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KR20040015794A - 부직포를 이용한 핵산 정제법 및 검출법 - Google Patents

부직포를 이용한 핵산 정제법 및 검출법 Download PDF

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KR20040015794A
KR20040015794A KR10-2004-7000272A KR20047000272A KR20040015794A KR 20040015794 A KR20040015794 A KR 20040015794A KR 20047000272 A KR20047000272 A KR 20047000272A KR 20040015794 A KR20040015794 A KR 20040015794A
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Abstract

본 발명은 혈액 또는 액체 배양 배지와 같이 세포를 함유하는 샘플로부터 핵산을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서는, 세포를 파괴하여 얻은 세포 추출액은 부직포로 만든 필터에 의해 흡착되며, 필터를 세척한 후에 이로부터 핵산을 용출한다. 핵산은 알칼리 조건 (pH 12 이상)하에서 용출될 수 있다. 또한, 필터에 흡착된 핵산을 활성 산소로 처리하거나, 또는 계면활성제를 사용하여 용출시키는 것도 가능하다. 상기 방법에 의해 분리 및 정제된 핵산은 핵산 증폭 또는 염기 서열 분석 기술에 유용하다.

Description

부직포를 이용한 핵산 정제법 및 검출법 {Method of Purifying Nucleic Acid Using Nonwoven Fabric and Detection Method}
DNA와 같은 핵산을 세포로부터 제조하기 위해서는, 일반적으로 세포를 포함하는 시료를 SDS나 프로테이나제 K(Proteinase K)로 처리하여 가용화한 후, 페놀로 단백질을 변성 제거하여 핵산을 정제한다 [Molecular Cloning 2nd Edition, 9. 16-9. 23, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. 그러나, 수고와 시간이 걸리기 때문에 보다 간편한 방법이 요구되고 있다.
보다 간편한 방법으로서는, 예를 들면 실리카를 이용하는 방법이 EP0389063에 개시되어 있다. 이 방법에서는, 우선 세포를 카오트로픽성 시약(chaotropic reagent)으로 처리하여 세포를 용해시키고, 핵산을 유리시킨다. 다음으로, 실리카 또는 그의 유도체로 이루어진 핵산 결합성 담체에 핵산을 흡착시키고, 이 담체를카오트로픽성 시약이나 유기 용매 중에서 원심분리하여 세정한다. 마지막으로, 낮은 염농도의 완충액으로 핵산을 용출시킨다. 이 방법은 페놀법과 비교하면 간편하다고 하지만, 아직 많은 공정을 포함하며 원심분리 조작이 필요하다는 결점이 있다. 또한, PCR 등의 효소 반응을 강하게 저해하는 카오트로픽제나 에탄올을 사용하기 때문에 이들 물질을 완전히 제거해야할 필요가 있고, 그 때문에 조작이 번잡하게 되어 시간이 걸리는 등의 결점이 있다.
백혈구 분리 필터와 같은 세포 흡착성 섬유 집합체를 이용하여 말초혈 백혈구로부터 핵산을 제조하는 방법은, 일본 특허 공개(평)8-24583호나 일본 특허 공개 (평)8-280384호에 개시되어 있다.
일본 특허 공개(평)8-24583호에 따르면, 우선 백혈구 분리 필터에 혈액을 통과시키고, 혈액 중의 백혈구를 필터에 흡착시켜 혈액의 다른 성분과 분리한다. 이 필터에 TE 완충액(10 mM Tris; 1 mM EDTA; pH 7.6)을 통과시켜 세정함으로써, 헤모글로빈 등의 단백질을 제거한다. 이렇게 해서 분리 세정된 백혈구를 각 필터 상에서, 예를 들면 -80 ℃에서 동결한 후, 실온에서 방치하여 백혈구를 해동시킨다. 그로부터 섬유상 물질에 TE 완충액-혼합물(TE 완충액, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, pH 7.5)를 첨가하여, 필터의 섬유상 물질에 흡착되어 있던 백혈구를 섬유상 물질로부터 회수한다. 그러나, 일본 특허 공개(평)8-24583호에서는 회수된 백혈구로부터 게놈 DNA를 추출하는 조작이 종래의 기술로 행해지고 있다. 즉, 백혈구에 10 ％ 황산도데실나트륨(SDS) 등의 계면활성제와 단백질 분해 효소(프로테이나제 K)를 첨가하여 65 ℃에서 15 시간 인큐베이션하고, 이것에 RNA 분해 효소(RNaseA)를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 인큐베이션한다. 이로부터 이것을 페놀 시약으로 처리하여, DNA를 에탄올로 침전시켜 정제한다.
일본 특허 공개(평) 8-280384호에서는 유핵 세포를 흡착한 후, 유핵 세포 중의 핵산 또는 단백질을 추출하는 방법을 개시하고 있다. 핵산 또는 단백질을 추출하는 방법으로서는, 극세 섬유 집합체에 세포를 결합시킨 채로 세포 용해액을 통액하여 용해시키거나 또는 파쇄 등을 행한다. 이 방법의 이점은, 흡착된 세포를 그대로 파쇄, 용해 처리하는 것이 가능한 것이다. 흡착한 세포를 탈리시키지 않고 흡착된 세포를 파쇄하거나 또는 용해시킴으로써, 흡착된 세포를 탈리시키는 방법으로도 용이하게 실시가 가능하다. 그러나, 세포 용해 후의 핵산 정제에 대해서는, 종래의 기술을 이용하고 있으며 새로운 방법은 개시되어 있지 않다. 즉, 우선 세포를 흡착한 극세 섬유 집합체를 정제수나 계면활성제로 처리하여, 극세 섬유 집합체를 통과한 세포 용해액으로부터 통상의 페놀ㆍ클로로포름법으로 핵산을 정제하고 있다.
이상과 같이, 백혈구 분리 필터와 같은 세포 흡착성 섬유 집합체를 사용하여 말초혈 백혈구로부터 핵산을 제조하는 방법은 알려져 있었지만, 상기한 방법에서는 백혈구의 분리나 핵산 추출의 단계까지 필터로 행한 후에는 기존의 핵산 정제법으로 핵산을 정제하지 않으면 안되고, 공정이 복잡해져 수고와 시간이 걸린다는 결점이 있었다.
최근, 필터를 사용하여 세포로부터 핵산을 직접 정제하는 방법이 국제 공개WO00/21973호에 개시되었다. 이 방법에서는 (1) 우선 세포를 포함하는 시료를 필터에 통과시켜 세포를 필터에 흡착시킨다. (2) 다음으로 필터에 흡착된 세포를 용해시키고, (3) 필터로 여과시킨다. (4) 필터에 흡착된 핵산을 세정한다. (5) 마지막으로 핵산을 필터로부터 용출시킨다. 흡착된 핵산은 40 ℃ 내지 125 ℃로 가온하면 용출되고, 용출 완충액의 pH는 5 내지 11의 범위이고, 염 농도는 높아도 좋고 낮아도 좋다. 정제된 핵산의 흡광도비 A260/A280은 1.8이고, PCR의 주형으로서 사용 가능하였다. 국제 공개 WO00/21973호에서는, 핵산을 정제할 목적으로 사용 가능한 필터의 예로서 와트만 GF/D 배리언트 필터(Whatman GF/D variant filter)를 들 수 있고, 사용 불가능한 예로서 와트만 GF/C 필터를 들 수 있다. 또한, 이 방법에 적합한 필터의 특징으로서, 정제 DNA를 필터에 통과시켜도 정제 DNA를 포착할 수 없는 것, 세포를 용해시키고 나서 필터에 통과시키면 DNA의 수율이 80 ％ 저하되어 실용적이지 않은 것이 진술되고 있다. 또한, 이 방법을 이용하여 혈액으로부터 핵산을 제조하는 경우, 실험자는 백혈구를 용해시키기 전에 적혈구를 용혈시킬 필요가 있다. 또한, 이들 세포를 필터에 흡착시킨 후 정제하는 방법에서는, 세포의 종류에 따라서 필터를 선택해야만 한다는 결점이 있다.
미국 특허 제5187083호 및 미국 특허 제5234824호에서는 혈액 세포를 계면활성제로 용해시키고 나서 포어(pore) 크기가 0.2 ㎛ 내지 0.8 ㎛인 필터에 통과시켜 DNA를 정제하는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 제5234824호에서 청구하고 있는 방법은 혈구로부터 순수한 DNA를 신속하게 제조하는 방법으로서 다음 공정을 포함한다. (1) 고전단력이 걸리지 않도록 2 분 내지 40 분에 걸쳐서 계면활성제와 점도 증강제를 포함하는 용액으로 서서히 세포를 용해시켜 세포의 DNA를 포함하는 용해액을 제조한다. 이 때, DNA는 필터에 포획되도록 충분히 큰 분자량을 가지고 있어야 한다. 다음으로, (2) 상기 추출액을 0.2 ㎛ 내지 0.8 ㎛의 공경을 갖는 필터로 여과하여 DNA를 필터에 포획한다. 이로부터 (3) 필터를 순수한 물 중에서 약 100 ℃로 5 분 내지 15 분간 가열하여 DNA를 추출한다. 용출액은 100 mM 이하의 마그네슘 또는 칼슘을 포함하고 있을 수 있다. 여기서, (1)의 점도 증강제로서는 폴리비닐알코올(분자량 7만 내지 10만), 수용성 중합체, 당, 폴리펩티드, 젤라틴 등을 사용한다. 또한, 이 방법으로 혈액에서 DNA를 정제하기 위해서는, 혈액을 10 배 이상 희석해야만 한다. 그렇게 하지 않으면, 점도가 너무 높아서 상기 필터로 여과할 수 없다.
또한, 일본 특허 공표 2001-520894호에서는 (1) 핵산류를 소정의 방향으로 표면에 투입하는 것, (2) 상기 표면 상에서의 핵산류의 고정화, (3) 상기 표면으로부터의 고정화된 핵산류 방출, 및 (4) 주로 투입 방향에서의 상기 표면으로부터 방출된 핵산류 제거의 단계에 의해 핵산류를 단리하는 방법이 개시되어 있다. 표면으로서는 막이 사용 가능하고, 막은 소수성일 수도 있고, 친수성일 수도 있다. 막의 재질로서는 나일론, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리카보네이트, 폴리아크릴레이트 및 아크릴산 공중합체, 폴리우레탄, 폴리아미드, 폴리염화비닐, 폴리플루오로카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리비닐리덴디플루오라이드, 폴리에틸렌-테트라플루오로에틸렌 공중합화물, 폴리에틸렌-클로로트리플루오로에틸렌 공중합화물 또는 폴리페닐렌술피드를 사용할 수 있다. 막의 세공은 0.001 내지 50 ㎛, 바람직하게는 0.01 내지 20 ㎛, 가장 바람직하게는 0.05 내지 10 ㎛의 직경을 갖는다. 핵산류의 고정화를 위하여, 무기산과 알칼리 및 알칼리 토류 금속류와의 염류, 알칼리 또는 알칼리 토류 금속과 일염기 또는 다염기 또는 다관능성 유기산류로부터의 염류, 지방족 또는 비환식 포화 또는 불포화탄화수소의 히드록실 유도체, 페놀 또는 폴리페놀 또는 카오트로픽제를 사용할 수 있다.
상기 방법에서는, 핵산의 회수량을 높이기 위해서 흡착시에 알코올이나 카오트로픽제를 첨가해야만 한다는 결점이 있다. 예를 들면, 소수성 나일론 막인 세공 1.2 ㎛의 히드로론(Hydrolon, Pall)에 RNA를 흡착시키는 경우, 결합 용액에 1 M NaCl을 사용하면 회수량이 0.15 ㎍인 데 반하여, 36 ％ 에탄올 함유 1 M NaCl을 사용하면 1.55 ㎍이 되어, 회수량은 실제 10 배로 증가한다. 또한, 결합 용액에 36 ％ 에탄올 함유 500 mM 이소티오시안산구아니듐 또는 36 ％ 에탄올 함유 1 M 염산 구아니듐을 이용하면, 회수량은 2.3 ㎍ 또는 6.7 ㎍이 된다. 또한, 카오트로픽제를 사용하면, 그 후 알코올을 포함하는 완충액으로 잘 세정하고, 또한 건조시킬 필요가 있다.
또한, 일본 특허 공표(평)11-501504호에서는, 샘플을 계면활성제 및 고체 지지체에 접촉시키고, 이에 의해 상기 샘플 중의 가용성 핵산이 상기 지지체에 결합하고, 계속해서 상기 지지체를 결합한 핵산과 함께 상기 샘플로부터 분리한 후, 샘플로부터 핵산을 단리하는 방법이 개시되어 있다. 이 발명에서 사용되는 특히 바람직한 고체 지지체로서, DYNABEADS로서 판매되는 자성 입자를 예로 들고 있고, 실시예에서도 그것을 사용하였다. 또한, 계면활성제는 임의의 계면활성제일 수도 있고, 음이온성 및 양이온성을 포함하는 이온성일 수도 있으며, 비이온성 또는 양쪽이온성일 수도 있다.
자성 입자를 사용하는 경우, 샘플 용량은 통상 수 ㎕ 내지 수십 ㎕가 된다. 이 때문에, 샘플 용량이 많은 경우에는 미리 원심분리 등의 조작으로 세포를 농축하거나, 또는 불필요한 세포와 물질을 제거하고 나서 목적하는 세포를 농축하는 등의 조작이 필요하다. 예를 들면, 0.5 ㎖의 혈액에 포함되는 백혈구 DNA를 정제하는 경우, 우선 용혈시키고, 다음으로 원심분리하여 백혈구를 펠릿으로 만드는 등의 조작이 필요하다. 또한, DNA는 겔상의 DNA/DYNABEADS 복합체로서 회수되고, 이 복합체는 피펫팅 등의 조작으로 간단히 파괴된다. 따라서, 서서히 세정하지 않으면 복합체가 조각조각 파괴되어, DNA 회수량이 현저히 감소하기 때문에 주의가 필요하다.
또한, 고체 표면에 흡착된 핵산을 활성 산소로 용출한다는 보고는 지금까지 없다. 동일하게, 고체 표면에 흡착된 핵산을 알칼리로 용출한다는 보고도 없다.
최근, 인간 게놈 해석이 급속히 진전되고, 그 성과인 게놈 정보를 의료의 질적 개선에 결부시키려고 하는 시도가 활발해지고 있다. 일염기 다형(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 데이타가 정비되면, 약효의 개인차를 식별하여 환자마다에게 적합한 약물과 투여량을 결정하는, 소위 오더 메이드(order made) 의료가 가능해지는 것으로 기대되고 있다. 이러한 SNP를 이용한 오더 메이드 의료를실현하기 위해서는 신속, 정확, 또한 염가인 SNP 타이핑 기술의 개발이 불가결하다. 여기서 말하는 SNP 타이핑 기술이란, 게놈의 추출ㆍ정제, 핵산 증폭, 염기 서열의 분석 등 검체의 처리로부터 검사 결과의 산출(output)에 이르기까지의 모든 기술을 의미한다.
중합효소 연쇄 반응(Polymelase Chain Reaction; PCR) 등의 핵산 증폭 반응으로 특정한 염기 서열을 증폭시키는 경우, 또는 SNP 타이핑 기술로 염기 서열을 분석하는 경우, 증폭이나 서열 분석의 대상이 되는 핵산은 통상 용액 상태로 반응계에 공급된다. 상기에 인용된 모든 방법에서 용액으로서 핵산을 회수하고 있다(국제 공개 WO00/21973호, 미국 특허 제5187083호, 미국 특허 제5234824호, 일본 특허 공표 2001-520894호). 핵산 제조법은 일반적이지만, 용출에는 시간이 걸리고, 또한 그것에 적합한 용출 조건을 설정할 필요가 있다. 상기 핵산 용출에 필요한 시간을 짧게 하거나, 또는 용출 공정 그 자체를 생략하여 다음 검사 단계로 진행시키면, 검사에 요하는 시간은 현저히 단축된다.
미국 특허 제5,756,126호에서는, 필터에 흡착된 핵산을 직접 분석하는 방법에 대하여 진술하고 있다. 이 방법에서는, (1) 약염기, 킬레이트제, 음이온성 계면활성제, 및 분석에 필요한 성분을 흡착시킨 건조 고체 매체에 핵산 물질을 함유하는 샘플을 첨가하고, (2) 상기 샘플을 보존하고, (3) 상기 샘플에 포함되어 있었던 단백질 또는 헤모글로빈을 제거하고, (4) 상기 샘플을 분석한다. 미국 특허 제5,972,386호에서는, (가) 단백질 변성제를 흡착시킨 고체 매트릭스, (나) 분석에 필요한 성분, (다) 이 성분을 매트릭스 상에 유지하기 위한 유지제의 3 요소로 이루어지는 핵산 보존을 위한 건조 고체 매체를 이용하여, 필터에 흡착된 핵산을 직접 분석하는 방법에 대하여 진술하고 있다. 즉, (1) 상기 건조 고체 매체에 핵산 물질을 함유하는 샘플을 첨가하고, (2) 상기 샘플을 보존하고, (3) 상기 샘플에 포함되어 있었던 단백질 또는 헤모글로빈을 제거하고, (4) 상기 샘플을 분석한다.
상기 2개의 특허에서는 건조 고체 매체의 예로서 요산, 트리스, EDTA, SDS를 흡착시킨 셀룰로스 페이퍼를 들고 있다. 이 9 mm2에 혈액 3 ㎕를 로딩하거나, 또는 100 mm2에 혈액 100 ㎕를 로딩하고 건조시켜 보존하며, 그 후 분석한다. 또한, 여기서 말하는 분석이란, PCR이나 제한 단편 길이 다형(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)의 전기영동에 의한 분석을 가리킨다. 이 방법에는, 건조 고체 매체의 제조에 시간이 걸리고, 건조 고체 매체에 첨가할 수 있는 샘플의 용량에 제한이 있으며, 그 때문에 매체 상에 고정할 수 있는 핵산 밀도가 작고, 헤모글로빈 등의 단백질을 제거하기 위해서 페놀이나 알코올 등의 유기 용매를 사용해야만 하며, 조작이 번잡하고 시간이 걸리는 등의 결점이 있다.
또한, EP389,063에서는 시료, 카오트로픽제, 핵산 결합성 고상체를 혼합하여 고상체에 핵산을 결합시킨 후, 고상체를 분리 및 세정하여 핵산을 분리하는 방법이 기술되고 있다. 핵산 결합성 고상체로서는 실리카비드 이외에 PVDF(Millipore), 니트로셀룰로스(Schleicher and Schuell), 하이본드(Hybond)-N(Amersham) 등의 필터를 예로서 들고 있다. 핵산이 흡착된 필터를 직접 주형으로서 PCR하는 방법에 대해서도 진술되고 있다. 핵산 용액을 구아니딘티오시아네이트 용액과 상기 필터와 혼합하여 핵산을 필터에 흡착시키고, 카오트로픽제, 70 ％ 에탄올로 세정하여 56 ℃에서 건조시킨다. 상기 필터를 PCR 반응계에 직접 첨가하여 표적 핵산을 증폭할 수 있음이 기재되어 있다. 이 방법에서는, 카오트로픽제나 유기 용매를 사용해야만 하고, 카오트로픽제나 에탄올은 PCR 반응을 강하게 저해하기 때문에 이들 물질을 완전히 제거해야 하며, 그 때문에 조작이 번잡해져 시간이 걸리는 등의 결점이 있다. 또한, 상기 필터는 통상 블롯팅에 사용되는 것으로, 혈액과 같은 생체 재료로부터 핵산을 정제하는 목적으로는 적합하지 않다.
또한, 국제 공개 WO98/51693호에서는, 샘플 중의 세포를 핵산으로 검출하는 일반적인 방법이 진술되고 있는데, (1) 샘플 중의 세포를 고체에 결합시키고, (2) 세포를 용해시키고, (3) 세포로부터 유리된 핵산을 (1)과 동일한 고체에 결합시켜, (4) 표적 세포의 핵산을 검출한다. 이 방법에서는, 우선 세포를 고체에 결합시켜야 하기 때문에, 세포의 종류에 따라 고체를 선택할 필요가 있고, 세포를 파괴하지 않고 결합시켜야 하기 때문에 여과의 유속에 제한이 있는 등의 결점이 있다.
본 발명은 부직포를 이용하여 세포로부터 고순도의 핵산을 간편하게 제조하는 방법 및 그의 제조 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산이 흡착된 부직포로부터 핵산을 증폭시키는 방법, 및 핵산이 흡착된 부직포로부터 핵산의 염기 서열을 검출하는 방법에 관한 것이며, 또한 이 방법에서 사용되는 핵산이 흡착된 부직포의 제조법 및 그의 제조 키트에 관한 것이다.
도 1은 혈액으로부터 정제한 핵산의 0.7 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 레인 1은 1kb DNA 래더(ladder) 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 마커 7GT(Nippon Gene); 레인 3은 A040C01/HM-3 코트로 정제한 핵산; 레인 4는 A040C01; 레인 5는 P020A(EL); 레인 6은 P020C; 레인 7은 P090D; 레인 8은 N05070; 레인 9는 E05070이다.
도 2는 PCR 증폭 산물의 2 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 혈액으로부터정제한 핵산을 주형으로 하여 G3PDH 유전자의 PCR을 행하였다. 레인 1은 100bp DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 음성 대조군; 레인 3은 양성 대조군; 레인 4는 A040C01/HM-3 코트; 레인 5는 A040C01; 레인 6은 PO20A(EL); 레인 7은 P020C; 레인 8은 P090D; 레인 9는 N05070; 레인 10은 E05070이다.
도 3은 대장균으로부터 정제한 핵산의 0.7 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 레인 1은 1kb DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 마커 7GT(Nippon Gene); 레인 3은 A040C01/HM-3 코트로 정제한 핵산이다.
도 4는 PCR 증폭 산물의 3 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 대장균으로부터 정제한 핵산을 주형으로 하여 리보솜 단백질 L25 유전자의 PCR을 행하였다. 레인 1은 저분자량 바이오마커(BioMarker Low; BioVentures); 레인 2는 음성 대조군; 레인 3은 양성 대조군; 레인 4는 A040C01/HM-3 코트로 정제한 핵산이다.
도 5는 혈액의 처리 시간으로, ■ 실온, + 프로테이나제 K; □ 실온, - 프로테이나제 K; ● 50 ℃, + 프로테이나제 K; ○ 50 ℃, - 프로테이나제 K를 나타낸다.
도 6은 부직포의 백혈구 흡착율과 DNA 회수량을 나타낸다.
도 7은 알칼리 조건하에서의 DNA 용출을 나타낸다. TE 완충액, 0.2 N NaOH 또는 0.05 N NaOH에 핵산을 흡착시킨 부직포를 침지하고, 95 ℃에서 5 분 내지 20 분 보온하여 용출되는 DNA량을 측정하였다. ◆ TE 완충액; ■ 0.2 N NaOH; ▲ 0.05 N NaOH를 나타낸다.
도 8은 알칼리 조건하에서 용출된 핵산의 0.7 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 레인 1은 1kb DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 마커 7GT(Nippon Gene); 레인 3은 TE 완충액, 95 ℃ 20 분; 레인 4는 0.2 N NaOH, 95 ℃ 5 분; 레인 5는 0.2 N NaOH, 95 ℃ 10 분; 레인 6은 0.2 N NaOH, 95 ℃ 20 분; 레인 7은 0.05 N NaOH, 95 ℃ 5 분; 레인 8은 0.05 N NaOH, 95 ℃ 10 분; 레인 9는 0.05 N NaOH, 95 ℃ 20 분이다.
도 9는 PCR 증폭 산물의 2 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 알칼리 조건하에서 용출된 핵산을 주형으로 하여 G3PDH 유전자의 PCR을 행하였다. 레인 1은 100bp DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 음성 대조군; 레인 3은 양성 대조군; 레인 4는 TE 완충액, 95 ℃ 20 분; 레인 5는 0.2 N NaOH, 95 ℃ 5 분; 레인 6은 0.2 N NaOH, 95 ℃ 10 분; 레인 7은 0.2 N NaOH, 95 ℃ 20 분; 레인 8은 0.05 N NaOH, 95 ℃ 5 분; 레인 9는 0.05 N NaOH, 95 ℃ 10 분; 레인 10은 0.05 N NaOH, 95 ℃ 20 분이다.
도 10은 알칼리 용출에 대한 온도의 효과를 나타내며, □ TE 완충액; ■ 0.2 N NaOH;0.05 N NaOH를 나타낸다.
도 11은 산성 조건하에서 용출된 핵산의 0.7 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 레인 1은 1kb DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 마커 7GT(Nippon Gene); 레인 3은 TE 완충액, 95 ℃ 20 분; 레인 4는 10 mM 시트레이트(pH 4.5)/1 mM EDTA, 95 ℃ 10 분이다.
도 12는 PCR 증폭 산물의 2 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 산성 조건하에서 용출된 핵산을 주형으로 하여 G3PDH 유전자의 PCR을 행하였다. 레인 1은100bp DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 음성 대조군; 레인 3은 양성 대조군; 레인 4는 TE 완충액, 95 ℃ 20 분; 레인 5는 10 mM 시트레이트(pH 4.5)/1 mM EDTA, 95 ℃ 10 분이다.
도 13은 알칼리 용출의 DNA 프로브에 대한 영향을 나타낸다. DIG 표지 DNA 프로브를 0.05 N NaOH에서 95 ℃로 5 분간 처리(스팟 1, 2)와 미처리(스팟 3, 4). 고정화한 람다 DNA량은 10 ng(스팟 1, 3)과 1 ng(스팟 2, 4).
도 14는 과산화수소로 용출된 핵산의 0.7 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 0.1 mM CuCl2를 포함하는 3 ％ 과산화수소로 용출시켰다. 레인 1은 1kb DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 과산화수소 처리 실온 1 분; 레인 3은 과산화수소 처리 실온 2 분; 레인 4는 과산화수소 처리 실온 3 분; 레인 5는 과산화수소 처리 실온 5 분이다.
도 15는 과산화수소로 용출된 핵산을 주형으로 한 PCR 증폭 산물의 2 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 0.1 mM CuCl2를 포함하는 3 ％ 과산화수소로 용출된 핵산을 주형으로 한 인간 G3PDH 부분 서열의 PCR에 의한 증폭을 나타낸다. 레인 1은 100bp DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 과산화수소 처리 실온 1 분; 레인 3은 과산화수소 처리 실온 2 분; 레인 4는 과산화수소 처리 실온 3 분; 레인 5는 과산화수소 처리 실온 5 분이다.
도 16은 환원당과 금속 이온으로 용출된 핵산의 0.7 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 100 mM D-리보스 5-포스페이트와 0.1 mM CuCl2를 포함하는 활성 산소액으로 용출시켰다. 레인 1은 1kb DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 50 ℃ 1 분; 레인 3은 50 ℃ 3 분; 레인 4는 50 ℃ 5 분; 레인 5는 50 ℃ 10 분; 레인 6은 50 ℃ 30 분; 레인 7은 TE 완충액에 의한 용출 95 ℃ 20 분(대조군)이다.
도 17은 환원당으로 용출된 핵산을 주형으로 한 PCR 증폭 산물의 2 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 100 mM D-리보스 5-포스페이트와 0.1 mM CuCl2를 포함하는 활성 산소액으로 용출시킨 핵산을 주형으로 한 인간 G3PDH 부분 서열의 PCR에 의한 증폭을 나타낸다. 레인 1은 100bp DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 50 ℃ 1 분; 레인 3은 50 ℃ 3 분; 레인 4는 50 ℃ 5 분; 레인 5는 100bp DNA 래더 마커; 레인 6은 50 ℃ 10 분; 레인 7은 50 ℃ 30 분이다.
도 18은 부직포로부터 제한 효소로 용출된 핵산의 0.7 ％ 아가로오스 전기영동 결과이며, 레인 1은 1kb DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 실온 5 분간; 레인 3은 실온 5 분간(컬럼 정제); 레인 4는 실온 10 분간; 레인 5는 실온 10 분간(컬럼 정제); 레인 6은 실온 30 분간; 레인 7은 실온 30 분간(컬럼 정제); 레인 8은 37 ℃ 5 분간; 레인 9는 37 ℃ 5 분간(컬럼 정제); 레인 10은 37 ℃ 10 분간; 레인 11은 37 ℃ 10 분간(컬럼 정제); 레인 12는 37 ℃ 30 분간; 레인 13은 37 ℃ 30 분간(컬럼 정제); 레인 14는 1kb DNA 래더 마커(GIBCO BRL)이다.
도 19는 활성 산소로의 처리가 혼성화에 미치는 영향을 나타낸다. 최종 농도 50 mM D-리보스 5-포스페이트와 25 μM CuCl2로 처리한 DIG 표지 DNA 프로브와 나일론 멤브레인에 고정화된 DNA와의 혼성화. 대조군으로서, 활성 산소 미처리와TE 완충액 중에서 95 ℃에서 20 분간 처리한 DIG 표지 DNA 프로브를 이용하였다.
도 20은 부직포에 흡착된 인간 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 나타낸다. 혈액으로부터 추출한 핵산을 부직포에 흡착시켜 G3PDH 유전자의 PCR을 행하였다. 레인 1은 100bp DNA 래더 마커(GIBCO BRL); 레인 2는 음성 대조군; 레인 3은 양성 대조군; 레인 4는 A040C01/HM-3 코트; 레인 5는 A040C01; 레인 6은 PO20A(EL); 레인 7은 P090D; 레인 8은 N05070; 레인 9는 E05070이다.
도 21은 부직포에 흡착된 대장균 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 나타낸다. 대장균으로부터 추출한 핵산을 A040C01/HM-3 코트에 흡착시켜 리보솜 단백질 L25 유전자의 PCR을 행하였다. 레인 1은 저분자량 바이오마커(BioVentures); 레인 2는 음성 대조군; 레인 3은 양성 대조군; 레인 4는 A040C01/HM-3 코트이다.
도 22는 부직포에 흡착된 인간 게놈 DNA의 검출을 나타낸다. 0.25 ㎖의 혈액으로부터 추출한 인간 게놈을 흡착시킨 2종류의 부직포 A040C01/HM-3 코트, A040C01에 대한 방사성 동위원소 표지 DNA 프로브의 혼성화. 1 ㎍ 인간 게놈 DNA(hgDNA)와 1 ㎍ 람다 DNA(λ DNA)를 고정화한 하이본드-N+ 나일론 멤브레인(Amersham Pharmaica biotech)를 대조군으로 하였다. 범례는 인간 G3PDH 프로브와 람다 DNA 프로브의 혼합 비율을 나타낸다. 모두 총 방사 활성이 448,000 cpm이 되도록 혼합하였다.
도 23는 부직포에 흡착된 핵산의 주사 전자 현미경 상을 나탄낸다. A: 부직포 P03050(대조군), B: 혈액 중의 핵산을 흡착시킨 부직포 P03050.
도 24는 세포 용해액에 사용되는 계면활성제의 검토를 나타낸다. X-114(트리톤 X-100), TOC(Nissan Dispanol TOC), X-100(트리톤 X-100), CA630(Igepal CA630), NS-208.5(Nissan Nonion NS-208.5), HPC(헥사데실피리디늄 클로라이드), HPB(헥사데실피리디늄 브로마이드), HTAC(헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드), HTAB(헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드), CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), CHAPSO(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트), SDS(나트륨도데실술페이트).
도 25는 정제 게놈 DNA 흡착의 NaCl 농도 의존성을 나타낸다. ◆ A040C01; ▲ A066A; ■ A040B를 나타낸다.
도 26은 정제 게놈 DNA 흡착의 MgCl2농도 의존성을 나타낸다. ◆ A040C01; ▲ A066A; ■ A040B; ● E01030을 나타낸다.
도 27은 정제 게놈 DNA 흡착의 HPO4 2-농도 의존성을 나타낸다. ◆ A040C01; ▲ A066A; ■ A040B; ● A040C01/HM-3을 나타낸다.
도 28은 정제 게놈 DNA 흡착의 (NH4)2SO4농도 의존성을 나타낸다. ◆ A040C01; ■ A066A; ▲ E01030을 나타낸다.
도 29는 정제 게놈 DNA 흡착에 대한 에탄올의 효과를 나타낸다. 10 mM 인산 완충액(pH 7.4)에 에탄올을 첨가하여 정제 게놈 DNA 흡착에 대한 영향을 조사한 것이다. ■ 10 mM 인산(pH 7.4);10 mM 인산(pH 7.4)/10 ％ 에탄올;10 mM 인산(pH 7.4)/20 ％ 에탄올;10 mM 인산(pH 7.4)/40 ％ 에탄올을 나타낸다.
도 30은 정제 게놈 DNA의 진탕 흡착 1을 나타낸다. ■ 10 mM Tris(pH 8)/1 mM EDTA/50 mM NaCl;10 mM Tris(pH 8)/2 mM MgCl2;50 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.4)를 나타낸다.
도 31은 정제 게놈 DNA의 진탕 흡착 2를 나타낸다. ■ 10 mM 인산(pH 7.4); □ 10 mM 인산(pH 7.4)/0.2 M 황산암모늄; □ 10 mM 인산(pH 7.4)/0.5 M 황산암모늄; □ 10 mM 인산(pH 7.4)/1.0 M 황산암모늄을 나타낸다.
도 32는 부직포의 스크리닝 (DNA 회수량)을 나타낸다. 검체는 신선한 혈액을 사용하였다. Gr1 내지 Gr5는 사용한 혈액의 공혈자가 다르다는 것을 나타낸다.
도 33은 부직포의 스크리닝 (DNA 순도 A260/A280)을 나타낸다. 도 31과 동일한 샘플의 흡광도비 A260/A280을 측정하였다.
도 34는 대장균 첨가 객담으로부터의 핵산 정제 1 (가열 처리)을 나타낸다. 실시예 27의 대장균 유래 핵산의 검출 결과. PCR 증폭 후, 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 레인 1은 DNA 분자량 마커; 레인 2는 105개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 3은 104개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 4는 103개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 5는 대장균 미첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물이다.
도 35는 대장균 첨가 객담으로부터의 핵산 정제 2 (가열 처리)를 나타낸다.실시예 27의 인간 유래 핵산의 검출 결과. PCR 증폭 후, 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 레인 1은 DNA 분자량 마커; 레인 2는 105개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 3은 104개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 4는 103개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 5는 대장균 미첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물이다.
도 36은 대장균 첨가 객담으로부터의 핵산 정제 1 (환원제 처리)을 나타낸다. 실시예 28의 대장균 유래 핵산의 검출 결과. PCR 증폭 후, 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 레인 1은 DNA 분자량 마커; 레인 2는 105개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 3은 104개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 4는 103개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 5는 대장균 미첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물이다.
도 37은 대장균 첨가 객담으로부터의 핵산 정제 2 (환원제 처리)를 나타낸다. 실시예 28의 인간 유래 핵산의 검출 결과. PCR 증폭 후, 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 레인 1은 DNA 분자량 마커; 레인 2는 105개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 3은 104개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 4는 103개의 대장균 첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물; 레인 5는 대장균 미첨가 객담 시료로부터 얻어진 핵산 추출액의 PCR 증폭 산물이다.
도 38은 부직포 상에서의 핵산 신장 반응을 나타낸다. 클라나우의 큰 단편(Klenow Large Fragment) 효소 반응 용액에 2종의 프라이머 bACT1과 bACT2를 각 10 ㎍, 100 ng, 1 ng, 0 ng 혼성화시켜 37 ℃에서 신장 반응을 일으키게 하였다.
도 39는 LAMP법에 의한 부직포 상에서의 핵산 증폭 및 검출을 나타낸다. 루프앰프(Loopamp)로 증폭시킨 소 게놈 DNA의 1 ％ 아가로오스 겔 전기영동. 레인 1은 분자량 마커; 레인 2는 주형으로서 인간 게놈 DNA를 흡착시킨 부직포; 레인 3은 주형으로서 소 게놈 DNA를 흡착시킨 부직포; 레인 4는 주형으로서 부직포에 흡착시킨 소 게놈 DNA를 TE 완충액 중에서 열 용출시킨 상청액; 레인 5는 주형 없음; 레인 6은 주형으로서 키트 부속의 대조군 소 게놈 DNA이다.
도 40는 부직포에 의해 정제된 게놈 DNA의 혼성화 1을 나타낸다. TE 완충액 용출법과 알칼리 용출법을 검정하였다. 부직포에 의해 정제된 DNA 용액 각 1 ㎕를 하이본드 N+ 막 상에 도트 블롯팅하여, 혼성화의 표적으로 사용하였다.
도 41은 부직포에 의해 정제된 게놈 DNA의 혼성화 2를 나타낸다. TE 완충액 용출법과 과산화수소 용출법을 검정하였다. 부직포에 의해 정제된 DNA 용액 각 1 ㎕를 하이본드 N+ 막 상에 도트 블롯팅하여, 혼성화의 표적으로 사용하였다.
도 42는 부직포에 의해 정제된 게놈 DNA의 혼성화 3을 나타낸다. 부직포에 의해 정제된 DNA를 표지하여 혼성화의 프로브로 사용하고, TE 완충액 용출법, 알칼리 용출법, 과산화수소 용출법을 검정하였다.
도 43은 계면활성제에 의한 핵산의 용출을 나타낸다. 0.5 ％의 계면활성제를 포함하는 수용액 또는 TE 완충액을 500 ㎕ 가하여 80 ℃로 20 분간 가열함으로써, 부직포에 흡착된 핵산을 용출시켰다. TE 완충액 중에서 95 ℃로 20 분간 가열했을 때의 핵산 용출량을 100 ％로 하였다.
도 44는 계면활성제로 용출된 핵산의 전기영동 결과이다. 도 43의 용출 샘플을 뉴클레오스핀 컬럼으로 농축 정제하고 0.7 ％ 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다.
도 45는 계면활성제로 용출된 핵산의 PCR 증폭 산물의 전기영동 결과이다. 도 43의 용출 샘플을 주형으로 하여, G3PDH 유전자의 PCR을 행하였다.
도 46은 PCR 산물의 전기영동 결과이며, 게놈 용출에 사용된 계면활성제를 PCR 반응계에 첨가하여 G3PDH 유전자의 PCR을 행하였다. DNA 마커로서 1kb 래더 마커(GIBCO BRL)를 사용하였다.
도 47은 바이오틴 하이본드(켐-링크(Chem-link)) 표지 핵산 프로브에 의한 혼성화를 나타낸다. 인간 게놈 DNA 또는 람다 DNA를 도트 블롯팅한 막에 바이오틴 하이본드 표지 핵산 프로브 1 또는 2를 혼성화시켰다.
<발명의 개요>
본 발명의 과제는 혈액과 같은 세포를 포함하는 시료로부터, 종래의 기술보다 간편하면서 고수율로 세포의 핵산을 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 과제는 종래의 핵산 증폭 기술이나 염기 서열 분석 기술에 사용 가능하고, 신속, 간편한 핵산 제조법을 공급하는 것에 있다.
본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) (가) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
(나) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정; 및
(다) 부직포로부터 핵산을 용출시키는 공정
을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하는 방법.
(2) (1)에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위, 바람직하게는 80 ℃ 내지 95 ℃의 온도 범위에서 가열하여 핵산을 용출시키는 방법.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 pH 12 이상의 알칼리 조건하에 처리하여 핵산을 용출시키는 방법.
(4) (1) 또는 (2)에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 단편화하여 용출시키는 방법.
(5) (4)에 있어서, 활성 산소를 이용하여 핵산을 단편화하는 방법.
(6) (5)에 있어서, 환원당에 2가의 금속 이온을 첨가하여 발생시킨 활성 산소를 이용하는 방법.
(7) (5)에 있어서, 활성 산소가 과산화수소인 방법.
(8) (5)에 있어서, 과산화수소에 2가의 금속 이온을 첨가하여 발생시킨 활성 산소를 이용하는 방법.
(9) (4)에 있어서, 효소를 이용하여 핵산을 단편화하는 방법.
(10) (1) 또는 (2)에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 계면활성제로 처리하여 용출시키는 방법.
(11) (10)에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제 또는 양쪽성 계면활성제인 방법.
(12) (가) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
(나) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정;
(다) 상기 부직포에 핵산을 증폭시키기 위한 용액을 첨가하여, 상기 부직포에 흡착된 핵산을 주형으로 하여 핵산을 증폭시키는 공정; 및
(라) 상기 반응액을 회수하는 공정
을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 증폭시키는 방법.
(13) (12)에 있어서, PCR법 또는 LAMP(루프-매개 등온 증폭; Loop-Mediated Isothermal Amplification)법으로 핵산을 증폭시키는 방법.
(14) (가) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
(나) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정;
(다) 상기 부직포에 염기 서열을 검출하기 위한 용액을 첨가하여 반응시키는 공정; 및
(라) 상기반응액을 측정하는 공정
을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 특정한염기 서열을 검출하는 방법.
(15) (가) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
(나) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정;
(다) 상기 부직포에 염기 서열을 검출하기 위한 용액을 첨가하여 반응시키는 공정; 및
(라) 상기 부직포 표면을 측정하는 공정
을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 특정한 염기 서열을 검출하는 방법.
(16) (14) 또는 (15)에 있어서, PCR법 또는 LAMP법으로 염기 서열을 검출하는 방법.
(17) (15)에 있어서, 프로브를 이용한 혼성화로 특정한 염기 서열을 검출하는 방법.
(18) (14) 또는 (15)에 있어서, 프라이머와 핵산 합성 효소에 의한 핵산 신장 반응으로 특정한 염기 서열을 검출하는 방법.
(19) (18)에 있어서, 핵산 신장 반응시에 표지 뉴클레오티드를 혼입시켜 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
(20) (18)에 있어서, 핵산 신장 반응으로 생성된 피로인산을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
(21) (가) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정; 및
(나) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정
을 포함하는, 세포의 핵산이 흡착된 부직포를 제조하는 방법.
(22) (가) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
(나) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정; 및
(다) 상기 부직포에 염기 서열을 검출하기 위한 용액을 첨가하여 반응시키는 공정
을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 핵산을 표지하는 방법.
(23) (22)에 있어서, 바이오틴, 형광 또는 합텐으로 핵산을 표지하는 방법.
(24) (22) 또는 (23)에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산 그 자체를 표지하는 방법.
(25) (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 부직포의 소재가 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 나일론인 방법.
(26) (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 부직포의 소재가 폴리에틸렌 테레프탈레이트인 방법.
(27) (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 부직포의 공경이 2 내지 150 ㎛인 방법.
(28) (1) 내지 (27) 중 어느 하나에 있어서, 부직포의 섬유경이 0.3 내지 20㎛인 방법.
(29) (1) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 점도 증가제, 카오트로픽제, 및 알코올을 포함하지 않는 세포 추출액을 사용하는 방법.
(30) (1) 내지 (29) 중 어느 하나에 있어서, 염을 포함하는 세포 추출액을 사용하는 방법.
(31) (30)에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 암모늄염, 인산염, 황산염 또는 염산염인 방법.
(32) (30)에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 염화나트륨이며, 그의 농도가 10 mM 내지 1000 mM인 방법.
(33) (30)에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 염화마그네슘이며, 그의 농도가 1 mM 내지 100 mM인 방법.
(34) (30)에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 인산나트륨이며, 그의 농도가 2 mM 내지 100 mM인 방법.
(35) (30)에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 황산암모늄이며, 그의 농도가 20 mM 내지 1000 mm인 방법.
(36) (1) 내지 (35) 중 어느 하나에 있어서, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 포함하는 세포 용해액을 사용하는 방법.
(37) (1) 내지 (36) 중 어느 하나에 있어서, 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정을 80 ℃ 내지 110 ℃의 온도 범위에서 행하는 방법.
(38) (1) 내지 (37) 중 어느 하나에 있어서, 세포를 파괴하여 세포 추출액을제조하는 공정을 환원제의 존재하에 행하는 방법.
(39) (38)에 있어서, 환원제가 티올기를 포함하는 화합물인 방법.
(40) (1) 내지 (39) 중 어느 하나에 있어서, 세포 추출액을 부직포에 접촉시키는 방법이 여과인 방법.
(41) (1) 내지 (40) 중 어느 하나에 있어서, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정 후에 부직포를 세정하는 공정이 계속되는 방법.
(41) (41)에 있어서, 카오트로픽제 및 알코올을 포함하지 않는 용액으로 부직포를 세정하는 방법.
(42) (41) 내지 (42)에 있어서, 세포 용해액으로 부직포를 세정하는 방법.
(44) (41) 내지 (43) 중 어느 하나에 있어서, 0.5 M 내지 2 M 농도 범위의 염 용액으로 부직포를 세정하는 방법.
(45) (1) 부직포를 조립한 장치; 및 (2) 세포 용해액과 핵산 용출액 중 어느 하나를 포함하는 용액을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하기 위한 키트.
(46) (1) 부직포를 조립한 장치; 및 (2) 세포 용해액과 세정액 중 어느 하나를 포함하는 용액을 포함하는, 세포로부터 핵산을 추출하여 상기 핵산이 흡착된 부직포를 제조하기 위한 키트.
(47) 고체 표면에 흡착된 핵산을 pH 12 이상의 알칼리 조건하에 처리하여 용출시키는 방법.
(48) 고체 표면에 흡착된 핵산을 활성 산소로 처리하여 용출시키는 방법.
(49) 고체 표면에 흡착된 핵산을 계면활성제로 처리하여 용출시키는 방법.
(50) 핵산이 흡착된 부직포.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서, 세포란 진핵 세포, 원핵 세포 또는 바이러스를 의미하고, 특히 인간 체세포, 인간 말초혈 백혈구, 감염증의 원인이 되는 진균, 세균, 바이러스를 포함한다.
본 발명에 있어서, 세포를 포함하는 시료란 혈액, 뇨, 골수액, 객담, 체액, 세포 부유액, 세포 배양액 등 세포를 포함하는 것이라면 어떤 것이라도 좋다. 또한, 이들 시료에 특정 처리를 실시한 처리액일 수도 있다. 처리 방법으로서는, 예를 들면, 객담과 같은 점성이 높은 시료를 객담 처리제에 의해 용해시키는 등의 방법을 생각할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 추출액이란 세포를 파괴하여 얻어지는 세포의 구성 성분을 포함하는 혼합물로, 세포를 포함하는 시료에 세포 용해액을 작용시켜 제조할 수 있다. 세포 용해액이란 세포를 파괴하여 핵산을 추출하기 위해 사용되는 용액으로, 계면활성제, 효소, EDTA 등을 포함하지만, 이들을 전부 포함할 필요는 없다. 효소로서는 단백질 분해 효소, 예를 들면 프로테이나제 K 등을 이용하지만, 세포종에 따라서는 리소자임(lysozyme), 리조스타핀(스타필로코커스속), β1,3-글루카나아제, 만나아제, 키티나아제(진균류) 등도 사용된다. RNA를 제거한 것이 바람직한 경우에는, RNaseA와 같은 RNA 분해 효소를 첨가할 수 있다. 또한, 효소는 포함하지 않을 수도 있다. 동물 세포는 저장액에 접촉시키는 것으로 세포를 파열시키는 것도 가능하다. EDTA는 DNA 분해 효소를 저해하기 위해서 사용하고, 통상 25 mM의 농도로 사용한다. 또한, 세포 추출액은 세포를 포함하는 시료에 초음파를 처리하거나, 균질기로 파쇄하는 등 물리적인 힘을 가하여 제조하는 것도 가능하다.
세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키기 위해서는, 염을 포함하는 세포 추출액을 사용하는 것이 바람직하다. 염은 세포 용해액에 첨가할 수도 있고, 세포 추출액을 부직포에 접촉시킬 때에 첨가할 수도 있다. 여러가지 종류의 염이 사용 가능하지만, 나트염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 암모늄염, 인산염, 황산염, 염산염 등이 바람직하다. 핵산 흡착을 촉진시키는 농도 범위는 염의 종류에 따라 다르다. 예를 들면, 염화나트륨이면 10 mM 내지 1000 mM, 바람직하게는 50 mM 내지 200 mM, 염화마그네슘은 1 mM 내지 100 mM, 바람직하게 2 mM 내지 20 mM, 인산나트륨은 2 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 100 mM, 황산암모늄은 20 mM 내지 1000 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 200 mM이 핵산을 흡착시키는 데 적합한 농도이다. 또한, 핵산 흡착은 pH 6 내지 11의 범위, 바람직하게는 pH 6 내지 8의 범위에서 행한다.
본 발명에 있어서, 부직포란 단섬유 또는 필라멘트를 기계적, 열적, 화학적인 수단을 이용하여 접착 또는 교락(交絡)시켜 만든 시트상 또는 웹 구조의 것이다(제2판 섬유 편람 섬유 학회편 마루젠). 부직포는 다양한 방법으로 생산되지만, 기본적인 공정은 웹(섬유의 방향이 어느 정도 갖추어진 섬유괴의 시트상의 것)의 형성 공정과, 웹의 접착 공정, 그의 마무리 공정이다. 부직포에는 천연 섬유로부터 화학 섬유까지 다양한 섬유가 사용되고 있지만, 일반적으로 사용되는 것은 솜, 레이온, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 나일론, 기타 아크릴, 비닐론, 유리 섬유, 펄프, 탄소 섬유 등도 사용된다. 웹을 형성하는 방식은 습식, 건식 및 직접식으로 크게 구별된다. 직접식 방법은 방사 직결식이라고도 하는 방법으로, 용융 고분자 용액으로부터 방사된 섬유를 모아 직접 웹으로 만드는 공정이다. 이에 포함되는 방법은 스펀레이스법, 스펀본드법, 멜트 블로우법, 니들 펀치법, 스티치 본드법 등이다. 본 발명에는 멜트 블로우법으로 만들어진 초극세 섬유 부직포가 가장 적합하다.
본 발명에 있어서, 세포 추출액을 부직포에 접촉시키다는 것은, 예를 들면 세포 추출액에 부직포를 부유시키거나, 세포 추출액에 부직포를 부유시켜 침투시키거나, 세포 추출액을 부직포 표면 상에 흘리는 등의 방법을 포함한다.
본 발명에 있어서, 세정은 부직포에 부착된 단백질, 지질 등의 물질을 씻어 버리기 위해서 행한다. 세정액에는 SDS나 트리톤 X-100 등의 계면활성제, 0.5 M 이상의 NaCl 등의 염 용액 등을 사용하지만, 반드시 이들에 한정되는 것은 아니고, 부착된 물질의 종류에 따라서 선택할 수 있다. 또한, 경우에 따라서는 세정 공정을 생략하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 알칼리 처리란 필터를 pH 12 이상의 수용액에 침지시키는 것을 의미한다. 알칼리 용액으로서는 통상 NaOH, KOH 등을 사용하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼리 처리 후에는 중화하여 pH를 중성으로 복귀시키는 것이 바람직하고, 중화에는 인산염 등 중성 부근에 완충능이 있는 화합물 또는 산 등이 사용된다.
본 발명에서 사용되는 활성 산소는 협의의 활성 산소인3O2의 1 전자 환원종인 수퍼 옥시드(O2 ㆍ-), 2 전자 환원종인 과산화수소(H2O2), 전자 여기 상태의 산소 분자종인 1중항 산소(1O2) 및 히드록시 라디칼(HOㆍ), 및 광의의 활성 산소인, 금속-산소 착체(금속 옥소산도 포함함)를 주로, 이들 활성종과 생체 분자(예를 들면, 불포화 지방산 L)과의 반응에서 유래하는 퍼옥시 라디칼(LOOㆍ), 알콕시 라디칼(LOㆍ), 히드록시퍼옥시드(LOOH), 일산화질소(NO) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 활성 산소에 대해서는, 「활성 산소」[단백질 핵산 효소, 임시 증간, Vol.33, NO.16]나 「항산화 물질의 전부」(센단 이까꾸사)에 상세하게 기재되어 있다.
활성 산소를 발생시키는 방법으로서는 여러가지 방법이 보고되어 있고, 예를 들면, 다음과 같은 방법으로 쉽게 활성 산소를 발생시킬 수 있다. 과산화수소수는 그 자체가 활성 산소이지만, 과산화수소수에 Ca2+나 Fe2+등의 2가의 금속 이온을 첨가하면 과산화수소는 산화제로서 작용하여 히드록시 라디칼(HOㆍ)을 발생시킨다. D-리보스 등의 환원당에 금속 이온 Cu2+을 첨가하면 활성 산소가 발생하여, 세포 장해성이나 핵산의 손상을 야기시키는 경우도 보고되어 있다. 항종양성 항생 물질인 블레오마이신을 철 (II)와 산소, 또는 철(III)과 과산화수소와 공존시키면 활성 산소 착체종이 발생하여, DNA 절단을 야기하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서 특히 바람직하게 사용되는 활성 산소로서는, D-리보스-5-포스페이트나 D-프럭토스-6-포스페이트 등의 환원당에 Cu2+나 Fe2+등의 2가 금속 이온을 첨가하여 얻어지는 히드록시 라디칼, 과산화수소에 Cu2+나 Fe2+등의 2가 금속 이온을 첨가하여 얻어지는 히드록시 라디칼 등을 들 수 있다. 2가의 금속 이온을 첨가하여 활성 산소를 발생시키는 경우, 활성 산소 반응액 중에 EDTA 등의 금속 킬레이트제를 첨가함으로써 활성 산소의 발생을 정지시켜, 핵산이 과도하게 손상받는 것을 막을 수 있기 때문에, 특별히 바람직하게 사용될 수 있다. 활성 산소를 이용한 핵산의 처리 시간은 1 초 내지 10 분, 바람직하게는 1 초 내지 5 분, 보다 바람직하게는 10 초 내지 1 분이다.
부직포에 흡착된 핵산을 용출시키는 경우의 바람직한 조건은, 흡착된 핵산량이나 종류에도 의존하지만, 예를 들면 D-리보스-5-포스페이트에 2가의 금속 이온으서 Fe2+를 첨가하여 히드록시 라디칼을 발생시키는 경우, D-리보스-5-포스페이트의 농도는 1 mM 내지 1 M, 바람직하게는 10 mM 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 50 mM 내지 200 mM이다. 또한, Fe2+의 농도는 0.001 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 0.0 1 mM 내지 10 mM, 더욱 바람직하게는 0.05 mM 내지 5 mM이다. 반응 온도는 30 ℃ 내지 65 ℃, 바람직하게는 40 ℃ 내지 60 ℃, 더욱 바람직하게는 45 ℃ 내지 55 ℃ 이다.
본 발명에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 단편화하는 방법으로서, 활성 산소를 이용하는 방법 이외에, 핵산의 특정한 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소, 임의 서열을 절단하는 DNase 등의 핵산 분해 효소를 사용하여 단편화할 수도 있다. 또한, 부직포에 자외선을 조사하여 핵산을 단편화하는 등의 방법도 고려된다. 본 발명에 있어서 바람직하게 사용되는 제한 효소로서는 HaeIII, Sau3AI, EcoRI, BamHI 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 인식되는 핵산의 길이는 제한 효소에 따라 다르지만, 예를 들면 6개의 염기를 인식하는 제한 효소보다 4개의 염기를 인식하는 효소의 쪽이 단편화에 따라서 생기는 핵산 단편이 보다 짧게 되므로 부직포로부터의 용출 효율이 높아져서 보다 바람직하다. 효소를 이용하는 경우, 효소의 양(농도, 비율 등)은 핵산의 양 및 효소의 종류에 의존한다.
본 발명에 있어서, 부직포에 핵산을 증폭시키기 위한 용액을 가하거나, 또는 염기 서열을 검출하기 위한 용액을 가한다는 것은, 핵산이 흡착된 부직포의 일부 또는 전체를, 핵산의 용출 조작을 행하지 않고, 그대로 핵산 증폭 또는 염기 서열 검출을 위한 반응계에 사용하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 핵산 증폭법이란 PCR로 대표되는 특정한 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법이고, PCR 이외에 리가아제 연쇄 반응(Ligase Chain Reaction; LCR), 전사-매개 증폭(Transcription-Mediated Amplification; TMA), 분지 DNA 분석법(Branched DNA(bDNA) Assay), 핵선 서열 기재 증폭(Nucleic Acid Sequence Based Amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(Strand Displacement Amplification; SDA), 사이클링 프로브 기술(Cycling Probe Technology; CPT), Q-베타 복제효소 증폭 기술(Q-Beta Replicase Amplification Technology), 롤링 써클증폭 기술(Rolling Circle Amplification Technology; RCAT), 루프-매개 등온 증폭(LAMP), 핵산의 등온 및 키메라 프라이머-개시 증폭(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids; ICAN) 등의 방법을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. Q-베타 복제효소, RCAT, NASBA, SDA, TMA, LAMP, ICAN 등은 등온(일정 온도)에서 증폭 반응을 행하고, 그 이외의 PCR, LCR 등은 열 사이클링(온도 사이클링)으로 증폭 반응을 행한다.
본 발명에 있어서, 핵산 염기 서열의 검출법이란, 전기영동이나 질량 분석계를 이용하지 않고, 필터 상에서 염기 서열 분석이 가능한 기술을 가리킨다. 이들에는, 예를 들면 검출에 형광, 발광, 발색, 방사성 동위원소를 이용하는 일반적인 프로브 혼성화법, 핵산의 삽입물(intercalator)을 이용하는 일반적인 방법이나 SNP 타이핑 기술이 포함된다. SNP 타이핑 기술의 구체예로서는 인베이더(상표명, Invader) 분석법, 택맨(상표명, TaqMan)법, 롤링 써클 증폭(RCA)법, 피로시퀀싱 (Pyrosequencing)법, 프라이머 신장법, LAMP법, UCAN법 등이 있다.
본 발명에서 프라이머와 핵산 합성 효소에 의한 핵산 신장 반응이란, DNA 의존성 DNA 중합효소, DNA 의존성 RNA 중합효소, RNA 의존성 RNA 중합효소, 역전사 효소, 쇄치환형 DNA 중합효소 등을 이용하여 프라이머 특이적으로 일으키는 5'→3' DNA 또는 RNA 합성 반응이다. DNA 중합효소로서는 클레나우 단편(Klenow Fragment), T4 DNA 중합효소, Taq DNA 중합효소 등이 이용되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 프라이머와 DNA 중합효소에 의한 핵산 신장 반응으로 특정한 염기 서열을 검출하는 방법에는, 예를 들면 상술한 SNP 타이핑 기술의 피로시퀀싱법, 프라이머 신장법, LAMP법 등이 있다.
본 발명에 있어서, 카오트로픽제란 수용액 중의 물 분자 구조를 파괴하는 물질의 총칭이다.
본 발명에 있어서, 계면활성제란 1 분자 중에 친수성 부분과 지방 친화 특성 부분을 공유하고 있는 화합물을 의미하고, 이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 크게 구별된다. 이온성 계면활성제는 또한 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제와 양쪽이온성 계면활성제로 크게 구별할 수 있다. 본 발명에 있어서 세포 용해액에 사용할 수 있는 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제 중 어느 하나이고, 양이온성 계면활성제는 사용할 수 없다. 음이온성 계면활성제로서는 예를 들면 도데실황산나트륨, 도데실술폰산나트륨, 도데실-N-사르코신산나트륨, 콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨, 타우로데옥시콜산나트륨 등을 들 수 있다. 양쪽성 계면활성제로서는 예를 들면 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산, 팔미토일 리조레시틴, 도데실-N-베타인, 도데실-β-알라닌 등을 들 수 있다. 비이온성 계면활성제로서는 예를 들면 옥틸글루코시드, 헵틸티오글루코시드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 폴리옥시에틸렌 도데실에테르, 폴리옥시에틸렌 헵타메틸헥실에테르, 폴리옥시에틸렌 이소옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산에스테르, 수크로스 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 부직포에 흡착된 핵산 그 자체를 표지한다는 것은, 핵산을 신규로 합성하지 않고 흡착된 핵산에 직접 표지를 도입하는 것을 의미한다. 이러한 표지법으로서는, 예를 들면 바이오틴이나 디그옥시제닌(Digoxigenin), 또는 로다민(Rhodamine), 플루오레세인(Fluorescein), Cy3, Cy5 등의 형광 물질을 비효소적, 화학적으로 도입하는 방법이 있고, 그를 위한 시약도 시판되고 있다. 한편, 본 발명에 있어서 부직포에 흡착된 핵산을 표지한다는 것은, 상술한 직접 표지 뿐 아니라, 핵산 합성 효소와 표지 뉴클레오티드를 이용하여 핵산의 상보쇄를 합성하여 표지하는 것도 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서 합텐이란, 단독으로는 면역원성이 낮지만 담체와 화학적으로 결합하면 특이적인 항체 생산을 유도할 수 있는 화합물을 말한다. 예를 들면 상술한 디그옥시제닌 표지에서는, 디그옥시제닌이 합텐으로서 이용되고 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명자들은 카오트로픽제나 에탄올 등의 유기 용매를 사용하지 않고, 간편하고 신속하게 핵산을 정제하는 방법을 검토하였다. 그 결과, 부직포가 핵산 정제에 매우 적합하다는 것을 발견하였다. 다른 다공질 필터의 경우, 예를 들면 비교예 2에 기재된 바와 같이 8 ㎛의 공경을 갖는 폴리카보네이트제 트랙 엣치드(track-etched) 멤브레인에는 핵산 흡착능이 없고, 다공질 필터라고 해도 어떤 것이나 핵산 정제에 사용 가능하다고 할 수는 없다. 상기 트랙 엣치드 멤브레인에는 2층의 박막이 코팅되어 있고, 최상층은 SiCN이다. 한편, 부직포는 공경이 약 10 내지 약 130 ㎛, 섬유경이 약 1.2 내지 약 20 ㎛인 것을 검토하였지만, 소재에 상관없이 혈액으로부터의 핵산 정제에 사용하였다. 즉, 부직포는 평균 공경이 2 내지 150 ㎛이면 사용 가능하고, 특히 7 내지 13 ㎛의 것이 바람직하다. 또한, 평균 섬유경은 0.3 내지 20 ㎛이면 사용 가능하고, 특히 0.7 내지 1.7 ㎛인 것이 바람직하다. 또한, 부직포의 소재에 관해서는, 혈액으로부터의 핵산의 회수량, 정제도에 우열은 있지만, 폴리에스테르, 셀룰로스, 아크릴, 폴리프로필렌, 나일론 중 어느 하나이어도 또한 그의 조합이어도 사용 가능하였다. 또한, 적당한 염을 포함하는 정제 게놈 DNA 용액에 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 평막과 부직포를 침지하여 진탕하면, 놀랍게도 게놈 DNA는 부직포에는 결합하였지만 평막에는 결합하지 않았다. 여기서 PET 평막이란 세공이 전혀 없는 PET 시트를 의미한다. DNA 용액을 부직포에 접촉시키는 것만으로 DNA가 부직포에 결합하였기 때문에, DNA는 필터 여과된다고 하기보다 물리적 흡착으로 부직포에 결합되어 있다고 생각되었다. 이상의 결과는, 부직포라는 형태가 핵산 정제에 매우 적합하다는 것을 나타내고 있다.
더욱 검토를 거듭한 결과, 부직포 중에서도 PET 부직포, 보다 바람직하게는 공경이 약 10 ㎛, 섬유경이 약 1.2 ㎛인 PET 부직포가 가장 우수하다는 것을 발견하였다. 정제 게놈 DNA를 PET 부직포에 접촉시키는 것만으로 그의 80 ％ 내지 90 ％가 부직포에 흡착하였다. 핵산이 부직포에 결합하기 위해서는 NaCl, MgCl2, HPO4 2-등의 염이 필요하지만, 일본 특허 공표 2001-520894호와 같이 핵산 회수량을 늘이기 위해서 카오트로픽제나 에탄올을 첨가할 필요는 전혀 없고, 오히려 에탄올을 첨가하면 흡착량이 현저히 감소하였다. 부직포에 결합된 핵산을 용출하기 위해서는, 가열 또는 핵산의 단편화가 필요하였다. 핵산 용출에는 TE 완충액 중에서 95 ℃로 20 분 가열해야 하지만, 알칼리 용액 중에서는 시간을 5 분으로 단축할 수 있고, 또한 활성 산소를 이용하면 실온에서 10 초에 용출할 수 있음을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 핵산 흡착된 부직포에 놀랄만한 특징이 있다는 것을 발견하였다. 즉, 흡착된 핵산을 용출시키지 않고 PCR 등으로 핵산을 증폭시키거나, 부직포 상에서 프로브를 혼성화시킬 수 있을 뿐 아니라, 부직포 상에서 프라이머 의존성의 핵산 신장 반응이 발생하는 것을 발견하였다. 이 방법을 이용하면 동일한 부직포 상에서 핵산의 정제부터 검출까지 행할 수 있으므로, 조작 시간이나 공정이 현저히 단순화되었다. 부직포 상에서의 검출은, 부직포의 표면이 평활하고 얇은 시트이기 때문에 가능하였다. 이상의 검토에 의해 본 발명을 완성하는데 이르렀다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 특징 중 하나는, 카오트로픽제나 에탄올 등의 유기 용매를 사용하지 않고, 간편하고 신속하게 세포의 핵산을 정제할 수 있다는 점에 있다. 카오트로픽제나 에탄올 등의 유기 용매는 PCR 등의 효소 반응을 강하게 저해하기 때문에, 이들을 사용하는 방법에서는 사용 후에 잘 세정해야 하며, 에탄올의 경우 잘 건조시키지 않으면 안된다. 본 발명에서는 이러한 시약을 사용하지 않고, 따라서 철저한 세정이나 건조가 불필요하기 때문에, 간편하고 신속하게 세포의 핵산을 정제할 수 있게 되었다.
또한, 본 발명의 특징 중 하나는, 세포로부터 핵산을 유리시켜 용액 상태로 부직포에 여과하기 때문에 어떤 세포에도 응용할 수 있는 범용성이 높은 방법이 된다는 점에 있다. 세포는 인간 백혈구와 같은 진핵 세포이어도 대장균과 같은 원핵 세포이어도 바이러스이어도 좋다. 세포를 직접 필터에 포착하고 나서 용해시키는 방법에서는, 세포의 종류에 따라서 필터의 특성이나 흡착 조건을 적합화할 필요가 있다. 또한, 세포를 파괴하지 않고 필터에 결합시켜야만 하기 때문에 여과의 유속에 제한이 있고, 통상적으로는 필터를 서서히 통과시켜야 한다. 본 발명에서는 세포 추출액을 필터에 통과시키기 때문에, 유속을 빠르게 하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 특징 중 하나는, 세포 추출액을 그대로 부직포에 통과시키는 것만으로 핵산이 부직포에 흡착된다는 점에 있다. 또한, 필터의 핵산 흡착 능력의 범위내이면, 샘플 중에 포함되는 세포수나 샘플 용량에 제한은 없다. 한편, FTA(상표명)과 같은 세포 용액을 기재에 투과시키고 나서 세포를 용해시키는 방법에서는, 기재가 흡수할 수 있는 샘플 용량이 처리량의 상한이 되기 때문에, 대용량의 샘플로부터 핵산을 추출하는 목적에는 그다지 적합하지 않다. 예를 들면, 세포 농도가 낮은 대용량의 샘플로부터, 샘플 중에 포함되는 총 세포의 핵산을 회수하고자 하는 경우에는, 원심분리 등 다른 수단으로 미리 세포를 농축할 필요가 있다. 본 발명의 필터에는, 이러한 샘플 용량에 대한 제한은 없다.
세포 추출액의 제조법은 중요하다. 세포 추출액은 불용물이 없는 용액인 것이 바람직하다. 또한, 세포 추출액의 점도가 너무 높으면 부직포를 통과시키는 것이 곤란해지기 때문에 바람직하지 않다. 프로테이나제 K(최종 농도 0.1 mg/㎖)를 첨가한 것이 바람직하지만, 필수는 아니다. 예를 들면, 실온에서 혈액을 용해시키는 경우, 프로테이나제 K를 첨가한 쪽이 핵산의 회수량은 양호한 경향이 있지만,프로테이나제 K가 없더라도 핵산은 정제 가능하다. 한편, 50 ℃에서 혈액을 용해시키는 경우, 프로테이나제 K의 첨가는 필수이고, 프로테이나제 K를 첨가하지 않고 제조한 혈액 추출액을 부직포로 여과하면 블로킹을 일으켜 핵산의 정제가 불가능해진다. 처리 시간은 실온에서는 5 분으로 충분하고, 5 분 이내라도 가능하다. 또한, 처리 시간을 60 분까지 연장하더라도 문제는 없다. 또한, 본 발명에 있어서 세포 추출액의 제조에서는, 미국 특허 제5234824호와 같이 혈액을 10 배 이상으로 희석할 필요는 없고, 폴리비닐 알코올과 같은 점도 증강제를 첨가할 필요도 없다. 또한, 본 발명자들은, 객담 등의 점성이 높은 시료는 80 ℃ 내지 110 ℃의 온도 범위에서 가열 처리하거나 또는 환원제의 존재하에 처리하면, 점성이 저하되어 부직포를 통과시키기가 쉬워지는 것을 발견하였다. 예를 들면, 객담은 가열 처리 또는 환원제 처리하지 않으면 블로킹을 일으켜 부직포를 통과시킬 수 없다. 가열 처리 또는 환원제의 처리에 의해, 객담 등에 포함되어 있는 점성을 나타내는 원인이 되는 단백질 등이 변성되어 점성이 저하됨으로써, 부직포에 블로킹을 일으키지 않고 통과시킬 수 있게 된다. 가열 온도는 80 ℃ 이상이 바람직하다. 또한, 너무 높은 온도는, 핵산이 분해될 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않고, 110 ℃ 이하가 바람직하다. 가열 시간은 시료 내부까지 가온되면 좋고, 상기 온도 범위에서 1 분간 이상이면 좋으며, 바람직하게는 1 분 내지 15 분이다. 환원제로서는, 단백질을 변성시키지만 핵산에 영향을 주지 않는 물질이면 좋다. 이러한 환원제로서는 티올기를 포함하는 물질이 바람직하다. 예를 들면, 디티오트레이톨, 시스테인, 아세틸시스테인, β머캅토에탄올 등을 들 수 있다. 최적인 환원제 처리의 농도나 처리 시간은, 사용되는 환원제의 환원 능력에 따라서 변화한다. 예를 들어 디티오트레이톨의 경우에는, 농도가 1 mM 내지 10 mM 정도이고, 처리 시간이 1 분 내지 10 분 정도인 것이 바람직하다. 또한, 가열 처리와 환원제 처리는 동시에 행할 수도 있다.
또한, 세포의 핵산이 분해되지 않는 한 어떠한 방법으로 보존된 시료를 사용하더라도 본 발명으로 핵산을 제조할 수 있다. 예를 들면, 세포를 포함하는 시료는 채취 또는 제조 직후의 것이어도, 또는 동결 보존된 시료이어도 좋다. 혈액의 경우, 신선한 혈액이어도, 또는 동결 보존된 혈액이어도 핵산을 정제할 수 있다.
본 발명의 특징 중 하나는 다공질 필터로서 부직포를 사용하는 점에 있다.
부직포의 이점은, 미국 특허 제5234824호에 개시되어 있는 필터의 공경이 0.2 내지 0.8 ㎛인 데 비하여, 본 발명에서 사용되는 부직포의 평균 공경은 크기 때문에 큰 유속이 얻어져 블로킹되지 않는 것을 예로 들 수 있다. 이것은 혈액의 용해액과 같은 점도가 높은 시료로부터 핵산을 정제하는 경우에 특히 유리하다. 예를 들면, A040C01의 평균 공경은 10 ㎛이다. 여기서, 부직포의 평균 공경이란 수은 포로시미터(porosimeter)에 의해 측정한 측정치(평균값)을 말한다. 평균 공경은 필터 요소를 구성하는 섬유의 얽힘 상태나 공극의 크기에 관련하는 지표이다. 부직포에서는, 섬유의 방향이 액의 흐름에 수직인 평면 방향에 나란하고, 또한 충전 상태가 균일하고 편류가 적기 때문에, 신속한 처리 속도를 유지하면서 우수한 핵산 흡착 능력을 발휘하는 것으로 생각되었다. 블로킹이 문제가 되는 경우에는, 섬유경이나 공경이 다른 부직포를 조합하여 사용하는 것도 생각할 수 있다. 또한,자기 비드와 비교한 경우의 부직포의 이점은, 부직포에서는 필터 여과하는 것만으로 간단하게 DNA 용액과 접촉시키는 것이 가능하다는 점이다. 자기 비드법에서는, 효율적으로 DNA를 비드에 접촉시키기 위해서 가능한 샘플 용량을 적게 제어할 필요가 있고, 통상은 수 ㎕ 내지 수십 ㎕로 한정된다. 따라서, 목적하는 세포를 원심분리 등의 조작으로 농축하는 등의 조치를 행한다. 부직포는 예를 들면 A040C01/HM-3 코트와 같은 친수성 코트 제품도, 또는 A040C01과 같은 미코트 제품도 핵산 정제에 사용 가능하다. A040C01과 A040C01/HM-3 코트의 정제 게놈 DNA 흡착 성능을 비교하면, A040C01 쪽이 높았다. 여기서 A040C01이란, PET를 소재로 한 아사히 가세이(주) 제조 부직포이다. A040C01/HM-3 코트란, HM-3(2-히드록시에틸메타크릴레이트(이하 HEMA라 약칭함)와 N,N-디메틸에틸메타크릴레이트(이하 DM이라 약칭함)로 이루어진 공중합체, HEMA:DM=97:3)를 에탄올에 용해시킨 용액에 A040C01을 코팅한 것으로, 아사히 메디칼(주)에서 시판하는 세파셀(등록상표, Sepacell)의 메인 필터로서 사용되고 있다. 또한, 부직포는 80 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 표면 코팅제 등의 성분이 용출되지 않는 것, 가능한 블로킹되기 어려운 것이 바람직하다. 또한, 부직포의 백혈구 흡착 능력과 핵산 흡착 능력에는 상관 관계가 없다. 핵산 흡착 능력을 나타내는 부직포 중에는, 우수한 백혈구 흡착 능력을 나타내는 A040C01/HM-3 코트나 A040C01이 있고, 또한 거의 백혈구 흡착 능력을 나타내지 않는 E05070과 같은 필터도 있다. 이것은 본 발명에서 사용 가능한 필터의 특성과, 예를 들면 국제 공개 WO00/21973호에서 요구되는 필터의 특성이 다르다는 것을 의미한다.
또한 본 발명은, 국제 공개 WO00/21973호와 같이 세포를 직접 필터에 포착하고 나서 용해시키는 방법과 비교하면, 공정수가 적고 보다 간편한 방법으로 이루어져 있다. 예를 들면 혈액으로부터 핵산을 정제하는 경우, 필터에 핵산을 흡착시키기까지 국제 공개 WO00/21973호에서는 1) 혈액을 흘리고, 2) 용혈액을 흘려 적혈구를 파괴하고, 3) 세포 용해액을 흘려 백혈구를 파괴한다는 세가지 공정이 필요하게 된다. 본 발명에서는 혈액과 세포 용해액을 혼합하여 필터에 여과시킬 뿐이다.
부직포에 흡착된 핵산은 일본 특허 공표 2001-520894호에 있는 바와 같이 단순히 필터를 물에 담그고 10 내지 30 ℃에서 1 내지 2 분 방치하는 것만으로는 용출되지 않는다. 부직포에 흡착된 핵산은 물 또는 저염 완충액 중에서 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위, 바람직하게는 80 ℃ 내지 95 ℃의 온도 범위로 가열하면 용출된다. 즉, 본 발명에서는 TE 완충액 중에서 80 ℃로 60 분 가열하거나 또는 95 ℃로 20 분 가열하면 핵산이 용출되는 것을 발견하였다. 또한, 알칼리 처리하여 용출시키는 방법을 발견하였지만, 이 방법을 이용하면 TE 완충액 중에서 용출하는 것보다 단시간으로 흡착 DNA를 용출할 수 있어 매우 유용하였다. 가열하면 용출 속도는 더욱 빨라지고, 95 ℃에서는 5 분에 용출되었다. 알칼리 처리하면 이중가닥 DNA가 단일가닥으로 변성하는 것이 잘 알려져 있기 때문에, 이러한 변성에 의해 필터에 흡착된 핵산이 용출되기 쉽게 되었다고 생각된다. 또한, 1.2 N NaOH에서 90 ℃로 10 분 처리하면 핵산 중의 아데닌과 시토신, 특히 아데닌이 보다 선택적으로 수식되는 것이 보고되어 있다[Methods in Enzymology, Vol. 65, p537(1980)]. 본 발명의 알칼리 처리는 0.2 N 이하의 NaOH를 사용하고 있기 때문에, 상기한 것과 같은 염기 수식이 발생할 가능성은 낮다고 생각된다. 실제, 알칼리 용출된 핵산은 PCR 반응의 주형으로서 사용 가능하고, 혼성화에 사용하는 프로브를 알칼리 용출과 동일 조건에서 처리하더라도 혼성화는 가능하였다.
알칼리 용출의 특징은 용출 핵산의 분자량이 크다는 것이다. TE 완충액 중에서 95 ℃로 20 분간 가열하여 용출하면, 핵산은 수 kb 내지 수십 kb의 단편으로서 회수되지만, 알칼리 중에서 95 ℃로 5 분간 가열하여 용출하는 경우에는 수백 kb 이상의 단편도 있었다. 크기가 큰 게놈 DNA를 제조하고자 하는 경우에는, 알칼리 용출이 매우 유용하다. 또한, 본 알칼리 용출법은, 본 발명에서 제조된 핵산 흡착 필터, 예를 들면 국제 공개 WO00/21973호, 미국 특허 제5187083호, 미국 특허 제5234824호 등에서 개시된 방법에 의해 제조된 핵산 흡착 필터로부터 핵산을 용출시키는 경우에도 유효하다.
또한, 본 발명자들은 산성 조건하에서의 용출을 검토하였다. 그 결과, pH 3 내지 pH 5 범위, 보다 바람직하게는 pH 4 내지 pH 5 범위의 산성 용액 중에서, 70 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위로 가열하면 핵산의 용출이 촉진되는 것을 발견하였다. 예를 들면, 95 ℃에서는 10 분에 핵산이 필터로부터 용출되고, 또한 이 핵산은 PCR의 주형으로서 사용 가능하였다. 그러나, TE 완충액으로 용출된 경우와 비교하면 PCR에 의한 증폭이 발생하기 어렵기 때문에, 산 용출된 핵산은 어떠한 손상을 받을 가능성이 있다. 실제, DNA의 데옥시리보스와 피리미딘 염기와의 글리코시드 결합은 산성에서 안정하지만, 푸린 염기와의 글리코시드 결합은 산성에서 가수분해되어, 소위 아푸린산(apurinic acid)을 생성하는 것이 잘 알려져 있다. 이 반응은염기 특이적인 화학 분해법으로서, DNA 염기 서열 결정법인 막삼 길버트법으로 사용되고 있고, 이 경우 pH 2.0의 0.1 M 피페리딘 포르메이트에서 20 ℃로 60 분간 처리한다[Methods in Enzymology, Vol.65, p535(1980)]. 본 발명에 기술되어 있는 조건은 pH 3 내지 pH 5의 범위이지만, 그러한 염기 손상이 발생할 가능성이 있다.
알칼리 용출에서는, 용출 후에 pH를 중성으로 복귀시키는 조작이 필요하였다. 본 발명자들은 그와 같은 후처리가 불필요한 방법으로서 계면활성제의 존재하에 용출시키는 방법을 발견하였다. 부직포에 흡착된 핵산은 물 또는 저염 조건하에 가열하면 용출되지만, 거기에 계면활성제를 첨가하면 핵산 용출은 더욱 촉진된다. TE 완충액으로 용출시키는 경우와 비교하면, 계면활성제는 용출 온도를 내리고, 용출 시간을 단축시키는 효과가 있었다. 계면활성제 중에서도 비이온성 계면활성제나 양쪽성 계면활성제는, 1 ％ 정도의 농도에서는 PCR이나 혼성화를 저해하지 않기 때문에 용출 핵산을 그대로 사용할 수 있고 용출제로서 매우 유용하였다.
또한, 본 발명자들은, 용출시의 온도 제어가 불필요하고, 단시간에 용출시키는 방법도 발견하였다. 부직포에 흡착된 핵산을 활성 산소 처리하여 용출시킨 경우, TE 완충액 중에서의 용출이나 알칼리에 의한 용출보다 간편하고 단시간에 흡착 DNA를 용출할 수 있어, 매우 유용하였다. 활성 산소에 의해 핵산 잔기의 인산에스테르 결합이 절단되어 핵산의 단편화가 발생하는 것은 잘 알려져 있고, 필터에 흡착된 핵산이 단편화되어 필터로부터 쉽게 용출되었다고 생각된다. 금속 이온을 첨가한 과산화수소를 이용한 경우, 금속 이온을 첨가하지 않은 경우와 비교하면, 첨가한 쪽이 필터에 흡착된 게놈을 단시간에 단편화하여 용출시켰다. 또한, 과산화수소수의 농도를 높이면 게놈 DNA의 단편화에 필요한 시간이 단축되어 용출에 필요한 시간이 단축되었다.
활성 산소를 핵산에 작용시킨 경우, 핵산 잔기의 인산에스테르 결합이 절단될 뿐 아니라, 특히 핵산의 염기 부분에 손상이 생기는 것도 알려져 있지만, 활성 산소 처리를 단시간에 행하거나 또는 용출된 핵산 용액으로부터 활성 산소를 신속하게 제거함으로써 핵산에 대한 손상을 최소한으로 억제할 수 있다. 활성 산소를 제거하는 방법으로서, 예를 들면, 뉴클레오스핀(상표명, NucieoSpin; Marcherey-Nagel사) 등의 핵산 정제 컬럼을 사용하여 핵산 용출액 중의 활성 산소를 제거하는 방법, 한외여과막을 사용하여 핵산만을 정제하여 농축하는 방법, 또는 일반적으로 에탄올 침전법이라고 불리는, 염의 존재하에 적량의 알코올을 첨가하여 핵산을 침전시켜 핵산을 정제시키는 방법이 있다. 금속 이온의 존재하에 활성 산소를 생산시키고 싶은 경우에는, 금속 이온을 포함하는 활성 산소 반응액에 금속 이온의 킬레이트제를 첨가함으로써 활성 산소의 발생을 중지시키는 방법도 있다. 또한, 일반적으로 라디칼 스캐빈저라고 불리는 활성 산소 소거제를 첨가하여 활성 산소에 의한 핵산의 절단과 손상을 억제하는 것도 가능하다. 예를 들면, 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD)는 수퍼옥시드를 소거하는 것으로 알려져 있고, 아스코르브산이나 글루타티온은 히드록시 라디칼, 수퍼옥시드를 소거하는 것으로 잘 알려져 있다. 실제, 활성 산소 처리로써 용출된 게놈 DNA를 뉴클레오스핀(상표명) 컬럼으로 정제하여, PCR 반응의 주형으로서 사용하는 것도 가능하고, 혼성화에 사용되는 프로브를 활성 산소 용출과 동일한 조건에서 처리해도 혼성화는 가능하였다.
보다 더 직접적인 방법으로, 부직포로부터 용출된 게놈 DNA가 혼성화의 표적으로서 또는 프로브로서 사용 가능함이 입증되었다. 즉, 표준품 게놈 DNA를 바이오틴 표지하여 부직포로부터 용출된 게놈 DNA와 혼성화시키거나, 또는 부직포로부터 용출된 게놈 DNA를 바이오틴 표지하여 표준품 게놈 DNA와 혼성화시켰다. 그 결과, TE 완충액 또는 알칼리 용액 중에서의 가열 용출, 또는 활성 산소에 의한 용출 중 어느 경우도, 표적으로서도 프로브로서도 사용 가능한 것이 실증되었다.
또한, 본 발명의 특징 중 하나는, 핵산을 용출시키지 않고 핵산이 흡착된 부직포를 직접 이용하여 PCR 등의 핵산 증폭 반응이나 염기 서열 검출을 행할 수 있다는 점에 있다. 즉, 핵산의 추출ㆍ정제로부터 핵산 증폭, 또는 핵산의 추출ㆍ정제로부터 염기 서열 검출까지 동일한 필터 상에서 실시할 수 있다. 이에 의해, 핵산의 추출로부터 검사에 이르는 전체 공정이 현저하게 단순화되고, 용출 조작이 불필요해져 처리 시간이 현저히 단축되었다. 또한, 부직포를 어레이(array)형으로 배치하거나, 또는 동일한 부직포 상에 어레이형으로 핵산을 스팟팅(spot)하면, 많은 항목의 검출을 간단하게 행할 수 있다. 본 발명의 사용에서는 핵산의 추출ㆍ정제로부터 핵산 증폭까지 본 발명으로 행한 후, 표적 염기 서열을 전기영동이나 DNA 마이크로어레이 또는 질량 분석계를 이용하는 검사법으로 분석하는 것도 가능하다.
본 발명의 부직포에 흡착된 핵산은 유리하기 어려운 것이 특징이고, 이로인해 특별한 고정 조작없이 부직포 상에서 프로브를 혼성화시키거나 또는 부직포 상에서 핵산 신장 반응을 일으키는 것이 가능해졌다. 주사 전자 현미경으로 분석하면, 섬유상의 핵산이 부직포의 섬유 표면 상에 흡착되어 있음을 알 수 있다. 전자현미경으로 관찰되는 섬유상의 핵산 분자량은 거대하고, 이러한 긴 핵산은 다수의 지점에서 부직포 섬유와 상호 작용하고 있기 때문에 매우 유리되기 어렵다고 생각된다. 본 발명의 핵산 흡착 필터는 용액 중에 Mg2+나 NaCl 등의 염이 포함되면, 가열해도 핵산을 유리하기 어렵다는 특성을 갖는다． 그 때문에, 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 만드는 통상의 열 변성이나 알칼리 변성 조건하에도 핵산은 필터에 흡착된 채로 남아있고, 따라서 UV 조사 등 특별한 고정화 조작을 행하지 않더라도 혼성화가 가능해졌다. 한편, 핵산 증폭 반응에서는, 예를 들면 PCR 반응액 중에 게놈 DNA를 흡착한 부직포의 작은 단편을 가하여 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 행하면, PCR 증폭 산물은 용액 중에 회수된다.
또한, 본 발명의 큰 특징 중 하나는, 흡착된 핵산을 주형으로 한 DNA 신장 반응이 부직포 상에서 발생한다는 점에 있다. 상기와 같은 PCR 증폭 산물과 다르게, DNA 신장쇄는 용액 중에 유리되지 않고 부직포에 흡착된 그대로이다. 이것을 이용하여 감도가 좋은 검출계를 제조할 수 있다. 핵산 신장 반응을 행할 때에 DNA 중합효소의 기질이 되는 표지 뉴클레오티드를 가하면, 표지 뉴클레오티드가 신규 합성 DNA에 혼입되어 신장 반응을 검출할 수 있다. 표지 뉴클레오티드로서는, 예를 들면 형광 표지 뉴클레오티드나 디그옥시제닌(DIG) 표지 뉴클레오티드(Roche Diagnostics) 등이 사용 가능하다. DIG 시스템의 경우, 잘 알려진 바와 같이 표지 항DIG 항체와 조합하여 형광, 발광, 발색에 의한 검출이 가능하다. 표지 뉴클레오티드 대신에, DNA 합성시에 생성되는 피로인산을 검출할 수도 있다. 피로인산은,예를 들면 피로시퀀싱법과 동일한 반응에 의해 ATP로 변환하여 루시페린-루시퍼라아제의 계에서 발광시키거나, 피로인산마그네슘을 형성하여 백탁시킴으로써 검출할 수 있다.
본 발명에서는 부직포에 흡착된 핵산을 직접 표지하는 것도 가능하다. 용액 상태의 핵산을 표지하는 경우와 비교하면, 부직포 상에서는 미반응의 표지 시약을 세정으로 간단히 제거할 수 있다는 이점이 있다. 부직포 상에서 표지된 핵산은 본 발명에서 기술되어 있는 방법으로 간단히 용출되기 때문에, 이것을 이용하여 혼성화 등의 검출 반응을 행할 수 있다.
본 발명의 부직포는 단위 면적당 다수의 세포 또는 대용량의 샘플을 처리할 수 있기 때문에, 쉽게 단위 면적당 핵산 고정량(핵산 밀도)를 증가시킬 수 있다. 검사 대상이 되는 핵산의 양이 많아지면 검출도 쉽게 되기 때문에, 감염증 진단과 같이 감도가 요구되는 경우, 또는 핵산 증폭이 바람직하지 않은 검사로 샘플의 입수가 비교적 용이한 경우에는, 본 방법이 특히 유용하다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 설명을 위한 것으로, 본 발명의 기술적 범위를 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1] 부직포에 의한 인간의 신선한 혈액으로부터의 핵산 정제
혈액은 정상인으로부터 채혈하고, 항응고제로서 헤파린나트륨(시미즈 세이야꾸)을 혈액 1 ㎖당 10 단위 첨가하였다. 혈액 중의 백혈구 수는 류코 카운트 키트(Leuco COUNT Kit; Becton Dickinson)를 이용하고 유동 세포 계수기(FACS Calibur, Becton Dickinson)로 측정하였다. 혈액 0.25 ㎖ 중의 백혈구 수는 1.16 x 106개이었다. 부직포는 아사히 가세이(주)의 제품을 사용하였다. 부직포를 직경 12 mm의 원반상으로 절단하고, 그것을 4매 겹쳐서 필터 홀더(SWINNEX, MILLIPORE)에 셋팅하여, 필터 홀더의 상류에는 10 ㎖의 주사관, 하류에는 흡인 펌프를 설치하여 필터 홀더에 접속하였다. 최초에 3 ㎖의 분해 완충액(10 mM Tris pH 8; 100 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5 ％ SDS)으로 부직포를 세정하였다.
다음으로, 0.25 ㎖의 인간 혈액에 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 ㎍ 첨가하고, 2x 분해 완충액(20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ SDS)를 0.25 ㎖ 더 첨가하여 실온에서 5 분 방치하였다. 이 처리로 적혈구, 백혈구는 완전히 파괴되었다. 이 혈액 추출액을 부직포에 걸러 즉시 흡인 여과하였다. 이로부터, 흡인하면서 8 ㎖의 분해 완충액을 흘려 필터를 세정하였다.
다음으로, 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 마지막으로 3 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 흘려 부직포를 세정하였다. 이로부터, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어 뚜껑이 부착된 에펜도르프 튜브에 넣고,0.5 ㎖의 TE 완충액을 가하였다. 이것을 80 ℃에서 1 시간 보온한 후, 용출액의 A260(260 nm의 흡광도)와 A280(280 nm의 흡광도)를 UV-1600 UV-가시광 분광광도계(Shimazu)로 측정하였다. 용출액의 A260/A280가 1.8 내지 2.0의 범위에 있으면, 거의 순수한 핵산이라고 생각된다. 표 1은 A260/A280이 1.8 내지 2.0의 범위에 있었던 부직포를 목록으로 기재한 것이다. DNA 농도는 다음 수학식 1에 의해 산출하였다(UV1600의 부속 소프트 DNA/단백질 프로그램 팩 버전 2.00).
여기서, K1=62.90 K2=36.00이다.
상품명 부직포 사양 소재 DNA(㎍) A260/A280
A040C01/HM3 코트 폴리에틸렌 테레프탈레이트 5.7 1.86
A040C01 폴리에틸렌 테레프탈레이트 4.3 2.01
마이크로웹 P020A(EL) 폴리프로필렌 2.3 1.94
마이크로웹 P020C 폴리프로필렌 3.8 1.94
마이크로웹 P090D 폴리프로필렌 4.0 1.91
엘타스 N05070 나일론 4.7 1.93
엘타스 E05070 폴리에스테르 5.1 1.88
[실시예 2] 인간 정제 핵산의 분석
실시예 1에서 얻은 정제 핵산을 0.7 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하여 그의 크기를 확인하였다. 실시예 1의 용출액 10 ㎕에 10 x 로딩 완충액(1 ％ SDS; 50 ％ 글리세롤; 0.05 ％ 브로모페놀 블루, TaKaRa) 1.5 ㎕를 첨가하여 잘 혼합하고, 총량을 0.7 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하였다. 머피드(Mupid) 미니 겔영동조(Advance)에서 50 V로 90 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트(BioImage Gel Print) 2000i/VGA로 촬영하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 정제 핵산은 수 kb 내지 수십 kb에 달하는 다양한 크기의 핵산 단편을 포함하고 있었다.
다음으로, 실시예 1에서 얻은 정제 DNA가 PCR의 주형이 될 수 있는가를 확인하였다. 프라이머는 클론테크(Clontech)사의 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제(G3PDH) 0.45 kb 콘트롤 앰플리머 세트(Control Amplimer Set; 카탈로그 번호 5405-3)를 사용하였다. 실시예 1의 용출액을 증류수로 10 배에 희석하고, 그 중 5 ㎕를 PCR 반응액(최종 농도 10 mM Tris-HCl pH 8.3; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.2 mM dTTP; 1.25U 앰플리 택(Ampli Taq; Applied Biosystems); G3PDH 3'-프라이머 0.5 μM G3PDH 5'-프라이머 0.5 μM)에 가하여 50 ㎕로 만들었다.
이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 5 분 1 사이클; 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 1 분, 72 ℃ 1.5 분, 30 사이클; 72 ℃ 7 분 반응시켰다. PCR 종료 후, 반응액 10 ㎕에 10 x 로딩 완충액을 1.5 ㎕ 가하여 잘 혼합하고, 총량을 2 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하였다. 50 V로 45 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트 2000i/VGA로 촬영하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 모든 정제 DNA 분획으로부터 452 bp의 PCR 산물이 증폭되어 있어, PCR의 주형으로서 사용 가능한 것으로 나타났다.
[실시예 3] 대장균 핵산의 정제
A040C01/HM-3 코트(아사히 가세이)를 직경 12 mm의 원반상으로 절단하고, 그것을 4매 겹쳐서 필터 홀더(SWINNEX, MILLIPORE)에 셋팅하여, 필터 홀더의 상류에는 10 ㎖의 주사관, 하류에는 흡인 펌프를 설치하였다. 최초에 3 ㎖의 분해 완충액(10 mM Tris pH 8; 100 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5 ％ SDS)으로 부직포를 세정하였다.
대장균(E. coli) DH5의 글리세롤 저장액 50 ㎕를 3 ㎖의 LB 배지(트립톤 펩톤(DIFCO) 1 g; 효모 추출물(DIFCO) 0.5 g; NaCl 1 g; 1 N NaOH 200 ㎕; 증류수 100 ㎖)에 가하고, 37 ℃에서 4.5 시간 배양하여 A600=1.56의 배양액을 얻었다. 흡광도로부터 대장균(E. coli) 농도는 약 6.2 x 109개/㎖로 생각되었다. 이 배양액을 1.6 ㎖(대장균 1010개) 취하여 15,000 rpm으로 1 분간 원심분리하였다. 균의 침전물을 0.25 ㎖의 LB 배지에 현탁시켰다. 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 ㎍/2.6 ㎕ 가하고, 2x 분해 완충액 20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ SDS)를 0.25 ㎖ 더 가하여 실온에서 5 분 방치하였다. 이 추출액을 상기 준비한 A040C01/HM-3 코트에 로딩하여 즉시 흡인 여과하였다. 그 후, 흡인하면서 8 ㎖의 분해 완충액을 흘려 필터를 세정하였다.
다음으로, 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 마지막으로 3 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 흘려 A040C01/HM-3 코트를 세정하였다. 이로부터, 4매의 A040C01/HM-3 코트를 필터 홀더로부터 떼어내어, 뚜껑이 부착된에펜도르프 튜브에 넣고, 0.5 ㎖의 TE 완충액을 가하였다. 이것을 80 ℃ 1 시간 보온한 후, 용출액의 흡광도를 측정하였다. A260/A280=1.84의 정제 핵산을 64.1 ㎍ 취득하였다.
[실시예 4] 대장균 핵산의 분석
실시예 3에서 얻은 정제 핵산을 0.7 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하여, 그의 크기를 확인하였다. 실시예 3의 용출액 10 ㎕에 10 x 로딩 완충액(1 ％ SDS; 50 ％ 글리세롤; 0.05 ％ 브로모페놀 블루, TaKaRa) 1.5 ㎕를 첨가하여 잘 혼합하고, 총량을 0.7 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하였다. 머피드 미니 겔 영동조(Advance)에서 50 V로 90 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트 2000i/VGA로 촬영하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 정제 핵산은 수백 bp 내지 수십 kb의 핵산 단편을 포함하고 있었다.
다음으로, 실시예 3에서 얻은 정제 DNA가 PCR의 주형이 될 수 있는지를 확인하였다. PCR의 프라이머는, 대장균의 리보솜 단백질 L25를 코딩하는 유전자 rplY의 염기 서열 393번째 c로부터 413번째 a까지의 서열(서열 1)과 염기 서열 567번째 c로부터 587번째 a까지의 상보쇄 서열(서열 2)을 사용하여, 시그마 사에 의뢰하여 화학적으로 합성하였다. PCR 증폭 산물의 길이는 195 bp이었다. 실시예 3의 용출액을 증류수로 4000 배에 희석하고, 그 중 10 ㎕를 PCR 반응액에 첨가하여 25 ㎕로 만들었다(최종 농도 60 mM Tris/15 mM (NH4)2SO4pH 10.0; 50 mM KCl; 3.5 mM MgCl2; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.2 mM dTTP; 1.25 U 다까라(TaKaRa) ExTaq(다까라 슈조); 프라이머 각 0.5 μM).
이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 2 분 1 사이클; 94 ℃ 1 분, 55 ℃ 1 분, 72 ℃ 1 분, 30 사이클; 72 ℃ 7 분 반응시켰다. PCR 종료 후, 반응액 10 ㎕에 10 x 로딩 완충액을 1.5 ㎕ 가하여 잘 혼합하고, 총량을 3 ％ 뉴시브(NuSieve) 3:1 아가로오스 (BioWhittaker Molecular Applications) 전기영동으로 분석하였다. 머피드 미니 겔 영동조(Advance)에서 100 V로 40 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트 2000i/VGA로 촬영하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 195 bp의 PCR 산물이 증폭되어 있어, PCR의 주형으로서 사용 가능한 것으로 확인되었다.
[실시예 5] 인간 동결 보존혈로부터의 핵산 정제
혈액은 정상인으로부터 채혈하고, 항응고제로서 헤파린나트륨(시미즈 세이야꾸)을 혈액 1 ㎖당 10 단위 첨가하였다. 혈액 중의 백혈구 수는 류코 카운트 키트(Becton Dickinson)를 이용하고 유동 세포 계수기(FACS Calibur, Becton Dickinson)로 측정하였다. 혈액 0.25 ㎖ 중의 백혈구 수는 1.16 x 106개이었다.
0.25 ㎖의 혈액을 에펜도르프 튜브에 넣고 - 80 ℃에서 동결하였다. 0.25 ㎖의 동결 보존혈에, 37 ℃로 가온한 2x 분해 완충액(20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ SDS)를 0.25 ㎖ 가하고, 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 ㎍ 더 가하여, 이것을 37 ℃의 수조에서 때때로 가온하면서 볼텍스에서 교반하여 완전히 용해시켰다. 실온에서 5 분 방치 후, 이 혈액 추출액을 부직포에걸러 즉시 흡인 여과하였다. 이하, 실시예 1에서 기술한 방법에 따라서 핵산을 제조하였다. 대조군으로서, 신선한 혈액을 동일하게 처리하였다. 결과를 표 2에 나타내었다. 동결 보존혈로부터도 신선한 혈액과 동일하게 정제 핵산이 얻어졌다.
DNA(㎍) A260/A280
신선한 혈액 4.4 1.92
동결 보존혈 3.0 1.90
[실시예 6] 부직포에 대한 게놈 DNA의 흡착
6.20 x 107개의 인간 말초혈 백혈구에 620 ㎕의 분해 완충액(10 mM Tris pH 8; 100 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5 ％ SDS)와 프로테이나제 K(최종 농도 0.1 mg/㎖, PCR-등급, Roche)를 첨가하여 백혈구를 현탁시켰다. 50 ℃에서 12 시간 인큐베이션한 후, 등량의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올=25:24:1(GIBCO BRL)을 첨가하고, 완전히 혼합하여 1700 xg로 10 분간 원심분리하였다. 상청액을 취하여, 동일한 조작을 2회 더 반복하였다. 상청액을 투석 튜브로 옮기고, 4 ℃에서 100 용적의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)에 대하여 3회 투석하였다. A260/A280=1.76의 게놈 DNA가 531 ㎍ 얻어졌다.
부직포 A040C01/HM-3 코트를 직경 12 mm의 원반상으로 절단하고, 그것을 4매겹쳐서 필터 홀더(SWINNEX, MILLIPORE)에 셋팅하였다. 필터 홀더의 상류에는 10 ㎖의 주사관을 셋팅하고, 테르퓨젼(terfusion) 실린지 펌프 TE-311(데루모)로 3 ㎖의 PBS를 유속 26.2 ㎖/hr로 흘려 부직포를 세정하였다. 다음으로, 26.3 ㎍의 게놈 DNA를 1 ㎖의 PBS에 녹여 A040C01/HM-3 코트로 여과하였다. 그 후, 3 ㎖의 PBS로 부직포를 세정하였다. 여액은 전부 회수하였다. 마지막으로 부직포를 필터 홀더로부터 떼어내어, 뚜껑이 부착된 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.5 ㎖의 TE 완충액을 가하였다. 이것을 80 ℃에서 1 시간 보온한 후, TE 완충액을 회수하였다. 모든 여액과 용출액의 용량과 흡광도를 측정하여 DNA의 회수율을 계산한 결과를 표 3에 나타내었다. A040C01/HM-3 코트로 26.3 ㎍의 DNA를 여과한 결과, 약 65 ％의 DNA가 흡착되고 51 ％의 DNA(13.5 ㎍)가 회수되었다. 또한, DNA 회수율은 다음 수학식 2로 계산하였다.
회수율(％)=100*회수 DNA(㎍)/26.3(㎍)
총 DNA량 그냥 통과함 세정 용출
DNA(㎍) 26.3 6.6 2.7 13.5
회수율(％) 100％ 25％ 10％ 51％
[실시예 7] 혈액의 용해 조건
실시예 1과 동일한 조건으로 실험을 행하여 혈액의 처리 시간, 처리 온도, 프로테이나제 K의 유무를 검토하였다. 부직포는 A040C01/HM-3 코트를 사용하였다. 혈액 0.25 ㎖에 프로테이나제 K, 2x 분해 완충액을 가하고 나서, 실온 또는 50 ℃에서 5 분 내지 60 분 처리한 후 A040C01/HM-3 코트로 핵산을 정제하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 프로테이나제 K없이 50 ℃에서 5 분 내지 15 분 처리하면, 혈액 추출액이 블로킹되어 부직포를 통과할 수 없게 되어 핵산을 회수할 수 없었다. 또한, 실온에서 5 분 내지 60 분 처리의 범위에서는, 프로테이나제 K 첨가 또는 무첨가 어느 계에서도 핵산을 정제할 수 있었다.
[실시예 8] 백혈구 흡착능과 핵산 흡착능
부직포는 A040C01/HM-3 코트, A040C01, N05070, E05070을 이용하였다. 부직포를 직경 12 mm의 원반상으로 절단하고, 그것을 4매 겹쳐서 필터 홀더(SWINNEX, MILLIPORE)에 셋팅하였다. 필터 홀더의 상류에는 10 ㎖의 주사관을 두고, 테르퓨젼 실린지 펌프 TE-311(데루모)에 셋팅하였다. 부직포는 3 ㎖의 EtOH, 다음으로 3 ㎖의 PBS를 흘려 전처리하였다. 유속은 실린지 펌프로 26.2 ㎖/hr로 설정하였다. 전처리한 부직포에 혈액 1 ㎖를 흘리고, 다음으로 6 ㎖의 PBS로 세정하였다. 마지막으로 부직포에 공기를 통과시켜 세정액을 모두 압출시켰다. 그냥 통과한 혈액과 세정액을 전부 회수하여(합쳐서 여액으로 함) 용량과 백혈구 수를 측정하였다. 부직포에 거르기 전의 혈액과 여액 중의 백혈구 수는 류코 카운트 키트(Becton Dickinson)를 이용하고 유동 세포 계수기(FACS Calibur, Becton Dickinson)로 측정하였다. 백혈구 흡착율은 다음 수학식으로 산출하였다.
백혈구 흡착율(％)=100*(혈액 1 ㎖의 백혈구 수-여액의 백혈구 수)/(혈액 1 ㎖의 백혈구 수)
상기에서 구한 백혈구 흡착율과 표 1의 DNA 회수량을 플롯팅한 것이 도 6이다. 부직포의 백혈구 흡착 능력(백혈구 제거 능력)과 핵산 흡착 능력에 있어서의 상관 관계는 확인되지 않았다.
[실시예 9] 알칼리 조건하에서의 핵산 용출
실시예 5와 동일한 조건에서 실험하여, 알칼리 조건하에서의 핵산 용출을 검토하였다. 부직포는 아사히 가세이(주)의 제품 A040C01/HM-3 코트를 사용하였다. 0.25 ㎖의 동결 보존혈을 실시예 5의 순서로 부직포에 거르고, 마지막으로 3 ㎖의 TE 완충액을 흘려 부직포를 세정한 후, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어, 뚜껑이 부착된 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.5 ㎖의 TE 완충액, 0.05 N NaOH 또는 0.2 N NaOH를 첨가하여 부직포를 침지하고, 가열 블럭에서 95 ℃로 5 분 내지 20 분 보온하였다. 반응 종료 후, 3 M NaH2PO4를 0.2 N NaOH에 대하여 1/10 용적(50 ㎕), 0.05 N NaOH에 대하여 1/40 용적(12.5 ㎕) 가하여 중화시켰다.
용출된 DNA의 양은, 올리그린(등록 상표, OliGreen) ssDNA 정량 키트(Molecular Probes사 상품 번호 0-11492)를 이용하여 측정하였다. 키트 부속의 18 잔기 올리고뉴클레오티드를 표준으로 하고, Ex 485 nm, Em 535 nm에서 형광 플레이트 리더 ARVOsx-3(와락베르토올드 재팬(주))로 정량하였다. 부직포로부터의 용출액을 TE 완충액으로 10 배에 희석시키고, 또한 RNA를 제거하기 위해서 DNase-비함유 RNase(Roche사 상품 번호 1119915)를 최종 농도 2.5 ㎍/㎖가 되도록 첨가하여 37 ℃에서 30 분 반응시켰다. 이 처리로 RNA는 분해되어, 올리그린의 측정계에서는 거의 검출할 수 없게 된다. 이것은 16S 및 23S rRNA 표준품을 이용하여 확인되었다.
측정 결과를 도 7에 나타내었다. TE 완충액 중에서 95 ℃로 용출시키면, DNA량은 20 분까지 반응 시간의 경과와 동시에 증가하지만(도 7), 그 후 용출 DNA량은 안정기(plateau)에 달하였다. 한편, 동일한 양의 DNA가 0.05 N 또는 0.2 N NaOH의 알칼리 용액 중에서는 95 ℃ 5 분에 용출 가능하였다.
이 정제 DNA 10 ㎕를 0.7 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하여, 그의 크기를 확인하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 알칼리 조건하에 용출된 DNA의 크기는, TE 완충액으로 용출된 DNA보다 큰 경향이 있었다. 95 ℃에서 5 분, 10 분, 20 분으로 반응 시간이 길어짐에 따라서, 용출 DNA의 크기는 감소하였다. 0.05 N NaOH로 용출시킨 쪽이 0.2 N NaOH로 용출시킨 경우보다 DNA 크기는 크고, 어느 경우에도 DNA 크기는 수 kb 내지 수백 kb 이상에 달하였다.
다음으로, 알칼리 조건하에 용출된 정제 DNA가 PCR의 주형이 될 수 있는지 를 확인하였다. PCR과 그의 분석은 실시예 2와 동일하게 행하였다. 즉, 프라이머는 클론테크사의 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제(G3PDH) 0.45 kb 콘트롤 앰플리머 세트를 사용하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 알칼리 조건하에 용출된 정제 DNA로부터도 452 bp의 PCR 산물이 증폭되어 있어, PCR의 주형으로서 사용 가능함을 나타내었다.
[실시예 10] 알칼리 용출에 대한 온도의 영향
실시예 9와 동일한 방법으로, 혈액 유래의 핵산이 흡착된 부직포 A040C0 1/HM-3 코트를 제조하여 용출 온도의 영향을 조사하였다. 용출은 TE 완충액으로 95 ℃ 20 분; 0.05 N NaOH로 95 ℃ 또는 70 ℃ 10 분; 0.2 N NaOH로 95 ℃, 70 ℃, 60 ℃, 50 ℃ 또는 40 ℃ 10 분 행하여, 용출된 DNA량을 비교하였다. DNA량은 실시예 9와 동일하게 올리그린(등록 상표) ssDNA 정량 키트로 측정하였다. 도 10에나타낸 바와 같이, DNA의 용출량은 온도가 높아짐에 따라서 증가하고, 특히 70 ℃ 이상에서 현저하였다.
[비교예 1] 산성 조건하에서의 DNA 용출
실시예 9와 동일한 방법으로, 혈액 유래의 핵산이 흡착된 부직포 A040C01/HM-3 코트를 제조하였다. 용출은 TE 완충액으로 95 ℃ 20 분 또는 10 mM 시트레이트(pH 4.5)/1 mM EDTA 완충액 중에서 95 ℃ 10 분 행하였다. 용출 후, 즉시 1 M Tris(pH 8.0)을 용출액에 첨가하여 중화시켰다. 다음으로, 용출액의 A260(260 nm의 흡광도)와 A280(280 nm의 흡광도)를 UV-1600 UV-가시광 분광광도계(Shimazu)로 측정하여 용출 핵산량을 산출하였다. 결과를 표 4에 나타내었다. DNA 농도는 다음 수학식 1에 의해 산출하였다(UV1600의 부속 소프트 DNA/단백질 프로그램 팩 버전 2.00).
<수학식 1>
여기서, K1=62.90 K2=36.00이다.
용출 DNA(㎍)
TE, 95 ℃ 10 분 1.1
TE, 95 ℃ 20 분 6.4
pH 4.5, 95 ℃ 10 분 4.5
이 용출 DNA를 실시예 9와 동일한 방법으로 0.7 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하여, 그의 크기를 확인하였다. 결과를 도 11에 나타내었다. pH 4.5 95 ℃ 10 분으로 용출시킨 핵산의 크기는 수 kb 내지 수십 kb에 달하고 있었다. 다음으로, 산성 조건하에 용출된 정제 DNA가 PCR의 주형이 될 수 있는지는 확인하였다. 이것도 실시예 9와 동일한 방법으로 행하여, 산성 조건하에 용출된 DNA도 PCR이 가능하다는 것을 발견하였다(도 12).
[참고예 1] 알칼리 용출의 DNA 프로브에 대한 영향
부직포로부터 알칼리 용출된 DNA가 혼성화에 사용 가능한지 여부를 평가하기 위해서, 알칼리 용출과 동일한 조건하에 둔 디그옥시제닌-11-dUTP(DIG) 표지 DNA를 이용하여 혼성화 실험을 행하였다. DNA의 DIG 표지는 로슈(Roche)사 PCR DIG 프로브 합성 키트(Probe Synthesis Kit)와 PCR DIG 표지 혼합물(Labeling Mix)을 사용하고, 혼성화의 검출에는 로슈(Roche)사의 DIG 하이 프라임(high prime) DNA 표지/검출 키트를 이용하였다. 1 ng 람다 DNA(Takara), 닛본 바이오 서비스사에 의뢰하여 화학적으로 합성한 서열 3의 DNA 프라이머(최종 농도 0.4 μM)와 서열 4의 DNA 프라이머(최종 농도 0.4 μM)를 포함하는 PCR 반응액(최종 농도 1.5 mM MgCl2를 포함하는 PCR 완충액; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.19 mM dTTP; 0.01 mM 디그옥시제닌-11-dUTP; 2.6U 익스펜드 하이 피델리티(Expand High Fidelity) 앰플리 택) 50 ㎕를 제조하고, 이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 3 분 1 사이클; 94 ℃, 30 초, 60 ℃ 1 분, 72 ℃ 3분, 30 사이클; 72 ℃ 5 분 반응시켰다. 표지된 DNA를 마셔리-나겔(Macherey-Nagel)사의 뉴클레오스핀 컬럼으로 정제하여 50 ㎕의 DNA 용액을 얻었다. 이것에 최종 농도가 0.05 N 또는 0.2 N가 되도록 NaOH를 첨가하고, 가열 블럭에서 95 ℃로 5 분 내지 20 분 보온하여 알칼리용출과 동일한 조건하에 두었다. 보온 종료 후, 3 M NaH2PO4를 0.2 N NaOH에 대하여 1/10 용적, 0.05 N NaOH에 대하여 1/40 용적 첨가하여 중화시켰다. 이 DNA 용액을 재차 뉴클레오스핀 컬럼으로 정제하고, 50 ㎕의 혼성화용 DIG 표지 DNA 프로브를 얻었다. 0.01 ng 내지 10 ㎍의 람다 DNA를 하이본드-N+ 막(Amersham-Pharmaica) 상에 블롯팅하여 알칼리 변성을 행하여 단일가닥으로 만든 후, UV 가교결합에 의해 막 상에 고정화하였다. 이것을 DIG Easy Hyb(Roche) 액 중에 침지하여 42 ℃에서 3 시간 예비 혼성화를 행한 후, 열변성에 의해 단일가닥으로 만든 상기 DIG 표지 DNA 프로브를 첨가하여 42 ℃에서 18 시간 보온시켜 혼성화를 행하였다. 이것을 2 X SSC, 0.1 ％ SDS를 사용하여 실온에서 5 분간의 세정을 2회 행한 후, 0.1 X SSC, 0.1 ％ SDS를 사용하여 68 ℃에서 15 분간의 세정을 2회 행하였다. 다음으로 세정 완충액(최종 농도 0.1 M 말레산; 0.15 M NaCl; 0.3 ％ 트윈(Tween) 20 pH 7.5)으로 1 분간 평형화를 행한 후, 말레산 완충액(최종 농도 0.1 M 말레산; 0.15 M NaCl pH 7.5)으로 10 배 희석한 블롯팅 용액(Roche)에 1 시간 침지하였다. 이것에 3 ㎕의 알칼리 포스파타아제 표지 항-DIG 항체(Roche)를 첨가하여 실온에서 30 분간 두었다. 세정 완충액을 이용하여 실온에서 15 분간의 세정을 2회 행하고, 다음으로 알칼리 포스파타아제 완충액(최종 농도 0.1 M Tris pH 9.5; 0.1 M NaCl; 50 mM MgCl2)으로 2 분간 평형화를 행하고, 이것에 1/100 용적의 CSPD 레디-투-유즈(ready-to-use; Roche)를 첨가하여 20 분간 37 ℃에서 보온한 후, 이것을 Hyper ECL 필름(Amersham-Pharmacia)에 30 분간 감광시키고, 현상기(Konica)로 현상하였다. 그 결과, 알칼리 용액으로 처리한 DNA 프로브는 알칼리 용액으로 처리하지 않은 DNA 프로브와 거의 동일한 강도의 신호를 검출할 수 있었다(도 13). 이상의 결과는, 실시예 9에 나타낸 알칼리 조건하에 용출시킨 DNA가 혼성화에 사용 가능하다는 것을 시사하고 있다.
[실시예 11] 과산화수소수에 의한 핵산 용출
실시예 5와 동일한 조건으로 실험을 행하여, 과산화수소수에 의한 핵산 용출을 검토하였다. 부직포는 아사히 가세이(주)의 제품 A040C01/HM-3 코트를 사용하였다. 0.25 ㎖의 동결 보존혈을 실시예 5의 순서로 부직포에 걸러, 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 10 ㎖의 정제수를 흘려 부직포를 세정한 후, 여기에 3 ％의 과산화수소수와 0.1 mM의 CuCl2를 포함하는 활성 산소액 1 ㎖를 첨가하여 실린지를 천천히 눌러 액체를 부직포 전체에 잠기게 하였다. 실온에 1, 2, 3, 5 분간 방치한 후, 실린지를 눌러 라디칼액을 모두 압출시키고, 또한 1 ㎖의 TE 완충액으로 부직포에 흡착된 핵산을 용출시켰다. 핵산은 뉴클레오스핀 컬럼(Macherey-Nagel사)으로 빨리 정제하여 용출액 중에 포함되는 과산화수소와 금속 이온을 제거하였다.
정제한 핵산량은 OD260nm을 측정하여 정량을 행하였다. 또한, 이 정제 핵산을 0.7 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하여, 그의 단편화의 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 단시간의 과산화수소 처리에 의해 필터에 흡착된 핵산이 용출되는 것으로 나타났다.
다음으로, 이 라디칼액으로 용출시켜 정제한 게놈 DNA가 PCR의 주형이 될 수 있는지를 확인하였다. PCR과 그의 분석은 실시예 2와 동일하게 행하였다. 즉, 프라이머에는 클론테크사의 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제(G3PDH) 0.45 kb 콘트롤 앰플리머 세트를 사용하였다. 결과를 도 15에 나타내었다. 과산화수소로 용출된 정제 게놈 DNA를 주형으로서 PCR에 의한 핵산 증폭이 가능한 것으로 나타났다.
[실시예 12] 환원당과 금속 이온에 의한 핵산 용출
실시예 11과 동일한 방법으로, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01/HM-3 코트의 부직포를 준비하였다. 이것을 컬럼 홀더로부터 떼어내고, 24웰 플레이트(SUMILON)로 이동하여 라디칼액으로서 100 mM D-리보스 5-포스페이트(시그마)와 0.1 mM CuCl2를 각각 250 ㎕씩 첨가하여, 교반하면서 50 ℃에 두었다. 1, 3, 5, 10, 30 분 후에, 0.5 M EDTA를 50 ㎕ 첨가하여 활성 산소의 발생을 중지시켰다. 이 중의 10 ㎕를 0.7 ％의 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 50 V로 45 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트 2000i/VGA로 촬영하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다. 2가의 금속 이온을 첨가한 환원당으로 발생시킨 활성 산소에 의해서, 필터에 흡착된 핵산이 용출되는 것으로 나타났다.
다음으로, 이 라디칼액으로 용출시켜 정제된 게놈 DNA가 PCR의 주형이 될 수 있는가를 실시예 11과 동일한 방법으로 확인하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 2가의 금속 이온을 첨가한 환원당으로 발생시킨 활성 산소에 의해 필터로부터용출된 인간 게놈 정제 DNA를 주형으로 한 PCR 핵산 증폭은, 단시간의 활성 산소 반응에 있어서 가능한 것으로 나타났다.
[실시예 13] 제한 효소에 의한 핵산 용출
실시예 11과 동일한 방법으로, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01/HM-3 코트의 부직포를 준비하였다. 이것을 컬럼 홀더로부터 떼어내고, 24웰 플레이트(SUMILON)로 이동하여 제한 효소 Sau3AI(Takara) 2.5 ㎕를 포함하는 효소용액 50 ㎕를 첨가하고, 실온 또는 37 ℃에서 5, 10, 30 분간 두었다. 이 중 50 ㎕를 뉴클레오스핀 컬럼으로 정제하여 50 ㎕의 용출 게놈 용액을 얻었다. 이들 중에서의 10 ㎕를 0.7 ％의 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 50 V로 45 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트 2000i/VGA로 촬영하였다. 결과를 도 18에 나타내었다. 제한 효소에 의해 필터에 흡착된 게놈 DNA가 절단되어 용출되는 것으로 나타났다.
[참고예 2] 활성 산소 용출의 DNA 프로브에 대한 영향
부직포로부터 활성 산소로 단편화하여 용출시킨 게놈 DNA가 혼성화에 사용 가능한지 여부를 참고예 1과 동일한 방법으로 확인하였다. 디그옥시제닌-11-dUTP(DIG) 표지 DNA를 사용한 혼성화 실험으로 확인하였다. DNA의 DIG 표지는 로슈(Roche)사 PCR DIG 프로브 합성 키트와 PCR DIG 표지 혼합물을 사용하고, 혼성화와 검출에는 로슈(Roche)사의 DIG 하이 프라임 DNA 표지/검출 키트를 사용하였다. 1 ng 람다 DNA(Takara)와 서열 3과 4 기재의 DNA 프라이머(최종 농도 각 0.4 μM)를 포함하는 PCR 반응액 50 ㎕를 제조하고, 이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 3 분 1 사이클; 94 ℃ 30 초, 60 ℃ 1 분, 72 ℃ 3 분, 30 사이클; 72 ℃ 5 분 반응시켰다. 표지된 DNA를 마셔리-나겔(Macherey-Nagel)사의 뉴클레오스핀 컬럼으로 정제하여 50 ㎕의 DIG 표지 DNA 프로브 수용액을 얻었다. 이 DIG 표지 DNA 프로브에 100 mM D-리보스 5-포스페이트와 0.05 mM CuCl2를 포함하는 활성 산소액 50 ㎕를 첨가하여 50 ℃에서 2, 10 분간 두었다. 이것을 뉴클레오스핀 컬럼으로 재차 정제하고, 용액 중의 활성 산소를 제거하여 활성 산소 처리가 종료된 DIG 표지 DNA 프로브로 만들었다. 이하, 참고예 1과 동일하게 행하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다. 활성 산소 처리한 DIG 표지 DNA 프로브에 있어서도, 막 상에 고정화된 DNA와 혼성화가 가능한 것으로 나타났다.
[실시예 14] 부직포에 흡착된 인간 게놈 DNA의 PCR
0.25 ㎖의 동결 보존혈(백혈구 수 1.15 x 106개)를 실시예 11과 동일한 방법으로 처리하여, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01/HM-3 코트, A040C01, P020A(EL), P090D, E05070, N05070의 부직포를 준비하였다. 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 3 ㎖의 TE 완충액, 마지막으로 3 ㎖의 정제수를 흘려 부직포를 세정한 후, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어, 가장 상류(입구)측의 부직포 중앙부를 3 mm x 3 mm의 사각형으로 절단하고, 0.5 ㎖의 PCR용 튜브의 바닥에 넣었다.
PCR의 시스템으로서는, 클론테크사의 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제(G3PDH) 0.45 kb 콘트롤 앰플리머 세트(카탈로그 번호 5405-3)를 사용하였다. PCR용 튜브에 부직포의 세그먼트를 넣고, 이하 실시예 2와 동일하게 PCR 반응액 50 ㎕를 가하여, 이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 5 분, 1 사이클; 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 1 분, 72 ℃ 1.5 분, 30 사이클; 72 ℃ 7 분 반응시켰다. PCR 종료 후, 반응액 10 ㎕에 10 x 로딩 완충액을 1.5 ㎕ 가하여 잘 혼합하고, 총량을 2 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하였다. 50 V로 45 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트 2000i/VGA로 촬영하였다. 결과를 도 20에 나타내었다. 핵산이 흡착된 모든 부직포로부터 452 bp의 PCR 산물이 증폭되어 있어, 부직포에 흡착된 인간 게놈 DNA가 PCR의 주형으로서 사용 가능한 것으로 나타났다.
[실시예 15] 부직포에 흡착된 대장균 게놈 DNA의 PCR
대장균(E. coli) DH5의 글리세롤 저장액 50 ㎕를 3 ㎖의 LB 배지에 가하여, 37 ℃에서 3.5 시간 배양하고, A600=0.9의 배양액을 얻었다. 흡광도로부터 대장균(E. coli) 농도는 약 3.6 x 109개/㎖로 생각되었다. 이 배양액을 1.4 ㎖ 취하여 15,000 rpm으로 1 분간 원심분리하였다. 균의 침전물을 0.25 ㎖의 LB 배지에 현탁시키고, 이하 실시예 3과 동일하게 처리하여, 대장균의 핵산이 흡착된 A040C01/HN4-3 코트를 준비하였다. 3 ㎖의 TE 완충액을 흘려 부직포를 세정한 후, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어, 가장 상류(입구)측의 부직포 중앙부를 3 mm x 3 mm의 사각형으로 절단하고, 0.5 ㎖의 PCR용 튜브의 바닥에 넣었다. 다음으로, 실시예 4와 동일한 PCR 시스템을 이용하여 대장균의 리보솜 단백질 L25를 코딩하는 유전자 rplY를 표적으로 한 PCR 반응을 행하고, 아가로오스 전기영동으로 분석하였다. 결과를 도 21에 나타내었다. 195 bp의 PCR 산물이 증폭되어 있어, 부직포에 흡착된 대장균 게놈 DNA가 PCR의 주형으로서 사용 가능한 것으로 확인되었다.
[실시예 16] 부직포에 흡착된 인간 게놈 DNA의 프로브 혼성화에 의한 검출
0.25 ㎖의 동결 보존혈(백혈구 수 1.15 x 106개)를 실시예 11과 동일한 방법으로 처리하여, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01/HM-3 코트 및 A040C01의 부직포를 준비하였다. 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 다음으로 3 ㎖의 TE 완충액을 흘려 부직포를 세정하였다.
세정한 부직포를 필터 홀더로부터 떼어내고, 부유 세포 배양용의 24웰 플레이트(SUMILON)로 이동하여, 알칼리 변성에 의해 부직포 상에 흡착된 게놈 DNA를 단일가닥으로 만들었다. 막 표면에의 게놈 DNA의 고정화 조작을 하지 않고, 즉시 이것에 0.5 ㎖의 혼성화 완충액(5 x 덴하르트(Denhardt's); 2 x SSPE; 0.2 ％ SDS; 10 ng/㎖ 연어 정자 DNA(시그마))를 첨가하고, 65 ℃에서 1 시간 두어 혼성화를 행하였다.
인간 G3PDH 유전자에 대한 방사성 동위원소 표지 DNA 프로브와 람다 DNA에 대한 방사성 동위원소 표지 DNA 프로브를 이하의 방법으로 제조하였다. 우선, 클론테크사의 G3PDH용 콘트롤 앰플리머 세트를 사용하여 다음 PCR 반응을 행하였다. 10 ng의 인간 게놈 DNA(GIBCO BRL)를 넣은 PCR용 튜브에, 최종량이 50 ㎕가 되도록PCR 반응액(최종 농도 10 mM Tris-HCl pH 8.3; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.2 mM dTTP; 1.25U 앰플리 택(Applied Biosystems); G3PDH 3'-프라이머 0.5 μM; G3PDH 5'-프라이머 0.5 μM)를 가하였다. 람다 DNA 프로브는 1 ng 람다 DNA(Takara), 닛본 바이오서비스사에 의뢰하여 화학적으로 합성한 서열 3의 DNA 프라이머(최종 농도 0.4 μM)와 서열 4의 DNA 프라이머(최종 농도 0.4 μM)를 넣은 PCR용 튜브에, 최종량이 50 ㎕가 되도록 PCR 반응액(최종 농도 10 mM Tris-HCl pH 8.3; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2: 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.2 mM dTTP; 1.25 U 앰플리 택(Applied Biosystems)를 가하였다. 이들 PCR 반응액을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 96 ℃ 5 분, 1 사이클; 96 ℃ 30 초, 60 ℃ 1 분, 72 ℃ 3분, 30 사이클; 72 ℃ 5 분 반응시켰다. PCR 종료 후, PCR 산물을 각각 뉴클레오스핀 추출(NucleoSpin Extract) 키트(Macherey-Nagel)로 정제하여, 인간 G3PDH 유전자와 람다 DNA 각각의 부분 서열 DNA 단편을 얻었다. 이들 각각의 DNA 단편 20 ng을 포함하는 45 ㎕의 TE 완충액을 96 ℃에 5 분간 둔 후 빨리 얼음에 5 분간 넣어 DNA를 단일가닥으로 만들었다. 이들에 레디프라임(Rediprime) II DNA 표지 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)의 표지 반응 혼합물과 1.85 MBq의 레디뷰(Readyview)[α-32P] dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)을 첨가하여 서서히 혼합한 후, 37 ℃에서 10 분간 두어 표지를 행하였다. 이것을 바이오스핀(BioSpin) 컬럼 G-30(BIORAD)으로 정제하여 미반응의 [α-32P] dCTP를 제거한 후, 재차 96 ℃에 5 분간 둔 후에 얼음에 5 분간 넣어 DNA를 단일가닥으로 만들어, 방사성 동위원소 표지 인간 G3PDH DNA 프로브와 람다 DNA 프로브를 각각 얻었다.
방사성 동위원소 표지 프로브의 일부를 취하고, 섬광으로 방사 활성을 측정한 후, 총 방사 활성이 동일하게 되도록 인간 G3PDH 프로브와 람다 DNA 프로브의 비율을 조정하여 혼합하고, 이들을 상기 예비 혼성화액 중에 첨가하여 65 ℃에서 18 시간 두어 혼성화를 행하였다. 혼성화 후, 부직포를 새로운 24웰 플레이트로 옮기고, 이것에 0.5 ㎖의 2 x SSC, 1 ％ SDS를 첨가하여 65 ℃에서 10 분간의 세정을 행하고, 다음으로 0.5 ㎖의 0.1 x SSC, 1 ％ SDS를 첨가하여 65 ℃에서 10 분간의 세정을 총 2회 행하였다. 세정 후 부직포를 꺼내어 5 ㎖의 액체 신틸레이터가 들어간 바이알병으로 옮기고, 섬광 계수기로 부직포에 잔존하고 있는 방사 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 22에 나타내었다. G3PDH 프로브로 부직포 상의 게놈 DNA가 검출되고, 인간 G3PDH 프로브의 비율이 낮아짐에 따라서 검출된 방사 활성도 낮아졌고, 인간 G3PDH 프로브와 부직포 상의 인간 게놈에 포함되는 G3PDH 유전자의 특이적인 혼성화가 검출되는 경우가 나타났다.
[실시예 17] 부직포에 흡착된 핵산의 유리
0.25 ㎖의 동결 보존혈(백혈구 수 1.15 x 106개)를 실시예 11과 동일한 방법으로 처리하여, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01/HM-3 코트의 부직포를 준비하였다. 3 ㎖의 정제수를 흘려 부직포를 세정한 후, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어, 1.5 ㎖의 에펜도르프 튜브에 넣었다. 이것을 5개 조로 제조하고, 각각에 표 5에 기재한 용액을 첨가하여 각각의 온도, 시간으로 처리하였다. 95 ℃ 처리에는 가열 블럭을 사용하였다. 상대 용출량(％)란, TE 완충액 중에서 95 ℃, 20 분 처리했을 때에 용출된 핵산량을 100 ％로 하였을 때의 각 조건에서의 핵산 용출량이다. 표 5의 결과는, Mg2+이나 고농도의 염이 포함되는 용액 중에서는 95 ℃에서 가온하더라도 핵산은 유리되기 어렵고, 알칼리 변성의 조건하라도 실온에서는 핵산이 유리되기가 어렵다는 것을 나타내고 있다.
용액 온도(℃) 시간(분) 상대용출량(％)
TE 95 20 100
10 mM Tris(pH 8.0)/1 mM MgCl2 95 20 5
10 mM Tris(pH 8.0)/10 mM MgCl2 95 20 3
1 M NaCl/1 mM EDTA를 포함하는 PBS 95 20 4
0.05 N NaOH 25 10 2
[실시예 18] 부직포에 흡착된 핵산의 전자 현미경 사진
부직포 P03050을 사용하여, 실시예 14와 동일한 방법으로 핵산 흡착 필터를 제조하였다. 정제수를 흘려 부직포를 세정한 후, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어, 가장 상류(입구)측의 부직포를 1매 취하여 동결 건조기 DC-41(YAMATO 제조)을 이용하여 동결 건조시켰다. 또한, 혈액을 흘리지 않은 것을 제외하고는 동일한 조작을 한 부직포를 만들어 동결 건조시키고 이것을 대조군으로 하였다. 건조시킨 부직포를 약 5 mm 각으로 잘라내고, SEM용 시료대에 카본 페이스트를 사용하여 고정하였다. 이것을 풍건한 후, 오스뮴 플라즈마 코터 OPC-80(닛본 레이저 덴시 제조)을 이용하여 두께 20 nm에서 오스뮴 플라즈마 코팅을 행하여, 검경용 시료로 하였다. 이 시료를 전계 방사형 주사 전자 현미경 S-900(히타치 제조)으로 가속 전압 1 kV에서 SEM 관찰하였다. 도 23의 사진으로부터, 핵산은 섬유상이 되어 부직포 섬유의 표면에 흡착되어 있는 것으로 판명되었다.
[실시예 19] 계면활성제의 검토
실시예 5와 동일한 조건으로 실험을 행하여, 핵산 추출에 사용하는 계면활성제의 종류를 검토하였다. 부직포는 아사히 가세이(주)의 제품 A040C01의 HM-3 코트 제품을 사용하였다. 0.25 ㎖의 동결 보존혈 중의 백혈구 수는 1.50 x 106이었다. 0.25 ㎖의 동결 보존혈에, 37 ℃로 가온한 2x 분해 완충액(20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ 계면활성제)를 0.25 ㎖ 첨가하였다. 계면활성제는 이하에 기술하는 계면활성제로부터 어느 하나를 선택하여 사용하였다. 즉, 음이온성 계면활성제인 나트륨도데실술페이트(SDS), 양쪽성 계면활성제인 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS) 또는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산(CHAPSO), 비이온성 계면활성제인 폴리에틸렌글리콜 tert-옥틸페닐 에테르(트리톤 X-114), 폴리에틸렌글리콜 tert-옥틸페닐 에테르(트리톤 X-100), 폴리에틸렌 알킬에테르(Nissan Dispanol TOC), (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(Igepal CA630) 또는 논옥시놀-8.5(Nissan Nonion NS-208.5), 양이온성 계면활성제인 헥사데실피리디늄클로라이드(HPC), 헥사데실피리디늄브로마이드(HPB), 헥사데실트리에틸암모늄클로라이드(HTAC) 또는 헥사데실트리에틸암모늄브로마이드(HTAB) 중에서 어느 하나를 사용하였다. 2x 분해 완충액을 첨가한 후,프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 ㎍ 더 첨가하여, 이것을 37 ℃의 수조에서 때때로 가온하면서 볼텍스에서 교반하여 완전히 용해하였다. 실온에서 5 분 방치 후, 이 혈액 추출액을 부직포에 걸러 즉시 흡인 여과하였다. 다음으로, 동일한 계면활성제를 포함하는 분해 완충액을 8 ㎖ 흘려 필터를 세정하였다.
또한, 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 3 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 흘려 부직포를 세정하였다. 이로부터 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어, 뚜껑이 붙은 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.5 ㎖의 TE 완충액에 부직포를 침지하여 가열 블럭에서 95 ℃로 20 분 보온하였다.
부직포로부터 용출된 DNA의 양은, 실시예 9와 동일하게 올리그린(등록 상표) ssDNA 정량 키트를 이용하여 측정하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 사용한 경우에는 핵산을 정제할 수 있지만, 양이온성 계면활성제를 사용하면 핵산은 회수할 수 없었다.
[비교예 2] 부직포 이외의 다공질 필터
실시예 1과 동일한 조건으로 실험을 행하여, 부직포 이외의 다공질 필터가 핵산 정제에 사용 가능한지 여부를 검토하였다. 다공질 필터로서는 다공성 폴리우레탄 시트(임가드 III-RC의 메인 필터, 데루모) 또는 8 ㎛의 공경을 갖는 최상층이 SiCN으로 박막 코팅되어 있는 폴리카보네이트제 트랙 엣치드 멤브레인(OIA 플로우 쓰루(flow through)막, 미국 BioStar사 제조)를 사용하여, 대조군으로서 아사히 가세이(주)의 부직포 A040C01의 HM-3 코트 제품을 사용하였다.
필터를 직경 12 mm의 원반상으로 절단하여, 다공성 폴리우레탄 시트 또는OIA 플로우 쓰루막은 1매, 부직포 A040C01/HM-3은 4매 중첩하여 필터 홀더(SWINNEX, MILLIPORE)에 셋팅하였다. 필터 홀더의 상류에는 10 ㎖의 주사관, 하류에는 흡인 펌프를 설치하여 필터 홀더에 접속하였다. 최초에 3 ㎖의 분해 완충액(10 mM Tris pH 8; 100 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5 ％ SDS)로 필터를 세정하였다.
다음으로, 0.25 ㎖의 인간 혈액(백혈구 수 1.62 x 106개)에 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 ㎍ 가하고, 2x 분해 완충액(20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA: 1 ％ SDS)를 0.25 ㎖ 더 가하여 실온에서 5 분 방치하였다. 이 혈액 추출액을 필터에 걸러 즉시 흡인 여과하였다. 이하, 실시예 1과 동일하게 실험을 행하여, 용출된 핵산량을 흡광도로 측정하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 부직포 A040C01/HM-3과 비교하면 핵산의 회수량이나 순도는 뒤떨어지지만 다공성 폴리우레탄 시트를 사용한 핵산 정제는 가능하지만, OIA 플로우 쓰루막을 사용해서는 핵산을 정제할 수 없었다. 이것은, 공경이 8 ㎛ 정도의 다공질 필터라도 핵산 정제에 사용할 수 없는 경우가 있음을 나타내고 있다.
다공질 필터 DNA(㎍) A260/A280
다공성 폴리우레탄 시트 5.2 1.70
OIA 플로우 쓰루막 0.2 1.21
A040C01/HM-3 8.6 1.95
[실시예 20] 정제 게놈 DNA의 흡착 조건의 검토 -염의 영향-
정제 게놈 DNA를 이용하여, 부직포에의 DNA 흡착에 대한 용액 조성의 영향을 검토하였다. 게놈 DNA는 실시예 6에서 정제한 표준품을 사용하였다. 아사히 가세이(주)의 부직포 A040C01, A040C01의 HM-3 코트 제품, A066A, A040B, E01030 중 어느 하나를 직경 12 mm의 원반상으로 절단하고, 이것을 4매 중첩하여 필터 홀더(SWINNEX, MILLIPORE)에 셋팅하였다. 다음으로, 부직포를 3 ㎖ 에탄올과 3 ㎖ TE 완충액으로 세정하고, 마지막으로 샘플 완충액을 3 ㎖ 흘려 평형화하였다. 필터 홀더의 상류에 10 ㎖의 주사관을 부착하여 실린지 펌프 하버드 어페러터스 모델(HARVARD APPARATUS Model) 55-2219(HARVARD APPARATUS Inc)에 셋팅하였다.
정제 게놈 DNA를 용해시키는 샘플 완충액으로서는 10 mM Tris(pH 8)/1 mM EDTA/0 내지 1000 mM NaCl 또는 10 mM Tris(pH 8)/0 내지 100 mM MgCl2또는 0 내지 100 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.4), 또는 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.4)/0 내지 1000 mM (NH4)2SO4를 사용하였다. 약 800 ng의 정제 게놈 DNA를 5 ㎖의 샘플 완충액에 현탁시키고, 유속 26.2 ㎖/hr로 부직포에 통과시켰다. 또한, 6 ㎖의 샘플 완충액으로 세정하고 나서 3 ㎖의 TE 완충액을 흘렸다. 마지막으로 부직포를 필터 홀더로부터 떼어내어, 뚜껑이 붙은 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.5 ㎖의 TE 완충액을 가하였다. 이것을 95 ℃에서 30 분 보온한 후, TE 완충액을 회수하였다.
부직포로부터 용출된 DNA의 양은 실시예 9와 동일하게 올리그린(등록상표)의 ssDNA 정량 키트를 이용하여 측정하였다. 키트 부속의 18 잔기 올리고뉴클레오티드를 표준으로 하고, Ex 485 nm, Em 535 nm에서 형광 플레이트 리더 스펙트라 맥스 제미니 XS(SPECTRA MAX GEMINI XS; Molecular Devices사)로 측정하였다. 결과를 도 25, 도 26, 도 27, 도 28에 나타내었다. NaCl, MgCl2, 인산, (NH4)2SO4등의 염은 게놈 DNA의 흡착을 촉진시키는 것으로 판명되었다.
[실시예 21] 정제 게놈 DNA의 흡착 조건의 검토 2 -에탄올의 영향-
실시예 20과 동일한 방법으로, 부직포에의 DNA 흡착에 대한 에탄올의 영향을 검토하였다. 게놈 DNA는, 실시예 6과 동일한 방법으로 정제하였다. 부직포는 아사히 가세이(주)의 부직포 A040C01, A066A 또는 E01030을 사용하였다. 정제 게놈 DNA를 용해시키는 샘플 완충액으로서는, 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.4)/0 내지 40 ％ 에탄올을 사용하였다. 약 800 ng의 정제 게놈 DNA를 5 ㎖의 샘플 완충액에 현탁시키고, 유속 26.2 ㎖/hr로 부직포에 통과시켰다. 또한, 6 ㎖의 샘플 완충액으로 세정하고 나서 3 ㎖의 TE 완충액을 흘렸다. 마지막으로 부직포를 필터 홀더로부터 떼어내어, 뚜껑이 붙은 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.5 ㎖의 TE 완충액을 가하였다. 이것을 95 ℃에서 30 분 보온한 후, TE 완충액을 회수하였다.
부직포로부터 용출된 DNA의 양은 올리그린(등록 상표) ssDNA 정량 키트로 측정하였다. 도 29에 나타낸 바와 같이, 정제 게놈 DNA를 용해시키는 샘플 완충액에 에탄올을 첨가하면 DNA 회수량은 감소하였다.
[실시예 22] DNA의 진탕 흡착
정제 게놈 DNA 용액에 PET 부직포 또는 PET 평막을 첨가하여 진탕하고, DNA가 흡착하는지 여부를 검토하였다. 게놈 DNA는 실시예 6과 동일한 방법으로 정제하였다. 부직포는 아사히 가세이(주)의 부직포 A040C01, A066A 또는 E01030을 사용하였다. 직경 12 mm의 원반상으로 절단한 PET 부직포 또는 PET 평막 4매를 폴리프로필렌제의 15 ㎖ 시험관(IWAKI)에 넣었다. 이 시험관에 우선 3 ㎖의 에탄올을 첨가하여 부직포를 적셨다. 에탄올을 흡인하여 제거하고, 다음으로 3 ㎖의 TE 완충액을 첨가하여 부직포를 세정하고, 동일하게 흡인 제거하였다. 마지막으로, 동일하게 3 ㎖의 샘플 완충액으로 부직포를 처리하였다. 샘플 완충액으로는 10 mM Tris(pH 8)/1 mM EDTA/50 mM NaCl 또는 10 mM Tris(pH 8)/2 mM MgCl2또는 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.4), 또는 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.4)/0.2 내지 1.0 M (NH4)2SO4중 어느 하나를 사용하였다.
다음으로, 부직포가 들어간 시험관에 5 ㎖의 샘플 완충액을 첨가하고, 여기에 약 800 ng의 정제 게놈 DNA를 첨가하여 잘 교반하였다. 이 시험관을 믹스-로터(MIX-ROTAR) VMR-5(IUCHI)에 넣고, 80 rpm으로 30 분 처리하였다. 다음으로, 시험관내의 DNA 용액을 흡인 제거하고, 6 ㎖의 샘플 완충액을 첨가하고, 동일하게 80 rpm에서 15 분 처리하였다. 샘플 완충액을 제거한 후, 3 ㎖의 TE 완충액을 첨가하여 동일하게 80 rpm에서 15 분 처리하였다. 시험관으로부터 부직포를 추출하여 뚜껑이 붙은 에펜도르프 튜브에 넣고, 이것에 0.5 ㎖의 TE 완충액을 첨가하여 95 ℃에서 30 분 보온하였다. 부직포로부터 용출된 DNA의 양은, 올리그린(등록 상표) ssDNA 정량 키트를 이용하여 측정하였다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 게놈 DNA는 PET 부직포에 흡착하여 회수되지만, PET 평막에는 흡착되지 않았다. 이것은, 부직포라는 형상이 DNA 흡착에 중요하다는 것을 나타내고 있다.
또한, 도 31에서는 10 mM 인산에 대한 황산암모늄의 첨가 효과를 보았다.특히 부직포 E01030에서는, 황산암모늄이 DNA 흡착을 현저하게 촉진하였다. 또한, 이 진탕 흡착의 경우, 실시예 20의 여과 흡착과 다르고, A040C01보다 E01030쪽이 DNA를 양호하게 흡착하여, 약 8할의 DNA가 회수되었다. 이것은, 흡착의 조건에 따라서 핵산 정제에 최적인 부직포가 다름을 보이고 있다.
[실시예 23] 부직포의 스크리닝
실시예 1과 동일한 실험을 행하여 DNA 정제에 사용할 수 있는 부직포를 스크리닝하였다. 혈액은 5명의 정상인으로부터 채혈하고, 혈액 0.25 ㎖ 중의 백혈구 수는 0.94 내지 1.91 x 106개이었다. 사용된 부직포의 일람표를 표 7에 나타내었다. 이들은 모두 아사히 가세이(주)의 제품이다. 여기서, 평균 공경은 수은 포로시미터에 의해 측정하고, 평균 섬유경은 SEM 사진으로부터 산출하였다.
0.25 ㎖의 인간 혈액에 프로테이나제 K를 0.05 ㎍ 첨가하고, 2x 분해 완충액을 0.25 ㎖ 더 첨가하여 실온에서 5 분 방치하였다. 이하 실시예 1과 동일하게 처리하고, 마지막으로 3 ㎖의 TE 완충액을 흘려 부직포를 세정하였다. 이로부터, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내어, 뚜껑이 부착된 에펜도르프 튜브에 넣고 0.5 ㎖의 TE 완충액을 가하였다. 이것을 80 ℃에서 1 시간 보온한 후, TE 완충액을 회수하였다.
회수한 용액 중에 포함되는 핵산량은 TE 완충액으로 10 배에 희석한 후, 올리그린(등록 상표) ssDNA 정량 키트를 이용하여 측정하였다. 결과를 도 32에 나타내었다. 또한, 핵산의 순도는 용출액의 A260(260 nm의 흡광도)와 A280(280 nm의 흡광도)를 UV-1600 UV-가시광 분광광도계(Shimazu)로 측정하고, A260/A280을 구하여 평가하였다. 결과를 도 33에 나타내었다. 핵산의 회수량, 순도는 다르지만, 규격, 소재가 다른 여러가지 부직포가 핵산 정제에 사용 가능하였다.
[실시예 24] 부직포에 의해 정제된 핵산 정제품 중의 RNA
실시예 3에서 제조된 대장균 핵산 중에 RNA가 포함되는 것을 올리그린(등록 상표) ssDNA 정량 키트로 확인하였다. 올리그린 측정계는 DNA 뿐 아니라 RNA도 검출한다. 따라서, 핵산 용액을 RNase 처리하여 RNA를 선택적으로 분해한 후의 측정치와 RNase 미처리의 측정치를 비교하면, 핵산 용액에 포함되어 있는 RNA량을 어림할 수 있다. 이것은 rRNA를 이용한 대조군 실험으로 확인하였다.
부직포로부터의 용출액을 150 ㎕ 취하고, 이것에 소 췌장 DNase-비함유 RNase(Roche사, 상품 번호 1,119,915)를 0.375 ㎍/0.75 ㎕ 첨가하였다(최종 농도 2.5 ㎍/㎖). 대조군은 RNase 용액 대신에 TE 완충액을 첨가하여, 이하 동일하게 처리하였다. 37 ℃에서 30 분 인큐베이션한 후, 빙냉하여 TE 완충액으로 40 배 희석하고, 이 중 100 ㎕를 취하여 올리그린으로 정량하였다. RNase 미처리의 핵산량은 75.3 ㎍이었지만, RNase 처리하면 10.0 ㎍으로 감소하였다. 따라서, 핵산 용액에는 DNA 약 10 ㎍과 RNA 약 65 ㎍이 포함되어 있었던 것이 되므로, 부직포에 의해 DNA도 RNA도 정제 가능한 것으로 나타났다.
[실시예 25] 검체의 가열 처리
객담은 민간 봉사자로부터 채취하여 6 명분의 시료를 혼합하고, 0.2 ㎖씩 에펜도르프 튜브에 넣어 -20 ℃에서 동결 보존하였다. 또한, 대장균 DH5(TOYOBO)의 글리세롤 저장액으로부터 플라스틱제 일회용 백금이로 LB 배지(트립톤 펩톤(DIFCO) 1 g; 효모 추출물(DIFCO) 0.5 g; NaCl 1 g; 1 N NaOH 200 ㎕; 증류수 100 ㎖)에 균을 접종하였다. 이 액체를 37 ℃에서 16 시간 배양하여 A600=3.5의 배양액을 얻었다. 배양액 중의 대장균 농도는 흡광도로부터 약 1.4 x 1010개/㎖로 어림하였다. 이 배양액을 이용하여 2×106개/㎖, 2×105개/㎖, 2×104개/㎖의 균체 현탁액을 제조하였다. 앞서 분주한 객담 시료를 용해시키고, 그 용기에 상기 현탁액을 50 ㎕씩 첨가하여 대장균 첨가 객담 시료로 하였다.
부직포는 아사히 가세이(주)의 제품 A040CO1을 사용하였다. 부직포를 직경 12 mm의 원반상으로 절단하고, 이것을 4매 중첩하여 필터 홀더(SWINNEX, MILLIPORE)에 셋팅하여, 필터 홀더의 상류에는 10 ㎖의 주사관, 하류에는 흡인 펌프를 설치하여 필터 홀더에 접속하였다. 최초에 3 ㎖의 분해 완충액(10 mM Tris pH 8; 100 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5 ％ SDS)로 부직포를 세정하였다.
대장균 첨가 객담 시료에 2×분해 완충액(20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ SDS)를 0.25 ㎖를 첨가하여 98 ℃에서 1 분간 처리를 행하였다. 냉각 후, 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 mg을 첨가하고, 이것을 37 ℃의 수조 상에서 때때로 교반하면서 5 분 처리하였다. 이 대장균 첨가 객담 시료 추출액을 부직포에 걸러 흡인 여과하였다. 계속해서, 흡인하면서 8 ㎖의 분해 완충액을 흘려 필터를 세정하였다. 마지막으로, 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS, 1 mMEDTA, 3 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 흘려 부직포를 세정하였다. 그 후, 필터 홀더로부터 부직포 4매를 떼어내어, 가장 상류(입구)측의 부직포를 추출하여 에펜도르프 튜브에 넣었다. 이것에 0.2 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 첨가하여, 95 ℃에서 20 분간 처리하여 용출 조작을 행하였다. 이 용출액을 이용한 PCR 반응에 의해, 대장균 및 인간 유래의 DNA의 검출을 행하였다.
우선, 용출액 중의 대장균 DNA의 검출은 이하의 방법으로 행하였다. PCR의 프라이머에, 대장균의 ProteinPII 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열 1283번째인 g로부터 1302번째인 a까지의 서열(서열 5)과 염기 서열 2229번째인 t로부터 2248번째인 g까지의 상보쇄의 서열(서열 6)을 사용하여, 인비트로젠(Invitrogen)사에 의뢰하여 화학적으로 합성하였다. 용출액 10 ㎕를 PCR 반응액에 첨가하여, 총량을 25 ㎕로 만들었다(최종 농도 10 mM Tris/HCl pH 8.3; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.2 mM dTTP; 1.25 U Taq(시그마); 상기 프라이머 각 0.5 μM). 이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 2 분, 1 사이클; 94 ℃ 30 초, 55로 30 초, 72 ℃ 1 분, 40 사이클; 72 ℃ 5 분 반응시켰다.
또한, 용출액 중의 인간 유래 DNA의 검출은 이하의 방법으로 행하였다. PCR의 프라이머에, 인간 HGFR(간세포 생장 인자 수용체; hepatocyte Growth Factor receptor) 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열 483번째인 c로부터 502번째인 c까지의 서열(서열 7)과 염기 서열 1039번째인 c로부터 1058번째인 c까지의 상보쇄의 서열(서열 8)을 사용하여, 인비트로젠사에 의뢰하여 화학적으로 합성하였다. 용출액 10 ㎕를 PCR 반응액에 첨가하여 총량을 25 ㎕로 만들었다(최종 농도 10 mM Tris/HCl pH 8.3.; 50 mM KC1; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.2 mM dTTP; 1.25 U Taq(시그마); 상기 프라이머 각 0.5 μM). 이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 2 분, 1 사이클; 94 ℃ 30 초, 60로 30 초, 72 ℃ 1 분, 40 사이클; 72 ℃ 5 분 반응시켰다. 각각의 PCR을 종료 후, 각 반응액 10 ㎕에 10x 로딩 완충액을 1.5 ㎕ 첨가하여 잘 혼합하고, 총량을 1.5 ％ 아가로오스 (GIBCO BRL) 전기영동으로 분석하였다. 머피드 미니 겔 영동조(Advance)에서 100 V, 30 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 바이오이미지 겔 프린트 2000i/VGA로 촬영하였다. 결과를 도 34, 35에 나타내었다. 도 34로부터 알 수 있듯이, 대장균 첨가 객담 시료에 있어서, 시료 중에 103개 이상의 대장균이 존재하면, 대장균 유래의 966 bp의 PCR 산물이 증폭되었다. 도 35에 나타낸 바와 같이 인간 유래 577 bp의 PCR 산물은, 대장균의 첨가량에 관계없이 검출되었다. 따라서, 본 실시예에 나타낸 가열에 의한 시료의 처리와, 이에 계속되는 부직포에 의한 핵산 정제에 의해 시료 중에 존재하는 균 DNA가 추출 정제되어, 그의 검출이 가능한 것으로 확인되었다.
[실시예 26] 검체의 환원제 처리
실시예 25에 따라서 제조한 대장균 첨가 객담 시료에, 2× 분해 완충액(20mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ SDS)을 0.25 ㎖ 첨가하고, 10 ％ 디티오트레이톨 용액을 5 ㎕ 더 첨가하여 실온에서 교반하면서 2 분간의 처리를 행하였다. 그 후, 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 mg을 첨가하고, 이것을 37 ℃의 수조 상에서 때때로 교반하면서 5 분 처리하였다. 이 대장균 첨가 객담 시료 추출액을 부직포 A040C01에 걸러 흡인 여과하였다. 계속해서, 흡인하면서 8 ㎖의 분해 완충액을 흘려 필터를 세정하였다. 마지막으로, 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 3 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 흘려 부직포를 세정하였다.
그 후, 필터 홀더로부터 부직포 4매를 떼어내어, 가장 상류(입구)측의 부직포를 떼어내어 에펜도르프 튜브에 넣었다. 이것에 0.2 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 첨가하여, 95 ℃에서 20 분간 처리하여 용출 조작을 행하였다. 이 용출액을 이용하여, 실시예 25와 동일한 PCR 반응에 의해 대장균 및 인간 유래의 DNA의 검출을 행하였다. 결과를 도 36, 37에 나타내었다. 도 36으로부터 분명한 바와 같이, 대장균 첨가 객담 시료에 있어서, 시료 중에 103개 이상의 대장균이 존재하면, 대장균 유래의 966 bp PCR 산물이 증폭되었다. 또한, 도 37에 나타낸 바와 같이, 인간 유래 577 bp의 PCR 산물은 대장균의 첨가량에 관계없이 검출되었다. 따라서, 본 실시예에 나타낸 환원제에 의한 시료의 처리와, 이에 계속되는 부직포에 의한 핵산 정제에 의해 시료 중에 존재하는 균 DNA가 추출 정제되어, 그의 검출이 가능한 것으로 확인되었다.
[비교예 3] 가열 처리 또는 환원제 처리를 행하지 않고 대장균 첨가 객담 시료로부터 핵산을 정제하는 경우
실시예 25와 같이 하여, 대장균을 첨가한 객담 시료 및 핵산 흡착 필터를 제조하였다. 대장균 첨가 객담 시료에 2× 분해 완충액(20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ SDS)를 0.25 ㎖를 첨가한 후, 실시예 25에서 행한 가열 처리 또는 실시예 26에서 행한 환원제에 의한 처리를 행하지 않고, 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 mg을 첨가하여, 이것을 37 ℃의 수조 상에서 때때로 교반하면서 5 분 처리하였다. 이 때, 실시예 25 또는 실시예 26과는 달리, 객담은 투명하고 균일한 상태로 용해되지 않고 불균일하게 덩어리가 남아 탁해져 있는 상태이었다.
다음으로, 이 대장균 첨가 객담 시료 추출액을 부직포에 걸러 흡인 여과하였다. 이 때, 녹지 않고 남아 있었던 객담 성분의 덩어리가 부직포 표면 상에 붙어버려 흡인 여과가 곤란하였다. 또한, 흡인을 계속하면, 액체 부분은 흡인 여과되었지만, 부직포 표면 상에 붙어버린 객담 성분의 덩어리를 완전히 여과할 수는 없으므로, 이후의 조작을 계속하는 것이 곤란하였다.
[실시예 27] 부직포 상에서의 핵산 신장 반응
부직포 상에 흡착된 게놈 DNA를 주형으로 하여, 부직포 상에서 핵산 신장 반응이 일어나는지 여부를 조사하였다. DNA의 DIG 표지는 PCR DIG 프로브 합성 키트(Roche)와 PCR DIG 표지 혼합물(Roche)를 사용하고, 혼성화와 검출에는 DlG 하이 프라임 DNA 표지/검출 키트(Roche)를 사용하였다.
0.25 ㎖의 동결 보존혈(백혈구 수 1.15 x 106개)를 실시예 11과 동일한 방법으로 처리하여, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01/HM-3 코트의 부직포를 준비하였다. 3 ㎖의 TE 완충액을 흘려 부직포를 세정한 후, 이 부직포를 0.2 ㎖의 DIG Easy Hyb 완충액(Roche)을 포함하는 24웰 플레이트에 넣어 42 ℃에서 2 시간 두었다. 이것에, 닛본 바이오서비스사에 의뢰하여 화학적으로 합성한 서열 9의 DNA 프라이머 bACT1과 서열 10의 DNA 프라이머 bACT2를 첨가하여 42 ℃에서 18 시간 두었다. 적당한 세정액으로 세정하여 여분의 프라이머를 제거한 후, 효소 반응액(최종 농도 1.5 mM MgCl2를 포함하는 PCR 완충액; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.19 mM dTTP; 0.01 mM 디그옥시제닌-11-dUTP: 5U 클레나우의 큰 단편(BioLabs))를 200 ㎕ 첨가하여 37 ℃에서 18 시간 두었다. 적당한 세정액으로 세정하고, 알칼리 포스파타아제 표지 항-DIG 항체를 반응시켜, NBT/BCIP 기질로 핵산 신장 반응 중에 받아들인 DIG를 검출하였다. 그 결과를 도 38에 나타내었다. 첨가한 프라이머의 양에 의존하여 검출가능한 신호가 증가하고 있어, 부직포 상에서 프라이머 의존적으로 핵산 신장 반응이 발생하고 있는 것으로 나타났다.
[실시예 28] LAMP법에 의한 부직포 상에서의 핵산의 증폭 및 검출
부직포 상에 흡착된 게놈 DNA를 주형으로 하여, LAMP법에 의한 핵산의 증폭이 가능한지 여부를 조사하였다. LAMP법은 루프앰프 소 배아 성 판별 키트(에이껭 가가꾸)를 사용하였다. 우선, 이하의 방법으로 소 게놈 DNA를, 부직포로서 아사히 가세이(주)의 제품 A040C01에 흡착시켰다. 0.25 ㎖의 소 보존 혈액((주)닛본 바이오 테스트 연구소)에 37 ℃로 가온한 2x 분해 완충액(20 mM Tris pH 8; 200 mM NaCl; 50 mM EDTA; 1 ％ SDS)을 0.25 ㎖ 가하고, 프로테이나제 K(PCR-등급, Roche)를 0.05 ㎍ 더 가하여, 이것을 37 ℃의 수조에서 때때로 가온하면서 볼텍스에서 교반하여 완전히 용해시켰다. 실온에서 5 분 방치 후, 이 혈액 추출액을 부직포에 걸러 즉시 흡인 여과하였다. 이로부터, 흡인하면서 8 ㎖의 분해 완충액을 흘려 필터를 세정하였다. 다음으로, 3 ㎖의 1 M NaCl을 포함하는 PBS/1 mM EDTA, 3 ㎖의 TE 완충액(10 mM Tris pH 8; 1 mM EDTA)를 흘려 부직포를 세정하였다. 이 부직포를 사방 3 mm의 크기로에 재단하여 이것을 0.5 ㎖ 마이크로튜브에 넣었다. 이것을 루프앰프의 반응 혼합물 II 40 ㎕과 Bst DNA 중합효소 1 ㎕를 첨가하여, 63 ℃에서 인큐베이션을 행하였다. 1 시간 후 증폭 용액의 탁도를 조사하고, 일부를 아가로오스 전기영동으로 분석하였다. 그 결과, LAMP법에 의해 부직포에 흡착된 소 게놈 DNA를 주형으로 한 핵산 증폭이 발생하는 것으로 나타났다(도 39).
[실시예 29] 용출 게놈 DNA의 혼성화
실시예 9 및 11에서 나타낸 용출법으로 얻어진 게놈 DNA가 혼성화에 사용 가능한지 여부를 조사하였다. 우선, 인간 게놈 DNA(클론테크) 1 ㎍에 바이오틴 켐-링크(Roche)를 1 ㎕와 총량이 20 ㎕가 되도록 물을 첨가하고, 85 ℃에서 1 시간 인큐베이션을 행한 후, 5 ㎕의 반응 정지액을 첨가하여 바이오틴 표지 게놈 DNA 용액을 얻었다. 다음으로, 각 용출법으로 얻은 게놈 DNA를 나일론 필터 하이본드 N+(Amercham-Pharmacia)에 도트 블롯팅하여, 알칼리액에 의한 변성과 UV 가교결합에 의한 고정화를 행하였다. 이것에 혼성화 용액 Easy Hyb(Roche)을 첨가하여 42℃에서 1 시간 혼성화를 행한 후, 상기 바이오틴 표지 게놈 DNA를 첨가하고 42 ℃에서 18 시간 혼성화를 행하였다. 세정을 행한 후, 알칼리 포스파타아제 표지 아비딘을 반응시키고, 다음으로 알칼리 포스파타아제 기질 CSPD(Roche)을 첨가하여 반응시키고, 적당한 시간 동안 X선 필름에 노광하여 신호의 검출을 행하였다. 도 40 및 도 41에 나타낸 바와 같이, TE 완충액, 알칼리, 과산화수소 중 어느 하나의 용출법으로 얻어진 게놈 DNA도 혼성화에 사용 가능하였다.
[실시예 30] 용출 게놈 DNA를 프로브로 사용한 혼성화
실시예 9 및 11에서 나타낸 용출법으로 얻어진 게놈 DNA가 혼성화용 프로브로서 사용 가능한지 여부를 조사하였다. 우선, 부직포로부터 용출시킨 인간 게놈 DNA 각 1 ㎍에 바이오틴 켐-링크(Roche)를 1 ㎕와 총량이 20 ㎕가 되도록 물을 첨가하고, 85 ℃에서 1 시간 인큐베이션을 행한 후, 5 ㎕의 반응 정지액을 첨가하여 바이오틴 표지 용출 게놈 DNA 용액을 얻었다. 다음으로, 인간 게놈 DNA(클론테크)와 DNA(Takara)를 나일론 필터 하이본드 N+(Amercham-Pharmacia)에 도트 블롯팅하여, 알칼리액에 의한 변성과 UV 가교결합에 의한 고정화를 행하였다. 이것에 혼성화 용액 Easy Hyb(Roche)을 첨가하여 42 ℃에서 1 시간 혼성화를 행한 후, 상기 바이오틴 표지한 각종 용출법의 게놈 DNA를 첨가하고 42 ℃에서 18 시간 혼성화를 행하였다. 세정을 행한 후, 알칼리 포스파타아제 표지 아비딘을 반응시키고, 다음으로 알칼리 포스파타아제 기질 CSPD(Roche)을 첨가하여 반응시키고, 적당한 시간 동안 X선 필름에 노광하여 신호의 검출을 행하였다. 결과를 도 42에 나타내었다. TE 완충액, 알칼리, 과산화수소 중 어느 하나의 용출법으로 얻어진 게놈 DNA도 혼성화용 프로브로서 사용 가능하였다.
[실시예 31] 계면활성제에 의한 핵산 용출
0.25 ㎖의 동결 보존혈(백혈구 수 1.16 x 106개)를 실시예 11과 동일한 방법으로 처리하여, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01의 부직포를 준비하였다. 5 ㎖의 TE 완충액을 흘려 부직포를 세정한 후, 부직포 4매를 필터 홀더로부터 떼어내고, 1.5 ㎖의 에펜도르프 튜브에 넣었다. 이것에 실시예 19에서 사용한 계면활성제 중에서 양쪽성 계면활성제인 CHAPS, CHAPSO, 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-114, 트리톤 X-100, 닛산 디스파놀(Nissan Dispanol) TOC, 이게팔(Igepal) CA630, 닛산 노니온(Nissan Nonion) NS-208.5를 선택하여, 이들의 0.5 ％ 수용액을 0.5 ㎖ 첨가하였다. TE 완충액을 0.5 ㎖ 더 첨가한 계를 준비하였다. 이들을 80 ℃에서 20 분간 가열하여, 부직포에 흡착된 핵산을 용출하였다. 부직포로부터 용출된 DNA량은 실시예 9와 동일하게 올리그린(등록 상표) ssDNA 정량 키트를 이용하고, 용출액을 TE 완충액으로 10 배로 희석하여 측정하였다. 결과를 도 43에 나타내었다. TE 완충액 중에서 95 ℃ 20 분간 가열했을 때의 용출량을 100 ％로서 나타내었다. TE 완충액을 이용한 경우와 비교하면, 어떤 계면활성제도 핵산 용출을 촉진시켰다.
용출된 핵산을 전기영동한 결과를 도 44에 나타내었다. 용출된 핵산을 뉴클레오스핀 컬럼으로 농축하고, 그 중 10 ㎕를 0.7 ％ 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 계면활성제의 존재하에 용출된 핵산은 TE 완충액으로 용출된 핵산과 같은 분자량을 가지고 있었다. 다음으로, 계면활성제의 존재하에 용출된 정제 DNA가 PCR의 주형이 될 수 있는가를 확인하였다. PCR과 그의 분석은 실시예 2와 동일하게 행하였지만, 프라이머는 클론테크사의 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나제(G3PDH) 콘트롤 앰플리머 세트(카탈로그 번호 5406-3)를 사용하였다. 결과를 도 45에 나타내었다. 계면활성제로 용출시킨 정제 DNA로부터도 983 bp의 PCR 산물이 증폭되어 있어, PCR의 주형으로서 사용 가능한 것으로 나타났다.
[참고예 3] 계면활성제의 PCR에 대한 영향
음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 PCR에 미치는 영향을 조사하였다.
PCR의 프라이머로서, 서열 11에 기재된 합성 DNA를 5' 프라이머, 서열 12에 기재된 합성 DNA를 3' 프라이머로 하여, 각각 최종 농도가 0.4 μM가 되도록, 인간 게놈 DNA(클론테크) 5 ng을 포함하는 PCR 반응액(최종 농도 10 mM Tris-HCl pH 8.3; 50 mM KCl: 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dATP; 0.2 mM dGTP; 0.2 mM dCTP; 0.2 mM dTTP; 0.5 U 앰플리 택(Applied Biosystems))에 첨가하였다.
이것에, 실시예 19에서 사용된 음이온성 계면활성제인 SDS, 양쪽성 계면활성제인 CHAPS, CHAPSO, 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-114, 트리톤 X-100, 닛산 디스파놀 TOC, 이게팔 CA630 또는 닛산 노니온 NS-208.5를 각각 최종 농도가 1 ％, 0.5 ％, 0.1 ％가 되도록 첨가하여 PCR의 반응액을 20 ㎕로 만들었다.
이것을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer)에서 94 ℃ 3 분 1 사이클; 94 ℃ 30 초, 60 ℃ 1 분, 72 ℃ 3 분, 30 사이클; 72 ℃ 7 분 반응시켰다. PCR 종료 후,반응액 5 ㎕에 10 x 로딩 완충액을 1 ㎕ 첨가하여 잘 혼합하고, 총량을 1.5 ％ 아가로오스 전기영동으로 분석하였다. 50 V로 45 분간 영동한 후, 겔을 에티듐브로마이드로 염색하고, 바이오이미지 겔 프린트 72000i/VGA로 촬영하였다. 결과를 도 46에 나타내었다.
용출시에 사용한 농도의 계면활성제 중, SDS 이외에는 PCR에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 한편 SDS는 0.1 ％라도 PCR에 영향을 주는 것으로 나타났다.
〔실시예 32〕부직포에 흡착시킨 핵산의 바이오틴화
부직포 상에 흡착된 핵산을 직접 표지하는 것이 가능한지 여부를 조사하였다. 0.25 ㎖의 동결 보존혈(백혈구 수 1.16 x 106개)를 실시예 11과 동일한 방법으로 처리하여, 인간의 핵산이 흡착된 A040C01의 부직포를 준비하였다. 이것을 4등분으로 절단하여 0.5 ㎖ 마이크로튜브에 넣고, 95 ㎕의 물과 5 ㎕의 바이오틴 켐-링크(Roche)에 가하고, 85 ℃에서 1 시간 두어 바이오틴화를 행하였다. 상청액을 다른 튜브로 옮기고, 95 ℃에서 5 분간 두어 핵산을 단일가닥으로 만든 후 빙냉시켜 프로브 1이라 하였다. 바이오틴 켐-링크을 반응시킨 상술한 부직포를 100 ㎕의 TE 완충액을 넣은 튜브로 옮겨 95 ℃에서 20 분간 두고, 부직포로부터 핵산 용출과 핵산의 단일가닥화를 동시에 행하였다. 그 후 이것을 빙냉하여 프로브 2라 하였다. 100 ng 내지 0.1 ng의 인간 게놈 DNA(클론테크)과 람다 DNA(Takara)를 하이본드 N+(Amercham-Pharmacia)에 도트 블롯팅하여, 알칼리 변성과 UV 가교결합에 의한 고정화를 행하였다. 이것을 적당한 밀폐 용기로 옮겨 Easy Hyb(Roche)를 첨가하였다. 42 ℃에서 1 시간 둔 후, 1 ㎖의 Easy Hyb에 대하여 20 ㎕의 프로브 1 또는 프로브 2를 첨가하고, 계속해서 42 ℃에서 18 시간 두어 프로브를 혼성화시켰다. 이것을 2X SSC, 0.1 ％ SDS를 사용하여 실온에서 5 분간의 세정을 2회 행한 후, 0.1X SSC, 0.1 ％ SDS를 사용하여 68 ℃ 15 분간의 세정을 2회 행하였다. 다음으로, 세정 완충액(최종 농도 0.1 M 말레산; 0.15 M NaCl; 0.3 ％ 트윈 20 pH 7.5)으로 1 분간 평형화시킨 후, 말레산 완충액(최종 농도 0.1 M 말레산; 0.15 M NaCl pH 7.5)으로 10 배로 희석한 블로킹 용액(Roche)에 1 시간 침지하였다. 5 ㎖의 액량에 대하여 1 ㎕의 알칼리포스파타아제 표지 아비딘(CALBIOCHEM)을 첨가하고, 천천히 침투시키면서 실온에서 30 분간 두었다. 세정 완충액을 이용하여 실온에서 15 분간의 세정을 2회 행하고, 다음으로 알칼리포스파타아제 완충액(최종 농도 0.1 M Tris pH 9.5; 0.1 M NaCl; 50 mM MgCl2)으로 2 분간 평형화시키고, 이것에 2/100 용적의 NBT/BCIP(Roche)를 첨가하여 발색 반응을 행하였다. 그 결과를 도 47에 나타내었다. 프로브 1, 프로브 2 모두 하이본드 N+ 막 상에 도트 블롯팅된 인간 게놈 DNA에 혼성화되어 있어, 부직포 상에 포획된 핵산이 바이오틴 표지되어 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 방법에 따르면, 백혈구나 세균 등의 세포를 포함하는 시료로부터 핵산을 쉽게 정제하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명을 이용하면, 핵산이 흡착된 필터로부터 신속하게 핵산을 용출할 수 있다. 마지막으로 본 발명의 방법에 따르면, 부직포를 이용하여 백혈구나 세균 등의 세포를 포함하는 시료로부터 핵산을 신속하게 정제하고, 또한, 그 부직포 상에서 핵산 증폭이나 염기 서열 검출 등을 직접 행하는 것이 가능하다. 이로부터, 시료의 처리로부터 핵산 증폭 또는 염기 서열 검출에 이르는 공정의 간소화가 가능해지고, 단시간에 처리할 수 있게 되었다.
<서열 목록 설명>
서열 1: 합성 DNA
서열 2: 합성 DNA
서열 3: 합성 DNA
서열 4: 합성 DNA
서열 5: 합성 DNA
서열 6: 합성 DNA
서열 7: 합성 DNA
서열 8: 합성 DNA
서열 9: 합성 DNA
서열 10: 합성 DNA
서열 11: 합성 DNA
서열 12: 합성 DNA

Claims (50)

  1. (1) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
    (2) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정; 및
    (3) 부직포로부터 핵산을 용출시키는 공정
    을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도 범위에서 가열하여 핵산을 용출시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 pH 12 이상의 알칼리 조건하에 처리하여 핵산을 용출시키는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 단편화하여 용출시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 활성 산소를 이용하여 핵산을 단편화하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 환원당에 2가의 금속 이온을 첨가하여 발생시킨 활성 산소를 이용하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 활성 산소가 과산화수소인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 과산화수소에 2가의 금속 이온을 첨가하여 발생시킨 활성 산소를 이용하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 효소를 이용하여 핵산을 단편화하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산을 계면활성제로 처리하여 용출시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제 또는 양쪽성 계면활성제인 방법.
  12. (1) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
    (2) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정;
    (3) 상기 부직포에 핵산을 증폭하기 위한 용액을 첨가하여, 상기 부직포에 흡착된 핵산을 주형으로 하여 핵산을 증폭시키는 공정; 및
    (4) 상기 반응액을 회수하는 공정
    을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 증폭시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, PCR(중합효소 연쇄 반응; Polymerase Chain Reaction)법 또는 LAMP(루프-매개 등온 증폭; Loop-Mediated Isothermal Amplification)법으로 핵산을 증폭시키는 방법.
  14. (1) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
    (2) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정;
    (3) 상기 부직포에 염기 서열을 검출하기 위한 용액을 첨가하여 반응시키는 공정; 및
    (4) 상기 반응액을 측정하는 공정
    을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 특정한 염기 서열을 검출하는 방법.
  15. (1) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
    (2) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정;
    (3) 상기 부직포에 염기 서열을 검출하기 위한 용액을 첨가하여 반응시키는 공정; 및
    (4) 상기 부직포 표면을 측정하는 공정;
    을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 특정한 염기 서열을 검출하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, PCR법 또는 LAMP법으로 염기 서열을 검출하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 프로브를 사용한 혼성화(hybridization)로 특정한 염기 서열을 검출하는 방법.
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서, 프라이머와 핵산 합성 효소에 의한 핵산 신장 반응으로 특정한 염기 서열을 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 핵산 신장 반응시에 표지 뉴클레오티드를 혼입시켜 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 핵산 신장 반응으로 생성된 피로인산을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. (1) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정; 및
    (2) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정
    을 포함하는, 세포의 핵산이 흡착된 부직포를 제조하는 방법.
  22. (1) 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정;
    (2) 세포 추출액을 부직포에 접촉시켜, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정; 및
    (3) 상기 부직포에 핵산을 표지하기 위한 용액을 첨가하여 반응시키는 공정;
    을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하여 핵산을 표지하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 바이오틴, 형광 또는 합텐으로 핵산을 표지하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 부직포에 흡착된 핵산 그 자체를 표지하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 부직포의 소재가 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 나일론인 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 부직포의 소재가 폴리에틸렌 테레프탈레이트인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 부직포의 공경이 2 내지 150 ㎛인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 부직포의 섬유경이 0.3 내지 20 ㎛인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 점도 증가제, 카오트로픽제 (chaotrophic agent) 및 알코올을 포함하지 않는 세포 추출액을 사용하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 염을 포함하는 세포 추출액을 사용하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 암모늄염, 인산염, 황산염 또는 염산염인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 염화나트륨이며, 그의 농도가 10 mM 내지 1000 mM인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 염화마그네슘이며, 그의 농도가 1 mM 내지 100 mM인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 인산나트륨이며, 그의 농도가 2 mM 내지 100 mM인 방법.
  35. 제30항에 있어서, 세포 추출액에 포함되는 염이 황산암모늄이며, 그의 농도가 20 mM 내지 1000 mM인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 포함하는 세포 용해액을 사용하는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정을 80 ℃ 내지 110 ℃의 온도 범위에서 행하는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 파괴하여 세포 추출액을 제조하는 공정을 환원제의 존재하에 행하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 환원제가 티올기를 포함하는 화합물인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 추출액을 부직포에 접촉시키는 방법이 여과인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 추출액 중의 핵산을 부직포에 흡착시키는 공정 후에 부직포를 세정하는 공정이 계속되는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 카오트로픽제 및 알코올을 포함하지 않는 용액으로 부직포를 세정하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 세포 용해액으로 부직포를 세정하는 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 0.5 M 내지 2 M 농도 범위의 염 용액으로 부직포를 세정하는 방법.
  45. (1) 부직포를 조립한 장치; 및 (2) 세포 용해액과 핵산 용출액 중 어느 하나를 포함하는 용액을 포함하는, 세포를 포함하는 시료로부터 세포의 핵산을 제조하기 위한 키트.
  46. (1) 부직포를 조립한 장치; 및 (2) 세포 용해액과 세정액 중 어느 하나를 포함하는 용액을 포함하는, 세포로부터 핵산을 추출하여 상기 핵산이 흡착된 부직포를 제조하기 위한 키트.
  47. 고체 표면에 흡착된 핵산을 pH 12 이상의 알칼리 조건하에 처리하여 용출시키는 방법.
  48. 고체 표면에 흡착된 핵산을 활성 산소로 처리하여 용출시키는 방법.
  49. 고체 표면에 흡착된 핵산을 계면활성제로 처리하여 용출시키는 방법.
  50. 핵산이 흡착된 부직포.
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