KR20050119149A

KR20050119149A - 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 클루스테린의용도

Info

Publication number: KR20050119149A
Application number: KR1020057018172A
Authority: KR
Inventors: 죠지 페게르; 유술라 보셔르트; 이베스 사고트; 루벤 파포이안
Original assignee: 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2005-12-20
Also published as: BRPI0408889A; JP2006523199A; MXPA05010414A; WO2004084932A2; EA008938B1; EP1610810A2; NO20054913D0; NO20054913L; WO2004084932A3; AU2004224779A1; US20070134260A1; CN1791422A; CA2519681A1; EA200501528A1

Abstract

본 발명은 말초 신경 질환의 치료 또는 예방을 위한 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도에 관한다. 또한, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 또는 예방을 위한 클루스테린과 헤파린 조합의 용도에 관한다.

Description

말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 클루스테린의 용도{USE OF CLUSTERIN FOR THE TREATMENT AND/OR PREVENTION OF PERIPHERAL NEUROLOGICAL DISEASES}

본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도에 관한다. 본 발명은 일반적으로 말초 신경 질환 및 장애의 분야에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 신경보호, 신경 수초화 및 미엘린(myelin) 생성 세포의 발생이나 재생에 관한다. 특히, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도에 관한다.

말초 신경 질환은 말초 신경계(PNS) 또는 PNS를 지지하는 말초 신경교와 관련된 질환이다. 말초 신경병증은 가장 일반적인 말초 신경 질환에 속한다.

말초 신경병증은 감각 손실, 근육 약화와 위축, 감소된 심건(deep tendon) 이완, 혈관운동 증상의 단독 또는 공동 증후군이다.

질병은 단일 신경(단일신경병증), 별개의 부위에서 둘 이상의 신경(다중 단일신경병증), 또는 동시적으로 많은 신경(복합신경병증)에 영향을 미칠 수 있다. 축삭은 일차적으로 영향을 받거나(가령, 당뇨병, 라임병 또는 요독증에서, 또는 독성 제제로), 또는 미엘린 수초 또는 슈반 세포이다(가령, 급성 또는 만성 염증성 복합신경병증, 백질이영양증 또는 길레인-바르 증후군에서). 소형 비수초화 섬유 및 수초화 섬유에 대한 손상은 일차적으로 온도와 통증 감각의 상실로 귀결된다; 대형 수초화 섬유에 대한 손상은 운동 또는 고유체위감각 결함으로 귀결된다. 일부 신경병증(가령, 납 독성, 답손 사용, 진드기에 물림, 포르피린증 또는 길레인-바르 증후군에 기인)은 일차적으로 운동 섬유에 영향을 준다; 다른 신경병증(가령, 암, 기면, 에이즈, 당뇨병 또는 만성 피리독신 독소유발의 배면근 결절종에 기인)은 배면 근 신경절 또는 감각 섬유에 영향을 미쳐, 감각 증상을 유발한다. 때로는, 두개신경 역시 관여한다(가령, 길라인-바르 증후군, 라임병, 당뇨병, 디프테리아에서). 수반되는 양식을 확인하는 것은 원인을 결정하는데 도움이 된다.

외상은 단일 신경에 대한 국부적 손상의 가장 공통적 원인이다. 격렬한 근육의 활동 또는 관절의 강한 과신장은 반복된 소형 외상(가령, 작은 도구의 단단한 파지, 에어 햄머로부터 과도한 진동)과 같은 국부적 신경병증을 유발할 수 있다. 압력 또는 포획마비는 통상적으로 골 돌출(가령, 마른 또는 악액질성 개체 및 때로는 알콜중독자에서 깊은 수면 또는 마취 동안) 또는 좁은 관(가령, 수근 터널 증후군에서)에서 표면적 신경(척골, 요골, 비골)에 영향을 미친다. 압력 마비는 또한 종양, 골의 과골다공증, 깁스, 목발 또는 장기간 절름발이 자세(즉, 가드닝(gardening)에서)에 기인할 수 있다. 신경으로 출혈 및 냉기 또는 방사선에 노출은 신경병증을 유발할 수 있다. 단일신경병증은 직접적인 종양 침입에 기인할 수 있다.

PNS의 외상성 신경 손상은 수술(가령, 외과적 전립선 절제술)동안 발생될 수 있다. 발기신경-보존 전립선절제술에서, 신경 손상을 피하기 위하여, 발기 신경의 행로를 확인하고 외과의가 신경 손상을 피하도록 수술동안 발기 신경의 자극이 수행된다(Klotz and Herschorn, 1998). 근치적 전립선 전제술(Radical Prostatectomy)이후 불임을 평가하는 연구에서, 기존에 성적능력이 있었던 503명의 남성중에서 212명(42%)이 한쪽 또는 양쪽 발기신경의 부분적인 또는 완전한 절제이후 불임을 경험하였다. 이런 불임율은 이들 신경이 손상되지 않는 경우에 24%로 낮아졌다(Quinlan et al., 1991b; Quinlan et al., 1991a).

다중 단일신경병증은 통상적으로 콜라겐 혈관 장애(즉, 복합동맥 결절, SLE, 쇼그렌 증후군, RA), 유육종증, 대사성 질환(즉, 당뇨병, 아밀로이드증) 또는 전염성 질환(즉, 라임병, HIV 감염)에 대해 이차적이다. 미생물은 신경의 직접적 침입(즉, 기면)으로 다중 단일신경병증을 야기할 수 있다.

급작한 섬유성 질환에 기인한 복합신경병증은 독성(즉, 디프테리아에서) 또는 자가면역반응(즉, 길레인-바르 증후군에서)에 기인할 수 있다; 때로는, 면역 반응을 수반하는 복합신경병증은 아마도 자가면역이다.

독성 제제는 일반적으로 복합신경병증을 유발하지만, 때로는 단일신경병증을 유발한다. 이들은 에메틴, 헥사바비톨, 바비톨, 클로로부탄올, 술폰아미드, 페니토인, 니트로퓨란토인, 빈카 알카로이드, 중금속, 일산화탄소, 트리오르토크 레실 포스페이트, 오르토디니트로페놀, 다양한 용매, 기타 산업성 독소, 특정 에이즈 약물(즉, 잘시타빈, 디단노신)을 포함한다.

영양 결핍 및 대사 장애는 복합신경병증을 나타낼 수 있다. 때로는, B 비타민 결핍이 원인이다(가령, 알콜중독증, 각기, 악성 빈혈, 이소니아지드-유발 피리독신 결핍, 흡수불량증, 임신오조에서). 복합신경병증은 또한 과소티로이드증, 유육종증, 아밀로이드증, 요독증에서 일어난다. 당뇨병은 감각운동 말단 복합신경병증(대부분의 경우), 다중 단일신경병증, 소상의 단일신경병증(가령, 눈 운동의 또는 외전의 두개골 신경)을 유발할 수 있다.

악성은 단클론의 감마병증(다중 골수종, 림프종), 아밀로이드 침입 또는 영양 결핍을 통하여, 또는 방종양성 증후군으로서 복합신경병증을 유발할 수 있다.

특정 단일신경병증; 단일 및 다중 단일신경병증은 영향을 받은 신경의 분포에서 감각 이상, 약화, 통증으로 특성화된다. 다중 단일신경병증은 비대칭이다; 신경은 한 번에 또는 점진적으로 관련될 수 있다. 많은 신경의 포괄적 관련은 복합신경병증에 유사하다.

측골 신경 마비는 때로는, 팔꿈치로 반복적인 기댐에 의한 팔꿈치의 척골 홈에서 신경의 외상에 의해, 또는 어린 시절 골절이후 비대칭적인 뼈의 성장(지연된 측골 마비)에 의해 야기된다. 측골 신경은 또한 팔꿈치 터널에서 압박될 수도 있다.

5번째 손가락 및 4번째 손가락의 내측 절반에서 감각이상 및 감각결핍이 발생한다; 엄지손가락 내전근, 5번째 손가락 내전근, 골간의 근육이 약화되고 위축된다. 심각한 만성 척골 마비는 꾸부러진 손가락 기형을 유발한다. 신경 전도 연구는 손상 부위를 확인할 수 있다. 보존 처리는 외과적 치료를 시도하기에 앞서 수행되어야 한다.

수근 터널 증상은 횡 표면적 수근 인대 및 손을 구부리는 전완 근육의 종 건 사이에 손목의 손바닥 측면에서 중간 신경의 압박으로부터 기인한다. 이는 일측성 또는 양측성일 수 있다. 압박은 손의 방사상 손바닥 측면에서 감각이상 및 손목과 손바닥의 통증을 유발한다; 때때로, 통증은 전완과 어깨의 압박 부위에서 근위적으로 발생한다. 통증은 밤에 더욱 심해진다. 첫 번째 세 손가락의 손바닥 측면에서 감각 결핍이 뒤따를 수 있다; 엄지 외전 및 대항(opposition)을 조절하는 근육이 약화되거나 위축될 수 있다. 이런 증상은 경추 신경근증에 기인한 C-6 근 압박으로부터 구별된다.

비골의 신경 마비는 통상적으로 비골근 목의 측면에 대한 신경의 압박으로 야기된다. 이는 쇠약하여 침대에 누워만 있는 환자와 습관적으로 다리를 교차하는 마른 사람에서 가장 일반적이다. 족 신전의 약화 및 외전(풋드롭)이 일어난다. 때로는, 감각 결핍이 하부 다리의 전외측 측면 및 족의 배부 상에서 일어나거나 또는 일차와 이차 중족골 사이의 웹 공간에서 일어난다. 치료는 통상적으로 압박 신경병증에 대해 보존적이다(가령, 다리 교차를 회피한다). 일반적으로, 불완전한 신경병증이 만성적으로 뒤따르고 자발적으로 개선된다. 만일 회복이 되지 않으면, 외과적 검사가 필요하다.

요골 신경 마비(토요일 밤 마비)는, 예로써 중독 또는 숙면동안 팔이 의자의 뒤로 축 늘어질 때처럼, 상박골에 대해 신경의 압박으로 발생한다. 증상은 손목과 손가락 신근의 약화(수근 하수) 및 때로는, 일차 배부의 골간 근육의 배부 측면에서 감각 상실을 포함한다. 치료는 압박성 비골 신경병증과 유사하다.

복합신경병증은 상대적으로 대칭적이고, 빈번하게 감각, 운동 및 혈관운동 섬유에 동시에 영향을 준다. 이들은 축삭 실린더 또는 미엘린 수초에 영향을 줄 수 있는데, 이들 형태에서 급성(가령, 길레인-바르 증후군) 또는 만성(가령, 신부전)이다.

대사 장애(가령, 당뇨병) 또는 신부전증에 기인한 복합신경병증은 수개월 또는 수년에 걸쳐 서서히 진행된다. 이는 빈번하게, 근부보다 원위에서 보다 심각한 하부 사지에 있어 감각 비정상으로 시작된다. 주변 자통, 무감각, 화상통증, 또는 관절 고유 수용(proprioception)에서 결핍 및 진동적 감각이 가끔 현저하다. 통증은 종종 밤에 더욱 심하고 병든 영역을 만지거나 또는 온도변화에 의해 악화될 수 있다. 심각한 경우에, 전형적으로 스타킹-앤드-글로브(stocking-and-glove) 분포를 갖는 감각 상실의 객관적인 징후가 나타난다. 아킬레스 및 다른 심건 이완이 소멸되거나 부재한다. 손가락 또는 샤코(Charcot's) 관절에서 무통 궤양은 감각 손실이 현저할 때 발생될 수 있다. 감각 또는 고유수용성 결핍은 비정상적인 보행을 유발할 수 있다. 운동 관련(motor involvement)은 원위 근육의 약화와 위축을 유발한다. 자율성 신경계는 부가적으로 또는 선택적으로 관련되어, 야행성 어지럼증, 배뇨와 배변 실금, 임포텐스, 또는 체위적 저혈압을 유발한다. 혈관운동 증상은 다양하다. 피부는 정상보다 창백하며 건조하며, 때로는 어두운 탈색화가 나타난다; 땀을 과도하게 흘릴 수 있다. 영양의 변화(부드럽고 윤기나는 피부, 얽힌 자국이 있는 손톱, 골다공증)는 심각하고 장기화된 경우에 일반적이다.

영양의 복합신경병증은 알콜중독자 및 영양결핍자에서 일반적이다. 일차적 축삭병증은 가장 길고 큰 신경에서 축삭의 파괴 및 이차적인 탈수초화를 유발한다. 원인이 티아민 또는 다른 비타민(가령, 피리독신, 판토텐산, 폴릭산)의 결핍인지는 불명확하다. 피리독신 결핍에 기인한 신경병증은 일반적으로, TB에 대한 이소니아지드를 섭취하는 사람에게만 발생한다; 피리독신에 의존하거나 결핍된 유아는 경련을 일으킬 수 있다. 원위 사지의 점진적인 약화 또는 대칭적인 약화는 일반적으로, 잠행성이지만 급속하게 진행될 수 있고, 때로는 감각 상실, 감각이상 및 통증을 수반한다. 장단지와 발에서 통증, 구부러짐, 동상, 화상 및 무감각이 접촉에 의해 악화될 수 있다. 복합 비타민이 병인이 모호할 때 처방될 수 있지만, 이들은 어떤 이점도 입증되지 않았다.

비정상적으로, 배타적으로 감각의 복합신경병증은 주위의 통증과 감각이상으로 시작하여 모든 형태의 감각의 상실로 진행한다. 이는 아밀로이드증, 갑상선기능저하증, 골수종 및 요독증에서 과도한 피리독신 주입(>0.5 ㎍/일)이후에, 암종(특히, 기관지원성)의 별도 효과로 발생한다. 피리독신-유발 신경병증은 피리독신이 중단되면 해결된다.

유전성 신경병증은 감각운동 신경병증 또는 감각 신경병증으로 분류된다. 샤코-마리-투쓰(Charcot-Marie-Tooth) 질병은 가장 일반적인 유전성 감각운동 신경병증이다. 흔하지 않은 감각운동 신경병증은 출생시 시작되고 큰 장애로 귀결된다. 희귀한 감각 신경병증에서, 원위 통증과 온도감각의 상실은 진동과 위치 감각의 상실보다 현저하다. 주요 문제점은 잦은 감염 및 골수염과 함께, 통증 무감각에 기인한 발의 절단이다.

유전성 운동과 감각 신경병증 타입I 및 II(샤코-마리-투쓰 질병, 비골 근육 위축)는 상대적으로 흔하고, 일반적으로 주로 비골과 원위 다리 근육에서 약화와 위축으로 특징되는 상염색체의 현저한 장애이다. 환자는 또한, 다른 퇴행성 질환(가령, 프레드리히 운동실조(Friedreich's ataxia)) 또는 가족 병력을 가진다. 타입I 환자는 '스토크 레그(stork leg)'를 유발하는 풋드롭(footdrop) 및 서서히 진행하는 원위 근육 위축을 갖는 중간 어린이에 존재한다. 손에서 내부 근육 약화가 이후에 시작된다. 진동, 통증 및 온도 감각은 스타킹-글로브 패턴에서 감소한다. 심건 이완이 부재한다. 높은 발의 장심 또는 햄머 발톱은 이런 질병을 갖는 병세가 덜한 가족 구성원에서 유일한 징후일 수 있다. 신경 전도 속도는 느리고, 원위 잠재가 장기화된다. 부분적 탈수초화작용 및 재수초화작용이 일어난다. 확대된 주변 신경이 촉진될 수 있다. 상기 질병은 서서히 진행되고 수명에 영향을 미치지 않는다. 타입II 질병은 더욱 느리게 진행되고, 통상적으로 인생의 후반부에 약화가 발생한다. 환자는 상대적으로 정상적인 신경 전도 속도를 보유하지만, 낮은 진폭이 잠세를 일으킨다. 부검은 왈러(wallerian) 변성을 나타낸다.

희귀한 상염색체의 퇴행성 장애인 유전적 운동과 감각 신경병증 타입III(과영양성 장기 신경장애, 데제린-솟타(Dejerine-Sottas)병)는 어린 시절 진행성 약화 및 감각 상실로 시작하고 심건 이완이 없다. 초기에, 이는 샤코-마리-투쓰 질환에 유사하지만, 운동 약화는 보다 빠른 속도로 진행된다. 탈수초화 및 재수초화작용이 발생하여, 신경 조직검사에서 관찰되는 확대된 말초 신경 및 어니언 벌브(onion bulbs)를 형성한다.

운동 약화, 족 변형, 가족 병력, 전기생리학적 비정상의 특징적 분포는 진단을 확인한다. 유전적 분석이 이용될 수 있지만, 특징적인 치료법은 없다. 질환 진행을 젊은 환자에게 대비시키는 직업적인 카운셀링은 유용할 수 있다. 브레이싱(Bracing)은 풋드롭을 교정하는데 도움이 된다; 족을 안정화하는 정형적 수술이 도움이 될 수 있다.

척추 손상은 양하지마비 및 사지마비로 인한 병원 입원의 대부분을 차지한다. 80% 이상이 노상 사고에 기인한다. 2가지의 주요 상해군은 임상적으로 인식된다; 개도 상해 및 폐쇄 상해.

개도 상해는 척추와 신경 근의 직접적인 외상을 야기한다. 관통 상해는 포괄적인 파열 및 출혈을 야기할 수 있다. 폐쇄 상해는 대부분의 척주 손상을 차지하고, 통상적으로 척주의 골절/이탈과 연계되는데, 일반적으로 방사선으로 진단될 수 있다. 코드에 대한 손상은 골 손상의 정도에 좌우되고, 2가지 주요 단계로 고려될 수 있다; 타박상, 신경 섬유 절단, 출혈성 괴사인 일차적인 손상 및 경막외 혈종(extradural heamatoma), 골절, 감염, 부종인 이차적인 손상.

코드 손상의 후기 영향은 손상된 신경 섬유의 상승과 하강 전행성 퇴행, 후-외상성 척수공동증 및 양하지마비의 전신 효과, 예를 들면, 뇨도관과 가슴 감염, 압력 통증 및 근육 소모를 포함한다.

탈수초화는 신경 임펄스 전도에서 기능적 감소 또는 봉쇄와 연관된다.

다중라멜라(multilamellar) 미엘린 수초는 신경교의 세포 플라즈마 막의 특정화된 영역으로, 지질이 풍부하고 단백질이 적다. 이는 축삭을 지지하고, 전하가 주변 조직으로 방혈되는 것을 방지함으로써 신경계에서 전기적 신호 전도의 효능을 개선하는 작용을 한다. 랑비에 결절(nodes of Ranvier)은 도약성 전도가 일어나는 축삭을 따른 수초에서 위치이다.

재수초화 과정은 손상을 회복하고 절단과 사망으로부터 축삭을 보고하는 소염 경로와 공조할 수 있다.

슈반 세포는 말초 신경계에서 지지 역할을 제공하는 말초 신경교 세포이며, 위성 세포(satellite cell)에 속한다. 슈반 세포는 말초 축삭의 줄기 주변을 개별적으로 둘러싸고, 축삭의 분절을 따라 미엘린 수초 층을 형성한다. 슈반 세포는 주로 지질 또는 지방으로 구성된다; 지방은 절연체로 기능하여, 축삭을 따라 활동 전위(action potential)의 전달율을 가속화시킨다.

슈반 세포는 또한, 말초 신경계에서 신경 재생 과정에 필수적이다. 축삭이 사멸하는 경우에, 이를 둘러싼 슈반 세포는 이의 분해를 보조한다. 이로 인하여 연속적인 슈반 세포에 의해 형성되는 빈 채널을 남겨지게 되는데, 이를 통하여 새로운 축삭이 3-4 ㎜/day의 속도로 단절 말단으로부터 성장하게 된다.

일반적으로, 신경병증은 영향을 받은 PNS 뉴런의 유형(가령, 감각 대 자율) 및 실제로 뉴런의 아형(소형 대 대형)에 선택적이다. 말초 신경의 액소토미(axotomy)는 신경영양성 인자의 신경보호 효과를 관찰하기 위한 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델이다. 외상성 신경 손상, 신경총 병소 및 근(根) 병소는 사고의 심각한 합병증이다. 부가하여, 미엘린 손상을 일으킬 수 있는 말초 신경에 대한 압박은 수근 터널 증상(tunnel syndrome)같은 질환에서 빈번하게 관찰되거나 척주 정형의 합병증과 연관된다. 액소토미는 세포 사멸, 감소된 축삭의 전도속도 및 손상된 뉴런에서 변경된 신경전달자(neurotransmitter) 수준과 같은 현상을 유발한다. 압좌 병소는 신경병증 상태에 관해 흥미로운 부가적인 과정인 재생을 가능하게 한다(McMahon S. and Priestley J.V. 1995).

세포의 신경생리학에서 기초적인 의문은 상해 또는 질환이후 신경 재생의 조절이다. 기능적인 신경 재생은 축삭 발아(sprouting)와 신장뿐만 아니라 새로운 미엘린 합성을 요한다. 재수초화는 정상 신경 전도의 복구 및 새로운 신경퇴행성 면역학적 공격으로부터 축삭의 보호에 요구된다. 신경퇴행성 장애에서의 연구의 일차적인 목표는 신경 사멸을 방지하고, 신경 표현형을 유지하고, 신경과 미엘린 손상을 치유하는 개입을 궁극적으로 개발하는 것이다. 많은 연구는 액소토미된 척추 운동 뉴런의 완전한 재생을 담당하는 분자와 세포 메커니즘을 밝히는데 공헌하였다(Fawcett and Keynes, 1990; Funakoshi et al., 1993). 신경영양성 인자 및 상응하는 수용체의 손상-유도된 발현은 신경 재생의 능력에 중요한 역할을 할 수 있다. 기존의 연구는 신경 재생에 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1), ACTH(Lewis et al., 1993; Strand et al., 1980), 테스토스테론(Jones, 1993), SR 57746A(Fournier et al., 1993), 4-메틸카테콜(Kaechi K et al. 1993, 1995; Hanaoka Y et al., 1992; Kaechi et al., 1993)과 같은 다양한 펩티드와 비-펩티드 화합물로 신경 재생의 현저한 향상을 보였다.

클루스테린은 아포지단백 J, SGP-2, TRPM-2, SP-40으로도 알려져 있는 세포외 단백질이다. 이는 거의 편재하는 조직 분포를 갖는데, 정제되는 출처에 따라 명칭이 부여되었다(Trougakos and Gonos, 2002; Jones and Jomary, 2002). 이의 편재성 발현 및 이의 상대적 혈청 존재비(100 ㎍/㎖)에도 불구하고, 클루스테린의 진정한 기능은 밝혀지지 않고 있다. 클루스테린의 여러 생물학적 역할이 제안되었는데, 여기에는 C9 보체에 결합함으로써 보체 캐스케이드를 저해하는 능력(Tschopp et al., 1993), 연구된 동물 모델에 따른 친-아폽토시스 활성 또는 항-아폽토시스 활성(Han et al., 2001; Wehrli et al., 2001), 발달의 제한 및 샤페론 특성(Poon et al., 2002) 등이 포함된다. 알츠하이머병에서 클루스테린의 신경보호 역할 역시 제안되었다(Giannakopouios et al., 1998). 이의 주요 형태, 75-80 kDa 이종이합체는 단일 전사체로부터 산출된다. 이후, 폴리펩티드 사슬은 단백분해 절단하여 22-mer 분비 신호 펩티드 및 후속으로 잔기 227/228이 제거되어 2개의 사슬, 알파와 베타가 산출되는데, 이들 사슬은 각 사슬의 중심에 위치한 5-시스테인-결합에 의해 조합된다. 상기 폴리펩티드는 당화 부위 및 핵 위치 신호 서열(nuclear localization signal sequence) 역시 보유한다.

헤파린(heparin)은 설파민 가교를 보유하는 황산처리된 D-글루코사민과 D-글루쿠론산의 동등 부분으로 형성된 고도 산성 무코폴리사카라이드이다. 분자량은 6,000 내지 20,000이다. 헤파린은 척추동물의 간, 폐, 비만 세포로부터 생성되고 수득된다. 이의 기능을 알려져 있지 않지만, 다양한 염의 형태로 생체내와 시험관내에서 혈액 응고를 예방하는데 이용된다(Medical Subject Headings(MESH), http://www.nim.nih.gov/mesh/meshhome.html). 헤파린 소디움(상품명: Lipo Hepin과 Liquaemin)은 혈전증의 치료에서 항응고제로 이용된다.

저분자량 헤파린(LMWHs), 헤파린 분획물 역시 존재한다. 이들은 일반적으로 4000 내지 6000 kD의 분자량을 보유한다. 이들 저분자량 분획물은 효과적인 항혈전제이다. 이들의 투여는 출혈의 위험을 감소시키는데, 이들은 분획되지 않은 헤파린에 비하여 반감기가 연장되고, 혈소판 상호작용이 감소한다. 이들은 또한, 수술후 주요 폐동맥 색전증(postoperative major pulmonary embolism)에 대한 효과적인 예방을 제공한다(Medical Subject as Headings(MESH), http://www.nim.nih.gov/mesh/meshhome.html). LMWH는 예로써 나드로파린, N-아세틸헤파린, 아르데파린, 세르토파린, 달테파린, 에녹사파린, 레비파린, 틴자파린일 수 있다.

다른 헤파린에는 헤파리노이드(heparinoid)가 포함된다. 이들은 유사한 구조의 자연 발생과 합성 고도-황산처리된 폴리사카라이드이다. 헤파리노이드 제조물, 예를 들면, 다나파로이드 소디움은 항응고제와 소염제를 비롯한 광범위한 분야에 이용되고 있으며, 고지혈증 억제 특성을 보유하는 것으로 주장되었다(Martindale, The Extra Pharmacopoeia, 30th, p232).

인터페론은 소염, 항바이러스, 항증식 활성을 보이는 사이토킨의 아강(subclass)이다. 생화학적 특성과 면역학적 특성에 기초하여, 이들 자연-발생 인간 인터페론은 3가지 종류로 분류된다: 인터페론-알파(백혈구), 인터페론-베타(섬유아세포), 인터페론-감마(면역체). 현재, 알파-인터페론은 미국 및 다른 국가에서 모상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 성기 사마귀(venereal warts), 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma)(후천성 면역 결핍증(AIDS) 환자에서 통상적으로 발생하는 암), 만성 비-A형, 비-B형 간염의 치료제로서 승인되었다.

더 나아가, 인터페론(IFN)은 바이러스 감염에 반응하여 체내에서 생성되는 당단백질이다. 이들은 보호된 세포에서 바이러스 복제를 저해한다. 저분자량 단백질로 구성되는 IFN는 비-특이적으로 작용한다, 다시 말하면, 한 바이러스에 의해 유도된 IFN은 넓은 범위의 다른 바이러스에 유효하다. 하지만, 이들은 종-특이적이다. 다시 말하면, 한 종에 의해 생성된 IFN은 동일하거나 밀접하게 관련된 종의 세포에서만 항바이러스 활성을 자극한다. IFN은 잠재적인 항-종양과 항바이러스 활성이 개발된 첫 번째 사이토킨이다.

3가지 주요 IFN은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ이다. 초기에, 이들 IFN은 기원된 세포(백혈구, 섬유아세포 또는 T 세포)에 따라 분류되었다. 하지만, 한 세포에서 여러 유형이 생성될 수 있음이 확인되었다. 이후, 백혈구 IFN은 IFN-α, 섬유아세포 IFN는 IFN-β, T 세포 IFN는 IFN-γ로 불린다. 또한, “Namalwa”세포주(버킷림프종(Burkitt's lymphoma)으로부터 유래됨)에서 생성되는 네 번째 유형의 IFN, 림포양성(lymphoblastoid) IFN이 존재하는데, 이는 백혈구와 섬유아세포 IFN의 혼합물로 보인다.

인터페론 단위는 바이러스 손상으로부터 세포의 50%를 보호하는데 필요한 양으로 정의되는 IFN 활성의 척도이다.

모든 종류의 IFN은 여러 상이한 유형을 포함한다. IFN-β와 IFN-γ는 각각 단일 유전자의 산물이다. 개별 유형간의 차이는 주로 당화에서 변이에 기인하는 것으로 보인다.

IFN-α로 분류된 단백질은 가장 다양한 군이며, 대략 15가지 유형을 포함한다. 크로모좀 9에 적어도 23개의 구성원을 포함하는 IFN-α 유전자의 클러스터가 존재하는데, 이들 중에서 15개가 활성화되고 전사된다. 성숙 IFN-α는 당화되지 않는다.

IFN-α와 IFN-β는 동일한 길이(165개 또는 166개 아미노산) 및 유사한 생물학적 활성을 보유한다. IFN-γ는 146개 아미노산 길이를 보유하며, α와 β 종류와 다소 상이하다. IFN-γ만 대식세포를 활성화시키거나 킬러 T 세포의 성숙을 유도할 수 있다. 효과 측면에서, 이들 새로운 유형의 치료제는 생물학적 반응 조절제(BRM)라고 하는데, 그 이유는 이들 치료제가 종양에 대한 생물체의 반응에 영향을 주고, 따라서 면역조절을 통한 인식에 영향을 주기 때문이다.

특히, 인간 섬유아세포 인터페론(IFN-β)은 항바이러스 활성을 보유하며, 종양 세포에 대항하는 자연 킬러 세포를 자극할 수 있다. 이는 바이러스와 이중-가닥 RNA에 의해 유도되는 대략 20,000 Da의 폴리펩티드이다. 재조합 DNA 기술에 의해 클론된 섬유아세포 인터페론 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터, Derynk 등(Derynk et al., 1980)은 상기 단백질의 완전 아미노산 서열을 추론하였다. 이는 166개 아미노산 길이를 보유한다.

Shepard 등(Shepard et al., 1981)은 항-바이러스 활성이 소멸된 염기 842 돌연변이(141번 위치에서 Cys → Tyr) 및 뉴클레오티드 1119-1121이 결실된 변이 클론을 기술하였다.

Mark 등(Mark et al., 1984)은 염기 469(T)를(A)로 치환시켜 17번 위치에서 Cys → Ser 아미노산 전환을 유도하는 인공 돌연변이를 삽입하였다. 생성된 IFN-β는 장기 보관(-70℃)동안 ‘고유’IFN-β 만큼 유효하고 안정한 것으로 보고되었다.

IFN이 효과를 발휘하는 메커니즘은 완전히 이해되지는 않는다. 하지만, 대부분의 경우에, 이들은 특정 유전자의 유도 또는 전사에 영향을 주고, 따라서, 면역계에 영향을 주는 역할을 한다. 시험관내 연구에서 IFN은 대략 20가지 유전자 산물을 유도하거나 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

오스테오폰틴(osteopontin)은 골과 치아의 광화된 세포외 매트릭스의 주요 구성성분인 고도 인산화된 시알로단백질이다. OPN은 폴리아스파라긴산 서열 및 수산화인회석 결합(hydroxyapatite binding)을 매개하는 Ser/Thr 인산화 부위의 존재; 세포 부착/신호전달을 매개하는 고도로 보전된 RGD 모티브(motif)에 의해 특징된다. 오스테오폰틴 저해제는 감염, 면역 장애와 질환, MS를 포함하는 자가면역 장애, 다양한 면역결핍증, 암의 치료에 유효한 것으로 기술되었다(WO 00/63241). WO 02/92122에서는 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 오스테오폰틴 또는 오스테오폰틴 활성 촉진제의 용도를 청구한다.

Bonnard 등은 쥐 좌골 신경 압좌이후 병소 부위에서 클루스테린 mRNA 발현의 증가를 관찰하였다.

클루스테린으로 PNS 질환의 치료는 선행 기술에서 아직 고려되지 않았다.

본 발명의 요약

본 발명의 목적은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 새로운 수단을 제공하는 것이다.

본 발명은 단백질 클루스테린이 말초 신경병증의 동물모델에서 유효한 효과를 갖는다는 것이 조사 결과에 기초한다.

이런 이유로, 본 발명은 말초 신경계(PNS)의 외상성 신경 손상과 말초 신경병증과 같은 말초 신경 질환에서 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도에 관한다.

말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 클루스테린을 포함하는 핵산 분자와 발현 벡터 및 클루스테린을 발현하는 세포의 용도 역시 본 발명에 속한다.

더 나아가, 본 발명은 클루스테린 및 헤파린 또는 인터페론 또는 오스테오폰틴을 함유하고, 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용할 수 있는 부형제를 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 두 번째 측면에서, 클루스테린은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위하여 헤파린, 인터페론 또는 오스테오폰틴과 병용될 수 있다.

도 1에서는 클루스테린(Rosenberg and Silkensen, 1995에 기초하여)의 구조를 개략적으로 도시한다. (A)는 전구 폴리펩티드이고, (B)는 성숙 폴리펩티드의 전형인데, 이는 중심 부근에 5개의 이황화 가교에 의해 역행으로 연결된 α(34-36 kDa)와 β(36-39 kDa) 사슬에 의해 형성된 75-80 kDa의 이종이합체 당단백질이고, (C)는 인간 클루스테린 전구물질의 서열을 도시한다.

도 2에서는 복강내(i.p.) 투여된 운반제(열린 원), 300 ㎍/㎏(닫힌 삼각형) 또는 1 ㎎/㎏ m-클루스테린(닫힌 마름모꼴) 치료에서, 좌골 신경 압좌에 의해 유도된 신경병증 생쥐의 체중(g)을 도시한다. 대조: 건강한 생쥐(닫힌 사각형).

도 3에서는 운반제, 300 ㎍/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 복강내(i.p.)의 m-클루스테린, 0.01 ㎍/㎏ 양성 대조 화합물(4-MC) 또는 100 ㎍/㎏ 피하(s.c.)의 오스테오폰틴으로 처리된 신경병증 생쥐에서 화합물 근육 활동 전위의 진폭(mV)을 도시한다. 대조: 정상(sham operated) 생쥐.

도 4에서는 운반제, 300 ㎍/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 복강내(i.p.)의 m-클루스테린, 0.01 ㎍/㎏ 양성 대조 화합물(4-MC) 또는 100 ㎍/㎏ 피하(s.c.)의 오스테오폰틴으로 처리된 신경병증 생쥐에서 화합물 근육 활동 전위의 지연 시간(latency)(ms)을 도시한다. 대조: 정상(sham operated) 생쥐.

도 5에서는 운반제, 300 ㎍/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 복강내(i.p.)의 m-클루스테린, 0.01 ㎍/㎏ 양성 대조 화합물(4-MC) 또는 100 ㎍/㎏ 피하(s.c.)의 오스테오폰틴으로 처리된 신경병증 생쥐에서 화합물 근육 활동 전위의 지속 기간(latency)(ms)을 도시한다. 대조: 정상(sham operated) 생쥐.

도 6에서는 운반제, 300 ㎍/㎏, 또는 1 ㎎/㎏ 복강내(i.p.)의 m-클루스테린으로 처리된 신경병증 생쥐에서 퇴행된 섬유의 비율을 도시한다. 대조: 정상(sham operated) 생쥐.

도 7에서는 운반제, 300 ㎍/㎏, 또는 1 ㎎/㎏의 m-클루스테린으로 처리된 신경병증 생쥐에서 퇴행되지 않은 섬유의 비율을 도시한다. 대조: 정상(sham operated) 생쥐.

도 8에서는 운반제, 100 ㎍/㎏, 300 ㎍/㎏ 또는 1000 ㎍/㎏ 피하(s.c.)의 재조합 h-클루스테린 및 30 ㎍/㎏ 피하(s.c.)의 양성 대조(재조합 hIL-6)로 처리된 신경병증 생쥐에서 화합물 근육 활동 전위의 진폭(mV)을 도시한다. 기록은 좌골 신경 손상이후 1, 2, 3 또는 4주 시점에 수행한다. 데이터는 평균 전체 진폭(mV) ± 표준 오차로 표시한다; n = 6마리 생쥐/군. # p<0.01, * p< 0.05 , ** p<0.01.

도 9에서는 4주간 운반제, 30 ㎍/㎏의 재조합 인간 IL-6, 또는 100 ㎍/㎏, 300 ㎍/㎏, 1000 ㎍/㎏의 재조합 h-클루스테린으로 처리된 신경병증 생쥐의 반대측(contralateral side)(a)과 동측(ipsilateral side)(b)의 비복근군(gastrocnemius muscle)에서 단백질(㎍)에 의한 콜린 아세틸 전이효소(ChAT)(cpm) 활성(cpm/㎍ 단백질)을 도시한다. n = 6마리 생쥐/군. # p<0.1.

도 10에서는 4주간 운반제, 30 ㎍/㎏의 재조합 인간 IL-6, 또는 100 ㎍/㎏, 300 ㎍/㎏, 1000 ㎍/㎏ s.c.의 재조합 h-클루스테린 처리이후, (a) 반대측 좌골 신경 및 동측 좌골 신경의 (b) 근부(압좌 상부)와 (c) 원부(압좌 하부)에서 단백질(㎍)당 신경섬유-고분자량 형태(NF-H) 함량(ng)(ng NF-H/㎍ 단백질)을 도시한다. n = 6마리 생쥐/군. ** p<0.01.

도 11에서는 10일, 13일, 17 DIV(Day in vitro, 시험관내 일수)에 해당하는 처리 3일, 6일, 10일(T3, T6, T10)에서 1 ㎍/㎖의 재조합 m-클루스테린으로 처리된 기관형 해마 조각(organotypic hippocampal slice)의 단백질(㎍)당 미엘린 기초 단백질(MBP) 함량(pg)(pg MBP/㎍ 전체 단백질)을 도시한다. 대조군은 통상적인 매체(50% MEM, 25% HBSS, 25% 말 혈청)를 섭취하였다. HEK 또는 CHO 세포로부터 유래된 재조합 인간 클루스테린을 이용하는 경우에 유사한 결과가 달성되었다(데이터 제시하지 않음). 데이터는 평균 전체 MBP ± 표준 오차로 표시한다; exp=2, n = 12/군. p < 0.001 ^***.

도 12에서는 보체(IgG 항-MOG + 보체)와 공동으로 항-MOG(항-미엘린 희돌기교세포 당단백질) 항체에 의해, 또는 무관한 이소타입 대응 면역글로불린 IgG와 보체(IgG 대조 + 보체)로 유도된 특정 탈수초화이후 10, 100, 1000 ng/㎖의 재조합 m-클루스테린으로 처리된 기관형 해마 조각의 단백질(㎍)당 MBP 함량(pg)(pg MBP/㎍ 전체 단백질)을 도시한다. 대조로서, 치료를 받지 않은 군은 통상적인 매체(50% MEM, 25% HBSS, 25% 말 혈청)를 섭취하였다. m-클루스테린은 21 DIV, 항체의 첨가 24시간 전, 치료의 종결 시점에 적용하였다. exp=3, n=15, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.

HEK 또는 CHO 세포로부터 유래된 재조합 인간 클루스테린을 이용하는 경우에 유사한 결과가 달성되었다(데이터 제시하지 않음).

도 13에서는 헤파린(7500 U/㎏)의 존부하에 재조합 h-클루스테린(300 ㎍/㎏)의 정맥내(i.v.) 주사이후 5분 또는 30분 시점에, ELISA에 의해 검출된 h-클루스테린의 혈청 농도(ng/㎖)를 도시한다.

A. 클루스테린 5분전에 투여된 헤파린(클루스테린 이전에 주입된 헤파린) 또는 클루스테린과 동시에 투여된 클루스테린(헤파린과 혼합된 클루스테린). 대조로서, 생쥐는 클루스테린 단독(클루스테린)을 주입하고, 혈액을 튜브 +/- 헤파린에 수집하였다(헤파린에서 수집된 클루스테린). n=3마리 생쥐/군; *** p< 0.005.

B. 혈액 수집 이전에 헤파린(7500 U/㎏) 투여의 효과. 1군: 클루스테린(1 ㎎/㎏) 5분전에 투여된 헤파린. 2군: 클루스테린(1 ㎎/㎏) 28분후에 주입된 헤파린. 3군: 클루스테린(1 ㎎/㎏) 단독. a: 1군에 대한 Anova 단일 인자 검증(Anova single factor test). b: 2군에 대한 Anova 단일 인자 검증. N=4마리 생쥐/군, # p< 0.1, * p< 0.05, ** p< 0.01. N-아세틸헤파린 투여에서 유사한 결과가 달성되었다(데이터 제시하지 않음).

본 발명에서, 클루스테린의 투여는 말초 신경 질환의 생체내 동물 모델에서 유익한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 좌골 신경 압좌 유도된 신경병증의 뮤린 모델에서, 신경 재생, 보존, 생존력과 관련된 모든 생리학적, 형태학적 파라미터는 클루스테린의 투여에 의해 긍정적인 영향을 받았다.

이런 이유로, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 조제에서 클루스테린, 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물, 순환 변이된 유도체 또는 이들의 염, 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도에 관한다.

본 명세서에서 “클루스테린”전장 성숙 인간 클루스테린, 또는 임의의 클루스테린 아단위 또는 이들의 단편에 관한다. 인간 클루스테린의 서열은 첨부된 서열 리스트와 첨부된 도면의 도 1C에서 SEQ ID NO: 1로 보고된다. 본 명세서에서 “클루스테린”은 또한, 클루스테린 활성을 유지하기 위한 충분한 동일성이 있고, 획득된 분자가 인간에 면역원성이 아니라면, 뮤린, 송아지 돼지, 고양이 또는 양 클루스테린과 같은 동물로부터 유래된 클루스테린에 관한다.

본 명세서에서 “클루스테린”은 또한, 클루스테린의 자연 발생 알파와 베타 아단위와 같은 생물학적 활성 뮤테인과 단편에 관한다.

본 명세서에서 “클루스테린”은 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물, 또는 순환 변이된 유도체 또는 이들의 염을 더욱 포괄한다. 이들 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물, 또는 순환 변이된 유도체는 클루스테린의 생물학적 활성을 보유한다. 적절하게는, 이들은 야생형 클루스테린에 비하여 향상된 생물학적 활성을 갖는다.

본 명세서에서 “클루스테린 활성의 항진제”는 클루스테린 수용체를 통해 신호전달을 활성화시키는 저분자량 항진제, 또는 클루스테린 수용체의 항진 항체와 같은 클루스테린 활성을 모방하는 분자에 관한다. 클루스테린 수용체는 예로써 gp330/megalin/LRP2(Kounnas et al., 1995)일 수 있다. 이런 수용체의 항진제, 시뮬레이터 또는 인헨서는 본 명세서에서 “클루스테린 활성의 항진제”에 포함된다.

본 명세서에서 “클루스테린 활성의 항진제”는 또한, 클루스테린 활성을 모방하는 저분자량 화합물과 같은 클루스테린 매개된 활성을 강화시키는 작용제에 관한다.

본 명세서에서 “치료” 및 “예방”은 말초 신경 질환에 수반되는 증상, 질환 또는 합병증을 비롯하여 말초 신경 질환의 한가지이상 증상 또는 원인을 예방, 저해, 약화, 완화 또는 반전시키는 것으로 이해된다. 말초 신경 질환을 “ 치료”하는 경우에, 본 발명에 따른 물질은 질환의 발병이후 제공되고, “예방”은 질환의 징후가 환자에서 감지되기 이전에 상기 물질의 투여에 관한다.

본 명세서에서 “말초 신경 질환”은 “본 발명의 배경기술”에서 상세하게 기술된 질환을 비롯한 모든 공지된 말초 신경 질환 또는 장애, 또는 PNS의 손상을 포괄한다.

말초 신경 질환은 신경전달에 관련된 질환, 신경 외상, PNS 감염, PNS의 탈수초 질환, 또는 PNS의 신경병증과 같은 PNS의 기능 장애와 연계된 질환을 포함한다.

적절하게는, 본 발명의 말초 신경 병증은 말초 신경계의 외상성 신경 손상, PNS의 탈수초 질환, 말초 신경퇴행성 질환과 말초 신경병증에서 선택된다.

외상성 신경 손상은 상기 “본 발명의 배경기술”에 기술된 바와 같이 PNS에 관련된다.

말초 신경병증은 감각 상실, 근육 약화와 위축, 감소된 심건 이완, 혈관운동 증상에, 단독으로 또는 임의의 조합으로 관련될 수 있다. 이들은 예로써 알코올중독, 당뇨병 또는 화학요법에 기인할 수 있다.

신경병증은 단일 신경(단일신경병증), 별개 부위에서 둘 이상의 신경(다중 단일신경병증), 또는 동시적으로 많은 신경(복합신경병증)에 영향을 미칠 수 있다. 축삭이 일차적으로 영향을 받거나(가령, 당뇨병, 라임(Lyme)병, 또는 뇨독증에서 또는 독성 제제에 의해), 또는 미엘린 수초 또는 슈반 세포가 영향을 받을 수 있다(가령. 급성 또는 만성 염증성 복합신경병증, 백질이영양증, 또는 길레인 바르 증후군에서). 본 발명에 따라 치료될 수 있는 다른 신경병증은 예로써, 납 독성, 답손(dapsone) 사용, 진드기에 물림, 포르피린증, 또는 길레인 바르 증후군에 기인한 수 있고, 이들은 일차적으로 운동 섬유에 영향을 줄 수 있다. 암의 배근 신결절증, 나병, AIDS, 당뇨병, 또는 만성의 피리독신 중독에 기인된 것과 같은 다른 신경병증은 배근 신경절 또는 감각 섬유에 일차적으로 영향을 주고, 감각 증상을 유발한다. 두개 신경 역시 예로써, 길레인 바르 증후군, 라임병, 당뇨병 및 디프테리아에서 관여할 수 있다.

다른 말초 신경 장애는 상기 “본 발명의 배경기술”에 기술된 바와 같은 비정상 수초화를 보이는 신경병증 및 수근 터널 증후군을 포함한다. 외상성 신경 손상은 척주 정형의 합병증을 수반할 수 있는데, 이들 역시 본 발명에 따른 질환에 속한다.

말초 신경계 장애는 선천성 대사 장애에 기인할 수도 있다. 이런 이유로, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 신경 질환은 선천성 대사성 결손에 기인한다.

다른 바람직한 구체예에서, 말초 신경 질환은 밀초 신경병증, 가장 바람직하게는 당뇨성 신경병증이다. 신경병증과 연관된 화학요법 역시 본 발명에 적합하다.

“당뇨성 신경병증”임의 형태의 당뇨성 신경병증, 또는 당뇨성 신경병증에 의해 야기되거나 수반되는 하나 이상의 증상 또는 장애, 또는 상기 “본 발명의 배경기술”에서 상세히 기술된 바와 같은 신경에 영향을 미치는 당뇨 합병증에 관한다. 당뇨성 신경병증은 복합신경병증일 수 있다. 당뇨성 복합신경병증에서, 많은 신경이 동시적으로 영향을 받는다. 당뇨성 신경병증은 또한 단일 신경병증일 수도 있다. 병소의 단일신경병증에서, 예로써, 상기 질환은 동안(動眼) 또는 외전 두개 신경과 같은 단일 신경에 영향을 미친다. 상기 질환은 2개 이상의 신경이 별개의 부위에서 영향을 받는 다중 단일신경병증일 수도 있다.

더욱 바람직한 구체예, 말초 신경 장애는 말초 신경계(PNS)의 탈수초 질환이다. 상기 질환은 만성 염증성 탈수초 다발성신경근염(CIDP) 및 급성 단일상 장애, 예를 들면, 길레인 바르 증후군(GBS)이라 불리는 염증성 탈수초 다발성 신경근염과 같은 질환을 포함한다.

적절하게는, 클루스테린은 아래에서 선택되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 선택된다:

(a) SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;

(b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO: 1의 아미노산 228 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(g) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (f)중에서 적어도 하나의 서열에 적어도 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 동일성을 보유한다;

(h) 중간 엄밀도 조건 또는 높은 엄밀도 조건 하에서 (a) 내지 (f)중에서 어느 하나를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩된 (a) 내지 (f)중에서 임의 하나의 뮤테인;

(i) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열에서 임의의 변화는 (a) 내지 (f)에서 아미노산 서열에서 보존성 아미노산 치환체이다;

(j) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 염 또는 동등형, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 순환 변이된 유도체.

활성 분획물 또는 단편은 분리되거나, 또는 예로써 이황화 가교, 직접 융합 또는 적절한 링커에 의한 융합을 통하여 서로 연결된 알파 사슬 또는 베타 사슬과 같은 클루스테린의 임의의 일부분 또는 도메인을 포함한다. 활성 분획물은 또한, 클루스테린의 상이하게 당화되거나 시알릴화(sialylation)된 형태를 포함한다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 클루스테린 기능에 요구되는 필수 아미노산을 포함하는 활성 펩티드와 같은 클루스테린의 작은 일부분 또는 이의 아단위 역시 기능을 발휘하기에 충분하다.

당업자가 더욱 인지하는 바와 같이, 클루스테린의 뮤테인, 염, 동등형, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 순환 변이된 유도체가 유사한 또는 보다 우수한 클루스테린의 생물학적 활성을 보유한다. 클루스테린 및 이들의 뮤테인, 동등형, 융합 단백질 또는 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 단편, 순환 변이된 유도체, 또는 염의 생물학적 활성은 동시-배양 분석으로 측정할 수 있다.

바람직한 활성 분획물은 전장 클루스테린의 활성보다 우수하거나 동등한 활성을 보유하거나, 보다 우수한 안정성 또는 낮은 독성 또는 면역원성과 같은 추가적인 이점을 보유하거나, 많은 양으로 생산하기에 용이하거나, 또는 정제하기에 용이하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 뮤테인, 활성 단편 및 기능성 유도체는 적당한 플라스미드 내에서 상응하는 cDNA를 클로닝하고, 이를 상기한 바와 같이 동시-배양 분석에서 시험함으로써 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질은 당화되거나 비-당화될 수 있는데, 이들은 신체의 유체와 같은 자연적인 근원으로부터 유래되거나, 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 재조합 발현 대장균(E. coli)과 같은 원핵생물 발현 시스템에서, 또는 곤충 세포와 같은 진핵 발현 시스템, 바람직하게는 CHO-세포 또는 HEK-세포와 같은 포유류 발현 시스템에서 수행될 수 있다.

본 명세서에서 “뮤테인”은 클루스테린의 유사체를 의미하는데, 고유 클루스테린의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 대체되거나, 또는 결손되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 야생형 클루스테린과 비교하여 생성 산물의 활성에서 별다른 변화 없이 클루스테린의 고유 서열에 부가된다. 이들 뮤테인은 공지된 합성법 및/또는 특정부위 돌연변이유발 기술, 또는 여기에 적합한 다른 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 클루스테린의 뮤테인, 또는 이들을 코딩하는 핵산은 본원에 제시된 교시 및 보도에 기초하여 과도한 실험없이 당업자에 의해 일상적으로 수득될 수 있는 치환 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로서 실질적으로 상응하는 일단의 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 뮤테인은 중간 엄밀도 조건 또는 높은 엄밀도 조건 하에서 본 발명에 따른 클루스테린을 인코딩하는 DNA 또는 RNA에 혼성화되는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다. “엄밀도”는 혼성화 및 후속 세척 조건을 의미하는데, 당분야에서 통상적으로 “엄밀도”로 지칭된다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., 6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al.,(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)).

제한없이, 엄밀도 조건의 예에는 연구조사중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 12-20℃ 낮은 세척 조건, 예를 들면 5분간 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분간 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분간 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분간 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS. 당업자가 인지하는 바와 같이 엄밀도 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고 뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 이용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.).

바람직한 구체예에서, 임의의 이런 뮤테인은 첨부된 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 40동일성 % 또는 상동성을 갖는다. 더욱 적절하게는, 상기 뮤테인은 상기 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 가장 바람직하게는 적어도 90동일성 % 또는 상동성을 갖는다.

동일성은 서열을 비교함에 의해 결정된 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열의 길이 상에서 각각 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 서열의 정확한 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응을 의미한다.

정확한 대응이 없는 서열에 대하여, “동일성 %”를 결정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열은 서열 사이에 최대의 상관관계를 제공하도록 배열된다. 정렬의 정도를 향상시키기 위하여 한 서열이나 양 서열에 '틈새(gap)'를 삽입할 수 있다. 동일성 %는 비교되는 각 서열의 전체 범위(소위, 전역정렬)(동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 적합), 또는 좀더 짧고 한정된 범위(소위, 국부정렬)(동등하지 않은 길이의 서열에 적합)에서 측정할 수 있다.

둘 이상 서열의 동일성과 상동성을 비교하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1(Devereux J et al., 1984)에서 가용한 프로그램, 예를 들면 BESTFIT와 GAP 프로그램을 이용하여 두 폴리뉴클레오티드 서열간 동일성 % 및 두 폴리펩티드 서열간 동일성 %와 상동성 %를 측정할 수 있다. BESTFIT에서는 Smith와 Waterman의 “국부 상동성(local homology)” 알고리즘(1981)을 이용하여 두 서열간 가장 유사한 단일 영역을 찾는다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램은 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 BLAST 계통의 프로그램(Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, NCBI 홈페이지: www.ncbi.nlm.nih.gov)과 FASTA(Pearson W R, 1990; Pearson 1988)이다.

본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변화는“보존성”치환이다. 클루스테린 폴리펩티드의 보존성 아미노산 치환에는 상기 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 충분히 유사한 물리화학적 성질을 갖는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974). 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히, 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(가령, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질과 뮤테인은 본 발명의 목적에 포함된다.

바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 더욱 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.

[표 1]

바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산 동질성 군

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys Ser, Thr, Cys

His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn Gln, Asp, Ser, Asn

Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp Glu, Asn, Asp

Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp Trp

[표 2]

더욱 바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산 동질성 군

Ser Ser

Arg His, Lys, Arg

Leu Leu, Ile, Phe, Met

Pro Ala, Pro

Thr Thr

Ala Pro, Ala

Val Val, Met, Ile

Gly Gly

Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr Phe, Tyr

Cys Cys, Ser

His His, Gln, Arg

Gln Glu, Gln, His

Asn Asp, Asn

Lys Lys, Arg

Asp Asp, Asn

Glu Glu, Gln

Met Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp Trp

[표 3]

가장 바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산 동질성 군

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, Ile, Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile, Met, Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys, Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met, Ile, Leu

Trp Trp

본 발명에 사용될 수 있는 클루스테린의 뮤테인, 폴리펩티드 또는 단백질을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환체의 생산 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다.

“융합 단백질”은 예로써 체액에서 연장된 체류 시간을 갖고 다른 단백질과 융합된 클루스테린, 또는 이의 뮤테인 또는 단편으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 클루스테린은 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린이나 이의 단편과 융합될 수 있다. 면역글로불린 Fc 부분은 이합체- 또는 다합체 Ig 융합 단백질의 생산에 특히 적합하다. 클루스테린의 알파-와 베타-사슬은 예로써, Ig Fc 부분에 의해 이합체화된 클루스테린의 알파-와 베타-사슬을 산출하는 방식으로, 면역글로불린의 일부분에 결합될 수 있다.

본 명세서에서 “기능성 유도체”에는 클루스테린의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N-이나 C-말단 기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 클루스테린의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본 발명에 포함된다.

가령, 이들 유도체는 폴리에틸렌글리콜 측쇄를 보유하는데, 이들 측쇄는 항원성 부위를 감추고 체액에서 클루스테린의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르; 암모니아, 또는 일차 또는 이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드; 아실 부분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실 부분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체 등이 포함된다.

본 발명에서 클루스테린, 뮤테인, 융합 단백질의 “활성 분획물”에는 단독으로, 또는 관련된 분자나 여기에 결합된 잔기(가령, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체 응집체)와 결합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되지만, 이런 분획물은 클루스테린과 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.

본원에서 “염”은 클루스테린 단백질 또는 이의 유사체의 카르복실기의 염과 아미노기의 산 첨가염을 의미한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 방법으로 생성될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철, 아연 등과 같은 무기 염기로 형성된 염 및 예로써 아민, 예를 들면 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산 첨가염에는 예로써 무기산, 예를 들면 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 이들 염은 본 발명에 관련된 클루스테린의 생물학적 활성, 다시 말하면, 말초 신경 질환에서 신경보호 효과를 유지해야 한다.

클루스테린의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 상기 단백질의 특성, 예를 들면, 안정성, 반감기, 생체이용효율, 인간 신체에서 내약성, 또는 면역원성을 개선할 수 있다. 이를 달성하기 위하여, 클루스테린은 예로써 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합된다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 기술된 공지된 방법으로 수행할 수 있다.

이런 이유로, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 클루스테린은 PEG화 된다.

다른 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 Ig 융합을 포함한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 좀더 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 짧은 링커 펩티드를 통하여 달성될 수 있다. 상기 링커는 예로써 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 또는 클루스테린 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생성된 융합 단백질은 체액에서 연장된 체류 시간(반감기), 증가된 특이적 활성, 증가된 발현 수준과 같은 향상된 특성을 보유한다. Ig 융합은 융합 단백질의 정제 역시 용이하게 할 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 클루스테린, 또는 한쪽이나 양쪽 아단위는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 예로써 인간 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. Ig 분자의 다른 동등형 역시 본 발명에 따른 융합 단백질, 예를 들면, 동등형 IgG₂ 혹은 IgG₄, 또는 다른 Ig 종류(가령, IgM)의 산출에 적합하다. 융합 단백질은 단일체 또는 다합체이고, 이종- 또는 동종다합체이다. 융합 단백질의 면역글로불린 부분은 Fc-수용체에 대한 보충 결합 또는 보충 캐스케이드(cascade)를 활성화시키지 않거나 상기 수용체에 결합하지 않는 방식으로 더욱 수식될 수 있다.

또한, 본 발명은 말초 신경 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로, 클루스테린과 면역억제제 조합의 용도에 관한다. 면역억제제는 스테로이드, 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드, 항-백혈구 항체(가령, CAMPATH-1) 등일 수 있다

또한, 본 발명은 클루스테린과 IL-6의 조합에 관한다.

헤파린 투여는 클루스테린 생체이용효율을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌는데, 이런 이유로, 본 발명은 말초 신경 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로, 클루스테린과 헤파린 조합의 용도에 관한다.

본 명세서에서 “헤파린”은 “본 발명의 배경기술”에 기술된 것과 같은 당분야에 공지된 헤파린과 헤파리노이드, 예를 들면, 저분자량 헤파린(LMWH)을 의미한다.

또한, 본 발명은 말초 신경 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조 에서, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로, 클루스테린과 인터페론 조합의 용도에 관한다.

본 명세서에서 “인터페론”은 예로써 “본 발명의 배경기술”에 기술된 임의 종류의 IFN를 비롯하여 기존 문헌에 정의된 임의의 분자를 포괄한다. 적절하게는, 인터페론은 인간으로부터 유래되지만, 생물학적 활성이 인간 인터페론과 유사하고 분자가 인간에서 면역원성이 아니라면 다른 종으로부터 유래될 수도 있다.

특히, 임의 종류의 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ은 상기 정의에 포함된다. IFN-β가 본 발명에 따른 바람직한 IFN이다.

본 명세서에서 “인터페론-베타(IFN-β)”는 생물학적 유체로부터 분리, 또는 원핵이나 진핵 호스트 세포로부터 DNA 재조합 기술로 수득되는 인간 섬유아세포 인터페론, 이의 염, 기능성 유도체, 변이체, 유사체, 단편을 포괄한다.

인터페론은 또한 단백질의 안정성을 개선하기 위하여 중합체에 공액될 수 있다. 인터페론 β와 폴리올 폴리에틸렌글리콜(PEG) 사이의 중합체는, 예로써 WO99/55377호에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 인터페론은 인터페론-β(IFN-β)이고, 더욱 바람직하게는 IFN-β1a이다.

적절하게는, 클루스테린은 인터페론과 동시에, 순차적으로, 또는 개별적으로 사용된다.

또한, 본 발명은 말초 신경 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조 에서, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로, 클루스테린과 오스테오폰틴 조합의 용도에 관한다.

본 명세서에서 “오스테오폰틴”은 오스테오폰틴의 뮤테인, 단편, 활성 분획물, 기능성 유도체를 포괄한다. 이들 단백질은 예로써 WO 02/092122에서 기술한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 클루스테린은 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 100 ㎎, 또는 대략 1 내지 10 ㎎, 또는 대략 5 ㎎의 양으로 사용된다.

또한, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 핵산 분자의 용도에 관하는데, 여기서 핵산 분자는 아래에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다:

(a) SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;

(b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(j) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 동등형, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 순환 변이된 유도체.

핵산은 예로써 근육내 주사에 의해 나신 핵산 분자로서 투여될 수 있다.

핵산은 인간 신체, 바람직하게는 적절한 세포 또는 조직에서 핵산 분자에 의해 인코딩된 유전자의 발현에 유용한 벡터 서열, 예를 들면, 바이러스 서열을 추가로 포함할 수 있다.

이런 이유로, 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 발현 벡터 서열을 추가로 포함한다. 발현 벡터 서열은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 목적 유전자의 발현에 작용하는 요소를 추가로 포함한다. 이들은 프로모터 및 인헨서 서열, 선택 마커 서열, 복제 기원 등과 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 유전자 치료 방식은 질환의 치료 및/또는 예방에 유효하다. 적절하게는, 클루스테린의 발현은 in situ에서 진행된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 근육내 주사로 투여될 수 있다.

충분하지 않은 양으로 클루스테린을 발현하거나 또는 클루스테린의 발현에 통상적으로 침묵하는 세포에서 클루스테린의 내인성 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본 발명에 따라 고려된다. 상기 벡터는 목적 세포에서 클루스테린을 발현하도록 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 예로써 프로모터 또는 인헨서이다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입될 수 있는데, 여기서 상기 조절 서열은 발현의 유도 또는 강화가 요구되는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 “내인성 유전자 활성화(EGA)”라 한다(참조: WO 91/09955).

또한, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 클루스테린을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.

또한, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에 있어 클루스테린을 생산하도록 유전적으로 변형된 세포에 관한다. 따라서, 인체의 적절한 부위에 약물을 전달하기 위하여 세포 치료 방식이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관하는데, 이들은 제약학적 효과량의 클루스테린 및 제약학적 효과량의 헤파린을 함유하고, 선택적으로 제약학적 효과량의 면역억제제를 추가로 함유한다.

또한, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관하는데, 이들은 제약학적 효과량의 클루스테린 및 제약학적 효과량의 인터페론을 함유하고, 선택적으로 제약학적 효과량의 면역억제제를 추가로 함유한다.

또한, 본 발명은 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관하는데, 이들은 제약학적 효과량의 클루스테린 및 제약학적 효과량의 오스테오폰틴을 함유하고, 선택적으로 제약학적 효과량의 면역억제제를 추가로 함유한다.

“제약학적으로 수용가능한”은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 담긴 주사용 단위 약형으로 조제될 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(가령, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 국소, 척수강내, 직장, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 다른 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코딩하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(가령, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현하고 분비하도록 하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반제와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여될 수 있다.

장관외(가령, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반제(가령, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(가령, 만니톨) 또는 화학적 안정성(가령, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 냉동 건조된 분말 형태로 조제될 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균된다.

본 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 인체 내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자를 폴리에틸렌글리콜에 부착시켜 개선할 수 있다(참조: PCT 특허 출원 WO 92/13095).

활성 단백질의 치료요법적 효과량은 단백질의 유형, 단백질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔류 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 클루스테린 활성의 비-독성 수준 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.

개체에 투여되는 단일 또는 다중 섭취량은 약동학적 특성, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 목적 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다.

“치료요법적 효과량”은 말초 신경 질환에 유익한 효과를 발휘하는 클루스테린의 투여량이다. 개체에 단일 또는 복수 투약되는 용량은 클루스테린 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다.

적절하게는, 클루스테린은 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 10 ㎎, 대략 0.01 내지 5 ㎎, 대략 0.1 내지 3 ㎎, 또는 대략 1 내지 2 ㎎의 함량으로 사용된다. 대안으로, 클루스테린은 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 1000 ㎍, 대략 1 내지 100 ㎍, 또는 대략 10 내지 50 ㎍의 양으로 사용된다.

본 발명에서 바람직한 투여 경로는 피하 경로를 통한 투여이다. 본 발명에서 더욱 바람직한 투여 경로는 근육내 투여이다.

다른 바람직한 구체예에서, 클루스테린은 매일 또는 격일로 투여된다.

일일 섭취량은 분할 분량으로 또는 원하는 결과를 달성하는데 효과적인 서방 형태로 제공된다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 최초량 또는 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 용량으로 수행될 수 있다. 2차 또는 후속 투여는 발병 동안 또는 발병에 앞서 투여될 수 있다.

본 발명에 따라, 클루스테린은 예방이나 치료 목적으로 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약물(가령, 다중 약물 섭생), 특히 인터페론에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 개체에 투여될 수 있다. 다른 치료제와 동시에 투여되는 활성 약물은 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 병든 환자에 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제를 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법에 관한다.

또한, 본 발명은 병든 환자에 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 헤파린을 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법에 관한다.

또한, 본 발명은 병든 환자에 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 인터페론을 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법에 관한다.

또한, 본 발명은 병든 환자에 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 오스테오폰틴을 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법에 관한다.

논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 특허 혹은 외국 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면 모든 데이터, 표, 도면 및 이들 언급된 자료에 기재된 참고문헌은 여기에 순전히 참조로 한다. 이에 덧붙여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체 내용은 순전히 참조로 한다.

공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 교시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다.

특정 구체예의 전술한 설명에서는 본 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이런 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 개시된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에 이용된 용어는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.

본 발명은 상세하게 기술되었기 때문에, 아래에 예로써 제시된 실시예를 참조하면 더욱 용이하게 이해할 수 있지만, 이들 실시예는 본 발명을 한정하지 않는다.

실시예 1: 클루스테린의 재조합 발현

표지된 재조합 뮤린 또는 재조합 인간 클루스테린(각각, m-클루스테린과 h-클루스테린)은 HEK 세포에서 발현시키고 아래와 같이 정제하였다:

C-말단 태그를 보유하는 재조합 단백질을 함유하는 배양 배지 샘플(100 ㎖)은 1 볼륨의 냉각 완충액 A(50 mM NaH₂PO₄; 600 mM NaCl; 8.7%(w/v) 글리세롤; pH 7.5)로 200 ㎖의 최종 부피로 희석하였다. 샘플은 0.22 ㎛ 무균 필터(Millipore, 500 ㎖ 필터 단위)에 여과하고 4℃, 무균 사각 배지 병(Nalgene)에 유지시켰다.

정제는 4℃에서, 자동 샘플 로더(Labomatic)에 연결된 VISION 워크스테이션(Applied Biosystems)에서 수행하였다. 정제 과정은 2가지 순차적 단계, 태그에 특이적인 친화성 크로마토그래피 및 Sephadex G-25 배지(Amersham Pharmacia) 칼럼(1.0 x 10 cm)에서 겔 여과로 구성되었다.

일차 크로마토그래피 단계에서 1.6 ㎖ 분획물에 수집된 용리 단백질이 산출된다.

이차 크로마토그래피 단계에서, Sephadex G-25 겔-여과 칼럼은 2 ㎖의 완충액 D(1.137 M NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH₂PO₄; 8 mM Na₂HPO₄; pH 7.2)로 재생하고, 이후 4 칼럼 볼륨의 완충액 C(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH₂PO₄; 8 mM Na₂HPO₄; 20%(w/v) 글리세롤; pH 7.4)로 평형화시켰다. 첫 번째 단계 친화성 칼럼으로부터 용리된 피크 분획은 Sephadex G-25 칼럼에 적하된 VISION에서 통합 샘플 로더를 자동적으로 통과하고, 단백질은 2 ㎖/min의 유속에서 완충액 C로 용리시켰다. 탈염된 샘플은 2.2 ㎖ 분획물에서 회수하였다. 분획물은 0.22 ㎛ 무균 원심분리 필터(Millipore)를 통하여 여과시키고 동결하며 80℃에서 보관하였다. 샘플 분량은 SDS-PAGE(4-12% NuPAGE 겔; Novex)에서 쿠마시 염색 및 항-태그 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

쿠마시 염색. NuPAGE 겔은 실온에서 0.1% 쿠마시 블루 R250 염색 용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)에 염색하고, 이후 배경이 투명하고 단백질 띠가 분명하게 드러날 때까지 20% 메탄올, 7.5% 아세트산에서 탈색하였다.

웨스턴 블랏. 전기영동이후, 단백질은 4℃, 290 mA에서 1시간동안 겔에서 니트로셀룰로오스 막으로 전기이전하였다. 막은 실온에서 1시간동안 완충액 E(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH₂PO₄; 8 mM Na₂HPO₄; 0.1% Tween 20, pH 7.4)에 담긴 5% 우유 분말로 차단하고, 이후 완충액 E에 담긴 2.5% 우유 분말에서 2가지 토끼 다클론 항-태그 항체(G-18과 H-15, 각각 0.2 ㎍/㎖; Santa Cruz)의 혼합물과 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 실온에서 추가로 1시간동안 배양한 이후, 막은 완충액 E(3 x 10 min)로 세척하고, 이후 2.5% 우유 분말을 함유하는 완충액 E에서 1/3000 희석된 이차 HRP-공액된 항-토끼 항체(DAKO, HRP 0399)와 함께 실온에서 2시간동안 배양하였다. 완충액 E(3 x 10 minutes)로 세척이후, 막은 ECL 키트(Amersham Pharmacia)로 1분동안 진전시켰다. 이후, 막은 Hyperfilm(Amersham Pharmacia)에 노출시키고, 상기 필름은 현상시키고, 웨스턴 블랏 영상은 시각적으로 분석하였다.

단백질 분석. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce)를 이용하여 결정하였다. 평균 단백질 회수는 100 ㎖ 배양 배지당 216 ㎍ 정제된 클루스테린이었다.

비-환원 SDS PAGE에서 수행된 정제 단백질의 분석에서, 상기 재조합 단백질은 이종이합체 구조의 고유 클루스테린을 보유하는 것으로 밝혀졌다(데이터 제시하지 않음).

실시예 2: 생쥐에서 좌골 신경 압좌에 의해 유발된 신경병증에 대한 클루스테린의 보호적 효과

약어

CMAP: 화합물 근육 활동 전위(compound muscle action potential)

DAC: 압좌이후 일수

DIV: 시험관내 일수

EMG: 근전도계(electromyography)

IGF-1: 인슐린-형 성장 인자

i.p.: 복강내

i.v.: 정맥내

S.C.: 피하

s.e.m.: 평균의 표준 편차(standard error)

vs: 대(versus)

도입

본 연구는 서로 다른 섭취량으로 클루스테린 처리된 생쥐에서 신경 재생을 평가하기 위하여 수행된다. 상기 모델에서 신경과 축삭(감각 및 운동 뉴런)의 생존 및 재생, 수초화 또는 대식세포 염증에 대한 클루스테린의 긍정적인 효과는 운동 기능의 회복을 유도한다. 재생은 감각운동 기능의 회복 및 형태학적 연구에 따라 측정될 수 있다. 따라서, 본 연구에서 전기물리학적 기록 및 조직형태학적 분석이 병행하여 수행된다.

재료 및 방법

동물

72 마리의 8 주령 암컷 C57bl/6 RJ 생쥐(Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, France)를 이용하였다. 이들은 6개 군으로 나누었다(n = 12): (a) 운반제 정상(sham operated) 군; (b) 운반제 신경 압좌 조작 군; (c) 신경 압좌/m-클루스테린(300 ㎍/㎏); (d) 신경 압좌/m-클루스테린(1000 ㎍/㎏); (e) 신경 압좌/4-메틸카테콜(10 ㎍/㎏); (f) 신경 압좌/오스테오폰틴(100 ㎍/㎏). 오스테오폰틴(OPN)은 뼈와 이빨의 광화된 세포외 기질의 주요 구성요소인 고도 인산화된 시알로단백질이다. 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 이의 용도 또는 이의 활성의 항진제로서 용도는 WO 02092122에서 청구한다.

이들 생쥐는 군별로 수용하고(우리당 12마리) 조절된 온도(21-22℃) 및 역진된 명암 주기(12h/12h)의 공간에 유지하며 음식 및 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구소 가이드라인에 따라 수행하였다.

좌골 신경 손상

동물은 60 ㎎/㎏ 케타민 클로로하이드레이트(Imalgene 500™ Rhone Meieux, Lyon, France)의 IP 주사로 마취시켰다. 우측 좌골 신경은 넓적다리 중간 수준에서 외과적으로 노출시켜 좌골 신경의 삼분기(trifurcation) 기부에 5 ㎜ 압좌시켰다. 신경은 지혈제 집게(폭 1.5 ㎜; Koenig; Strasbourg; France)로 30초동안, 각 압좌 사이에 90도 회전으로 2회 압좌시켰다.

실험 및 약리적 처리의 계획

근전도계(EMG) 시험은 수술일(기준선) 전에 1회 및 조작이후 2주 동안 매주 수행하였다.

신경 압좌 수술일은 0 일(D)로 간주하였다. 압좌이후 4일 동안 검사를 수행하지 않았다.

체중 및 생존율은 매일 기록하였다.

신경 손상일로부터 연구 종결 시점까지, m-클루스테린(HEK 세포로부터 유래된 재조합 m-클루스테린) 및 4-메틸카테콜은 매일 복강내(i.p) 경로로 투여되는 반면, 오스테오폰틴은 SC 경로로 매일 투여되었다.

2번째 주에, 형태학적 분석을 수행하기 위하여 군당 4마리 동물을 희생시키고 좌골 신경을 절개하였다.

전기물리학적 기록

전기물리학적 기록은 Neuromatic 2000M 근전도계(EMG)(Dantec, Les Ulis, France)를 이용하여 수행하였다. 생쥐는 100 ㎎/㎏ 케타민 클로로하이드레이트(Imalgene 500™ Rhone Meieux, Lyon, France)의 복강내 주사로 마취시켰다. 정상적인 체온은 가열 램프로 30℃로 유지시키고 접촉 온도계(Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, France)를 꼬리에 위치시켜 조절하였다.

화합물 근육 활동 전위(CMAP)는 최대 강도(12.8 mA)로 좌골 신경의 단일 0.2 ms 자극이후 비복근에서 측정하였다. 활동 전위의 진폭(mV), 지연 시간(ms), 지속 기간(탈분극과 재분극 기간에 요구된 시간)을 측정하였다. 진폭은 활성 운동 단위의 수를 나타내고, 원위 지연 시간은 운동 신경 전도와 신경근육의 전달 속도를 간접적으로 반영한다.

형태학적 분석

형태학적 분석은 신경 압좌이후 2주 시점에 수행하였다. 군당 4마리의 무작위 선택된 동물을 본 분석에 이용하였다. 이들 생쥐는 100 ㎎/㎏ Imalgene 500™의 IP 주사로 마취시켰다. 조직학적 분석을 위해 좌골 신경의 5 ㎜ 분절을 절개하였다. 상기 조직은 인산염 완충액 용액(pH = 7.4)에서 4% 수성 용액 글루타르알데하이드(Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, France)로 하룻밤동안 고정시키고, 사용 때까지 30% 수크로오스 용액에 4℃에서 유지시켰다. 신경은 인산염 완충액에 담긴 2% 오스뮴 테트록사이드(Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, France)에서 2시간 동안 고정시키고, 일련의 알코올 용액에서 탈수시키고, Epon에 포매시켰다. 포매된 조직은 중합화 반응을 위해 3일 동안 70℃에 놓아두었다. 1.5 ㎛의 횡 단면은 마이크로톰으로 만들고 1%의 톨루이딘 블루(Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, France)로 2분 동안 염색하며 탈수시키고 유키트(Eukitt)에 위치시켰다. 압좌 부위의 중간에서 횡 단면을 얻었다. 형태학적인 분석과 섬유 계산은 반자동화된 디지털 이미지 분석 소프트웨어(Biocom, France)를 이용하여 신경 절편의 전체 영역에서 수행하였다. 퇴행하는 수초화 섬유와 비-퇴행하는 수초화 섬유의 비율을 분석하였다. 다소엽성 축삭형질(multi-lobular axoplasm) 및/또는 미엘린 수초를 보이는 수초화 섬유는 퇴행이 진행되는 섬유로 간주하였다. 아래의 모수: 축삭 영역, 미엘린 영역, 섬유 영역(축삭과 미엘린 면적)을 계산하였다.

데이터 분석

데이터의 전체 분석은 분산의 한가지 인자 또는 반복된 측정 분석(ANOVA)과 일원 ANOVA 및 비-모수적 검증(mann whitney test)을 이용하여 수행하였다. 적절한 경우에, Dunnett 검증을 추가로 이용하였다. 유의성 수준은 p <0.05로 설정하였다. 결과는 평균 ± 평균의 표준편차(s.e.m.)로 표시하였다.

결과

모든 동물은 신경 압좌 절차이후 생존하였다. 전체 연구 기간동안, 여러 마리의 생쥐가 마취로 인하여 사멸하였다: 2일에, 생쥐 n°8(신경 압좌/오스테오폰틴 군)과 생쥐 n°12(신경 압좌/1 ㎎/㎏ m-클루스테린 군); 7일에, 생쥐 n°9(신경 압좌/운반제 군)와 생쥐 n°9(신경 압좌/1 ㎎/㎏ m-클루스테린 군)

동물 체중

도 2에 도시된 바와 같이, 모든 동물은 수술이후 2-3일동안 체중에서 약간의 증가를 보였다. 이후, 동물은 체중의 점진적인 회복을 보였다. m-클루스테린으로 상이한 처리는 처리되지 않은 생쥐에 비하여 좌골 신경 압좌된 생쥐의 체중에서 유의한 변화를 유도하지 않았다.

전기물리학적 측정

화합물 근육 활동 전위의 진폭(도 3):

정상(sham-operated) 동물에서, 전체 연구 기간동안 CMAP 진폭에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 좌골 신경의 압좌는 D7과 D14에 정상 동물의 개별 수준에 비하여 >90% 감소된 CAMP 진폭을 유도하였다. 좌골 신경이 압좌된 생쥐를 300 ㎍/㎏ 또는 1 ㎎/㎏의 클루스테린, 또는 100 ㎍/㎏의 오스테오폰틴으로 처리하면, 이들 생쥐는 처리되지 않은 생쥐에 비하여 CAMP 진폭에서 유의한 증가(대략 1.5배)를 보였다. 유사하게, 4-MC 처리 역시 신경 압좌된 생쥐의 CMAP 진폭을 강화시키진 하지만, 클루스테린 또는 오스테오폰틴의 수준에는 미치지 못하였다.

화합물 근육 활동 전위의 지연 시간(도 4):

정상(sham-operated) 동물에서, 전체 연구 기간동안 CMAP 지연 기간에서 악화는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 좌골 신경 압좌된 생쥐는 정상 동물보다 1.2배 높은 CAMP 지연 기간을 보였다. 클루스테린 또는 오스테오폰틴으로 처리된 좌골 신경 압좌된 생쥐는 생쥐에서, CAMP 지연 기간 수치는 처리되지 않은 생쥐의 수치에 입하여 유의하게 감소하였다. 7일에, 이런 효과는 0.3 ㎎/㎏ 클루스테린과 0.1 ㎎/㎏ 오스테오폰틴 처리이후 관찰되었다. 14일에, 양 농도의 클루스테린은 유효하였다.

화합물 근육 활동 전위의 지속 기간(도 5):

정상(sham-operated) 동물에서, CMAP 지속 기간은 기준 수치와 통계학적으로 상이하지 않았다. 대조적으로, 좌골 신경 압좌된 생쥐는 CMAP 지속 기간의 유의한 연장을 보였는데, 특히 D14에 지속 기간은 정상 동물보다 3배 높았다.

좌골 신경 압좌된 생쥐를 300 ㎍/㎏ 클루스테린 또는 오스테오폰틴으로 처리하는 경우에, 이들 생쥐는 신경 압좌된 운반제 처리된 동물에 비하여 유의하게 감소된 CMAP 지속 기간을 보였다.

형태학적 분석

형태학적 분석은 14일에 실험 종결이후 수행하였다.

퇴행된 섬유(도 6)와 비-퇴행된 섬유(도 7)의 비율

도 6에 도시된 바와 같이, 정상(sham-operated) 동물(대조)의 좌골 신경에서 퇴행된 섬유의 비율은 <20%이었다. 좌골 신경이 압좌의 대상인 경우에, 퇴행된 섬유의 비율은 최대 60%까지 유의하게 증가하였다(압좌/운반제). 300 ㎍/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 클루스테린으로 생쥐의 처리는 처리되지 않은 군에 비하여 퇴행된 섬유의 비율을 유의하게 증가시켰다.

반대로, 정상 동물(대조)에서 비-퇴행된 섬유의 비율은 좌골 신경 압좌된 처리되지 않은 동물(압좌/운반제)보다 2배 높았다(도 7). 300 ㎍/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 클루스테린 처리는 비-퇴행된 섬유의 밀도를 유의하게 증가시켰다.

결론

신경 압좌 모델은 말초 신경병증의 매우 극적인 모델이다. 신경 압좌 직후, 큰 직경을 보유하는 대부분의 섬유는 기계적인 손상에 기인하여 손실되어, CMAP 진폭의 강한 감소가 유발된다. CMAP 지연 시간은 즉시 영향을 받지는 않지만 이차적인 면역 매개된 퇴행(대식세포, 과립세포)에 의해 소직경 섬유의 부가적인 퇴행에 의해 14일에 증가를 보인다. CMAP 지속 기간은 7일에 증가하여 14일에 피크를 이룬다. 21일에, 압좌 손상은 신경병증 상태와 관련하여 흥미로운 부가적 과정인 재생을 가능하게 한다.

클루스테린은 생쥐 신경 압좌 모델에서 측정된 모든 모수에 보호적 효과를 보였다. 압좌 2주후에 수행된 형태학적 연구는 퇴행 섬유의 비율에서 유의한 감소 및 전체 섬유수의 증가를 입증한다. 클루스테린은 본 연구에 사용된 조절 분자, 4-메틸카테콜 만큼 유효하다. 기능적 및 조직학적 회복에 대한 이런 긍정적인 효과는 아래에 대한 클루스테린 효과에 기인하는 것으로 생각된다:

- 이차 면역 매개된 퇴행으로부터 섬유의 직접적인 보호;

- 가속화된 재수초화 및 축삭의 보호;

- 가속화된 재생/손상된 축삭의 발아;

- 대식세포에 의한 증가된 미엘린 잔해 청소.

- 액소토미(axotomy)에 대한 대식세포 반응의 조절.

실시예 3: 클루스테린의 피하 투여는 좌골 신경 압좌이후 기능 회복을 가속화시킨다.

도입

신경 재생에 대한 클루스테린 처리의 장기적인 지속 효과를 조사하기 위하여, 두 번째 생쥐 군은 4주동안, HEK 세포에서 생산된 재조합 인간 클루스테린의 매일(5회/week, s.c.) 투여로 처리하였다.

재료 및 방법

생쥐는 아래와 같이 6개 군(n = 6)으로 나누었다:

(a) 운반제 신경 압좌 조작 군;

(b) 신경 압좌/h-IL6(30 ㎍/kg);

(c) 신경 압좌/h-클루스테린(0.1 ㎎/kg);

(d) 신경 압좌/h-클루스테린(300 ㎍/kg);

(e) 신경 압좌/h-클루스테린(1 ㎎/kg).

이들 동물에 재조합 생쥐 클루스테린의 복강내 주사 대신에 HEK 세포에서 생산된 재조합 인간 클루스테린(h-클루스테린)을 피하 주사(100 ㎕/생쥐)한 점을 제외하고, 실시예 2에 기술된 과정을 수행하였다. 운반제는 NaCl 0.9%, BSA 0.02%이었다. 양성 대조는 재조합 인간 IL-6(30 ㎍/kg, s.c.)이었다.

근전도와 체중 모수는 상기한 바와 같이 평가하였다.

전기물리학적 기록

화합물 근육 활동 전위(CMAP)는 최대 강도(12.8 mA)로 좌골 신경의 단일 0.2 ms 자극이후 비복근에서 측정하였다. 활동 전위의 다양한 모수, 예를 들면, 진폭(mV), 지연 시간(ms), 지속 기간은 압좌된 측면의 비복근 및 반대 측면(반대측)의 비복근에서 압좌이후 0일, 7일, 14일, 21일, 28일에 상기한 바와 같이 평가하였다.

콜린 아세틸 전이효소(ChAT) 활성

실시예 3에 기술된 4주간의 처리이후, 생쥐는 마취시키고 희생시켰다. 반대측과 동측 비복근은 수집하고 신경 감응의 지표인 콜린 아세틸 전이효소(ChAT) 활성을 분석하였다. ChAT 활성은 냉각 아세틸-CoA를 제외하고 0.05 μCi에 상응하는 0.25 nmol의 ³H-아세틸-CoA를 첨가한 점을 제외하고, Contreras 등(Contreras et al., 1995)에 의해 기술된 프로토콜에 따라 측정하였다.

신경섬유-고분자량 형태(NF-H)

NF-H와 이의 인산화된 형태는 축삭 성숙의 지표이다(Riederer et al., 1996). 실시예 3에 기술된 4주간의 처리이후, 생쥐는 마취시키고 희생시켰다. 신경은 수집하고 삼중 세정제 완충액에서 추출하며, 샘플은 단백질 분석 키트(Pierce)로 단백질 함량 및 샌드위치 ELISA로 NF-H 정량을 측정하였다.

NF-H ELISA에 이용된 프로토콜은 아래와 같다: 포획 항체, 생쥐 단클론 항체 SMI 31(1/2500 인산화된 항-NF-H; Sternberger)은 4℃, PBS에서 하룻밤동안 배양하였다. 평판은 1% BSA를 함유하는 PBS로 1시간동안 차단하였다. 샘플과 함께 2시간동안 배양한 이후, 검출 항체, 토끼 단클론 N4142 항-NF(1/1000; Sigma)는 PBS-BSA에서 희석하고, 2시간동안 배양하며, 항-토끼 HRP 공액된 항체(1/3000, Sigma; PBS-BSA에서 희석됨, 1시간)와 함께 배양이후 과산화효소로 노출시켰다. 492 nm에서 판독된 각 흡광도는 소 NF-H(Sigma)의 표준 곡선, 이후 각 샘플의 단백질 함량에서 기록하였다.

결과

전기물리학적 특정

화합물 근육 활동 전위의 진폭(도 8):

압좌 1주후, CMAP 진폭은 IL-6(30 ㎍/kg), h-클루스테린(100, 300 또는 1000 ㎍/kg), 또는 운반제로 처리된 동물 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 15일에서부터 28일까지, h-클루스테린과 IL-6으로 처리된 좌골 신경 압좌된 생쥐는 CMAP 진폭의 점진적인 증가를 보였다. 4주후, 클루스테린으로 처리된 생쥐의 CMAP 진폭은 처리되지 않은 생쥐에서 수준에 비하여, 매우 유의한 증가를 보였다.

화합물 근육 활동 전위의 지연 시간:

화합물 근육 활동 전위의 지연 시간은 운반제, 재조합 인간 IL-6(30 ㎍/kg) 또는 h-클루스테린(100, 300, 1000 ㎍/kg)으로 처리된 신경병증 생쥐에서 측정하였다. 동측과 반대측 측정은 좌골 신경 손상이후 1, 2, 3 또는 4주 시점에 수행하였다. 결과는 아래의 표(표 4)에 보고한다:

[표 4]

a: 반대측 수치에 대한 Anova 단일 인자 검증

b: 운반제 처리된 군에 대한 Anova 단일 인자 검증

이탤릭체로 표시된 숫자는 표준 오차(SD)를 나타낸다

N=6마리 생쥐/군 # p< 0.1, * p< 0.05, ** p< 0.01, *** p<0.005

0.1 ㎎/kg 클루스테린으로 처리된 생쥐에서 7 DAC를 제외하고, 전체 연구 기간동안 반대측 CMAP 지연 시간의 악화는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 동측 CMAP 지연 시간은 압좌이후 증가하였다. IL-6과 클루스테린으로 처리된 생쥐에서, 동측 CMAP 지연 시간은 처리되지 않은 생쥐에 비하여 유의하게 감소하였다. 21과 28 DAC에서, 재조합 hIL-6과 클루스테린 투여(1과 0.3 ㎎/kg)는 지연 시간 회복을 유의하게 개선하였다.

화합물 근육 활동 전위의 지속 기간

상기한 바와 같이, 화합물 근육 활동 전위의 지속 기간은 반대측과 동측에서 모든 군에서 측정하고, 결과는 아래의 표 5에 보고한다:

[표 5]

A: 반대측 수치에 대한 Anova 단일 인자 검증

b: 운반제 처리된 군에 대한 Anova 단일 인자 검증

이탤릭체로 표시된 숫자는 표준 오차(SD)를 나타낸다

N=6마리 생쥐/군; # p< 0.1, * p< 0.05, ** p< 0.01, *** p<0.005

운반제 처리된 군에서, 동측 CMAP의 지속 기간은 압좌이후 증가하고, 4주후에 반대측 수치로 환원되었다. 클루스테린 처리(1과 0.3 ㎎/kg)는 CMAP 지속 기간의 전체적인 증가를 감소시키고 회복을 가속화시켰다.

콜린 아세틸 전이효소(ChAT) 활성(도 9):

압좌 4주후, 동측 비복근에서 ChAT 활성(도 9a)은 완전하게 회복되지는 않았다. 클루스테린 처리는 비복근에서 ChAT 활성을 약간 회복시켰다(p<0.1). h-클루스테린으로 처리된 생쥐의 반대측 근육에서 ChAT 함량은 운반제 처리된 동물에 비하여 증가를 보였다(도 9b).

신경섬유-고분자량 형태(NF-H)(도 10):

압좌 4주후, 운반제 처리된 군에서, 좌골 신경의 근부(압좌 상부; 도 10b)와 원부(압좌 하부, 도 10c)에서 NF-H의 수준은 반대측 신경(도 10a)에서 NF-H의 수준에 비하여 차이가 없었다. 클루스테린 처리는 압좌된 신경의 반대측과 근부에서 NF-H의 함량을 증가시켰다.

결론

15일간 처리(실시예 2)이후 달성된 이들 결과는 신경-압좌 모델을 치료하는데 있어 클루스테린의 유익한 효과를 입증한다. 치료 시점에 따라, 화합물 근육 활동 전위(CMAP)의 모든 조사된 모수, 다시 말하면, 지연 시간, 지속 기간, 진폭에서 효과가 관찰되었다. 클루스테린 처리는 또한, 압좌된 신경과 반대측 신경에서 ChAT와 NF-H 함량을 증가시켰다. 체중 전개에서 부작용은 관찰되지 않았다(데이터 제시하지 않음).

실시예 4: 클루스테린은 성숙 조각 배양액에서 미엘린 기초 단백질(MBP) 형성을 자극한다.

도입

손상이나 질병이후 신경 재생의 조절은 축삭과 발아뿐만 아니라 새로운 미엘린 합성을 요구한다. 수초화는 정상적인 신경 전도 및 예로써 흥분독성(excitotoxicity) 또는 면역학적 공격으로부터 축삭 보호에 필요하다. 미엘린 회복은 주로 개체발생 현상(ontogenetic event)의 발생반복(recapitulation)이기 때문에(Capello et al., 1997; Kuhn et al., 1993), 발달 수초화(developmental myelination)를 모방하는데 기관형 해마 조각 배양액을 이용하였다. 더욱 정확하게는, 성숙 희돌기교세포와 슈반 세포의 단백질을 대표하는 미엘린 기초 단백질(MBP) 수준을 ELISA로 모니터하였다.

재료 및 방법

기관형 해마 조각 배양액

기관형 해마 조각 배양액은 Stoppini 등(Stoppini et al., 1991)의 방법에 따라 준비하였다. 간단히 말하면, 해마는 5일령 C57/Bl6 생쥐로부터 얻었다. Mcillvain 조직 절단기를 이용하여, 500-마이크론 두께 조각을 절단하였다. 이후, 조각은 1 ㎖ 배양 배지(50% MEM, 25% HBSS, 25% 말 혈청)를 포함하는 6웰 평판에 배치된 Millicell-CM 삽입물에 위치시켰다. 배양액은 6일째까지 5% CO₂, 37℃에 유지시키고, 이후 33℃로 이전하였다. 배지는 3일마다 교체하였다.

발달 수초화

시험관내에서 첫 3주동안 정상적으로 발생하는 수초화를 증가시키는 클루스테린의 능력을 검사하였다.

조각은 7일에서부터 17일까지, 말 혈청(25%)을 함유하는 배지에 담긴 m-클루스테린(1 ㎍/㎖, 100 ng/㎖, 10 ng/㎖)으로 먼저 처리하였다. 처리는 2일마다 재개하였다.

처리 종결 시점(각각 시험관내에서 10일, 13일, 17일에 해당하는 처리 3일, 6일, 10일)에서, 조각(군당 6개 조각)은 삼중 세정제 완충액에서 용해시키고, MBP 함량을 MBP ELISA로 분석하였다.

본 실험은 2회 수행하고, 결과는 도 11에 도시한다.

이들 실험을 재조합 생쥐 클루스테린 대신에 HEK 또는 CHO 세포에서 생산된 재조합 인간 클루스테린으로 재현하는 경우에, 유사한 결과가 달성되었다(데이터 제시하지 않음).

MBP ELISA

서로 다른 시점에서 용해이후, 샘플은 단백질 분석 키트(Pierce)로 단백질 함량 및 샌드위치 ELISA로 NF-H 정량을 측정하였다.

MBP-ELISA에 이용된 프로토콜은 아래와 같다: 포획 항체, 생쥐 단클론 항체 항-MBP(1/5000; Chemicon)은 PBS에서 희석하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 평판은 1% BSA를 함유하는 PBS로 1시간동안 차단하였다. PBS에서 희석된 샘플은 2시간동안 배양하였다. PBS-BSA에 희석된 검출 항체, 토끼 다클론 항-MBP(1/300; Zymed)는 2시간동안 배양하고, 항-토끼 HRP 공액된 항체(1/3000, Sigma; PBS-BSA에서 희석됨, 1시간)와 함께 배양이후 과산화효소로 노출시켰다. 492 nm에서 판독된 각 흡광도는 MBP(InVitrogen)의 표준 곡선, 이후 각 샘플의 단백질 함량에서 기록하였다.

결과

배양 시작 시점에서, P4 생쥐(4일령)의 해마 조각은 검출가능 수준의 MBP를 발현하지 않았다. 해마 조각이 성숙함에 따라, ELISA로 검출되는 MBP의 수준은 21 DIV(시험관내 일수)후 안정적인 수준까지 증가하였다( 데이터 제시하지 않음).

7, 10 또는 14 DIV에 10, 100, 1000 ng/㎖의 재조합 h-클루스테린을 배양 배지에 첨가하면, 단백질 첨가 3일후에 수행된 MBP-ELISA에 의한 평가에서 해마 조각 배양액의 MBP 함량이 증가하였다. 1 ㎍/㎖ m-클루스테린으로 처리된 조각의 MBP 함량은 도 11에 도시한다. 이와 같은 MBP 증가는 미엘린 발달이 완결되면, 21 DIV에서 더 이상 관찰되지 않는다(데이터 제시하지 않음).

다른 농도의 m-클루스테린(10과 100 ng/㎖)과 h-클루스테린에서 유사한 결과가 달성되었다(데이터 제시하지 않음).

결론

클루스테린은 성숙 해마 조각에서 검출되는 전체량에 영향을 주지 않으면서 해마 조각 배양액에서 MBP 형성을 자극한다.

실시예 5: 클루스테린은 베이비 햄스터 보체(baby hamster complement)로 항-MOG 항체에 의한 해마 조각의 탈수초화로부터 보호한다.

도입

만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP)과 길리란-바레 증후군(GBS)의 특징인 미엘린의 파괴는 미엘린 보체를 비롯한 신경에 대한 자가면역반응의 존재에 기인하는 것으로 생각된다(Ho et al., 1998; Kwa et al., 2003; Steck et al., 1998). 항체-유도된 탈수초화를 모방하기 위하여, 기관형 해마 조각 배양액을 베이비 햄스터 보체와 함께 항-MOG(미엘린 희돌기교세포 당단백질)로 2일간 처리하는 시험관내 시스템을 설치하였다. 이런 처리는 이소타입 대응 대조 면역글로불린 처리가 현저한 탈수초화를 유도하지 않았기 때문에, 특이적인 탈수초화를 유발한다. 상기 시스템을 이용하여 클루스테린의 보호 효과를 검사하였다. 이런 패러다임에서, 클루스테린은 탈수초화 처리 하루전 및 처리와 동시에 첨가하고, MBP 수준은 ELISA로 모니터하였다(상세는 실시예 4를 참조한다).

재료 및 방법

탈수초화 프로토콜

실시예 4에 기술된 바와 같이 준비된 조각(기관형 해마 조각 배양액)은 21 DIV후 발생하는 발달 수초화의 종결 시점에 처리하였다.

탈수초화는 25% 말 혈청 함유 배지에 담긴 베이비 토끼 보체(1/60-1/30; CL-3441, Cedarlane)와 연관된 항-MOG 항체로 조각을 2일간 처리하여 유도하였다.

대조로서, 조각은 IgG1 무관한 항체(60 ㎍/㎖; M-7894, Sigma)로 처리하고, 보체 또는 조각은 처리하지 않았다.

처리 종결 시점에서, 조각(군당 5개 조각)은 삼중 세정제 완충액에 용해시키고, 미엘린 수준을 MBP ELISA로 분석하였다.

1 ㎍/㎖, 100 ng/㎖ 또는 10 ng/㎖의 재조합 생쥐 클루스테린은 탈수초화 처리 24시간 전에 적용하고, 처리 시점(총 3일)에 첨가하였다.

본 실험은 3회 수행하고, 결과는 도 12에 도시한다.

결과

본 실험의 결과는 도 12에 도시한다. 항-MOG/보체 처리 시점에서 10 ng/㎖ 정도의 클루스테린을 배지에 첨가하면, 탈수초로부터 보호가 현저하게 증가하였다.

결론

자가면역 매개된 탈수초화 모델에서, 클루스테린은 항-MOG와 보체에 의해 유발된 탈수초화로부터 보호한다.

실시예 6: 클루스테린과 헤파린의 동시 주입

도입

혈청에서, 클루스테린은 여러 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있고(Trougakos and Gonos, 2002; Jones and Jomary, 2002), 여러 추정 결합 부위를 제시한다(참조: 도 1, Rosenberg and Silkensen, 1995에 기초한 설계). 이들 중에서 4개는 헤파린-결합 도메인으로 생각된다. 클루스테린의 생체이용효율에 대한 이들 헤파린-결합 도메인의 관련성을 조사하기 위하여, 헤파린(본원에서, Liquemine(Roche))의 효과를 클루스테린 약동학적 관점에서 조사하였다.

재료 및 방법

일차 실험

8주령 C57Bl6 20 g 암컷 생쥐의 3개 군(3마리 생쥐/군)은 아래와 같이 i.v. 주입하였다:

- 1군: 100 ㎕의 NaCl 0.9%에 담긴 h-클루스테린(300 ㎍/kg)의 주입 5분전에, 100 ㎕의 NaCl 0.9%에 담긴 헤파린(7500 U/kg).

- 2군: 100 ㎕의 NaCl 0.9%에 담긴 h-클루스테린(300 ㎍/kg)과 헤파린(7500 U/kg)의 혼합 용액.

- 3군: 300 ㎍/kg의 h-클루스테린 단독.

혈액은 튜브에 클루스테린 주입이후 5분과 30분 시점에 수집하였다. 3군에 속하는 생쥐의 혈액은 헤파린을 포함하거나 포함하지 않는 튜브((+/- 헤파린)에 수집하였다. 클루스테린의 존재는 아래에 기술된 ELISA 검사로 조사하였다.

이차 실험

8주령 C57Bl6 20 g 암컷 생쥐의 3개 군(4마리 생쥐/군)은 아래와 같이 i.v. 주입하였다:

- 1군: 100 ㎕의 NaCl 0.9%에 담긴 h-클루스테린(1 ㎎/kg)의 주입 5분전에, 100 ㎕의 NaCl 0.9%에 담긴 헤파린(7500 U/kg). 1군은 100 ㎕의 NaCl 0.9%에 담긴 클루스테린(1 ㎎/kg)과 헤파린(7500 U/kg)의 혼합 용액을 섭취하였다.

- 2군: 1 ㎎/kg의 h-클루스테린 단독. 헤파린(7500 U/kg)은 h-클루스테린 주입 28분후(30분 채혈 시점에서 2분전)에 주입하였다.

- 3군: 1 ㎎/kg의 h-클루스테린 단독.

혈액은 클루스테린 주입이후 5분과 30분 시점에 수집하였다. 이후, 아래에 기술된 ELISA 검사를 이용하여 혈청에서 클루스테린 수준을 모니터하였다.

클루스테린 ELISA

단클론 항체 41D(1/1000-50 ㎕, Upstate N.05-354)를 포획 항체로 이용하여 샌드위치 ELISA를 개발하였다. 잔여 결합 부위는 실온에서 차단 완충액(0.5M NaCl에서 1% BSA(분획 V)/0.1% Tween-20)으로 차단하였다. 재조합 인간 클루스테린을 함유하는 혈청은 PBS에서 연속 희석하여 검사하였다. PBS/0.05% Tween-20에서 4회 세척이후, 태그 비오틴 공액체(1/1000, Qiagen N.34440)를 노출 항체(revealing antibody)로서 이용하였다. 노출 항체의 존재는 실온에서 1시간동안 스트렙타비딘-HRP(PBS에서 1/5000, DAKO P0397), 이후 OPD 반응(Sigma)으로 모니터하였다.

결과

도 13A에 도시된 바와 같이, 클루스테린과 헤파린의 사전-배양(헤파린과 혼합된 클루스테린) 또는 클루스테린 주입에 앞서 헤파린의 사전-주사(클루스테린 이전에 주입된 헤파린)는 클루스테린 생체이용효율을 상당히 개선하였다(p<0.005). 대조적으로, 헤파린 포함 튜브에서 클루스테린의 수집은 검출되는 클루스테린의 수준을 변화시키지 않았다.

헤파린을 2차 채혈(이차 실험의 2군, 도 13B)에 앞서 투여하는 경우에, 혈청에서 검출되는 클루스테린 수준은 헤파린을 클루스테린과 동시-주입하는 경우에 비하여 유의하게 낮았다(p<0.05). 그럼에도 불구하고, 채혈에 앞서 주입된 헤파린은 클루스테린 단독에 비하여 검출가능 클루스테린의 수준을 약간 증가시켰다(p<0.1).

결론

헤파린 투여는 클루스테린 생체이용효율을 현저하게 향상시켰다(도 13A). 하지만, 완전한 효능을 위하여, 헤파린은 클루스테린 전달에 앞서 또는 전달과 동시에 주입되어야 한다(도 13B).

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SEQUENCE LISTING <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V. <120> USE OF CLUSTERIN FOR THE TREATMENT AND/OR PREVENTION OF PERIPHERAL NEUROLOGICAL DISEASES <130> 830 WO/PCT <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu 1 5 10 15 Ser Gly Gln Val Leu Gly Asp Gln Thr Val Ser Asp Asn Glu Leu Gln 20 25 30 Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys Glu Ile Gln Asn 35 40 45 Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn 50 55 60 Glu Glu Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys 65 70 75 80 Lys Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys 85 90 95 Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu 100 105 110 Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val 115 120 125 Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu 130 135 140 Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp 145 150 155 160 Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln Thr His Met Leu Asp Val Met 165 170 175 Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Phe Gln 180 185 190 Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr Tyr His Tyr Leu Pro 195 200 205 Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe Pro Lys Ser Arg 210 215 220 Ile Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Phe 225 230 235 240 His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Glu Ala Gln Gln 245 250 255 Ala Met Asp Ile His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro Thr 260 265 270 Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu Ile 275 280 285 Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys 290 295 300 Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln 305 310 315 320 Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg 325 330 335 Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met 340 345 350 Leu Asn Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp 355 360 365 Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu 370 375 380 Arg Val Thr Thr Val Ala Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser 385 390 395 400 Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr 405 410 415 Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser Arg Lys Asn Pro Lys Phe Met Glu 420 425 430 Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu 435 440 445 Glu

Claims

말초 신경 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 클루스테린, 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물, 순환 변이된 유도체 또는 이의 염, 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
제 1항에 있어서, 말초 신경 질환은 말초 신경계(PNS)의 외상성 신경 손상, PNS의 탈수초 질환, 말초 신경병증, 말초 신경퇴행성 질환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 말초 신경 질환은 선천성 대사 장애인 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 말초 신경 질환은 말초 신경병증인 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
제 4항에 있어서, 말초 신경 질환은 당뇨성 신경병증인 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
제 4항에 있어서, 말초신경병증은 화학요법-유도된 신경병증인 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 클루스테린은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도:

(a) SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;

(b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO: 1의 아미노산 228 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(g) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (f)중에서 적어도 하나의 서열에 적어도 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 동일성을 보유한다;

(h) 중간 엄밀도 조건 또는 높은 엄밀도 조건 하에서 (a) 내지 (f)중에서 어느 하나를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩된 (a) 내지 (f)중에서 임의 하나의 뮤테인;

(i) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열에서 임의의 변화는 (a) 내지 (f)에서 아미노산 서열에서 보존성 아미노산 치환체이다;

(j) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 염 또는 동등형, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 순환 변이된 유도체.
제 7항에 있어서, 기능성 유도체는 PEG 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 사용.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 융합 단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용되는 헤파린을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또 는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용되는 인터페론을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또 는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
제 11항에 있어서, 인터페론은 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 클루스테린은 체중 ㎏당 0.001 내지 100㎎, 또는 1 내지 10 ㎎, 또는 5 ㎎의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 클루스테린의 용도 또는 클루스테린 활성의 항진제의 용도.
말초 신경 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료제의 조제를 위한 핵산 분자의 용도에 있어서, 여기서 핵산 분자는 아래에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자의 용도:

(a) SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;

(b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO: 1의 아미노산 23 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 227을 포함하는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO: 1의 아미노산 228 내지 449를 포함하는 폴리펩티드;

(g) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (f)중에서 적어도 하나의 서열에 적어도 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 동일성을 보유한다;

(h) 중간 엄밀도 조건 또는 높은 엄밀도 조건 하에서 (a) 내지 (f)중에서 어느 하나를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩된 (a) 내지 (f)중에서 임의 하나의 뮤테인;

(i) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열에서 임의의 변화는 (a) 내지 (f)에서 아미노산 서열에서 보존성 아미노산 치환체이다;

(j) (a) 내지 (f)중에서 어느 하나의 동등형, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 순환 변이된 유도체.
제 14항에 있어서, 핵산 분자는 발현 벡터 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자의 용도.
말초 신경 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서, 세포에서 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제의 내인성 생산을 유도 또는 강화하기 위한 벡터의 용도.
유전자 치료를 위한 제 14항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 용도.
말초 신경 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서, 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제를 생산하도록 유전적으로 변형된 세포의 용도.
말초 신경 질환의 치료 또는 예방에 유효하고, 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께, 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 헤파린을 함유하는 제약학적 조성물.
말초 신경 질환의 치료 또는 예방에 유효하고, 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께, 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 인터페론을 함유하는 제약학적 조성물.
말초 신경 질환의 치료 또는 예방에 유효하고, 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께, 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 오스테오폰틴을 함유하는 제약학적 조성물.
선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제를 병든 환자에 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법.
선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 헤파린을 병든 환자에 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법.
선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 인터페론을 병든 환자에 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법.
선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 클루스테린 또는 클루스테린 활성의 항진제 및 오스테오폰틴을 병든 환자에 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경 질환의 치료 방법.