KR20020037140A - 지질 저하 활성을 갖는 플라보노이드를 포함하는 터몹시스알터니플로라 추출물 및 이를 유효 성분으로 하는 약학적조성물 - Google Patents
지질 저하 활성을 갖는 플라보노이드를 포함하는 터몹시스알터니플로라 추출물 및 이를 유효 성분으로 하는 약학적조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 플라보노이드류 (flavonoids)를 활성 성분으로 포함하며, 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내 지질 농도를 저하시키는 활성을 나타내는터몹시스 알터니플로라(Thermopsis alterniflora) 추출물 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로터몹시스 알터니플로라의 알콜 추출물은 류트올린 (luteoline), 크리소에리올 (chrysoeriol), 포르모노네틴 (formononetin), 시나로시드 (cynarosid), 아피제닌 (apigenin) 및 터몹소시드 (thermopsozid) 등의 플라보노이드 화합물을 포함하며, 이들 플라보노이드 화합물 각각의 활성의 합에 비해 월등히 높은 지질 농도 저하 활성 (lipidemic activity)을 나타내므로, 지질의 축적 또는 지질 대사의 이상에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 약학적 조성물의 유효 성분으로서 효과적으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 플라보노이드류 (flavonoids)를 활성 성분으로 포함하며, 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내 지질 농도를 저하시키는 활성을 나타내는터몹시스 알터니플로라(Thermopsis alterniflora) 추출물 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
혈액 중에 과량의 지질이 함유되어 있는 질환을 고지혈증 (hyperlipidemia)이라 하며, 지질 (lipid)은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 비에스테르화 지방산, 지단백질 (lipoprotein) 및 인지질 등을 포함한다. 특히, 콜레스테롤과 트리글리세라이드는 단백질과 결합하여 지단백질을 형성하기도 한다. 고지혈증은 동맥경화증, 심장 관련 질병, 뇌혈관 질환 등을 유발시킬 수 있으므로, 지질 농도를 감소시킬 수 있는 물질은 약학적으로 매우 유용하다.
플라보노이드 (flavonoid)는 식물 등 자연계에 널리 분포하는 페놀계 화합물의 하나로, 2-페닐-1-벤조피란-4-온 (2-phenyl-1-benzopyran-4-one)의 유도체들로 구성된다. 플라보노이드는 생명체의 수많은 생물학적, 화학적 과정들의 조절에 있어 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 대부분의 플라보노이드 화합물은 독성이 없고 지질대사 개선, 모세혈관의 강화, 항염증, 담즙 배출, 심혈관계의 보호, 항산화 활성 등 매우 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다 (Meyeret al.,Angiology 45:579-584, 1994; Emimet al.,J. Pharm. Pharmacol. 46:118-122, 1994; Saijaet al.,Free Radical Biol. Med. 19:48-486, 1995; Kaul.et al.,J. Med. Virol.15:71-79, 1985).
플라보노이드의 지질대사 개선 효과와 관련되어, 플라보노이드는 지질 함량 감소 효과 및 지방 교환의 교란과 지단백질의 조성을 정상화시키고, 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis) 및 죽종증 (atheromatosis)에 대한 치료 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 아스트라갈러스 속 (Astragalus) 73종, 아스파르셋 속 (Asparcet) 5종, 콩과류 등의 식물에서 추출된 개별 플라보노이드 추출액과 총 플라보노이드 추출액은 지혈증 억제 활성 (lipidemic activity)을 갖는 것으로 알려져 있은데, 이들 플라보노이드 추출물을 투여하면 총 콜레스테롤 농도의 감소, 저밀도 지단백질 및 초저밀도 지단백질의 감소, 간 및 대동맥에서의 콜레스테롤 함량의 감소가 일어난다.
이와 같이 플라보노이드 화합물이 저독성 물질로서 담즙배출물질, 항질소혈증제 (hypoazitemic pharmaceuticals), 간장보호제, 혈중 지방 저하제로 사용될 가능성이 지적되어 왔으므로, 플라보노이드를 기반으로 한 의약품은 지혈증 억제제 및 항아테롬성 동맥경화증 제제로 유용하게 사용될 것이다.
이에 본 발명자들은 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내에서 지질 농도를 저하시키는 활성을 나타내는 새로운 식물 추출물을 찾고자 연구한 결과, 플라보노이드를 함유하는터몹시스 알터니플로라추출물이 지질 함량 저하에 뛰어난 효과가 있을 뿐만 아니라, 개별 활성 성분에 의한 효과보다 월등히 높은 지질 농도 저하 활성을 보임을 확인하고, 상기 추출물을 지질의 축적 또는 지질 대사의 이상에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방에 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내에서 지질 농도를 저하시키는 활성을 나타내어 지질의 축적 또는 지질 대사의 이상에 의해 유발되는 지혈증과 동맥경화증 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있는 식물 추출물 및 이를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은터몹시스 알터니플로라추출물 (이하 "FL006"라 한다)에 함유되어 있는 6 종의 주요 플라보노이드 화합물의 화학 구조식을 나타낸 것이고,
도 2는 FL006에 의한 정상 동물의 혈청 중 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량 저하 효과를 나타내는 그래프이고,
도 3은 토끼의 아테롬성 동맥경화증에 대한 FL006의 효과를 나타내는 그래프이고,
I: 대동맥 아테롬성 동맥경화증 치유 계수
II: 혈청 중 콜레스테롤 함량
III: 치유 동물의 비율
IV: 대동맥 아테롬증 침투 계수
*: 대조군에 대한 신뢰도가 0.05이하인 경우 (P < 0.05)
도 4는 아테롬성 동맥경화증 토끼의 젖산 (lactate)과 피루브산 (pyruvate)의 함량 및 잉여 젖산에 대한 FL006의 영향을 나타낸 그래프이고,
도 5는 다양한 원인의 지혈증에서 콜레스테롤, β-지단백질, 트리글리세라이드, 비에스테르화 지방산 등의 함량 감소에 대한 FL006의 효과를 나타낸 그래프이고,
도 6은 브라디키닌 (bradikinin), 히스타민 (histamine), 오브알부민 (ovalbumin) 투여에 따른 혈관 투과성 변화에 대한 FL006의 영향을 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내에서 지질 농도를 저하시키는 활성을 나타내며, 플라보노이드를 활성 성분으로 포함하는터몹시스 알터니플로라(Thermopsis alterniflora) 추출물을 제공한다.
상기 추출물은 류트올린 (luteoline; 5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone), 크리소에리올 (chrysoeriol; 5,7',4'-trihydroxy-3'methoxyflavone), 포르모노네틴 (formononetin; 7-hydroxy-4'-methoxyisoflavone), 시나로시드 (cynarosid; luteolin-7-O-β-D-glucoside), 아피제닌 (apigenin; 5,7',4'-trihydroxyflavone) 및 터몹소시드 (thermopsozid; chrysoeriol-7-O-β-D-glucoside)로부터 선택되는 하나 이상의 플라보노이드 화합물을 포함할 수 있다. 이들 플라보노이드 화합물들의 화학 구조식은 도 1에 나타난 바와 같다.
또한, 본 발명은 류트올린, 크리소에리올, 포르모노네틴, 시나로시드, 아피제닌 및 터몹소시드로부터 선택되는 둘 이상의 플라보노이드 화합물로 구성된 플라보노이드 조성물 또는 상기터몹시스 알터니플로라추출물을 유효성분으로 하며, 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내에서 지질의 축적 또는 지질 대사의 이상에 의해 발생하는 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 사용되는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 지질은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 비에스테르화 지방산, 인지질 또는 지단백질 등이 있으며, 특히 지혈증 (lipidemia)이나 동맥경화증을 일으킬 수 있는 지질 종이 바람직하다.
상기 플라보노이드 조성물 또는터몹시스 알터니플로라추출물은 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 저하, 아테롬원 지단백질 저하, 생체 내 산화-환원계 및 에너지 공급의 정상화, 항응고, 혈관 투과성 감소, 항염증 및 항산화 등의 효과를 나타낸다. 이를 통해 지질의 축적 또는 지질 대사의 이상에 의해 발생하는 내인성 지혈증, 에탄올 지혈증, 트리톤 지혈증, 아드레날린 지혈증, 메틸우라실 지혈증 등의 다양한 지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 동맥경화증, 동맥경화증으로 인한 합병증, 지방간 또는 간 손상 등의 치료 및 예방에 이용될 수 있으며, 항응고 요법, 혈관 투과성 억제 요법, 항염증 요법 및 항산화 요법 등에도 사용될 수 있다.
터몹시스 알터니플로라의알콜 추출물은 11 종류의 플라보노이드 화합물을 포함하고 있는데, 상기의 류트올린, 크리소에리올, 포르모노네틴, 시나로시드, 아피제닌 및 터몹소시드 등 6종의 주요 플라보노이드 화합물이 총 플라보노이드 함유량의 95 중량%를 차지한다. 따라서,터몹시스 알터니플로라로부터 플라보노이드를 다량 포함하는 추출물을 얻는 것이 안정성 및 비용 면에서 유리하다.본 발명의 플라보노이드 추출물은터몹시스 알터니플로라의 분쇄물을 수욕 추출하여 수용성 알칼로이드를 제거한 후, 알콜, 보다 바람직하게는 에탄올에 의해 추출된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의터몹시스 알터니플로라의알콜 추출물은 상기와 같은 성질을 갖는 플라보노이드를 활성 성분으로 하며, 개별 플라보노이드 화합물의 합보다 월등히 우수한 지질 감소 활성을 나타내므로 지혈증 억제제 및 항아테롬성 동맥경화증 제제로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명자들은 정상 동물과 지혈증을 가진 동물에서 상기 플라보노이드의 지혈증 억제 활성을 측정하고 동맥경화증에 대한 다양한 지표를 측정하여, 상기 플라보노이드 화합물의 유용성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한편, 본 발명은 비독성, 불활성, 제약상 적합한 부형제 이외에, 본 발명에 따른터몹시스 알터니플로라추출물 및 그 유효 성분으로 이루어지는 제약 조성물 및 이 조성물의 제조 방법을 포함한다. 본 발명의 식물 추출물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
비독성이고 불활성인 제약상 적합한 부형제는 고상, 준고상 또는 액상 희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형 보조물이며, 바람직한 제형으로는 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 및 분무제 등이 포함된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
본 발명의 지질의 축적 또는 지질대사 이상에 의해 유발되는 각종 질병의 치료제용 약학적 조성물에서 본 발명에 따른터몹시스 알터니플로라추출물의 유효용량은 30∼100 mg/kg 이고, 바람직하게는 50∼75 mg/kg 이다. 투여는 치료할 객체의 체질 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질, 및 투여기간 또는 간격을 고려해서 변화시킬 수 있으나 일반적으로 5~100 ㎎/dose로, 하루 3회, 2 주∼4 개월 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 플라보노이드를 포함하는터몹시스 알터니플로라(Thermopsis alterniflora)추출물 (FL006)을 얻고, FL006에 의해 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내 지질 농도가 감소되는 효과를 조사하였다. 그 결과, FL006은 유효 성분으로 류트올린 (luteoline), 크리소에리올 (chrysoeriol), 포르모노네틴 (formononetin), 시나로시드 (cynarosid), 아피제닌 (apigenin) 및 터몹소시드 (thermopsozid) 등 6 종의 플라보노이드 화합물을 주요 성분으로 포함하며, FL006과 상기 6종의 개별 플라보노이드 화합물 모두 비정상적으로 증가한 콜레스레롤과 트리글리세라이드 농도를 감소시키는 효과를 나타내었다. 그러나, 각 플라보노이드 화합물의 지질 함량 감소 억제 효과는 6종의 플라보노이드 화합물을 포함하는 FL006의 효과에 미치지 못하였으며, 개별 플라보노이드 화합물의 단순한 조합으로는 FL006의 지질 함량 감소 억제 효과를 예상하기는 어려움을 알 수 있다.
본 발명에 따른 플라보노이드를 포함하는터몹시스 알터니플로라추출물 (FL006)을 얻기 위해, 건조된터몹시스 알터니플로라를 분쇄하여 수욕 추출에 의해 수용성 알칼로이드를 제거한 후, 에탄올로 추출하여 얻어진 여액을 감압 농축시킨 다음, 물로 희석하여 클로로포름 추출로 클로로필과 수지류 등 플라보노이드 이외의 물질들을 제거한 후 수층을 회수하여 약 5 ℃에서 결정화시켜 FL006 침전을 얻었다. FL006 침전을 분리 건조한 후 클로로포름으로 세척하여 건조시킨 FL006를 95% 에탄올에 용해시킨 다음, 감압 농축하여 약 5 ℃에서 다시 결정화시켜 최종 FL006 결정을 얻었다. 상기 FL006에 대하여 화학적 조성을 분석한 결과, 총 11 종의 플라보노이드 화합물을 포함하고 있는데, 상기 6 종류의 플라보노이드 화합물이 90 중량%로 포함되어 있으며 (류트올린 22.3 중량%, 크리소에리올 21.4 중량%, 포르모노네틴 20.4중량%, 시나로시드 4.8중량%, 아피제닌 3.2 중량%, 터몹소시드 2.1중량%), 이 외에 5 종의 미확인 플라보노이드 화합물을 소량 포함하고 있음을 확인하였다.
한편, 또다른 본 발명의 실시예에서는 정상 동물에서 콜레스레롤과 트리글리세라이드 농도 감소에 대한 FL006의 효과를 조사하기 위해, 정상 쥐에 FL006을 10, 25, 50, 75, 100 mg/kg 씩 단회 투여하여 쥐 혈청 중 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 농도의 변화를 이용하여 각각 분석하였다. 그 결과, FL006 투여에 의해 정상 쥐 혈청 중 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량이 감소되었으며, 그 지질 감소 활성 (lipidemic activity)은 투여량에 의존적이었다. 10 mg/kg 투여군 및 25 mg/kg 투여군에서 콜레스테롤 함량은 평균 7~8% 감소하였고 트리글리세라이드 함량은 평균 1.5~1.8% 감소하였으나, 이들 효과는 통계적으로는 유의한 수준에 들지 않았다. 통계적으로 신뢰할 수 있는 수준의 데이터는 50 mg/kg 투여군에서 나타났는데, 이 경우 콜레스테롤은 20.7%, 트리글리세라이드는 14.8%로 각각 감소하였다. 한편, 75 mg/kg 투여군에서는 콜레스테롤과 트리글리세라이드의 함량 감소가 50 mg/kg 투여군과 동일한 수준으로 나타났으며, 100 mg/kg 투여군까지 투여량의 증가가 더 이상의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량의 감소를 일으키지 않았다. 따라서,터몹시스 알터니플로라에서 분리한 플라보노이드 추출물인 FL006이 정상 동물의 지질 농도 감소에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있다.
본 발명의 FL006의 지혈증에 대한 효과를 평가하기 위하여, 내인성 지혈증, 트리톤에 의한 지혈증, 에탄올에 의한 지혈증, 아드레날린에 의한 지혈증, 메틸우라실에 의한 지혈증 또는 고콜레스테롤혈증을 나타내는 동물에 각각 FL006을 투여한 후 혈청, 간, 심장의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 농도 변화를 분석하였다. 그 결과 상기 지혈증 동물의 혈청, 간 또는 심장에서 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 비에스테르화 지방산 등의 지질 농도가 FL006에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 FL006은 다양한 원인의 지혈증, 고콜레스테롤혈증, 지방간, 또는 이들로부터 유래되는 질환의 근원 치료 및 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis)에 대한 FL006의 약리 활성을 확인하기 위하여, 콜레스테롤을 투여한 토끼에 대하여FL006 투여에 의한 혈청 중 지질 농도 변화를 분석하였다. 그 결과, 콜레스테롤을 투여하여 아테롬성 동맥경화증을 유발한 실험 토끼에 FL006 투여함으로써 혈청 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질, 베타 및 프리-베타 지단백질 등의 농도 증가가 억제되었다. 또한, 혈청 뿐 아니라 심장, 간장 및 대동맥에서도 콜레스테롤과 트리글리세라이드 농도의 증가가 FL006 투여에 의해 억제되는 것으로 나타났다.
아테롬성 동맥경화증은 조직 내 산화-환원 과정 및 에너지 공급 과정에 심각한 교란을 일으켜, 피로파라타르타르산 (pyroparatartaric acid)과 젖산의 농도 상관 관계, 니코틴아마이드 조효소의 산화형 및 환원형 농도 상관 관계와 이들의 총량, 아데닌 뉴클레오티드 함량과 아킨슨 계수 (Atkinson coefficient, [ATP+0.5ADDP]/ [ATP+ADP+AMP])등이 비정상적으로 나타나는 것으로 알려져 있다. FL006의 아테롬성 동맥경화증의 개선 효과를 보다 면밀하게 조사하기 위하여 아테롬성 동맥경화증 실험 토끼의 심장 및 간에서 피로파라타르타르산과 젖산의 농도, 니코틴아마이드 조효소의 산화형 및 환원형 농도 및 이들의 총량, 아데닌 뉴클레오티드 함량과 에너지 공급 과정에 대한 지표로 사용되는 아킨슨 계수 등에 대한 FL006 투여 효과를 조사하였다. 그 결과, FL006이 아테롬성 동맥경화증 실험 토끼의 산화-환원계의 정상화 및 에너지 공급 과정 정상화에 모두 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, FL006은 아테롬성 동맥경화증에서 항응고 활성을 보이는 것으로 나타나, 항응고 기능이 약화되고 혈액 응고 체계의 활성이 증가되는 고콜레스테롤혈증이나 아테롬성 동맥경화증에 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
아테롬성 동맥경화증에 대한 FL006의 효과를 상기와 같이 다각적으로 검토한 결과, FL006은 정상 동물에서 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수준을 감소시키고, 아테롬성 동맥경화증 동물에서 나타나는 지질 교환의 교란 현상을 정상화시키고, 저트리글리세라이드 활성, 아테롬원 지단백질의 농도 감소 효과, 산화-환원계의 정상화, 에너지 공급 과정의 복원, 항응고 활성 등의 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
한편, FL006의 항지혈증 및 항아테롬성 동맥경화증 활성에 대한 작용 기전을 조사하기 위해, 쥐와 토끼를 대상으로 고지혈증에 대한 연구로서 FL006을 구성하는 6 종의 플라보노이드 화합물 각각에 대해 고콜레스테롤혈증 및 트리톤 고지혈증에 대한 효과, 저트리글리세라이드 활성 및 항산화 활성을 평가하였다.
FL006 및 6 종의 플라보노이드 화합물 각각에 의한 지혈증에 대한 효과를 평가하기 위해, 지혈증 환자가 사망한 후 2~3시간 지난 다음 대동맥에서 분리한 내피하 동맥내막 포말세포 (endothelial intimal foamy cells)를 대상으로 콜레스테롤과 트리글리세라이드에 대한 시험관내 실험을 실시하였다. 실험 결과, FL006와 6 종의 개별 플라보노이드 화합물 모두 비정상적으로 증가한 콜레스레롤과 트리글리세라이드의 함량을 감소시켰다. 상기 테스트에서 FL006을 투여한 경우가 개별 플라보노이드를 투여한 경우보다 콜레스테롤 감소 효과가 우수하였으며, 각각의 플라보노이드의 단순한 조합만으로는 FL006의 효과를 예상하기 어렵다는 것을 확인하였다.
각 플라보노이드 화합물과 FL006의 항산화 활성을 측정하기 위해 지질과산화억제 활성 측정법 (Ohkawa,et al.,Anal. Biochem.95:351, 1979)을 사용하여 MDA (malondialdehyde) 축적량과 POL (peroxidation of lipid???, 지질과산화) 저해율을 측정하였다. 개별 플라보노이드 종은 2.5 ×10-5M 농도에서 콜레스테롤 감소 및 트리글리세라이드 감소 효과 뿐 아니라, 철에 의해 유도되고 아스코르브산에 의존적인 지질 과산화 과정(ferroinducing, ascorbate-depending peroxide oxidizing of lipids)에도 영향을 준다. 개별 플라보노이드 중에서 터몹소시드만이 7.28%의 지질과산화 저해율을 나타내었으며, 포르모노네틴은 어떤 효과도 보이지 않았다. 지질의 과산화 과정은 크리소에리올 첨가 시 10.5%, 시나로시드의 경우 38.4%, 류트올린의 경우 63.7%로 각각 억제되었다. 또한, FL006을 0.3 mg/ml의 농도로 첨가하는 경우 지질 과산화 과정은 34.2% 억제되었다. 따라서 FL006에 함유되어 있는 6종의 플라보노이드 화합물 각각 콜레스테롤 감소 효과, 트리글리세라이드 감소 효과 및 항산화 활성을 명백히 가지고 있으므로 이들의 높은 함유량이 FL006의 항지혈증 활성의 원인으로 설명될 수 있을 것이다.
생체 내에서 50 내지 80%에 달하는 대부분의 콜레스테롤은 간에서 합성되는 담즙산으로 변형되어 제거되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아테롬성 동맥경화증의 경우에 이러한 자연적인 콜레스테롤 제거 과정이 효율적으로 일어나지 못한다. 따라서, 본 발명의 FL006이 정상 동물 및 간 질환을 가진 동물에서 콜레스테롤을 담즙산으로 산화시켜 배출하는 기능을 강화시키는지에 대해 조사하였다. FL006을 정상 쥐에 투여한 결과, 최담 반응 (choleretic reaction)이 답즙 분비의 강도를감소시키는 경향이 나타났다. 또한, 주목할 만한 담즙의 화학적 구성 변화가 나타났는데, 담즙 중 담즙산의 함량 증가와 담즙-콜레스테롤 계수의 증가가 특이적으로 나타났다. 특히, 선택적인 간 독소인 헬리오트린 (heliotrine)의 투여로 일어나는 간 손상 (hepatic deficiency)에 대한 FL006의 효과를 조사한 결과, 헬리오트린을 투여한 쥐에서는 간의 기능적 상태를 나타내는 지수가 실질적으로 악화되었으며 정상 동물보다 담즙 분비율이 더 낮았으며, 담즙산과 콜레스테롤의 농도 관계 또한 두드러지게 악화되었고, 그 결과 담즙-콜레스테롤 계수가 급격히 감소하였다. 또한, 간장 내의 빌리루빈 (bilirubin)과 콜레스테롤의 교환 사슬에서도 변화가 일어나, 담즙으로 배출된 빌리루빈 총량이 감소하였고, 콜레스테롤 총량도 감소하였다. 반면 헬리오트린과 FL006을 함께 투여한 쥐의 경우 담즙의 분비 강도, 콜레스테롤의 배설 및 빌리루빈의 담즙 배출 효과는 정상 쥐의 지수보다도 우수하였으며, 담즙-콜레스테롤 계수 또한 거의 정상 쥐의 수준까지 회복되었다. 따라서, 정상 동물 및 간질환을 가진 동물에서 FL006이 담즙으로의 콜레스테롤 분비를 증진시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
지단백질혈증과 결부되어 아테롬성 동맥경화증이 발달하는 동안에 혈관벽에서의 변화 특히, 혈관벽의 투과성의 변화가 중요한 작용을 한다는 사실이 알려져 있다. 본 발명에서는 FL006의 항아테롬성 동맥경화증 활성 기전을 확인하기 위하여, FL006의 혈관보호 특성, 혈관 투과성에 대한 영향, 항염증 활성을 조사하였다. 내인성 고콜레스테롤혈증을 가진 쥐와 토끼의 혈관을 사용하여, 혈관 투과성을 파괴하기 위해 자일렌(xylene), 히스타민, 오브알부민(ovalbumin)을 투여한 후, FL006을 투여하여 혈관 투과성 변화를 측정하였다. 아테롬원인 생물 기원의 고분자 폴리머 아민류를 투여하면 내피 세포가 수축하고 동맥 내막의 부종이 세포간극을 넓히면서 비특이적 엔도사이토시스 (endocytosis)가 증가하고 갈라진 접점이 늘어나게 된다. 그러나, 상기 과정은 혈관의 대사 상태와 혈관 투과성을 조절하는 약물을 투여함으로써 억제할 수 있다. FL006을 쥐에게 15일 동안 예방적으로 투여 (prophylactic administration)하면 혈관의 투과성을 16% 감소시켰다. 반면, 잘 알려진 혈관보호제 프로덱티눔(Prodectinum)을 전처리하여 투여하면 실질적으로 자일렌에 의해 증가된 혈관 투과성을 감소시키지 못하는 것으로 나타났다. 한편, FL006 및 프로덱티눔이 히스타민 방출에 미치는 영향을 비교한 결과, 각각 26.8% 및 39.8%의 투과성 감소 효과가 나타났다. 오브알부민 방출에 대한 영향은 유사한 효과를 가졌다. 상기 두 약물이 브라디키닌(bradikinin) 방출에 미치는 영향은 FL006이 22%의 투과성 감소 효과, 프로덱티눔이 66.6% 감소 효과를 가지는 것으로 나타났다. 브라디키닌은 아테롬원 지단백질이 혈관벽에 침투하는 것을 돕는 반면 FL006은 이 과정을 억제하므로 FL006은 좋은 항브라디키닌 약물인 것으로 판단된다. 또한, 20일 간 FL006을 고콜레스테롤혈증 토끼에 투여한 결과, 투여 기간 중에는 혈청 콜레스테롤 수준에 두드러진 영향을 주지 않으면서, 고분자에 대해 높은 투과성을 갖는 대동맥 내막 부위를 감소시키는 것으로 나타났으며 그 감소 효과는 대조군에 비해 5.1배인 것으로 나타났다. 따라서, FL006이 대동맥 혈관의 투과성을 감소시키는 효과를 나타냄을 알 수 있다.
FL006의 혈관보호 활성에 대한 또 다른 증거는 FL006의 항염증 효과이며, 이를 확인하기 위해 쥐에 FL006을 단회 투여하고 포르말린 관절염을 유도한 결과, 초기에 비해 커다란 테논(tenon)이 44.5%로 감소하였으나, 대조군 쥐에서는 63.6%의 테논이 남아 있어, FL006의 항염증 효과는 19.1%로 측정되었다.
따라서, FL006의 지혈증 완화 효과와 더불어 혈관보호 효과가 FL006의 활성을 설명하는 기전으로 사용될 수 있다. 지혈증 완화제의 효능은 개별 플라보노이드의 콜레스테롤 저하 활성과 트리글리세라이드 저하 활성에서 나오며, 트리글리세라이드의 분해, 간에서의 콜레스테롤, 지단백질 및 트리글리세라이드 합성, 담즙 분비를 통한 콜레스테롤 제거 등의 과정과 연관되어 있다. FL006의 혈관보호 활성은 항브라디키닌 효과, 즉 고분자 물질에 대한 혈관 투과성을 감소시키는 효과에 의해 알 수 있으며, 항산화 활성 및 항염증 효과를 통해서 확인할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
터몹시스 알터니플로라
로부터 플라보노이드의 추출 및 정량
터몹시스 알터니플로라(Thermopsis alterniflora)로부터 플라보노이드를 에탄올로 추출하여 정량하고 그 화학적 구성을 분석하였으며, 이 플라보노이드 추출물을 FL006라고 명명하였다.터몹시스 알터니플로라추출물FL006은 녹색을 띠는엷은 노란색의 분말로 얻어졌으며, 정량 분석 결과 총 11 종의 플라보노이드 화합물로 구성되어 있다. 그 중 류트올린 (luteoline), 크리소에리올 (chrysoeriol), 포르모노네틴 (formononetin), 시나로시드 (cynarosid), 아피제닌 (apigenin), 터몹소시드 (thermopsozid) 등 6 종의 주요 플라보노이드 화합물들이 FL006에 대하여 90 중량%로 함유되어 있고, 나머지 5 종의 미확인 플라보노이드 화합물이 소량 (5 중량%) 포함되어 있어, FL006 중 총 플라보노이드 화합물은 95 ±2.5 중량%를 차지한다. 이하 FL006의 추출 및 정량 과정에 대하여 구체적으로 나타내었다.
(단계 1) 수확 조건
터몹시스 알터니플로라의 총 플라보노이드 함유량과 6 종의 주요 플라보노이드 함유량은 표 1에 나타난 바와 같이 수확 시기에 따라 다르게 나타났으며, 완전 발아기부터 완전 개화기 사이에 수확한 것이 플라보노이드 추출물의 양과 생물학적 활성 면에서 가장 효과적인 것으로 나타났다.
| 터몹시스 알터니플로라 수확기 | 건조터몹시스 알터니플로라의 총 플라보노이드 함유량 (중량%) | 총 플라보노이드 중 6 종의 주요 플라보노이드 함유량 (중량%) |
| 최초 발아기 | 2.5 | 75.0 ~ 76.0 |
| 완전 발아기 | 2.8 | 87.0 ~ 90.0 |
| 개화 초기 | 3.1 | 87.0 ~ 89.0 |
| 완전 개화기 | 2.9 | 87.0 ~ 89.0 |
| 과실기 | 2.3 | 65.0 |
또한, 수확 지역에 따라터몹시스 알터니플로라의 플라보노이드 함유량이 다르게 나타났는데, 해발 고도 500 m 이하 지역에서 수확한 경우 건조된터몹시스 알터니플로라의 플라보노이드 함유량이 1.8 중량%로 가장 낮게 나타났으며, 해발 고도 500m 이상 지역에서 수확한 경우 플라보노이드 함유량이 3.1 중량%로 가장 크게 나타났다. 따라서, 유효 약리 활성을 지닌 FL006 추출물을 얻기 위해터몹시스 알터니플로라는 타쉬켄트(Tashkent)의 쿰산 (Khumsan) 지역에서 개화기의 것을 수확하여 지상부를 사용하였다.
(단계 2) 비플라보노이드계 물질의 추출 및 제거
플라보노이드를 추출하기 전에 먼저 독성 알칼로이드를 포함하는 비플라보노이드계 수용성 물질들을 제거하기 위해, 건조된터몹시스 알터니플로라100 ㎏을 5 mm정도 크기로 분쇄한 후 1000ℓ의 물을 사용하여 4 시간 동안 수욕 추출한 후 수평 경사분리기 (horizontal decanter)를 이용하여 수용액 추출물을 제거하였다. 그 후 한 번 더 같은 조건에서 2 시간 동안 수욕 추출하여 수용액 추출물을 분리, 제거하였다.
(단계 3) 플라보노이드의 추출 및 정량
수용성 비플라보노이드계 물질을 분리 제거한터몹시스 알터니플로라로부터 플라보노이드 추출물 즉, FL006을 얻기 위해 아래와 같은 방법으로 추출하였다. 40%, 60%, 80%, 96% 에탄올을 각각 사용하여 추출하였는데 에탄올의 농도에 따라 최종 FL006 추출량이 다르게 얻어졌으며 (표 2 참조), 80% 에탄올을 사용하였을 때FL006을 가장 많이 얻을 수 있었고, 이 때 수득률은 건조터몹시스 알터니플로라에 대해 2 중량%였다. 60% 에탄올 및 96% 에탄올을 사용한 경우 밸러스트 물질 (ballast substances)이 많이 함유되어 있어 FL006의 정제 단계에서 플라보노이드가 손실되어 FL006의 최종 추출량이 적게 얻어졌다. 따라서, 최적 추출 용매는 80% 에탄올임을 알 수 있었다.
| 에탄올 농도 | 추출물의 총량 (중량%) | 추출물의 순도 | FL006 추출량 (중량%) |
| 40% | 20 | 7.5 | 0.9 |
| 60% | 18 | 13.8 | 1.7 |
| 805 | 15 | 17.0 | 2.0 |
| 96% | 17 | 16.1 | 1.5 |
단계 1에서 얻어진 수용성 비플라보노이드계 물질을 분리 제거한터몹시스 알터니플로라로부터 FL006을 추출하기 위해 80% 에탄올을 추출 용매로 하여 연속 추출기 (continuous extractor) 또는 주입 방법 (infusion method)을 사용하여 추출하였다. 100 ㎏의터몹시스 알터니플로라를 주입 방법에 의해 5회 추출한 경우 1200 ℓ의 에탄올 추출물이 얻어졌다. 연속 추출방법을 사용한 경우 추출장치의 종류에 따라 500-700 ℓ의 에탄올 용액 추출물이 얻어졌다. 이렇게 얻어진 에탄올 추출물을 60 ℃에서 25ℓ로 감압 농축한 후 동량의 물로 희석하여 50 ℓ의 추출물 용액을 얻은 후, 10ℓ의 클로로포름이나 벤졸 등의 유기 용매로 4회 추출하여 유기 용매층을 제거하였다. 에탄올 추출물은 플라보노이드의 결정화를 방해하는 클로로필과 기타 수지 물질 등의 불순물을 함유하고 있어 플라보노이드의 정제를 저해하므로 클로로포름으로 추출하여 불순물을 제거하여야 한다. 이렇게 정제된 추출물을 5 ±2 ℃에서 24 시간동안 방치하여 플라보노이드 침전을 얻었는데, 더 높은 온도에서는 일부 플라보노이드의 결정화가 일어나지 않으며, 더 낮은 온도에서는 플라보노이드 결정의 순도가 저하된다. 저온에서 24 시간 동안 방치 후 추출물 용액을 여과하여 플라보노이드 침전만을 분리하여 얻은 후 80 ℃의 감압 오븐에서 건조시켰다. 건조된 플라보노이드 침전물을 분쇄하여 클로로포름으로 3회 세척한 후 (침전물: 클로로포름 = 1 : 5 중량비), 침전물을 감압 건조시켜 클로로포름을 제거하여 4 ㎏의 플라보노이드 침전을 얻었다. 4 ㎏의 플라보노이드 침전물을 60ℓ의 90% 에탄올에 용해시켜 여과지를 사용하여 1회 여과한 후 에탄올 추출물 용액을 20 ℓ로 감압 농축하고, 이 농축액을 24시간 동안 2차 결정화시킨 후 여과하여 FL006 결정을 얻었다. FL006 결정을 95% 에탄올 4ℓ로 세척한 후 80 ℃에서 감압 건조하여 수분 함량 5% 이하의 FL006 결정 2 ㎏을 얻었다. FLOO6의 수득율은 최초터몹시스 알터니플로라중량 (100 ㎏)에 대하여 2%이었다.
(단계 4) FL006의 정량분석
FLOO6에 함유된 플라보노이드 화합물의 종류와 함유량을 분석하기 위해 정량 분석하였다. 그 결과 FLOO6은 다음 6종의 플라보노이드 화합물을 주로 함유하고 있었다: 류트올린 (luteoline, 22.3중량%), 크리소에리올 (chrysoeriol, 21.4중량%), 포르모노네틴 (formononetin, 20.4중량%), 시나로시드 (cynarosid,4.8중량%), 아피제닌 (apigenin, 3.2중량%), 터몹소시드 (thermopsozid, 2.1중량%).
<실시예 2> FL006에 의한 정상 동물의 콜레스테롤과 트리글리세라이드 함량 저하 효과
FL006에 의한 정상 동물의 지질 함량 저하효과를 조사하기 위해, 정상 쥐 10 마리에 FL006을 10, 25, 50, 75, 100 mg/kg 씩 단회 투여한 후, 혈청 중 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량을 측정하였다. 콜레스테롤 함량은 시그마사의 콜레스테롤 키트 (Cat. No. 352-10052-3)를 이용한 효소 발색법 (Allain et al.,Clin. Chem. 20:470-475, 1974)에 의해 측정하였고, 트리글리세라이드 함량은 시그마사의 진단 키트 (Cat. No. 339-50)를 사용하여 측정하였다 (Bucoloet al.,Clin. Chem. 19:476-482, 1973). 그 결과는 표 3에 나타나 있는데, FL006은 혈청 중 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량을 감소시켰으며, 그 지질 감소 활성 (lipidemic activity)은 투여량에 의존적이었다. 10 mg/kg 투여군 및 25 mg/kg 투여군에서 콜레스테롤 함량은 평균 7~8% 감소하였고 트리글리세라이드 함량은 평균 1.5~1.8% 감소하였으나, 이들 효과는 통계적으로는 유의한 수준에 들지 않았다. 통계적으로 신뢰할 수 있는 수준의 데이터는 50 mg/kg 투여군에서 나타났는데, 이 경우 콜레스테롤은 20.7%, 트리글리세라이드는 14.8%가 각각 감소하였다. 한편, 75 mg/kg 투여군에서는 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 함량 감소가 50 mg/kg 투여군과 동일한 수준으로 나타났으며, 100 mg/kg 투여군까지 투여량의 증가가 더 이상의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량의 감소 효과를 나타내지는 않았다. 상기 결과를 통해,터몹시스 알터니플로라에서 분리한 플라보노이드 추출물인 FL006이 정상 동물의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량 저하에 우수한 효과를 보임을 확인하였다.
| 구분 | 투여량 (mg/kg) | 콜레스테롤 | P | 트리글리세라이드 | P | ||
| 혈청 중 함량 (mmol/L) | 감소율 (%비투여군) | 혈청 중 함량 (mmol/L) | 감소율 (%비투여군) | ||||
| 비투여군 | - | 1.88 ±0.04 | 0.591 ±0.03 | - | |||
| FL006 투여군 | 10 | 1.73 ±0.08 | 7.9 | >0.1 | 0.600 ±0.02 | 1.5 | >0.5 |
| 25 | 1.75 ±0.07 | 6.9 | >0.1 | 0.580 ±0.02 | 1.8 | >0.5 | |
| 50 | 1.49 ±0.07 | 20.7 | <0.01 | 0.503 ±0.01 | 14.8 | <0.02 | |
| 75 | 1.50 ±0.09 | 20.2 | <0.01 | 0.510 ±0.02 | 13.7 | <0.05 | |
| 100 | 1.45 ±0.09 | 22.8 | <0.02 | 0.509 ±0.02 | 13.8 | <0.05 |
n (각 군의 쥐의 수) = 6; P는 비투여군과의 차이를 기준으로 함.
하기 실시예 3~6에서는 다양한 원인의 지혈증 동물에 대해서 FLOO6에 의한 지질 함량 저하 효과를 조사하였다.
<실시예 3> FL006에 의한 내인성 지혈증 동물의 지질 농도 저하 효과
내인성 지혈증 쥐의 대조군을 확립하기 위해 혈청 중 지질 함량이 증가한 쥐 10 마리를 사용하였는데, 대조군 쥐의 혈청 중 β-지단백질의 함량이 28% 증가하였으며, 콜레스테롤은 39.2% 증가하였다. 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량은 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였고, β-지단백질의 함량을 측정하였다. 대조군 쥐에 수분을 충분히 공급해 주면서 단식을 시키면 지혈증이 일어나면서 간으로 지방이 침투하게 되어, 간에서는 콜레스테롤이 15.4%, 트리글리세라이드가 19.1% 증가하였으며, 이러한 증가는 모두 통계적으로 유의한 수준이었다 (표 4참조). 실험 초기와 종료 3시간 전에 두 번 FL006을 투여하였으며, 그 결과 표 4에 나타난 바와 같이 내인성 지혈증의 발전이 다양한 수준으로 억제되었다. 쥐의 혈청 중 β-지단백질 수준은 FL006 투여군이 비투여군에 비해 25.2% 감소하였으며, 콜레스테롤 함량은 24.2% 감소하였다. 간에서의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량 또한 FL006 투여에 의해 유사한 감소 경향을 보여 각각 8.3%와 12.3% 감소하였다 .
| 구분 | 혈청 중 함량 | 간에서의 함량 (mg/g) | ||
| 콜레스테롤 | β-지단백질 | 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | |
| 정상 쥐 | 1.63± 0.067 | 1.86± 0.12 | 6.55± 0.14 | 6.8± 0.41 |
| 대조군 (내인성 지혈증)P1 | 2.27± 0.20 | 2.38± 0.15 | 7.56± 0.45 | 8.1± 0.54 |
| <0.01 | <0.02 | =0.05 | >0.05 | |
| 대조군 + FL006P2 | 1.72± 0.14 | 1.78± 0.13 | 6.93± 0.82 | 7.1± 0.64 |
| <0.05 | >0.01 | >0.5 | >0.25 |
n = 8~10
P1: 정상 동물과의 차이를 기준으로 함.
P2: 지혈증 비투여군와의 차이를 기준으로 함.
<실시예 4> FL006에 의한 트리톤 지혈증 동물의 지질 농도 저하 효과
트리톤 투여에 의해 발생하는 지혈증에 대한 FL006의 효과를 확인하기 위해, 정상 쥐 8 마리에 트리톤 WR-1339를 투여하여 정상 쥐에 비해 5.05배의 콜레스테롤 농도 증가와 8.4배의 트리글리세라이드 농도 증가가 일어난 트리톤 지혈증 쥐의 대조군을 확립하였다. 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량은 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. 트리톤 WR-1339를 쥐에 투여하면 쥐 혈액에서 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량의 증가가 일어나는데, 이러한 증가는 혈장 지단백질 상의 지질에 대한 결합력과 관련됨이 알려져 있다. 지단백질 리파아제 활성에 의해 마이셀 (micelles)이 형성되며, 동시에 혈액과 조직간의 지질 교환이 붕괴되면서 마치 지방 부족 현상이 나타난 것과 같은 상태가 되어 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 합성이 간에서 일어나고 혈중 지질 농도가 증가하게 되는 것이다.
FL006을 트리톤 지혈증 쥐에 투여한 결과, 비투여 대조군에 비해 FL006 투여군의 경우 콜레스테롤 함량은 39.1%, 트리글리세라이드 함량은 25.4% 감소하였으며 (표 5참조), 이를 통해 트리톤 지혈증 쥐의 지질 교환 이상이 FL006에 의해 억제됨을 알 수 있다.
| 구분 | 콜레스테롤 | P | 트리글리세라이드 | P | ||
| 함량 (mmol/L) | 감소율 (%대조군) | 함량 (mmol/L) | 감소율 (%대조군) | |||
| 정상 쥐 | 1.63± 0.67 | - | - | 0.683± 0.050 | - | - |
| 대조군(트리톤 지혈증) | 8.24± 0.28 | - | - | 5.74± 0.19 | - | - |
| 대조군 + FL006 | 5.02± 0.87 | 39.1 | <0.001 | 4.28± 0.48 | 25.4 | <0.02 |
n = 8
<실시예 5> FL006에 의한 에탄올 지혈증 동물의 지질 농도 저하 효과
에탄올 지혈증 쥐 대조군을 확립하기 위해 쥐 8 마리에 에탄올을 투여하여 에탄올 지혈증을 일으켜 콜레스테롤과 트리글리세라이드의 함량을 증가시켰다. 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량은 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. 에탄올에 의한 지혈증으로 인해 대조군 쥐의 혈청 중 콜레스테롤 농도가 정상 동물에 비해 1.2배, 트리글리세라이드가 2.2배 증가되었다. 또한, 대조군 쥐의 간에서도 트리글리세라이드의 침윤이 관찰되었는데, 정상 동물에 비해 트리글리세라이드 농도가 1.72배 증가하였다 (표 6참조). 상기 에탄올 지혈증을 가진 대조군 쥐에 FL006를 투여한 결과 혈청 중 콜레스테롤 농도는 14.5% 감소하였고 트리글세라이드 농도는 36% 감소하였으며, 간에서 트리글리세라이드 농도는 19% 감소된 것으로 관찰되었다. 따라서 에탄올 지혈증 쥐에 FL006를 투여한 경우 에탄올로 파괴된 지질 교환이 FL006에 의해 정상화되어 지질 함량의 증가 억제 및 감소 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
| 구분 | 혈청 중 함량 (mmol/L) | 간에서의 함량 (mmol/L) | |
| 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | 트리글리세라이드 | |
| 정상 쥐 | 1.79± 0.067 | 0.695± 0.056 | 6.97± 0.39 |
| 대조군P1 | 2.13± 0.12 | 1.55± 0.056 | 12.041± 0.48 |
| <0.05 | <0.001 | <0.001 | |
| 대조군 + FL006P2 | 1.82± 0.08 | 0.993± 0.046 | 9.67± 0.34 |
| <0.05 | <0.002 | <0.002 |
n = 8
<실시예 6> FL006에 의한 아드레날린 지혈증 동물의 지질 농도 저하 효과
아드레날린 지혈증 대조군으로 사용한 쥐는 정상 쥐에 비해 혈청 중 비에스테르화 지방산 (nonesterificated aliphatic acids)이 29.4%, 콜레스테롤 함량이 8.1% 증가하였다 (표 7참조). 콜레스테롤 함량은 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였고, 비에스테르화 지방산의 함량을 측정하였다. 아드레날린 지혈증을 가진 쥐에 FL006을 투여한 결과, 혈청 중 콜레스테롤 농도가 30.4% 감소하였고 비에스테르화 지방산 함량은 29.7% 감소하였다. 이 결과로부터 아드레날린 지혈증을 가진 쥐에 있어 아드레날린에 의해 교란된 지질 교환이 FL006 투여에 의해서 정상화되어 지질 함량의 증가 억제 및 감소 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
| 구분 | 콜레스테롤 | P | 비에스테르화 지방산 | P | ||
| 함량 (mmol/L) | 감소율 (%대조군) | 함량 (mmol/L) | 감소율 (%대조군) | |||
| 정상 쥐 | 1.61 ± 0.067 | -- | - | 486 ±3.1 | -- | -- |
| 대조군 | 1.74 ± 0.059 | -- | - | 629 ±40.9 | -- | -- |
| 대조군 + FL006 | 1.21 ± 0.039 | -30.4 | <0.001 | 442 ±35 | -29.7 | <0.01 |
n = 8~10
따라서, 상기 동물실험에서 FL006은 정상 동물의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 저하 효과를 나타내며, 내인성 및 트리톤에 의해 유발되는 지혈증의 발전을 억제하며, 에탄올 및 아드레날린에 의해 유발된 지질 교환의 교란을 정상화시켜 준다는 사실을 확인하였다 (도 5참조).
하기 실시예 7~9에서는 정상 동물과 메틸우라실에 의한 고콜레스테롤혈증 (methyluracilum hypercholesterinemia) 및 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)을 가진 동물의 혈청, 간, 심근에서 지질 농도 감소에 미치는 FL006의 영향을 조사하였다.
<실시예 7> 정상 동물의 지질 교환에 대한 FL006 투여 효과
정상 동물의 지질 교환에 대한 FL006의 영향을 조사하기 위해, FL006을 정상 쥐 10 마리에 50 mg/kg의 투여량으로 10일간 연속 투여한 후 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량 변화를 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. 콜레스테롤 함량은 FL006 투여에 의해 혈청에서 27%, 간에서 14.2%, 심근에서 23.7% 각각 감소하는 결과를 나타내었다 (도 2참조).
| 구분 | 혈청 중 함량 (mmol/L) | 간 중 함량 (mg/g) | 심근 중 함량 (mg/g) | |||
| 콜레스테롤 | 트리글세리드 | 콜레스테롤 | 트리글세리드 | 콜레스테롤 | 트리글세리드 | |
| 정상 쥐 | 1.56± 0.064 | 0.540± 0.037 | 6.32± 0.17 | 7.86± 0.64 | 4.92± 0.38 | 4.21± 0.21 |
| FL006 투여군 | 1.14± 0.11 | 0.428± 0.023 | 5.42± 0.19 | 6.34± 0.53 | 3.75± 0.29 | 3.1± 0.13 |
| P1 | <0.01 | <0.05 | <0.01 | >0.05 | <0.05 | <0.01 |
n = 10
P1: 정상 쥐와의 차이를 기준으로 함.
<실시예 8> 메틸우라실 지혈증에 대한 FL006 투여 효과
메틸우라실 지혈증에서 FL006의 영향을 조사하기 위해, 대조군 쥐에게 단식과 함께 15일 간 2.4% 콜레스테롤, 가열된 30% 해바라기유 및 0.12% 6-메틸우라실을 투여하였다. 그 결과, 대조군 쥐는 정상 쥐에 비해 혈청 중 콜레스테롤 함량이 3.4배, 간 중 콜레스테롤 함량이 15.7배 증가한 반면, 혈장 중 트리글리세라이드 함량은 1.5배 감소하였고 간 중 트리글리세라이드 함량은 4배 증가하였다. 상기 대조군 쥐에 15일 간 50 mg/kg의 FL006 투여를 병행한 경우 통계상 유의적으로 혈청 중 콜레스테롤 수준이 18% 감소하고, 간 중 트리글리세라이드 함량이 15.8% 감소하였다. 한편, 혈청 중 트리글리세라이드 함량과 간 중 콜레스테롤 함량은 각각 3.3%, 15.5%만 감소하는 경향이 나타났다 (표 9참조).
| 구분 | 혈청 중 함량 (mmol/L) | 간에서의 함량 (mg/g) | ||
| 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | |
| 정상 쥐 | 0.121± 0.11 | 0.45± 0.016 | 2.7± 0.2 | 8.4± 0.7 |
| HD (대조군)P1 | 4.614± 0.15 | 0.30± 0.034 | 42.5 ±1.01 | 33.5 ±1.3 |
| <0.001 | <0.01 | <0.001 | <0.001 | |
| HD + FL006P2 | 3.39± 0.2 | 0.29± 0.26 | 35.9± 0.9 | 28.2 ±1.6 |
| <0.02 | >0.5 | <0.001 | <0.05 |
n = 6~8
HD: 저콜레스테롤혈증 식이 (hypocholesterinemia diet)
P1: 정상 쥐와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군 쥐와의 차이를 기준으로 함.
FL006 투여량을 100 mg/kg까지 늘리고 투여일을 23일까지 늘렸을 때의 결과는 통계적으로 신뢰할 수 있는 수준으로서, FL006 비투여 대조군에 비해 혈청 중 콜레스테롤 함량은 28.8% 감소하고 혈청 중 트리글리세라이드 함량은 27% 감소하였다. 간에서의 콜레스테롤 또한 34.2% 감소하였으며, 간의 트리글리세라이드 함량도 감소하는 경향을 보여 주었다 (표 10참조).
| 구분 | 혈청 중 함량 (mmol/L) | 간 중 함량 (mg/g) | ||
| 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | |
| 정상 쥐 | 1.27± 0.05 | 0.40± 0.04 | 2.8± 0.1 | 12.4 ±1.0 |
| HD (대조군)P1 | 3.74± 0.14 | 0.37± 0.097 | 49.9 ±1.7 | 48.7 ±6.7 |
| <0.001 | >0.5 | <0.001 | <0.001 | |
| HD + FL006P2 | 2.66± 0.16 | 0.27± 0.025 | 32.8 ±2.6 | 39.1 ±1.6 |
| <0.001 | >0.1 | <0.01 | >0.1 |
n = 6~8
HD: 저콜레스테롤혈증 식이 (hypocholesterinemia diet)
P1: 정상 쥐와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군 쥐와의 차이를 기준으로 함.
<실시예 9> FL006에 의한 지단백질의 교란 현상 억제 효과
쥐의 혈청 지단백질의 밀도 구배에 관한 연구에 따르면, 아테롬원 지단백질(atherogenous lipoproteins)의 스트립이 없는 정상 동물에서는 단백질 스트립의 신호가 강하고 고밀도 지단백질의 스트립이 상당히 넓은 것으로 나타난다. 대조군 쥐에 저콜레스테롤혈증 처리를 하면 고농도의 아테롬원 지단백질이 중간 밀도에 출현하고 지단백질이 저밀도에 출현한다. 이 때 나타나는 단백질 스트립은 넓고 강한 신호를 보여 준다. FL006을 투여한 경우 아테롬원 지단백질의 농도가 감소하는데, 저콜레스테롤혈증 처리만 받은 쥐의 혈장 지단백질의 분포와 비교할 때 FL006 투여군의 경우 이들 스트립의 강도가 감소하였다. 이 결과로부터 FL006은 지혈증 감소 효과와 함께 다양한 지단백질의 교란 현상을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 10> 아테롬성 동맥경화증 실험 토끼에 대한 FL006 투여 효과
아테롬성 동맥경화증 (experimental artherosclerosis)에 대한 FL006의 의약적 활성에 대한 연구를 토끼를 대상으로 하여 수행하였다. 토끼를 3 개의 그룹으로 나누어, 제 1 그룹은 정상 토끼로 구성되었고, 다른 두 그룹은 모두 두 달동안 하루 0.3 g/kg씩 콜레스테롤을 투여하였다. 두 달 후, 모든 실험군의 혈청에서 콜레스테롤과 지단백질 농도를 측정하였다. 아테롬성 동맥경화증 유발 이전의 정상 토끼의 콜레스테롤 함량은 1.2~1.7 mmol/L이었고, 콜레스테롤 투여 두 달 후 혈장의 콜레스테롤 함량은 4.02~16.8 mmol/L의 범위에 있었다. 이 때, 8 mmol/L 이하의 콜레스테롤 농도를 보여 주는 토끼의 경우 콜레스테롤에 대해 저항성을 가진 개체로 인정하고 실험에서 제외시켰다. 나머지 토끼를 2개 그룹으로 나누어 대략적으로 동일한 콜레스테롤 함량을 가지도록 하였다. 다음 두 달 간 한 그룹의 토끼에는 콜레스테롤을 경구 투여하고 이와 함께 FL006을 투여하였다. 대조군으로 사용한 그룹의 토끼에는 콜레스테롤 용액과 함께 상기 약품과 동일한 양의 살구나무 검 성분 (apricot natural gum)을 투여하였다. 2개월 동안 FL006을 투여한 후 토끼의 혈청과 주요 기관에서 지질 교환 지수를 측정하였다.
(10-1) 혈청, 간, 심장에서의 지질 교환 지수 및 대동맥의 아테롬성 동맥경화증에 대한 FL006의 치료 효과
상기와 같이 실험한 결과 표 11에 나타난 바와 같이, 4개월 간 콜레스테롤을위장에 투여한 대조군 토끼에 있어 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량의 증가가 일어났으며 정상치와 비교할 때 거의 15배나 증가하였다. 트리글리세라이드 함량 또한 9.4배 증가하였으며 인지질은 3배 증가하였다. 한편, 2개월 간의 FL006 투여는 증가된 혈청 콜레스테롤 농도를 55.4% 감소시켰으며, 혈청 트리글리세라이드 및 인지질 (34.1%)도 각각 54.8% 및 34.1% 감소시켰다.
| 구분(함량) | 총 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | 베타- 및 프리- 베타-지단백질 | 인지질 | 총콜레스테롤 인지질 |
| 정상 동물 | 1.56± 0.61 | 0.685± 0.152 | 1.55± 0.15 | 1.42± 0.20 | 1.098 |
| 대조군 | 23.05 ±1.35 | 6.49± 0.19 | 12.02± 0.57 | 4.34± 0.71 | 5.31 |
| P1 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | |
| FL006 | 10.27± 0.27 | 2.93± 0.45 | 5.46± 0.41 | 2.86± 0.39 | 3.59 |
| P2 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | >0.05 |
P1: 정상 토끼와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
아테롬성 동맥경화증을 가진 실험 토끼로부터 혈청을 분리하여 지단백질의 스펙트럼을 결정한 결과, 대조군 토끼는 정상치에 비해 베타- 및 프리베타-지단백질의 함량이 거의 8배 증가하였으며, 알파-지단백질 및 HDL (고밀도 콜레스테롤)의 함량은 감소하였다 (표 12참조). 전체 콜레스테롤 대비 HDL (고밀도 콜레스테롤)의 비율 또한 감소하였다. 이러한 지질 교환의 변화 때문에 아테롬화 콜레스테롤 계수 (cholesterol coefficient of atherogeneity)는 25배 이상 증가하면서 심혈관계 질환의 위험요인도 증가를 반영하였다. FL006을 투여한 토끼의 경우, 베타- 및 프리베타-지단백질 수준이 54.5%로 감소하였으며, HDL (고밀도 콜레스테롤)은 증가하였다. HDL (고밀도 콜레스테롤)의 경우 대조군에서 0.641 ±0.011, 실험군에서 0.718 ±0.015 mmol/l을 기록하였다. FL006 투여 결과 총 콜레스테롤의 수준이 감소하여, 인지질 대비 콜레스테롤의 비율의 감소(32.25%)와 총 콜레스테롤 대비 HDL (고밀도 콜레스테롤) 비율의 증가 (2.5배)를 일으켰다. 심혈관계 질환의 위험도를 나타내는 아테롬화 계수는 2.6배 감소하였다.
| 구분 | 총 콜레스테롤 | HDL (고밀도 콜레스테롤) | 총 콜레스테롤 중 HDL (고밀도 콜레스테롤) | 아테롬화 콜레스테롤 계수 |
| 함량 (mmol/L) | 함량 (mmol/L) | 비율 | ||
| 정상 동물 | 1.56± 0.061 | 0.675± 0.033 | 0.43 | 1.31 |
| 대조군P1 | 23.05 ±1.35 | 0.641± 0.011 | 0.027 | 34.95 |
| <0.001 | >0.25 | |||
| FL006P2 | 10.27± 0.27 | 0.718± 0.015 | 0.069 | 13.3 |
| <0.001 | <0.001 |
P1: 정상 토끼와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
간과 심장에서의 지질 교환 지수 (indexes of lipid exchange)에 대한 FL006의 효과를 알아보기 위해, 아테롬성 동맥경화증을 실험 동물에게 일으킨 후 지질 함량의 변화를 실험 동물의 혈청과 내부 기관에서 조사하였다.
토끼의 간에서 지질 함량을 측정한 결과 표 13에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 정상 동물에서 비해 총 지질 함량이 6배 높았고, 콜레스테롤은 4.5배, 트리글리세라이드는 4배, 인지질은 5배 더 높은 수치를 보였다. FL006을 실험 토끼에 투여한 경우, 대조군에 비해 간에서 총 지질은 1.5~1.7배, 콜레스테롤은 1.6배, 트리글리세라이드는 2배 이상 각각의 함량이 감소함을 확인하였다. 한편 인지질의 함량은 실질적으로 증가하지 않았다.
한편, 토끼의 심장에서 지질 함량을 결정한 결과, 대조군에서는 정상 동물에서 비해 총 지질 함량이 3배 높았고, 콜레스테롤은 2.1배, 트리글리세라이드는 1.6배 높은 수치를 보였다. 그러나, FL006을 2개월 간 실험 토끼에 투여한 경우, 심장 중 총 콜레스테롤의 함량은 1.7배, 트리글리세라이드는 1.5배 감소함을 확인하였다.
| 구분 | 심장 | 간 | ||
| 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | 콜레스테롤 | 트리글리세라이드 | |
| 정상 토끼 | 0.103± 0.05 | 8.7± 0.6 | 7.9± 0.5 | 9.3± 0.8 |
| 동물대조군 P1 | ||||
| 0.221± 0.03 | 14.1 ±1.3 | 35.75 ±2.18 | 38.6 ±2.76 | |
| >0.05 | <0.001 | <0. | <0.001 | |
| FL006 P2 | ||||
| 0.126± 0.036 | 9.1± 0.53 | 22.22 ±1.05 | 18.8 ±1.23 | |
| >0.05 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
P1: 정상 토끼와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
지질 교환 지수에 대한 FL006의 효과에 대해서는 대동맥에서의 결과도 혈청, 간, 심장에서의 결과와 유사한 변화 양상이 관찰되었다. 대동맥에서의 생화학적 분석 결과, 대조군 동물에서의 콜레스테롤 함량은 정상치보다 거의 20배 증가하였고, 트리글리세라이드는 7배, 인지질은 3배 이상 증가하였다. 한편, FL006을 실험 토끼에 투여한 경우, 대동맥에서의 콜레스테롤 함량은 45% 감소하였고, 트리글리세라이드 또한 45% 감소함을 확인하였다. 인지질 함량 또한 유의적으로 감소하였으며, 그 결과 인지질 대 콜레스테롤의 상관 계수는 정상화되었다 (표 14 참조).
| 구분 | 콜레스테롤 | P | 트리글리세라이드 | P | ||
| 함량 (mg/kg) | 대조군 대비 감소율 (%) | 함량 (mg/kg) | 대조군 대비 감소율 (%) | |||
| 정상 동물 | 1.24± 0.76 | 1.31± 0.34 | ||||
| 대조군 | 24.4 ±1.35 | <0.001 | 9.25± 0.52 | <0.001 | ||
| + FL006 | 13.34 ±1.36 | 45.3 | <0.001 | 5.1± 0.30 | 45 | <0.001 |
n = 10
P: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
상기 결과를 통해, 혈청 및 대동맥에서의 콜레스테롤 수준과 대동맥의 아테롬화동맥경화증 치유 계수간의 상관 관계가 밝혀질 수 있었다. 이와 같이 아테롬화동맥경화증 치유 계수를 측면법적으로 정의한 결과, 대조군 토끼의 대부분에서 대동맥 내막이 아테롬성 동맥경화 병반, 다양한 크기의 흑점 및 돌기로 채워져 있음을 확인할 수 있었다. 가장 돌출된 콜레스테롤 병반은 대동맥궁 부위 및 늑골간 대동맥의 심문에 위치하고 있었다. 아테롬성동맥경화 병반이 대동맥에 침투한 정도는 15 내지 85%로 다양하였다. 이들 동물에서 혈청 콜레스테롤 함량은 15배, 대동맥 콜레스테롤 함량은 20배로 증가하였다.
그러나, FL006 투여 토끼의 경우 50% 이상에서 상기 증상이 나타나지 않았으며, 아테롬성동맥경화 병반에 의한 대동맥 침투 정도는 5~28% 정도로 낮았다. 또한, 콜레스테롤 병반의 크기는 그다지 크지 않았으며, 대동맥 아테롬증 침투 계수는 대조군에 비해 3.3배 감소하였다 (도 3참조). FL006 투여군의 혈청에서 콜레스테롤의 평균 수준은 대조군에 비해 1.56배 감소하였고, 대동맥에서는 1.8배 감소하였다.
(10-2) 아테롬성 동맥경화증 실험 토끼의 심장 및 간의 에너지 공급 지수에 대한 FL006의 영향
실험 토끼에서 아테롬성 동맥경화증은 조직 내 산화-환원 과정에 심각한 저해를 일으키고 에너지 공급을 교란시킨다는 사실이 잘 알려져 있다. 그러나, 아테롬성 동맥경화증의 활성기에는 피로파라타르타르산 함량이 증가하여, 잉여 젖산이 양의 값 (+3,2)을 가지고 조직이 저산소증을 일으킨다. 그 결과, 탄수화물, 단백질, 지질의 산소 호흡 과정이 교란되어 개체 전체의 대사 과정에 영향을 미친다. 무엇보다도, 이러한 조건에서는 산화-환원 반응이 감소하고, 해당 과정에 탄수화물의 분해가 증가한다
탄수화물 교환 지수에 대한 FL006의 효과를 평가하기 위해, 심근 및 간에서 글리코겐 함량을 측정하고 혈청에서 피로파라타르타르산 및 젖산의 함량을 측정하였다. 이와 같이 잉여 젖산의 양과 락산-피로파라타르타르산의 산화환원 전위를 조사한 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 고콜레스테롤혈증 발병 후 2개월 째에 혈청 젖산 함량이 15% 증가하였고 피로파라타르타르산의 함량이 16% 감소하였다. 또한 잉여 젖산은 +1.95에서 +2.01로 증가하였다. 이와 같은 변화를 관찰한 후, 실험 토끼에 FL006을 투여하기 시작하여 4개월 째에 실험을 종료하였다. 실험 종료 시, 아테롬성 동맥경화증을 가진 대조군 토끼의 혈장 젖산 수준은 38%로 더 증가하였고, 피로파라타르타르산 함량은 25%로 감소하였다. 잉여 젖산 함량의 경우 +3.95에 달하였다. 한편, 대조군에서 심장 및 간장 내 글리코겐 함량은 각각 42%, 63.6% 감소하였고, 피로파라타르타르산 수준의 감소는 각각 39.3%, 40.6%이었다. 심장 내 젖산 수준은 71% 증가하였다. 이와 같은 탄수화물 교환 상의 변화는 젖산-피로파라타르타르산 산화-환원 전위 시스템의 값을 14.5 mV로 감소시켰다.
아테롬성 동맥경화증에서 산화 과정 수준의 감소 및 젖산의 이용 경향을 조사하기 위해, 잉여 젖산 지수를 측정하였다 (표 15참조). FL006을 실험 동물에 2개월 간 투여한 결과, 혈청 및 조직에서 탄수화물 교환에서 변화가 일어나, 피로파라타르타르산 함량은 40% 증가하고, 젖산 수준은 39.7% 감소하였다. 잉여 젖산 수치는 양에서 음으로 급격히 변화하였다 (-7.13). 또한 간장 내 글리코겐 함량은 2.8배 이상 증가하였다 (표 16및도 4참조).
심장에서 피로파라타르타르산 수준은 68.8% 상승하였으며, 간장에서는 60.2%상승하였다. 반면, 심장에서 젖산 함량은 40.4% 감소하였고, 간장에서 33% 감소하였다. 이와 같이 피로파라타르타르산과 젖산의 상관 관계는 FL006에 의해 간장과 심장에서 모두 정상화되었다. 또한, 심근 및 간에서 모두 잉여 젖산 지수가 음의 값으로 급격히 변화하였고 젖산/피로파라타르타르산의 산화-환원계의 전위 증가도 일어났다.
| 구분 | 심장 | 간 | ||||
| 락산 (mmol/g) | 잉여 락산 | LA/PPT | 락산 (mmol/g) | 잉여 락산 | LA/PPT | |
| 정상 동물 | 7.24± 0.19 | - | 35.1 | - | 22.7 | |
| 대조군P1 | 12.4± 0.46 | +7.96 | 99.2 | 15.2± 0.44 | +9 | 55.8 |
| <0.001 | ||||||
| 대조군+ FL006P2 | 7.39± 0.97 | -13.5 | 35.0 | 10.07± 0.9 | -14.3 | 23.1 |
| <0.001 | >0.001 |
n = 10
LA/PPT: 젖산 / 피로파라타르타르산
P1: 정상 토끼와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
| 구분 | 심장 | 간 | ||
| 글리코겐 (mg%) | 피루브산 (mmol/L) | 글리코겐 (mg%) | 피루브산 (mmol/L) | |
| 정상 동물 | 424 ±16.8 | 0.206± 0.002 | 1968 ±52.6 | 0.458± 0.002 |
| 대조군P1 | 246 ±6.9 | 0.125± 0.003 | 715 ±21.2 | 0.272± 0.003 |
| <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | |
| 대조군 + FL006P2 | 368 ±12.1 | 0.211± 0.003 | 2059 ±11.09 | 0.436± 0.002 |
| <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
P1: 정상 토끼와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
니코틴아마이드 조효소 함량에 대한 FL006의 효과를 연구한 결과, 무처리군 토끼에서는 심장과 간장에서 모두 니코틴아마이드 조효소의 산화 환원형의 불균형이 일어남을 확인하였다. 무처리군 토끼에서 산화형 NAD의 함량 감소는 심장에서 17.3%, 간장에서 37.8%로 측정되었다. 환원형 니코틴아마이드 조효소의 함량은 실제적으로 심근에서는 변화하지 않았으나, 간장에서는 22%로 감소하였다. 간장에서는 환원형 NAD 뿐 아니라 산화형 NAD도 그 함량이 감소하였는데, 그 결과 그들의 총량은 상당한 수준 (30.7%)으로 감소하게 되었다. 반면, 심장에서 NAD 총량은 단지 10% 만이 감소하였다 (표 17참조).
한편, FL006을 상기 토끼에 처리한 경우에는 심장에서 산화형 NAD 함량을 19.6% 상승시켰으며, 간장에서는 54.1% 상승시켰다. 환원형 NADP 수준은 심장에서 상승하였으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었고, 반면 간장에서는 통계적으로 유의한 수준으로 24.0% 상승함을 관찰하였다. 결과적으로, FL006 투여에 의해 니코틴아마이드 조효소의 산화형, 환원형 및 그들의 총합이 정상화되었음을 확인할 수있었다. 니코틴아마이드 조효소 체계가 회복되고 이들의 총량 감소가 억제되며, 특히 NAD 및 NADP의 산화형 풀이 유지되는 현상을 관찰하였으므로, 이러한 FL006의 효과는 아테롬성 동맥경화증을 개선하는 데 유용하게 이용될 수 있다.
| 조직 | 지수 | 정상 토끼 | 대조군 | 대조군 + FL006 | 대조군대비 효과 (%) |
| 심장 | NAD+NADP | 288.3 ±9.39 | 238.3 ±4.24* | 285.0 ±5.45** | 19.7 |
| NADH2+NADPH2 | 186.6 ±4.69 | 188.3 ±5.81 | 196.0 ±2.72 | 4.1 | |
| NAD+NADP+NADH2+NADPH2 | 474.9 ±5.42 | 426.6 ±3.65* | 481 ±4.94** | 12.9 | |
| 간장 | NAD+NADP | 428.1 ±8.48 | 266.0 ±7.65* | 410.0 ±12.58** | 54.1 |
| NADH2+NADPH2 | 340.8 ±5.47 | 266.4 ±5.56* | 330.9 ±9.01** | 24 | |
| NAD+NADP+NADH2+NADPH2 | 768.9 ±6.49 | 532.4 ±8.9* | 740.9 ±11.12** | 39.1 |
*: 정상 토끼과의 차이에 대한 신뢰도가 0.05 이하인 것
**: 대조군과의 차이에 대한 신뢰도가 0.05 이하인 것
아테롬성 동맥경화증 실험 토끼의 심장과 간장에서 아데닌 뉴클레오티드 함량에 대한 FL006의 영향을 평가한 결과, 상기 대조군 동물의 심장에서는 ATP 함량의 감소가 32% 일어났으며, ADP 감소는 22.7%, AMP 감소는 24.7% 일어났다 (표 18참조). 이와 같은 아데닌 뉴클레오티드 교환에서의 변화는 심근에서의 아데닌 뉴클레오티드 총량의 감소 (28%)를 유발하였다. 유사한 변화는 간장에서도 일어났는데, ATP 감소는 29%, ADP 감소는 20%, AMP 증가는 48%, 총 아데닌 뉴클레오티드 감소는 17%에 달하였다. 상기 변화로 인해, 아킨슨 계수 (Atkinson coefficient, [ATP+0.5ADP]/ [ATP+ADP+AMP])는 심장과 간장에서 모두 감소하여 에너지 공급이 감소함을 증명하였다.
| 조직 | 지수 | 정상 토끼 | 대조군 | + FL006 | 대조군 대비 증감 (%) |
| 심장 | ATP | 2.74± 0.04 | 1.85± 0.05* | 2.52± 0.05** | 36.2 |
| ADP | 1.76± 0.03 | 1.36± 0.03* | 1.74± 0.04** | 27.9 | |
| AMP | 0.81± 0.04 | 0.61± 0.04* | 0.75± 0.02** | 22.9 | |
| ATP/ADP | 1.55± 0.01 | 1.36± 0.05* | 1.44± 0.04 | 5.8 | |
| ATP/AMP | 3.38± 0.02 | 3.03± 0.05* | 3.36± 0.03** | 10.9 | |
| ATP+ADP+AMP | 5.31± 0.01 | 3.82± 0.04* | 5.01± 0.052** | 31.1 | |
| (ATP+0.5ADP)/ (ATP+ADP+AMP) | 0.68± 0.02 | 0.66± 0.03 | 0.68± 0.03 | 3.0 | |
| 간장 | ATP | 2.42± 0.051 | 1.71± 0.073* | 2.45± 0.053** | 43.3 |
| ADP | 2.01± 0.047 | 1.61± 0.1* | 1.93± 0.033** | 19.8 | |
| AMP | 0.54± 0.006 | 0.8± 0.078* | 0.71± 0.28 | -11.2 | |
| ATP/ADP | 1.20± 0.023 | 1.06± 0.019* | 1.26± 0.06** | 18.8 | |
| ATP/AMP | 4.48± 0.037 | 2.14± 0.028* | 3.45± 0.04** | 61.2 | |
| ATP+ADP+AMP | 4.97± 0.053 | 4.12± 0.015* | 5.09± 0.023** | 23.5 | |
| (ATP+0.5ADP)/ (ATP+ADP+AMP) | 0.69± 0.016 | 0.61± 0.064 | 0.67± 0.071 | 9.8 |
*: 정상 토끼와의 차이에 대한 신뢰도가 0.05 이하인 것
**: 대조군과의 차이에 대한 신뢰도가 0.05 이하인 것
상기 동물에 FL006을 투여한 경우, 심장에서 ATP 함량은 36.2%, ADP는 27.9%, AMP는 22.9% 증가하였으며, ATP/ADP 및 ATP/AMP 계수도 증가하는 경향을 나타냈다 (표 18참조). ATP, ADP, AMP 함량 증가에 따라, 이들의 총합 또한 31.1% 증가하였다. FL006 투여군의 간에서도 ATP는 43.3%, ADP는 19.8% 각각 증가하였고, ATP/ADP 계수는 18.8%, ATP/AMP 계수는 61.2% 증가하였다. 이와 같이 FL006의 투여에 의해 아데닌 뉴클레오티드의 총합이 간과 심장에서 완전히 정상화되었다. 또한, 심장 및 간에서 FL006의 활성은 아킨슨 계수를 증가시키는 경향을 가짐을 알 수 있었다. 앞서 밝힌 것과 같이 FL006은 고분자 에너지원의 분해와 합성 과정에서 촉매로 작용하는 산화형 니코틴아마이드 조효소의 저장량을 증가시킴으로써 에너지 생성 과정을 정상화시킬 수 있다.
(10-3) 아테롬성 동맥경화증 실험 토끼의 혈액 응고 체계에 대한 FL006의 영향
혈액 응고 체계에 대한 FL006의 영향 연구를 정상 토끼와 아테롬성 동맥경화증 실험 토끼에서 수행하였다. 정상 토끼에 FL006을 15일간 경구 투여하였으며, 혈액응고를 동력학적으로 측정하기 위해 토끼의 혈액을 FL006 투여 후 3일, 5일 및 15일째에 채취하였다. 3일째 채취한 혈액으로 조사한 결과, FL006 투여에 의해 트롬빈(R) 형성에 걸리는 시간 및 혈병 형성에 걸리는 시간이 증가하였다. FL006 투여 후 5일째에는 상기 변화가 더욱 심화되었고, 이와 더불어 라인 불일치 최대 진폭 (ma, Maximal amplitude of discrepancies of lines)이 늘어났지만 실질적으로 유연성 지수는 변화하지 않았다. 15일 째에는 트롬빈(R) 형성 시간이 통계적으로 유의하게 2배 증가하고 혈병 형성 시점(K)이 2.5배 증가하였다. 또한, ma 또한 1.55배 증가한 것이 관찰되었다.
이와 같은 FL006의 항응고 활성은 실험적 아테롬성 동맥경화증에서 보다 명백히 나타났다.표 19에 나타난 것처럼, 고콜레스테롤혈증 단계에 있는 토끼는 발병 후 2개월 째에 혈중 피브리노겐 수치가 51.3% 증가하였고, 혈병 수축율은 거의 두 배로 증가하였으며, 피브린 용해 활성 또한 상당히 감소하였다. 이러한 혈액 응고 동력학적 변화 상태에서 토끼에 FL006을 투여하였다. 이때의 대조군은 실험적 아테롬성 동맥경화증으로 발전한 토끼로서 정상 토끼에 비해 혈청 콜레스테롤이 거의 15배 증가하고, 피브리노겐 수준은 2배 이상, 헤파린에 대한 혈장 내성은 36.7%, 혈병 수축률은 2.5배, 프로트롬빈 비율은 1.6배 증가하였다. 또한, 이 대조군에서는 피브리노겐 용해 활성이 2배 이상 감소하고, 칼슘 혈병 형성 시간(Calcium clotting time)이 1.6배 감소하였다. 이러한 결과는 이전 연구와 일치하는 것으로서, 고콜레스테롤혈증이나 아테롬성 동맥경화증에서 항응고 기능이 약화되고 혈액 응고 체계의 활성이 증가된다는 사실을 재확인한 것이다.
상기 실험적 아테롬성 동맥경화증 토끼 대조군에 FL006을 투여한 경우, 각종 혈액 응고 체계의 지표에 대해 유효성을 가진다는 사실을 확인하였다. 즉, FL006은 상기 동물에서 대조군에 비해 혈청 콜레스테롤 함량을 56% 감소시키고 대동맥 콜레스테롤 함량을 72.8% 감소시켰으며, 피브리노겐은 28.4%, 헤파린에 대한 혈장 내성은 28% 감소시켰다. 또한, 프로트롬빈 지수는 1.3배, 피브린 용해 활성은 거의 1.8배 증가하였고, 칼슘 혈병 형성 시간은 14.8% 증가시켰다. 이와 같이 FL006을 연속 투여한 결과, 동물의 혈액 응고를 감소시켰으며, 그 결과 트롬보엘라스토그램(thromboelastogram) 반응의 신장, 프로트롬빈 지수의 감소, 피브리노겐 함량의 감소, 헤파린에 대한 혈장 내성 증가 및 피브린 용해 활성 증가가 일어났다 (표 19참조).
| 지수 | 정상 동물 | 고콜레스테롤혈증* | 아테롬성 동맥경화증 (대조군)** | 대조군 + FL006 |
| 혈청 콜레스테롤 (mmol/L) | 1.56± 0.061 | 8.27± 0.28 P1<0.001 | 22.95 ±1.33 P1<0.001 | 10.06± 0.33 P2<0.001 |
| 대동맥 콜레스테롤(mg/g) | 0.85± 0.081 | - | 16.34± 0.023 P1<0.001 | 7.18± 0.072 P2<0.001 |
| 헤마토크리트 (%) | 36.5± 0.29 | 40.9± 0.33 P1<0.001 | 52± 0.43 P1<0.001 | 48.6± 0.48 P2<0.001 |
| 프로트롬빈 지수 (%) | 81± 0.72 | 1117.03 ±1.9 P1<0.001 | 130 ±1.18 P1<0.001 | 97.5 ±1.5 P2<0.001 |
| 헤파린에 대한 혈장 내성 (초) | 395 ±6.9 | 300 ±5.4 P1<0.001 | 250 ±6.5 P1<0.001 | 320± 3.4 P2<0.001 |
| 피브리노겐 (mg%) | 150 ±9.2 | 227± 3.6 P1<0.001 | 320 ±4.34 P1<0.001 | 229.2 ±5.47 P2<0.001 |
| 재 칼슘 침착 (초) | 119.5 ±6.52 | 104.8 ±5.48 P1>0.1 | 74.5 ±5.58 P1<0.001 | 85.6 ±4.76 P2>0.1 |
| 피브린 용해 활성 (%) | 10.3± 0.3 | 6.2 ±1.3 P1<0.02 | 4.65± 0.21 P1<0.001 | 8.36± 0.17 P2<0.001 |
| 혈병 수축률 (%) | 35± 0.73 | 68.5± 0.27 P1<0.001 | 95± 0.19P1<0.001 | 77± 0.23 P2<0.001 |
*: 콜레스테롤을 2개월 투여
**: 콜레스테롤을 4개월 투여
P1: 정상 토끼와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
이상과 같이 실험적 아테롬성 동맥경화증에 대한 FL006의 효과를 다각적으로 검토한 결과, FL006은 정상 동물에서 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수준을 감소시키고, 아테롬성 동맥경화증 동물에서 나타나는 지질 교환의 교란 현상을 정상화시키고, 저트리글리세라이드 활성, 아테롬원 지단백질의 농도 감소 효과, 산화-환원계의 정상화, 에너지 공급 과정의 복원, 항응고 활성 등의 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<실시예 11> FL006의 항지혈증 및 항아테롬성 동맥경화증 활성
FL006의 항지혈증 및 항아테롬성 동맥경화증 활성에 대한 작용 기전을 조사하기 위해, 쥐와 토끼를 대상으로 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 고지혈증에 대한 연구로서, 개별 플라보노이드 종에 대해 고콜레스테롤혈증 및 트리톤 고지혈증에 대한 효과, 저트리글리세라이드 활성 및 항산화 활성을 평가하였다. 또한, FL006의 혈관보호 특성, 혈관 투과성에 대한 영향, 항염증 활성 및 담즙 배출 효과를 연구하여 FL006의 항아테롬성 동맥경화증 활성 기전을 확인하였다.
(11-1) 고콜레스테롤혈증에 대한 개별 플라노이드 종의 효과
FL006, 즉터몹시스 알터니플로라에서 획득한 플라보노이드 추출물은 여섯가지 개별 플라보노이드 종 (류트올린, 크리소에리올, 포르모노네틴, 시나로시드, 아피제닌, 터몹소시드)으로 구성되어 있다. 각 플라보노이드 종에 의한 지혈증에 대한 효과를 평가하기 위해, 지혈증 환자가 사망한 후 2~3 시간 지난 다음 대동맥에서 분리한 내피하 동맥내막 포말세포 (endothelial intimal foamy cells)로 콜레스테롤과 지질과산화에 대한 시험관내 실험을 실시하였다.
실험 결과 표 20에 나타난 바와 같이, FL006을 투여한 경우 콜레스레롤 함량이 대조군에 비해 62.9% 및 61.8% 감소하였다. FL006과 동일한 함량의 류트올린을 첨가한 경우 (0.3~0.03 mkg/ml) 콜레스레롤 함량이 대조군에 비해 21.7~20% 감소되었고, 크리소에리올을 첨가한 경우에는 콜레스테롤이 27.4% 및 43.6% 감소되었다. 포르모노네틴 또한 유사한 결과를 보였는데, 동일 함량을 처리한 경우 콜레스테롤이 58% 및 60.2% 감소되었으며, 시나로시드의 경우 포르모노네틴의 효과와 유사하였다. 류트올린, 크리소에리올, 포르모노네틴, 시나로시드 및 터몹소시드 각각이 가지는 콜레스테롤 함량 감소 효과에 비해 FL006의 효과가 보다 우수하였다. 또한, 개별 플라보노이드 종 (시나로시드, 크리소에리올, 포르모노네틴)을 복합하여 트리톤 지혈증을 가진 동물에 투여한 결과, 혈청 콜레스테롤의 감소가 32~34% 일어났고, 트리글리세라이드는 27.4~43.6% 감소하였다. 터몹소시드와 류트올린을 병용 투여한 경우, 혈청 콜레스테롤을 24~25% 감소시켰고, 트리글리세라이드는 11.4~39.5% 감소시켰다. 상기 테스트에서 FL006을 투여한 경우가 개별 플라보노이드를 투여한 경우보다 콜레스테롤 감소 효과가 우수하였으며, 트리글리세라이드 감소 효과에 대해서는 포르모노네틴 및 터몹소시드만의 효과보다 우수하였다.
| 지표 | 대동맥내막 포말세포 | 트리톤 고지혈증 | 항산화 효과 | |||
| 화합물 명칭 | 콜레스테롤 함량 (mkg/mg protein) | 콜레스테롤 (mmol/L) | 트리글리세라이드 (mmol/L) | MDA 축적 (nmol/mg protein) | POL 저해율 (%) | |
| 0.3 mkg/ml | 0.03 mkg/ml | |||||
| 정상 | - | - | 0.71± 0.06 | 0.44± 0.03 | - | |
| 대조군 | 124 ±9 | 123 ±7 | 6.6± 0.21 | 6.3± 0.56 | 20.19 ±1.4 | - |
| FL006 | 46 ±10* | 47 ±8* | 4.31± 0.36* | 4.41± 0.38* | 13.27± 0.87* | -34.27 |
| 류트올린 | 97 ±7 | 98 ±8 | 4.95± 0.6* | 3.81± 0.49* | 7.32 ±1.15* | -63.74 |
| 크리소에리올 | 90 ±5* | 70± 0* | 4.47± 0.34* | 3.94± 0.97* | 18.07± 0.37 | -10.50 |
| 포르모노네틴 | 52 ±10* | 49 ±9* | 4.50± 0.32* | 4.57± 0.20* | 20.01± 0.46 | - |
| 시나로시드 | 59 ±8* | 43 ±7* | 4.36± 0.30* | 3.55± 0.25* | 12.43 ±1.45* | -38.44 |
| 아피제닌 | - | - | - | - | - | - |
| 터몹소시드 | 87 ±5* | 99 ±7 | 5.03± 0.23 | 5.58± 0.42 | 21.66± 0.940 | +7.28 |
*: 대조군과의 차이에 대한 P가 0.05 이하인 것.
-: 실험하지 않음. 아피제닌은 기술적으로 충분한 양을 얻기 어려움.
MDA: 말론디알데하이드(malondialdehyde),
각 플라보노이드 화합물과 FL006의 항산화 활성을 측정하기 위해 지질과산화 억제 활성 측정법 (Ohkawa,et al.,Anal. Biochem.95:351, 1979)을 사용하여 MDA (malondialdehyde) 축적량과 POL (peroxidation of lipid???, 지질과산화) 저해율을 측정하여 표 20에 나타내었다. 개별 플라보노이드 종은 2.5 ×10-5M 농도에서 콜레스테롤 감소 및 트리글리세라이드 감소 효과 뿐 아니라, 철에 의해 유도되고 아스코르브산에 의존적인 지질 과산화 과정(ferroinducing, ascorbate-depending peroxide oxidizing of lipids)에도 영향을 준다. 개별 플라보노이드 중에서 터몹소시드만이 7.28%의 지질과산화 저해율을 나타내었으며, 포르모노네틴은 어떤 효과도 보이지 않았다. 지질의 과산화 과정은 크리소에리올 첨가시 10.5%, 시나로시드의 경우 38.4%, 류트올린의 경우 63.7%로 각각 억제되었다. 또한, 0.3 mkg/ml의 농도로 FL006을 첨가하는 경우 지질 과산화 과정은 34.2% 억제되었다. (표 20참조).
따라서 개별 플라보노이드 종들이 콜레스테롤 감소 효과, 트리글리세라이드 감소 효과 및 항산화 활성을 명백히 가지고 있으므로 이들의 효과가 앞서 밝힌 FL006의 항지혈증 효과의 원인이 될 것이다.
(11-2) FL006에 의한 담즙으로의 콜레스테롤 분비 효과
생체 내에서 50~80%에 달하는 대부분의 콜레스테롤은 간에서 합성되는 담즙산으로 변형되어 제거되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아테롬성 동맥경화증의 경우 콜레스테롤을 제거하는 자연적 과정이 제 역할을 수행하지 못한다. 이에 본 실험에서는 정상 동물 및 간 질환을 가진 동물에서 FL006이 콜레스테롤을 담즙산으로 산화시켜 배출하는 기능을 강화시키는지 대해 알아보았다.
FL006을 정상 쥐에 실험 초기에 단회 투여한 결과, 최담 반응(choleretic reaction)이 답즙 분비의 강도가 감소되는 경향이 나타났다. 최초 1시간째에 실험 동물에서 담즙 분비가 15.2%로 크게 감소하였고, 3시간째에는 8%로 분비 감소율이 둔화되었다. FL006을 투여한 쥐에서는 4시간 동안 분비된 담즙의 양이 전체적으로 8.8% 감소하였다. 그러나, 담즙의 화학적 구성 변화가 주목할 만한 것으로, 담즙 중 담즙산의 함량 증가(15%)와 담즙-콜레스테롤 계수의 증가(거의 20%)가 독특하게나타났다. 한편, FL006을 7일간 연속 투여하였을 때 담즙 배출 효과는 최초 2시간에 (10% 및 5%) 나타났다. 그 결과로, 다량의 담즙이 4시간동안 분비되었는데, 이는 대조군의 지수 및 단회 투여시의 효과보다 높은 것이었다. 또한, 담즙에서 담즙산염의 총 함량이 57%로 급격히 증가하였다. 특히 FL006이 간의 특이적 기능에 미치는 바람직한 효과는 헬리오트린 (heliotrine)의 투여로 일어나는 간 손상 (hepatic deficiency)에서 잘 드러난다.
헬리오트린은 선택적인 간 독소로서, 대조군 쥐에 투여되었다. 헬리오트린을 투여한 쥐에서는 간에 기능적 상태를 나타내는 지수가 실질적으로 악화된다. 실험 동물들은 모두 정상 동물보다 담즙 분비율이 더 낮았다. 4시간 동안 분비된 담즙의 총량은 대조군 쥐가 정상 쥐에 비해 31% 적었다. 담즙산과 콜레스테롤의 농도 관계 또한 두드러지게 악화되었고, 그 결과 담즙-콜레스테롤 계수가 급격히 감소하였다. 간장 내의 빌리루빈과 콜레스테롤의 교환 사슬에서도 변화가 일어나, 4시간 동안 담즙으로 배출된 빌리루빈 총량이 24%까지 감소하였고, 콜레스테롤 총량은 38.8%까지 감소하였다. 반면 헬리오트린과 FL006을 투여한 쥐의 경우 담즙의 분비 강도는 오히려 정상 쥐의 지수보다도 우수하였다. 콜레스테롤의 배설 및 빌리루빈의 담즙 배출 효과에 대해서도 마찬가지로 설명할 수 있다. 담즙-콜레스테롤 계수 또한 거의 정상 쥐의 수준까지 회복되었다. 상기 결과를 통해, 정상 동물 및 간질환을 가진 동물에서 FL006이 담즙으로의 콜레스테롤 분비를 증진시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
| 조건 | 정상 동물 | 헬리오트린 (대조군) | P1 | 대조군 + FL006 | P2 |
| 담즙 배설 속도(1시간 째)(hour/mg/100g) | 4.21± 0.3 | 3.1± 0.1 | <0.01 | 4.0± 0.2 | <0.002 |
| 담즙 배설 속도(2시간 째) | 4.39± 0.3 | 3.20± 0.2 | <0.01 | 3.71± 0.2 | >0.1 |
| 담즙 배설 속도(3시간 째) | 4.4± 0.3 | 3.08± 0.2 | <0.01 | 3.48± 0.3 | <0.001 |
| 담즙 배설량 (4시간 합계) | 1038.0 ±63.0 | 715.2± 09.5 | <0.002 | 858.4± 08.7 | <0.05 |
| 빌리루빈의 농도 (mg%/hour) | 27.7 ±4.04 | 23.4 ±2.24 | >0.25 | 27.5 ±2.55 | <0.25 |
| 담즙 중 빌리루빈 함량 (mg/100g/4hours) | 0.29± 0.021 | 0.22± 0.012 | <0.02 | 0.25± 0.027 | >0.25 |
| 콜레스테롤 농도 (mg%/hour) | 34.6 ±4.33 | 3.6± 0.49 | >0.5 | 32.2± 0.45 | >0.5 |
| 담즙 중 콜레스테롤 함량 (mg/100g/4hours) | 0.36± 0.021 | 0.22± 0.024 | <0.002 | 0.28± 0.014 | <0.05 |
| 담즙산염의 함량 (mg/100g/4hours) | 14.40 ±1.69 | 7.54± 0.73 | <0.01 | 11.16 ±2.78 | <0.1 |
| 담즙-콜레스테롤 계수 | 43.2± 0.7 | 33.8 ±4.4 | >0.1 | 41.7± 0.1 | >0.1 |
P1: 정상 쥐와의 차이를 기준으로 함.
P2: 대조군과의 차이를 기준으로 함.
(11-3) FL006에 의한 혈관 투과성 감소 효과
지단백질혈증과 결부되어 아테롬성 동맥경화증이 발달하는 동안에 혈관벽에서의 변화 특히, 혈관벽의 투과성의 변화가 중요한 역할을 수행한다는 사실이 알려져 있으며, 이에 혈관 투과성에 미치는 FL006의 영향을 조사하였다. 내인성 고콜레스테롤혈증을 가진 쥐와 토끼의 혈관을 사용하여, 혈관 투과성을 파괴하기 위해 자일렌(xylene), 히스타민, 오브알부민(ovalbumin)을 투여하였다. 그 후 FL006을 투여하여 혈관 투과성 변화를 측정하였다. 아테롬원인 생물 기원의 고분자 폴리머 아민류를 투여하면, 내피 세포가 수축하고 동맥내막의 부종이 세포간극을 넓히면서 비특이적 엔도시토시스가 증가하고 갈라진 접점이 늘어나게 된다. 그러나,상기 과정은 혈관의 대사 상태와 혈관 투과성을 조절하는 약물을 투여함으로써 억제할 수 있다.
도 6에 나타난 바와 같이, FL006을 쥐에게 15일 동안 예방적으로 투여한 경우, 혈관의 투과성을 16% 감소시켰다. 반면, 잘 알려진 혈관보호제 프로덱티눔(Prodectinum)을 전처리하여 투여하면 실질적으로 자일렌에 의해 증가된 혈관 투과성을 감소시키지 못하는 것으로 나타났다. 한편, 히스타민 방출에 미치는 FL006 및 프로덱티눔의 영향을 비교한 결과, 각각 26.8% 및 39.8%의 투과성 감소 효과가 나타났다. 오브알부민 방출에 대한 영향은 유사한 효과를 가졌다 (각각 45.2% 및 47.4%). 상기 두 약물이 브라디키닌(bradikinin) 방출에 미치는 영향은 FL006이 22%의 투과성 감소 효과, 프로덱티눔이 66.6% 감소 효과를 가지는 것으로 나타났다. 브라디키닌이 아테롬원 지단백질이 혈관벽에 침투하는 것을 돕는 반면 FL006은 이 과정을 막기 때문에 FL006은 좋은 항브라디키닌 약물인 것으로 판단된다. 또한, 20일 간 FL006을 고콜레스테롤혈증 토끼에 투여한 결과, 투여 기간 중에는 혈청 콜레스테롤 수준에 두드러진 영향을 주지 않으면서, 고분자에 대해 높은 투과성을 갖는 대동맥 내막 부위를 감소시키는 것으로 나타났으며 그 감소 효과는 대조군에 비해 5.1배인 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 FL006가 대동맥 혈관의 투과성을 감소시키는 효과를 나타냄을 알 수 있다.
(11-4) FL006의 항염증 효과
FL006의 혈관보호 활성에 대한 또다른 증거는 FL006이 항염증 효과이며, 이를 확인하기 위해 쥐에 FL006을 단회 투여하고 2시간 뒤에 포르말린 관절염을 유도한 결과, 초기에 비해 커다란 테논(tenon)이 44.5%로 감소하였으나, 대조군 쥐에서는 63.6%의 테논이 남아 있어, FL006의 항염증 효과는 19.1%로 측정되었다 (표 22 참조).
| 실험 조건 | Medial volume of tenon테논의 중간 부피 | 초기 테논 크기와 비교한 부피의 증가 | 항염증 효과 | ||
| In norm | 3시간 후 | (ml) | (%) | (%) | |
| 대조군 | 0.77± 0.04 | 1.26± 0.08 | 0.49± 0.22 | 63.6 | - |
| FL006 (50 mg/kg) | 0.74± 0.036 | 1.07± 0.06 | 0.33± 0.16 | 44.5 | 19.1 |
n = 10
따라서, 지혈증 완화 효과와 더불어 혈관보호 효과가 FL006의 활성을 설명하는 기전으로 이용될 수 있다. 지혈증 완화제의 효능은 개별 플라보노이드의 콜레스테롤 저하 활성과 트리글리세라이드 저하 활성에서 나오며, 트리글리세라이드의 분해, 간에서의 콜레스테롤, 지단백질 및 트리글리세라이드 합성, 담즙 분비를 통해 콜레스테롤 제거 등의 과정과 연관되어 있다.
FL006의 혈관보호 활성은 항브라디키닌 효과, 즉 고분자 물질에 대한 혈관 투과성을 감소시키는 효과에 의해 명백히 확증되었으며, 항산화 활성 및 항염증 효과에 대한 증거도 확인되었다.
상기 실험 결과들로부터 FL006의 투여에 의해 내인성 지혈증, 에탄올 지혈증, 트리톤 지혈증, 아드레날린 지혈증, 메틸우라실 지혈증 (또는 고콜레스테롤혈증)을 가진 동물에서 지질 교환의 지표가 정상화됨을 알 수 있었다. FL006을 실험적 아테롬성 동맥경화증을 가진 토끼에 투여한 결과, 혈청 중의 아테롬원 지단백질 함량, 심장, 간장 및 대동맥의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량, 대동맥의 아테롬 계수가 모두 감소되는 효과가 있었다. 또한, FL006은 혈액응고계에서 항응고 활성을 가지며, 혈관 투과성을 감소시키는 효과를 나타내었다. 이를 통해 저독성 플라보노이드 추출물인 FL006이 지혈증 치료제 및 항아테롬성 동맥경화증 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 플라보노이드를 포함하는터몹시스 알터니플로라추출물인 FL006은 저독성의 식물성 플라보노이드 추출물로서 혈액, 심근, 간장 또는 혈관 내 지질 함량을 효과적으로 감소시키는 활성을 나타냄으로써, 지혈증과 동맥경화증 등을 포함하여 지질의 축적 또는 지질 대사의 이상에 의해 발생하는 질병의 치료 및 예방에 유용한 약학적 조성물의 유효 성분으로 이용될 수 있다.
Claims (12)
- 플라보노이드를 활성성분으로 포함하며, 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내 지질 함량을 저하시키는터몹시스 알터니플로라(Thermopsis alterniflora) 추출물.
- 제 1항에 있어서, 플라보노이드는 류트올린 (luteoline), 크리소에리올 (chrysoeriol), 포르모노네틴 (formononetin), 시나로시드 (cynarosid), 아피제닌 (apigenin) 및 터몹소시드 (thermopsozid)로부터 선택되는 1 종 이상의 플라보노이드 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는터몹시스 알터니플로라추출물.
- 제 1항에 있어서, 상기 지질은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 비에스테르화 지방산, 인지질, 또는 지단백질인 것을 특징으로 하는터몹시스 알터니플로라추출물.
- 류트올린, 크리소에리올, 포르모노네틴, 시나로시드, 아피제닌 및 터몹소시드로부터 선택되는 둘 이상의 플라보노이드 화합물로 구성되는 플라보노이드 조성물 또는 제 1항의터몹시스 알터니플로라추출물을 유효 성분으로 하며, 혈액, 심근, 간장, 또는 혈관 내에서 지질의 축적 또는 지질 대사의 이상에 의해 발생하는 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 사용하는 약학적 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 플라보노이드 조성물은 15 ~ 30 중량% 류트올린, 15 ~ 30 중량% 크리소에리올, 15 ~ 40 중량% 포르모노네틴, 0 ~ 20 중량% 시나로시드, 0 ~ 10 중량% 아피제닌, 0 ~ 10 중량% 터몹소시드의 성분으로 구성된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 질병은 지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 동맥경화증, 동맥경화증으로 인한 합병증, 지방간 또는 간 손상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
- 제 6항에 있어서, 상기 지혈증은 내인성 지혈증, 에탄올 지혈증, 트리톤 지혈증, 아드레날린 지혈증 또는 메틸우라실 지혈증인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 동맥경화증은 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis)이고, 활성성분인 플라보노이드가 트리글리세라이드 농도 감소, 아테롬원지단백질 (atherogenous lipoproteins)의 농도 감소, 산화-환원계의 정상화, 에너지 공급의 복원 및 항응고 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
- 제 4항에 있어서, 항응고 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
- 제 4항에 있어서, 혈관 투과성에 대한 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
- 제 4항에 있어서, 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
- 제 4항에 있어서, 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
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