KR20040025661A - 일본뇌염바이러스용 키메라 ｔ보조-ｂ세포 펩타이드 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일본뇌염바이러스 감염 또는 일본뇌염바이러스 감염에 대한 인간 및 동물용 백신 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 키메라 합성 펩타이드를 포함하며, 외피 당단백질로부터 선택된 상기 키메라 펩타이드는 일본뇌염바이러스 외피 당단백질의 아미노산들 Egp 149-SENHGHYSAQVGASQ-163 및 Egp 427-GSIGGVFNSIGKAVHQVFG-445로 구성되며, 일본뇌염바이러스 감염에 대한 방어면역을 유도하기에 충분한 양의 상기 키메라 펩타이드를 함유한다.
Description
곤충매개 바이러스 질환 중에서 일본뇌염(Japanese encephalitis)과 뎅기(dengue)는 동남아시아의 전 지역에서 발생하는 대표적인 질환이다. 외피 당단백질(envelop glycoprotein)은 적혈구응집 및 중화 같은 중요한 생물학적 특성들과 관련된 것으로 보이는 적어도 5개의 결정인자들을 함유한다. 외피 당단백질은 바이러스의 부착 원인이 되므로 감염성과 관련이 있다. 현재 일본 뇌염 백신으로는 주로 바이러스의 외피 당단백질을 구성하는 마우스 뇌조직으로부터 제조 정제된 바이러스 사백신이 있다. 마우스 뇌조직 유래 정제 사백신을 12 내지 18개월 후에 추가접종하는 3회 접종 방식이 중화항체(neutralizing antibody) 유도로 판단하였을 때 효과적인 예방접종법일 수 있다. 마우스 뇌조직 유래 백신은 또한 인도주(Indian Strain)에 중화항체를 나타낸다. 상기 백신의 효능은 단지 3회 접종하는 경우에만 나타난다.
"챈(chan)" 등에게 허여된 1998년 10월 20일자 미국특허 제5,824,586호에는 뎅기바이러스형-2 당단백질 NS1으로부터 유래된 펩타이드 항원이 개시되어 있다. 상기 펩타이드 항원은 특히 뎅기바이러스에 감염된 사람들의 혈청과 면역반응을 나타낸다. 상기 항원은 뎅기바이러스에 대한 감염여부를 판단하는 진단 방법, 및 뎅기바이러스에 의한 감염과 관련 플라비바이러스(flavivirus)에 의한 감염을 구별하는데 유용하다. 또한 상기 항원들은 뎅기바이러스 감염에 대한 면역용 백신 조성물로서도 유용하다.
"라이(Lai)" 등에게 허여된 미국특허 제5,494,671호에는 크기가 80-81%인 C-말단이 절단된 플라비바이러스의 외피 단백질들이 개시되어 있는데, 그것에 대응하는 전체길이의 단백질들보다 면역성이 커진다. 상기 특허에는 또한 상기 절단된 단백질을 암호화하고 감염된 세포들을 숙주로 하는 재조합 바이러스가 개시되어 있다. 숙주 세포(host cell)들은 자신의 외막에 상기 절단 단백질을 발현시켜 배지 안으로 분비한다. 상기 특허에는 플라비바이러스 감염에 대해 사용하기 위한 백신이 개시되어 있다. 상기 백신은 상기 절단 외피 단백질을 발현시키는 재조합 백신 바이러스, 및 재조합 바큘로바이러스(baculovirus)에 의해 생성되는 절단 외피 단백질을 포함한다.
중국에서는, 일본뇌염바이러스주 SA 14-14-2로 이루어진 약독화 일본뇌염바이러스 백신(attenuated Japanese encephalitis virus vaccine)이 사용되고 있다. 약독화는 햄스터 신장 세포에서 행하여져 왔으나 계대 이력(passage history)은 알려져 있지 않다. SA 14-14-2 백신주를 마우스 뇌내에 접종한 결과 CNS 병발의 증후 없이 생존하였다. 뇌의 바이러스가(virus titer)도 몇 일 동안 낮은 레벨을 유지하였고 10일 후에도 검출되지 않았다(Hase T, Dubois, Dr. Summers, PL, Downs, MB and Ussery, MA. (1993) Comparison of replication rates and pathogenicities between the SA14 parent and SA14-14-2 vaccine strains of Japanese encephalitis virus in mouse brain neurons. Arch Virol 130 131-43; Dubois T., Dr. Summers, PL. Downs, MB and Ussery, MA (1993) Comparison of replication rates and pathogenicities between the SA14 parent and SA 14-14-2 vaccine strains of Japanese encephalitis virus in mouse brain neurons. Arch Virol 130 131-43). 상기 백신의 안정성 및 면역원성(immunogenicity)이 검사되었다. 5 내지 12세 사이의 어린이 1026명에게 생약독화 일본뇌염바이러스 백신을 접종하였다. 접종 받은 어린이의 47 군 중 어느 군에서도 체온이 37.4℃를 넘지 않았다. 혈청반응 검사 결과 음성이었던 어린이의 양전률은 100%이었다(GMT 35.3) (Xin YY, Ming, ZG, Peng, GY, Jain, A and Min, LH (1988) Safety of a live-attenuated Japanese encephalitis virus vaccine (SA 14-14-2) for children. Am J Trop Med Hyg 39 214-7).
일본뇌염바이러스용 재조합 백신을 개발하기 위한 많은 시도가 진행되어 왔다. 여러 단백질들을 발현시켜 동물들에게 면역해 보았다. 외피 당단백질(envelop glycoprotein) 만의 발현 및 면역법은 유용하지 않다는 것을 발견하였다(Mason PW, McAda, PC, Dalrymple, JM, Fournier, MJ and Mason, TL(1987) Expression of Japanese encephalitis virus antigens in Escherichia coli. Virology 158 361-72). 외피 당단백질 및 NS-1 유전자를 함유한 재조합 바큘로바이러스 감염 세포들로 면역시킨 마우스에 일본뇌염바이러스를 시험감염시켰다. 생존율은 접종시키지 않은 마우스에서 약 30%로부터 NS-1 접종 마우스가 아니라 외피 당단백질과 다기능단백질(polyprotein)을 접종 받은 마우스들에서 70%까지 증가하였다(McCown J, Cochran, M, Putnak, R, Feighny, R, Burrous, J, Henchal, E and Hoke, C (1990). Protection of mice against lethal Japanese encephalitis with a recombinant baculovirus vaccine. Am J Trop Med Hyg 42 491-9). 재조합 백신 바이러스들의 prM/M 단백질과 E 단백질로 구성된 정제된 세포외 서브바이럴(subviral) 입자들로 마우스를 면역시키면 마우스는 일본뇌염바이러스의 4.9x105LD50으로부터 보호받을 수 있게 된다(Konishi E, Pincus, S, Paoletti, E, Shope, RE, Burrage, T and Mason, PW. (1992) Mice immunized with a subviral particle containing the Japanese encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection. Virology 188 714-20). 이러한 입자 항원들은 마우스에게서 일본뇌염바이러스의 특이 CTL 반응을 유발하는 것으로도 알려져 있다(Konishi E, Win, KS, Kurane, I, Mason, PW, Shope, RE and Ennis, FA (1997) Particulate vaccine candidate for Japanese encephalitis induce long-lasting virus-specific memory T lymphocytes in mice. Vaccine 15 281-6).
전막(premembrane) 및 외피 당단백질용 유전자들을 공동발현시킨 재조합 백신은 마우스에서 높은 레벨의 중화항체 및 적혈구응집억제(Hemagglutination inhibition: 이하 'HI'라 함) 항체를 유발하며 일본뇌염바이러스에 의한 치명적인 감염으로부터 마우스를 보호한다. NS1용 유전자만을 발현시킨 재조합 백신은 NS1에 대한 항체를 유도하지만 일본뇌염바이러스의 유사 감염 도즈(challenge dose)로부터의 보호율은 낮게 나타난다. NS-1 및 외피 당단백질과 함께 PrM 유전자를 함유한 재조합 바이러스 백신으로 마우스를 면역시키면 일본뇌염바이러스 감염으로부터 보호된다. 두창 바이러스(Canary pox and viccinia)에 근원한 일본 뇌염 재조합 백신들이 구성되어 마우스에서 일본뇌염바이러스의 특이 세포독성T림프구들을 나타내었다(Konishi, E, Kurane, I, Mason, PW, Shope, RE and Ennis, FA (1997) Poxvirus-based Japanese encephalitis vaccine candidates induce JE virus specific CDB+ cytotoxic T lymphocytes in mice. Virology 227 353). 일본뇌염바이러스 prM, E 및 NS1 단백질들을 인코딩(encoding)한, 두창 바이러스에 근원한 재조합 일본뇌염 후보백신들인, NYVAC-JEV 및 ALVAC-JEV을 대상으로 일본뇌염바이러스-특이 세포독성T림프구들(cytotoxic T lymphocytes: CTLs)을 유발하는 능력을 시험하였다. 자원자들에게 0과 28일 상에 이러한 후보백신들 각각을 피하 접종하였다. 항-E 항체 및 항-NS1 항체가 NYVAC-JE 바이러스를 접종 받은 대부분의 접종자들 및 ALVAC-JEV를 접종 받은 일부 접종자들에서 유도되었으며, 접종자들의 약 반으로부터 획득된 말초혈액 단핵세포들(peripheral blood mononuclear cell: PBMCs)는 생 일본뇌염바이러스에 의한 자극 반응에서 양성 증식을 나타내었다. 두 NYVAC-JEV 및 두 ALVAC-JEV 백신들로부터 얻어진 체외 자극 말초혈 단핵세포들에서일본뇌염바이러스-특이 CDB+CD4-세포독성T세포들이 존재한다는 것이 검증되었다(Konishi E, Kurane, I, Mason, PM, Shope, RE, Kanesa-Thasan, N, Smucny, JJ, Hoke, CH Jr and Ennis, FA (1998). Induction of Japanese encephalitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by poxvirus-based JE vaccine candidates. Vaccine 16 842-9). 키메라 황열병(Yellow fever: 이하 'YF'라 함)/일본뇌염 바이러스(이하 'ChimeriVax-JE 바이러스'라 함)는 YF 17D 감염 클론의 C와 NS 유전자들 사이에 일본뇌염바이러스의 약독화 인간 백신주(SA14-14-2)의 prM 및 외피 당단백질 유전자들을 삽입하여 구성된다. ChimeriVax-JE 바이러스의 >/=103 pfu 일회량을 피하 접종한 마우스는 악성 일본뇌염바이러스에 의한 IP 감염시험에서도 보호되었다.
최근, 합성 펩타이드(synthetic peptide) 형태의 단백질 단편들이 T 보조 및 항체 반응들을 유발하는데 사용될 수 있다는 것이 알려졌다. 일본뇌염바이러스로부터 B 세포 항원결정기의 윤곽을 묘사하려는 시도 결과 10 단클론 항체들(monoclonal antibodies: MAbs)와 반응할 수 있는 최단 서열로서 Met 303 내지 Trp 396의 윤곽이 그려졌다. 이러한 단클론 항체들에게 결합 자리(들)를 제공하기 위해서 cys 304와 335 간의 이황화(disulfide) 결합이 요구된다. 그러나, 마우스에서 중화항체 또는 방어항체를 유발하는데 있어서 효과적인 면역원은 아니었다(Mason PW, Dalrymple, JM, Gentry, MK, McCown, JM, Hoke, CH, Burke, DS, Fournier, MJ and MAson, TL (1989) Molecular characterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structuralglycoprotein. J Gen Virol 70 2037-49). 외피 당단백질의 아미노산 373-399의 코딩 서열을 운반하는 단편은 가장 높은 중화항체가(1:75)를 유발하였다. HI 항체들은 이러한 융합 단백질에 의해서는 유도되지 않았다(Seif SA, Morita, K and Igarashi, A (1996) A 27 amino acid coding region of JE virus E protein expressed in C. coli as fusion protein with glutathione-S-transferase elicit neutralizing antibody in mice. Virus Res 43 91-6). 중화항체유발 항원결정기(neutralizing antibody inducing epitope)들이 외피 당단백질의 C 말단 부위들 상에서 검출되었다(Seif SA, Morita, K, Matsuo, S, Hasebe, F and Igarashi, A (1995) Finer mapping of neutralizing epitope(s) on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system. Vaccine 13 1515-21; Jan LR, Yang, CS, Henchal, LS, Sumiyoshi, H, Summers, PL, Dubois DR and Lai, CJ (1993) Increased immunogenicity and protective efficacy in outbred and inbred mice by strategic carboxyl-terminal truncation of Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein. Am J Trop Med Hyg 48 412-23). C 단백질로부터 유래된 펩타이드들도 또한 일본 뇌염과 뎅기 환자들에게서 채취한 혈청들에 반응성을 나타내었다. Pep91-105 및 8-22는 일본 뇌염 및 뎅기-1 환자의 혈청들과 모두 반응하는 군-특이 항원결정기에 속한다. Pep 1-15 및 34-48은 일본 뇌염 환자 혈청에만 반응하고 뎅기-1 환자 혈청에는 반응하지 않는 부복합-특이 항원결정기에 속한다(Huang JH, Wey, JJ, Lee, HF, Tsou, TL, Wu, CS, Wu, JR, Chen, HM, Chin C, Chien, LJ, Chen, LK, Wu YC, Pan, MJ andWang, TM (1996) Indentification of immunodominant, group-specific and subcomplex-specific, continuous epitopes in the core regions of Japanese encephalitis virus using synthetic peptides. Virus Res 41 43-53).
마우스 뇌조직 유래 정제 사백신의 경우, 주사제 백신을 3회 접종한다. 인도, 타밀 나두의 사우스 아르코트 지역에서 전체 113명의 학생을 대상으로 일본에서 제조된 백신을 가지고 시험한 결과, 72%가 항체 반응을 나타냈으며, 한편 일년 후에 비켄(Biken) 일본 뇌염 백신의 추가접종 후에는 반응성이 87.8%로 증가하였다. 접종 학생의 약 20%만이 최초 접종 후 일년이 경과한 경우에도 항체를 보유하고 있었다(Mohan Rao CVR, Risbud, AR, Dandawate, CN, Umarani, UB, Ayachit, VM, Rodrigues, FM and Pavri, KM (1993) Serological response to Japanese encephalitis vaccine in a group of school children in South Arcot district of Tamil Nadu Indian J Med Res 97 53-59). 나카야마(Nakayama)주 불활성화 백신의 경우 주변이(strain variation)와 방어율에 문제가 있다.
중국에서 사용된 약독화 일본 뇌염 백신의 경우, 백신 효능은 지금까지의 많은 연구에서 밝혀졌지만, 전 세계적으로 이런 백신의 사용에 대한 허가와 관련된 일부 문제점이 있다. 상기 백신 생성에 사용된 계대 이력 및 실험 과정들이 완전히 알려져 있지 않다. 따라서 동일 SA14-14-2주로부터 유래된 약독화주(attenuated strain)를 재발명하려는 시도가 실행되어 왔다. 일본 연구에서, 외피 당단백질과 NS 1 모두에 대한 항체들이 생일본뇌염백신주 SA14-14-2로부터 유래된 약독화 일본뇌염바이러스주 SA(A)로 감염시킨 마우스에서관찰되었다(Lee T, Komiya, T, Watanabe, K, Aizawa, C and Hashimoto, H (1995) Immune response in mice infected with the attenuated Japanese encephalitis vaccine strain SA14-14-2. Acta Virol 39 161-4).
일본뇌염백신과 관련된 문제점으로는 예를 들면 일본뇌염백신이 접종되어야만 하는 연령이 일치하지 않는다는 것이다. 또한 현재 이용 가능한 백신의 비용도 매우 비싸다. 3회 접종에 따르는 추가 비용도 고려되어야만 한다. 3회 접종 후 일본뇌염에 대한 노출 없이 일본뇌염백신의 효과가 오래 지속될 것인 지의 여부도 알려져 있지 않다. 자연적인 일본뇌염감염에 기인한 자연 면역이 생길 때까지 매년 추가접종이 필요한지 아닌지도 알려져 있지 않다. 셋째, 일본뇌염바이러스에 대한 면역 반응이 매우 낮다는 문제점이 있다(Pavri KM (1984) Problems of JE immunization in India. Proc. Of National Conference on Japanese encephalitis. Ind. J. Med. Res suppl pp 81-84). 추가적으로, 백신에 사용되는 바이러스의 나카야마주 또는 베이징주에 의한 지역주들에 대한 면역성의 문제도 고려되어야만 할 것이다. 상기 백신이 마우스 뇌조직에서 유래되었기 때문에 상기 백신에 대한 과민 반응들이 있으며, 과민성 피부점막 반응이 1983-1995 사이 접종자 10,000명당 1-17명에게서 나타났다(Plesner AM and Ronne, T (1997) Allergic mucocutaneous' reactions to Japanese encephalitis vaccine. Vaccine 15 1239-43).
최근에, 합성 펩타이드 형태의 단백질 단편들이 T 보조 및 항체 반응들을 유발하는데 사용될 수 있다는 것이 알려졌다. (Ref) 따라서, 외피 당단백질들로부터 중화항체-유발 항원결정기들의 윤곽이 그려졌다. 이러한 펩타이드 서열들은 방어면역을 유발하는데 충분하지 않기 때문에, 키메라 펩타이드는 바이러스 중화항체유발 B세포 항원결정기와 함께 T 보조 항원결정기를 혼합하여 제조된다. 이는 일본뇌염바이러스 감염에 대한 방어를 위해 T 세포 및 B 세포 면역성이 발생되도록 한다. 상기 키메라 백신은 고안된 것으로 둘 이상의 키메라 펩타이드가 앞으로 요구에 따라 효과적인 백신을 구성하기 위해 첨가될 수 있다.
본 발명은 일본뇌염바이러스용 백신인 키메라 T 보조-B세포 펩타이드에 관한 것이다.
도 1은 플라비바이러스들과 일본뇌염바이러스 반쿠라주(Bankura strain)의 외피 당단백질 서열의 다중정렬을 나타낸 도면.
도 2는 다른 JEV(Japanese Encephalitis Virus)주들과 일본뇌염바이러스 반쿠라주의 외피 당단백질 서열의 다중정렬을 나타낸 도면.
도 3은 엘리자(ELISA)법 검사에서 희석율을 달리하였을 때 반응성을 나타낸 도면.
도 4는 일본뇌염바이러스 면역 스플리노사이트를 T 보조 세포 펩타이드들로 자극시킨 결과를 나타낸 도면.
도 5a, 5b, 5c는 ELISA법으로 검사한 항일본뇌염바이러스 반응을 나타낸 도면.
도 6은 플라그감소 중화항체 검사법에 의한 바이러스를 중화시키는 항펩타이드 혈청의 효율을 나타낸 도면.
도 7은 일본뇌염바이러스의 치사량 감염시켰을 때 키메라 펩타이드로 면역시킨 마우스의 생존율을 나타낸 도면.
따라서 본 발명의 목적은 인간 및 동물용 플라비바이러스에 대한 안전하고 효과적인 백신을 제공함에 있다. 본 발명의 여러 다른 목적들과 이점들은 이하에서 명백히 기술될 것이다.
본 발명에 따르면 일본뇌염바이러스 감염 또는 일본뇌염바이러스 감염에 대한 인간 및 동물용 백신 조성물(vaccine composition)이 제공되는데, 상기 백신 조성물은 키메라 합성 펩타이드를 포함하며, 외피 당단백질로부터 선택된 상기 키메라 합성 펩타이드는 일본뇌염바이러스 외피 당단백질의 아미노산들 Egp 149-SENHGHYSAQVGASQ-163 및 Egp 427-GSIGGVEFNSIGKAVHQVFG-445로 구성되며, 일본뇌염바이러스 감염에 대한 방어면역을 유도하기에 충분한 양의 상기 키메라 펩타이드를 함유한다.
일 실시예에서, 본 발명은 일본뇌염바이러스 감염 또는 일본뇌염바이러스 감염에 대한 인간 또는 동물용 백신 조성물에 관한 것으로서, 상기 백신 조성물은 키메라 합성 펩타이드(chimeric synthetic peptide)를 포함한다. 키메라 펩타이드는외피 당단백질로부터 선택되고, 아미노산들 149-SENGHYSAQVGASQAAKF-167 및 427-GSIGGVFNSIGKAVHQVFG-445로 구성된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 상기 펩타이드 149-SENHGHYSAQVGASQAAKF-167이 일본뇌염바이러스에 대해 중화항체를 유도하는 상기 백신 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 일본뇌염바이러스 감염에 대한 인간 및 동물용 백신 조성물에 제공되는데, 상기 백신 조성물은 일본뇌염바이러스의 외피 단백질로부터 선택된 중화항체유발 펩타이드 서열(sequence)들을 포함한다. 상기 서열들은 아미노산들 46-PTLDVRMINIEA-55, 266-EYSSSVKLTSG-272이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역 동물의 T 보조세포를 자극할 수 있는 외피 당단백질, 캡시드 단백질(Capsid protein), 막단백질(membrane protein), 비구조 단백질(non structural protein)-1 및 비구조 단백질-3으로부터 선택된 펩타이드 서열들에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 일본뇌염바이러스 감염에 대해 방어면역을 유발할 수 있는 키메라 T 보조 B 세포 펩타이드(chimeric T helper B cell peptide)들을 유도하는 상기에서 언급된 펩타이드들의 조합(combination)에 관한 것이다.
자신들의 수용체(receptor)들을 통해서 B 또는 T 림프구들은 인식된 단백질들의 일부 부분들로서 항원결정기들을 한정할 수 있다. 관련 세포들에 근거하여 항원결정기들은 B 세포, T 보조세포 또는 세포독성T림프구(cytotoxic T lymphocyte: 이하 'CTL'이라 함) 항원결정기들로 분류되며, 각 항원결정기들은 각각 B 세포들, T 보조(CD4+) 및 CTLs 들을 자극한다. 주조직적합복합체(major histocompatibility complex: 이하 'MHC'라 함)분자들은 상기 T 세포들 상에 존재하는 T 세포수용체(T cellreceptor: 이하 'TCR'이라 함)에게 T 세포 항원결정기들을 제공한다. 상기 T 세포 항원결정기들과 대조적으로 B 세포 항원결정기들은 3차원 구조에 대한 의존성을 갖고 있다. B 세포 항원결정기들은 몇 가지 다른 방법들을 사용하여 예측될 수 있으며, 반쿠라(Bankura) (India)주 (733913)의 외피 당단백질의 B 세포 결정인자들이 인지되었다. 간단히, 실험적으로 확인된 B 세포 항원결정기들의 발생 빈도에 근거하여 20개 아미노산 잔유기들의 각각에 항원값들이 할당된다. 적당한 경계치(cutoff value)들과 함께 이러한 파라미터들은 개발된 컴퓨터 프로그램에 사용되었다. 표 1은 일본뇌염바이러스의 외피 당단백질의 예측된 B 세포 결정인자들을 나타낸다.
| 콜라스카르(Kolaskar)& 통가오카르(Tongaokar)의 방법 쿠투부딘(Kutubuddin)외 1993 |
| 18-TWVDLVLEGDSCLTIM-33 |
| 40-TLDVRMI-46 |
| 48-IEAVQLAEVRSYCYHASVTDISTVARCP-75 75-CPTTGEAHNEKRADSSYV-92 |
| 88-SSYVCKQG-95 |
| 113-IDTCAKFSCTSK-124 |
| 155-YSAQVGASQAAKFTVTPNAPSITLKL-180 147-TTTSENHGNYS-157 |
| 155-YSAQVGASQAAKFTVTPNAPSITLKLGD-182 |
| 185-EVTLDCE-191 |
| 199-EAFYVMTV-206 |
| 208-SKSFLVHRE-216 226-WTPPSSTAWRNR-237 |
| 262-LHQALAG-268 243-FEEAHATKQ-251 |
| 273-EYSSSVKLTSGHLKCRLK-290 |
| 292-DKLALKG-298 309-FAFAKNPADTG-319 |
| 320-GTVVIELSYS-329 328-SYSGSDGP-335 |
| 351-VGRLVTVN-358 |
| 367-NSKVLVEME-375 363-ATSSANS-369 |
| 379-GDSYIVVGR-387 |
상기 표 1은 일본뇌염바이러스의 외피 당단백질로부터 예측된 아미노산 서열들을 나타낸 것이다. 아미노산 서열은 일본뇌염바이러스주 반쿠라(Bankura)(733913)으로부터 유래된다.
백신 개발에 유용할 수 있는 독특한 서열들에 도달하기 위해서, 다른 관련 플라비바이러스들, 즉, WNV, MVEV, DENV 및 YFV로부터 유래된 아미노산 서열들이 아미노산 데이터 뱅크들로부터 다운로드되었으며, CLUSTAL 프로그램을 사용하여 다중정렬(multiple alignment)하였다. 유사하게 약간의 일본뇌염바이러스주들로부터 아미노산 서열들을 이해하기 위해서 다중정렬을 이용하였다.
CLUSTAL 프로그램을 사용하여 상기 다중정렬을 실행하였고 그 결과가 표 1 및 표 2에 나타나 있다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 다른 플라비바이러스들과 비동종인 외피 당단백질들의 부위들은 다음과 같다:
1. 149-SENHGNYSAQVGASQ-163
2. 40-TLDVRMINIEA-50
3. 270-IVVEYSSSVKLTS-282
이러한 서열들은 다른 일본뇌염바이러스주들 내에서도 보존된다(도 2). 이는 40-50, 155-163 및 270-290 부위들이 일본뇌염바이러스에 대해 유일한 것임을 의미한다. 따라서 외피 당단백질로부터 선택된 이러한 펩타이드들에 대해 유도된 항체들은 중화항체가 될 가능성이 더 많게 된다. 일본뇌염바이러스 나카야마주(Nakayama strain) 및 반쿠라주(Bankura strain)의 아미노산 서열 사이에 큰 차이가 없다는 것이 이해되어야 한다.
펩타이드 합성
표준 고체상 합성 프로토콜에 따라서 펩타이드들을 합성하였다. 분열(cleavage) 시 펩타이드산들을 생성하는 Novasyn PA 500 수지(Novabiochem Ltd. UK) 상에 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-Fluorenylmethoxycarbonyl: 이하 'FMOC'라 함) 아미노산 펜타플루오로페닐(pentafluorophenyl) (O PFP) 에스터를 사용하여 합성을 수행하였다. 아미노산 커플링(coupling)의 완성 여부는 불충분하게 치환된 펩타이드의 생성을 방지하기 위해서 엄격히 모니터되는데, 상기 고체상에서 자유 말단 아미노기들을 검출하기 위한 커플링반응 컬러 테스트의 정성 감시에 의해 자유 아미노기들을 검출함으로써 행하여진다. 또한 피페리딘(piperidine) 20%을 함유한 다이메틸 포름아마이드(dimethyl formamide) 용액에 의한 반응기노출(deprotection) 과정 중에 제거된 FMOC기를 모니터하여 290nm에서 커플링을 체크하였다. 서열에 따른 적당한 포집제(scavenger)와 함께 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid: 이하 'TFA'라 함)에 의해 수지에서 펩타이드를 분열시켰다. 상기 펩타이드을 초건조 다이에틸 에테르(super dry diethyl ehter)에 침전시켰다. 상기 펩타이드를 침전시킨 에테르를 고성능크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography: 이하 'HPLC'라 함)로 정제하고 피크(peak) 데이터를 수집하였다. 역상(reverse phase) 18 컬럼(column) 상에서 0.1% TFA를 함유한 80% 아세토나이트릴(acetonitrile) 수용액의 선형 기울기 용리(linear gradient elution)로 상기 펩타이드의 단일 피크 용리를 평가하여 순도를 체크하였다. 정제된 펩타이드를 동결건조하여 -20℃에서 보관하였다.
85%보다 큰 순도를 가진 펩타이드를 콘쥬게이션(conjugation)용으로 사용하였다. 택일적으로, 제조 프로토콜에 따라 FMOC 아미노산을 사용하여 핀 헤드(Pin head) 펩타이드 합성으로 270-290 영역의 펩타이드들을 합성하였다. 상기 핀들에 부착된 펩타이드들은 유지하면서 트리플루오로아세트산을 사용하여 이러한 펩타이드들의 곁사슬(side chain)들을 분열시켰다.
JE 바이러스에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody)와 펩타이드의 반응성
다른 면역 특성을 가진 항일본뇌염바이러스 단클론 항체의 패널(panel) 및 NIV에서 개발된 인도주(Indian strain)에 대한 단클론 항체들을 사용하여 일본뇌염바이러스의 외피단백질의 항원결정기를 지도화하였다. 상기 펩타이드들의 항원성을 규명하는데 이러한 단클론 항체들을 사용하였다. 이런 연구의 목적은 상기 단클론 항체들에 의해 인지된 항원결정기를 결정하고 최적의 펩타이드 길이 및 항원결정기로서의 서열을 찾고자 하는 것이다. 또한 항원 결합을 위해 구조적 요구를 명확히 하는 것이다. 상기 단클론 항체들은 일본뇌염바이러스 특이한 Hs-1, Hs-2, Hs-3을 포함하며, 인도주에 대한 단클론 항체를 사용하여 일본뇌염바이러스 외피단백질의 적혈구응집억제(Hemagglutination inhibition: 이하 'HI'라 함) 양성 항원결정기를 지도화하였다(J. Gen Virol 69 2714-7).
pH 9.6인 Na2CO3/HCO3버퍼를 사용하여 엘리자(Enzyme Linked Immunosorbent Assay: 이하 'ELISA'라 함) 웰(Immulon II, Nunc)들 상에 펩타이드(lug/well)를 수동으로 코팅하였다. 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin: 이하 'BSA'라 함)을 함유한 인산염완충식염수(phosphate buffer saline: 이하 'PBS'라 함)로 차단(blocking)하였다. 펩타이드의 반응 및 세척은 1% BSA를 함유한 PBS(0.01M 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2)에서 수행되었다. 반응을 위해 단클론 항체를 1:50 또는 1:100배 희석하였다. 1% BSA를 함유한 PBS로 희석한 100마이크로 리터의 항체를 첨가한 후 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 그리고 나서 0.1% Tween 20, 결합 항체(Sigma, USA)를 함유한 PBS로 세척하였다. ELISA의 경우, 펩타이드로 핀들을 차단한 후 핀 헤드들이 항체를 함유한 웰들에 적시어졌다. 색원체(chromogen)로서 H2O2및 오르소-페닐 다이아민(O-phenyl diamine: 이하 'OPD'라 함)를 사용하여 발색시켰다. 흡광도(optical density: 이하 'OD'라 함) 값들을 492nm에서 측정하였고, 인도주에 대한 단클론 항체를 사용하여 일본뇌염바이러스 외피단백질의 항원결정기를 지도화하였다. 음성 대조군으로는 SP2/0 AF를 사용하였다. 표 2의 데이터에는 펩타이드들 39-PTLDVRMINI-48, 269-AIVVEYSSSVKLT-281과 단클론 항체 Hs-1을 반응시킨 것 및 펩타이드 151-NHGNYSAQVGASQAAKF-167과 단클론 항체 Hs-2, 단클론 항체 Hs-3을 반응시킨 것이 나타나 있다.
일본뇌염 바이러스에 대한 엘리자법(ELISA)
엘리자 웰(Nunc Immulon II)을 탄산나트륨 버퍼(0.05M, pH 9.8)에 하룻밤 둔 정제된 JE 항원(10g/well)으로 코팅하였다. 그리고 나서, 1% BSA를 함유한PBS(0.01M 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2)로 웰을 차단하였다. 1% 오브알부민(ovalbumin)을 함유한 PBS로 희석한 100마이크로 리터의 항체를 첨가한 후 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 0.1% Tween 20-PBS로 세척한 후, 결합 항체를 염소-항마우스 엘지-허스래디시페록시다제 콘쥬게이티드 항체(goat-anti mouse lg-horseradish peroxidase conjugated antibody)(Sigma, USA)로 검사하였다. 색원체로 H2O2와 OPD를 사용하여 발색시켰다. 492nm에서 흡광도(OD)값을 측정하였다(Cecilia 외, 1988). 일본 뇌염(Japanese encephalitis: 이하 'JE'라 함) 바이러스에 대한 항체 반응은 항펩타이드 항체혈청으로 시험하였다. 이런 모든 실험들에서, PBS 대조군 마우스 및 오브알브민으로 면역시킨 마우스로부터 채취한 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 다클론 면역 AF를 양성 대조군으로 사용하였고 비면역 마우스에서 얻은 복막 AF를 음성 대조군으로 사용하였다. 단클론 항체들에 대한 실험들에서, SP2/0을 접종한 마우스로부터 얻어진 AF를 음성 대조군으로 사용하였다.
| 펩타이드 | Hs-1 | Hs-2 | Hs-3 |
| 33-IMANDKPT-40 | 0.110 | 0.016 | 0.017 |
| 35-ANDKPTLD-42 | 0.022 | 0.016 | 0.052 |
| 37-DKPTLDVR-44 | 0.029 | 0.016 | 0.035 |
| 39-PTLDVRMI-46 | 0.313 | 0.006 | 0.025 |
| 40-TLDVRMIN-47 | 0.329 | 0.008 | 0.064 |
| 41-LDVRMINI-48 | 0.277 | 0.007 | 0.082 |
| 42-DVRMINIE-49 | 0.155 | 0.008 | 0.043 |
| 43-VRMINIEA-50 | 0.338 | 0.012 | 0.133 |
| 45-MINIEASQ-52 | 0.177 | 0.001 | 0.080 |
| 47-NIEASQLA-54 | 0.07 | 0.003 | 0.081 |
| 155-YSAQVGASQ-163 | 0.118 | 0.492 | 0.334 |
| 151-NHGNYSAQVGASQ-163 | 0.074 | 0.294 | 0.258 |
| 149-SENHGNYSAQVGASQ-163 | 0.093 | 0.415 | 0.377 |
| 155-YSAQVGASQAAKF-167 | 0.106 | 0.501 | 0.377 |
| 151-NHGNYSAQVGASQAAKF-167 | 0.084 | 0.561 | 0.259 |
| 149-SENHGNYSAQVGASQAAKF-167 | 0.095 | 0.412 | 0.400 |
| 269-AIVVEYSS-276 | 0.696 | 0.041 | 0.115 |
| 270-IVVEYSSS-277 | 0.637 | 0.030 | 0.112 |
| 271-VVEYSSSV-278 | 0.659 | 0.029 | 0.090 |
| 272-VEYSSSVK-279 | 0.290 | 0.040 | 0.106 |
| 273-EYSSSVKL-280 | 0.538 | 0.045 | 0.110 |
| 274-YSSSVKLT-281 | 0.616 | 0.054 | 0.153 |
| 275-SSSVKLTS-276 | 0.765 | 0.053 | 0.136 |
| 276-SSVKLTSG-277 | 0.447 | 0.061 | 0.123 |
마우스의 면역 운반체와 펩타이드의 콘쥬게이션(conjugation)
펩타이드들 40-TLDVRMINIEASQ-52 및 149-SENHGNYSAQVGASQA-163을 합성 정제하여 상기 운반체 분자(carrier molecule)에 콘쥬게이션하였다. 이번 실험에서 사용된 운반체 분자는 오브알부민(ovalbumin: 이하 'OA'라 함)이었다. N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에스-아네술폰산(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-eth-anesulfonic acid: 이하 'HEPES'라 함) 버퍼(50mM pH 8.5)에 상기 펩타이드를 10 mg ml-1농도로 용해시켜 교반하였다. 교반 중에, 동일 부피의 무수시트라콘산(citraconic anhydride) 용액(10 mg ml-1수용액)을 천천히 첨가하였다. 반응 중에 pH는 8-9로 유지하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 한 시간 동안 배양하였다. 상기 펩타이드를 1 mg ml-1농도까지 희석하였다. 3-다이메틸-아미노프로필-3-에틸카르보다이이미드(3-dimethyl-aminopropyl-3-ethylcarbodiimide: 이하 'EDC'라 함)를 상기 펩타이드에 첨가하여 최종 농도를 10 mg ml-1이 되게 하였고, pH는 8로 유지하였다. 실온에서 5분 동안 배양한 후, 동일 부피의 오브알부민을 1;20 몰비(운반체:펩타이드)로 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 반응시킨 후 소디움 아세테이트(sodium acetate) pH 4.2를 첨가하여 최종 농도 100mM로 반응을 종결시켰다. 1시간동안 배양한 후, 용액을 소디움 아세테이트 pH 4.2에 대해 투석하고 12시간 동안 4번 PBS 12L에 대해 투석하였다. 상기 펩타이드 단백질 콘쥬게이트(peptide protein conjugate)를 동결건조하여 0℃에서 보관하였다.
면역반응을 위해, 프로인트완전면역보강제(Freund's complete adjuvant)에 (1:1) 유화시킨 펩타이드-단백질 콘쥬게이트 40㎍를 마우스의 피하에 주사하였다. 펩타이드-단백질 운반체 콘쥬게이트당 4마리의 마우스를 사용하였다. 유사량의 펩타이드-운반체 콘쥬게이트를 프로인트불완전보강제에 유화시켜 일주일 간격으로 2회 추가접종하였다. 펩타이드와 PBS가 없는 운반체 단백질을 면역보강제에 유화시켜 대조군들에 주사하였다. 항체가를 체크하기 위해서 면역 후 7일, 14일, 21일에 마우스의 안구후신경총(retro-orbital plexus)에서 혈액을 채취하였다. 혈액에서 혈청을 분리하여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다. 항 일본뇌염바이러스 면역반응을 ELISA법으로 체크하였는데, 항펩타이드 혈청을 상기에서 언급한 방법으로 자연 일본뇌염바이러스 비리온(virion)과 반응시켰다. 도 3은 ELISA법 검사에서 희석율을 달리하였을 때의 반응성을 나타낸다.
항체 유발 및 항체 결합 용량의 관점에서 이런 영역을 미세조정하기 위해서 중복 펩타이드의 세트를 합성하여 동일한 것을 검사하는데 사용하였다.
다음과 같은 중복 펩타이드들을 합성하였다.
155-163YSAQVGASQ
151-163NHGNYSAQVGASQ
149-163SENHGNYSAQVGASQ
155-167YSAQVGASQAAKF
151-167NHGNYSAQVGASQAAKF
상기 모든 펩타이드들은 필수적으로 오브알부민에 콘쥬게이션시켰다.
상기에서 언급된 프로토콜에 따라서, 4마리의 BALB/c 마우스 각각을 프로인트면역보강제와 함께 상기 펩타이드 오브알부민 콘쥬게이트들의 40㎍/mouse/dose로 면역시켰다. 1주일 간격으로 상기 마우스에 추가접종을 실시하였고 1주일 간격으로 채혈하였다. 항일본뇌염바이러스 반응을 상기 언급한 방법에 따라 ELISA법으로 측정하였다. 측정으로 얻어진 값들은 평균 흡광도이다.
| 오브알부민과 함께 펩타이드 콘쥬게이트로 면역시킨 마우스 | 접종 후 7일마다 채취된 혈청 | ||
| 7 | 14 | 21 | |
| 155YSAQVGASQ163 | 0.212+0.076 | 0.236+0.028 | 0.195+0.047 |
| 151NHGNYSAQVGASQ163 | 0.286+0.153 | 0.270+0.62 | 0.246+0.090 |
| 149SENHGNYSAQVGASQ163 | 0.242+0.157 | 0.268+0.096 | 0.268+0.057 |
| 155YSAQVGASQAAKF167 | 0.223+0.037 | 0.262+0.067 | 0.198+0.0178 |
| 151NHGNYSAQVGASQAAKF167 | 0.226+0.060 | 0.220+0.033 | 0.144+0.021 |
| 149SENHGNYSAQVGASQAAKF167 | 0.191+0.058 | 0.255+0.050 | 0.217+0.029 |
| 오브알부민 | 0.127+0.022 | 0.116+0.072 | 0.153+0.003 |
| PBS | 0.113+0.034 | 0.124+0.029 | 0.183+0.029 |
표 3은 ELISA법에 의한 일본뇌염바이러스와 항펩타이드 항체의 반응성을 나타낸다. 일본뇌염바이러스에 반응하는 항펩타이드 항체 반응은 1회 접종 후 7일마다 모든 펩타이드 면역 마우스에 대해 관찰되었다. 예측 방법의 정확성을 확인하는 ELISA법에서 모든 펩타이드들에 대한 항혈청이 자연 일본뇌염바이러스에 반응성을 나타내었다.
일본뇌염바이러스의 구조 단백질 및 비구조 단백질로부터 얻어진 T 보조 항원결정기들의 윤곽
면역 반응에서 T 보조 세포들의 중요성은 잘 알려져 있다. B 세포들의 성장 및 면역 반응의 성숙의 경우에 B 세포들은 어떤 국소적인 인지체 신호들 및 T 세포들에서 기원한 세포-세포 접촉을 필요로 한다. 양친매성(amphipathic)을 예측하기 위해 방법들을 조합 사용하는 경우, I-A 및 I-E 결합 모티프(motif)를 갖게되는 나선 프레퍼러(prefere)들 및 서열들의 예측과 함께 사량체(tetramer) 및 오량체(pentamer)가 JE 바이러스의 모든 단백질들에 대해 예측되었다.마르가리트(Margalit) 등에 의해 개발된 AMPHI 프로그램에 의해 예측된 양친매성 나선 단편들을 포함하여 T 보조 항원결정기들에 대한 예측이 EPIPLOT를 사용하여 실행되었다(Margalit H, Spnge J.L., Cornette J.L., Cease K.B., DeLisi C, and Berzofsky J.A. (1987) Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence. J. Immunology 138, 2213-2229). 양친매성 단편들을 예측하기 위해서, 아미노산의 파우헤레(Fauchere) 및 플리스카(Pliska) 소수성 척도가 사용되었으며, 7개의 블록 길이가 선택되었다(Fauchere J.L. and Pliska V., (1983) Hydrophobic parameters II of amino acid side chains from the partitioning of N-acetyl amino acid Eur. J. Med. Chem. 18, 369-375). 사량체 및 오량체 모티프 [하전된 잔기(residue)들 또는 2-3 소수성 잔기들 및 극성 잔기들이 따라오는 글라이신(glycine)]는 "라스바드(Rothbard)" 및 "테일러(Taylor)"에 의한 것이다(Rothbard J. and Taylor W.R. (1988) A common sequence pattern in T cell epitopes. EMBO J. 7, 93-100). 고 친화력으로 주조직적합복합체(MHC)[la/le]에 결합가능한 면역지배적 이차 구조들의 서열 모티프들에 대한 예측이 "세테(Sette)" 등의 방법에 따라 실행되었다(Sette A., Buus S., colon S., Miles C. and Grey H.M. (1989) Structural analysis of peptides capable of binding to more than one la antigen. J. Immunol 142, 35-40). 플라비바이러스의 교차반응 T 보조 항원결정기들을 선택하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하여 플라비바이러스들을 다중정렬하였다. 이러한 각각의 예측 프로그램들에 스코어(score)가 높은 T 보조 펩타이드들을 선택하였다. 교차반응 항원결정기들은플라비바이러스들 간의 상동성(homology)에 근거하여 선택되었다. 다양한 플라비바이러스들 간의 상동성 분석 및 서열 정렬 후에 14개의 펩타이드 서열을 선택하였다.
제조자의 방법에 따라 분리할 수 있는 선택사항들을 사용하는 카이론 핀-헤드 모듈(Chiron Pin-head module)들 상에서 이러한 펩타이드들을 합성하였다. 상기에서 언급한 트리플로오로아세트산을 사용하여 펩타이드를 분열시켰다. BALB/c 마우스는 마우스 뇌조직 생 일본뇌염바이러스, 복막내 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)의 0.1 ml,10-2희석액으로 초회항원자극을 받았으며, 초회항원자극을 받은 마우스에게 일본뇌염바이러스, 웨스트 나일 바이러스를 불활화시킨 마우스 뇌조직 항원[10㎍] 및 동일 부피의 프로인트완전면역보강제에 혼합한 정상 항원 0.1ml를 피하 접종하였다. 채취 4일 전에 동일 항원을 프로인트불완전면역보강제에 혼합하여 추가접종하였다. 면역 마우스 및 비면역 마우스로부터 얻은 스플리노사이트(spleenocyte)를 사용하여 T 보조 세포 증식법을 실행하였다. 96-웰 평바닥 플레이트(plate)들에 2x105cells/well/0.1ml 농도의 스플리노사이트를 첨가하였다. 0.1 ml의 JEV 항원[5,2.5 & 1㎍/ml] 및 펩타이드[10,5 &2.5 ㎍/ml]를 가지고 배양을 자극하였다. 6일 후, 배양은 18시간 동안 luCi[H] 티미딘(Thymidine)으로 펄스(pulse)된다. 세포들을 증식하여 방사능을 측정하였다. 수치들이 비면역 림프구들의 바이러스 면역 림프구들-cpm(counts per minute)의 네트(NET)cpm으로 도시되었다. 도면과 표에 나타낸 바와 같이 JE 바이러스의 비구조 단백질로부터 얻어진 펩타이드들은 특히 좋은 자극을 나타내었다.
도 4는 일본뇌염바이러스 면역 스플리노사이트를 T 보조 세포 펩타이드들로 자극시킨 결과를 나타낸다.
| 단백질 | 서열 | 반응 | ||
| JE | WN | |||
| 펩타이드1 | WN Egp | 135-IKYEVAIFVHB-145 | ++ | + |
| 펩타이드 2 | JE Egp | 260-GALHQALAGAI-270 | - | - |
| 펩타이드 3 | JE Egp | 140-GIFVHGTTTSE-150 | + | + |
| 펩타이드 4 | JE Egp | 346-HVLGRLTTVN-355 | +++ | - |
| 펩타이드 5 | JE M | 17-EAWLDSTKAT-26 | ++++ | - |
| 펩타이드 6 | JE PrM | 36-WVRAIDVG-43 | ++ | - |
| 펩타이드 7 | JE NS1 | 37-ETPRSLAKIVHKAH-50 | + | - |
| 펩타이드 8 | JE NS1 | 297-SVRTTTDSGKLITD-310 | ++++ | + |
| 펩타이드 9 | JE NS1 | 156-EDFGFGITSTRV-167 | ++++ | - |
| 펩타이드 10 | JE NS1 | 404-TDLARYVVL-412 | +++ | ++ |
| 펩타이드 11 | JE NS3 | 202-KILPQIIKDAIQ-212 | + | - |
| 펩타이드 12 | JE NS3 | 17-DTTTGVYRIMARG-29 | ++ | ++ |
| 펩타이드 13 | JE NS3 | 534-FLELLRTAD-543 | + | - |
| 펩타이드 14 | JE Egp | 439-SIGGVFNSIGKAVHQ-455 | +++ | + |
도면 및 표에 나타낸 결과들을 근거하여 다음과 같은 펩타이드들이 키메라 T 보조 B 세포 백신에 포함될 후보 T 보조 세포 펩타이드들로 선택되었다.
JE Egp 346-HVLGRLTTVN-355
JE M 17-EAWLDSTKAT-26
JE NS1 297-SVRTTTDSGKLITD-310
JE NS1 156-EDFGFGITSTRV-167
JE NS1 404-TDLARYVVL-412
JE Egp 439-SIGGVFNSIGKAVHQ-455
키메라 T 보조 및 B 세포 펩타이드들의 합성, 면역반응 및 방어에 대한 연구
T 세포들을 자극할 수 있는 후보로서 외피 당단백질로부터 유래된 T 세포 항원결정기들을 실험실에서 일찍이 검사하였었다(Kutubuddin, M, Kolaskar, AS, Galande, S, Gore MM, Ghosh. SN, Banerjee, K. (1991) Recognition of helper T cell epitopes in envelope (E) glycoprotein of Japanese encephalitis West Nile and Dengue virus. Mol. Immunol 28 149-54). 따라서 직렬로 T 보조 및 B 세포 항원결정기들을 모두 갖고 있는 합성 펩타이드를 제조하기로 하였다. 다음과 같은 등방향성 펩타이드가 합성되었다:
NH2-SENHGNYSAQVGASQGSIGGVFNSIGKAVHQVFG-COOH
이러한 펩타이드는 다음과 같은 두 개의 성분들을 갖는다:
B 세포 항원결정기149-SENHGNYSAQVGASQ-163
T 세포 항원결정기429-SIGGVFNSIGKAVHQVFG-445
상기 펩타이드는 상기에서 언급된 FMOC 아미노산을 이용하는 고체상 합성법으로 등방향성 단일 펩타이드로 합성되었다.
단일 피크를 나타내는 정제된 펩타이드를 모아서 동결건조하여 면역반응에 사용하였다. 면역반응은 근교배 및 비근교배한 다른 계통의 성인 마우스에서 이루어졌다(n=8). 상기 근교배 마우스는 BALB/C(H-2) 및 C3H(H-2)인 반면에 상기 비근교계 마우스는 SWISS/Albino이었다. 면역반응에 사용된 항원들은 키메라 펩타이드, B 세포 펩타이드, 상품화된 일본뇌염바이러스 백신(인도, 카사울리, 중앙연구소로부터 구입함) 및 PBS(sham)이었다. 면역반응은 스케줄을 달리하여 이루어졌다. 면역반응 스케줄은 14일 마다 sc 경로를 통하여 프로인트면역보강제와 함께 펩타이드 50㎍/mouse/dose 접종하는 것이었다. 제1 접종 시에는 프로인트완전면역보강제를 사용한 반면에 그 후 접종에는 프로인트불완전면역보강제를 사용하였다. 총 2회 추가접종을 실시하였다. 접종 3일 전(면역 전 혈청), 제1 접종 후 10, 22, 34일마다 안와후방(retro-orbital) 경로를 통하여 모든 마우스들의 혈액을 채취하였다. 마지막 접종 후 일주일이 지난 35일째에 상기 마우스들에게 치사량의 생바이러스를 감염시켰다. 감염 후 21일 동안 부반응과 사망률을 기록하였다. 또한 ELISA법, 면역형광계측법(immunofluorsence assay) 및 중화항체검사와 시험감염과 같은 바이러스학법 등의 일반적인 방법들을 이용하여 면역반응을 판정하였다.
ELISA법으로 항 일본뇌염바이러스 반응을 검사하였다. 도 5 a, b, c에 도시된 바와 같이, 상기 키메라 펩타이드가 면역원인 경우, 상기 펩타이드들은 특히 JE 바이러스에 대해 면역반응을 유발할 수 있음을 알 수 있다. 면역반응에서, 일본뇌염바이러스 백신 접종 후 키메라 펩타이드와 B 세포 펩타이드 순으로 접종한 마우스에게서 가장 좋은 반응 결과가 나타났다.
항 키메라 펩타이드 혈청에 의한 시험관내 바이러스 중화항체 검사법
플라그감소법(plaque reduction assay)을 이용하여 중화항체검사를 실행하였다. 항키메라 펩타이드 혈청을 배양 배지에 1:50으로 희석하였다. 희석된 혈청 50㎕와 유닛(unit)들을 형성하는 48 플라그를 함유한 바이러스 풀(pool) 50㎕를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 바이러스 항체 혼합물을 24 웰 플레이트들에서 미리 형성된 돼지의 안정 신장세포들에 첨가하였다. 1시간 후 카르복실메틸 셀룰로오스 중첩 흡착제를 첨가하여 상기 플레이트들을 3시간 동안 배양하였다. 항체 없는 바이러스 플라그 수를 세어서 플라그 억제율을 계산하였다. 도 6은 상기 바이러스를 중화시키는 항펩타이드 혈청의 효율을 나타낸다. 도면에 나타낸 바와 같이 C3H 마우스에서 키메라 펩타이드들에 대해 형성된 항체들은 일본 뇌염 바이러스를 중화할 수 있다.
치사량의 일본뇌염바이러스 감염에 대한 키메라 펩타이드로 면역시킨 쥐의 방어시험
상기 펩타이드들은 잠재적인 백신 후보들이기 때문에, 상기 펩타디들로 면역시킨 마우스들을 가지고 바이러스 감염에 대한 저항성을 측정하였다. "예오레카르(Yeolekar)"와 "바네르지(Banerjee)"에 의한 프로토콜에 따라서 일본뇌염바이러스의 치사량을 투여하였다(Yeolekar, LR and Banerjee, K. (1996) Immunogenicity of immunostimulating complexes of Japanese encephalitis virus in experimental animals. Acta Virological 40 245-250). 일본뇌염바이러스 현탁액 0.1ml를 키메라 펩타이드 면역 마우스의 복강내에 접종한 후 즉시 뇌내 경로에 의하여 1% 녹말용액 0.03ml를 접종하였다. 감염 후 21일 동안 상기 마우스들을 관찰하였다. 도 7에 나타낸 생존 곡선에 따르면 키메라 펩타이드들로 면역된 C3H 마우스는 바이러스 감염을 견뎌낼 수 있었다. 다른 계통의 마우스들(BALB/c 또는 SWISS)은 상기 바이러스를 중화할 수 없었으며 상기 바이러스 감염을 견뎌낼 수도없었다.
도 7은 2.3 log LD 50의 바이러스를 감염 접종하였을 때 일본뇌염바이러스 감염에 대한 키메라 펩타이드 KK 면역 마우스들의 생존율을 나타낸 도면이다.
여기서 제공된 데이터에 따르면 일본뇌염바이러스의 치사량 감염으로부터 마우스들이 보호될 수 있음을 알 수 있다. 또한 상기 데이터는 상기 펩타이드 항원결정기 149-SENHGNYSAQVGASQAAKF-167외에도 B 세포 항원결정기들 39-PTLDVRMINI-48 및 269-AIVVEYSSSVKLT-281도 일본뇌염바이러스에 대해서 중화항체들을 유발할 수 있고 이는 이런 항원결정기들에 유일한 것임을 나타낸다. 또한 상기 데이터는 펩타이드들 JE Egp 346-HVLGRLTTVN-355, JE M 17-EAWLDSTKAT-26, JE NS1 297-SVRTTTDSGKLITD-310, JE NS1 156-EDFGFGITSTRV-167, JE NS1 404-TDLARYVVL-412, JE Egp 439-SIGGVFNSIGKAVHQ-455가 T 보조 세포 펩타이드들로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 키메라 T 보조 B 세포 펩타이드는 치사량 감염으로부터 상기 마우스들을 보호할 수 있기 때문에, B 세포 및 T 보조 펩타이드들의 어떠한 모든 조합들도 일본뇌염바이러스에 대한 백신 개발에 있어서 유용하다.
본 발명은 일본뇌염바이러스용 백신인 키메라 T 보조-B세포 펩타이드에 관한 것으로서, 일본뇌염바이러스의 백신 개발에 이용 가능하다.
Claims (5)
- 일본뇌염바이러스 감염용 또는 일본뇌염바이러스 감염에 대한 인간 및 동물용 백신 조성물에 있어서,상기 백신 조성물은 키메라 합성 펩타이드를 포함하고, 상기 펩타이드는 외피 당단백질로부터 선택되며, 일본뇌염바이러스 외피 당단백질의 아미노산들 Egp 149-SENHGHYSAQVGASQ-163 및 Egp 427-GSIGGVFNSIGKAVHQVFG-445로 구성되며, 일본뇌염바이러스 감염에 대한 방어면역을 유도하기에 충분한 양의 상기 키메라 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 Egp 149-SENHGHYSAQVGASQAAKF-167이 일본뇌염바이러스에 대해 중화항체를 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 일본뇌염바이러스 감염에 대한 인간 및 동물용 백신 조성물에 있어서, 일본뇌염바이러스의 외피 당단백질로부터 선택된 중화항체 유발 펩타이드 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 면역 동물의 T 보조세포를 자극할 수 있는 일본뇌염바이러스의 외피 당단백질, 캡시드단백질, 막단백질, 비구조 단백질-1 및 비구조 단백질-3으로부터 선택된 펩타이드 서열.
- 일본뇌염바이러스 감염에 대해 방어면역을 유발할 수 있는 키메라 T 보조 B세포 펩타이드들을 유도하는 제3항 및 제4항에서 청구된 펩타이드들의 조합.
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Cited By (1)
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