KR20050074313A

KR20050074313A - 세팔로스포린 ｃ 아실라제

Info

Publication number: KR20050074313A
Application number: KR1020050002553A
Authority: KR
Inventors: 폴레지오니로레다노; 필로네미렐라; 몰라지안루카; 쿠체티유제니오; 베르가로베르토; 카브리왈터
Original assignee: 안티비오티코스 에스.피.에이.
Priority date: 2004-01-12
Filing date: 2005-01-11
Publication date: 2005-07-18
Also published as: US7399624B2; CN1641019A; ITMI20040016A1; US20050158818A1; JP2005198655A; EP1553175A1

Abstract

대장균에서 발현에 대해 최적화된 천연 서열의 자리 지정, 무작위 또는 "자리 포화" 돌연변이유발에 의해 수득된 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 갖는 효소.

Description

세팔로스포린 Ｃ 아실라제{Cephalosporin C acylases}

본 발명은 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 갖는 효소, 이의 재조합 DNA 제조 방법, 상기 효소를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포 및 상기 효소를 통해 7-아미노-세팔로스포란산의 제조 방법에 관한 것이다.

세팔로스포린 C 아실라제는 세팔로스포린 C를 수 많은 반합성 세팔로스포린의 제조용 중간체인 7-아미노-세팔로스포란산(7-ACA)으로 전환하는 효소이다.

7-ACA가 화학 합성에 의해 세팔로스포린 C로부터 수득될 수 있지만, 효소 방법이 더욱 환경 친화적이고 비용이 저렴한 점에서 바람직하다.

7-ACA에서 세팔로스포린 C의 전환에 대한 통상적인 효소적인 절차는 2가지 상이한 효소인 D-아미노산 옥시다제(DAAO) 및 글루타릴 아실라제를 요한다. DAAO는 과산화수소의 부수적인 생산과 함께 세팔로스포린 C를 α-케토-아디포일-7ACA로 전환한다. α-케토-아디포일-7ACA는 이어서 과산화수소(산화 탈이민화에 의해 제조되고/되거나 반응 매질에 첨가됨)를 이용하여 글루타릴-7-ACA로 산화되며, 그 후에 글루타릴 아실라제는 글루타릴-7-ACA를 7-ACA로 가수분해한다. 통상적인 방법은 2가지의 별개의 효소 반응기를 요하며, 과산화수소의 존재 또는 첨가가 고정화된 효소를 불활성화시킬 수 있는데, 이는 플랜트를 손상시키고, 비용을 증가시킨다.

세팔로스포린 C를 7-ACA로 직접 가수분해할 수 있는 효소를 개발하기 위한 시도가 있었다. 슈도모나스(Pseudomonas) 균주로부터 분리된 SE83, N176 및 V22로 언급되는 3가지의 공지된 효소는 상기 능력을 가지나 (Journal of Fermentation and Bioengineering Vol. 72(4), 232-243, 1991), 이들의 아실라제 활성은 세팔로스포린 C보다 글루타릴-7ACA 에 대해 더 높다.

상기 효소의 특성, 특히 특이성, 안정성 및 활성을 개선시키기 위한 돌연변이체 및 재조합 DNA 제조 방법이 개시되어 있다 (US 5320948, EP 475652, EP 558241, US 5804429).

그러나, 동력학, 안정성, 활성 및 특이성의 면에서 개선된 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 가지며, 대량으로 발현될 수 있는 효소에 대한 요구가 여전히 존재한다.

본 발명의 주 목적은 하나 이상의 돌연변이가 삽입된 도 1(서열번호 1)에 보고된 아미노산 서열을 가지며, 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 갖는 효소를 제공하는데 있다.

세팔로스포린 아실라제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자를 슈도모나스 N176 유래의 공지된 아실라제의 서열에 기초하여 디자인하였다 (Aramori I. et al. (1991). Cloning and Nucleotide Sequencing of New Glutaryl 7-ACA and Cephalosporin C Acylase Genes from Pseudomonas Strains Journal of Fermentation and Bioengineering; 72(4), 232-243). 상기 아실라제가 글루타릴-7ACA 및 낮은 정도이지만 세팔로스포린 C 양자에 대해 활성이라는 것이 보고된다.

출발 유전자(야생형 HisVAC로 명명됨)를 디자인할 때, 다양한 변이를 삽입하였다:

- 270 위치에서 페닐알라닌의 도입; 상기 돌연변이(문헌으로부터 공지됨)는 세팔로스포린 C에 대한 활성을 증가시킨다(IIshii Y. et al. (1995) High-level production, chemical modification and site-directed mutagenesis of a cephalosporin C acylase from Pseudomonas strain N176 Eur. J. Biochem; 230, 773-778).

- 활성 자리 영역을 방해하지 않기 위해, C-말단에 부가적인 서열(아미노산 LEHHHHHH으로 이루어짐)의 도입(β 서브유닛의 첫번째 아미노산은 촉매화에 관련된다). 클로닝 및 발현 벡터로서 pET24 플라스미드를 이용하여 이은 크로마토그래피 정제를 용이하게 하기 위해 상기 서열을 도입하였다. 상기 플라스미드는 카나마이신에 내성이며, 단백질의 C-말단에 "His-Tag 서열" 및 N-말단에 "T7-Tag 서열"을 삽입할 수 있다. EcoRI, XhoI 및 NdeI의 제한효소 자리를 포함하는 영역을 pET24의 폴리링커를 통해 유전자 말단에 첨가하여, 플라스미드내로의 클로닝을 용이하게 하였다.

- 해당하는 아미노산 서열에서 원하지 않는 변경을 도입하지 않기 위해, 즉, 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)을 이용하여, 일부 염기의 치환에 의해 유전자내의 일부 제한효소 자리(BamHI 및 NheI)의 제거.

- 가장 많이 번역된 코돈을 이용하여 대장균 코돈 사용빈도에 대한 핵산 서열의 최적화(특히, 단백질의 N-말단 위치를 코딩하는 서열이 현저하게 변형됨), 주요 돌연변이는 하기이다:

1. 대장균에서 거의 사용되지 않는 글리신에 대한 GGA 코돈의 치환;

2. 대장균에서 거의 사용되지 않는 아르기닌에 대한 AGG 및 CGA 코돈의 치환;

3. 대장균에서 거의 사용되지 않는 이소류신에 대한 ATA 코돈의 치환;

4. 대장균에서 거의 사용되지 않는 프롤린에 대한 CCC 코돈의 치환;

5. 대장균에서 이들의 빈도에 따라, 글루탐산에 대한 GAG 및 GAA 코돈의 사용에서 균형;

6. 대장균에서 이들의 빈도에 따라, 페닐알라닌에 대한 TTT 및 TTC 코돈의 사용에서 균형;

7. 대장균에서 이들의 빈도에 따라, 글루타민에 대한 CAG 및 CAA 코돈의 사용에서 균형;

8. 대장균에서 이들의 빈도에 따라, 히스티딘에 대한 CAT 및 CAC 코돈의 사용에서 균형.

생성된 cDNA는 천연 N176 유전자와 63.7%의 서열 동일성을 가진다.

HisVAC를 코딩하는 cDNA는 이어서 화학 합성에 의해 수득하였다(Itakura K, Rossi JJ, Wallace RB Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Annu Rev Biochem. 1984; 53:323-56).

지금 일부 특정 돌연변이가 "야생형" 효소(이후부터 HisVAC로 언급함)의 특성을 현저하게 개선하는 것이 허용되다는 것을 발견하였다.

특히, 본 발명은 도 1(서열번호 1)에 보고된 아미노산 서열을 가지며, 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 갖는 효소를 제공하는데, 여기에서 하나 이상의 하기 돌연변이가 삽입되었다:

- Tyr, Phe, Glu 또는 Val를 이용하여 알라닌 215의 치환;

- Asn, Ser, Thr, Phe를 이용하여 히스티딘 296의 치환;

- 임의의 다른 아미노산을 이용하여 아스파르트산 416 및 히스티딘 417의 치환;

- 임의의 다른 아미노산을 이용하여 261, 271, 294, 297, 307, 308 및 309 위치의 아미노산의 치환.

특히 바람직한 것은 하기의 효소이다:

- 알라닌 215가 Tyr로 치환되고;

- 알라닌 215가 Phe로 치환되고;

- 알라닌 215가 Glu로 치환되고;

- 알라닌 215가 Val로 치환되고;

- 히스티딘 296이 Asn로 치환되고;

- 히스티딘 296이 Ser로 치환되고;

- 히스티딘 296이 Thr로 치환되고;

- 히스티딘 296이 Phe로 치환되고;

- 알라닌 215이 Tyr로 치환되고, 히스티딘 296이 Ser로 치환된다.

"야생형" 효소의 아르기닌 263은 치환되어서는 안된다.

본 발명의 효소는 하기를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다:

- 도 2(서열번호 2)에 보고된 핵산 서열의 자리 지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis), 무작위 또는 철저한(exhaustive) 돌연변이유발에 의해 수득가능한 DNA 서열의 박테리아 또는 진핵세포용 발현 벡터내로의 삽입;

- 상기 벡터를 이용하여 박테리아 또는 진핵세포의 형질전환;

- 상기 형질전환된 세포의 배양, 발현 산물의 추출 및 회수.

본 발명의 돌연변이된 서열은 이어서 통상적인 방법을 이용하여 플라스미드 발현 벡터에 삽입될 수 있는데, 이는 효소를 생산할 수 있는 대장균 컴피턴트 세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있다.

고찰된 산업적인 용도를 위해, 상기 효소는 세팔로스포린 C의 7-아미노-세팔로스포란산의 효소 전환에 사용된 수성 매질에 불용성인 합성 중합체와 같은 고체 담체에 연결될 수 있다. 아실라제의 고정화에 적합한 수지는 Sepabeads EC-EP (Resindion srl - Mitsubishi Chemical Corporation) 및 Eupergit C (Rohm - Degussa)와 같은 에폭시 작용기를 갖는 것, 또는 Sepabeads EC-has 및 EC-EA (Resindion srl - Mitsubishi Chemical Corporation)와 같은 1차 아미노기를 갖는 것의 아크릴형 구조를 갖는 것이다. 임의의 경우에, 상기 효소를 매트릭스에 결합하기 위해, 상기 효소는 작용기(에폭시드)의 높은 재활성을 통해 또는 글루타르알데히드와 같은 이작용성 물질을 이용한 수지의 활성화를 통해 상기 수지와 접촉하고, 고정화된다. 아실라제 고정화에 적합한 기타 수지는 폴리스티렌 수지, 매크로레티큘라(macroreticular) 수지 및 Sepabeads EC-Q1A와 같은 염기성 작용기를 갖는 수지이며; 상기 효소는 수지 상에 흡착된 후, 이작용성 물질(글루타르알데히드)를 이용한 가교에 의해 안정화된다.

실시예

실시예 1

미생물 배양 및 발효

HisVAC에 대한 발현 플라스미드를 포함하는 대장균 균주를 한천 플레이트로부터 분리된 단일 콜로니를 배양하면서 유지하였다. 모든 균주는 상이한 한천 배지, 특히 pH 7.0 및 하기 조성을 갖는 LB 및 LB 밀러 배지(1% 글루코오스의 존재 및 부재)에서 만족스러운 성장 속도를 보였다:

LB = 트립톤(췌장 카제인 다이제스트) 10g/l; 효모 추출액 5g/l; NaCl 5g/l;

LB 밀러 = 트립톤(췌장 카제인 다이제스트) 10g/l; 효모 추출액 5g/l; NaCl 10g/l.

한천 플레이트를 37℃에서 1일 동안 배양한 후, 세포를 긁어내었다. 콜로니는 몇 주 동안 플레이트를 4℃에서 유지할 때 생존해 있었다.

세포를 멸균 용액에 현탁하고, 현탁액(OD₆₀₀= 4으로 키움)을 34㎍/ml 클로람페니콜 및 30㎍/ml 카나마이신을 포함하는 LB 밀러 배지를 갖는 플라스크(또는 플라스크에서 생장기의 완료 후에 발효기)내로 옮겼다. 배양물을 37℃, 200rpm에서 3시간 동안 OD₆₀₀= 0.8으로 키웠다(대수기). 생산기 후에, 0.6 mM IPTG의 첨가로 유도한 후, 세포를 21℃ 또는 25℃에서 3-5시간 동안 키웠다.

야생형 HisVAC 아실라제의 추출 및 정제

HisVAC는 세포내 아실라제이며; 발효 후에 배양물 브로쓰를 원심분리하고, 세포막의 용해를 화학적(세제 또는 수산화나트륨의 수초 동안 첨가) 또는 물리적(프레스 또는 유리 비드 밀) 처리에 의해 수행하였다. 바람직한 방법은 포스페이트 또는 피로포스페이트 완충액(pH 7.5-8)과 같은 완충용액에서 세포 페이스트의 재현탁에 이은 600-800 바에서 French Press o Rannie 균질기를 이용한 용해이다. 세포 용해물은 선택적으로 고분자전해질의 존재하에 원심분리 또는 미세여과(컷오프 0.45㎛)에 의해 투명해진다. 상기 조(crude) 효소를 포함하는 투명해진 용액은 크로마토그래피에 의해 정제된다. 바람직한 절차는 히스티딘 태깅된 단백질을 선택적으로 흡착할 수 있는 금속 이온(예를 들면, 아연 또는 니켈)을 결합하는 이미노디아세트산기를 갖는 킬레이트 수지를 포함하는 칼럼을 통한 정제이다. 적합한 크로마토그래피 수지는 HiTrap Chelating (Amersham Biosciences) 및 Sepabeads FP-IDA (Resindion srl - Mitsubishi Chemical Corporation)이다. 매우 순수한 HisVAC 아실라제는 증가하는 이미다졸 농도 또는 pH 변화를 이용한 용출에 의해 수득될 수 있다.

정제된 HisVAC는 pH 5 내지 9의 범위에서 120분 동안 인큐베이션 후에 안정하다. 효소 활성은 5-10 범위의 반응액의 pH의 함수로서 증가하며, 30분 동안 반응 후에 40℃에서 최고치에 도달한다.

pET24△-HisVAC 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)pLysS의 배양을 통한 HisVAC 아실라제의 생산

1) 미생물 제조

HisVAC를 코딩하는 cDNA (야생형 및 돌연변이체, 2322 bp)를 NdeI 및 BamHI 제한효소로 절단하였다. 상기 cDNA를 NdeI-BamHI-절단된 pET24△(BglII-Tth111I)-HisVAC 발현 플라스미드에 해당하는 3.6 kb 단편에 연결하였다. 상기 플라스미드는 BglII 및 Tth111I 제한효소에 의해 7.6 kb pET24-HisVAC 플라스미드(XhoI/NdeI 제한효소로 처리된 전체 VAC cDNA (2.3kb)의 XhoI/NdeI로 절단된 5.3kb 단편의 pET24 플라스미드내로의 클로닝에 의해 수득됨)의 절단, 4984 bp 단편의 회수, Klenow 효소를 통한 접착성 말단의 블런팅(blunting) 및 연결에 의해 수득되었다. 생성된 pET△-HisVAC는 BL21(DE3)pLysS 대장균 세포를 형질전환하기 위해 사용된다. 상기 형질전환된 세포를 34㎍/ml 클로람페니콜 및 30㎍/ml 카나마이신을 포함한 LB-한천 플레이트에 옮기고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 상기 플레이트로부터 선발하고, 34㎍/ml 클로람페니콜 및 30㎍/ml 카나마이신을 포함하는 액체 LB 밀러 배지 750 ml에서 배양하였다. 상기 세포에서 pET24△-HisVAC 플라스미드의 존재를 회수된 플라스미드 DNA의 제한효소 분석에 의해 검사하였다.

2) 발효

a) 생산기(Productive phase)

pET24△-HisVAC 플라스미드로 형질전환된 BL21(DE3)pLysS 대장균 세포를 34㎍/ml 클로람페니콜 및 30㎍/ml 카나마이신을 포함한 고체 LB-한천 배지에서 37℃에서 24시간 동안 발효하였다. 상기 세포를 100ml의 멸균 용액에 재현탁하고, 15ml의 현탁액(OD₆₀₀= 4로 키움)을 34㎍/ml 클로람페니콜 및 30㎍/ml 카나마이신을 포함한 750ml의 LB 밀러 배지를 포함하는 2 리터 플라스크(또는 생장기의 완료까지 플라스크에서 성장에 이어 발효기내로)내로 옮겼다. 배양물을 37℃, 200rpm에서 3시간 동안 OD₆₀₀= 0.8으로 키웠다(대수기).

b) 유도기

생산기 후에, 0.6 mM IPTG의 첨가로 유도하였다. 유도 후에, 세포를 21℃ 또는 25℃에서 키우고; 가장 높은 효소 생산은 3-5시간 후에 도달하였다.

실시예 2

야생형 HisVAC 아실라제의 추출 및 정제

실시예 1에 기재된 4.5리터의 브로쓰로부터 수득된 세포 페이스트(13 g, HisVAC 아실라제의 90U에 해당함)를 0.7㎍/ml 펩스타틴을 갖는 39 ml의 50mM 인산염 완충액/pH7.5에 재현탁하였다. 상기 현탁액을 4℃로 냉각하고, 프렌치 프레스를 통과시켰다. 용해물을 39000g에서 60분 동안 원심분리하여 투명하게 하였다. 총 90유닛에 해당하는 1.8 U/ml의 HisVAC 아실라제 활성을 갖는 50ml의 투명해진 용액을 수득하였다. 상기 조(crude) 시료를 이전에 니켈 이온으로 적재되고, 50mM 소듐 피로포스페이트 완충액, 1 M NaCl 및 20 mM 이미다졸 완충액, pH 7.2로 평형화된 5ml HiTrap 킬레이팅 칼럼(Amersham Biosciences)상에 적재하였다. HisVAC 아실라제를 6ml의 50mM 소듐 피로포스페이트 완충액, 500mM 이미다졸, 10% 글리세롤, pH7.2를 이용하여 용출하였다. 정제된 효소는 기질로서 글루타릴-7ACA를 이용하여 12 U/ml (총 72 유닛)의 활성 및 6.5 U/mg 단백질의 비활성(specific activity)을 가졌다.

실시예 3

EC-EP Sepabead 상에 HisVAC 아실라제의 고정화

1g의 EC-EP Sepabeads를 100 유닛의 아실라제를 포함하는 10ml의 1M 포타슘 포스페이트 완충액/pH8.0에 20℃에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 약한 교반하에 방치한 후, 추가로 12시간 동안 20℃에서 정치시켰다. 수지를 여과로 회수하고, 25mM 포타슘 포스페이트 완충액, pH 8.0으로 세정하였다. 생성된 생물촉매는 기질로서 글루타릴-7ACA를 이용하여 35-40 U/g의 고정화된 활성을 가졌다.

실시예 4

용액에서 HisVAC 아실라제를 이용한 세팔로스포린 C의 전환

0.053g 세팔로스포린 C(이수화물 나트륨염, 순도 86%)를 20ml의 100mM 포타슘 포스페이트 완충액, pH 8 (2.27 g/l, 순도 100% 가정함)에 용해하고, 6.4ml 정제된 아실라제(총 167.2 유닛)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 희석한 수산화나트륨의 첨가에 의해 pH 8로 유지하면서 교반하에 20℃에서 인큐베이션하였다. 7-ACA로의 최대 전환은 150분 후에 달성된다(92.8% 전환, HPLC).

실시예 5

돌연변이체 제조

1. 자리 지정 돌연변이유발

핵산 돌연변이를 이중가닥 DNA의 특정 자리에 돌연변이를 도입하도록 하는 "QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" (STRATAGENE)를 이용하여 도입하였다. 관심 있는 유전자를 포함하는 이중가닥 pET24△-HisVAC 및 원하는 돌연변이를 갖는 2개의 프라이머를 또한 사용하였다. 해당하는 벡터 가닥에 각각 상보적인 프라이머는 높은 정확도로 플라스미드 가닥 양자를 복제하는 PfuTurbo DNA 중합효소를 이용하여 신장하였다. PCR 후에, 혼합물을 Dpn I (부모(parental) DNA를 절단하기 위해 사용되는 메틸화된 DNA에 대해 특이적인 내부절단효소)으로 처리하고, 산물을 XL1-Blue 슈퍼컴피턴트 세포를 형질전환하기 위해 사용하였고, 이로부터 DNA를 추출하여 대장균 발현 균주 BL21(DE3)pLysS를 형질전환하였다.

하기 PCR 프로그램에 따라 약 50ng의 주형 DNA(pET24△-HisVAC); 125ng의 각각의 프라이머; 2.5U PfuTurbo DNA 중합효소를 사용하였다:

95℃ 30초, 14 사이클(95℃ 30초, 57℃ 1분, 68℃ 12분) 및 4℃ ∞

자리 지정 돌연변이유발에 의해 수득된 돌연변이된 단백질을 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제하였다.

2. 자리 포화 돌연변이유발(Site-saturation mutagenesis)

무작위 재조합 HisVAC 돌연변이체의 라이브러리를 수득하기 위해, 자리 포화(또는 철저한(exhaustive)) 돌연변이유발을 이용하였는데, 이는 단백질의 동일한 위치에 20개의 아미노산 중의 임의의 하나를 삽입하는 것을 허용하기 때문이다. 이 기술은 특정 표적 코돈에 상이한 돌연변이를 도입하기 위해 축퇴된 올리고뉴클레오티드의 사용에 있다. 상기 올리고뉴클레오티드를 "포화"되는 위치에 대응하여 동일몰의 뉴클레오시드 혼합물(dA, dC, dG, dT)을 이용하여 합성하였다. 생성된 돌연변이체 유전자 집단은 무작위 코돈을 갖는 동일한 유전자로 이루어진다. 상이한 클론에서, 상기 코돈은 임의의 아미노산을 코딩할 수 있으므로, 하나의 특정 표적 잔기에서 모든 가능한 아미노산 치환을 갖는 돌연변이체의 라이브러리를 수득한다. pET24△-AcyHis 발현 플라스미드를 DNA 주형으로서 이용하고, 특정 잔기(예를 들면, 위치 215 및 296에서의 아미노산)를 코딩하는 코돈의 모든 3개 염기에서 축퇴된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하였다.

또한 자리 특이적 돌연변이유발에 사용된 "QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit"(STRATAGENE)을 이용하여 돌연변이를 도입하였다. 돌연변이된 DNA를 이용하여 발현 균주 BL21(DE3)pLysS를 형질전환하였다. 돌연변이된 클론을 스크리닝하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제하였다.

3. 무작위 돌연변이유발

재조합 HisVAC 효소 돌연변이체의 라이브러리를 에러 유발성 PCR을 통해 관심 있는 유전자의 증폭에 의해 제조하였다. 증폭을 상이한 돌연변이유발 조건하에 수행하였다:

a. 10% DMSO, 1mM 2-머캅토에탄올 및 높은 사이클수;

b. [Mn⁺⁺]= 0.5mM, [Mg⁺⁺]= 0.25mM, [dGTP] 및 [dATP]= 0.2mM, [dCTP] 및 [dTTP] = 1mM.

pET24△-AcyHis 발현 플라스미드(하기 참고)를 DNA 주형으로 이용하고, 2개의 고안된 올리고뉴클레오티드인 RND-ACY-EXT (5'-CGAGATCTCGATCCCGCGAAA-3') 및 RND-ACY-UP (5'-AACCAACCGTTTCATGATGCTTCGGC-3')를 프라이머로 이용하였다. 상기 프라이머는 하기 모식도에 보여준 바와 같이, NdeI 및 BamHI 제한효소 자리 옆의 벡터 영역에 어닐링한다:

DNA 주형 (7.6 kb)으로부터 증폭된 밴드(~1.6 kb)를 분리하기 위해, PCR 산물을 모으고, 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 증폭된 DNA를 겔 정제하고, NdeI 및 BamHI 제한효소로 절단하였다. 절단 혼합물을 아가로스 겔 상에 적재하고, 관심 있는 단편(~ 1.4 kb)을 회수하고, 겔 정제하였다. 추출된 DNA를 NdeI 및 BamHI 제한효소로 O.N. 절단하고; 3.6kb 및 1.4kb의 2개의 단편을 수득하였다. 관심 있는 단편(3.6 kb)을 회수하고, 겔 정제하였다. 돌연변이유발 조건하에 증폭되고, 절단되고, 정제된 AcyHis 효소를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 pET24△(BglII-Tth111)-AcyHis에 연결하였다. 연결 혼합물을 사용하여 대장균 균주 JM109를 형질전환하였다.

대장균 BL21(DE3)pLysS (발현 균주)에 "돌연변이체 라이브러리"를 옮기기 위해, 세포를 모든 수득된 돌연변이체를 포함하는 플라스미드 DNA 의 풀(pool)로 형질전환하였다. 상기 목적을 위해, 연결 산물을 이용한 JM109 세포의 형질전환에 의해 수득된 모든 콜로니를 선택 배지에서 재현탁하고, 전체 플라스미드 DNA를 추출하였다. 상기 DNA를 사용하여 BL21(DE3)pLysS 발현 균주를 형질전환하였다.

실시예 6

돌연변이유발에 의해 수득된 돌연변이체의 특성 규명

돌연변이체 및 HisVAC 아실라제의 역학 변수는 37℃, 0.1M 포스페이트 완충액, pH 8.0에서 세팔로스포린 C 또는 글루타릴 7-ACA의 가수분해를 측정하여 결정하였다(이어서 25℃에서의 유닛으로 전환함). 7-ACA의 양은 변형된 Bulasingham 방법(Biochem. Biophys. Acta 276, 250, 1972)을 이용하여, p-디메틸아미노벤즈알데히드와 반응시 생성되는 415nm (쉬프 염기(Schiff base))에서의 황색 강도를 측정하여 표준 곡선을 이용하여 분광측정으로 결정하였다.

1 아실라제 유닛은 분석 조건하에 분당 1마이크로몰의 7-ACA를 생산하는 효소(용액 중 또는 고정화된)의 양이다.

하기 표에 보고된 데이타에 따라, 본 발명의 돌연변이체는 야생형 HisVAC 아실라제와 비교하여 글루타릴-7-ACA 보다 세팔로스포린 C에 대해 더욱 양호한 역학 특성을 가진다.

더욱이, 돌연변이체 A215Y는 25℃보다 높은 온도에서 더욱 안정하다.

산물 저해 데이타는 하기 표에 보고된다. 데이타는 야생형 HisVAC에 대해 돌연변이된 아실라제의 산물 저해의 현저한 변화를 보여준다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 돌연변이체는 야생형 HisVAC 아실라제의 특성을 현저하게 개선한다.

도 1a 내지 도 1D는 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 갖는 효소의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2a 내지 도 2b는 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> antibioticos s.p.a. <120> cephalosporin C acylase <130> 7186meur <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 782 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. <400> 1 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 80 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 85 90 95 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 160 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 165 170 175 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 245 250 255 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Phe Tyr Ala 260 265 270 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 320 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 325 330 335 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 405 410 415 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 480 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 485 490 495 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 560 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 565 570 575 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 640 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 645 650 655 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 720 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 725 730 735 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 Gln Glu Leu Val Pro Ala Leu Glu His His His His His His 770 775 780 <210> 2 <211> 2349 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. <400> 2 atgactatgg cagctaatac ggatcgtgcg gttttacaag cggcgctgcc tccgttgtct 60 ggttccctgc cgattccggg cctctcggca agcgtgcggg tgcggcgtga tgcttggggt 120 atccctcata tcaaagcaag tggtgaagcg gatgcatacc gcgctcttgg cttcgttcat 180 tctcaagatc ggttgttcca aatggaactt acccggcgca aagcgctggg tcgtgctgcg 240 gagtggcttg gggcggaggc cgctgaggcg gacatcctgg tccgccgtct gggtatggaa 300 aaagtctgtc gccgcgattt cgaggctctc ggcgttgaag cgaaagatat gttacgggcc 360 tacgttgccg gggtgaatgc cttcctggca tcgggggcac ctctgcctgt ggaatacggc 420 ctgcttggtg cggaaccgga accatgggaa ccatggcaca gtatcgcggt tatgcgccgc 480 ttgggcctgc tgatggggtc tgtgtggttt aaattatggc ggatgcttgc actgccggtc 540 gtgggggctg ctaacgcgtt aaaactgcgc tatgacgacg gcgggcggga tctcttgtgc 600 attccgccgg gcgccgaggc tgatcggctt gaggcggacc tcgcgacgct ccgcccagcg 660 gtcgatgcgc tgctgaaagc catgggtggg gatgctagcg acgccgctgg cgggggcagc 720 aataactggg ccgtcgctcc gggccgcacc gcaaccggtc gtccgatcct ggccggtgat 780 ccgcatcggg tttttgagat tccgggtttt tatgctcaac atcacttagc atgtgaccgt 840 tttgatatga ttggtctgac cgtgcctggc gtcccgggct tcccacattt tgcccataac 900 ggtaaggtcg catattgtgt gacccacgca tttatggata tccacgatct ttatctggaa 960 cagttcgcag gcgaaggtcg gacggcgcgc ttcggtaacg acttcgaacc ggtggcctgg 1020 tcccgcgacc gtattgcggt tcgtggcggg gccgaccgtg aatttgatat tgtcgagacg 1080 cgtcacgggc cggttatcgc aggtgaccca cgggatggtg cagcgctgac gctgcggagc 1140 gttcagtttg cggaaacgga cctctcgttt gactgcctca ctcgcatgcc gggggccagc 1200 accgttgcgc agctgtatga tgctacccgt ggctgggggt tgattgatca caacctcgtc 1260 gccggggatg tcgcaggctc gatcgggcac cttgtgcgtg cacgggtgcc gagtcgtcca 1320 cgcgagaatg ggtggttacc ggtgcctggc tggagcggtg agcacgaatg gcggggctgg 1380 atccctcatg aagctatgcc tcgcgttatt gatcctccgg gtggtattat cgtgacggcc 1440 aacaaccggg tcgttgcgga cgaccaccct gattacttgt gcacggactg ccatccgccg 1500 taccgtgccg aacgcatcat gaaacggttg gttgcgaatc ctgcgtttgc tgtggacgat 1560 gccgccgcca tccacgcaga tactctgagt ccgcacgtcg ggctgctgcg ccgccgtctg 1620 gaagccctgg gcgcccgcga cgattcggcc gcagagggtc tccgtcagat gctggtcgcc 1680 tgggatggtc gcatggatgc agcgtccgaa gtcgcctctg cctacaatgc attccgtcgg 1740 gcgctgaccc gtctggttac tgatcggtcc gggctggaac aggctattag tcatccattt 1800 gccgcggtgg caccgggcgt ttctccacag ggccaggtgt ggtgggcggt tccgacttta 1860 ttgcgggacg atgacgctgg tatgctgaag ggttggtcct gggatcaagc attatcggaa 1920 gcgctgagcg ttgccagcca aaatctgact ggtcgctcgt ggggtgaaga acatcgtccg 1980 cgctttactc atcctctggc aactcagttt ccagcttggg caggtttgct taatccagcg 2040 agccgcccga ttggcggcga tggggatact gtcctggcga atggcctggt tccaagcgca 2100 ggccctcagg cgacgtatgg cgccttatcc cggtatgtgt tcgatgtcgg caactgggac 2160 aacagtcgtt gggtggtgtt tcatggcgca tccggtcatc cggcgagtgc gcattatgcg 2220 gaccagaatg cgccatggag tgattgtgcc atggtcccaa tgctgtattc ttgggatcgc 2280 attgcggcgg aagcggtgac ctctcaggaa ttagtcccgg ctctcgagca ccaccaccac 2340 caccactga 2349

Claims

하나 이상의 하기 돌연변이가 도입된, 아미노산 서열(서열번호 1)을 가지며, 세팔로스포린 C 아실라제 활성을 갖는 효소:

- 알라닌 215를 Tyr, Phe, Glu 또는 Val로 치환하고;

- 히스티딘 296를 Asn, Ser, Thr, Phe로 치환하고;

- 아스파르트산 416 및 히스티딘 417을 임의의 다른 아미노산으로 치환하고;

- 아미노산 261, 271, 294, 297, 307, 308 및 309를 임의의 다른 아미노산으로 치환함.
제 1 항에 있어서, 알라닌 215가 Tyr로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항에 있어서, 알라닌 215가 Phe로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항에 있어서, 알라닌 215가 Glu로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항에 있어서, 알라닌 215가 Val로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘 296이 Asn로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘 296이 Ser로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘 296이 Thr로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘 296이 Phe로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌 215이 Tyr로 치환되고, 히스티딘 296이 Ser로 치환된 것을 특징으로 하는 효소.
하기를 포함하는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 효소의 제조 방법:

- 핵산 서열(서열번호 2)의 자리 지정, 무작위 또는 철저한(exhaustive) 돌연변이유발에 의해 수득가능한 DNA 서열의 박테리아 또는 진핵세포용 발현 벡터내로의 삽입;

- 상기 벡터를 이용하여 박테리아 또는 진핵세포의 형질전환;

- 상기 형질전환된 세포의 배양, 발현 산물의 추출 및 회수.
적당한 아실화제의 존재하에 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 효소를 이용하여 세팔로스포린 C의 가수분해 및 아실화를 포함하는 세팔로스포린의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 효소를 코딩하는 핵산 서열.
제 13 항의 서열을 포함하는 발현 벡터.
제 14 항의 벡터로 형질전환된 세포.