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KR20060036466A - 수용체 - Google Patents

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KR20060036466A
KR20060036466A KR1020067001486A KR20067001486A KR20060036466A KR 20060036466 A KR20060036466 A KR 20060036466A KR 1020067001486 A KR1020067001486 A KR 1020067001486A KR 20067001486 A KR20067001486 A KR 20067001486A KR 20060036466 A KR20060036466 A KR 20060036466A
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KR
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gpr12
polypeptide
mammal
cells
disease
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KR1020067001486A
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Inventor
마크 칼튼
존 딕슨
알렌 헨드릭
소피 메사저
디크 잔
제니퍼 마리 호우드
Original Assignee
패러다임 테라퓨틱스 리미티드
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Publication date
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Priority claimed from GB0404309A external-priority patent/GB0404309D0/en
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Abstract

본 발명은 알려진 수용체의 신규한 기능에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 신경 및 변연계의 조작 및 통증의 진단 및 치료시 스핑고실포스포릴콜린 수용체 및/또는 그의 리간드의 이용에 관한 것이다.
Figure 112006004789952-PCT00002
GPR12 폴리펩타이드, 불활성, 넉아웃, 포유류, 작용제, 길항제, 스핑고실포스포릴콜린

Description

수용체{Receptor}
본 발명은 알려진 수용체의 신규한 기능에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 변연계의 조작시 스핑고실포스포릴콜린 수용체 및/또는 그의 리간드의 이용에 관한 것이다.
GPR12를 인코드하는 애니(Annie)는 인간 염색체 13q12에 위치한다. GPR12 cDNA는 1005 bp 길이이다. 이는 Song et al (Genomics, 1995, 28, 347-349)에 의해 처음으로 개시되었다. 이는 먼저 스핑고신 1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate)에 대한 수용체로 간주되었다(Uhlenbrock, K. et al. Cellular Signalling 2002, 14:941-953). 최근에는 이는 탈고아화(deorphanise)되었고 스핑고실포스포릴콜린)(sphingosylphosphorylcholine, SPC)의 수용체로 나타났다(Ignatov,. et al. 2003, J. Neurosci. 23,(2):907-914).
일부 SPC의 세포적 효과는 S1P-EDG 수용체에 대한 낮은-친화력 결합 및 활성 화에 의해 설명될 수 있다. 그러나 SPC의 특정 세포 및 세포하 작용은 혈장, 복수 및 다양한 조직 내에서 확인되었고 지질 매개자인 S1P에 의해 공유되지 않는다. 스핑고리피드(sphingolipid) 붕괴 생성물은 현재 세포 시그날링에 이중적 역할을 하고 세포외뿐만 아니라 세포내 시그날링 분자로서 작용하는 것으로 인식되고 있다. G 단백질-결합 수용체는 스핑고신 1-포스페이트 및 스핑고실포스포릴콜린에 대해 높은 친화력을 지니고 스핑고리피드가 심장박동수, 산화파괴, 신경돌기 수축, 상처 치유(미토겐 효과) 또는 혈소판 활성화의 조절을 포함한 많은 기능을 지니는 것으로 나타났다.
스핑고신-1 포스페이트(S1P)는 예를 들어 혈소판 응집 동안 방출되는 효과적인 세포외 라이소인지질(lysophospholipid) 인산 매개자이다. S1P는 다양한 자극 즉, 생장인자, 사이토카인, GPCR 작용제, 항원 등에 의해 유도된다. S1P 수용체 시그날링 경로는 전사인자 활성화, 세포골격 단백질, 부착 분자 발현 등에 연결된다. 따라서 S1P는 유사분열생식, 분화, 증식, 이동 및 아폽토시스를 포함한 다양한 생물학적 반응에 영향을 미칠 수 있다.
Edg 1, 3 또는 5는 세포 증식, 혈관형성 및 세포 이동에 관련된다(Edg8은 40% 서열 상동성으로 Edg5와 가장 가깝다). Edg4는 난소암 세포에 대한 마커이다.
S1P는 유방암에 관련되었다. S1P는 에스트로겐-독립적 유방암 세포주, MDA-MB-231에서 화학-침입성(chemo-invasiveness)을 억제한다. 백혈구 이동은 S1P에 의해 영향을 받고, 따라서 S1P는 염증에 중요한 역할을 한다. 비만 세포 내 S1P의 수준은 그의 알레르기 반응을 결정한다. Edg 수용체 내의 변화는 S1P의 세포내/세포외 농도를 제어하는데 중요한 역할을 하고 많은 질환에 영향을 미친다.
Edg 수용체는 알츠하이머 및 파킨스 병과 같은 탈-조절된 아폽토시스와 관련된 신경계 장애에 중요한 역할을 한다. PKC의 억제를 통한 흉터의 국부적 치료는 또다른 잠재적 적용이고 이는 백혈병에도 마찬가지이다.
Edg1 널(null) 마우스를 이용하여 Liu, et al. (2000)은 Edg1을 통한 S1P 시그날링이 혈관 형성에 필수적임을 증명하였다. Edg1 널 마우스는 배아일 12.5∼14.5 사이의 자궁내태아사망을 이끄는 배알 출혈을 나타내었다. 혈관형성 및 혈관신생은 돌연변이 배아에서 정상으로 나타났다. 그러나 혈관 성숙은 혈관 평활근 세포/혈관주위세포의 결핍에 의해 불완전하였다. 위장관 및 기관세지 내의 근육층이 잘 발달되었기 때문에 본 결함은 평활근 내에서의 일반화된 결함은 아니었다. 배양시 야생형 및 Edg1 널 섬유모세포를 이용하여 저자는 Edg1가 돌열변이 세포 내에서 결함이 있는 S1P-유도 이동 반응을 매개함을 나타내었다. 또한 돌연변이 세포는 S1P 자극에 대해 반응하여 Rac을 활성화시킬 수 없었다.
Ishii, et al. (2001)은 마우스 내 Edg3 유전자를 분열시켰고, 유전자, 전사체 및 단백질의 완전한 부재를 유발하였다. Edg3 널 마우스는 생육가능하였고 번식력이 있으며 분명한 표현형적 비정상이 없이 정상적으로 발달되었다. 야생형 마우스 배아 섬유모세포는 Edg1, Edg5 및 Egd3을 발현하였고 포스포리파제(phospholipase) C(PLC; 600810 참조) 활성화, 아데닐사이클라제(adenylyl cyclase) 억제 및 Rho(602732 참조) 활성화 내에서 S1P에 높게 반응적이었다. Edg3 널 섬유모세포는 PLC 활성화의 유의적인 감소, 아데닐사이클라제 억제의 약한 감소 및 Rho 활성화의 무변화를 나타내었다. Ishii, et al. (2002)은 Edg3 및 Edg5 모두에 대해 무효화된(null) 마우스를 개발하였다. Edg5만 결핍된 마우스는 생육가능하고 번식 가능하며 정상적으로 발달되었다. Edg5-Edg3 이중-널 교차로부터의 새끼 크기는 현저하게 감소되었고, 이중-널 생존자가 어떠한 명백한 표현현을 나타내지 않으나 이들은 새끼는 종종 유아기로 생존하지 않았다. Ishii, et al. (2002)은 수용체 아형이 배아기 발달을 지지한다고나 결론 내렸으나 이 둘 생성의 삭제는 주산기 치사율을 특징지었다. S1P 시그날링 상의 수용체 삭제의 효과에 대한 마우스 배아 섬유모세포를 조사하였다. Edg5 널 섬유모세포는 S1P로의 노출로 Rho 활성화의 유의적인 감소를 나타내었고, 이중-널 섬유모세포는 Rho 활성화의 완전한 상실 및 PLC 활성화 및 칼슘 동원의 유의적인 감소를 나타내었고, 아데닐사이클라제 억제 상에는 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 마우스 내에서 Edg5 및 Edg3의 Rho 및 PLC/Ca(2+) 경로로의 우선적 결합이 있는 것으로 결론 내렸다.
최근 GPR12 발현은 배아 발달 동안 뇌 내에서 뉴런의 분화, 성숙 또는 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 실제로 해마 세포 HT22는 세포수 증가와 함께 SPC에 반응하고, SPC에 의해 처리된 초기 래트 피질 배양액은 시냅스 접촉의 증가를 나타낸다.
마우스에서 GPR12는 노던 블럿팅에 의해 하기 조직에서 검출되었다: 뇌, 특히 전뇌 및 후뇌 및 간. 더욱 상세하게는 이는 뇌의 해마, 편도, 조롱박겉질 및 후각기(변연계)의 원위치에서 검출되었다(Saeki, Y., et al FEBS letters 1993 336:317-322).
더욱 최근에는 GPR12는 스핑고실포스포릴콜린(SPC)에 대한 수용체로서 탈고아화(deorphanise)되었다. GPR12는 배아 및 성체 마우스 뇌에서 우세하게 발현되는 유일한 SPC 수용체이다. 배아 발달 동안 GPR12 mRNA는 피질 및 해마 내에서 매우 강하게 발현되고, 본 발현이 성체 마우스 내에서 여전히 존재하더라도 발달 동안 보다는 약해진다. 또한 발달 동안의 발현은 조롱박겉질, 꼬리 경막, 배내측핵 및 활꼴핵, 유두체, 후뇌의 운동핵 및 감각핵, 뇌줄기 및 척수 내에서도 존재한다. 성체 마우스에서 GPR12는 피질(몸감각 및 역판상근(retrosplenial) 피질) 및 해마(CA2 구역의 피라미드세포층이 가장 강하게 표지됨), 핵 측위, 조롱박겉질, p중격, 후구(승모 및 사구체 세포층), 편도 및 무릎핵 내에서 발현된다. 후뇌에서 GPR12 발현은 미약하고 소뇌의 일부 세포만(소엽 9 및 10)이 발현을 나타낸다.
래트에서 노던은 뇌 및 고환 내에서의 GPR12 발현을 나타낸다. RT-PCR에 의해 뇌하수체, 뇌 및 고환 내에 존재하는 것으로 나타났다. 원위치 하이브리디제이션은 전 및 후 뇌하수체, 조롱박겉질 및 측면 중격핵 내에서의 GPR12 발현을 나타내었다(Eidne, K. A., et al. FEBS letters. 1991. 292. 243-248).
그러나 일반적으로 포유류 내, 특히 뇌 내의 GPR12에 의해 수행되는 역할의 이해는 당분야에서 달성되지 않았다. WO 01/48483호는 적당한 조절 작용제로서 이용하기 위한 시험 화합물로서 GPR12 수용체의 하나 이상의 작용제 및 길항제를 이용하는 것을 포함한 적당한 조절 작용제의 제공 방법을 기술한다. 그러나 cDNA 서열 및 아미노산 서열의 분석은 많은 오류를 나타내고, 이는 명세서로부터 결정될 수 없다. 따라서 이들 연구의 반복은 달성될 수 없다.
발명의 요약
본 발명자는 GPR12의 생체 내 역할을 조사하기 위해 GPR12 넉아웃 마우스를 생성하였다. 본 발명자는 이러한 넉아웃 마우스가 운동력(걸음걸이를 포함), 신경 발달 및 시냅스 형성 제어시 GPR12가 중요한 역할을 하는 학습 능력 및 신경내분비 행동 조절에서 비-돌연변이와의 차이를 나타내었다. 또한 이러한 마우스는 고진통성(hyperanalgesic) 즉, 아픈 자극에 대해 민감성인 점에서 통증에 대한 민감도에서 차이를 나타낸다. 더욱이 이러한 돌연변이의 생리학 및 형태학은 특정한 신경학적 장애 및 예를 들어 알츠하이머병 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증에 중요한 역할을 한다. 생화학적 분석은 넉아웃 마우스가 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병을 포함한 간 및 신장 질환의 신호를 나타낸다.
GPR12 넉아웃 마우스는 질병 모델로서 및 치료적 이용을 위한 GPR12의 길항제 및 작용제를 확인하는데 유용하다.
따라서 첫 번째 관점에서 본 발명은 GPR12 폴리펩타이드가 기능적으로 불활성인 하나 이상의 세포를 포함한 GPR12 넉아웃 포유류를 제공한다.
본 발명자는 본 발명의 상기 관점에 따른 GPR12 넉아웃 마우스가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한 일부 한정 특성을 나타냄을 발견하였다: 반전된 그리드(grid)를 움켜쥐는 능력 저하에 의해 증명되는 부족한 운동 또는 평형 기능, 로타로드(rotarod) 상의 부족한 수행, 넓은 자세의 비정상 걸음걸이 및 증가된 통증 민감도.
넉아웃 포유류의 생성은 당업자에게 익숙살 것이고 여기에 기술된 상동적 재조합을 포함한 표준 실험 기술을 이용한다.
바람직하게는, 형질전환 포유류는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하기 포유류 중의 어느 하나이다: 마우스, 래트, 뾰족뒤쥐, 게르빌루스쥐, 기나아-피그, 원숭이, 햄스터, 고양이 및 개. 당업자는 본 리스트가 한정적이지 않음을 인식할 것이다. 가장 유리하게는 포유류는 마우스이다.
여기에 나타난 바와 같이 '기능적으로 불활성화된'(상동적 재조합에 의한 GPR12)이라는 용어는 고유의 환경(즉, 생체 내 환경)에서 기능시 GPR12 폴리펩타이드에 의해 정상적으로 수행된 하나 이상의 기능이 GPR12가 기능적으로 불활성화되지 않은 대조군과 비교시 유의적으로 억제됨을 의미한다. 유리하게는, '기능적으로 불활성인'이라는 용어는 고유의 환경(즉, 생체 내 환경)에서 기능시 GPR12에 의해 정상적으로 수행된 하나 이상의 기능이 GPR12가 기능적으로 불활성화되지 않은 대조군과 비교시 유의적으로 억제됨을 의미한다. 가장 유리하게는, 여기서 표기된 '기능적으로 불활성인'이라는 용어는 고유의 환경(즉, 생체 내 환경)에서 기능시 GPR12에 의해 정상적으로 수행된 모든 기능이 GPR12가 기능적으로 불활성화되지 않은 대조군과 비교시 유의적으로 억제됨을 의미한다.
유사하게는, 여기에 정의된 '기능적으로 불활성화된' GPR12 핵산은 여기에 정의된 기능적으로 불활성화인 GPR12를 인코드한다.
상기 나타난 바와 같이 '유의적으로 억제된'(GPR12 기능)은 억제(상기 기술된 바와 같이 상동적 재조합에 의한 포유류 세포 내의 적어도 하나 이상의 GPR12 기능의)는 적당한 대조군과 비교시 적어도 20% 이상까지 억제됨을 의미한다. 적당한 대조군의 예는 여기에 기술된 바와 같이 GPR12가 상동적 재조합에 의해 기능적으로 불활성화되지 않은 생체 내 환경과 동일하거나 유사한 상태에서의 동일하거나 유사한 세포이다. 유리하게는, '유의적으로 억제된'(상기 기술된 바와 같이 상동적 재조합에 의한 포유류 세포 내 GPR12 기능의)이라는 용어는 적어도 하나 이상의 GPR12 기능이 적당한 대조군과 비교시 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상까지 억제됨을 의미한다. 가장 유리하게는, '유의적으로 억제된'(상기 기술된 바와 같이 상동적 재조합에 의한 포유류 세포 내 GPR12 기능의)이라는 용어는 적어도 하나 이상의 GPR12 기능이 적당한 대조군과 비교시 100%까지 억제됨을 의미한다.
또다른 관점에서 본 발명은:
(a) 하나 이상의 기능적으로 활성인 내생적 GPR12 유전자를 포함한 하나 이상의 세포를 선택하는 단계;
(b) 상동적 재조합에 의해 하나 이상의 내생적 GPR12 유전자와 재결합시킬 수 있는 기능적으로 불활성인 GPR12 핵산으로 단계 (a)에 따른 하나 이상의 세포를 트랜스펙션시키는 단계;
(c) 하나 이상의 내생적 GPR12 유전자가 기능적으로 불활성인 GPR12 핵산으로 상동적 재조합을 수행한 하나 이상의 세포를 선택하는 단계를 포함한 하나 이상의 기능적으로 불활성인 GPR12 유전자를 포함한 하나 이상의 포유류 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
유리하게는, 본 발명에 따른 포유류 세포는 상기 상세하게 기술된 본 발명의 방법에 따라 생성된다. 본 발명의 본 관점의 바람직한 실시태양에서 상기 포유류 세포는 포유류 내에 포함된다. 즉, 본 발명의 상기 관점에 따른 세포가 바람직하게는 '넉아웃' 포유류를 구성한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 상기 넉아웃 포유류는 마우스이다.
기능적으로 불활성인 GPR12로 하나 이상의 세포를 트랜스펙션시키는 방법은 표준 분자생물학 기술의 이용을 포함하고, 여기에 기술된다. 유사하게는, 하나 이상의 내생적 GPR12 유전자가 기능적으로 불활성인 GPR12 핵산으로 상동적 재조합을 수행한 하나 이상의 세포를 선택하는 방법은 여기에 기술된 표준 실험 기술을 이용하여 수행된다.
또다른 관점에서 본 발명은:
(a) 비-상동성 복위 구역;
(b) 상기 비-상동성 복위 구역의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역;
(c) 발현시 기능적으로 활성인 GPR12를 인코드하지 않는 돌연변이된 GPR12 유전자;
(d) 상기 비-상동성 복위 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역을 포함하고, 상기 두 번째 상동성 구역은 상기 비-상동성 복위 구역의 다운스트림에 위치하고, 상기 두 번째 상동성 구역은 두 번째 GPR12 유전자에 대해 적어도 90% 이상의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 숙주 세포 내에서 하나 이상의 내생적 GPR12 유전자를 기능적으로 불활성화시키기에 적당한 핵산 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명자들은 GPR12와 관련된 여러 기능을 확인하였고, 따라서 GPR12 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 그의 결합 단백질/들 또는 이를 인코드하는 핵산이 치료적으로 유의적인 것으로 고려한다.
따라서 또다른 관점에서 본 발명은 GPR12 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 그의 결합 단백질/들 또는 이를 인코드하는 핵산 및 약제적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 관점에 따라, 유리하게는 상기 조성물은 하나 이상의 GPR12 폴리펩타이드 결합 단백질/들을 포함한다. 바람직하게는 하나 이상의 GPR12 결합 단백질은 GPR12의 길항제 및 작용제이다.
GPR12 결합 단백질은 자연 발생적 또는 합성적인 것이다. 자연 발생적 결합 단백질은 여기에 논의된 항체와 같은 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 합성적 GPR12 결합 단백질은 유리하게는 작은 분자이고 당업자에게 익숙할 것이고 여기에 기술된 스크리닝 방법에 의해 선택된다.
본 발명의 대안적 실시태양에서 바람직하게는 조성물은 GPR12 결합 단백질을 인코드하는 핵산 또는 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산을 포함한다.
본 발명자들은 GPR12 넉아웃 마우스가 정상 대조군 마우스와 비교시 변화된 신경 기능을 지님을 발견하였다. 더욱이 GPR12 넉아웃 마우스는 다른 형태학적 또는 해부학적 비정상을 보유한다. 따라서 본 발명자들은 GPR12의 작용제 및/또는 길항제 또는 이를 포함한 조성물이 신경 이상의 치료시 특별한 치료적 이용인 것으로 고려한다. 이러한 신경 이상은 하나 이상의 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
따라서 또다른 관점에서 본 발명은
(a) 기능적으로 불활성인 GPR12 폴리펩타이드를 포함한 하나 이상의 포유류를 선택하는 단계;
(b) 적어도 GPR12 활성의 측면에서 잠재적으로 작용하는(agonise) 하나 이상의 잠재적 GPR12 모방자로 하나 이상의 포유류를 처리하는 단계;
(c) 상기 처리된 포유류가 단계 (a)에 따라 선택된 포유류와 비교시 하나 이상의 복구된 특성을 지니는지 여부를 결정하기 위해 단계 (b)에 따라 처리된 하나 이상의 포유류를 시험하는 단계; 및
(d) 단계 (a)에 따라 선택된 포유류에 대해 야생형 포유류의 하나 이상의 특성을 복구한 하나 이상의 GPR12-리간드 모방자를 선택하는 단계를 포함한 GPR12 폴리펩타이드의 기능적 활성에 작용하는 하나 이상의 분자를 확인하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은:
(a) 기능적으로 활성인 GPR12 폴리펩타이드를 포함한 하나 이상이 포유류를 선택하는 단계;
(b) 적어도 GPR12 활성의 측면에서 잠재적으로 길항작용하는 하나 이상의 잠재적 GPR12 길항제로 하나 이상의 포유류를 처리하는 단계;
(c) 상기 처리된 포유류가 단계 (a)에 따라 선택된 포유류와 비교시 하나 이상의 조절된 특성을 지니는지 여부를 결정하기 위해 단계 (b)에 따라 처리된 하나 이상의 포유류를 시험하는 단계를 포함한 GPR12 폴리펩타이드의 기능적 활성을 길항작용하는 하나 이상의 분자를 확인하는 방법을 제공한다.
더욱이 본 발명은 하나 이상의 화합물의 생물학적 효과에 대한 분석시 형질전환 GPR12 넉아웃 포유류의 이용을 제공한다.
본 발명의 상기 관점에 따라 '길항제'라는 용어는 여기에 정의된 바와 같이 적당한 대조군과 비교시 GPR12의 하나 이상의 기능을 유의적으로 억제하는 분자를 나타낸다.
본 발명은 GPR12 자체, 그의 작용제 및 길항제뿐만 아니라 GPR12 활성 조절자의 이용을 포함한다. 당업자는 다양한 약제가 GPR12의 효과를 증가시키거나 감소시키는 작용을 할 것이고, 이것이 달성되는 루트가 다양할 것임을 인식할 것이고; 따라서 작용제는 활성화된 GPR12를 모방하거나 GPR12에 결합하고 그의 활성을 증가시키고; GPR12 활성의 작용적 조절자는 동일하게 작용하거나, GPR12의 내생적 작용제 또는 내성적 GPR12 자체의 생성을 증가시킨다. 길항제 및 길항적 조절자는 유사하게 작용하나 GPR12의 생물학적 효과를 감소시킨다.
여기에 나타난 '포유류'라는 용어는 어떠한 포유류도 된다. 유리하게는 포유류는 비-인간 포유류이다. 바람직하게는 포유류는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 마우스, 래트, 기니아-피그, 토끼, 햄스터, 게르빌루스쥐, 고양이, 개 및 원숭이. 당업자는 본 목록이 한정적이지 않음을 인식할 것이다.
본 발명의 본 관점에 따라 '처리'(GPR12의 잠재적 길항제로 포유류를)라는 용어는 포유류를 포함한 하나 이상의 세포를 접촉(GPR12의 하나 이상의 잠재적 길항제와)시키는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 관점에 따라 비정상 신경학적 특성의 지표는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
비정상 신경 기능에 대한 시험은 표준 실험 기술을 이용하고 당업자에게 익숙할 것이다.
유리하게는, 본 발명의 상기 관점의 단계 (c)는 이들 포유류가 GPR12 넉아웃 마우스에 의해 나타난 하나 이상의 특성을 나타내는지 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 포유류를 시험하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 관점에 따라, 단계 (a)에 따라 선택된 하나 이상의 포유류는 유리하게는 GPR12 넉아웃 마우스이다. 바람직하게는 이들은 여기에 기술된 방법에 따라 생성된다.
여기에 나타난 바와 같이 '기능적으로 불활성인'(GPR12)라는 용어는 GPR12 폴리펩타이드가 그의 고유의 환경(즉, 생체 내 환경 내에 있는) 내에서 기능할 때 GPR12 폴리펩타이드에 의해 정상적으로 수행된 하나 이상의 기능이 GPR12가 기능적으로 불활성이 아닌 대조군과 비교시 유의적으로 억제됨을 의미한다. 유리하게는, '기능적으로 불활성인'이라는 용어는 GPR12가 그의 고유의 환경(즉, 생체 내 환경 내에 있는) 내에서 기능할 때 GPR12에 의해 정상적으로 수행된 하나 이상의 기능이 GPR12가 기능적으로 불활성화되지 않은 대조군과 비교시 유의적으로 억제됨을 의미한다. 가장 유리하게는, 여기에 나타난 바와 같이 '기능적으로 불활성인'이라는 용어는 GPR12가 그의 고유의 환경 내에서 기능할 때 GPR12에 의해 정상적으로 수행된 모든 기능이 GPR12가 기능적으로 불활성화되지 않은 대조군과 비교시 유의적으로 억제됨을 의미한다.
유사하게는, 여기에 정의된 '기능적으로 불활성인' GPR12 핵산은 여기에 정의된 기능적으로 불활성인 GPR12를 인코드한다.
상기 나타난 바와 같이 '유의적으로 억제된'(GPR12 기능)이라는 용어는 억제 (상기 기술된 바와 같이 상동성 재조합에 의한 포유류 세포 내에서의 적어도 하나 이상의 GPR12 기능의)는 적당한 대조군과 비교시 적어도 20% 이상까지 억제됨을 의미한다. 적당한 대조군의 예는 여기에 기술된 바와 같이 GPR12가 상동성 재조합에 의해 기능적으로 불활성화되지 않은 생체 내 환경과 동일하거나 유사한 환경 내의 동일하거나 유사한 세포이다. 유리하게는, '유의적으로 억제된'(상기 기술된 바와 같이 상동성 재조합에 의한 포유류 세포 내의 GPR12 기능의)은 적어도 하나 이상의 GPR12 기능이 적당한 대조군과 비교시 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상까지 억제됨을 의미한다. 가장 유리하게는, '유의적으로 억제된'(상기 기술된 바와 같이 상동성 재조합에 의한 포유류 세포 내의 GPR12 기능의)은 적어도 하나 이상의 GPR12 기능이 적당한 대조군과 비교시 100%까지 억제됨을 의미한다.
본 발명의 이러한 관점에 따라, '처리'(GPR12 잠재적인 길항제로 포유류를)라는 용어는 포유류를 구성하는 하나 이상의 세포가 접촉(하나 이상의 GPR12의 잠재적 길항제와)하게 하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 관점에 따라, '야생형 포유류의 하나 이상의 조절된 특성'이라는 용어는 여기에 정의된 기능적으로 불활성인 GPR12 폴리펩타이드를 포함한 포유류와 비교시 야생형 포유류에 의해 나타난 하나 이상의 특성의 조절을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 조절은 상실된 기능의 복구이다.
여기에 나타난 GPR12 마우스는 야생형 GPR12의 적어도 하나 이상의 활성 또는 기능을 복제한다. 마우스는 활성화된 GPR12를 모방하거나 불활성인 GPR12를 모방하여 자연적인 불활성 GPR12의 부재시 그 자체로 억제된 기능을 더욱 억제한다.
본 발명자들은 하나 이상의 치료적 효과를 생성하기 위해 GPR12 핵산 또는 하나 이상의 GPR12의 작용제 또는 길항제를 인코드하는 핵산이 포유류 내로 삽입되는 것을 고려한다.
따라서 또다른 관점에서 본 발명은 적어도 그의 세포의 일부분 내에서 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 인코드하는 외생적 핵산을 포함한 형질전환 동물을 제공한다: GPR12 폴리펩타이드, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 작용제 및 GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 길항제.
유리하게는, 형질전환 동물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 마우스, 인간, 돼지, 염소, 사슴, 원숭이 및 소. 당업자는 본 목록이 한정적이지 않음을 인식할 것이다.
본 발명의 상기 관점에 따라, '외생적 핵산'이라는 용어는 특정한 동물로부 터 유래하지 않은 핵산을 의미한다. 그러나 이는 동일한 동물 형태 또는 품종으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어 형질전환 마우스는 박테리아 기원의 GPR 작용제 핵산을 포함한다.
바람직하게는, 형질전환 동물은 그의 세포의 일부분 내에 GPR12의 하나 이상의 작용제 또는 하나 이상의 길항제를 인코드하는 외생적 DNA를 포함한다.
여기에 기술된 바와 같이 비-인간 형질전환 동물은: 마우스, 래트, 원숭이, 개, 고양이 및 돼지로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 당업자는 본 목록이 한정적인 것이 아님을 인식할 것이다.
본 발명에 따라 제조된 GPR12 넉아웃 마우스를 이용한 연구는 GPR12 폴리펩타이드가 신경 기능뿐만 아니라 다른 이상과 관련됨을 나타내었다. 이러한 신경학적 이상은 하나 이상의 하기를 포함하나 이에 한정적이지 않다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
따라서 또다른 관점에서 본 발명은:
(a) 진단되는 환자로부터 표본 세포를 선택하는 단계; 및
(b) 상기 표본 세포 내 GPR12 폴리펩타이드의 발현 수준 및/또는 기능적 활성을 건강한 개체로부터의 하나 이상의 대조군 표본/들과 비교하는 단계를 포함한,
하기로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 이상의 진단 방법을 제공한다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
또다른 관점에서 GPR12 또는 그의 자연적 리간드 내의 다형성이 질병을 진단하는데 이용된다. 따라서 본 발명은:
(a) 진단되는 환자로부터 표본 세포를 선택하는 단계; 및
(b) 내생적 GPR12 유전자 및 GPR12의 하나 이상의 자연적 리간드 내의 하나 이상의 다형성을 검출하기 위해 상기 세포 내 내생적 핵산을 분석하는 단계를 포함한,
하기로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 이상의 진단 방법을 제공한다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
본 발명의 상기 관점에 따라, GPR12의 발현 수준 및/또는 기능적 활성이 증가되거나 감소되거나 변화되거나 또는 GPR12 핵산 또는 GPR12 리간드를 인코드하는 핵산이 하나 이상의 다형성을 포함한 표본은 건강한 개체로부터의 하나 이상의 대조군 표본과 비교시 표본이 채취된 개체가 상기 목록된 하나 이상의 질병을 지님을 나타낸다.
본 발명의 상기 관점에 따라, 환자로부터의 세포 표본은 표준 실험 기술을 이용하여 선택되고, 이는 당업자에게 익숙할 것이다.
상기 나타난 GPR12 폴리펩타이드의 '기능적인 활성'은 그의 고유의 환경 즉, 그의 세포 내에서 정상적으로 기능하는 GPR12 기능을 나타낸다.
따라서 또다른 관점에서 본 발명은:
알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 환자 이상의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조시 GPR12의 하나 이상의 길항제 또는 작용제의 이용을 제공한다.
본 발명의 실행은 나타내지 않는 한 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 내에 설명된다. J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James OD. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson Immunocytochemistry : Theory and Practice, CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); Immunochemical Protocols, vol 80, in the series: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; and The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th Edition, Beers, M. H., and Berkow, R, Eds, ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons) 참조. 이들 일반 문헌 각각은 참고문헌으로 포함된다.
GPR12 폴리펩타이드
여기에 기술된 "폴리펩타이드"라는 용어는 서로 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합 즉, 등가근(isostere)에 의해 결합된 2 이상의 아미노산을 포함한 펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. "폴리펩타이드"는 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 올리고머로 표현되는 짧은 체인과 일반적으로 단백질로 표현되는 더 긴 체인 모두를 나타낸다. 폴리펩타이드는 20 유전자-인코드된 아미노산 이상의 아미노산을 포함한다.
"폴리펩타이드"는 후-번역 과정과 같은 자연적 과정에 의해 또는 당분야에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산을 포함한다. 이러한 변형은 일반 교본 및 더욱 상세한 모노그래프뿐만 아니라 여러 권의 연구 논문 내에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 백본(backbone), 아미노산 사이드-체인 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한 폴리펩타이드의 어떤 곳에서도 발생할 수 있다. 동일한 형태의 변형은 제공된 폴리펩타이드 내의 동일하거나 여러 사이트의 다양한 정도 내에 존재한다.
폴리펩타이드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지되고, 이들은 분지가 있거나 또는 없이 환형일 수 있다. 환형, 분지된, 분지된 환형 폴리펩타이드는 후-번역 자연 과정으로부터 유발되거나 합성적 방법에 의해 제조된다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실레이션(ribosylation), 아미드화, 플라빈의 공유결합 부착, 헴 반족의 공유결합 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합 부착, 리피드 또는 리피드 유도체의 공유결합 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유결합 부착, 교차-결합, 순환, 이황결합 형성, 탈메틸화, 공유결합 교차-결합 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀레이션(formylation), 감마-카르복실화, 글리코실레이션, GPI 앵커(anchor) 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일레이션(myristoylation), 산화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일레이션(selenoylation), 황산화, 아르기닌화 및 유비퀴틴화와 같은 단백질로 아미노산의 전이-RNA 매개 첨가. 예를 들어, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter, et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 and Rattan, et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 참조.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", "유도체" 또는 "단편"이라는 용어는 서열로부터 또는 그에 대한 하나(또는 그 이상의) 아미노산의 치환, 변이, 변형, 교체, 삭제 또는 첨가를 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "GPR12"에 대한 표기는 GPR12의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
표기가 GPR12와 같은 수용체의 "수용체 활성" 또는 "생물학적 활성"에 대해 이루어진 경우 이들 용어는 유사한 활성 또는 증가된 활성 또는 감소된 바람직하지 않은 부작용을 지닌 활성을 포함한 GPR12 수용체의 신진대사적 또는 생리적 기능을 나타낸다. 또한 GPR12 수용체의 항원성 및 면역원성 활성도 포함된다. GPCR 활성의 예 및 이들 활성을 분석하고 질량화하는 방법은 당분야에 알려져 있고, 본 문서에 상세히 기술되어 있다.
여기에 사용된 "삭제"는 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 부재한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내 변화로서 정의된다. 여기에 사용된 "삽입" 또는 "첨가"는 자연 발생적인 물질과 비교시 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 첨가를 유발한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내의 변화이다. 여기에 사용된 "치환"은 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의한 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체를 유발한다.
또한 본 발명에 따른 GPR12 폴리펩타이드는 침묵(silent) 변화를 생성하고 기능적으로 동일한 아미노산 서열을 유발하는 아미노산 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 지닌다. 계획적인 아미노산 치환은 극성, 용해성, 소수성, 친수성에 있어서의 유사성 및/또는 잔기의 양친매성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어 음성적으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하고; 양성적으로 하전된 아미노산을 포함하고; 유사한 친수성 수치를 지닌 하전되지 않은 극성 헤드를 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
GPR12 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드
일반적으로 "폴리뉴클레오타이드"는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오타이드를 나타낸다. "폴리뉴클레오타이드"는 단일- 및 이중-나선 DNA에 제한없이 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA 및 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 RNA, 단일-나선 또는 더욱 일반적으로는, 이중-나선 또는 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA 및 RNA를 포함한 하이브리드 분자를 포함한다. 더욱이 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함한 삼중-나선 구역을 나타낸다. 또한 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한 DNAs 또는 RNAs 및 안정성 또는 다른 이유를 위해 변형된 백본을 지닌 DNAs 또는 RNAs를 나타낸다. 예를 들어 "변형된" 염기는 트리틸레이트된(tritylated) 염기 및 이노신(inosine)과 같은 특이적인 염기를 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 이루어진다; 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 자연 내에서 발견된 폴리뉴클레오타이드의 화학적으로, 효소학적으로 또는 신진대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태를 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오타이드"는 종종 올리고뉴클레오타이드로 표현되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
많은 뉴클레오타이드 서열이 유전자 코드의 퇴보의 결과로서 동일한 폴리펩타이드를 인코드할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
여기에 나타난 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열, 올리고뉴클레오타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체(그의 일부분과 같은)를 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 나선 또는 그의 결합에 관계없이 이중-나선 또는 단일-나선인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA이다. 뉴클레오타이드 서열이라는 용어는 재조합 DNA 기술(예를 들어 재조합 DNA)의 이용에 의해 제조된다.
바람직하게는, "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 DNA를 의미한다.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", 유도체" 또는 단편"이라는 용어는 GPR12 뉴클레오타이드 서열로부터 또는 그에 대한 하나(또는 그 이상의) 핵산의 치환, 변이, 변형, 교체, 삭제 또는 첨가 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "GPR12"에 대한 표기는 GPR12의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
GPR12에 대한 발현 분석
GPR12 관련 질병을 치료하기 위해 유용한 치료제를 고안하기 위해 GPR12의 발현 프로파일을 측정하는 것이 유용하다(야생형 또는 특정한 돌연변이에 관계없이). 따라서 당분야에 알려진 방법은 GPR12가 발현되는 기관, 조직 및 세포 형태(뿐만 아니라 발달 단계)를 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 일반적인 또는 "전자" 노던이 수행된다. 또한 역-전사효소 PCR(RT-PCR)이 GPR12 유전자 또는 돌연변이의 발현을 분석하는데 사용된다. GPR12의 발현 프로파일을 측정하기 위한 더욱 민감한 방법은 당분야에 알려진 RNAse 보호 분석을 포함한다.
노던 분석은 유전자의 전사체 존재를 검출하는데 사용되는 실험 기술이고, 표지된 뉴클레오타이드 서열의 특정한 세포 또는 조직으로부터의 RANs가 결합된 멤브레인에 대한 하이브리디제이션을 포함한다(Sambrook, supra, ch. 7 and Ausubel, F. M. et al. supra, ch. 4 and 16). BLAST를 응용한 아날로그 컴퓨터 기술("전자 노던")이 유전자은행 또는 LIFESEQ 데이터베이스(Incyte Pharmaceuticals)와 같은 뉴클레오타이드 데이터베이트 내의 분자와 동일하거나 관련된 분자에 대한 검색에 사용된다. 이러한 형태의 분석은 다수의 멤브레인-기반 하이브리디제이션 보다 더 빠르다는데 장점을 지닌다. 더욱이 컴퓨터 검색의 민감도는 어떤 특정한 매치가 정확하거나 상동체로서 분류되는지 여부를 측정하도록 변형될 수 있다.
상기 기술된 프로브를 포함하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 본 문서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 연구 시약 및 치료 및 진단의 발견 물질로서 사용된다.
GPR12 폴리펩타이드의 발현
GPR12 폴리펩타이드의 발현은 여기에 기술된 GPR12의 작용제 또는 길항제로서 기능하는 GPR12 항체의 생성에 필요하다.
생물학적으로 활성인 GPR12 폴리펩타이드를 발현하기 위해 GPR12를 인코드하는 뉴클레오타이드 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체는 적당한 발현 벡터 즉, 삽입된 코팅 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한 벡터 내로 삽입된다.
당업자에게 잘 알려진 방법이 GPR12를 인코드하는 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 포함한 발현 벡터를 구조하는데 이용된다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 Sambrook, J., et al., (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ch. 4, 8, and 16-17, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.) and Ausubel, F. M., et al., (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.) 내에 기술되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 GPR12를 인코드하는 서열을 포함하고 발현하는데 이용된다. 이들은 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드(cosmid) DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(즉, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(즉, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 또는 담배 모자이크 바이러스(TMV)) 또는 박테리아 발현 벡터(즉, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 본 발명은 사용되는 숙주 세포에 한정적이지 않다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역된 구역(즉, 인핸서, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역된 구역)이다. 이러한 요소는 그의 강도 및 특성에 있어서 다양하다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라 다르게 구성적(constitutive) 및 유도성 프로모터를 포함한 어떠한 수의 적당한 전사 및 번역 요소도 사용된다. 예를 들어 박테리아 시스템 내의 클로닝시 BLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPorT1 플라스미드(GIBCO/BRL) 등의 하이브리드 lacZ 프로모터와 같은 유도성 프로모터가 사용된다. 바큘로바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터는 곤충 세포 내에 사용된다. 식물 세포의 게놈으로부터(즉, 열 충격, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스로부터(즉, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열) 유도된 프로모터 또는 인핸서가 벡터 내로 클론된다. 포유류 세포 시스템에서 포유류 유전자로부터 또는 포유류 바이러스로부터의 프로모터가 바람직하다. GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열의 다수의 카피를 포함한 세포주를 생성할 필요가 있는 경우 SV40 또는 EBV에 기반한 벡터가 적당한 선택가능성 마커로 사용된다.
박테리아 시스템 내에서 다수의 발현 벡터가 GPR12 폴리펩타이드에 대한 이용에 따라 선택된다. 예를 들어 다량의 GPR12 폴리펩타이드가 항체의 유도에 필요한 경우 용이하게 정제되는 높은 발현 수준의 융합 단백질을 검출하는 벡터가 사용된다. 이러한 벡터는 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열이 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 하위 7개 잔기에 대한 서열과 인 프레임(in frame)으로 벡터 내에 라이게이트되어 하이브리드 단백질이 생성되는 BLUESCRIPT(Stratagene)과 같은 다기능성 E. coli 클로닝 및 발현 벡터, pIN 벡터(Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)가 글루타티온 S-트랜퍼라제(GST)를 지닌 융합 단백질로서 외부 폴리펩타이드를 발현하는데 사용된다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 용해성이고 글루타티온-아가로스 비드로 흡착시킨 후 자유 글루타티온의 존재 하에서 용출시킴으로서 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템 내에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 XA 프로테아제 분역 사이트 인자를 포함하여 클론된 목적 폴리펩타이드가 원하는 곳에서 GST 반족으로부터 분비될 수 있게 고안된다.
효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 내에서 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한 다수의 벡터가 사용된다. 참고로 Ausubel (상동) and Grant et al.(1987; Methods Enzymol. 153:516-544)을 참조.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열의 발현은 어떠한 수의 프로모터에 의해서도 작동된다. 예를 들어 CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터가 단독으로 또는 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 결합하여 사용된다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 대안으로, RUBISCO의 작은 서브유니트 또는 열 충격 플라스미드와 같은 식물 프로모터가 사용된다(Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이들 컨스트럭트는 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원균-매개 트랜스펙션에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 다수의 일반적으로 유용한 논문 내에 기술되어 있다(예를 들어 Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196 참조).
또한 곤충 시스템도 GPR12 폴리펩타이드를 발현하는데 사용된다. 예를 들어 이러한 시스템 내에서 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)가 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 내 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충 내의 외부 유전자를 발현하는 벡터로서 사용된다. GPR12를 인코드하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비-필수 구역 내로 클론되고, 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓인다. GPR12 폴리펩타이드의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자의 불활성을 유발하고 코트 단백질이 없는 재조합 바이러스를 생성할 것이다. 이후, 재조합 바이러스는 예를 들어, GPR12 폴리펩타이드가 발현되는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 내 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충을 감염시키는데 사용된다(Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유류 숙주 세포 내에서 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 사용된다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열은 후기 프로모터 및 3부로 이루어진 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내로 라이게이트된다. 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 구역 내로의 삽입이 감염된 숙주 세포 내에서 GPR12 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생존가능한 바이러스를 수득하는데 사용된다(Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 더욱이 라우스육종 바이러스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서가 포유류 숙주 세포 내 발현을 증가시키는데 사용된다.
또한 인간 인공 염색체(HACs)가 플라스미드 내 포함되고 발현될 수 있는 것 보다 더 큰 DNA 단편을 전달하기 위해 이용된다. 약 6 kb 내지 10 kb의 HACs가 구조되고 치료적 목적으로 통상적인 전달 방법(리포솜, 다양이온성(polycationic) 아미노 폴리머 또는 소포)을 통해 전달된다.
또한 특정한 개시 신호가 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열의 더욱 효과적인 번역을 달성하는데 사용된다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열 및 그의 개시 코돈 및 업스트림 서열이 적당한 발현 벡터 내로 삽입된 경우 어떠한 부가적인 전사 또는 번역 조절 신호가 필요하지 않다. 그러나 단지 코딩 서열 또는 그의 단편만이 삽입된 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외생적 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 더욱이 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 확보하기 위해 정확한 리딩 프레임 내에 존재해야 한다. 외생적 번역 요소 및 개시 코돈은 자연적 또는 합성적 모두의 다양한 기원이다. 발현의 효율은 논문에 기술된 것과 같이 사용된 특정한 세포 시스템에 적당한 인핸서의 포함에 의해 증가된다(Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
더욱이 숙주 세포 스트레인은 삽입된 서열의 발현을 조절하고 원하는 형태로 발현된 단백질을 처리할 수 있는 능력에 대해 선택된다. 이러한 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실레이션, 인산화, 리피드화 및 아실화를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 단백질의 "프리프로(prepro)" 형태를 분열시키는 후-번역 처리가 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진시키는데 이용된다. 후-번역 활성에 대한 특정한 세포성 기구 및 특성적 메카니즘을 지닌 다른 숙주 세포(즉, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38)가 American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Md.)으로부터 입수가능하고, 외부 단백질의 정확한 변형 및 처리를 확보하기 위해 선택된다.
재조합 단백질의 장기간의 고수율의 생선을 위해 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어 GPR12 GPCR을 안정하게 발현할 수 있는 세포주는 동일하거나 개별적인 벡터 상에 복제 및/또는 내생적 발현 요소의 바이러스 오리진 및 선택가능한 마커 유전자를 포함한 발현 벡터를 이용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후 세포는 선택성 배지 내로 스위치되기 전에 풍부화된 배지 내에서 약 1∼2일간 생장된다. 선택가능한 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 생장 및 회수를 가능하게 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 세포는 세포 형태에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식된다.
어떠한 수의 선택 시스템도 형질전환된 세포주를 회수하는데 사용된다. 이들은 각각 tk- 또는 apr- 세포 내에서 사용될 수 있는, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 대사길항물질, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택에 대한 근거로 사용될 수 있다. 예를 들어 dhfr은 메토트렉사트(methotrexate)에 저항성을 부여하고(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt는 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 저항성을 부여하고(Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); als 또는 pat는 각각 클로르설푸론(chlorsulfuron) 및 포스피노트리신(phosphinotricin) 아세틸트랜스퍼라제에 저항성을 부여한다(Murry, 상동). 부가적인 선택가능 유전자가 기술되었고, 예를 들어 trpB는 세포가 트립토판의 위치에서 인돌을 이용할 수 있게 하고, hiD는 세포가 히스티딘의 위치에서 히스티놀을 이용할 수 있게 한다(Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 최근, 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 그의 기질 GUS 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 시각적으로 표시되는 마커의 이용이 인기를 얻고 있다. 이들 마커는 형질전환체를 확인할 뿐만 아니라 특정한 벡터 시스템에 기인한 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량하는데 사용될 수 있다(Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
마커 유전자의 존재/부재가 목적 유전자가 존재함을 나타낸다하더라도 상기 유전자의 존재 및 발현은 확인될 필요가 있다. 예를 들어 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열이 마커 유전자 서열 내로 삽입되면 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열을 포함한 형질전환된 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다.
대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에서 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열과 나란히 놓일 수 있다. 유도 또는 선택에 반응한 마커 유전자의 발현은 일반적으로 나란히 놓인 유전자의 발현도 나타낸다.
대안으로, GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 서열을 포함하고 GPR12를 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 다양한 절차에 의해 확인된다. 이들 절차는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 및 멤브레인, 용액을 포함한 단백질 바이오에세이 또는 면역에세이 또는 핵산 또는 단백질 서열의 검출 및/또는 정량화에 대한 기술에 기반한 칩을 포함하나 이에 한정적이지 않다.
GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 또는 프로브 또는 단편 또는 GPR12 GPCR을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드의 단편을 이용한 증폭에 의해 검출될 수 있다. 핵산 증폭 기반 분석은 GPR12를 인코드하는 DNA 또는 RNA를 포함한 형질전환체를 검출하기 위해 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 서열에 기반한 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고머의 이용을 포함한다.
본 단백질에 대해 특이적인 폴리클론 또는 단일클론 항체를 이용한 GPR12의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당분야에 알려져 있다. 이러한 기술의 예는 효소면역측정법(ELISAs), 방사면역측정법(RIAs) 및 형광활성화세포분류(FACS)를 포함한다. GPR12 상의 2개의 비-방해성 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 이용한 2-사이트, 단일클론-기반 면역에세이가 바람직하나 경쟁적 결합 에세이가 이용된다. 이들 및 다른 분석은 예를 들어 Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.) 및 in Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)에서와 같이 당 분야에 잘 기술되어 있다.
광범위한 표지 및 컨쥬게이션 기술이 당업자에게 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산에 이용된다. 표지된 하이브리디제이션을 생성하기 위한 수단 또는 GPR12를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관련된 서열을 검출하기 위한 PCR 프로브는 올리고표지, 니크(nick) 번역, 말단-표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 이용한 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로, GPR12를 인코드하는 서열 또는 그의 단편은 mRNA 프로브의 생성을 위해 벡터 내로 클론된다. 이러한 벡터는 당분야에 알려져 있고, 통상적으로 이용가능하고, T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오타이드와 같은 적당한 RNA 중합효소의 첨가에 의해 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 이용된다. 이들 절차는 Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, Mich.), Promega(Madison, Wis.), 및 U.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio)에 의해 제공된 것과 같은 통상적으로 이용가능한 다양한 키트를 이용하여 수행된다. 검출의 용이성에 대해 이용된 적당한 수용체 분자 또는 표지는 라디오뉴클레오타이드, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 색원체성 약제뿐만 아니라 기질, 공동인자, 억제자, 자기입자 등을 포함한다.
GPR12를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양액으로부터의 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에서 배양된다. 형질전환된 세포에 의해 생성된 단백질은 세포 멤브레인 내에 위치하고, 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 세포내로 분비되거나 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 GPR12를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포 멤브레인을 통해 GPR12의 분비를 지시하는 신호 서열을 포함하도록 고안된다. 다른 구조는 용해성 단백질의 정제를 촉진시킬 폴리펩타이드 도메인을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 GPR12를 인코드하는 서열을 결합시키는데 이용된다. 이러한 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상에서 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이팅 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상에서의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 전충성/친화력 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash.)에 사용되는 도메인을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. XA 인자 또는 엔테로키나제(enterokinase)(Invitrogen, San Diego, Calif.)에 특이적인 것과 같이 정제 도메인과 GPR12 GPCR 인코딩 서열 사이로의 분열가능한 링커 서열의 포함은 정제를 촉진시키는데 사용된다. 이러한 발현 벡터는 GPR12 및 티오레독신(thioredoxin) 또는 엔테로키나제 분열 사이트에 앞선 6개 히스티딘 잔기를 인코드하는 핵산을 포함한 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 고정된 이온 친화력 크로마토그래피(IMIAC; described in Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) 상에서의 정제를 촉진하고, 엔테로키나제 분열 사이트는 융합 단백질로부터 GPR12를 정제하기 위한 수단을 제공한다. 융합 단백질을 포함한 벡터의 논의는 Kroll, D. J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)에서 제공된다.
GPR12의 단편은 재조합 생성뿐만 아니라 고형-상 기술을 이용한 직접적인 펩타이드 합성에 의해서도 생성된다(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행된다. 자동화된 합성은 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다. GPR12의 다양한 단편은 개별적으로 합성된 후 결합되어 전체 길이 분자를 생성한다.
형질전환 동물
(a) 넉아웃
본 발명의 또다른 관점에서 GPR12 폴리펩타이드가 기능적으로 불활성화된 하나 이상의 세포를 포함한 GPR12 넉아웃 포유류가 제공된다.
본 발명의 GPR12 넉아웃은 GPR12 유전자의 기능적 분열 또는 GPR12 유전자의 기능 돌연변이의 하나 이상의 손실을 포함하고, GPR12 유전자의 삭제 또는 교체를 포함한 유전자의 일부분의 결과로서 유발된다. 돌연변이는 단일 점돌연변이를 포함하고, GPR12의 코딩 또는 비-코딩 구역을 타겟한다.
바람직하게는, 이러한 넉아웃 동물은 돼지, 양 또는 설치류와 같은 비-인간 포유류이다. 더욱 바람직하게는, 넉아웃 동물은 마우스 또는 래트이다. 이러한 넉아웃 동물은 GPR12의 작용제 및/또는 길항제를 확인하는 스크리닝 절차에 이용될 뿐만 아니라 생체 내에서 질병 치료제로서 그들의 효능에 대해 시험하는데 이용된다.
예를 들어 GPR12의 생성에 결함이 있도록 설계된 넉아웃 동물은 GPR12의 작용제 및/또는 길항제를 확인하는 분석에 이용된다. 하나의 분석은 GPR12 수용체의 부재시 생리적 반응을 생성하는지 여부를 측정하기 위해 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)을 평가하도록 고안된다. 이는 상기 논의된 넉아웃 동물에 상기 약물을 투여한 후 특정한 반응에 대해 동물을 분석함으로서 달성된다. 어떠한 생리적 파라미터가 본 분석에서 측정될 수 있다.
GPR12 넉아웃 동물로부터 유래된 조직은 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)이 GPR12 수용체에 결합하는지 여부를 측정하는 수용체 결합 분석에 이용된다. 이러한 분석은 GPR12 수용체 생성에 결함이 있도록 설계된 넉아웃 동물로부터 첫 번째 수용체 제제를 수득하고, 확인된 GPR12 리간드 또는 화합물에 결합하는 것으로 알려진 출처로부터 두 번째 수용체 제제를 수득함으로서 수행될 수 있다. 일반적으로 첫 번째 및 두 번째 수용체 제제는 수득되는 출처를 제외하고는 모든 면에서 유사할 것이다. 예를 들어 넉아웃 동물로부터의 뇌 조직(상기 및 하기에 기술된)이 분석에 이용될 때 정상(야생형) 동물로부터의 비교 뇌 조직이 두 번째 수용체 제제의 출처로서 이용된다. 각각의 수용체 제제는 단독 및 후보 리간드 또는 화합물의 존재 하에 GPR12 수용체에 결합하는 것으로 알려진 리간드와 인큐베이트된다. 바람직하게는 후보 리간드 또는 화합물은 여러 다른 농도에서 조사될 것이다.
알려진 리간드에 의한 결합이 상기 시험 화합물에 의해 디스플레이되는 정도는 첫 번째 및 두 번째 수용체 제제 모두에 대해 측정된다. 넉아웃 동물로부터 유래된 조직은 직접 분석에 이용되거나 본 조직은 멤브레인 또는 멤브레인 단백질을 분리하도록 처리되고, 이들 자체가 분석에 이용된다. 바람직한 넉아웃 동물은 마우스이다. 리간드는 결합 분석과 양립가능한 다른 수단을 이용하여 표지된다. 이는 제한없이 방사성, 효소적, 형광 또는 화학발광 표지(뿐만 아니라 상기 더욱 상세히 기술된 다른 표지 기술)를 포함한다.
더욱이 GPR12 수용체의 길항제는 기능적인 GPR12를 발현하는 야생형 동물 및 GPR12 수용체 기능이 감소되거나 제거된 발현과 관련된 표현형적 특성을 나타내는 것으로 확인된 동물에 후보 화합물 등을 투여함으로서 확인된다.
비-인간 넉아웃 동물을 생성하는 상세한 방법은 하기에 더욱 상세히 기술된다. 형질전환 유전자 컨스트럭트는 넉아웃 포유류를 생성하기 위해 동물의 생식세포로 도입될 수 있다. 예를 들어 하나 또는 여러 개의 상기 컨스트럭트는 표준 형질전환 기술에 의해 포유류 배아의 게놈 내로 도입된다.
예시적 실시태양에서 본 발명의 넉아웃 비-인간 동물은 비-인간 동물의 생식세포 내로 전이유전자를 도입시킴으로서 생성된다. 다양한 발단 단계에서의 배아 타겟 세포는 전이유전자를 도입시키는데 이용돌 수 있다. 다른 방법들은 배아 타겟 세포의 발달 단계에 따라 다르게 이용된다. 본 발명을 실행하는데 이용된 동물의 특정한 라인(들)은 일반적인 양호한 건강, 양호한 배아 생산량, 배아 내에서의 양호한 전핵 시정도 및 양호한 생식 적합성에 대해 선택된다. 더욱이 일배체형은 유의적인 인자이다.
배아 내로의 전이유전자의 도입은 예를 들어 현미주사, 일렉트로포레이션 또는 리포펙션과 같은 당분야에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 GPR12 수용체 전이유전자는 수정된 포유류 수정란(들)의 전핵 내로 컨스트럭트의 현미주사에 의해 포유류에 도입되어 컨스트럭트의 하나 이상의 카피가 발달하는 포유류(들)의 세포 내에서 유지되게 할 수 있다. 전이유전자 컨스트럭트의 수정란 내로의 도입 후 수정란은 다양한 시간 동은 시험관 내에서 인큐베이트되거나 대리 숙주 또는 둘 모두 내로 재이식된다. 성숙기로의 시험관 내에서의 인큐베이션은 본 발명의 범위 내에 있다. 일반적인 방법의 하나는 종에 따라 다르게 약 1∼7일간 시험관 내에서 배아를 인큐베이트한 후 대리 숙주 내로 이들을 재이식하는 것이다.
형질전환적으로 조작된 배아의 자손은 조직 세그먼트의 서던 블럿 분석에 의해 컨스트럭트 존재에 대해 시험될 수 있다. 외생적 클론된 컨스트럭트의 하나 이상의 카피가 넉아웃 배아와 같은 게놈 내로 통합되어 안정하게 유지되면 형질전환적으로 추가된 컨스트럭트를 지닌 영구적인 넉아웃 포유류 라인을 수립하는 것이 가능하다.
넉아웃 변화된 포유류의 새끼는 출생 후 자손 게놈 내로 컨스트럭트의 통합에 대해 분석될 수 있다. 바람직하게는, 본 분석은 자손으로부터의 염색체 물질 상에 원하는 재조합 단백질 생성물 또는 그의 세그먼트를 코드하는 DNA 서열에 상응하는 프로프를 하이브리다이즈함으로서 달성된다. 그의 게놈 내에 컨스트럭트의 적어도 하나 이상의 카피를 포함한 것으로 나타난 이들 포유류 자손은 성숙기로 생장된다.
본 발명의 목적을 위해 접합체는 완전한 생물로 발달할 수 있는 이배체 세포의 형태가 실질적으로 된다. 일반적으로 접합체는 생식체 또는 생식체들로부터 2개의 반수체 핵의 융합에 의해 자연적으로 또는 인공적으로 형성된 핵을 포함한 난으로 구성될 것이다. 따라서 생식체 핵은 자연적으로 양립가능한 것 즉, 분화를 수행하고 기능적인 생물체로 발달할 수 있는 생존 가능한 접합체를 유발하는 것이어야 한다. 일반적으로 정배수성 접합체가 바람직하다. 이수성 접합체가 수득되면 염색체 수는 생식체 기원의 생물체의 정배수성 수에 대해 하나 이상까지 변화되지 않아야 한다.
유사한 생물학적 고찰에 더하여 물리적인 고찰도 접합체의 핵 또는 접합체 핵의 일부를 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외생적 유전 물질의 양(즉, 부피)을 좌우한다. 어떠한 유전 물질도 제거되지 않으면 첨가될 수 있는 외생적 유전 물질의 양은 물리적으로 분열되지 않는 한 흡수도리 수 있는 양까지로 제한된다. 일반적으로 삽입되는 외생적 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않을 것이다. 첨가의 물리적 효과는 접합체를 물리적으로 파괴할 정도로 크지 않아야 한다. 수득되는 접합체의 외생적 유전 물질을 포함한 유전 물질은 기능성 생물체로 분화 및 발달을 생물학적으로 개시하고 유지시킬 수 있어야 하기 때문에 DNA 서열의 수 및 다양성의 생물학적 제한은 특정한 접합체 및 외생적 유전 물질의 기능에 따라 달라질 것이고, 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
접합체 내로 첨가되는 전이유전자 컨스트럭트 카피 수는 첨가되는 외생적 유전 물질의 총량에 따라 달라지고, 유전적 형질전환이 발생할 수 있게 하는 양이 될 것이다. 단지 이론적으로는 하나의 카피가 필요하다; 그러나 일반적으로 하나의 카피가 기능적임을 보증하기 위해 예를 들어 1,000∼20,000개 카피의 전이유전자 컨스트럭트와 같은 많은 카피가 이용된다. 본 발명에 있어서, 외생적 DNA 서열의 표현형적 발현을 증가시키기 위해 각각의 삽입된 외생적 DNA 서열의 하나 이상의 기능성 카피를 지니는 것이 이로울 것이다.
핵 유전 물질 내로의 외생적 유전 물질의 첨가를 가능하게 하는 기술은 세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포성 또는 유전성 구조물을 파괴하지 않는 한 이용될 수 있다. 외생적 유전 물질은 현미주사에 의해 핵 유전 물질 내로 우선적으로 삽입된다. 세포 및 세포 구조물의 현미주사는 알려져 있고 당분야에 이용된다.
재이식은 표준 방법을 이용하여 달성된다. 일반적으로 대리 숙주는 마취되고, 배아는 난관 내로 삽입된다. 특정 숙주 내로 이식되는 배아의 수는 종에 따라 달라질 것이나, 일반적으로 자연적으로 생성하는 종의 자손 수에 비교가능할 것이다.
대리 숙주의 넉아웃 자손은 적당한 방법에 의해 전이유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 스크린된다. 스크리닝은 전이유전자의 적어도 일부분에 상보적인 프로브를 이용한 서던 블럿 또는 노던 블럿 분석에 의해 달성된다. 전이유전자에 의해 인코드된 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석은 전이유전자 생성물의 존재에 대한 스크리닝 방법에 대안적으로 또는 추가적으로 이용된다. 일반적으로, DNA는 말단 조직으로부터 제조되고 전이유전자에 대해 서던 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 대안으로, 어떠한 조직 또는 세포도 이러한 분석에 이용되더라도 가장 높은 수준에서 전이유전자를 발현하는 것으로 여겨지는 조직 또는 세포가 서던 분석 또는 PCR을 이용하여 전이유전자의 존재 및 발현에 대해 시험된다.
전이유전자의 존재를 평가하는 대안적인 또는 부가적인 방법은 제한없이 효소 및/또는 면역학적 분석과 같은 생화학적 분석, 특정한 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 플로우 시토메트리 분석(flow cytometric analysis) 등을 포함한다. 또한 혈액의 분석이 혈액 내 전이유전자 생성물의 존재를 검출할 뿐만 아니라 다양한 형태의 혈액 세포 및 다른 혈액 성분의 수준 상에서의 전이유전자의 효과를 평가하는데 유용하다.
또한 레트로바이러스 감염이 비-인간 동물 내로 전이유전자를 도입시키는데 이용될 수 있다. 발달성 비-인간 배아는 배반포 단계로 시험관 내에서 배양될 수 있다. 이러한 시간 동안 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 타겟이 될 수 있다(Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). 할구의 효과적인 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리에 의해 수득된다(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). 전이유전자를 도입하는데 이용되는 바이러스 벡터 시스템은 일반적으로 전이유전자를 운반하는 복제-결함성 레트로바이러스이다(Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152). 트랜스펙션은 바이러스-생성 세포의 단분자층 상에서 할구를 배양함으로서 용이하고 효과적으로 수득된다(Van der Putten, supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388). 대안으로 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생성 세포는 할구 내로 주입될 수 있다(Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628). 통합은 형질전환 비-인간 동물을 형성한 세포의 서브세트 내에서만 발생하기 때문에 대부분의 주조물은 전이유전자에 대해 모자이크일 것이다. 또한 주조물은 일반적으로 자손 내에서 분리될 게놈 내의 다른 위치에서 전이유전자의 다양한 레트로바이러스 감염을 포함한다. 더욱이 잉태중간 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 생식세포 내로 전이유전자를 도입하는 것이 가능하다(Jahner et al. (1982) 상동).
전이유전자 도입을 위한 타겟 세포의 세 번째 형태는 배아 줄기 세포(ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양되고 배아로 융합된 이식-전 배아로부터 수득된다(Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322:445-448). 전이유전자는 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스-매개 형질도입에 의해 ES 세포 내로 효과적으로 도입될 수 있다. 이후, 이러한 형질전환된 ES 세포는 비-인간 동물로부터의 배반포와 결합된다. 이후, ES 세포는 배아로 이주되고 수득되는 키메라 동물의 생식세포에 기여한다. Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474 참조.
또한 본 발명은 숙주 세포 내에서 GPR12 유전자를 기능적으로 분열시키기 위한 핵산 컨스트럭트에 관련된다. 핵산 컨스트럭트는 하기를 포함한다: a) 비-상동성 교체 부분; b) 비-상동성 교체 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역, 상기 첫 번째 상동은 첫 번째 GPR12 유전자 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하고; c) 비-상동성 교체 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역, 상기 두 번째 상동성 구역은 두 번째 GPR12 유전자 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하고, 상기 두 번째 GPR12 유전자 서열은 자연 발생적인 내생적 GPR12 유전자 내의 첫 번째 GPR12 유전자 서열의 다운스트림 위치를 지님을 특징으로 한다. 더욱이 핵산 분자가 숙두 세포 내로 도입될 때 상기 첫 번째 및 두 번째 상동성 구역은 숙주 세포 내의 핵산 컨스트럭트와 내생적 GPR12 유전자 사이의 상동성 재조합을 위한 충분한 길이이다. 바람직한 실시태양에서 비-상동성 교체 부분은 발현 수용체를 포함하고, 바람직하게는 lacZ 및 양성적 선택 발현 카세트를 포함하고, 바람직하게는 조절 요소(들)에 실시가능하게 결합된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함한다.
GPR12 GPCR 결함 형질전환 동물은 하기와 같이 생성된다:
(a) GPR12 유전자 타겟팅 벡터의 구축
마우스 GPR12 게놈 클론이 표준 기술을 이용하여 추정된 마우스 오픈 리딩 프레임 cDNA 서열(서열번호: 4)의 일부로부터 증폭된 프로브 서열을 이용하여 HGMP(Hintox, UK)로부터 수득된 마우스 거대 삽입 PAC 라이브러리로부터 분리된다. 이후, 분리된 마우스 GPR12 게놈 클론은 작은 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 표준 기술을 이용하여 GPR12 유전자의 구역 내에서 제한 지도화된다.
마우스 게놈 좌위가 부분적으로 시퀀스되어 상동성 암(arm)의 고안이 타겟팅 벡터 내로 클론되는 것이 가능하게 된다. 5' 및 3' 상동성 암으로 불리는 삭제되는 오픈 리딩 프레임의 측면 구역으로부터의 일반적으로 1kb와 5kb 사이의 크기인 2개의 DNA 구역이 타겟팅 벡터 내로 클론된다. 이들 암의 위치는 상동성 재조합 이벤트가 적어도 7개 이상의 트랜스-멤브레인 스패닝(spanning) 구역을 삭제함으로서 GPR12 유전자를 기능적으로 분열시키도록 선택된다. 삭제된 GPR12 서열이 촉진된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자로 구성된 선택 카세트의 업스트림의 내생적 유전자 발현 수용체(프레임-독립적 lacZ 유전자)로 구성된 비-상동성 서열로 교체되고 GPR12 유전자와 동일한 방향으로 배열될 때 타겟팅 벡터가 제조된다.
(b) 배아 줄기세포의 트랜스펙션 및 분석
배아 줄기세포(Evans and Kaufman, 1981)는 20% 태아 소 혈청, 10% 신생 송아지 혈청, 2 mM 글루타민, 비-필수 아미노산, 100 μM 2-멀캅토에탄올 및 500 u/ml 백혈병 억제 인자로 보충된 Dulbecco's Modified Eagles 배지 내에서 생장된다. 배지는 매일 교환되고 ES 세포는 3일마다 이차배양되었다. 5 ×106 ES 세포가 일렉트로포레이션에 의해 5 ㎍의 선형화된 플라스미드로 트랜스펙트되었다(25 μF 정전용량 및 400 볼트). 일렉트로포레이션 24시간 후 트랜스펙트된 세포가 200 ㎍/ml 네오마이신을 포함한 배지 내에서 9일간 배양되었다. 클론은 96 웰 플레이트 내로 채취뒤었고 상동성 재조합이 내생적 GPR12 유전자와 타겟팅 컨스트럭트 사이에서 발생한 클론을 확인하기 위해 PCR에 의해 스크린되기 전에 복제되고 확장된다. 일반적으로 양성 클론은 1∼5%의 비율로 확인된다. 확장되어 복제가 동결되게 하고 충분히 양질의 DNA가 외부 5' 및 3' 프로브를 이용한 타겟팅 이벤트의 서던 블럿 확인을 위해 제조되게 하는 이들 클론은 모두 표준 절차를 이용한다(Russ et al, 2000, Nature 2000 Mar 2; 404(6773):95-9).
(c) GPR12 결함 마우스의 생성
C57BL/6 암컷 및 수컷 마우스가 교미되고 배반포는 잉태 3.5일에 분리된다. 선택된 클론으로부터의 10∼12개 세포가 배반포 당 주입되고 7∼8개의 배반포가 의사임신된 F1 암컷의 자궁 내로 이식된다. 키메라 새끼의 새끼는 여러 높은 수준(100% 까지)의 아구티(agouti) 수컷을 포함하여 출생된다(아구티 외피 색은 타겟된 클론으로부터 전해진 세포의 기여를 나타낸다). 이들 수컷 키메라는 암컷 및 MF1 및 129마리 마우스와 교미되고, 생식세포 전달은 각각 아구티 외피 색 및 PCR 유전자타이핑에 의해 측정된다.
다른 비-인간 형질전환 동물
또한 GPR12 수용체의 과발현 또는 본 수용체의 저발현(underexpression)(적당한 대조군과 비교시)을 유발하는 비-인간 형질전환 동물이 본 발명에 따라 숙고된다.
본 동물은 수용체 기능의 작용제 및 길항제를 확인하는데 유용하고 또는 치료적으로도 유용하다.
항체
여기에 기술된 항체는 GPR12 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제로 이용된다.
본 발명의 목적으로 "항체"라는 용어는 반대에 대해 상술되지 않는 한 폴리클론, 단일클론, 키메라, 단일 체인, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 한정적이지 않다. 이러한 단편은 타겟 물질, Fv, F(ab') 및 F(ab')2 단편뿐만 아니라 단일 체인 항체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 사이트를 포함한 다른 합성 단백질에 대한 그들의 결합 활성을 보유한 전체 항체이 단편을 포함한다. 항체 및 그의 단편은 예를 들어 EP-A-239400에 기술된 바와 같이 인간화된 항체이다. 더욱이 예를 들어 미국특허 제5,545,807호 및 제6,075,181호에 기술된 바와 같이 전체 인간 변이가능 구역을 지닌 항체도 이용된다. 중화 항체 즉, 아미노산 서열 물질의 생물학적 활성을 억제하는 것이 진단 및 치료에 특히 바람직하다.
항체는 면역화 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하는 것과 같이 표준 기술에 의해 생성된다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 알려진 기술에 의해 항체를 발달시키는데 이용된다. 이러한 항체는 GPR12 단백질 또는 상동체, 단편 등에 특이적으로 결합할 수 있다.
폴리클론 항체가 바람직한 경우 선택된 포유류(즉, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한 면역원성 조성물로 면역화된다. 숙주 종에 따라 다르게 다양한 애쥬번트가 면역 반응을 증가시키는데 사용된다. 이러한 애쥬번트는 수산화알루미늄과 같은 Freund의 미네랄 겔 및 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 폴리음이온(polyanion), 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 및 디니트로페놀(dinitrophenol)과 같은 표면 활성 물질을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 정제된 아미노산 서열 물질이 전신 방어를 자극할 목적으로 면역적으로 타협된 개체에 투여될 경우 BCG(Bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 사용되는 인간 애쥬번트로 잠재적으로 유용하다.
면역화된 동물로부터의 혈청이 수집되고 알려진 절차에 따라 처리된다. 본 발명의 폴리펩타이드로부터 수득가능한 에피토프에 대한 폴리클론 항체를 포함한 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 포함하면 폴리클론 항체는 면역친화력 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클론 항혈청을 생성하고 처리하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 또한 이러한 항체가 제조되기 위해 본 발명은 동물 또는 인간 내에서 면역원으로 이용하기 위한 또다른 아미노산 서열로 합텐화된 본 발명의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득가능한 에피토프에 대해 지시된 단일클론 항체는 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 하이브리도만에 의해 단일클론 항체를 제조하기 위한 일반적인 방법론이 잘 알려져 있다. 영구적인 항체-생성 세포주는 세포 융합 및 B 림파구와 종양유전자 DNA의 직접적인 형질전환 또는 Epstein-Barr 바이러스로의 트랜스펙션과 같은 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 궤도 에피토프에 대해 생성된 단일클론 항체 패널은 다양한 목적에 대해 스크린된다; 즉, 아이소타입(isotype) 및 에피토프 친화력.
단일클론 항체는 배양액 내 연속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 이용하여 제조된다. 이들은 Koehler and Milstein (1975 Nature 256:495-497)에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
더욱이 "키메라 항체"의 생성을 위해 발달된 기술, 적당한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 지닌 분자를 수득하기 위한 인간 항체 유전자에 대한 마우스 항체 유전자의 스플라이싱(splicing)이 이용될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454). 대안으로, 단일 체인 항체의 생성에 대해 상술된 기술(미국특허 제4,946,779호)이 특정한 단일 체인 항체 물질을 생성하는데 개조될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득가능한 에피토프에 대해 지시된 단일클론 및 폴리클론 모두의 항체가 진단에 특히 유용하고, 중화하는 것은 수동적 면역치료에 유용하다. 특히, 단일클론 항체는 항-유전자형 항체를 유발시키는데 유용하다. 항-유전자형 항체는 보호가 요구되는 물질 및/또는 약제의 "내부 이미지"를 운반하는 면역글로불린이다. 항-유전자형 항체를 유발시키는 기술은 당분야에 알려져 있다. 또한 이들 항-유전자형 항체는 치료에 유용하다.
또한 항체는 Orlandi et al (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) 및 Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:293-299)에 개시된 바와 같이 림파구군 내의 생체 내 생성을 유도함으로서 또는 매우 특이적인 결합 반응물의 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 스크린함으로서 생성된다.
또한 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 특이적인 결합 사이트를 포함한 항체 단편이 생성된다. 예를 들어 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황화물 결합을 감소시킴으로서 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 대안으로, Fab 발현 라이브러리는 원하는 특이성을 지닌 단일클론 Fab 단편의 빠르고 용이한 확인을 가능하게 하도록 구조된다(Huse WD et al (1989) Science 256:1275-128 1).
또한 단일 체인 항체의 생성 기술(미국특허 제4,946,778호)이 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 단일 체인 항체를 생성하도록 개조될 수 있다. 또한 형질전환 마우스 또는 다른 포유류를 포함한 다른 생물체가 인간화된 항체를 발현하는데 이용된다.
따라서 본 발명자들은 GPR12 항체 또는 이를 포함한 조성물이 신경학적, 생식 호르몬 관련 및 어떤 다른 이상의 치료시 특정한 치료제가 된다. 이러한 신경학적 이상은 하나 이상의 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
진단적 분석
또다른 관점에서 본 발명은:
진단되는 환자로부터 표본 세포를 선택하는 단계;
상기 표본 세포 내의 GPR12 폴리펩타이드의 발현 수준 및/또는 기능적 활성을 건강한 개체로부터의 하나 이상의 대조군 표본/들과 비교하는 단계를 포함한
하기로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 이상의 진단을 위한 방법을 제공한다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
또한 본 발명은 진단 시약으로서 진단에 또는 유전적 분석에 이용하기 위한 GPR12 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 인코드하는 GPR12 펩타이드 리간드(뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 및 유도체)의 이용에 관한 것이다. 또한 GPR12 핵산(상동체, 변이체 및 유도체 포함)에 대해 상보적이거나 하이브리다이즈할 수 있는 핵산뿐만 아니라 GPR12 폴리펩타이드 및 GPR12 리간드 폴리펩타이드에 대한 항체도 이러한 분석에 유용하다.
기능장애와 관련된 GPR12 유전자 또는 다른 자연적 리간드 유전자의 돌연변이 형태의 검출은 GPR12 또는 그의 자연적 리간드의 저발현, 과발현 또는 변화된 발현을 유발하는 질병의 진단 또는 질병에 대한 민감성에 첨가하거나 이를 정의할 수 있는 진단 도구를 제공할 것이다. GPR12 유전자(대조군 서열을 포함) 내 돌연변이를 지닌 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출된다.
예를 들어 DNA는 환자로부터 분리되고 GPR12의 DNA 다형성 패턴이 측정된다. 확인된 패턴은 GPR12의 과발현, 저발현 또는 비정상 발현과 관련된 질병에 걸린 것으로 알려진 환자의 대조군과 비교된다. GPR12 관련 질병과 관련된 유전자 다형성 패턴을 발현하는 환자가 확인된다. GPR12 또는 메타스틴 유전자의 유전적 분석은 당분야에 알려진 기술에 의해 수행된다. 예를 들어 개체는 RFLP 또는 SNP 분석 등에 의해 GPR12 대립유전자의 DNA 서열을 측정함으로서 스크린된다. 환자는 GPR12에 대한 유전자 서열 또는 그의 발현을 조절하는 서열 내의 DNA 다형성 존재를 검출함으로서 GPR12의 과발현, 저발현 또는 비정상 발현과 관련된 질병에 대한 유전적 경향을 지니는지 확인된다.
이후 확인된 환자는 GPR12 관련 질병을 예방하기 위해 또는 더욱 적극적으로는, GPR12 관련 질병의 초기 단계에서 질병의 발병 또는 발달을 예방하기 위해 치료될 수 있다. GPR12 관련 질병은 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병을 포함한다.
바람직한 실시태양에서 GPR12 관련 질병은 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병 중의 어느 하나를 포함한다.
또한 본 발명은 GPR12 관련 질병과 관련된 환자의 유전적 다형성 패턴의 확인을 위한 키트를 개시한다. 키트는 유전적 다형성 패턴을 측정하기 위한 방법을 수집하는 DNA 표본을 포함하고, 이는 GPR12 관련 질병에 대한 환자의 민감성을 측정하기 위해 대조군 표본과 비교된다. 또한 GPR12 폴리펩타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드(또는 그의 단편)에 대한 항체를 포함한 GPR12 관련 질병의 진단용 키트가 제공된다.
진단용 핵산은 혈액, 소변, 타액, 조직 생체검사 또는 검시 물질로부터와 같은 피험 세포로부터 수득된다. 바람직한 실시태양에서 DNA는 환자의 손끝을 찔러 흡수 제지 상에 수집된 혈액으로부터 수득된 혈액 세포로부터 수득된다. 또다른 바람직한 실시태양에서 혈액은 AmpliCardTM 상에 수집된다(University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF).
DNA는 검출을 위해 직접적으로 이용되거나 분석 전에 PCR 또는 다른 증폭 기술을 이용하여 효소적으로 증폭된다. 목적 유전자 내에서 특정한 다형성 DNA 구역을 타겟하는 올리고뉴클레오타이드 DNA 프라이머가 제조되어 PCR 반응시 타겟 서열의 증폭이 달성된다. 또한 RNA 또는 cDNA가 유사한 방식으로 주형으로서 이용된다. 이후, 주형 DNA로부터 증폭된 DNA 서열은 증폭된 서열 내에 존재하는 유전적 다형성을 측정하기 위해 제한효소를 이용하여 분석되어 환자의 유전적 다형성 프로파일을 제공한다. 제한 단편 길이는 겔 분석에 의해 확인된다. 대안으로, 또는 결합되어 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 분석과 같은 기술이 이용된다.
검출 및 삽입은 정상적인 유전형과 비교시 증폭된 생성물의 크기 내 변화에 의해 검출될 수 있다. 점돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 GPR12 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈시킴으로서 확인될 수 있다. 완벽하게 매치된 서열은 RNase 분해 또는 녹는점의 차이에 의해 미스매치된 이중나선과 구별될 수 있다. 또한 DNA 서열 차이는 변성제로 또는 그것 없이 DNA 단편의 전기영동 이동도의 변화 또는 직접적인 DNA 시퀀싱 등에 의해 검출된다. Myers et al, Science (1985)230:1242 참조. 또한 특정한 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 분석 또는 화학제 분열 방법에 의해 나타난다. Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401 참조. 또다른 실시태양에서 GPR12 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편을 포함한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 배열은 유전적 돌연변이의 효과적인 스크리닝을 수행하도록 구조될 수 있다. 배열 기술 방법은 잘 알려져 있고 일반적인 적용성을 지니고 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 변이성을 포함한 분자 유전학의 다양한 질문을 처리하는데 이용될 수 있다(예를 들어 M.Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996) 참조).
단일나선 형상 다형성(SSCP)은 돌연변이와 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동도 차이를 검출하는데 이용된다(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, see also Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). 표본 및 대조군 GPR12 핵산의 단일-나선 DNA 단편은 변성되고 복원되게 된다. 단일-나선 DNA 단편의 이차구조는 서열에 따라 달라지고 전기영동 이동도 내 수득된 변화는 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 한다. DNA 단편은 표지된 프로브로 표지되거나 검출된다. 분석의 민감도는 이차구조가 서열 변화에 더욱 민감한 RNA(DNA 보다는)를 이용함으로서 증가된다. 바람직한 실시태양에서 주요 방법은 전기영동 이동도 내 변화에 기반하여 개별적인 이중나선 이형이중나선(heteroduplex) 분자에 대한 이형이중나선 분석을 이용한다(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
진단 분석은 기술된 방법에 의한 GPR12 유전자 내 돌연변이 검출을 통한 박테리아성, 진균성, 원생동물성 및 바이러스성 감염과 같은 감염, 특히 HIV-1 또는 HIV2에 의해 유발된 감염; 통증; 암; 당뇨병, 비만; 식용부진; 식용항진; 파킨슨병; 혈전증; 급성 심장마비; 저혈압; 고혈압; 발기부전; 폐뇨; 골다공증 및 골석화증과 같은 대사성 골 질환; 협심증; 심근경색; 궤양; 천식; 알레르기; 류머티즘관절염; 장염질환; 민감성 장 증후군; 양성 전립선비대증; 및 헌팅턴병 또는 질르 드라 뚜레 증후군과 같이 불안, 정신분열증, 조울증, 섬망, 치매, 중증정신지체 및 이상운동증을 포함한 정신 또는 신경 장애에 대한 민감도를 진단하거나 측정하기 위한 과정을 제공한다.
특히 바람직한 실시태양에서 진단 분석은 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병에 대한 민감도를 진단하거나 측정하는데 이용된다.
GPR12 폴리펩타이드 및 핵산의 존재는 표본 내에서 검출된다. 따라서 상기 목록된 감염 및 질병은 피험체로부터 유도된 표본으로부터 GPR12 폴리펩타이드 또는 GPR12 mRNA의 비정상적으로 감소되거나 증가된 수준을 검출하는 것을 포함한 방법에 의해 진단될 수 있다. 표본은 발현 수준 또는 패턴 내 공간적 또는 시간적 변화를 포함하여 증가되거나 감소되거나 그렇지 않은 경우 비정상적인 GPR12 발현과 관련된 질병에 걸리거나 걸린 것으로 의심되는 생물체로부터의 세포 또는 조직 표본을 포함한다. 이러한 질병에 걸리거나 걸린 것으로 의심되는 생물체 내의 GPR12 발현 수준 또는 패턴은 질병의 진단 수단으로서 정상적인 생물체 내 발현 수준 또는 패턴과 유용하게 비교된다.
따라서 일반적으로 본 발명은 표본을 상기 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브과 접촉시키고, 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터링함으로서 표본 내 GPR12 핵산을 포함한 핵산의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 예를 들어 핵산 프로브는 GPR12 핵산 또는 그의 일부분에 특이적으로 결합하고, 검출된 2개 사이에 결합하고; 복합체 자체의 존재도 검출된다.
더욱이 본 발명은 표본을 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고, 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터링함으로서 GPR12 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이는 항체와 폴리펩타이드 사이에 형성된 복합체의 존재를 모니터링하거나 폴리펩타이드와 항체 사이의 결합을 모니터링함으로서 편리하게 달성된다. 2개의 실체 사이의 결합을 검출하는 방법은 당분야에 알려져 있고, FRET(형광 공명 에너지 전이), 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
감소되거나 증가된 발현은 예를 들어 PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블럿팅 및 다른 하이브리디제이션 방법과 같은 폴리뉴클레오타이드의 정량화에 대해 당분아에 잘 알려진 어떠한 방법도 이용하여 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 숙주로부터 유도된 표본 내에 GPR12와 같은 단백질 수준을 측정하는데 이용될 수 있는 분석 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 분석은 방사면역측정법, 경쟁-결합 분석, 웨스턴 블럿 분석 및 ELISA 분석을 포함한다.
본 발명은 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병 중의 하나를 포함한 질병 또는 질병에 대한 민감도에 대한 진단 키트에 관한 것이다.
특히 바람직한 진단 키트는 하기 중의 하나의 질병 또는 그에 대한 민감도를 검출하거나 진단하는데 이용된다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
진단 키트는 GPR12 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편; 상보적 뉴클레오타이드 서열; GPR12 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 GPR12 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다.
예방 및 치료 방법
본 발명은 과도한 양 및 불충분한 양의 GPR12 폴리펩타이드 활성 모두에 관련된 비정상 상태를 치료하는 방법을 제공하고, GPR12 폴리펩타이드, 그의 결합 단백질 및/또는 이를 인코드하는 핵산이 신경학적, 생식 호르몬 관련 및 어떤 다른 이상의 치료에 특정하게 이용됨을 고려한다. 이러한 신경학적 이상은 하나 이상의 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병.
GPR12의 활성이 과도한 경우 일부 접근이 유용하다. 하나의 접근은 GPR12에 대한 리간드의 결합을 차단하거나 두 번째 신호를 억제하여 비정상 상태를 완화시킴으로서 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 약제적으로 수용가능한 담체와 함께 상기 기술된 바와 같은 억제제 화합물(길항제)을 피험체에 투여하는 것을 포함한다.
또다른 접근으로, 내생적 GPR12와 경쟁하며 리간드에 결합할 수 있는 GPR12 폴리펩타이드의 용해성 형태가 투여된다. 이러한 경쟁자의 일반적인 실시태양은 GPR12 폴리펩타이드의 단편을 포함한다.
또다른 접근으로, 내생적 GPR12 폴리펩타이드를 인코드하는 유전자의 발현이 발현 억제 기술을 이용하여 억제될 수 있다. 이러한 알려진 기술은 내부적으로 생성되거나 별도로 투여되는 안티센스 서열의 이용을 포함한다. 예를 들어 O'Connor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988) 참조. 대안으로, 유전자와 3중 헬릭스를 형성하는 올리고뉴클레오타이드가 공급될 수 있다. 예를 들어 Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360 참조. 이들 올리고머는 그 자체로 투여되거나 적절한 올리고머가 생체 내에서 발현될 수 있다.
GPR12의 저-발현 및 그의 활성에 관련된 비정상 상태를 치료하기 위해 일부 접근이 유용하다. 하나의 접근은 약제적으로 수용가능한 담체와 결합하여, GPR12에 결합된 리간드를 모방하는 화합물 즉, 상기 기술된 작용제의 치료적으로 효과적인 양을 피험체에 투여하여 비정상 상태를 완화시키는 것을 포함한다. 대안으로, 피험체 내에서 관련 유전자에 의해 GPR12의 내성적 생성에 영향을 미치기 위해 유전자 치료가 이용된다. 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 기술된 바와 같이 복제 결함 레트로바이러스 벡터 내에서 발현을 위해 설계된다. 이후, 레트로바이러스 발현 컨스트럭트는 분리되고 본 발명의 폴리펩타이드를 인코드하는 RNA를 포함한 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질도입된 팩키징 세포 내로 도입되어 팩키징 세포는 목적 유전자를 포함한 감염성 바이러스 입자를 생성하게 된다. 이들 생성자 세포는 생체 내에서 세포를 설계하고 생체 내에서 폴리펩타이드를 발현하기 위해 피험체에 투여된다. 유전자 치료의 개요를 위해 Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (and references cited therein) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)를 참조.
포뮬레이션 및 투여
GPR12 폴리펩타이드의 용해성 형태와 같은 펩타이드 및 작용 제 및 길항제 펩타이드 또는 작은 분자가 적당한 약제적 담체와 결합하여 포뮬레이트된다. 이러한 포뮬레이션은 치료적으로 유효량의 펩타이드 또는 화합물 및 약제적으로 수용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 포뮬레이션은 투여 형태에 적합해야 하고 당분야에 만족스러워야 한다. 또한 본 발명은 본 발명의 전술된 조성물의 하나 이상의 성분으로 충진된 하나 이상의 컨테이터를 포함한 약제적 팩 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 다른 화합물은 단독으로 또는 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 컨쥬게이트되어 이용된다.
약제적 조성물의 전신 투여의 바람직한 형태는 일반적으로 정맥내 주사에 의한 주사를 포함한다. 피하, 근육내 또는 복강내와 같은 다른 주사 루트가 이용될 수 있다. 전신 투여에 대한 대안적 수단은 담즙염 또는 푸시딘산(fusidic acid) 또는 다른 세정제와 같은 침투제를 이용하여 점막성 및 경피성 투여를 포함한다. 더욱이 장 또는 캡슐화된 포뮬레이션 내로 포뮬레이트되면 경구 투여가 가능하다. 또한 이들 화합물의 투여는 국부성이고/또는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 집중된다.
필요한 투여량 범위는 펩타이드의 선택, 투여 루트, 포뮬레이션 특성, 피험체 조건의 특성 및 진료하는 의사의 판단에 따라 달라진다. 그러나 적당한 투여량은 0.1∼100 ㎍/피험체 kg의 범위이다. 그러나 유용한 다양한 화합물 및 다양한 루트의 투여의 다른 효율의 견지에서 필요한 투여량의 다양한 변화가 예상된다. 예를 들어 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여보다 더 높은 투여량을 필요할 것으로 예상된다. 이들 투여량 수준의 변화는 당분야에서 이해되고 있는 최적화를 위한 표준 경험적 루틴을 이용하여 조정될 수 있다.
또한 치료에 이용되는 폴리펩타이드가 피험체 내에서 내생적으로 생성될 수 있고, 치료 양식에서 종종 상기 기술된 "유전자 치료"로 표기된다. 따라서 예를 들어 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 이용함으로서 생체 외에서 폴리펩타이드를 인코드하기 위해 피험체로부터의 세포가 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로 설계된다. 이후 세포는 피험체 내로 도입된다.
약제적 조성물
또한 본 발명은 GPR12 폴리펩타이드, 그의 결합 분자 또는 본 발명에 따라 이들을 인코드하는 핵산의 치료적으로 유효한 양 및 선택적으로는 약제적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제(그의 결합 포함)를 투여하는 것을 포함한 약제적 조성물을 제공한다.
약제적 조성물은 인간 또는 인간의 동물 용법 및 수의 약물용이고, 일반적으로 하나 이상의 약제적으로 수용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함할 것이다. 치료적으로 이용하기 위한 수용가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약제적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 루트 및 표준 약제적 실행에 대해 선택될 수 있다. 약제적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 적당한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들) 용해제(들)을 포함한다.
방부제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약제적 조성물에 제공된다. 방부제의 예는 안식향산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 산화방지제 및 현탁제도 이용된다.
다른 전달 시스템에 따라 다른 조성물/포뮬레이션 필요조건이 있다. 예로서 본 발명의 약제적 조성물은 미니-펌프를 이용하여 또는 흡입제 또는 섭취 용액용 비강 스프레이 또는 에어로졸과 같은 점막 루트에 의해 또는 정맥내, 근육내 또는 조성물이 피하 루트에 의한 전달용 주사 형태에 의해 포뮬레이트되어 비경구적으로 전달되도록 포뮬레이트된다. 대안으로, 포뮬레이션은 양 루트에 의해 전달되도록 고안된다.
약제가 위장 점막을 통해 점막으로 전달되는 경우 위장관을 통한 운반 동안 안정하게 유지되어야 하고; 예를 들어 단백질분해성 분해에 대해 저항적이고, 산성 pH에 대해 안정적이고 담즙의 세정 효과에 저항적이어야 한다.
적당한 경우 약제적 조성물은 좌약 또는 페서리의 형태로 흡입에 의해, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 더스팅 파우더 형태로 국부적으로, 피부 패치의 이용에 의해, 전분 또는 락토스와 같은 부형제를 포함한 정제 형태 또는 캡슐 또는 오블(ovule) 단독 또는 부형제와 결합하여 또는 향미제 또는 착색제를 포함한 엘릭서(elixir), 용액 또는 현탁액의 형태로 경구 내로 투여될 수 있거나, 이들은 예를 들어 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 비경구적으로 주사될 수 있다. 비경구 투여의 경우 조성물은 혈액과 등장액을 이루기 위해 충분한 염 또는 모노사카라이드와 같은 다른 물질을 포함한 멸균 수용액 형태로 가장 바람직하게 이용된다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 통상의 방법으로 포뮬레이트될 수 있는 정제 또는 마름모형 정제(lozenge)의 형태로 투여된다.
투여
일반적으로 의사는 개별적인 피험자에 가장 적당한 실질적 투여량을 결정할 것이고, 이는 연령, 체중 및 특정 환자의 반응에 따라 달라질 것이다. 하기 투여량은 평균 경우의 예시이다. 물론, 더 높거나 낮은 투여량 범위가 장점인 개별적 경우도 있을 수 있다.
본 발명의 약제적 조성물은 직접적인 주사에 의해 투여된다. 조성물은 비경구적, 점막성, 근육내, 정맥내, 피하, 안구내 또는 경피성 투여를 위해 포뮬레이트된다. 일반적으로, 각각의 단백질은 0.01∼30 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 0.1∼1 mg/kg 체중의 투여량으로 투여된다.
"투여된"이라는 용어는 바이러스성 또는 비-바이러스성 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스성 전달 메카니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-결합 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정적이지 않다. 비-바이러스성 전달 메카니즘은 지질 매개 운송, 리포솜, 면역리포솜, 리포펙틴, 양이온성 양친매성화합물(CFAs) 및 그의 결합을 포함한다. 이러한 전달 메카니즘의 루트는 점막, 비강, 구강, 비경구, 위장, 국부 또는 설하 루트를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"투어된"이라는 용어는 예를 들어 흡입용 비강 스프레이, 에어로졸과 같은 또는 섭취가능한 용액과 같은 점막 루트; 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 루트와 같은 전달이 주사가능 형태인 비경구 루트를 또는 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"동시-투여된"이라는 용어는 본 발명의 폴리펩타이드 및 애쥬번트와 같은 첨가 실체 각각의 투여 사이트 및 시간이 면역 시스템의 필요한 조절이 달성되도록 되는 것을 의미한다. 따라서 폴리펩타이드 및 애쥬번트가 동일한 순간 및 동일한 사이트에 투여되면 애쥬번트와 다른 시간 및 다른 사이트에 폴리펩타이드를 투여하는 것 보다 유리하다. 폴리펩타이드 및 애쥬번트는 동일한 전달 수단으로 전달되고 - 폴리펩타이드 및 항원은 결합되고/또는 풀리고/또는 유전적으로 일반적으로 결합되고/또는 풀린다.
폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드 및 선택적으로 애쥬번트가 단일 투여량 또는 다수의 투여량으로 숙주 피험체에 개별적으로 투여되거나 동시-투여된다.
본 발명의 약제적 조성물은 주사(비경구, 피하 및 근육내 주사를 포함), 비강내, 점막, 경구, 질내, 요도 또는 안구 투여와 같은 다른 많은 루트에 의해 투여된다.
본 발명의 약제적 조성물은 통사적으로 예를 들어 피하적으로 또는 근육내로 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 투여 형태에 적당한 부가적인 포뮬레이션은 좌약 및 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 일반적인 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10% 범위의 활성 성분을 포함한 혼합물로부터 형성되고, 1∼2%이다. 구강 포뮬레이션은 예를 들어 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등의 약제 등급으로서 일반적으로 이용되는 부형테를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지속성 분비 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되면 동결건조된 물질은 투여 전에 현탁액과 같이 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충제 내에서 효과적이다.
본 발명은 본 발명을 한정하지 않는 실시예를 참조하여 기술될 것이다.
도 1은 GPR12 넉아웃 전 마우스 GPR12의 게놈 좌위 구조를 나타낸다.
도 2는 GPR12 넉아웃 후 마우스 GPR12의 게놈 좌위 구조를 나타낸다.
도 3은 관련된 제한 사이트를 포함한 GPR12의 상동성 재조합에 이용되는 타겟팅 벡터의 구조를 나타낸다.
도 4는 전자 노던을 이용한 GPR12에 대한 유전자 발현 패턴을 나타낸 것이다.
도 5는 로타로드(rotarod) 시험시 수컷 넉아웃 마우스의 수행을 나타낸 것이다.
도 6은 걸음걸이의 평가 결과를 나타낸다; 돌연변이 좌측 트랙 및 야생형 우측 트랙.
도 7은 5'프로브FII로부터 3'프로브R1까지의 게놈 좌위를 나타낸 것이다.
도 8은 꼬리 플릭 시험시 수컷 넉아웃 마우스의 평가 결과를 나타낸 것이다(-/- 넉아웃 돌연변이, +/+ 야생형 대조군).
도 9는 핫 플레이트 시험시 수컷 넉아웃 마우스의 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 워터메이즈(watermaze) 시험의 평가 결과를 나타낸 것이다(야생형 열린 사각형; 넉아웃 마우스 닫힌 원형).
도 11a는 밤새 마우스 기어오름의 Laboras 평가 결과를 나타낸 것이고(야생형 X; 넉아웃 닫힌 삼각형); 도 11b는 밤새 마우스 기어오름 빈도의 Laboras 평가 결과를 나타낸 것이다(야생형 X; 넉아웃 닫힌 삼각형).
도 12는 넉아웃 마우스의 크레아틴 키나제 수준의 평가 결과를 나타낸 것이다(1. 야생형 암컷 3월령; 2. 넉아웃(KO) 암컷 3월령; 3. 야생형 암컷 9월령; 4. 넉아웃(KO) 암컷 9월령; 5. 야생형 수컷 3월령; 6. 넉아웃(KO) 수컷 3월령; 7. 야생형 수컷 9월령; 8. 넉아웃(KO) 암컷 9월령).
(실시예 1) 형질전환 GPR12 넉아웃 마우스
GPR12 유전자 타겟팅 벡터의 구축
마우스 GPR12 유전자를 포함한 PAC가 코딩 서열 부분을 포함한 방사성 표지된 PCR 단편을 이용하여 확인되었다. 또한 코딩 서열 측면의 게놈 서열이 PCR 기술에 의해 고정된 제한 사이트를 이용하여 하우스에서 수득되었다. 8 kb 갭된 콘티그(contig)가 조립되었고 타겟팅 벡터의 디자인을 가능하기에 충분한 서열 정보 를 제공하였다. 이후의 생물정보학적 작업은 이러한 콘티그를 14 kb로 연장시켰고 손실 서열을 채웠다. 이러한 콘티그는 상동성 암의 고안이 타겟팅 벡터 내로 클론될 수 있게 하기 위해 충분한 측면 서열 정보를 제공하였다(관련 제한 사이트를 포함한 사용된 타겟팅 벡터의 구조는 도 3에 나타나 있음).
마우스 GPR12 유전자는 단일 코딩 엑손을 지닌다. 7tm 코딩 도메인의 시작 전 및 7tm 도메인의 전체를 포함한 코딩 엑손 일부를 제거하는 타겟팅 전략이 고안된다. 3.7 kb 5' 상동성 암 및 삭제되는 7tm-포함 구역 측면의 1.1 kb 3' 상동성 암이 PCR에 의해 증폭되고, 단편은 타겟팅 벡터 내로 클론된다. 암을 증폭시키는데 이용된 각각의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5' 말단이 합성되어 벡터 폴리링커의 클로닝 사이트와 경쟁가능하고 암 자체에는 없는 절단이 드문 제한 효소에 대한 다른 인식 사이트를 포함하게 된다. GPR12의 경우 프라이머는 NotI/SpeI의 5' 암 클로닝 효소 및 AscI/FseI의 3' 암 클로닝 효소를 지닌 하기 서열 표에 목록되어 있다.
암 프라이머쌍(5'암F/5'암R)에 더하여 GPR12 좌위에 특이적인 또다른 프라이머가 하기 목적으로 고안된다: 각 암의 외부에 그 이상으로 확장하는 바-반복 게놈 DNA의 2개의 짧은 150-300 bp를 증폭시키고, 추정된 타겟 클론 내에서 타겟된 좌위의 서던 분석을 가능하게 하는 5' 및 3' 프로브 프라이머쌍(5'prF/5'prR 및 3'prF/3'prR); 벡터 특이적 프라이머, 본 경우 Asc403으로의 멀티플렉스 PCR에 이 용시 야생형, 이형접합자 및 상동접합자 마우스 사이에서 분화를 가능하게 하는 마우스 유전자타이핑 프라이머쌍(hetF 및 hetR); 및 마지막으로 3' 암 구역의 말단 다운스트림을 어닐하고, 벡터의 3' 말단(neo36)에 특이적인 프라이머와 쌍을 형성시 타겟 이벤트 특이적 1.5 kb 앰플리머(amplimer)를 생성하는 타겟 스크리닝 프라이머(3'scr). 본 앰플리머는 원하는 게놈 변화가 발생하고 무작위로 통합된 벡터 카피를 포함한 클론의 백그라운드로부터 정확히 타겟된 세포의 확인을 가능하는 세포로부터의 주형 DNA로부터 유도될 수 있다. 타겟팅 전략에 이용된 이들 프라이머의 위치 및 GPR12 좌위의 게놈 구조가 서열번호 14(도 7)에 나타나 있다.
Figure 112006004789952-PCT00001
상동성 암의 위치는 모든 7개의 트랜스멤브레인 스패닝 구역을 삭제함으로서 GPR12를 기능적으로 분열시키도록 선택된다. 삭제된 GPR12 서열이 GPR12 유전자와 동일한 방향으로 배열된 촉지된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자로 구성된 선택 카세트의 업스트림의 내생적 유전자 발현 수용체(프레임 독립적 lacZ 유전자)로 구성된 비-상동성 서열로 교체될 때 타겟팅 벡터가 제조된다.
5' 및 3' 상동성 암이 타겟팅 벡터 pTK5IBLMNL 내로 클론되면(도 5 참조) 매우 높게 순수한 DNA 제제가 표준 분자생물학 기술을 이용하여 제조된다. 20 ㎍의 신선하게 제조된 내독소가 없는 DNA는 암피실린 저항성 유전자와 복제의 박테리아 오리진 사이의 벡터 백본 내 특이적 사이트에 존재하는 또다른 드물게-절단하는 제한효소 PmeI로 제한된다. 이후 선형화된 DNA는 일렉트포레이션을 위해 침전되고 100 ㎕의 인산 완충 식염수에 재현탁된다.
일렉트로포레이션 24시간 후 트랜스펙트된 세포가 200 ㎍/ml 네오마이신을 포함한 배지 내에서 9일간 배양된다. 상동적 재조합이 내생적 GPR12 유전자와 타겟팅 컨스트럭트 사이에서 발생한 클론을 확인하기 위해 클론은 96 웰 플레이트 내로 옮겨지고, 복제되고, PCR(상기 기술된 바와 같이 프라이머 3'scr 및 neo36을 이용)에 의해 스크린되기 전까지 확장된다. 양성 클론은 1∼5% 비율로 확인될 수 있다. 이들 클론은 확장되어 복제체가 동결되게 하고, 충분히 좋은 질의 DNA가 상기 기술된 바와 같이 제조된 외부 5' 및 3' 프로브를 이용한 타겟팅 이벤트의 서던 블럿 확인을 위해 제조되게 하고, 모두는 표준 절차를 이용한다(Russ et al, Nature 2000 Mar 2;404(6773):95-99). 진단성 제한효소로 분해된 DNA의 서던 블럿이 외부 프로브와 하이브리다이즈되면 상동적으로 타겟된 ES 세포 클론이 돌연변이 밴드뿐만 아니라 변화되지 않은 야생형 밴드의 존재에 의해 검증된다. 예를 들어, 5' 프로브를 이용하여 EcoRI 분해된 DNA가 5.5 kb 야생형 밴드 및 4.0 kb 타겟된 밴드를 제공할 것이고; 3' 프로브를 이용하여 BamHI는 3.9 kb 야생형 밴드 및 1.5 kb 타겟된 밴드를 제공할 것이다.
넉아웃 전의 마우스 GPR12의 게놈 좌위 구조가 도 1에 나타나 있다. 넉아웃 후의 마우스 GPR12의 게놈 좌위 구조가 도 2에 나타나 있다. 서던 검증에 관련된 효소 사이트에 주석이 달려 있다.
GPR12 GPCR 결함 마우의 생성
C57BL/6 암컷 및 수컷 마우스가 교미되고 배반포가 임신 3.5일에 분리된다. 선택된 클론으로부터의 10∼12개 세포가 배반포당 주사되고 7∼8개 배반포가 의사-임신 F1 암컷의 자궁 내로 이식된다. 키메라 새끼의 새끼는 여러 높은 수준(100% 까지)의 아구티(agouti) 수컷을 포함하여 출생된다(아구티 외피 색은 타겟된 클론으로부터 전해진 세포의 기여를 나타낸다). 이들 수컷 키메라는 암컷 및 MF1 및 129마리 마우스와 교미되고, 생식세포 전달은 각각 아구티 외피 색 및 PCR 유전자타이핑에 의해 측정된다.
PCR 유전자타이핑은 세 번째 벡터 특이적 프라이머(Asc403)로 프라이머 hetF 및 hetR를 이용하여 용해된 말단 클립 상에서 수행된다. 이러한 멀티플렉스 PCR은 야생형 좌위로부터(존재하는 경우), 219 bp 밴드를 제공하는 프라이머 hetF 및 hetR로부터 증폭을 가능하게 한다. hetF에 대한 사이트는 넉아웃 마우스 내에서 삭제되어 이러한 증폭은 타겟된 대립유전자로부터 실패할 것이다. 그러나 Asc403 프라이머는 3' 암의 바로 내부 구역으로 어닐하는 hetR 프라이머와 결합하여 타겟된 좌위로부터 441 bp 밴드를 증폭할 것이다. 따라서 이러한 멀티플렉스 PCR은 하기와 같은 새끼의 유전형을 나타낸다: 야생형 표본은 단일 219 bp 밴드를 나타낼 것이고; 이형접합성 DNA 표본은 219 bp 및 441 bp에서 2개의 밴드를 산출하고; 동성접합성 표본은 타겟 특이적 441 bp 밴드만을 나타낼 것이다.
(실시예 2)
B) 결과
Ⅰ) 유전자 발현 패턴
1) 전자 노던
전자 노던이 하기 기관에 발현되는 것으로 나타났다(도 16): 고환, 소장, 폐, 뇌, 심장 및 비장.
2) LacZ 염색된 구조의 목록
LacZ 염색은 뇌 내 특히, 후구, 조롱박겉질(후각), 선조체(이동 경로의 계획 및 조절, 또한 다양한 다른 실행적 기능 관련 인식 과정에 관련됨), 시상(청각, 몸감각 및 시각 감각 신호를 수용), 해마(학습 및 기억 통합에 중요함), 무릎핵(측면: 시각; 중앙: 청각) 및 피질 내의 애니(Annie)의 강한 발현을 나타내었다.
Ⅱ) 해부학적 관찰
일부 수컷은 그의 등에 백색 털 패치를 지녔다. 어떠한 명백한 해부학적 결함도 넉아웃 동물에서 관찰되지 않았다.
Ⅲ) 행동
모든 동물은 7 am에 불이 켜지는 12h 광/12h 암의 광-암 사이클 조건 하에서 먹이 및 물에 자유롭게 접근하도록 수용되었다. 동물은 일주기성 효과를 방지하기 위해 세트 시간에서 시험되었다.
시험은 돌연변이와 야생형 사이의 차이를 나타낸다.
a) 팝-맴(Pop-Map)
수컷 넉아웃 마우스는 반전된 그리드 및 선 운동(wire manoeuver) 상에서의 부족한 움켜쥠 수행을 나타내었다.
b) 로타로드(Rotarod)
수컷 넉아웃 마우스는 가속화된 로타로드 상에서 잘 수행하지 못했다. 암컷 돌연변이에 대해 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
이는 전뇌성 학습 및 운동 동시-배열 및 파킨슨병 및 헌팅턴 무도병과 같은 운동 장애의 지표이다.
c) 족문/걸음걸이 시험
돌연변이 수컷이 야생형 동물보다 넓은 발 위치를 지닌 비정상 걸음걸이를 지닌 것으로 관찰되었다.
d) 꼬리 튀기기 시험
돌연변이 수컷은 당업자에 알려진 통증에 대한 실험실 시험인 꼬리 튀기기 시험을 이용하여 시험되었다. 본 시험은 침해성 통증에 반응하는 넉아웃 마우스의 지표로서 이용되었다. 돌연변이는 과진통(hyperanalgesia)을 나타내는 열 유도 통증에 더욱 민감한 것으로 관찰되었다(도 8).
e) 핫 플레이트 시험
핫 플레이트 시험은 침해성 통증에 반응하는 넉아웃 마우스의 지표로서 이용되었다. 넉아웃 마우스는 짧은 열-유도 발-핥기 잠복기에 의해 증명된 바와 같이 열-유도 통증에 더욱 민감하였다. 본 시험은 GPR12 넉아웃 마우스의 꼬리-튀기기 시험에서 앞서 관찰된 과진통 표현형을 확인시킨다(도 9).
f) 워터메이즈(Watermaze) 시험
워터메이즈는 설치류에서 공간 학습 능력을 평가하는데 널리 이용된다. 학습은 꼬리를 가로질러 숨겨진 플랫폼에 도달하는 시감 감소로서 평가된다. 이들 데이터는 공간 단서를 이용하여 숨겨진 플랫폼의 위치에 대해 학습하는 능력 감소를 제안한다(도 10). 이러한 시험의 결손은 알츠하이머병, 노인성 치매 또는 일반적 학습 및 기억 장애와 같은 다양한 병리학 내 학습 및 기억 곤란을 나타낸다.
g) 라보라스(Laboras)
라보라스는 설치류가 장기간 동안 모니터되고 그의 운동이 평가될 수 있는 장기간 모니터링 시스템이다.
4. 요산(간 및 신장에서 관찰, 푸린 대사의 최종 생성물임): 3월령 수컷(∼15%) 및 9월령 수컷 내에서 증가됨(∼80%)(응혈, 감염, 신장 질환, 흡수불량, 간 손상 또는 과산성 신장 내에서 증가된 수준이 관찰됨).
5. 알부민: 9월령 수컷 내에서 증가됨(∼25%)(간 질환, 다발골수종에서 증가된 알부민이 관찰됨).
6. 아스파라긴산 아미노전이효소: 3 & 9월령 수컷에서 증가됨(∼80%)(급성 간세포 손상 또는 간염의 지표)
전체 결과는 간 또는 신장 기능장애를 나타낸다.
각 출원 및 특허의 수행 동안("출원 인용 문헌")을 포함한 본 문헌에 논의된 각각의 출원 및 특허 및 상기 출원 및 특허에서 인용되거나 참조된 각 문헌 및 각 출원 및 특허에서 인용되거나 논의된 제품에 대한 제조사의 지침 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다. 더욱이 본 명세서 내에 인용된 모든 문헌 및 본 명세서 내에서 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌 및 본 명세서에서 인용되거나 논의된 제품에 대한 제조사의 지침 또는 카달로그는 참고문헌에 포함된다.
본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이가 본 발명의 범위 및 정신에 위배되지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되더라도 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 과도하게 한정적이지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로, 생화학, 분자생물학 및 생명공학 또는 관련 분야 업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 형태의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다. 더욱이 하기 종속적 청구항의 특징의 결합은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 독립 청구항의 특징으로 이루어질 수 있다.
<110> Paradigm Therapeutics Limited <120> Receptor <150> GB 0321998.7 <151> 2003-09-19 <150> US 60/509,471 <151> 2003-10-08 <150> GB 0404309.7 <151> 2004-02-26 <150> US 60/548,653 <151> 2004-02-27 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 aaactcatgg ctgcctagag caacttg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 tggtgtgctt aagacttttg ttaccac 27 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 aaaaaagcgg ccgcaacagt cattcaagga gcaagaagtc 40 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ttttttacta gtgggagggg acagcggctg agatgttc 38 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 aaaaaaggcg cgccagaaag ccctctgcct catttgctg 39 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 tttttggccg gccgcttcag atgcaatttg ccctaccaac 40 <210> 7 <211> 27 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aaaaaaatga 120 gatgctggca agcagagaag caaagacaag cagagataaa tcaggtagga actaactgcc 180 cattgcctgg caaatgcttc ttgcagcttt tacttctttc ccatgggtta gtctagatct 240 gtctcagcca gacagtaaaa ggcattaatc tagtttgaac tagatttctg ctttgtggta 300 acaaaagtct taagcacacc aataaatacg gaatttgaaa taaagttaag ttacaacagt 360 cattcaagga gcaagaagtc ctcttttctt tgtcttaaac tgtagtacat ataatattta 420 gagtatattt aaatatatta aatatatgca aatttagaaa agttaaatat aagcgaagag 480 gaaggattga gtggtaatgc acagaagtta tgaaagggga tgtgaagaaa attatgtttc 540 tagttctaat tctgtgtgga gtttttgtct agtgatggat aagtgtataa gacatattca 600 catgtgaatg ccaaatgcca cagcttccat attataactg tatagatgtt ctctatggtg 660 tatgactttg gggctggtta attttggggt gtgtgtgtgt gtgtgtgtat tttaaaaatt 720 gggaagtttt ttttaatgat aaaggttttt tagggggata ggcaaattgg ggtacagctg 780 ctgccagcca cctggagtca ctgagttgtc ttatatacag gaggctggag gttcaagagg 840 tttctattgt tgtaacaaaa taccatgacc acagcaactt ctagaagaaa gactttaatt 900 agggttatag ttccagatgt tggagtccat gctcaggcac ctcaaacggt ctcagtgcta 960 ggtgtgcgcc tatgtaattc cttctttcca ctcctttcag gtttcaacac aggaccacac 1020 acgtctcagc acactgctgc cttcgcccag ccctgcccac tcacttcttt ctccttattt 1080 cccaaccatg ccacagagag tgaactccag gcttaaggaa cagcttaggg gcagggcaca 1140 ctaccatcaa tgtaagactg gattcaggtt ccacccttag ctctggggaa aacttggaca 1200 aactccatgg ctgagtaaat taagccagta aggtccaagt gcatgctgtt gccattggct 1260 tgaagggcat ccagcttgtc ctgtgaattt gcttttccag aactgtacaa ccaatgagag 1320 gctcctaaaa tttaaccagt tggtttgagc tgtcttttgt taaactgctt ttgtgtatat 1380 gaaaccattg accgcttttt ttttaaacaa cctgtttatt ttatgtatat taagtgtttg 1440 cttgtattgt gtgtaccttg tgcatgtaat gctccaggag gccagaagag ggcgtcgtat 1500 tccctggaac tggagttgca gatggttgtg agtcacctta tacgcgcctg gaactgaacc 1560 caggtccact gcaagagcag tcagagcatg taaccactga gccacctctc cagccccaca 1620 ttgctcattt cccattgctc tgttctaaaa atgcttccgc ttattacaaa gaaatgaaaa 1680 gagacaggag catcccttca cagcagtacc tgctacctgg gataatgttg atttttgtct 1740 taccactggt ccagggtgtg tctgtgagtg ctaagataat gtcttcgtga atttgttcac 1800 gcaggctttc aaacggtcct tgacgcaagt gatgtctcct ttccatacac acgactatta 1860 aactccatag aacctcgttt cttaaagtgt gacccgcagg tcggcatcac cagcatcttg 1920 ggactgacgc cgggacccca accccagaac tgctggtttc taagtcaagt ttcagaagtg 1980 ttgccgcagg gaatacagga ctcagaaaga gtcctggagc cttttggggg acatgagaag 2040 actcagcaga aaactcaaca gctccacgtg tcccaaagca gaatgtccag ggagagagtt 2100 cagaagcagt gtgagagctc aggttgggcg gaacggatct gctgcattat ggcaaggtca 2160 caccgggttt agtgtgttgc cttagtgaga aagggggaag gggcggctag aggaaggttg 2220 taaccaggga ggtgaaggga gggttttggt accaggagca tgacacggta gagacagctg 2280 ctgatggatg cgcgcggggc tggggctggg gtgggggaac atggggtaaa aagagatcta 2340 agacttggag cctggtaggc tggagtagga atttcagtga gacacagggg aggcagatgc 2400 atctgatgat aaccccatat gaagggtcct caggatcctt tgccttgcac aacattgagg 2460 tcacacggaa ataggacttt tctcctccca cctttaggct ggagagcgtg attaaattta 2520 agatctgatc cggttccagg atgagagaca caggctagtc cttttccggc aggcaacctt 2580 caggatctta accctagact ccgcggatga ggtacaggaa acaataaatt aataagtgtc 2640 acttgggtac ttaaatgaat tgggtttggg ccagtgcctg aaggaagctt ttgcaagaat 2700 gccctaaatg atttccactc gcgaacggct ccgagagtgc ctaataagtg cagctgggcg 2760 atctaagtag cagcagctcc tatccagtta agcgaacgtc cccaagggaa caataatttg 2820 cagaccggcc aactgcaatc taagagaggg agtcgcttgc tgttgtaagt ctcctccgcc 2880 agccctaacc tgcttacccc gcattcctcc tgttcatccc gaaaacccgg ccgtttacaa 2940 ttctttaggg gaaagcataa gaagccgagc cccagggtca agggcgcctc ggggaagcca 3000 caggatcaaa gtaggtcgcc agactctccg gccgttcgag tgggtcttcg catgactgtt 3060 gcaggcgggc gtccacggtg gcgggctccc gcccctcacg cagctgcgac ctgcgggggc 3120 gcgcgcagcc tcgtggggtt cccgcggatg cgcgcccggc ggggagcgcg gagggcggag 3180 agccgggcgc gagcaccgca gctcacctgc cgcgggcgcc accacggacg tgccacgcgg 3240 gtggcccgag ctattcggca gcactgaagg agccacccct cggccagggc gtgccaaggt 3300 gacccccggt aaccccctgc cccgcaggct gcgcgtcccc gctgctaggg gagcggtgcc 3360 aaatgcatgc atatctttct ctctgtctgt ctgggcacct ctgtggtaca cacctacctt 3420 ttttgtagcc cttgcactct gagcggtgca catgggagag actgggaccc cacccctttg 3480 tttgagtctg gaggtgtgtt tgggggtgtg ctcgcgcgtg aggtatgttt gggaagggtg 3540 ggagtttggg gcccttaaaa tattccaccc tcctgcagac ttgtggctgc tgggcggtgc 3600 tctctcagca gcccagatgt caaacagtyg ttggttttcg gcatgggaga tgcaattagc 3660 caatgtcggt tttcagcgtt ttggcaagtg tgcgagtgtg catgtgccgc ctcgggagtc 3720 ctgatccgtg tttccctcag agacaaacag catttcggtt gcagacttta gcttttgttt 3780 ttaattcctg aagctcgtgg cattttgaca ctgatagctg agcccagggt tgtctgtctt 3840 tctctgtgtg ttttgcatga tcttggattg gcaccctact gtacccaaac attaaaaagc 3900 ctgtctttcc gttgaagagg acaggggtta aaatgaacga agacccgaag gtcaatttaa 3960 gcgggctgcc tcgggactgt atagatgccg gtgctccaga gaacatctca gccgctgtcc 4020 cctcccaggg ctctgttgcg gagtcagaac ccgagctcgt tgtcaacccc tgggacattg 4080 tcttgtgcag ctcaggaacc ctcatctgct gtgaaaatgc cgttgtggtc cttatcatct 4140 tccacagccc cagcctgcga gcccccatgt tcctactgat aggcagcctg gctcttgcag 4200 acctgctggc tggcctggga ctcatcatca attttgtttt tgcgtacctg cttcagtcag 4260 aagccaccaa gctggtcacc atcggactca ttgtcgcctc tttctctgcc tctgtctgca 4320 gtttgctggc tattactgtg gaccgctacc tctcgctata ttacgccctg acgtaccact 4380 ccgagaggac cgtcaccttt acctatgtca tgctagtgat gctctgggga acctccatct 4440 gcctggggct gctgcccgtc atgggctgga actgcttgag ggacgagtcc acctgcagcg 4500 tggtcagacc tctcactaag aacaacgctg ccatcctctc catctccttc ctcttcatgt 4560 ttgctctgat gcttcagctc tacatccaga tttgtaagat tgtgatgagg cacgcccatc 4620 agatagccct gcagcaccac ttcctggcta catcgcacta tgtgactacc cggaaagggg 4680 tctcgaccct ggctctcatc ctagggacct ttgctgcctg ctggatgcct ttcaccctct 4740 attccttgat cgccgattac acctaccctt cgatctatac ctatgccacc ctcctgcccg 4800 ccacctacaa ttccatcatc aaccctgtca tttacgcttt cagaaaccaa gagatccaga 4860 aagccctctg cctcatttgc tgtgggtgca tcccttcctc gctgtctcag agagctcggt 4920 ctcccagcga tgtgtagcag ccttctcctc ataggacgct gcctctacca agcgctccca 4980 cctcccaggg cggccagtga tttccttcct taaattcttt gcactggatc tcacaagcag 5040 aagcaatgac atcttttaga cacgtattga cagtggaaat catcttacca gtgtttttta 5100 aaaaaaaaac aaaacaaaac tcgacttctc ggctcagcat tctgttgttt ggtttgggag 5160 ttaggatttg tttgtttgtt tgcttgtttg tttgtttgga gggtgtaatg ggacctcatg 5220 tggccatgaa attatacaaa agtctcggga ttttttaacc taggcttgaa aataaatcaa 5280 agttttaaag gaaactggag aaggaaatac tttttctgaa ggaaatactt tttttttttt 5340 aatcaaggta gatcttccat tctgtatgta tctaacagga taggagcttt gccatataac 5400 caaaatagtt tatataatta catttggaag ggcttgtgtt tatttctagg aattcagtaa 5460 taagtgacca gtaacagagg cgcgaactcc tttctttcct ttcagcagta gtgactgctc 5520 ttaagaatca ctttgcagtt tctctgtgtt acagtttggt atgcatggtt acctgtggca 5580 gtcagatcac taattgcaat attgccatgt taaacccaga attaaaagag tcattttttc 5640 ttcaatacag tttttgaaat atcctttcca aagtgagtct tgaaaaaaat gtttccaatt 5700 cctatatgaa gatagcactg gttagatttg tcattgtgat ttttaaaact ctagactggt 5760 ggttttcaga aaacaaaaga gaaaatatta ccagcatcta ttgaaagaag attttattta 5820 tttttaatat attctgagag aataaatggt gtgatactat taagaaatat acaaacatga 5880 cttttcaaat ctctatctat ggatacattg ttattcttac ttaagatgag tagaattaag 5940 tattataaat ggaaaatttt ctcattctgt tggtagggca aattgcatct gaagcaggtg 6000 gtctcctacc ttaacaacta ggtctgaggc acgcccagct aacatgactg gggtgtacca 6060 gctgtgtcct gtgtgctcat gcaggaatga ccatatgtct gatggtgaaa agtttaattt 6120 ccttttacca gaagacatcc tccatgcaac aaggactctg ctgcctgctt tcagaaagca 6180 aaggtttacc tgggaaatta ctacaagacg tgacttaaaa caccatacag agtaattatg 6240 tccaagtgtc attttctgtg aaagcagaca gatgtaagat acactgtccc tcagtttgca 6300 atgggctcat ggctgtgtct atacaggaag tggaagaatt cctgaatggc acatcaagac 6360 cagtatttca ggatccttgg tgaggggtca tttgtaatag 6400 <210> 15 <211> 6334 <212> DNA <213> Mus musculus (bottom strand of SEQ ID 14) <400> 15 agtaccttaa gaagagaagt ccgatccttc taccgaagtc ccattccacg tttgagtacc 60 gacggatctc gttgaactga ggttatgttc cttcttggta ggactcctcc tttttttact 120 ctacgaccgt tcgtctcttc gtttctgttc gtctctattt agtccatcct tgattgacgg 180 gtaacggacc gtttacgaag aacgtcgaaa atgaagaaag ggtacccaat cagatctaga 240 cagagtcggt ctgtcatttt ccgtaattag atcaaacttg atctaaagac gaaacaccat 300 tgttttcaga attcgtgtgg ttatttatgc cttaaacttt atttcaattc aatgttgtca 360 gtaagttcct cgttcttcag gagaaaagaa acagaatttg acatcatgta tattataaat 420 ctcatataaa tttatataat ttatatacgt ttaaatcttt tcaatttata ttcgcttctc 480 cttcctaact caccattacg tgtcttcaat actttcccct acacttcttt taatacaaag 540 atcaagatta agacacacct caaaaacaga tcactaccta ttcacatatt ctgtataagt 600 gtacacttac ggtttacggt gtcgaaggta taatattgac atatctacaa gagataccac 660 atactgaaac cccgaccaat taaaacccca cacacacaca cacacacata aaatttttaa 720 cccttcaaaa aaaattacta tttccaaaaa atccccctat ccgtttaacc ccatgtcgac 780 gacggtcggt ggacctcagt gactcaacag aatatatgtc ctccgacctc caagttctcc 840 aaagataaca acattgtttt atggtactgg tgtcgttgaa gatcttcttt ctgaaattaa 900 tcccaatatc aaggtctaca acctcaggta cgagtccgtg gagtttgcca gagtcacgat 960 ccacacgcgg atacattaag gaagaaaggt gaggaaagtc caaagttgtg tcctggtgtg 1020 tgcagagtcg tgtgacgacg gaagcgggtc gggacgggtg agtgaagaaa gaggaataaa 1080 gggttggtac ggtgtctctc acttgaggtc cgaattcctt gtcgaatccc cgtcccgtgt 1140 gatggtagtt acattctgac ctaagtccaa ggtgggaatc gagacccctt ttgaacctgt 1200 ttgaggtacc gactcattta attcggtcat tccaggttca cgtacgacaa cggtaaccga 1260 acttcccgta ggtcgaacag gacacttaaa cgaaaaggtc ttgacatgtt ggttactctc 1320 cgaggatttt aaattggtca accaaactcg acagaaaaca atttgacgaa aacacatata 1380 ctttggtaac tggcgaaaaa aaaatttgtt ggacaaataa aatacatata attcacaaac 1440 gaacataaca cacatggaac acgtacatta cgaggtcctc cggtcttctc ccgcagcata 1500 agggaccttg acctcaacgt ctaccaacac tcagtggaat atgcgcggac cttgacttgg 1560 gtccaggtga cgttctcgtc agtctcgtac attggtgact cggtggagag gtcggggtgt 1620 aacgagtaaa gggtaacgag acaagatttt tacgaaggcg aataatgttt ctttactttt 1680 ctctgtcctc gtagggaagt gtcgtcatgg acgatggacc ctattacaac taaaaacaga 1740 atggtgacca ggtcccacac agacactcac gattctatta cagaagcact taaacaagtg 1800 cgtccgaaag tttgccagga actgcgttca ctacagagga aaggtatgtg tgctgataat 1860 ttgaggtatc ttggagcaaa gaatttcaca ctgggcgtcc agccgtagtg gtcgtagaac 1920 cctgactgcg gccctggggt tggggtcttg acgaccaaag attcagttca aagtcttcac 1980 aacggcgtcc cttatgtcct gagtctttct caggacctcg gaaaaccccc tgtactcttc 2040 tgagtcgtct tttgagttgt cgaggtgcac agggtttcgt cttacaggtc cctctctcaa 2100 gtcttcgtca cactctcgag tccaacccgc cttgcctaga cgacgtaata ccgttccagt 2160 gtggcccaaa tcacacaacg gaatcactct ttcccccttc cccgccgatc tccttccaac 2220 attggtccct ccacttccct cccaaaacca tggtcctcgt actgtgccat ctctgtcgac 2280 gactacctac gcgcgccccg accccgaccc cacccccttg taccccattt ttctctagat 2340 tctgaacctc ggaccatccg acctcatcct taaagtcact ctgtgtcccc tccgtctacg 2400 tagactacta ttggggtata cttcccagga gtcctaggaa acggaacgtg ttgtaactcc 2460 agtgtgcctt tatcctgaaa agaggagggt ggaaatccga cctctcgcac taatttaaat 2520 tctagactag gccaaggtcc tactctctgt gtccgatcag gaaaaggccg tccgttggaa 2580 gtcctagaat tgggatctga ggcgcctact ccatgtcctt tgttatttaa ttattcacag 2640 tgaacccatg aatttactta acccaaaccc ggtcacggac ttccttcgaa aacgttctta 2700 cgggatttac taaaggtgag cgcttgccga ggctctcacg gattattcac gtcgacccgc 2760 tagattcatc gtcgtcgagg ataggtcaat tcgcttgcag gggttccctt gttattaaac 2820 gtctggccgg ttgacgttag attctctccc tcagcgaacg acaacattca gaggaggcgg 2880 tcgggattgg acgaatgggg cgtaaggagg acaagtaggg cttttgggcc ggcaaatgtt 2940 aagaaatccc ctttcgtatt cttcggctcg gggtcccagt tcccgcggag ccccttcggt 3000 gtcctagttt catccagcgg tctgagaggc cggcaagctc acccagaagc gtactgacaa 3060 cgtccgcccg caggtgccac cgcccgaggg cggggagtgc gtcgacgctg gacgcccccg 3120 cgcgcgtcgg agcaccccaa gggcgcctac gcgcgggccg cccctcgcgc ctcccgcctc 3180 tcggcccgcg ctcgtggcgt cgagtggacg gcgcccgcgg tggtgcctgc acggtgcgcc 3240 caccgggctc gataagccgt cgtgacttcc tcggtgggga gccggtcccg cacggttcca 3300 ctgggggcca ttgggggacg gggcgtccga cgcgcagggg cgacgatccc ctcgccacgg 3360 tttacgtacg tatagaaaga gagacagaca gacccgtgga gacaccatgt gtggatggaa 3420 aaaacatcgg gaacgtgaga ctcgccacgt gtaccctctc tgaccctggg gtggggaaac 3480 aaactcagac ctccacacaa acccccacac gagcgcgcac tccatacaaa cccttcccac 3540 cctcaaaccc cgggaatttt ataaggtggg aggacgtctg aacaccgacg acccgccacg 3600 cttgtagagt cggcgacagg ggagggtccc gagacaacgc ctcagtcttg ggctcgagca 3660 acagttgggg accctgtaac agaacacgtc gagtccttgg agagagtcgt cgggtctaca 3720 gtttgtcarc aaccaaaagc cgtaccctct acgttaatcg gttacagcca aaagtcgcaa 3780 aaccgttcac acgctcacac gtacacggcg gagccctcag gactaggcac aaagggagtc 3840 tctgtttgtc gtaaagccaa cgtctgaaat cgaaaacaaa aattaaggac ttcgagcacc 3900 gtaaaactgt gactatcgac tcgggtccca acagacagaa agagacacac aaaacgtact 3960 agaacctaac cgtgggatga catgggtttg taatttttcg gacagaaagg caacttctcc 4020 tgtccccaat tttacttgct tctgggcttc cagttaaatt cgcccgacgg agccctgaca 4080 tatctacggc cacgaggtct gagtagacga cacttttacg gcaacaccag gaatagtaga 4140 aggtgtcggg gtcggacgct cgggggtaca aggatgacta tccgtcggac cgagaacgtc 4200 ggttcgacca gtggtagcct gagtaacagc ggagaaagag acggagacag acgtcaaacg 4260 accgataatg acacctggcg atggagagcg atataatgcg ggactgcatg gtgaggctct 4320 cctggcagtg gaaatggata cagtacgatc actacgagac cccttggagg tagacggacc 4380 ccgacgacgg gcagtacccg accttgacga actccctgct caggtggacg tcgcaccagt 4440 ctggagagtg attcttgttg cgacggtagg agaggtagag gaaggagaag tacaaacgag 4500 actacgaagt cgagatgtag gtctaaacat tctaacacta ctccgtgcgg gtagtctatc 4560 gggacgtcgt ggtgaaggac cgatgtagcg tgatacactg atgggccttt ccccagagct 4620 gggaccgaga gtaggatccc tggaaacgac ggacgaccta cggaaagtgg gagataagga 4680 actagcggct aatgtggatg ggaagctaga tatggatacg gtgggaggac gggcggtgga 4740 tgttaaggta gtagttggga cagtaaatgc gaaagtcttt ggttctctag gtctttcggg 4800 agacggagta aacgacaccc acgtagggaa ggagcgacag agtctctcga gccagagggt 4860 cgctacacat cgtcggaaga ggagtatcct gcgacggaga tggttcgcga gggtggaggg 4920 tcccgccggt cactaaagga aggaatttaa gaaacgtgac ctagagtgtt cgtcttcgtt 4980 actgtagaaa atctgtgcat aactgtcacc tttagtagaa tggtcacaaa aaattttttt 5040 tttgttttgt tttgagctga agagccgagt cgtaagacaa caaaccaaac cctcaatcct 5100 aaacaaacaa acaaacgaac aaacaaacaa acctcccaca ttaccctgga gtacaccggt 5160 actttaatat gttttcagag ccctaaaaaa ttggatccga acttttattt agtttcaaaa 5220 tttcctttga cctcttcctt tatgaaaaag acttccttta tgaaaaaaaa aaaattagtt 5280 ccatctagaa ggtaagacat acatagattg tcctatcctc gaaacggtat attggtttta 5340 tcaaatatat taatgtaaac cttcccgaac acaaataaag atccttaagt cattattcac 5400 tggtcattgt ctccgcgctt gaggaaagaa aggaaagtcg tcatcactga cgagaattct 5460 tagtgaaacg tcaaagagac acaatgtcaa accatacgta ccaatggaca ccgtcagtct 5520 agtgattaac gttataacgg tacaatttgg gtcttaattt tctcagtaaa aaagaagtta 5580 tgtcaaaaac tttataggaa aggtttcact cagaactttt tttacaaagg ttaaggatat 5640 acttctatcg tgaccaatct aaacagtaac actaaaaatt ttgagatctg accaccaaaa 5700 gtcttttgtt ttctctttta taatggtcgt agataacttt cttctaaaat aaataaaaat 5760 tatataagac tctcttattt accacactat gataattctt tatatgtttg tactgaaaag 5820 tttagagata gatacctatg taacaataag aatgaattct actcatctta attcataata 5880 tttacctttt aaaagagtaa gacaaccatc ccgtttaacg tagacttcgt ccaccagagg 5940 atggaattgt tgatccagac tccgtgcggg tcgattgtac tgaccccaca tggtcgacac 6000 aggacacacg agtacgtcct tactggtata cagactacca cttttcaaat taaaggaaaa 6060 tggtcttctg taggaggtac gttgttcctg agacgacgga cgaaagtctt tcgtttccaa 6120 atggaccctt taatgatgtt ctgcactgaa ttttgtggta tgtctcatta atacaggttc 6180 acagtaaaag acactttcgt ctgtctacat tctatgtgac agggagtcaa acgttacccg 6240 agtaccgaca cagatatgtc cttcaccttc ttaaggactt accgtgtagt tctggtcata 6300 aagtcctagg aaccactccc cagtaaacat tatc 6334 <210> 16 <211> 334 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Met Asn Glu Asp Pro Lys Val Asn Leu Ser Gly Leu Pro Arg Asp Cys 1 5 10 15 Ile Asp Ala Gly Ala Pro Glu Asn Ile Ser Ala Ala Val Pro Ser Gln 20 25 30 Gly Ser Val Ala Glu Ser Glu Pro Glu Leu Val Val Asn Pro Trp Asp 35 40 45 Ile Val Leu Cys Ser Ser Gly Thr Leu Ile Cys Cys Glu Asn Ala Val 50 55 60 Val Val Leu Ile Ile Phe His Ser Pro Ser Leu Arg Ala Pro Met Phe 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gly Ser Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Ala Gly Leu Gly 85 90 95 Leu Ile Ile Asn Phe Val Phe Ala Tyr Leu Leu Gln Ser Glu Ala Thr 100 105 110 Lys Leu Val Thr Ile Gly Leu Ile Val Ala Ser Phe Ser Ala Ser Val 115 120 125 Cys Ser Leu Leu Ala Ile Thr Val Asp Arg Tyr Leu Ser Leu Tyr Tyr 130 135 140 Ala Leu Thr Tyr His Ser Glu Arg Thr Val Thr Phe Thr Tyr Val Met 145 150 155 160 Leu Val Met Leu Trp Gly Thr Ser Ile Cys Leu Gly Leu Leu Pro Val 165 170 175 Met Gly Trp Asn Cys Leu Arg Asp Glu Ser Thr Cys Ser Val Val Arg 180 185 190 Pro Leu Thr Lys Asn Asn Ala Ala Ile Leu Ser Ile Ser Phe Leu Phe 195 200 205 Met Phe Ala Leu Met Leu Gln Leu Tyr Ile Gln Ile Cys Lys Ile Val 210 215 220 Met Arg His Ala His Gln Ile Ala Leu Gln His His Phe Leu Ala Thr 225 230 235 240 Ser His Tyr Val Thr Thr Arg Lys Gly Val Ser Thr Leu Ala Leu Ile 245 250 255 Leu Gly Thr Phe Ala Ala Cys Trp Met Pro Phe Thr Leu Tyr Ser Leu 260 265 270 Ile Ala Asp Tyr Thr Tyr Pro Ser Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr Leu Leu 275 280 285 Pro Ala Thr Tyr Asn Ser Ile Ile Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Arg 290 295 300 Asn Gln Glu Ile Gln Lys Ala Leu Cys Leu Ile Cys Cys Gly Cys Ile 305 310 315 320 Pro Ser Ser Leu Ser Gln Arg Ala Arg Ser Pro Ser Asp Val 325 330

Claims (17)

  1. GPR12 폴리펩타이드가 기능적으로 불활성인 하나 이상의 세포를 포함한 GPR12 넉아웃 포유류
  2. 야생형 대조군과 비교시 로타로드(Rotarod) 시험, 반전된 그리드, 선 운동(wire manoeuver) 시험, 걸음걸이 시험 상에서의 감소된 수행으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 지닌 제 1항에 따른 GPR12 넉아웃 마우스
  3. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 특징을 지닌 제 2항에 따른 GPR12 넉아웃 마우스: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병
  4. (a) 하나 이상의 기능적으로 활성인 내생적 GPR12 유전자/들을 포함한 하나 이상의 세포를 선택하는 단계;
    (b) 하나 이상의 내생적 GPR12 유전자로의 상동성 재조합에 의한 재조합을 가능하게 하는 기능적으로 불활성인 GPR12 핵산으로 단계 (a)에 따른 하나 이상의 세포를 트랜스펙트하는 단계;
    (c) 하나 이상의 내성적 GPR12 유전자가 기능적으로 불활성인 GPR12 핵산으로 상동성 재조합을 수행한 하나 이상의 세포를 선택하는 단계를 포함한
    하나 이상의 기능적으로 불활성인 GPR12 유전자를 포함한 하나 이상의 포유류 세포의 생성 방법
  5. (a) 비-상동성 복위 구역;
    (b) 상기 비-상동성 복위 구역의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역;
    (c) 발현시 기능적으로 활성인 GPR12를 인코드하지 않는 돌연변이된 GPR12 유전자;
    (d) 상기 비-상동성 복위 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역을 포함하고, 상기 두 번째 상동성 구역은 상기 비-상동성 복위 구역의 다운스트림에 위치하고, 상기 두 번째 상동성 구역은 두 번째 GPR12 유전자에 대해 적어도 90% 이상의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는
    숙주 세포 내에서 하나 이상의 내생적 GPR12 유전자를 기능적으로 불활성화시키기에 적당한 핵산 컨스트럭트
  6. GPR12 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 그의 결합 단백질/들 또는 이들을 인코드하는 핵산 및 약제적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한 조성물
  7. (a) 기능적으로 활성인 GPR12 폴리펩타이드를 포함한 하나 이상의 포유류를 선택하는 단계;
    (b) 하나 이상의 GPR12 폴리펩타이드의 잠재적 길항제로 하나 이상의 포유류를 처리하는 단계;
    (c) 상기 포유류가 GPR12 넉아웃 마우스에 의해 나타나고, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내는지 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 포유류를 시험하는 단계: 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병; 및
    (d) 단계 (c)에 따른 하나 이상의 특성을 나타내는 하나 이상의 길항제를 선택하는 단계를 포함한
    GPR12 폴리펩타이드의 기능적 활성의 하나 이상의 길항제를 확인하는 방법
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 포유류가 나타내는지 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 포유류를 시험하는 하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법
  9. (a) 기능적으로 불활성인 GPR12 폴리펩타이드를 포함한 하나 이상의 포유류를 선택하는 단계;
    (b) 적어도 GPR12 활성의 측면에서 잠재적으로 작용하는 하나 이상의 잠재적 GPR12 모방자로 하나 이상의 포유류를 처리하는 단계;
    (c) 상기 처리된 포유류가 단계 (a)에 따라 선택된 포유류와 비교시 하나 이상의 복구된 특성을 지니는지 여부를 결정하기 위해 단계 (b)에 따라 처리된 하나 이상의 포유류를 시험하는 단계; 및
    (d) 단계 (a)에 따라 선택된 포유류에 대해 야생형 포유류의 하나 이상의 특성을 복구하는 하나 이상의 GPR12-리간드 모방자를 선택하는 단계를 포함한
    GPR12 폴리펩타이드의 기능적 활성에 작용하는 하나 이상의 분자를 확인하는 방법
  10. (a) 기능적으로 활성인 GPR12 폴리펩타이드를 포함한 하나 이상이 포유류를 선택하는 단계;
    (b) 적어도 GPR12 활성의 측면에서 잠재적으로 길항작용하는 하나 이상의 잠 재적 GPR12 길항제로 하나 이상의 포유류를 처리하는 단계;
    (c) 상기 처리된 포유류가 단계 (a)에 따라 선택된 포유류와 비교시 하나 이상의 조절된 특성을 지니는지 여부를 결정하기 위해 단계 (b)에 따라 처리된 하나 이상의 포유류를 시험하는 단계를 포함한
    GPR12 폴리펩타이드의 기능적 활성을 길항작용하는 하나 이상의 분자를 확인하는 방법
  11. 하나 이상의 화합물의 생물학적 효과를 분석시 형질전환 GPR12 넉아웃 포유류의 이용
  12. (a) 진단되는 환자로부터 표본 세포를 선택하는 단계; 및
    (b) 상기 표본 세포 내 GPR12 폴리펩타이드의 발현 수준 및/또는 기능적 활성을 건강한 개체로부터의 하나 이상의 대조군 표본/들과 비교하는 단계를 포함한
    하기로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 이상의 진단 방법:
    알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병
  13. 세포의 적어도 일부분 내에 GPR12 폴리펩타이드, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 작용제, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 길항제 및 GPR12 활성의 하나 이상의 조절자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 인코드하는 외생적 핵산을 포함한 형질전환 동물
  14. GPR12 폴리펩타이드, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 작용제, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 길항제 및 GPR12 활성의 하나 이상의 조절자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료적으로 효과적인 양으로 환자를 치료하는 단계를 포함한, 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 환자 이상의 치료 방법
  15. 알츠하이머 및 관련 질환, 파킨슨병, 간질 및 간질발작, 현기증 및 멀미, 운동신경세포병 및 신경세포 기능장애 질환뿐만 아니라 침해성 통증을 포함한 통증, 간염, 근육 퇴행, 갑상선기능저하증, 췌장염 또는 MI, 다발골수종 및 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 환자 이상의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조시 GPR12 폴리펩타이드, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 작용제, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 길항제 및 GPR12 활성의 하나 이상의 조절자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 이용
  16. GPR12 폴리펩타이드, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 작용제, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 길항제 및 GPR12 활성의 하나 이상의 조절자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료적으로 효과적인 양으로 환자를 치료하는 단계를 포함한, 환자의 신경세포 증식 및 시냅스 형성의 조작 방법
  17. 동물의 신경세포 증식 및 시냅스 형성의 조작을 위한 약제의 제조시 GPR12 폴리펩타이드, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 작용제, GPR12 폴리펩타이드의 하나 이상의 길항제 및 GPR12 활성의 하나 이상의 조절자로 구성된 군으로부터 선택된 것의 이용
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