KR20040057278A

KR20040057278A - 오미자 추출물을 이용한 심혈관 질환의 예방 및 치료용조성물

Info

Publication number: KR20040057278A
Application number: KR1020020083946A
Authority: KR
Inventors: 류미라; 윤병구
Original assignee: 한국식품개발연구원
Priority date: 2002-12-26
Filing date: 2002-12-26
Publication date: 2004-07-02

Abstract

본 발명은 에스트로겐성 활성을 가진 오미자의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다

본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 활성을 가진 조성물을 제공한다. 상기 에스트로겐성 활성은 동맥혈관 확장 및 혈관평활근세포 성장억제의 효능인 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 일반적인 생약인 오미자 추출물로 에스트로겐성 활성을 가진 조성물을 제조할 수 있고, 종래의 식물성 에스트로겐과 다른 물질을 함유한다. 또한 부작용이 없는 식물성 에스트로겐으로서 합성 에스트로겐을 대체할 수 있는 생리적 활성의 안전성이 매우 우수한 물질이다.

따라서 본 발명에 의하면 순환기 계통의 장애로 인하여 발생하는 협심증, 심근경색, 심장병, 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화, 혈액순환 장애, 신경통, 당뇨병, 성기능 장애, 기억력 장애 등 질환에 대한 예방 및 치료와, 그 외의 에스트로겐 결핍에 의한 질환의 예방 및 치료시에 처방될 수 있는 안전하고 우수하고 저렴한 식물성 에스트로겐 조성물 및 기능성 식품을 제공할 수 있다.

Description

오미자 추출물을 이용한 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for prevention and remedy of cardiovascular disease with the extract of schizandrae fructus}

본 발명은 오미자 추출물을 이용한 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 에스트로겐성 활성을 가진 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

한국여성 사망 제 1 원인은 심혈관질환(31%)으로 특히 폐경 이후 그 위험이 급증하며, 주요 원인은 노화로 인한 여성호르몬결핍으로 지적되고 있다. 현재 호르몬결핍증의 예방 및 치료에 호르몬대치요법이 사용되고 있으며, 특히 장기복용으로 폐경 후 심혈관질환 위험이 반감되는 것으로 보고되고 있다.

임상적으로 호르몬투여법은 현재 경구투여법이 가장 널리 사용되나 매일 복용하는 번거로움이 있고, 또한 위장관을 통한 흡수 중 60-90%가 대사되므로 다량이투여되어야 하기 때문에, 상대적으로 혈중 에스트로겐(estrogen) 농도가 상승된다. 또한 흡수된 간문맥을 통하여 일차적으로 간대사에 영향을 주는 단점이 있다.

임상적으로 사용되는 호르몬요법의 주요 작용기전은 혈중 지방 수준(lipid profile)을 개선시키며, 고혈압 환자에 대해서는 혈압을 낮출 수 있고, 동맥혈전증의 독립된 위험인자인 혈중 피브리노겐, Lp(a) 및 플라스미노겐 활성억제 인자 1(plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1))의 농도를 낮추며, 혈소판응집을 억제시키는 것이다.

다수의 연구에 따르면, 에스트로겐은 혈청 지방 농도상을 개선시키는데, 폐경후 여성을 에스트로겐으로 치료하면 혈청 총 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질(low density lipoprotein; LDL) 콜레스테롤 농도가 감소하고, 혈청 고밀도 지단백질 (high-density lipoprotein; HDL) 콜레스테롤 및 삼중글리세라이드(Triglyceride) 농도는 증가하며, 혈청 Lp(a) 지단백질 농도는 감소하였다(PEPI 실험을 위한 집필 그룹(The Writing Group for the PEPI Trial)의 문헌[JAMA 1995;273:199-208]; [Erratum, JAMA 1995;274;1676.]).

또한, 수개의 응고 작용 및 섬유소 용혈성 단백질을 위한 유전자의 간 발현도 에스트로겐에 의해 조절된다. 또한, 에스트로겐은 동맥혈전증의 독립된 위험인자인 혈중 피브리노젠(fibrinogen), Lp(a) 및 플라스미노겐 활성억제인자(plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1))의 농도를 낮추며 혈소판응집을 억제시킨다.

한편, 에스트로겐을 장기간 투여하면, 레닌(renin)의 혈장 농도가 감소되고, 안지오텐신-전환 효소(angiotensine-converting enzyme)와 엔도테린-1(endothelin-1)과 안지오텐신 II 수용체 유형 1(angiotensine II receptor type 1)을 위한 유전자가 혈관에서 감소될 뿐만 아니라, 산화질소(nitric oxide, NO) 대 엔도테린-1의 비가 혈장내에서 증가된다. 이들 변화로 혈관확장을 증진시키게 되고 고혈압 환자의 혈압을 낮출 수 있게 된다[(쉰케르트(Schunkert, H.) 등의 문헌 [Circulation 1997;95:39-45]),(프로우들러(Proudler, A.) 등의 문헌[Lancet 1995;346:89-90]) 및 엔도테린-1(일리코칼라(Ylikorkala, O.) 등의 문헌[J Clin Endocrinol Metab 1995;80: 3384-7]),(니켄니그(Nickenig, G.) 등의 문헌 [Circulation 1998;97:2197- 201]),(베스트(Best, P.J.M.) 등의 문헌[Ann Intern Med 1998;128:285-8])].

난포호르몬은 관상동맥을 확장시키며, 내피세포의 산화질소(NO)와 프로스타사이클린(prostacycline)의 생성증가에 의한 혈관내피세포 의존성확장, 및 혈관평활근세포의 칼슘 채널(Ca²⁺channel)과 평활근세포에 대한 엔도텔린-1(endothelin-1)의 작용억제로 내피세포 비의존성확장을 유도한다.

혈장막에 위치한 에스트로겐 수용체는 비게놈성 방식으로 산화질소 합성 효소를 신속하게 활성화시킨다. 이것은 내피 세포에서 산화질소 합성 효소(nitric oxide synthetase) 활성의 에스트로겐-유도 자극이 특정한 에스트로겐-수용체 길항제에 의해서 차단된다는 관찰결과와 일치하고(첸(Chen, Z.) 등의 문헌[J Clin Invest 1999;103;401-6]; 란틴-헤모소(Lantin-Hermono, R.L.)의 문헌[Am J Physiol 1997;273:L119-L126]; 카울린-글라서 등의 문헌[Circ Res 1997;81:885-92]), 에스트로겐 수용체 α는 내피 산화질소 합성 효소를 직접 활성화시킬 수 있다는 관찰결과와도 일치하는 것이다(카라스 등의 문헌[Circulation 1994;89: 1943-50], 벤코브 등의 문헌[Circulation 1996;94;1402-7]; 카울린-글라서 등의 문헌[J Clin Invest 1996;98;36-42]; 코이케(Koike, H.) 등의 문헌[J Vasc Surg 1996;23:477-82]).

에스트로겐은 프로스타사이클린(prostacycline) 합성 효소 및 산화질소 합성 효소와 같은 중요한 혈관확장 효소를 위한 유전자의 발현을 증가시키는데, 이로써 에스트로겐의 신속한 혈관확장 효과의 일부를 설명할 수 있다. 또한, 에스트로겐은 산화질소 합성 효소의 유도를 위한 유전자의 발현을 증가시켜 혈관 내에서 산화질소의 생체 이용률을 증가시킬 수 있다(빈코 등의 문헌[Am J Physiol 1998;274: H853-H859]).

생리학적 농도에서, 에스트로겐은 산화질소 및 환형 구아노신 모노포스페이트 -의존성 경로(NO and cyclic guanosine monophosphate-dependent pathway)를 통해서 칼슘-활성화 칼륨 채널(Ca²⁺-activated K⁺-channels)의 개방을 자극하고, 이런 방식으로 평활근을 완화시키고 혈관확장을 증진시킨다(화이트 등(White, R.E.) 등의 문헌[Circ Res 1995;77:936-42]; 웰만(Wellman G.C.) 등의 문헌[Circ Res 1996;79: 1024-30]).

폐경전 여성에서의 임상적인 관상 동맥 질환(coronary artery disease; CAD)의 발병율은 매우 낮다. 그러나, 폐경 후 죽종형성성 위험 인자가 증가하고(예컨대, 증가된 LDL, 감소된 HDL), 임상적인 관상 질환 발생 비율이 남성에서 관찰되는수치까지 상승된다. 여성에서 보다 일반적인 당뇨병은 임상적인 CAD의 발병율을 증가시키고 긴장 항진증, 고지혈증, 및 흡연의 해로운 효과를 증폭시킨다. 호르몬 대체 치료법(에스트로겐과 함께 또는 프로게스틴이 없이)을 폐경후에 사용하면 해로운 관상 질환 발생을 감소시킨다.

또한, 난포호르몬은 혈관평활근세포의 이동과 증식을 억제하며, 콜라겐 (collagen) 생성을 감소시키고, 내피세포에 직접 작용하여 혈관형성과 손상 후 내피회복을 촉진시키며, 내피세포의 아폽토시스(apoptosis)와 세포응착(cell adhesion) 분자의 발현을 억제한다.

에스트로겐은 생체외 및 생체내에서 내피 세포의 성장을 가속화한다[(모랄레스(Morales, D.E.) 등의 문헌 Circulation, 91:755-63(1995); 크라신스키 (Krasinski, K.) 등의 문헌 Circulation, 95:1768-72(1997)]. 혈관 상해 후에 에스트로겐에 의해 유도된 빠른 재내피세포증식(reendothelialization)은 혈관의 내피 성장 인자의 증가된 국소 발현에 일부 기인할 수 있다. 또한 에스트로겐은 에스트로겐 수용체-의존 방식으로 배양된 인간의 내피 세포의 고사를 저해한다[스피리도폴로스(Spyridopoulos, I.) 등의 문헌 Circulation, 95:1505-14(1997)].

에스트로겐에 의한 내피 일체성의 초기 복원은 산화질소의 이용가능성을 증가시킴으로써 상해에 대한 반응의 감쇄에 기여하며, 평활근 세포의 증식을 직접 저해할 수 있다[콘웰(Cornwell, T.L.) 등의 문헌 Am. J. Physiol., 267:C1405-C1413(1994)]. 에스트로겐은 생체외에서 평활근 세포의 이동 및 증식을 직접적으로 저해한다[콜로직 (Kolodgic, F.D.) 등의 문헌 Am. J. Pathol., 148:969-76(1996); 발라(Bhalla, R.C.) 등의 문헌 Am. J. Physiol., 272:HI996-H2003 (1997)].

상기와 같이 에스트로겐의 효과에도 불구하고, 현재 사용되고 있는 호르몬요법은 약제의 신체적, 정신적 부작용이 발생하는 단점이 있기 때문에, 현재 폐경 후 여성이 호르몬치료를 받는 비율은 미국이 약 15%, 한국은 약 5%로 극히 낮으며, 1년 후 순응도 역시 30-50%에 머물고 있는 실정으로, 부작용 없는 '호르몬제제'에 대한 요구가 절실하다.

이에 대해, 최근에는 식물에 존재하는 에스트로겐성 활성물질(estrogenic activator)인 "식물성 에스트로겐(phytoestrogen)"에 대한 효능이 과학적으로 입증되고 있으며, 이의 호르몬 대체소재로서의 활용가능성이 점쳐지고 있다. 또한, 전통 생약제는 오랜 기간의 임상실험을 거친 것이어서 생명에 치명적인 부작용은 거의 없다고 할 수 있으므로, 안전한 약제로서 합성 호르몬제를 대체할 수 있다고 기대된다.

식물성 에스트로겐은 에스트로겐(estrogen)과 유사한 구조를 갖는 식물유래의 다양한 디페놀 화합물(diphenolic compounds)로, 이것의 3개 주요 그룹은 이소플라본(isoflavones), 쿠메스탄(coumestans) 및 리그난(lignans)으로 분류된다. 현재 300종류 이상의 식물로부터 에스트로겐성 활성을 나타내는 화합물이 보고되고 있으며, 특히 이소플라본과 리그난이 호르몬결핍성 심혈관질환 관련 물질로 주목받고 있다. 이들 외에도 강한 에스트로겐성 활성을 나타내는 플라본(flavones), 플라바논(flavanones), 디하이드로칼콘(dihydrochalcones) 등 다양한 활성화합물이 보고되고 있으나 소재의 실용화에 이르지 못하고 있다.

최근 식생활을 통한 관련질환의 예방을 위해 식품원료소재의 식물성 에스트로겐 함량에 대한 데이터 베이스(data base) 작성 노력이 영국에서는 국가의 지원으로 이루어지고 있으며 호주나 미국에서도 관련 연구가 이루어지고 있다.

식물성 에스트로겐의 분석법으로 GC/MS 및 HPLC가 비교적 널리 사용되는데, GC/MS는 감도가 높은 반면 시료전처리 및 경비면에서 비효율적이며, HPLC는 편의성 및 경비면에서 장점이 있으나 감도 및 specificity가 낮은 단점이 지적되고 있으며, 최근 비동위원소 수용체기준 미세적정 분석법(nonisotopic receptor-based microtitration assay)이 개발되어 다양한 식물성 에스트로겐 화합물의 효율적 분석법으로 평가되고 있다.

서양의 전통적 민간 약초 치료(herbal remedy)에 근거한 약용식물 및 콩 생산물(soy product)를 중심으로 한 식품소재에 대한 관련연구는 최근 상당한 과학적 근거를 확보하고 있으나, 기능성 식품소재로서의 적극적인 개발에는 이르지 못하고 있는 실정이며, 특히 중국, 한국 등지에서 주로 사용되는 약용식물의 에스트로겐성 활성에 대한 체계적 연구는 극히 미흡한 실정이다.

한국여성의 호르몬결핍기간은 수명의 약 1/3을 차지하며, 전체여성의 약 20%로 추정되는 폐경 후 여성이 식물성 호르몬의 주요 수요자가 될 수 있으며, 특히 호르몬결핍성 심혈관 질환의 적극적인 예방 및 경증치료제로 활용될 수 있다. 현재 사용되는 호르몬제제의 시장규모는 국내 386억원/년(10/00-09/01), 세계시장 3.8bil.$('01 추정치)에 이른다(International Medical Statistics (IMS) data).

지금까지 살펴본 바와 같이, 안전한 에스트로겐인 식물성 에스트로겐의 필요성에도 불구하고 아직까지 식물성 에스트로겐의 실용화가 부족하여, 본 발명자들은 식물성 에스트로겐에 관한 연구를 거듭한 결과, 오미자 추출물의 에스트로겐성 활성을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. 오미자는 한방의 부인과 처방에 쓰이는 약초중 하나이지만, 아직까지 그 성분 및 기전이 과학적으로 밝혀지지 못하여 왔다.

본 발명에서는 이들 작용기전에 근거를 둔 활성평가법을 적용하며 최종 선발된 식물의 추출물 및 분획물에 대해서는 모델동물계를 통해 효능을 입증하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 오미자 추출물을 포함하는 새로운 식물성 에스트로겐 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 에스트로겐성 활성을 가진 오미자 추출물을 포함하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 동맥혈관 확장 및 혈관평활근세포 성장억제의 효능을 가진 오미자 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

도1a는 본 발명의 일실시예에 따른 조성물의 내피세포 의존성 여부를 설명하는 그래프.

도1b는 본 발명의 일실시예에 따른 조성물의 내피세포 비의존성 여부를 설명하는 그래프.

도2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조성물의 산화질소 저해제에 대한 효과를 설명하는 그래프.

도2b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조성물의 프로스타싸이클린 저해제에 대한 효과를 설명하는 그래프.

도3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 조성물의 혈관이완효능에 대한 농도의존성 효과를 설명하는 그래프.

도4a는 본 발명의 비교예로서 17β-에스트라디올(17β-estradiol)의 엔도텔린-1(endothelin-1)에 대한 작용억제 효과를 설명한 그래프.

도4b는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 조성물의 엔도텔린-1(endothelin-1)에 대한 작용억제 효과를 설명한 그래프.

도5a는 본 발명의 비교예로서 17β-에스트라디올의 칼슘 채널(Ca²⁺-channel)에 대한 작용억제 효과를 설명한 그래프.

도5b는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 조성물의 칼슘 채널(Ca²⁺-channel)에 대한 작용억제 효과를 설명한 그래프.

도6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 조성물의 농도의존적 혈관평활근세포 성장억제효과를 설명한 그래프.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 에스트로겐성 활성을 가진 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기 에스트로겐성 활성은 동맥혈관 확장 및 혈관평활근세포성장억제의 효능인 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 및 치료제와, 에스트로겐성 활성을 가진 기능성 식품을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

오미자 추출물은 일반적인 추출방법에 의하여 생산된다. 상기 추출물을 예방 또는 치료 등의 실제 임상에 적용할 때는 그 사용량을 적절히 조절할 필요가 있을 것이며, 약품제조산업에 적용되어 대량 생산하는 경우 등 실용적인 견지에서는 표준화된 함량을 가지도록 적절히 통제된 과정에 의하여 생산되는 분말 또는 추출물의 형태로 사용하는 것이 바람직할 것이다.

본 발명의 오미자 추출물은 오미자를 물, 저급 알콜 또는 유기용매 등의 추출용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 저급 알콜로는 메탄올, 에탄올 등을, 유기용매로서는 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 그러나, 추출용매로서 유기용매를 사용하는 것이 회수율이 가장 높으므로 가장 바람직하며, 다만 식품으로 이용할 목적일 경우에는 물로 추출하는 것이 가장 안전할 것이다.

구체적으로, 본 발명의 오미자 추출물은 오미자 건조분말에 약 5 내지 50배, 바람직하게는 약 10배의 추출용매를 가하여 균질화시킨다. 이를 75∼85℃로 가열하면서 환류냉각하거나 10,000×g로 약 20분간 원심분리한 후, 여과한다. 이 여액을 통상의 방법에 따라 감압건조후 동결건조하면 고형의 오미자 추출물을 얻을 수 있다. 상기 오미자 추출물의 유의성 있는 유효 성분 농도는 0.1∼1.0㎎/㎖가 바람직하고, 0.1∼0.3㎎/㎖가 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 오미자 추출물에 기존에 알려진 식물성 에스트로겐인 이소플라본(isoflavone), 플라보노이드(flavonoid), 리그난(lignan), 다이드제인 (daidzein) 등이 함유되어 있는지 알아보기 위해 HPLC 분석을 하였는데, 그 결과 기존에 알려진 식물성 에스트로겐이 함유되어 있지 아니함을 확인하였다.

오미자 추출물의 동맥확장 작용 및 그 기전을 알아내기 위하여 조직수조 (organ bath)내에서 쥐 대동맥의 혈관수축의 변화에 대한 실험을 하였다. 내피세포가 존재 또는 부존재 하는 쥐의 대동맥을 노르에피네프린(norepinephrine, 이하 'NE'이라 한다.)으로 수축시킨 후, 오미자의 추출물를 첨가하였다. 그 결과, 내피세포가 존재하는 경우는 농도 의존적인 일과성 이완효과를 나타내었다(도1a). 내피세포가 제거된 경우는 상기 추출물의 유효 농도에서 이완효과를 나타내지 않았으나 (도1b), 매우 높은 추출물 농도(high dose, 3mg/ml 이상의 경우)에서는 이완효과를 나타냈다. 따라서, 오미자 추출물의 통상 유효농도에서는 내피세포 의존성 혈관이완작용이 있음을 알 수 있다.

상기 내피세포 의존성 혈관이완작용의 기전을 알아보기 위해, 산화질소 (nitric oxide, 이하 NO라고 함) 합성 저해제 및 프로스타싸이클린 합성 저해제 (prostacycline synthase inhibitor)를 혈관에 미리 처리하여 상기 추출물에 의한 이완효과 실험을 하였는데, 상기 저해제에 의해 상기 추출물의 이완작용이 억제되었다. 결과적으로 본 발명에 따른 오미자 추출물의 혈관이완 작용중 내피세포 의존성 경로로는 내피세포로부터 NO의 방출 및 프로스타싸이클린의 생성 경로가 있음을알 수 있다.

오미자 추출물의 내피세포 비의존성 혈관이완작용을 알아 보기 위해, 내피세포를 제거한 쥐의 대동맥을 엔도텔린-1(endothelin-1) 및 염화칼륨으로 수축시킨 후, 오미자 추출물을 가하였다. 또, 이와 비교하기 위해 17β-에스트라디올(17β-estradiol)을 가하는 실험을 함께 수행하였다. 그 결과, 상기 오미자 추출물은 상기 에스트라디올과 마찬가지로 엔도텔린-1 및 염화칼륨으로 수축된 대동맥을 모두 이완시켰으며, 농도 의존적인 이완효과를 보였다. 따라서, 상기 오미자 추출물은 내피세포 비의존성 혈관이완 경로로서, 엔도텔린-1의 작용억제 및 칼슘 채널 억제(Ca²⁺-channel blocker)의 경로가 있음을 알 수 있다.

또한, 오미자 추출물의 혈관평활근세포 성장억제효능을 알아보기 위해, 쥐의 흉부대동맥에서 얻은 혈관평활근세포를 배양하여 [³H] 티미딘 융합 시험([³H] thymidine incorporation test)를 하였다. 10% FBS(Fetal Bovine Serum)를 넣은 경우는 매우 왕성한 세포증식율(60000count/min)을 보여 시험대상 세포가 정상적인 증식능력을 갖고 있음을 알 수 있었으며, DSF(Defined serum-free medium) 배양액에 아무것도 넣지 않은 블랭크(blank)의 경우는 약간의 세포증식율(6000count/min)을 보였고, lysoPC(lysophosphatidylcholine)만 넣은 경우는 블랭크의 두배 정도 높은 세포증식율(12000count/min)을 보였다. lysoPC와 오미자 추출물을 함께 넣은 경우는 lysoPC만 넣은 경우보다 낮은 세포증식율을 보였으며, 오미자 추출물의 농도가 증가할수록 낮은 세포증식율을 보였다. 따라서, 오미자 추출물은 농도 의존적으로 혈관평활근세포의 성장을 억제함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 오미자 추출물은 기존의 식물성 에스트로겐을 함유하지 않으면서, 에스트로겐의 동일한 기전으로 혈관확장 및 혈관평활근세포 성장억제의 효능을 가지므로, 새로운 식물성 에스트로겐을 함유하고 있음을 알 수 있다. 이는 오미자 추출물이 에스트로겐성 활성을 가진 조성물로서 사용될 수 있다는 것을 말한다. 즉, 에스트로겐성 활성을 기반으로 심혈관 질환의 예방 및 치료제로서 사용될 수 있고, 이는 고혈압, 고지혈증, 동맥경화, 동맥혈전증 및 관상동맥질환 등을 포함하는 질환에 사용될 수 있음을 의미한다. 또한, 에스트로겐성 활성을 가진 기능성 식품 또는 심혈관 질환의 예방 및 치료에 사용되는 기능성 식품으로 이용될 수 있으며, 상기 고혈압 등의 질환에 사용되는 기능성 식품으로 이용될 수 있다.

상기와 같은 성질을 가지는 본 발명의 오미자 추출물은 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 목적에 따라 다른 활성성분과 혼합하여 효과를 증진시킬 수도 있다. 또한, 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 배합됨으로써 약제학 분야의 통상의 제제로서 사용될 수 있다.

상기 오미자 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 오미자 추출물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 오미자 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의할 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 오미자 추출물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하게는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

아울러, 본 발명에서는 상기 오미자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 기능성 식품을 제공한다. 이 때, 오미자 추출물을 함유하는 기능성 식품으로는 상기 오미자 추출물을 유효성분으로 한 차, 젤리, 즙, 쥬스, 엑기스, 음료 등의 심혈관 질환의 예방 및 치료 등을 목적으로 하는 민간요법제 등을 들 수 있다.

이하 구체적인 실험예를 들어 본 발명을 설명하나 본 발명이 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.

[실험예1] 오미자 추출물의 제조

건조, 절단한 오미자를 시장에서 구입하여 푸드믹서로 갈아 분말형태로 만든 후, 오미자 건조분말에 10배량의 물을 가하여 균질화 시키고 환류 냉각기에 넣어 78℃에서 환류 냉각한 다음 여과하였다. 이 여액을 감압건조한 후 동결건조한 고형의 오미자 추출물을 에탄올에 1g/ml의 농도로 녹여 보관하면서 실험에 사용하였다.

[실험예2] 오미자 추출물의 내피세포 의존여부 실험

A. 실험준비

본 실험용 동물은 수컷 스프라그-다우리 랫트(Sprague-Dawley rats(200-250g))이며, 이 쥐를 기절시킨 즉시 방혈하고 하행흉부대동맥(thoracic aorta)을 분리하여 길이 약 2-3mm의 링(ring) 형태로 잘랐으며, 내피가 완전한 상태의 혈관과 생리적 염용액(physiologically salt solution, 이하 'PSS'라 한다.)에 담근 솜을 사용하여 혈관의 내부를 부드럽게 문질러서 내피를 제거한 상태의 혈관을 분리하여 준비하였다. 분리한 혈관을 4ml의 PSS가 들어있는 조직 수조(organ bath)에 1g의 안정장력을 나타내도록 현수시켰다. 혈관을 수조에 현수시킨 후 1g의 장력으로 20분간 평형화시키고 반응이 안정될 때까지 70mM 염화칼륨 용액에 반복적으로노출시켰다.

실험에 사용한 PSS의 조성은 염화나트륨(NaCl) 136.9mM, 염화칼륨 (KCl) 5.4mM, 염화칼슘(CaCl₂) 1.5mM, 염화마그네슘(MgCl₂) 1.0mM, 탄산수소나트륨 (NaHCO₃) 23.8mM, 포도당 5.5mM 그리고 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)) 0.01mM이었다. 고농도의 칼륨 용액은 염화나트륨을 동일한 농도의 염화칼륨으로 대치시켰다. 조직수조내의 용액은 37℃, pH 7.5에서 95%의 산소(O₂) - 5%의 이산화탄소(CO₂) 혼합기체로 통기상태를 유지시켰다. 혈관의 장력은 장력-변위 변환기(force-displacement transducer(FT03, Grass, Fhode Island, USA))가 연결된 다원기록 장치(polygraph system(RPS212, Grass, RI, USA))와 컴퓨터 분석기(computer analyser(Power Lab 400, MacLab system, Castle Hill, Australia))로 측정하였다.

B. 오미자 추출물의 내피의존 여부에 관한 효과

혈관내피세포의 기능적 활성은 300nM의 NE으로 수축시킨 대동맥에 1μM 카바콜(carbachol)을 첨가시 거의 완전하게 이완시키는지(>90%)를 측정하여 판정이 가능하였다(Sudarwo et al. 1992).

실험예1에서 제조한 오미자 추출물을 0.03∼10mg/ml의 농도로 상기 조직 수조내 혈관에 적용했는데, 내피세포 유무에 관계없이 안정상태에서는 분리한 쥐 대동맥의 장력에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(데이터는 미도시함).

상기 분리된 쥐의 흉부대동맥을 300nM NE로 혈관 수축을 유도한 후, 실험예1의 에탄올에 녹인 오미자 추출물을 상기 조직 수조내에 첨가하되, 상기 오미자 추출물이 0.3mg/ml가 되도록 첨가하여 20분간 반응을 관찰하였다. 시료에 의한 혈관이완작용은 NE 투여로 인해 나타나는 수축에 대한 퍼센트로 표시하였다. 이 때 첨가하는 에탄올이 혈관운동성에 영향을 미치지 않도록 하기 위해서, 조직 수조내 전체의 용액중 상기 에탄올이 0.01%(V/V) 이내가 되도록 하였다.

내피가 완전한 쥐 대동맥에서 300nM NE로 수축시킨 혈관에 대해 오미자 추출물은 일시적 이완효과를 나타내었다(47.7±6.8%)(도1a). 이러한 이완효과는 적어도 3분간 지속되었으며, 대동맥을 PSS로 다시 씻어낸 후 카바콜 자극시에도 완전한 이완효과를 나타내어, 상기 오미자 추출물은 내피세포를 손상하거나 용혈 등의 부작용을 일으키지 않는다는 것을 알 수 있었다.

또한, 내피가 제거된 쥐 대동맥에서 300nM NE로 수축시킨 혈관에 대해 오미자 추출물은 이완효과를 나타내지 않았다. 다만, 오미자 추출물을 3mg/ml이상으로 과량(high dose) 첨가했을 때는 이완효과를 나타냈으며, 3mg/ml인 경우는 약 40%의 이완효과가 나타났다.

따라서, 위 결과로서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 오미자 추출물은 내피세포 의존성 혈관이완작용을 가지고 있다고 볼 수 있다.

상기 실험에 사용한 NE, 카바콜은 시그마 사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

[실험예3] 오미자 추출물의 내피세포 의존성 혈관이완 효과

실험예2에서 확인된 오미자 추출물의 내피세포 의존성 혈관이완 효과가 어떤기전에 의한 것인지 확인하기 위해, 각종 혈관이완 저해물질로 처리한 후 다음과 같은 실험을 하였다.

상기 실험예2의 A에서와 같이 실험 준비를 하되, 내피가 완전한 혈관이 든 조직 수조를 4개 준비하였다. 각 조직 수조에 NO 합성효소 저해제인 N^G-니트로-L-아르기닌(N^G-nitro-L-arginine, 이하 'L-NNA'라 함)), N^ω-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(N^ω-nitro-L-arginine methyl ester, 이하 'NAME'이라 함), N^G-메틸-L-아르기닌(N^G-methyl-L-arginine, 이하 'NMMA'이라 함) 각각 10μM과 프로스타싸이클린 합성 저해제인 인도메타신(indomethacin) 10μM을 NE에 의한 수축 자극 30분 전에 상기 조직 수조에 각각 첨가하였다.

그 다음 상기 분리된 쥐의 흉부대동맥을 300nM NE로 혈관 수축을 유도한 후, 실험예1의 에탄올에 녹인 오미자 추출물을 상기 조직 수조내에 첨가하되 상기 오미자 추출물이 0.3mg/ml가 되도록 첨가하여 20분간 반응을 관찰하였다. 시료에 의한 혈관이완작용은 NE 투여로 인해 나타나는 수축에 대한 퍼센트로 표시하였다. 이 때 첨가하는 에탄올이 혈관운동성에 영향을 미치지 않도록 하기 위해서, 조직 수조내 전체의 용액중 상기 에탄올이 0.01%(V/V) 이내가 되도록 하였다.

NO 합성저해제인 L-NNA는 NE로 수축시킨 대동맥에 대한 오미자 추출물의 혈관이완작용을 완전히 저해하는 것으로 나타났다(도2a). 또다른 NO 합성저해제인 NAME와 NMMA도 내피세포가 완전한 쥐 대동맥에 대해 L-NNA와 유사한 영향을 미치는것으로 나타났다(데이터 미도시함). 또한, 프로스타싸이클린 합성 저해제인 인도메타신은 NE로 수축시킨 쥐 대동맥에 대한 오미자 추출물의 혈관이완작용을 완전히 저해했다(도2b).

따라서, 오미자 추출물의 내피세포 의존적 혈관이완작용은 NO 합성 및 프로스타싸이클린 합성을 유도하는 기전임을 알 수 있었다.

상기 실험에 사용한 L-NNA, NAME, NMMA, 및 인도메타신은 시그마 사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

[실험예4] 오미자 추출물의 농도 의존성 효과

상기 실시예2의 A에서와 실험을 준비하되, 내피세포가 완전한 혈관을 준비하여 300nM NE로 혈관 수축을 유도한 후, 실시예1의 에탄올에 녹인 오미자 추출물을 상기 조직 수조내에 첨가하되 상기 오미자 추출물이 0.3mg/ml가 되도록 첨가하여 20분간 반응을 관찰하였다. 시료에 의한 혈관이완작용은 NE 투여로 인해 나타나는 수축에 대한 퍼센트로 표시하였다. 이 때 첨가하는 에탄올이 혈관운동성에 영향을 미치지 않도록 하기 위해서, 조직 수조내 전체의 용액중 상기 에탄올이 0.01%(V/V) 이내가 되도록 하였다.

상기 오미자 추출물의 농도를 0.1에서 3.0mg/ml로 증가시켜 상기 조직 수조내에 첨가한 후, 혈관 이완의 효과를 측정하였다. 이때, 이완효과가 30.9±3.0%에서 87.1±1.3%로 증가하여 상기 오미자 추출물이 쥐 대동맥에 대해 농도 의존적 혈관 이완작용이 있음을 알 수 있었다(도3).

[실험예5] 오미자 추출물의 엔도텔린-1 작용억제 효과

상기 실시예2의 A에서와 실험을 준비하되, 내피세포를 제거한 혈관을 두 개 준비하여 10^-7nM 엔도텔린-1으로 혈관 수축을 유도한 후, 하나에는 실시예1의 에탄올에 녹인 오미자 추출물을 상기 조직 수조내에 첨가하여 반응을 관찰하였다. 또한, 다른 하나에는 상기 오미자 추출물의 효과를 에스트로겐의 효과와 비교하기 위해, 상기 오미자 추출물 대신 17β-에스트라디올을 첨가하였다. 시료에 의한 혈관이완작용은 엔도텔린-1의 투여로 인해 나타나는 수축에 대한 퍼센트로 표시하였다. 이 때 첨가하는 에탄올이 혈관운동성에 영향을 미치지 않도록 하기 위해서, 조직 수조내 전체의 용액중 상기 에탄올이 0.01%(V/V) 이내가 되도록 하였다.

상기 오미자 추출물의 농도는 0.3에서 1.0mg/ml로, 상기 에스트라디올의 농도는 10^-5에서 10^-3M/ml로 증가시켜 상기 조직 수조내에 첨가한 후, 혈관 이완의 효과를 측정하였다. 이때, 이완효과가 상기 에스트라디올은 10∼65%로(도4a), 상기 오미자 추출물은 42∼100%로(도4b) 증가하였다. 따라서, 상기 오미자 추출물이 쥐 대동맥에 대해 에스트라디올과 마찬가지로 엔토텔린-1의 작용억제 경로에 의한 농도 의존적 혈관 이완작용이 있음을 알 수 있었다.

[실험예6] 오미자 추출물의 칼슘 채널 작용억제 효과

상기 실시예2의 A에서와 실험을 준비하되, 내피세포를 제거한 혈관을 두 개 준비하여 72mM 염화칼륨으로 혈관 수축을 유도한 후, 하나는 실시예1의 에탄올에 녹인 오미자 추출물을 상기 조직 수조내에 첨가하여 반응을 관찰하였다. 또한, 상기 오미자 추출물의 효과를 에스트로겐의 효과와 비교하기 위해, 상기 오미자 추출물 대신 17β-에스트라디올을 첨가하였다. 시료에 의한 혈관이완작용은 염화칼륨의 투여로 인해 나타나는 수축에 대한 퍼센트로 표시하였다. 이 때 첨가하는 에탄올이 혈관운동성에 영향을 미치지 않도록 하기 위해서, 조직 수조내 전체의 용액중 상기 에탄올이 0.01% (V/V) 이내가 되도록 하였다.

상기 오미자 추출물의 농도는 0.01에서 0.3mg/ml로, 상기 에스트라디올의 농도는 10^-7에서 10^-3M/ml로 증가시켜 상기 조직 수조내에 첨가한 후, 혈관 이완의 효과를 측정하였다. 이때, 이완효과가 상기 에스트라디올은 0%에서 100%로(도5a), 상기 오미자 추출물은 0%에서 100%로(도5b) 증가하였다. 따라서, 상기 오미자 추출물이 쥐 대동맥에 대해 에스트라디올과 마찬가지로 칼슘 채널의 작용억제 기전에 기인한 농도 의존적 혈관 이완작용이 있음을 알 수 있었다.

[실험예7] 오미자 추출물의 혈관평환근세포 성장억제 효과

A. 혈관평활근 세포 분리 및 배양

3개월된 스프라그-다우리 랫트(SD rat)에서 흉부 대동맥을 제거하여 혈관평활근세포를 분리한다. 혈관주위의 무른 결합조직(loose connective tissue)을 없애고 효소 해리 혼합액(enzyme dissociation mixture; collagenase type Ⅱ 1mg/ml, elastase 0.25mg/ml, soybean tripsine inhibitor 1mg/ml, BSA(Bovine serum albumin) 2mg/ml, 배지 DMEM/F-12)에 담가 내피세포를 제거하고 혈관 외벽 (adventia)과 중막(media)의 분리를 용이하게 한다. 해부현미경하에서 외막 (adventitia)을 박리한 후 2-3 mm의 크기로 잘게 자른다. 중막 조직(Media tissue)을 다시 효소 해리 혼합액에 담가 회전 교반기(gyratory shaker)내에서 37℃, 60분 반응시킨다. 혈관평활근세포가 분리되면 10%FBS를 첨가하여 효소를 비활성화 시킨 후 소독된 거즈(gauze)로 걸러 분해되지 않은 찌꺼기를 제거한다. 다시 원심분리 후 세포배양액에 재부유 시켜 세포배양 플라스크(flask)에 2,000∼5,000/cm²세포농도로 평판 배양(plating)한다. 혈관평활근세포는 37℃의 습한(humidified) CO₂/95% 공기(air) 환경에서 키우며, 배양된 세포가 혈관평활근세포임을 확인하기 위하여 알파 평활근 액틴(alpha-smooth muscle actin,SMA)의 발현을 조사한다.

B. [³H] 티미딘 융합 실험([³H] Thymidine incorporation test )

상기 A에서 배양된 세포의 70∼80%가 세포이동 시기(confluence)에 도달하면 DSF(defined serum-free medium)로 배양액을 교체한다. 44시간 후에 무활동의 세포(quiescent cell)를 배양액 DSF에서 아무것도 첨가하지 않은 것(blank), 배양된 세포의 증식능력을 시험하기 위해 10% FBS로만 처리한 것, 5uM의 lysoPC (lysophosphatidylcholine)로만 처리한 것, 및 5uM의 lysoPC처리 후 실시예1의 에탄올에 녹인 오미자 추출물을 0.1mg/ml 및 0.3mg/ml로 처리한 것을 각각 준비한다. 이 때 첨가하는 에탄올이 혈관운동성에 영향을 미치지 않도록 하기 위해서, 조직 수조내 전체의 용액중 상기 에탄올이 0.01%(V/V) 이내가 되도록 하였다.

그런 다음, 4시간 동안 [³H] 티미딘과 작용시킨 후, 하베스트(Harvest) 처리한다. 상기 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 10% TCA(trichloroacetic acid)로 다시 세척한다. TCA에 녹지않는 물질을 에탄올(ethanol)로 세척하고 0.25M 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 녹인 다음, 섬광 계수관(liquid scintillation counter)으로 방사능 양을 측정함으로써 세포의 DNA 합성을 [³H] 티미딘 융합 (Thymidine incorporation)으로 평가한다.

이 때, 혈관평활근세포 성장억제 효과는 도6에 나타낸 바와 같다. 10% FBS (Fetal Bovine Serum)를 넣은 경우는 60000count/min의 세포증식율을 보여 시험대상 세포가 정상적인 증식능력을 갖고 있음을 알 수 있었으며, DSF(Defined serum-free medium) 배양액에 아무것도 넣지 않은 블랭크(blank)의 경우는 6000count/min의 세포증식율을 보였고, lysoPC(lysophosphatidylcholine)을 넣은 경우는 블랭크의 두배 정도 높은 세포증식율 12000count/min를 보였다. lysoPC와 오미자 추출물을 함께 넣은 경우는, 블랭크보다 높은 세포증식율을 보였고 lysoPC만 넣은 경우보다 낮은 세포증식율을 보였으며, 오미자 추출물의 농도가 증가할수록 낮은 세포증식율을 보였다.

즉, 배양된 세포는 10% FBS에 의한 결과로 보아 세포증식 능력이 있는 것으로 확인되었고, lysoPC에 의해 유도된 세포 성장은 오미자 추출물에 의해 농도 의존적으로 억제되었다. 따라서, 상기 오미자 추출물은 쥐 대동맥에 대해 에스트로겐과 마찬가지로 농도 의존적 혈관평활근세포 성장억제작용이 있음을 알 수 있었다(도6).

실험결과는 평균±표준오차로 나타내었다. 통계적 유의차는 Student's t-test를 이용하여 α=0.05 수준에서 검정하였다.

따라서 본 발명은 일반적인 생약인 오미자 추출물로 에스트로겐성 활성을 가진 조성물을 제조할 수 있고, 종래의 식물성 에스트로겐과 다른 물질을 함유한다. 또한 부작용이 없는 식물성 에스트로겐으로서 합성 에스트로겐을 대체할 수 있는 생리적 활성의 안전성이 매우 우수한 물질이다.

Claims

오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 오미자 추출물의 에스트로겐성 동맥확장 및 혈관평활근세포 성장억제 활성에 기인한 심혈관 질환의 예방 및 치료효과를 가지는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고혈압, 고지혈증, 동맥경화, 동맥혈전증 및 관상동맥질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 오미자 추출물이 물, 저급알콜, 유기용매로 이루어진 군중에서 1종이상을 추출용매로 선택하여 추출한 것임을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
상기 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조제되어 단위별로 심혈관 질환에 적용될 수 있는 단위형태로 조제됨을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
상기 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서, 오미자 추출물의 유효 성분 농도가 0.1∼0.3㎎/㎖ 임을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물.
오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환의 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물.