유전자가 상기 벡터 내로 제공되어 삽입되게 할 수 있다. 당 업자라면 본 발명의 핵산 분자와 함께 사용하기 위한 당 업계에 공지된 임의의 숙주/발현 시스템을 손쉽게 개조하여 재조합 단백질을 생성할 수 있다.

본 발명이 더욱 잘 이해될 수 있게 하기 위하여 하기 실시예를 나타낸다. 본 실시예는 단지 예시를 목적으로 하며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 아니된다.

실시예 1

쥐과 모노클로날 항-Nogo 수용체-1 항체의 제조

본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항-Nogo 수용체-1 항체를 하기 방법 및 절차를 사용하여 제조하였다.

면역화

2가지의 면역화 접근법을 사용하였다:

1. 면역원으로 Nogo 수용체-1 (NogoR-1)을 포함하는 COS-7 세포 또는 세포막

쥐 Nogo 수용체-1 유전자 (젠뱅크 (상표명) 번호: AF 462390)를 CMV 프로모터 및 약물 선발을 위한 제네티신 내성 유전자를 포함하는 포유류 발현 벡터 pEAG1256 (바이오겐 (Biogen)) 내로 서브클로닝하였다. 이 재조합 플라스미드를 수퍼펙트 ( Superfect) (키아겐 (Qiagen)(등록 상표))를 사용하여 COS-7 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션체를 제네티신 (깁코 (Gibco) (상표명), 2 mg/ml)을 사용하여 선발하고, 클로닝하고 FACS로 Nogo 수용체-1 단백질에 대하여 확인하였다. COS-7 막을 문헌[Wang et al., J. Neurochem., 75: 1155- 1161(2000)]에 기술된 절차에 따라 상기 세포로부터 2회 세척하여 제조하고, -70℃에서 10% 글리세롤 중 1 mg/ml로 [단백질 농도] 보관하였다.

8주령의 암컷 RBF 생쥐 (잭슨 랩스 (Jackson Labs), 미국 메인주 바 하버 소재)를 50 ㎍의 쥐 Nogo 수용체-1-COS-7 막 또는 표면 상에서 Nogo 수용체-1을 발현하는 전체 COS-7 세포 및 50 ㎕의 RIBI MPL + TDM + CWS 항원 보강제 (시그마 케미컬 컴퍼니 (Sigma Chemical Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 포함하는 에멀젼으로 매 2주마다 1회 복강내로 면역화하였다 (문헌[Lipman et al., 1992]). 면역화한 생쥐로부터의 혈청을 첫번째 면역화 전, 두번째 및 세번째 면역화한지 7일 후, 그리고 세번째 면역화한지 38일 후에 수집하고 항-Nogo 수용체-1 항체 역치를 하기하는 바와 같이 ELISA로 측정하였다.

2. 면역원으로서의 특이적 Nogo 수용체-1 펩티드

쥐 Nogo 수용체-1 유전자 서열을 Vector NTi^TM 소프트웨어를 사용하여 면역원성에 대하여 분석하였다 (도 2). 이 분석에서 확인된 항원성 펩티드를 표준 글루탈데히드 절차를 사용하여 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)에 콘쥬게이션시켰다.

8주령의 암컷 RBF 생쥐 (잭슨 랩스, 미국 메인주 바 하버 소재)를 50 ㎍의 KLH-콘쥬게이션 펩티드 및 50 ㎕의 완전 프로인트 항원 보강제 (시그마 케미컬 컴퍼니, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 포함하는 에멀젼으로 매 2주마다 1회 복강내로 면역화하였다. 면역화한 생쥐로부터의 혈청을 첫번재 면역화 전에, 그리고 두번째 및 세번째 면역화한지 1주일 후에 수집하고 항-Nogo 수용체-1 항체 역치를 측정하였다. 세번째 면역화 후에 추가 접종량을 주었다. 상기 추가 접종량의 면역화 후 3일에 융합 실험을 개시하였다.

하이브리도마 생성 및 스크리닝

항원성 Nogo 수용체-1 펩티드로 면역화한 생쥐로부터의 혈청을 ELISA로 스크리닝하고 반면 Nogo 수용체-1을 발현하는 COS-7 세포로 면역화한 생쥐를 유세포 분석기 (flow cytometry)로 스크리닝하였다. Nogo 수용체-1-COS-7 세포에 특이적으로 결합하는 항체에 대하여 양성인 생쥐를 유세포 분석기로 확인하고 희생시켰다. 비장 세포를 생쥐로부터 단리하고 상기한 바와 같이 FL653 골수종 (Ig-/HGPRT-Balb/c 생쥐 골수종으로부터의 APRT- 유도체로서, 10% FBS, 4500 mg/L 글루코스, 4 mM의 L-글루타민 및 20 mg/ml의 8-아자구아닌을 포함하는 DMEM에서 유지됨)에 융합시켰다 (문헌[Kennett et al., 1993. Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis. Plenum Press, New York]). 융합 세포를 24- 또는 48-웰 플레이트 (코닝 글래스 웍스 (Corning Glass Works), 미국 뉴욕주 코닝 소재)에 도말하고 아데닌, 아미노프테린 및 티미딘 함유 배양 배지를 공급하였다. 하기하는 바와 같이 AAT 내성 배양물을 Nogo 수용체-1-COS-7 세포 또는 Nogo 수용체-1 항원성 펩티드에 결합하는 것에 대하여 ELISA 또는 유세포 측정법으로 스크리닝하였다. 양성 웰의 세포를 제한 희석에 의해 추가로 서브클로닝하였다.

Nogo 수용체-1 항원성 펩티드에 결합하는 항체에 대하여 스크리닝하기 위하여 면역원으로 사용한 펩티드를 BSA에 콘쥬게이션시켰다. pH 9.0의 50 ㎕의 0.1 M 중탄산나트륨 완충제 중 0.5 ㎍의 콘쥬게이션 펩티드를 96-웰 맥시 소르프(MaxiSorp) (상표명) 플레이트 (넝크 (Nunc))의 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 37℃에서 1시간 동안, 또는 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하고 0.1% BSA, 0.1% 난알부민, 0.1% 블로토 (blotto) 및 0.001% 아지드를 포함하는 pH 7.4의 25 mM HEPES를 사용하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 하이브리도마 상청액을 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척한 후 1:10,000 희석의 서양 고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이션된 염소 항-생쥐 이차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 인크. (Jackson ImmunoResearch Inc.)) 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회의 세척 후 TMB (피어스 (Pierce))로 발색시키고 2 M 황산으로 정지시켰다. 색 강도를 450 nm에서 분광 광도계에서 모니터링하였다.

하기와 같이 항체를 전장 Nogo 수용체-1에의 결합에 대하여 스크리닝하였다. 판매 업자가 기술한 바와 같이 COS-7 세포를 0.1 μM의 셀트랙커 (CellTracker) (상표명) 그린 (Green) CMFDA (몰레큘러 프로브즈 (Molecular Probes), 미국 오레곤주 유진 소재)으로 표지하였다. 동일한 부피의 셀트랙커 (상표명) 표지된 대조 세포를 세척된 Nogo 수용체-1-COS-7 세포와 혼합시킨 후 항-Nogo 수용체-1 시험 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 50 마이크로리터의 세포 혼합물을 96-웰의 V자형 바닥 폴리스티렌 플레이트 (코스타 (Costar)(등록 상표) 3877, 미국 뉴욕주 코닝 소재)의 각각의 웰 내로 분배하고 100 ㎕의 하이브리도마 상청액 또는 대조 항-Nogo 수용체-1 항체를 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 세포를 세척하고 PBS 중 R-피코에리쓰린-콘쥬게이션된 친화성 순수 (Fab')2 단편 염소 항-생쥐 IgG Fc 감마 특이적 제2 항체 (1:200, 잭슨 이뮤노리서치 래브러토리, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재) 50 ㎕와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 마지막에 세포를 PBS로 2회 세척하고 1% FBS를 포함하는 PBS 200 ㎕에 현탁시키고 FACS 분석하였다. 다르게는, Nogo 수용체-1-COS-7 세포를 하이브리도마 상청액과 혼합시키고 이어서 R-피코에리쓰린-콘쥬게이션된 염소 항-생쥐 이차 항체로 처리하고 직접적으로 표준 FACS 분석에 처하였다.

본 발명자들은 다양한 면역원을 사용하여 25종의 항-Nogo 수용체-1 항체를 생성하였다. 본 발명자들은 면역원으로 쥐 Nogo 수용체-1의 잔기 110-125에 해당하는 펩티드 서열을 사용하여 2종의 항체 7E11 및 5B10을 생성하였다. 본 발명자들은 면역원으로 전장 쥐 Nogo 수용체-1로 트랜스펙션시킨 COS7 세포로부터 제조한 막을 사용하여 3종의 항체, 1H2, 3G5 및 2F7을 생성하였다. 본 발명자들은 면역원으로 sNogoR310-F를 사용하여 13종의 항체를 생성하였으며 (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1, 2G7.1, 2C4.1, 2F11.1, 및 1H4.1) 면역원으로 쥐 Nogo 수용체-1 잔기 423-434에 해당하는 펩티드 서열을 사용하여 7종의 항체를 생성하였다 (2E8.1, 2G11.2, 및 1B5.1).

모노클로날 항체 7E11 및 5B10의 서열 분석

본 발명자들은 키아젠(등록 상표) RNeasy(등록 상표) 미니 키트를 사용하여 전체 RNA를 추출하고 단리 RNA로부터 cDNA를 생성하였다. 본 발명자들은 프라이머 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' (서열 번호 12) 및 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' (서열 번호 25)을 사용하여 PCR로 경쇄 서열을 증폭시켰다. 본 발명자들은 프라이머 5'-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (서열 번호 13) 및 5'-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3' (서열 번호 14)를 사용하여 PCR로 중쇄를 증폭시켰다. 상기 프라이머는 하기와 같은 축퇴성 (degenerate) 뉴클레오티드를 포함한다: S는 G 또는 C를 나타내며; M은 A 또는 C를 나타내며, R은 G 또는 A를 나타내며; W는 A 또는 T를 나타내며; K는 G 또는 T를 나타내며; Y는 T 또는 C를 나타낸다. 본 발명자들은 PCR 단편을 서열 결정용 벡터 내로 클로닝하고 서열 결정용 벡터에 특이적인 프라이머를 사용하여 디데옥시사슬 종결법으로 CDR의 DNA 서열을 결정하였다. 본 발명자들은 개념적으로 DNA 서열을 번역하였으며 모노클로날 항체인 7E11 및 5B10의 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역의 부분적인 아미노산 서열을 표 2에 나타낸다. mAb의 중쇄 및 경쇄로부터의 3개의 CDR은 표 2에서 밑줄이 그어져 있다. 7E11 및 5B10의 경쇄는 아미노산 서열 동일성이 94%이며 중쇄는 아미노산 서열 동일성이 91%이다. mAb인 7E11, 5B10, 및 1H2는 IgG1 이소형의 것이며 mAb인 3G5 및 2F7은 IgG2a 이소형의 것이다. 상기 5종의 mAb 각각은 카파 이소형의 경쇄를 가진다. 본 발명자들은 이러한 접근법으로 다른 모노클로날 항체의 서열을 분석하였다.

[표 2]

mAb인 7E11 및 5B10의 아미노산 서열

모노클로날 항체 7E11의 에피토프 맵핑

Mab 7E11은 쥐 및 인간 NgR1 모두에 결합한다. 7E11 결합을 담당하는 에피토프를 결정하기 위해서, 쥐 NgR1의 합성 펩티드 및 단편을 형성하고, 이를 7E11 결합에 대해 테스트하였다.

모두 8개의 LRR 도메인과 N- 및 C-말단 캡(sNgR310)을 포함하는 쥐 NgR1의 재조합 단편을, 산 또는 시아노젠 브로마이드(CNBr)로 처리하고, 겔 전기영동으로 단편을 분리하였다. 미처리된 sNgR310은 42 kDa의 겉보기 분자량으로 이동하였다. sNgR310의 산 처리 결과 15 kDa (aa 27-aa 122) 및 30 kDa (aa 123-aa 310)의 2개의 주요 분해 산물이 생성되었다. CNBr 처리로 3개의 단편, 즉 불균질 글리코실화된 단편을 나타낼 수 있는 33/35 kDa 이중체 (aa 27-aa 229), 10 kDa 산물 (aa 241-aa 310), 및 겔에 보유되지 않는 11-아미노산 단편 (aa 230-aa 240)이 형성되었다. 겔의 웨스턴 블롯을 7E11로 브로빙하고, 온전한 쥐 NgR1 (aa 27-aa 310), 15 kDa 산 처리 단편 (aa 27-aa 122) 및 35 kDa CNBr 처리 단편 (aa 27-aa 229)에 결합함을 입증하였다. 7E11은 30 kD 산 처리 단편 (aa 123-aa 310) 또는 10 kDa CNBr 처리 단편 (aa 241-aa 310)에는 결합하지 않았다. 15 kDa 산 처리 단편 및 35 kDa CNBr 처리 단편은 모두 서열 LDLSDNAQLRVVDPTT (서열 번호 1)을 포함하였으며, 이것은 7E11이 NgR1 상의 단일 에피토프에 결합한다는 것과 일치한다.

sNgR310의 트립신 펩티드 분해 시험으로 7E11 결합 부위를 추가 분석하였다. HPLC 분석 결과 몇몇 단편이 확인되었으며, 이것은 NgR1 서열 내에 트립신 민감성 리신 및 아르기닌 잔기가 몇개 있다는 것을 나타낸다. 7E11은 단일 트립신 분해 펩티드에만 결합하는데, 이는 7E11이 NgR1 상의 단일 에피토프에 결합한다는 추가 증거를 제공하는 것이다. 후속 질량 분광분석(MS) 및 서열 분석으로 결합된 펩티드가 AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (서열 번호 26)임을 확인하였다.

LDLSDNAQLRVVDPTT 펩티드 (서열 번호 1)에 대해 추가의 맵핑 분석을 실시하였다. 펩티드를 트립신으로 분해하여, 2개의 주요 단편, 즉 LDLSDNAQLR (서열 번호 27) 및 VVDPTT (서열 번호 28)를 얻었으며, 이들에 결합하는 7E11의 능력을 시험하였다. MS 분석 결과 항체가 펩티드 LDLSDNAQLR (서열 번호 27)에 결합하며, 따라서 이 펩티드가 7E11에 대한 결합 에피토프를 포함한다는 것을 확인하였다. 이 펩티드 분획에 대해 상세 MS 분석한 결과, Asn115 및 Gln117에서의 탈아민화, 112 또는 113에서의 알라닌 첨가, 또는 114에서의 세린 첨가를 가지는 펩티드를 포함하여, 7E11에 결합하는 몇몇 스크램블된 펩티드를 확인하였다(표 3). 이들 데이타는, 이 펩티드 단편에 위치하는 몇몇 아미노산 잔기가 7E11 결합에 중요하지 않을 수 있음을 나타낸다.

[표 3]

7E11에 의해 결합된 돌연변이 펩티드

결합된 펩티드	아미노산 서열
야생형 단편 탈아민화됨	LDLSDNAQLR (서열 번호 27) LDLSDDAELR (서열 번호 29)
스크램블형 단편 1번 탈아민화됨	LDLASDNAQLR (서열 번호 30) LDLASDDAELR (서열 번호 31)
스크램블형 단편 2번 탈아민화됨	LDALSDNAQLR (서열 번호 32) LDALSDDAELR (서열 번호 33)
스크램블형 단편 3번 탈아민화됨	LDLSSDNAQLR (서열 번호 34) LDLSSDEAELR (서열 번호 35)

LDLSDNAQLRVVDPTT 펩티드를 엔도프로테아제 Asp-N으로 분해하고, 7E11 결합을 테스트하였다. 엔도프로테아제 Asp-N은 펩티드를 3개의 펩티드 단편, 즉 L, DLS 및 DNAQLRVVDPTT (서열 번호 36)로 분해하였다. 이들 산물 중, 7E11은 DNAQLRVVDPTT 펩티드에 결합하였다. 트립신 및 Asp-N 분해 데이타를 취합하면, 7E11 결합 에피토프를 이들 사이에 공유된 서열, 즉 DNAQLR (서열 번호 37)로 국재화할 수 있다.

각종 종으로부터 유래한 NgR1, NgR2, 및 NgR3의 아미노산 서열을 분석하여 7E11이 쥐 및 인간 NgR1에는 결합하지만, 마우스 NgRl, 인간 NgR2 또는 마우스 NgR3에는 결합하지 않는다는 관찰 결과에 기초하여, 7E11 결합 에피토프 내의 중요한 잔기를 예측하였다. 서열 정렬 결과, 쥐 NgR1의 아미노산 110-125와 인간 NgR1의 상응하는 서열은 동일하고, 마우스 NgR1 서열은 위치 119에서 하나의 아미노산만 다르다는 것이 밝혀졌다(쥐 및 인간 NgR1에서 Arg119, 마우스 NgR1에서 His119; 표 4).

[표 4]

다른 종으로부터 유래한 NgR의 서열 정렬

단백질(들)	aa 110 내지 aa 119의 서열	서열 번호
쥐 및 인간 NgR1	LDLSDNAQLR	27
마우스 NgR1	LDLSDNAQLH	38
쥐 및 인간 NgR2	LDLGDNRHLR	39
쥐, 인간 및 마우스 NgR3	LDLGDNRQLR	40

7E11이 쥐 및 인간 NgR1에 잘 결합하지만 마우스 NgR1에 대한 결합은 좋지 않은 것으로 보아 NgR1 상의 Arg119가 7E11 결합에 기여한다. 유사하게, 7E11은 NgR3에는 잘 결합하지 않고, NgR3은 DNAQLR (서열 번호 38) 내에서 NgR1과 상응하는 서열 중 아르기닌만 차이가 있기 때문에 Ala116은 에피토프 내에 포함되어 있다. DNAQLR 서열 내에서, NgR2 내의 잔기 6개 중 4개는 쥐 NgR1과 동일하다. Ala116 및 Gln117은 아르기닌 및 히스티딘으로 각각 치환되어 있다. 그 결과, Ala116은 7E11 결합에 기여하는 중요한 아미노산 잔기이지만 Gln117의 관련성을 반드시 배제하는 것은 아니다.

이들 접촉점을 입증하기 위해서, LDLSDNAQLR 서열 (서열 번호 27) 내에 점 돌연변이를 포함하는 몇몇 펩티드를 형성하여 7E11 결합에 대해 테스트하였다. 펩티드를 MaxiSorp^TM 플레이트 (Nunc^TM)에 고정시키고, 일련의 7E11의 희석물을 적용하였다. 얻어진 EC₅₀ 값은 표 5에 제시되어 있다. 7E11은 본래의 펩티드와 유사한 EC₅₀ 값으로 돌연변이 Leu11OAla 및 Asp111Ala에 결합하였다. Gln117Ala를 테스트한 결과, EC₅₀이 30배 증가하였고, Arg119His을 테스트한 결과 EC₅₀이 25배 증가하였다. EC₅₀의 가장 유의적인 변화는, Arg119가 알라닌으로 돌연변이되었을 때 관찰되었다.

[표 5]

7E11은 다른 EC₅₀으로 돌연변이 펩티드에 결합한다.

7E11 결합 에피토프의 위치는 sNgR310의 최근 밝혀진 결정 구조로 측정하였다. 예상한 바와 같이, 구조는 7E11 에피토프가 분자 표면에 노출되어 있는 것을 보여준다. 잔기 Arg119, Gln117, Ala116 및 Asp114는 구조로부터 외측으로 돌출되어 있는 반면에 Leu118 및 Asn115는 내측을 향해 위치한다. 에피토프는 측면 중 하나와 대향하는 염기성 표면과 구조의 오목한 표면 내에 산성 패치의 상부에 위치한다.

모노클로날 항-Nogo 수용체-1 항체에 의한 리간드의 용해성 Nogo 수용체-1에의 결합의 억제

본 발명자들은 상기한 바와 같이 생성한 항-Nogo 수용체-1 모노클로날 항체를 시험하여 이들이 리간드가 Nogo 수용체-1에 결합하는 것을 억제하는지를 결정하였다.

쥐 Nogo 수용체-1의 아미노산 잔기 26-344 및 하기하는 바와 같이 생성시킨 쥐 IgG1 분자의 힌지와 Fc 영역을 포함하는 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질 (sNogoR344-Fc) 0.5 ㎍을 25℃에서 2시간 동안 250 ㎍의 단백질-A- 또는 맥아 아글루티닌-콘쥬게이션된 SPA 비드 (아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech)) 상에 고정시켰다. 50 ㎕의 HEPES-완충 인큐베이션 배지 (10 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 난알부민, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ 및 프로테아제 억제제) 중 1 ㎕의 ¹²⁵I-Nogo66 (아머샴, 2000 Ci/mmol, 1 nM), 항-Nogo 수용체-1 mAb 및 Fc-sNogoR-1에 커플링된 SPA 비드를 각각의 샘플 웰에 첨가하였다. 16시간 후 방사능을 톱카운트 (TopCount)(등록 상표) (패커드 (Packard))를 사용하여 4중 샘플에서 측정하였다. IC₅₀ 값을 곡선 보정 분석으로부터 계산하였다 (도 3) (프리즘 (PRISM), 그래프패드 소프트웨어 (GraphPad Software), 미국 뉴저지주). 일부 실험에 있어서 본 발명자들은 또한 AP-리간드 콘쥬게이트 (예를 들어 AP-Nogo66)를 사용하였으며 알칼라인 포스파타제 활성의 모니터링에 의해 결합을 검출하였다. 본 발명자들은 또한 리간드인 MAG-Fc 및 AP-OM-gp가 Nogo 수용체-1에 결합하는 것을 차단하는 mAb의 능력을 분석하였다.

모노클로날 항체 7E11, 5B10, 1H2, 3G5 및 2F7 모두는 Nogo66, MAG 및 OM-gp의 sNogoR344-Fc에의 결합을 억제하였다. Nogo66에 대한 7E11 및 1H2의 계산된 IC₅₀은 각각 400 nM 및 60 nM이었다. 상기 3종의 리간드의 Nogo 수용체-1에의 결합의 mAb-매개된 억제를 모니터링하는 ELISA로부터의 데이터를 표 6에 요약하여 두었다.

[표 6]

mAb는 Nogo66, MAG 및 OM-gp가 Nogo 수용체-1에 결합하는 것을 억제한다

퍼센트 대체는 30 nM의 항체에서 나타내었으며 특정 mAb의 EC₅₀은 상기한 바와 같이 곡선 보정 분석으로부터 결정하였다. "-"는 검출가능한 활성이 전혀 없음을 나타내며 "ND"는 결정되지 않았음을 나타낸다.

실시예 2

Fab-파지 항-Nogo 수용체-1 항체의 제조

본 발명의 면역원성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항-Nogo 수용체-1 Fab-파지 항체도 하기와 같이 Fab-파지 라이브러리의 스크리닝으로 제조하였다.

모르포시스 (MorphoSys) Fab-파지 라이브러리 HuCAL(등록 상표) 골드 (GOLD)를 용해성의 재조합 쥐 sNogoR310-Fc 단백질 및 쥐 Nogo 수용체-1을 발현하는 COS7 세포에 대하여 스크리닝하였다. Nogo 수용체-1에 특이적으로 결합된 Fab-파지를 정제하고 특성화하였다. 14D5의 중쇄는 V_H2 유전자로부터 유래되며 경쇄는 V_K1 유전자로부터 유래된다. 상기 Fab-파지, 14D5 중 하나의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열을 표 7에 나타낸다.

[표 7]

14D5의 CDR들의 아미노산 서열

14D5는 일가 및 이가 형태 모두로 쥐 Nogo 수용체-1에 결합한다. 또한 14D5는 생쥐 및 인간 Nogo 수용체-1과 인간 Nogo 수용체-2에는 결합하지만 생쥐 Nogo 수용체-3에는 결합하지 않는다.

실시예 3

항-Nogo 수용체-1의 모노클로날 항체에 의한 Nogo 수용체-1의 면역 침전

면역 침전을 수행하기 위하여 100 ㎕의 용해 세포 또는 50 ㎕의 PiPLC 처리 세포를, 각각 30 ㎕의 단백질 A 또는 G 및 1-2 ㎍의 항체의 존재 하에서 400 또는 450 ㎕의 추출용 완충제 [10 mM 트리스 (Tris)-HCl, pH 7.2, 0.5% 트윈 (Tween) (상표명)-20, 0.2 mM PMSF] 또는 RIPA 완충제와 혼합하였다. 이 혼합물을 진탕기에서 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.

샘플을 부드럽게 회전시켜 단백질 A 또는 G 커플링된 비드를 펠렛화하였다. 이 비드를 1 ml의 세척 완충제 (10 mM 트리스-HC1, pH 7.2,0. 1% 트윈-20 (상표명))로 3회 세척하였다. 최종 세척은 10%의 원래 세척 완충제를 사용하여 수행하였다.

비드를 10% 베타-머캅토에탄올을 포함하는 2 X SDS 100 ㎕에 재현탁시켰다. 샘플을 실온에서 인큐베이션한 후 SDS-PAGE용의 4-20% 트리스-글리신 겔 상에서 이동시켰다. SDS-PAGE 겔 분석으로 결정되는 바와 같이 모노클로날 항체 3G5 및 2F7은 Nogo 수용체-1을 면역 침전시킨다.

실시예 4

ELISA에 의한 항체 특이성의 결정

실시예 1 및 2에서 제조한 모노클로날 및 Fab-파지 항체의 특이성을 측정하기 위하여 본 발명자들은 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 패널을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 이 패널은 sNogoR310-Fc (쥐 Nogo 수용체-1의 아미노산 26-310 및 쥐 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질), sNogoR344-Fc (상기 참조), 폴리펩티드 p-617 (서열 번호 1), 폴리펩티드 p-618 (쥐 Nogo 수용체-1의 LRR7 영역으로부터 유래된 19-아미노산의 폴리펩티드; 도 2; 서열 번호 11) 및 폴리펩티드 p-4와 p-5 (각각 Nogo 수용체-1의 LRR5 및 LRRCT 영역으로부터 유래된 폴리펩티드)로 구성된다. 난알부민 및 BSA를 대조로 사용하였다. 도 4에 도시된 바와 같이 mAb 1H2, 3G5 및 2F7은 모두 sNogoR344-Fc에 특이적으로 결합하였다. 유사한 실험에 있어서 상기 항체는 또한 쥐 Nogo 수용체-1 (서열 번호 3)의 아미노산 310-344로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하였으며 mAb 7E11 및 5B10은 폴리펩티드 p-617 (서열 번호 1)에 특이적으로 결합하였다.

sNogoR310-Fc 면역화로부터의 10종의 항체 (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1, 및 2G7.1)는 결합에 있어서 서로를 대체하였는데 이는 이들이 sNogoR310-Fc 상의 유사하거나 중복되는 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다. sNogoR310-Fc 면역화로부터의 다른 3종의 항체 (2C4.1, 2F11.1, 및 1H4.1)는 아미노산 잔기 26-310에 위치하는 다른 에피토프를 인식한다.

본 발명자들은 또한 Fab-파지 14D5를 사용하여 ELISA 결합 분석을 수행하였다. AP-Nogo66, AP-OM-gp 및 MAG-Fc 리간드가 고정화 sNogoR344-Fc에 결합되는 경우 1 μM의 14D5는 Nogo 및 MAG 결합을 완전히 억제하였다. 10 μM의 14D5가 OM-gp의 sNogoR344-Fc에의 결합을 완전히 차단하는 데에 필요하였다.

실시예 5

신경 돌기 생장 분석

상기에서 제조한 모노클로날 및 Fab-파지 항체가 뉴런에 대한 CNS 마이엘린의 영향을 감소시키는 능력을 시험하기 위하여 랩-텍 (Lab-Tek)(등록 상표) 배양 슬라이드 (4웰)을 0.1 mg/ml의 폴리-D-라이신 (시그마(등록 상표))으로 코팅하였다. CNS 마이엘린 또는 PBS를 3㎕의 드롭으로 스포팅하였다. 형광성 미세구 (폴리사이언시즈 (Polysciences))를 마이엘린/PBS에 첨가하여 드롭의 이후의 확인을 가능하게 하였다 (문헌[Grandpre et al, Nature 403, 2000]). 이어서 랩-텍(등록 상표) 슬라이드를 헹구고 10 ㎍/ml의 라미닌 (깁코 (상표명))으로 코팅하였다. P3-4 스프라그 돌리 (Sprague Dawley) 쥐 새끼로부터의 배근 신경절 (dorsal root ganglion, DRG)을 1 mg/ml의 제1형 콜라게나제 (워팅톤 (Worthington))로 해리시키고 뉴런 세포가 풍부하도록 예비 도말한 화염 폴리싱된 파스퇴르 (Pasteur) 피펫으로 미분화하고 마지막으로 예비 코팅한 랩-텍(등록 상표) 배양 슬라이드 상에서 23,000개의 세포/웰로 도말한다. 배양 배지는 5%의 가열 불활성화 공여 말 혈청, 5%의 가열 불활성화 소 태아 혈청 및 50 ng/ml의 mNGF를 포함하는 F12였으며 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 15 ㎍/ml의 mAb7E11을 도말 직후 첨가하였다.

슬라이드를 20% 수크로스를 포함하는 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정하고 1:500으로 희석시킨 뉴런 마커인 항 베타-III-튜불린 (Covance TUJ1)에 대하여 염색하였다. 이차 항체로서 항-생쥐 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor)(등록 상표) 594 (몰레큘러 프로브즈 (Molecular Probes))를 1:300으로 희석시키고 슬라이드를 겔/마운트 (상표명) (바이오메다 (Biomeda) (상표명)로 커버 글래스를 덮었다. 5x의 디지털 영상을 오픈랩 (OpenLab) (상표명) 소프트웨어로 획득하고 신경 돌기 생장의 정량화를 위하여 메타모르프 (MetaMorph)(등록 상표) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

mAb 7E11은 DRG 뉴런을 마이엘린에 의해 매개되는 신경 돌기 생장 억제로부터 보호하였다 (도 5). 유사한 결과가 mAb인 1H2 및 3G5에서 관찰되었다.

쥐 P7 DRG 뉴런을 CNS 마이엘린 기질 상에서 배양한 신경 돌기 생장 보호 분석에 있어서 이가 14D5도 신경 돌기 생장을 효율적으로 촉진하였다.

실시예 6

Nogo 수용체-1으로 트랜스펙션시킨 세포 상에서의 7E11에서의 면역 조직 화학적 특성

실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조한 항-Nogo 수용체-1 mAb의 결합 특성을 추가로 특성화하기 위하여 본 발명자들은 쥐 또는 인간 Nogo 수용체-1을 발현하는 고정 및 생 COS-7 또는 293 세포 모두에 대한 결합력을 비교하였다.

고정 세포:

Nogo 수용체-1 트랜스펙션 및 비-트랜스펙션 세포를 8-웰의 랩-텍(등록 상표) 배양 슬라이드에 도말하고 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시키고 PBS 중 10%의 보통의 염소 혈청, 0.1% 트리톤 X-100으로 1시간 동안 차단시켰다. 차단 용액 중 mAb 7E11을 15 ㎍/ml 및 1.5 ㎍/ml로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시키고; 알렉사 (Alexa)(등록 상표)-콘쥬게이션된 이차 항체 항-생쥐 (몰레큘러 프로브즈)를 차단 용액에서 1:300으로 희석시켜 1시간 동안 인큐베이션시키고; DAPI를 5 ㎍/ml로 이차 항체에 첨가하여 모든 핵을 표지하였다.

생 세포:

트랜스펙션 및 비-트랜스펙션 세포를 8-웰의 랩 텍(등록 상표) 배양 슬라이드에 도말하고 FACS 완충제 (4% 공여 말 혈청 포함)로 4℃에서 30분 동안 차단시키고 FACS 완충제 중 15 ㎍/ml 및 1.5 ㎍/ml의 7E11과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고 헹구고 이차 항체 항-생쥐-알렉사(등록 상표) (FACS 완충제에서 1:300)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.

면역 조직 화학적 염색 실험에 의하면 모든 mAb가 쥐 Nogo 수용체 1을 발현하는 세포에 결합한다는 것이 입증되었다. mAb인 7E11, 2G7.1 및 2C4.1은 인간 Nogo 수용체-1을 발현하는 고정 및 생 세포 둘 모두에 결합하였다.

실시예 7

척수 좌상성 손상의 생쥐 모델

생체 내에서 실시예 1에서 제조한 항-Nogo 수용체-1 mAb의 뉴런에 대한 영향을 시험하기 위하여 본 발명자들은 생쥐 척수 좌상 손상 모델을 사용한다.

암컷 생쥐 (18-22 g)를 진통제 및 항생제로 예방 치료한다. 생쥐를 마취시키고 입체 현미경 하에서 척주를 고정하여 정위 장치에 두었다. 척수에 대한 외상을 웨이트-드롭 (weight-drop) 방법의 변형된 버전으로 도입한다 (문헌[M. Li et al., Functional role and therapeutic implications of neuronal caspase-1 and-3 in a mouse model of traumatic spinal cord injury. Neuroscience Vol. 99, pp. 333-342, 2000]).

간략하게는 T9 및 T10 척추 후궁 절제를 행하고 T9-T10의 가로 프로세스를 양측에서 지지하는 한쌍의 생쥐 가로 클램프를 사용하여 척주를 안정화한다. 직경이 1.4 mm이고 중량이 2 g인 스테인레스 강 임팩트 (impact) 로드 (rod)를 경뇌막 위로 2.5 cm 상승시키고 T10 레벨에서 척수 상으로 하강시킨다. 수술 동안 생쥐를 37℃의 가온 블랭킷 (blanket) 상에 유지하고 1 ml의 가온 살균 염수를 수술 후 각각의 생쥐에게 피하 투여하여 탈수를 피한다. 내성적인 방광 대조를 되찾을 때까지 수동으로 일일 1회 방광을 밖으로 드러낸다.

모든 동물에게 수술 후 매 8-12시간에 수술 후 진통제를 수여하고 그 후 7일 동안 매일 2회 항생제 치료를 하였다. 동물은 연구 동안 음식 및 물에 자유롭게 접근한다. 항-Nogo 수용체-1 항체를 이하의 쥐 척수 가로 절단 모델에 기술한 바와 같이 28일 동안 경막내 주사를 통하여 손상 부위로 전달한다.

실시예 8

용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질의 특성화

용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 (sNogoR-1) 및 융합 단백질 (Fc-sNogoR-1)의 특성화를 위하여 본 발명자들은 하기 실험을 수행하였다.

3 ㎍의 용해성 Nogo 수용체 (sNogoR310-Fc 및 sNogoR344-Fc)를 250 ㎍의 WGA-SPA 비드 상에 고정시키고 최종 부피 100 ㎕의 결합 완충제 (20 mM HEPES, pH 7.4, 2 mM Ca, 2 mM Mg, 0.1% BSA, 0.1% 난알부민 및 프로테아제 억제제) 중 방사성 리간드 (최종 농도: 0.5 nM) 0.5 ㎕를 넣는다. 리간드는 각각의 리간드 세트에 있어서 10 μM의 Nogo66, 10 μM의 ¹²⁵I-Nogo40 (NogoA의 아미노산 1-40) 및 10 μL의 항-Nogo 수용체-1 항체 상청액을 포함한다. Nogo40 상의 3개의 타이로신을 개별적으로 요오드화하고 Nogo40-A, -B 및 -C로 각각 지칭하였다. 3중체의 평균 값을 정규화된 결합 방사능의 %로 나타낸다 (도 6, 7 및 8). 오류 막대는 SEM을 나타낸다. 데이터 정규화에 있어서 억제제의 부재 하에서의 결합 방사능을 100%로 하고 10 μM의 Nogo40의 존재 하에서의 최소 결합 방사능을 0%로 하였다.

실시예 9

리간드의 용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질에의 결합 억제

실시예 8의 결합 분석법과 유사한 결합 분석법을 사용하여 실시예 1에서 제조한 2종의 mAb가 ¹²⁵I-Nogo66의 sNogoR344-Fc에의 결합을 억제하는 능력을 시험하였다. mAb 2F7 및 3G5는 ¹²⁵I-Nogo66이 sNogoR344-Fc에 결합하는 것을 억제하였다.

실시예 10

신경 돌기 생장 분석

랩-텍(등록 상표) 배양 슬라이드 (4웰)을 0.1 mg/ml의 폴리-D-라이신 (시그마(등록 상표)으로 코팅하였다. 단독 또는 sNogoR310, sNogoR310-Fc 융합 단백질, mAb 5B10 또는 대조 PBS와 혼합된 CNS 마이엘린을 3 ㎕ 드롭으로 개별적으로 스포팅하였다. 형광성 미소구체 (폴리사이언시즈)를 마이엘린/PBS에 첨가하여 드롭의 이후의 확인을 가능하게 하였다 (문헌[Grandpre et al, Nature 403, 2000]). 이어서 랩-텍(등록 상표) 슬라이드를 헹구고 10 ㎍/ml의 라미닌 (깁코 (상표명))으로 코팅하였다.

P3-4 스프라그 돌리 쥐 새끼로부터의 배근 신경절 (DRG)을 1 mg/ml의 제1형 콜라게나제 (워팅톤)로 해리시키고 뉴런 세포가 풍부하도록 예비 도말한 화염 폴리싱된 파스퇴르 (Pasteur) 피펫으로 미분화하고 마지막으로 예비 코팅한 랩-텍 배양 슬라이드 상에 23,000개의 세포/웰로 도말한다. 배양 배지는 5%의 가열 불활성화 공여 말 혈청, 5%의 가열 불활성화 소 태아 혈청 및 50 ng/ml의 mNGF를 포함하는 F12였으며 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다.

슬라이드를 20% 수크로스를 포함하는 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정하고 1:500으로 희석시킨 뉴런 마커인 항 베타-III-튜불린 (Covance TUJ1)에 대하여 염색하였다. 이차 항체로서 항-생쥐 알렉사 플루오르(등록 상표) 594 (몰레큘러 프로브즈)를 1:300으로 희석시키고 슬라이드를 겔/마운트 (상표명) (바이오메다) (상표명)로 커버 글래스를 덮었다. 5x의 디지털 영상을 오픈랩 (상표명) 소프트웨어로 획득하고 신경 돌기 생장의 정량화를 위하여 메타모르프(등록 상표) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

sNogoR310, sNogoR310-Fc 및 mAb 5B10 모두는 DRG 뉴런을 마이엘린에 의해 매개되는 신경 돌기 생장 억제로부터 보호하였다 (도 9-11). sNogoR310은 병아리 뉴런을 사용하는 유사한 분석에서 사용하였으며 보호성인 것으로 밝혀졌다.

본 발명자들은 또한 라미닌의 존재 및 부재 하에서 배양한 세포로 실험을 수행하여 용해성 Nogo 수용체의 신경 보호 효과를 시험하였다. 라미닌을 포함하지 않는 배지에서의 뉴런 세포 성장은 열악하며 뉴런 스트레스 상태를 모델링한다.

DRG를 생후 6-7일의 쥐 새끼 (P6-7)로부터 절개하고 단일 세포로 분리하고 상기한 바와 같이 폴리-D-라이신으로 예비 코팅한 96-웰 플레이트 상에 도말하였다. 일부 웰에 있어서 2 ㎍/ml의 라미닌을 2-3시간 동안 첨가하고 헹군 후 세포를 도말하였다. 18-20시간의 인큐베이션 후 플레이트를 4% 파라포름 알데히드로 고정시키고 1:500으로 희석시킨 토끼 항-베타-III-튜불린 항체 (콘반스 (Covance(등록 상표)) 및 1:100으로 희석한 항-HuC/D (몰레큘러 프로브즈)로 염색하고 형광성 이차 항체 (몰레큘러 프로브즈)를 1:200으로 희석시켜 첨가하였다. 어레이스캔 (ArrayScan)(등록 상표) II (셀로믹스 (Cellomics)(등록 상표))를 사용하여 5x 디지털 영상을 획득하고 신경 돌기 생장 응용법을 사용하여 웰 당 평균 신경 돌기 생장/뉴런으로 신경 돌기 생장을 정량화하였다. 3개의 웰/조건으로부터의 9개의 5x 영상을 분석하였다.

일부 실험에 있어서 PC12 세포의 서브클론 (뉴로스크린 (Neuroscreen) (상표명))을 사용하였다 (셀로믹스(등록 상표)). 뉴로스크린 (상표명) 세포를 200 ng/ml의 NGF로 7일 동안 예비 분화시키고 떼어내고 폴리-D-라이신으로 예비 코팅한 96-웰 플레이트에 재도말하였다. 일부 웰에 있어서 5 ㎍/ml의 라미닌을 2-3시간 동안 첨가하고 헹군 후 세포를 도말하였다. 2일간의 인큐베이션 후 플레이트를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 1:500으로 희석시킨 토끼 항-베타-III-튜불린 항체 (코반스(등록 상표)) 및 훽스트 (Hoechst) (핵 염색)로 염색하였다. 어레이스캔Ⅱ(등록 상표)을 사용하여 DRG 세포에서와 같이 신경 돌기 생장을 정량화하였다.

용액 상태의 sNogoR344-Fc 또는 쥐 IgG를 도말 시점의 분화된 뉴로스크린 (상표명) 세포와 P6-7 DRG 뉴런에 첨가하였다.

sNogoR344-Fc의 신경 보호성은 DRG 뉴런을 라미닌의 부재 하에 배양할 경우 1 μM 및 10 μM에서 관찰되었다. 신경 돌기 생장의 정량화에 의하면 sNogoR344-Fc의 첨가시 용량 의존성 증가를 나타내었다. 동일 농도의 sNogoR344-Fc를 라미닌 기질 상에서 성장하는 DRG 뉴런에 첨가하면 모든 예외적인 효과가 생성되지 않았는데, 이는 sNogoR344-Fc가 단지 스트레스를 받은 세포에서만 활성을 가진다는 것을 나타낸다. 라미닌의 부재 하에서의 동일한 농도의 sNogoR344-Fc의 신경 보호 효과도 뉴로스크린 (상표명) 세포에서 관찰되었다.

실시예 11

Fc-sNogoR-1 융합 단백질의 제조 및 정제

쥐 Nogo 수용체-1의 아미노산 1-310을 코딩하는 cDNA 제작물을 포유류 발현 벡터에 포함된 쥐 IgG1 Fc에 융합시키고 이 벡터로 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) (DG44) 세포를 전기 천공하였다. 세포를 10%의 투석 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 항생제-항곰팡이제 시약이 보충된 알파-MEM에서 유지하였다. 트랜스펙션한지 2일 후 조절 배지를 수집하고 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 약 60 kDa의 단백질 밴드를 다클론 토끼 항-Nogo 수용체-1 항체를 사용하여 검출하였다. 세포를 확장시키고 R-PE 콘주게이션된 염소 항-쥐 IgG 항체를 사용하여 분류하였다. 두번째 분류 후 세포를 96-웰 플레이트에서 1개의 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 개개의 웰로부터 분비되는 용해성 Nogo 수용체-1 단백질을 샌드위치 ELISA를 사용하여 시험 및 비교하였다. ELISA 플레이트를 염소 항-쥐 IgG Fcκ 특이적 항체로 코팅하였다. 조절 배지를 적용하였다. 결합된 용해성 Nogo 수용체-1 단백질을 HRP 콘쥬게이션된 당나귀 항-쥐 IgG Fab, Fc-특이성 항체로 검출하였다. 클론 4C12의 분비 레벨이 가장 높았다. 4C12를 스피너 (spinner) 플라스크에서 CHO-M7 배지에서 확장 및 배양하였다. 분비 레벨은 37℃에서 약 10 mg/L이었다.

sNogoR310-Fc 융합 단백질을 발현하는 CHO 세포를 대규모로 배양하였다. 1.7 L의 농축 조절 배지를 10 L의 생물반응기 운행으로부터 수득하였다. pH를 pH 8.9의 1/10 부피의 1.0 M 트리스-HCl을 첨가하여 상승시켰다. 고체 염화나트륨 및 글리신을 각각 3.0 M 및 1.5 M로 첨가하였다. 10 mM 트리스-HCl, 3 M 염화나트륨, 1.5 M 글리신 (pH 8.9)으로 평형화한 세파로스 (Sepharose) (상표명) 컬럼을 준비하였다. 농축 조절 배지를 연동식 펌프를 사용하여 1.5 mL/분으로 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 10 mM 트리스-HCl, 3 M 염화나트륨, 1.5 M 글리신 (pH 8.9) 300 mL, 이어서 120 mL의 5 mM 트리스-HCl, 3 M 염화나트륨 (pH 8.9)으로 세척하였다. 단백질을 25 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨 (pH 2.8)으로 용출시켰다. 10 mL의 분획을 1.0 mL의 1.0 M HEPES (pH 8.5)를 포함하는 튜브에 수집하였다. 단백질 분획을 풀링하고 2 L의 5 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl (pH 7.4)로 3회 투석시켰다.

실시예 12

척수 가로 절단 분석

sNogoR-1 융합 단백질을, 생체내에서의 기능 회복을 촉진하는 능력을 시험하기 위하여 쥐 척수 가로 절단 분석으로 시험하였다.

알젯 (Alzet)(등록 상표) 삼투 펌프에 사용일에 새로 만들어진 시험 용액 (PBS 중 sNogoR310-Fc)을 로딩하였다. 로딩 농도는 5 및 50 μM인 것으로 계산되었다. 동물 내로의 이식 이전에 37℃에서 >40 시간 동안 펌프를 프라이밍하였다. 암컷 롱 에반스 (Long Evans) 쥐에 예비 작동성 진통제 및 신경 안정제를 주고 이소플루란 (O₂ 중 3%)을 사용하여 마취시켰다.

쥐를 정위 프레임에 놓고 신경로 (tract) 추적제 BDA (10,000 MW)의 양측 주입을 위하여 운동 피질을 노출시켰다. 이어서 쥐는 T5-T6에서 척수의 배면 반절단, 이어서 경막내 카테터 및 펌프 시스템의 이식을 하여 시험 화합물 (군 당 n = 11)을 전달하였다.

쥐를 회복시켰는데 쥐는 수술 후 28일까지 생존하였다. BBB 시스템을 사용하여 행동 점수를 손상 유발 후 28일까지 기록한 직후 연구의 생전 (in-life) 시기를 종결시켰다. 관류 및 고정에 이어 척수를 꺼내고, 동결방지시키고 절개하고 염색시키고 축삭 카운트를 수행하였다.

BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) 운동 등급화 규모 (문헌[Basso et al., 1996, Neurotrauma 13, 343-359]), 빗면 시험 및 경사 그리드 (grid) 보행 시험 (문헌[Li and Strittmatter, 2003, J Neurosci. 2003, 23, 4219-27])을 손상 후의 쥐 및 생쥐에서 모니터링하였다. 빗면 시험에 있어서 본 발명자들은 50 cm x 60 cm의 보드를 생쥐가 미끄러짐이 없이 5초 동안 기울일 수 있는 최대 각을 측정하였다. 경사 그리드 보행에 있어서 쥐를 45도의 슬로프에서 철사 그리드 (길이 35 cm x 2.54 cm의 눈 (square))를 기어 오르도록 훈련시켰다. 뒷발이 그리드 평면 아래로 낙하하는 경우의 수를 최하위에서 최상위까지의 각각의 이탈 (excursion)에 대하여 점수화하였다. 쥐 행동 시험에 있어서 BBB 운동 규모, 그리드 보행 및 족적 분석을 수행하였다. 그리드 보행에 있어서, 쥐는 철사 그리드 (길이 70 cm x 2.54 cm의 눈) 상에서 보행하도록 훈련시켰으며 뒷발이 그리드 평면 아래로 낙하하는 경우의 수를 카운트하였다. 족적 분석에 있어서 90 cm의 주로를 가로지르는 연속적인 운동 동안 쥐 뒷발의 보행 패턴을 잉크로 기록하고 각각의 면에서의 활보 길이 및 활보 폭을 계산하였다 (문헌[Metz et al., 2000, BrainRes., 883, 165-177]). 상기 행동 시험 모두를 2 이상의 개체에서 수행하였다. 수술, 행동 시험 및 조직학적 분석 전반에 걸쳐 연구자들은 미니펌프의 화합물의 신원 (identity)에 대해서 알지 목하였다.

sNogoR310-Fc는 기능 회복을 촉진하였다 (도 12).

실시예 13

쥐 척수 좌상 분석

생체 내에서 용해성 Nogo 수용체-1 폴리펩티드 및 융합 단백질의 뉴런에 대한 영향을 쥐 척수 좌상 분석으로 시험하였다.

두건을 씌운 암컷 롱 에반스 쥐 (170-190 g)를 진통제 및 항생제로 예방 치료하였다. 수술 10분 전에 동물을 2.5 mg/kg 미다졸람 i.p.로 진정시키고 O₂ 중 2-3% 이소플루란으로 마취시켰다. 이어서 쥐의 털을 깎고 알콜 및 베타딘으로 닦아내고 안구 윤활제를 동물의 눈에 도포하였다. 다음, 절개를 중심선 아래에서 행하고 T7 내지 T12 척추골을 노출시켰다.

배면 척추 후궁 절제를 T9 1/2 및 T10에서 수행하여 척수를 노출시켰다. 쥐를 충격 장치 (Impactor) 상에 놓는다. T7 및 T8 절편을 먼저 클램핑하고 이어서 T11 및 T12 절편을 꼬리 클램프에 부착시킨다. 연성 물질을 쥐의 가슴 아래에 둔다. 충격 장치 로드를 0 위치로 설정하고 전기 접지 클립을 상처 가장자리에 부착시킨다. 이어서 충격 장치 로드를 25.0 mm로 상승시키고 노출된 척수 바로 위의 위치로 적당하게 조정한다. 다음, 충격 장치 로드를 놓아 주어 노출 척수를 치도록 하고 충격 장치 로드를 즉시 들어올린다.

이어서 쥐를 내려 놓고 겔폼 (Gelfoam)(등록 상표)을 상처 위에 둔다. 상처 위의 근육을 봉합하고 절개를 수술로 고정한다. 동물을 마취에서 회복될 때까지 인큐베이터에 둔다. 쥐에게 항생제, 진통제, 및 필요할 경우 염수를 준다. 그 후 기능이 회복될 때까지 방광을 매일 아침 저녁으로 꺼낸다.

용해성 Nogo 수용체-1 융합 단백질 (예를 들어 sNogoR310-Fc)을 상기 쥐 척수 가로 절단 모델에서 기술한 바와 같이 경막내로 투여한다. BBB 점수화는 수술 하루 후, 이어서 그 후 4 내지 6주가 될때까지 매주 수행한다.

실시예 14

트랜스제닉 생쥐에서의 sNogoR310의 발현

본 발명자들은 용해성 Nogo 수용체-1 단백질을 발현하는 트랜스제닉 생쥐를 생성하여 생체내에서의 발현시의 그의 영향을 시험하였다.

본 발명자들은 생쥐 sNogoR310 cDNA (Nogo 수용체-1의 아미노산 1-310에 해당)를 C-3123 벡터의 NotI 부위 내로 클로닝하였다. 상기 벡터에 있어서 sNogoR310 발현은 아교 섬유 산성 단백질 (glial fibrillary acidic protein, gfap) 유전자 조절 요소의 제어 하에 있는데, 상기 요소는 손상 부위에서 발현 레벨을 높아지게 하며 반응성 성상 세포로부터의 분비를 증강시킨다. 본 발명자들은 생성된 벡터를 AatII 및 SfiI으로 순차적으로 절단하고 3.4 kb 단편 상에서 gfap :: sNogoR310 제작물을 단리하였다. 본 발명자들은 상기 단편을 배아 내로 미세 주사하여 트랜스제닉 생쥐를 생성하였다. 본 발명자들은 트랜스진이 통합되었다는 것을 PCR로 확인하고 5종의 시조 (founder) 주를 동정하였다. 본 발명자들은 발현 레벨이 가장 높은 2종의 시조 주의 이종성 수컷을 암컷 C57BL/6J 생쥐와 교배시켰다. 본 발명자들은 GFAP-양성 세포가 이종성 트랜스제닉 생쥐에서 sNogoR310을 발현 및 분비한다는 것을 Nogo 수용체1에 대하여 생성한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

본 발명자들은 프로테아제 억제제 (로슈 (Roche))가 보충된 트리스 완충 염수에 피질 및 척수를 균질화하고 이 균질물을 4℃에서 20분 동안 40,000 rpm에서 원심분리하였다. 본 발명자들은 상청액을 항체 특이성의 증강을 위하여 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 처리하고 투석시킨 후 면역블로팅하였다. 본 발명자들은 미립자형 분획을 RIPA 완충제 (PBS 중 0.1% SDS, 1% 트리톤(등록 상표) X-100, 0. 5% 나트륨 데옥시콜레이트)에서 초음파 처리로 균질화하고 생성된 균질물을 원심분리하고 상기 상청액 (세제-용해성 미립자형 분획)을 상기한 바와 같이 처리하였다. 본 발명자들은 1:2000으로 희석시킨 Nogo 수용체-1에 대하여 생성시킨 토끼 항혈청을 사용하여 면역블롯으로 20 ㎍의 뇌 또는 척수 단백질을 분석하였다. 본 발명자들은 AP-콘쥬게이션된 항-토끼 IgG 및 NBT/BCIP AP 기질과 함께 인큐베이션함으로써 면역 반응성을 가시화하였다.

본 발명자들은 2종의 트랜스제닉 주 Tg08 및 TgO1로부터 피질 및 척수의 세제가 없는 용해성 추출물에서 분비된 37 kDa의 sNogoR310을 검출하였지만 임의의 37 또는 81 kDa의 용해성 Nogo 수용체-1 단백질이 한배의 새끼 (littermate) 야생형 (WT) 생쥐에 존재할 경우 이들은 거의 검출되지 않았다. 미립자형 분획의 조사에 의하면 WT 및 트랜스제닉 생쥐 둘 모두에서 비견할만한 레벨의 내인성 Nogo 수용체-1이 존재한다는 것이 입증되었다.

실시예 15

손상 후의 트랜스제닉 생쥐에서의 sNogoR310의 발현

본 발명자들은 배면 과반 손상의 수행에 의해 트랜스제닉 생쥐에서 sNogoR310 발현에 대한 CNS 손상의 영향을 시험하였다. 본 발명자들은 실시예 14에 기술한 바와 같이 이종성 수컷을 C57/BL6 암컷과 교배시킴으로써 sNogoR310 트랜스제닉 및 비트랜스제닉 대조 동물을 수득하였다.

본 발명자들은 성숙한 이종성 암컷 트랜스제닉 생쥐 또는 한배의 새끼 WT 생쥐 (10-16주령)을 깊이 마취시키고 완전한 척추 후궁 절제를 수행하여 T6 및 T7 레벨의 척수의 배면 부분을 완전히 노출시켰다. 본 발명자들은 30-게이지 니들 및 한쌍의 미소가위로 T6에서 배면 과반 절단을 수행하여 배면 및 배면 측면 피질 척수로 (corticospinal tracts, CST)를 완전히 절단하였다. 본 발명자들은 척수의 배면 부분을 가로질러 표시한 니들을 수회 통과시켜 병변의 깊이가 1.0 mm가 되는 것을 보장하였다. 본 발명자들은 척추 후궁 절제물 위의 근육 층을 봉합하고 수술용 스테이플로 등 쪽의 피부를 폐쇄하였다. 피질척수로를 추적하기 위하여 본 발명자들은 척수 손상 14일 후에 두개골 내로 우측의 뇌 피질 위에 있는 버형 (burr) 구멍을 만들었다. 본 발명자들은 피질 표면으로부터 0.7 mm 깊이의 4개의 주사 부위에 추적제 BDA (MW 10,000, PBS 중 10%) (몰레큘러 프로브즈, 미국 오레곤주 유진 소재)를 적용하였다. 손상 4주 후 생쥐에 PBS, 이어서 4% 파라포름알데히드를 심장을 가로질러 (transcardially) 관류하였다. sNogoR310 발현 실험에 사용한 생쥐는 임의의 추적제를 주사하지 않은 것이었다.

웨스턴 블롯 분석에 사용하는 생쥐에 있어서, T3 내지 L3 사이의 레벨의 척수를 손상 14일 후에 관류 없이 수집하였다. Nogo 수용체-1 면역 조직 화학적 염색에 사용하는 생쥐는 반절단 10일 후 4% 파라포름알데히드로 관류하고 손상 척수를 절개를 위하여 옮겼다. 트랜스제닉 및 WT 생쥐의 손상 뇌에서의 sNogoR310의 발현을 조사하기 위하여 피질 자상 손상을 정위 장치 (데이피브 코프 (David Kopf), 미국 캘리포니아주 투준가 소재)에 유지한 11번의 외과용 매스 블레이드로 수행하였다. 대천문 뒤쪽으로 0.5 mm, 중심선으로부터 측면으로 1.5 mm, 그리고 깊이 3.5 mm의 4 mm의 방시상 (parasagittal) 절단을 행하였다.

본 발명자들은 트랜스제닉 생쥐에서 손상 10일 후 척수의 용해성 추출물에서 sNogoR310의 레벨이 증가하지만 WT 생쥐에서는 그렇지 않음을 탐지하였는데, 이는 병변 주위의 GFAP의 손상 후 상향 조절과 일치하였다. 이것이 Nogo-A의 보상성 상향 조절로 인한 것이 아님을 확인하기 위하여 본 발명자들은 그의 발현을 시험하였으며 이것이 WT 또는 트랜스제닉 생쥐로부터의 완전하거나 손상된 피질 및 척수에서 유사하다는 것을 알아내었다.

본 발명자들은 Nogo 수용체-1 및 GFAP에 대한 항체를 이용한 병변 지역을 포함하는 손상된 뇌 및 척수의 면역 염색에 의해 손상 CNS에서의 sNogoR310의 세포 발현을 조사하였다. 반응성 성상 세포형 신경교의 일반적인 형태는 WT와 트랜스제닉 생쥐 사이에서 다르지 않지만, 세포내 및 세포외 공간 둘 모두에 있어서 Nogo 수용체-1에 대하여 염색되는 밀도는 WT 생쥐에서보다 gfap::sNogoR310 트랜스제닉 생쥐에서 현저하게 더 높은데 이는 트랜스제닉 생쥐에서 병변 주위에서 sNogoR310 발현이 증가함을 나타낸다. Nogo 수용체-1 단백질은 단지 트랜스제닉 생쥐에서 성상세포 마커인 GFAP와 함께 국소화된다. 또한 트랜스제닉 샘플에 있어서 확산성 비세포 염색이 크게 증강되었는데, 이는 세포외 공간에서의 sNogoR310과 일치하였다. 뉴런 세포체 Nogo 수용체-1 염색은 WT 및 트랜스제닉 생쥐 둘 모두에서 탐지되었다.

실시예 16

분비 sNogoR310은 트랜스제닉 생쥐에서 CST 발아를 유도한다

본 발명자들은 트랜스제닉 생쥐에 있어서 병변 주위의 sNogoR310의 발현 증가가 손상된 축삭을 재생시키는지를 시험하였다.

본 발명자들은 문헌[Li and Strittmatter, 2003, J. Neurosci., 23, 4219-27]에 기술된 바와 같이 전행성 추적제인 바이오틴 덱스트란 아민 (BDA)을 우측 운동 피질 내로 주사함으로써 하강하는 피질척수로의 온전성을 조사하였다. 한배의 새끼의 WT 생쥐에 있어서 돌출 배면 CST (dCST)를 병변에 대하여 입쪽으로 단단하게 묶고 약간의 배면 측면 CST 섬유를 동측으로 보이게 한다. 소수의 BDA-표지된 짧은 병립성 발아물이 회색질 내로, 특히 복부쪽 척수 내에서 돌출되지만 이 발아물은 추적제 주사에 대하여 반대쪽의 척수 면에 대부분 국한된다. 그러나 손상 sNogoR310 트랜스제닉 생쥐로부터의 배면 반절단에 대하여 입쪽의 절편은 상당히 다른 BDA 표지 패턴을 나타낸다. 고밀도의 BDA-표지된 CST 섬유가 Tg08 주 또는 TgO1 주 유래의 모든 트랜스제닉 생쥐에서의 돌출 dCST의 외부에서 관찰된다. 이소성 섬유는 회색질 지역 전반에 걸쳐 연장하며 일부 섬유는 측면 및 배면 측면의 백색질 내에 도달한다. 여러 섬유 (가로 절단 절편 당 4-12개의 발아물)이 척수의 반대편에서 보여진다 (추적제 주사 부위에 대하여 동측성). 병립성 발아물의 마이크로 농도계에 의한 측정에 의하면 sNogoR310 트랜스제닉 생쥐에 있어서 발아물 밀도가 대략 10배 증가한다는 것이 나타났다. 병변에 대하여 입쪽으로 1 내지 4 mm의 방시상의 세로 절편을 조사해보면, 한배의 새끼의 WT 동물과는 대조적으로, sNogoR310 트랜스제닉 생쥐에 있어서 복부쪽 회색질 지역 내로 다수의 분지 발아물을 dCST 섬유가 연장시킨다는 것이 나타났다. 일반적으로 트랜스제닉 생쥐에 있어서 병변에 대하여 입쪽으로 발아하는 패턴 및 정도는 Nogo 수용체-1 길항제 펩티드 NEP1-40으로 전신적으로 처리한 생쥐에서 관찰되는 것과 유사하다 (문헌[Li and Strittmatter, 2003]).

이러한 결과는 트랜스제닉 생쥐에 있어서 분비 sNogoR310이 CST 발아를 유도한다는 것을 입증한다.

실시예 17

sNogoR310 트랜스제닉 생쥐에 있어서 재생 CST 축삭은 병변 부위를 말단부 척수 내로 우회시킨다

본 발명자들은 트랜스제닉 생쥐로부터 병변 부위에 대하여 입쪽으로 4 mm, 그리고 꼬리 쪽으로 4 mm (총 8 mm 길이)의 척수를 단리하고 이를 글루타르알데히드-중합 알부민 매트릭스에 묻고 방시상적으로 조직 절편기 (vibratome) 상에서 절단하였다 (30 ㎛의 두께). 본 발명자들은 손상 부위에 대하여 입쪽으로 5-7 mm, 그리고 꼬리 쪽으로 5-7 mm의 척수로부터 가로 절단 절편 (50 ㎛)을 수집하였다. 쥐에서의 sNogoR310-Fc 주사 실험에 있어서 병변 부위로부터 입쪽으로 10 mm에서 꼬리 쪽으로 10 mm 연장하는 척수를 진동 미세 절단기 상에서 방시상적으로 절단하였다 (50 ㎛). 가로 절단 절편을 손상 부위에 대하여 입쪽으로 11-16 mm, 그리고 꼬리 쪽으로 11-16 mm의 척수로부터 수집하였다. 본 발명자들은 이 절편을 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 복합체와 함께 인큐베이션하고 니켈-증강된 디아미노벤지딘 HRP 반응에 의해 BDA 추적제를 가시화하였다 (문헌[Grandpre, 2002, Nature, 417, 547-551]). 본 발명자들은 간접적인 면역 형광성에 의해 세로토닌 면역 조직 화학 (항-5-HT 항체)을 위하여 일부 절편을 프로세싱하였다. 병변 지역을 가시화하기 위하여 본 발명자들은 GFAP (시그마(등록 상표), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에 대하여 생성된 항체로 일부 절편을 이중 염색하였다. 본 발명자들은 이 절편을 위에 놓는 매체로 위에 놓고 탈수시키고 덮었다.

본 발명자들은 손상 후 트랜스제닉 생쥐에서 발현되는 sNogoR310에 의해 유도되는 섬유 (실시예 16 참조)가 병변 지역에서 꼬리 척수 내로 가로질러 기능 회복을 제공하는지를 시험하였다.

카메라 루시다 (camera lucida)로 그려진 손상 부위를 가로지르는 연속성 방시상 절편은 이 병변으로부터 수밀리미터에서 재생 CST 섬유의 전체 분포 패턴을 보여 준다. WT 생쥐로부터의 절편은 손상 부위 너머로 연장하는 CST 섬유를 전혀 보여주지 못한다. sNogoR310 트랜스제닉 생쥐로부터의 유사한 절편은 가로 절단 지역을 가로질러 말단 회색 및 백색질 지역으로 고도로 분지된 패턴으로 돌출하는 다수의 CST 섬유를 보여 준다. 반절단에 대하여 바로 입쪽으로, 돌출 dCST로부터 시작되는 고밀도의 BDA-표지된 CST 발아물이 병변 지역 내로 돌출되지만 대부분의 CST 발아물은 반흔 형성 및 조직 공동 현상이 두드러진 가로 절단 지역을 통과하지 못하였다. 작지만 고도로 유의한 분율의 재생 축삭은 복부 및 복부 측면의 회색 및 백색질의 나머지 조직 가교를 통하여 병변 부위를 우회한다. 또한 약간의 CST 섬유는 상해를 입은 배면 및 배면 측면 척수를 통하여 말단 영역 내로 가로 절단 지역 그 자체를 가로지르는 것으로 나타났다. 병변 근처에 있어서 재생 섬유의 코스는 일반적으로 구불구불하며 입쪽 CST의 정상적인 곧은 섬유와는 매우 다르다. 병립성의 수목상 섬유는 말단 척수의 회색질 지역에서 가장 빈번하게 보여진다. 재구성에 의하면 각각의 트랜스제닉 생쥐에 있어서 병변에 대하여 꼬리 쪽으로 1-4 mm에서 임의의 레벨의 입쪽-꼬리쪽 축삭에서의 5-15개의 BDA-표지된 재생 섬유가 코스를 나아간다는 것이 입증되었다. 배면 반절단에 대하여 꼬리 쪽으로 5-7 mm의 가로 절단 절편에 있어서 BDA-표지된 CST 축삭은 각각의 트랜스제닉 생쥐에 있어서 회색질 및 백색질 지역 둘 모두에서 보여진다. 트랜스제닉 생쥐에 있어서의 섬유 카운트에 의하면 시상 절편에 있어서의 근접한 레벨과 대략 유사한 갯수의 BDA-표지된 CST 섬유가 나타났다.

CST 섬유 외에도 다른 하행로, 예를 들어 솔기 척수 섬유도 생쥐에 있어서 운동 기능에 기여한다. 이러한 생쥐 배면 과반 절단 모델에 있어서, 가로 절단은 세로토닌 섬유의 대부분을 손상시켜 복각에 있어서 상기 섬유의 밀도를 대략 80% 감소시킨다. 꼬리 척수의 복각에서의 세로토닌 섬유의 총 길이를 분석해 보면 WT 생쥐보다 트랜스제닉 생쥐에서 훨씬 많은 갯수의 상기 섬유가 나타났는데 이는 트랜스제닉 생쥐에 있어서 sNogoR310의 성장 촉진 효과가 하나의 축삭 하행 경로에 제한되지 않음을 나타낸다.

실시예 18

sNogoR310의 트랜스제닉 발현은 운동력 회복을 향상시킨다

CST 축삭 추적 및 세로토닌 섬유 분석에 의하면 트랜스제닉 생쥐에 있어서 성상 세포로부터 방출되는 sNogoR310이 척수에 있어서의 상해를 입은 하행 축삭의 광범한 해부학적 재생을 촉진하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 실시예 12에 기술한 바와 같이 여러 행동 시험을 수행하여 상기의 재생 섬유가 기능 회복에 도움이 되는지를 결정하였다.

BBB 시험으로 평가되는 바와 같이 WT 생쥐는 4주간의 생존 동안 운동 기능을 부분적으로 회복한다. 손상 4주 후 대부분의 WT 생쥐는 일관된 발바닥 내딛음 (stepping)과 더불어 일관된 웨이트 지지를 특징으로 하는 레벨을 회복하지만, 상기 생쥐는 단지 가끔 내지는 빈번한 앞다리-뒷다리 공동 작업 (coordination)을 나타내었으며 표면과 처음 접촉시 주된 발의 위치가 순환되었다. 이와는 대조적으로 TgO8 및 Tg 01 주 둘 모두로부터 유래된 sNogoR310 트랜스제닉 생쥐의 BBB 점수는 7-28일간의 관찰 기간 내내 대조 군보다 유의하게 더 높았다 (도 13a 및 13b). 손상 후 28일에 대부분의 트랜스제닉 생쥐는 앞다리-뒷다리 공동 작업을 나타내었으며 주된 발 위치는 신체와 평행하였다.

본 발명자들은 2가지의 추가의 행동 시험을 이용하여 sNogoR310 트랜스제닉 생쥐의 수행성을 더 특성화하였다. 먼저 본 발명자들은 5초 이내에 생쥐가 악력을 손실함이 없이 보드가 기울어지게 하는 최대 각을 측정하였다. 배면 반절단 손상 전에는 트랜스제닉 및 WT 생쥐 둘 모두 55도 각도의 보드 상에서 자세를 지속할 수 있다. 손상 후 7-28일째에는 지속 가능한 각이 모든 생쥐에서 감소하였지만 트랜스제닉 생쥐가 견딜수 있는 각은 대조 군의 각보다 유의하게 더 컸다 (도 13c). 다른 행동 시험에 있어서, 생쥐를 수직에 대하여 45도 각도로 두어진 그리드에 기어 오르게 하고 이 그리드의 평면 아래에서 뒷다리의 탈선 (excursion)을 카운트하였다 (문헌[Metz et al., 2000]). 손상 전 훈련 동안에는 상기 시험에서 생쥐가 전혀 오류를 범하지 않았다. 손상 후 2-6주의 기간 동안 WT 생쥐에 있어서 다수의 발 과실 오류가 단지 최소로 개선되었다. 이와는 대조적으로 sNogoR310 트랜스제닉 생쥐는 상기 기간 동안 그리드 기어오름에 있어서 점진적인 향상을 나타내었으며 대부분의 향상은 손상 후 1-3주 사이에 나타났다 (도 13d). 이와 같이 성상 세포로부터 sNogoR310을 분비하는 트랜스제닉 생쥐는 흉부 척수 반절단 후 운동 기능 개선, 솔기 척수 발아 및 CST 재생을 나타내었다.

실시예 19

sNogoR310-Fc 단백질의 경막내 투여는 CST 발아를 유도한다

척수 외상 후 용해성 Nogo 수용체-1의 성장 촉진 효과의 두번째 시험으로서 본 발명자들은 정제 단백질을 경막내로 투여하였다.

본 발명자들은 쥐 Nogo 수용체-1의 리간드 결합 도메인 (27-310)을 쥐 IgG1 Fc 도메인에 결합시켜 안정성 및 정제를 촉진하였다. 본 발명자들은 안정하게 트랜스펙션된 CHO 세포로부터 단백질을 정제하였다. 상기 단백질은, 이전에 생쥐 sNogoR310-Myc His에 대하여 나타내어진 바와 같이 (문헌[Fournier et al., 2002, J Neurosci., 22, 8876-8883]; 문헌[Liu et al., 2002, Science, 297,1190-1193]) 시험관 내에서 Nogo-66, MAG 및 마이엘린을 차단한다. 본 발명자들은 sNogoR310-Fc 단백질을 삼투 미니펌프를 통하여 흉부 중간의 배면 반절단 손상을 가지는 쥐에 경막내로 전달하였다. 손상 후 4주의 생존 기간 동안 1.2 mg의 sNogoR310-Fc 단백질을 각각의 쥐에 있어서 국소적으로 투여하였다. 비히클 처리 (1.2 mg의 쥐 IgG)를 받은 쥐에 있어서 반절단에 대하여 입쪽의 절편은 두드러진 배면 CST 및 병변 부위 위에서 단단하게 묶인 매우 적은 이소성 BDA-표지된 CST 섬유를 보여준다. sNogoR310-Fc 단백질을 수여받은 상해를 입은 쥐로부터의 병변에 대하여 입쪽의 절편은 표지 패턴이 상당히 다르다. BDA-표지된 CST로부터 발아되는 다수의 이소성 섬유가 횡절편 및 방시상 절편으로부터 관찰된다. 일부 경우에 있어서 돌출부는 중심선 근처의 dCST 지역에서 척수의 주변까지 가로질러, 배면 측면 CST와 섞이게 된다. 발아되는 축삭은 백색질보다 더 큰 정도로 회색질을 통하여 연장된다. dCST에 인접한 이소성 발아 섬유의 측정에 의하면 (횡절편에서 ≥100 ㎛, 시상 절편에서 ≥200 ㎛) sNogoR310-Fc-처리 쥐에서 더 많이 증가함이 나타났다.

실시예 20

sNogoR310-Fc 처리 쥐에 있어서 CST 축삭은 말단 척수 내로 재생된다

본 발명자들은 암컷 스프라그-돌리 쥐 (190-250 g)를 깊이 마취시키고 척수 레벨의 T6-7에서 척추 후궁 절제를 수행하여 척수를 노출시켰다. 본 발명자들은 30게이지 니들 및 마이크로가위로 척수의 배면 절반을 절단하여 CSGT로의 배면 일부를 절단하고, 11번 블레이드의 날카로운 부분을 척수의 배면 절반을 가로질러 통과시킴으로써 병변의 깊이 (1.8 mm)를 보장하였다 (문헌[Grandpre et al., 2002, Nature, 417, 547-551]). PBS 중 1.2 mg의 쥐 IgG 또는 PBS 중 1.2 mg의 sNogoR310-Fc 융합 단백질을 충전시킨 삼투 미니펌프 (알젯(등록 상표) 2ML4, 2 ml 부피, 2.5 ㎕/h, 28일 전달)를 동물의 등의 피부 하의 근육에 봉합하였다. 미니펌프의 유출구에 연결된 카테터를 경질막의 작은 구멍을 통하여 T7-8 레벨의 척수의 경막내 공간 내로 삽입하였다.

Nogo 수용체-1 길항제 단백질 주입에 의해 쥐 반절단에 대하여 입쪽에서 광범한 발아 (sprouting)이 유도되었지만, 더욱 결정적인 쟁점은 발아되는 CST 섬유가 말단 척수로 돌출되어 운동력 회복에 기여하는지이다. 비히클로 처리한 쥐로부터의 병변 부위를 가로지르는 세로 절편은 병변 레벨 아래의 BDA-표지된 복부 CST 섬유를 매우 소수로 표시하거나 이들이 전혀 검출되지 않는다 (문헌[GrandPre et al., 2002]; 문헌[Weidner et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3513-3518]). sNogoR310-Fc 처리 쥐로부터의 유사한 절편에 의하면 다수의 BDA-표지된 섬유가 가로절단 부위를 우회하며 대부분 복부 및 복부 측면 척수의 가교 조직을 통하여 꼬리 척수로 돌출된다는 것이 입증되었다. 성상세포 마커인 GFAP의 면역 염색에 의하면 가로절단의 정도가 중앙의 도관 지역보다 더욱 깊이 도달한다는 것이 나타났다. 돌출 배면 CST의 입쪽 섬유의 선형 프로필과는 달리, 재생 CST 섬유는 일반적으로 말단 척수, 특히 회색질 지역에서 고도로 분지되는 직교 절선을 따른다. 이러한 섬유는 척수의 다수의 영역에서 탐지되지만, 척수의 전반에 걸쳐 척수의 중앙 부분과 배면 절반부에서 더욱 용이하게 보여진다. 시상 절편으로부터의 CST 섬유의 카운트에 의하면 각각의 sNogoR310-Fc-처리 쥐로부터의 병변에 대하여 꼬리쪽으로 1-2 mm에서 대략 20개의 BDA-표지 축삭, 그리고 이 병변에 대하여 7-8 mm 말단부에서 15개의 추적된 축삭이 나타났다.

일반적으로 상기 섬유의 분지 패턴은 국소적인 NEP 1-40 펩티드 처리 동물로부터 관찰되는 것과 유사하지만, 각각의 발아에 있어서 더욱 병립성인 분지가 sNogoR310-Fc 단백질로 처리한 절편으로부터 보여진다. 말단 척수로부터의 발아의 측정에 의하면 sNogoR310-Fc-처리 쥐에서의 각각의 발아의 총 병립 길이는 NEP 1-40-처리 동물로부터의 것보다 2배 크다는 것이 입증되었다. Nogo 수용체-1 길항제 처리 군에서 척수에 대하여 꼬리쪽으로 1-10 mm에서의 발아 (길이가 ≥200 ㎛임)의 갯수는 대조 군보다 대략 20-40배 더 크다. 국소적 NEP 1-40 처리보다 sNogoR310-Fc 처리 쥐에서 더욱 많은 발아가 보여지지만 (~50 대 25개의 발아/쥐), 이러한 차이는 통계학적으로 유의하지 않다 (p=0.1713, t-검정).

재생 CST 축삭이 sNogoR310-Fc 처리를 한 쥐에서 반절단에 대하여 꼬리쪽으로 11-15 mm에서의 척수의 가로 절편에서 관찰된다. 이러한 섬유는 척수의 회색질 및 백색질 둘 모두에서 탐지된다. 회색질에서 탐지되는 섬유는 종종 백색질 지역에서보다 병립성 분지를 더욱 많이 나타낸다. 이와는 대조적으로 비히클 처리 군으로부터의 가로 절편에 있어서는 복부쪽 백색질 지역에서 단지 가끔의 BDA 표지가 보여지는데, 이는 상해를 입지 않은 복부 CST 축삭과 일치한다. 이러한 레벨의 말단 척수에서 Nogo 수용체-1 길항제 처리군 [sNogoR310-Fc 및 NEP 1-40] 둘 모두로부터의 BDA-표지 CST 섬유의 평균 갯수는 비히클 처리 쥐보다 대략 20배 더 많다. 이를 종합해 보면, Nogo 수용체 길항제인 sNogoR310-Fc 단백질 및 NEP 1-40 펩티드 둘 모두는 말단 척수에서의 CST 축삭을 극적으로 재생시키지만 전자에 의해 유도되는 발아는 더욱 고도로 분지된 패턴을 나타낸다.

실시예 21

상해를 입은 쥐에 있어서 국소적 sNogoR310-Fc는 루브로피날 (Rubropinal) 및 세로토닌 축삭의 발아를 유도한다

반절단 14일 후, 버 (burr) 구멍을 하지의 감각운동 피질 위의 두개골의 각각의 측면에 만들어 CST 섬유를 추적하였다. 각각의 측면 상의 경질막으로부터 1.5 mm 깊이의 7개의 주사 부위에 전행성 뉴런 추적제 BDA (PBS 중 10%, 피질 당 3.5 ㎕)를 적용하였다 (문헌[Grandpre, 2002]). 쥐에서 추적되는 적색척수로에 있어서, 추적제 BDA (1 ㎕; MW 10,000 ; PBS 중 10%)를 좌측 (정수리 뒤쪽으로 5.8 mm, 두개골 표면에 대하여 측면으로 0.7, 복부 쪽으로 7.0 mm)의 적색 핵에 주사하였다. BDA 주사 2주일 후, 상기 동물에 PBS, 이어서 4% 파라포름알데히드를 관류하고 조직을 조직학적 특성화를 위하여 수집하였다.

상해를 입은 적색척수로 (RST) 섬유의 복구는 척수 손상 후의 기능 개선에 기여한다 (문헌[Liu et al., 1999, J. Neurosci., 19, 4370-4387]). CNS 뉴런에서의 Nogo 수용체-1의 광범한 분포 (문헌[Wang et al., 2002, J. Neurosci., 22, 5505-5515])에 의해 Nogo 수용체-1을 그의 길항제로 억제하면 손상 후 RST 축삭이 재성장될 수 있음을 가능하게 한다. 상해를 입은 RST에 대한 sNogoR310-Fc의 영향을 시험하기 위하여, 상기 경로의 온전성을 좌측 적색 핵 내로의 BDA의 주사로 추적하였다. 척수 레벨에서, RST 섬유는 보통은 척수의 배면 측면 백색질 지역에 위치하며 본 연구의 배면 반절단에 의해 가로 절단된다. 대조 쥐로부터의 병변에 대하여 입쪽으로 11-15 mm의 가로 절편에 있어서 소수의 짧은 BDA-표지 섬유가 돌출 RST와 후각 (dorsal horn) 회색질 사이에서 보여진다. sNogoR310-Fc로 처리한 동일 레벨의 절편은 주 RST와 후각 회색질 사이에서 다수의 결합 섬유를 나타낸다. SCI에 대하여 말단으로 11-15 mm에서의 가로 절편에 있어서 비히클 처리 쥐에서는 BDA-표지 RST 섬유가 전혀 나타나지 않았다. 이와는 대조적으로 sNogoR310-Fc 처리를 한 동일 레벨의 절편은 추적제 주사에 대하여 반대편의 회색질 및 백색질 둘 모두에서 다수의 BDA-표지 RST 섬유를 표시한다. 분지 패턴을 가지는 일부 발아가 BDA 주사에 대하여 동측의 회색질에서 보여진다.

루피스피날 (ruphespinal) 척수 섬유도 sNogoR310-Fc로 처리한 척수 손상 쥐에서 관찰되었다. 면역 염색에 의하면 비히클 및 sNogoR310-Fc 처리 군 사이에서 유사한 병변에 대하여 입쪽으로 11-15 mm의 세로토닌 섬유의 밀도가 유사하다는 것이 입증되었다. 병변 아래로 11-15 mm의 절편에 있어서 sNogoR310-Fc 처리 쥐의 세로톤 섬유는 대조 군에서의 섬유보다 2배만큼 많았다. 이러한 결과는 sNogoR310-Fc 단백질에 의한 Nogo 수용체-1 억제에 대한 응답성이 CST 섬유에 제한되지 않으며 다른 하행로, 예를 들어 적색척수 및 세로토닌 축삭도 Nogo 수용체-1 길항에 응답성임을 입증한다.

실시예 22

쥐에 있어서 sNogoR310-Fc를 이용한 국소 처리는 기능 회복을 향상시킨다

sNogoR310-Fc 단백질의 경막내 투여는 외상성 척수 손상 후 여러 하행 경로에서 축삭 재생을 촉진한다. 본 발명자들은 이 단백질이 상해를 입은 척수에서 기능 회복도 향상시키는지를 시험하였다.

반절단 2주 후에 비히클 처리 쥐에 있어서의 운동 BBB 점수는 안정한 레벨의 12에 도달하였다 (도 14a). 손상 4주 후에 대조 중 대부분 (7마리 중 6마리)은 일관되게 빈번한 빈번한 웨이트-지지된 발바닥 스텝 및 일관되게 빈번한 앞다리-뒷다리 공동 작업을 가지지만, 이들은 표면과 처음 접촉시 주된 발 위치가 순환된다. 이와는 대조적으로, sNogoR310-Fc 단백질 처리를 한 쥐에 있어서는 운동 점수가 외상 후 2-4주 사이에 계속하여 개선되었다. 손상 4주 후에는 sNogoR310-Fc 처리 동물 9마리 모두가 일관된 앞다리-뒷다리 공동 작업 및 시험 표면과 처음 접촉에서 평행한 발 위치를 가진다.

그리드 보행법을 사용하여 척수 손상 후 하행하는 미세 운동 신경 제어에 있어서의 결함을 평가하였다 (문헌[Metz et al., 2000]). 이러한 수행은 앞다리-뒷다리 공동 작업 및 복부측의 피질 척수 및 적색척수 섬유에 의해 매개되는 자율 운동 제어를 필요로 한다. 손상 전 훈련 동안 모든 쥐는 정확하게 그의 뒷다리를 그리드 바 상에 둔다. 손상 2-4주 후에는 대조 쥐는 이 기간 당 8-9회의 오류를 범하는데 시간이 지남에 따라 단지 최소로 개선되었다. 이와는 대조로 sNogoR310-Fc로 처리한 쥐는 그리드 보행에서 점진적으로 개선되었으며 유의하게 더 적은 오류를 범하였다 (평균 4-7회/기간). 개선의 대부분은 손상 2-3주 후에 일어난다. 대조 군에서의 뒷발 족적의 분석에 의하면, sNogoR310-Fc 처리를 한 상해를 입지 않은 쥐 또는 상해를 입은 동물과 비교하여, 활보 길이는 유의하게 감소되며 서있는 자세의 폭은 반절단 후 4주에 증가함이 나타났다 (도 14c). 따라서 상기의 다수의 행동 시험에 의하면 Nogo 수용체-1 기능을 길항제 단백질의 국소 주사로 차단하면 손상 후 운동력 회복이 향상되는 것으로 입증되었다.

생물학적 수탁

하이브리도마 HB 7E11 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4587), HB1H2 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4584), HE 3G5 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4586), HB 5B10 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4588) 및 HB 2F7 (ATCC(등록 상표) 수탁 번호: PTA-4585)을 2002년 8월 9일에 미국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ("ATCC")에 기탁하였다.

당 업계의 숙련자라면 다수의 변화 및 변경이 본 발명의 취지로부터 벗어남이 없이 본 발명의 바람직한 실시 형태에 가해질 수 있음을 알 것이다. 이러한 모든 변형은 본 발명의 범주 이내에 포함시키고자 한다.

Claims (29)

1. AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (서열 번호 26); LDLSDNAQLR (서열 번호 27); LDLSDDAELR (서열 번호 29); LDLASDNAQLR (서열 번호 30); LDLASDDAELR (서열 번호 31); LDALSDNAQLR (서열 번호 32); LDALSDDAELR (서열 번호 33); LDLSSDNAQLR (서열 번호 34); LDLSSDEAELR (서열 번호 35); DNAQLRVVDPTT (서열 번호 36); DNAQLR (서열 번호 37); ADLSDNAQLRVVDPTT (서열 번호 41); LALSDNAQLRVVDPTT (서열 번호 42); LDLSDNAALRVVDPTT (서열 번호 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (서열 번호 44); 및 LDLSDNAQLAVVDPTT (서열 번호 45)로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
2. 제1항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
3. 제2항에 있어서, 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 핵산.
4. 제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
5. 제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 포함하거나 제4항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
6. (a) 제5항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

   (b) 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계

   를 포함하는 제1항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법.
7. (a) 숙주를 제1항에 따른 폴리펩티드 또는 제5항에 따른 숙주 세포로 면역화하는 단계; 및

   (b) 항체를 회수하는 단계

   를 포함하는 항체의 제조 방법.
8. 제7항에 따른 방법에 의해 생성된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편.
9. 제1항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 항체는 하이브리도마 세포주 HB 7E11 (ATCC 수탁 번호 PTA-4587)이 생산하는 모노클로날 항체가 아닌 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 항체는

    (a) 뉴런의 성장 원추 (growth cone) 쇠약 (collapse)을 억제하며;

    (b) 뉴런에서 신경 돌기의 생장 (outgrowth) 및 발아 (sprouting)의 억제를 감소시키며;

    (c) Nogo 수용체-1이 리간드에 결합하는 것을 억제하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
11. 제10항에 있어서, 신경 돌기 생장 및 발아가 축삭 성장인 항체 또는 항원 결합 단편.
12. 제10항에 있어서, 뉴런이 중추 신경계 뉴런인 항체 또는 항원 결합 단편.
13. 제8항 또는 제9항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항체 또는 항원 결합 단편.
14. 제8항 또는 제9항에 있어서, 항체가 쥐과 항체인 항체 또는 항원 결합 단편.
15. 제8항 또는 제9항에 있어서, 인간화 항체, 키메라 항체 및 단쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체.
16. Nogo 수용체-1을 제10항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, Nogo 수용체-1의 리간드에의 결합을 억제하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 리간드가 NogoA, NogoB, NogoC, MAG 및 OM-gp로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
18. 뉴런을 제10항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 성장 원추 쇠약을 억제하는 방법
19. 뉴런을 제10항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 신경 돌기의 생장 또는 발아의 억제를 감소시키는 방법.
20. 제19항에 있어서, 신경 돌기의 생장 또는 발아가 축삭 성장인 방법.
21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 뉴런이 중추 신경계 뉴런인 방법.
22. 제8항 또는 제9항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물.
23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제를 더 포함하는 것인 조성물.
24. 뉴런을 제8항 또는 제9항에 따른 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 사멸 위험 상태에 있는 뉴런의 생존을 촉진하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 뉴런은 시험관내에 있는 것인 방법.
26. 제24항에 있어서, 뉴런은 포유류에 존재하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 포유류가 다발성 경화증, ALS, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 당뇨성 신경병증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 또는 척수 손상의 징후 또는 증상을 나타내는 것인 방법.
28. 포유류에서 사멸 위험 상태에 있는 뉴런의 생존을 촉진하는 방법으로서,

    (a) 제8항 또는 제9항에 따른 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 배양된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및

    (b) 숙주 세포를 뉴런 부위 또는 상기 부위 근처에서 포유류 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
29. 포유류에 존재하는 사멸 위험 상태의 뉴런의 생존을 촉진하는 유전자 요법으로서, 제8항 또는 제9항에 따른 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 뉴런 부위 또는 상기 부위 근처에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항-Nogo 수용체-1 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 뉴클레오티드 서열로부터 뉴런의 생존을 촉진하기에 충분한 양으로 포유류에서 발현되는 것인 유전자 요법.

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