KR20010089280A - Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae - Google Patents
Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae Download PDFInfo
- Publication number
- KR20010089280A KR20010089280A KR1020017003811A KR20017003811A KR20010089280A KR 20010089280 A KR20010089280 A KR 20010089280A KR 1020017003811 A KR1020017003811 A KR 1020017003811A KR 20017003811 A KR20017003811 A KR 20017003811A KR 20010089280 A KR20010089280 A KR 20010089280A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- kda
- streptococcus pneumoniae
- isolated
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 258
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 249
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 240
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 84
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 title claims abstract description 79
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 22
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 title claims description 22
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 45
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 101000901154 Homo sapiens Complement C3 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 73
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 48
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 22
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims description 6
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 claims description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 43
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 9
- 108010040473 pneumococcal surface protein A Proteins 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 102000057770 human C3 Human genes 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 5
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 4
- 102100022133 Complement C3 Human genes 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 3
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117373 92 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000217440 Echovirus E3 Species 0.000 description 1
- 241000224432 Entamoeba histolytica Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- NLLHXVBITYTYHA-UHFFFAOYSA-N Nitrofor Chemical compound CCN(CC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O NLLHXVBITYTYHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 206010058859 Pneumococcal bacteraemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940007078 entamoeba histolytica Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 108700007621 mifamurtide Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960001973 pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000008979 vitamin B4 Nutrition 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Transplantation (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의해 발현되는 인간 보체 C3 분해 폴리펩티드의 패밀리의 동정 및 사용에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는, 예컨대, 약 15 kD 내지 약 25 kD 또는 약 75 kDa 내지 약 95 kDa의 분자량을 가지고 있다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하고 있다.The present invention relates to the identification and use of a family of human complement C3 degradation polypeptides expressed by Streptococcus pneumoniae. The polypeptide has a molecular weight of, for example, about 15 kD to about 25 kD or about 75 kDa to about 95 kDa. Preferred polypeptides of the invention comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5.
Description
세균 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의한 호흡기 감염은 매년 약 500,000 건의 폐렴 및 47,000명의 사망을 초래한다. 균혈성 폐렴구균 감염에 가장 위험한 사람은 2세 미만의 소아, 손상된 면역 시스템을 가진 개체 및 노인이다. 이들 군집에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 세균성 폐렴 및 수막염의 유발원이다. 아이들과 노인 모두는 세균 콜로니형성, 국소 또는 전신 감염 또는 정제된 다당류를 사용한 백신접종 후에 폐렴구균 캡슐 다당류에 대한 보호 항체의 합성에 있어서 결함을 가지고 있다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 성인 및 아이들 모두에 있어서 HIV 감염에 의한 침입성 세균 호흡기 질환의 유발원이며 상기 환자들에게 조혈성 감염을 일으킨다[참조 : Connor et al. Current Topics in AIDS 1987; 1: 185-209 and Janoff et al. Ann. Intern. Med. 1992; 117(4):314-324].Respiratory infections caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae cause about 500,000 pneumonia and 47,000 deaths each year. The most at risk for fungal pneumococcal infections are children under 2 years of age, individuals with an impaired immune system, and older people. In these populations, Streptococcus pneumoniae is a source of bacterial pneumonia and meningitis. Both children and the elderly have deficiencies in the synthesis of protective antibodies against pneumococcal capsular polysaccharides after bacterial colonization, local or systemic infection or vaccination with purified polysaccharides. Streptococcus pneumoniae is a source of invasive bacterial respiratory disease caused by HIV infection in both adults and children and causes hematopoietic infections in these patients [Connor et al. Current Topics in AIDS 1987; 1: 185-209 and Janoff et al. Ann. Intern. Med. 1992; 117 (4): 314-324.
심각한 감염에 대해 가장 위험한 개체는 현재의 캡슐 다당류 백신에 대한 항체를 만들어 낼 수 없다. 결과적으로, 현재 임상적 시도에 있어서 4가지 컨쥬게이트 백신이 존재한다. 컨쥬게이트 백신은 항체 반응을 상승시키려는 시도에서 단백질 캐리어 또는 애쥬번트와 커플링된 폐렴구균 캡슐 다당류로 구성되어 있다. 그러나, 임상적 시도에 있어서 현재의 컨쥬게이트 백신에는 다른 잠재적인 문제들이 존재한다. 예를 들어, 미국에서 가장 일반화되어 있는 폐렴구균 혈청형은 이스라엘, 서유럽, 남아프리카 또는 스칸디나비아와 같은 지역에서 가장 보편적으로 존재하는 혈청형과 다르다. 그러므로, 하나의 지리학적 장소에서 유용할 수 있는 백신들은 다른 장소에서 유용하지 않을 수 있다. 현재 이용가능한 캡슐 다당류를 개질시키거나 지리학적 혈청형 다양성에 적합한 캡슐 백신을 위한 단백질 컨쥬게이트를 개발하는 잠재적 필요성은 방해적인 재정적 및 기술적 어려움이 따른다. 따라서, 다양한 병원성 혈청형들간에 전세계적으로 보존되어 있는 면역원성, 표면-노출된 단백질을 연구하는 것이 폐렴구균 감염 및 폭넓은 보호 폐렴구균 백신의 제형을 위해 가장 중요하다. 또한, 전세계에 걸쳐 페니실린 및 세팔로스포린-저항성 폐렴구균의 출현으로 인해 더욱 긴박하게 효과적인 백신이 필요하게 되었다(참조 : Baquero et al. J. Antimicrob. Chemother. 1991; 28S; 31-8).The most dangerous individuals for serious infections cannot produce antibodies against current capsular polysaccharide vaccines. As a result, there are four conjugate vaccines in current clinical trials. Conjugate vaccines consist of pneumococcal capsular polysaccharide coupled with a protein carrier or adjuvant in an attempt to elevate the antibody response. However, there are other potential problems with current conjugate vaccines in clinical trials. For example, the most common pneumococcal serotypes in the United States differ from the most common serotypes in regions such as Israel, Western Europe, South Africa, or Scandinavia. Therefore, vaccines that may be useful in one geographic location may not be useful in another. The potential need to modify currently available capsular polysaccharides or to develop protein conjugates for capsular vaccines suitable for geological serotype variability poses disruptive financial and technical difficulties. Thus, studying immunogenic, surface-exposed proteins that are globally conserved among various pathogenic serotypes is of paramount importance for the formulation of pneumococcal infections and a wide range of protective pneumococcal vaccines. In addition, the emergence of penicillin and cephalosporin-resistant pneumococci throughout the world has led to the need for more urgently effective vaccines (Baquero et al. J. Antimicrob. Chemother. 1991; 28S; 31-8).
몇몇 폐렴구균 단백질들이 폐렴구균 캡슐 다당류와의 컨쥬게이션을 위해 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역성을 자극시키는 단일 면역원으로서 제안되었다. 호흡기관의 상피 세포에 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 부착과 관련되어 있는 것으로 보고된 표면 단백질에는 PsaA, PspC/CBP112 및 IgA1 단백질분해효소가 포함된다(참조 : Sampson et al. Infect. Immun. 1994; 62:319-324, Sheffield etal. Microb. Pathogen. 1992; 13:261-9, and Wani, et al. Infect. Immun. 1996; 64:3967-3974). 상기 부착소에 대한 항체들은 호흡기 상피 세포에 폐렴구균의 결합을 억제시킴으로써 콜로니형성을 감소시킬 수 있다. 폐렴용해소, 자가용해소, 뉴라미니다제 또는 히알루로니다제는 항체들이 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 감염된 환자에서의 상기 단백질들의 독성 효과를 잠재적으로 블로킹할 수 있기때문에, 백신 항원으로서 제안되었다. 그러나, 상기 단백질들은 전형적으로 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 표면에 위치하지 않으며, 오히려 이들은 세포 용해 및 사멸시에 세균으로부터 분비되거나 방출된다(참조 : Lee et al. Vaccine 1994; 12:875-8 and Berry et al. Infect. Immun. 1994; 62:1101-1108). 면역원으로서 상기 세포질 단백질들을 사용하는 것이 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염의 늦은 결과를 개선시킬 수 있지만, 상기 단백질들에 대한 항체들은 폐렴구균의 사멸을 촉진시키지 않을 뿐만 아니라 개시 또는 후속하는 폐렴구균 콜로니형성을 방지시키지도 않을 것이다.Several pneumococcal proteins have been proposed for conjugation with pneumococcal capsular polysaccharides or as a single immunogen that stimulates immunity to Streptococcus pneumoniae. Surface proteins reported to be associated with the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cells of the respiratory tract include PsaA, PspC / CBP112 and IgA1 protease (Sampson et al. Infect. Immun. 1994; 62: 319-324, Sheffield et al. Microb.Pathogen. 1992; 13: 261-9, and Wani, et al. Infect. Immun. 1996; 64: 3967-3974). Antibodies to these attachments can reduce colony formation by inhibiting the binding of pneumococci to respiratory epithelial cells. Pneumonia dissolution, autolysis, neuraminidase or hyaluronidase have been proposed as vaccine antigens because antibodies can potentially block the toxic effects of these proteins in patients infected with Streptococcus pneumoniae. However, these proteins are typically not located on the surface of Streptococcus pneumoniae, rather they are secreted or released from bacteria upon cell lysis and death (Lee et al. Vaccine 1994; 12: 875-8 and Berry et al. Infect. Immun. 1994; 62: 1101-1108). Although using the cytoplasmic proteins as an immunogen may improve the late consequences of Streptococcus pneumoniae infection, antibodies to these proteins do not promote the killing of pneumococci but also initiate or follow up pneumococcal colonization. It will not prevent it.
폐렴구균 백신으로서 시험되고 있는 원형 표면 단백질은 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA)이다. PspA는 약 70-140 kDa의 이종 단백질이다. PspA 구조에는 아미노 말단에 알파 헬릭스, 이어서 프롤린이 풍부한 서열이 포함되며 카복시 말단에 11개 콜린이 결합한 일련의 반복단위에서 끝이 난다. 상기 구조에 대한 많은 정보가 이용가능하지만, PspA는 다양한 폐렴구균 혈청형간에 구조적으로 보존되어 있지 않으며, 이의 기능은 완전히 밝혀지지 않았다(참조 : Yother et al. J. Bacteriol. 1992; 174:601-9 and Yother J. Bacteriol. 1994; 176:2976-2985). 연구를 통해 동물에서 PspA의 면역원성이 확인되었다(참조 : McDaniel et al. Microb.Pathogen. 1994; 17;323-337). PspA의 면역원성에도 불구하고, PspA의 이종성, 4가지 구조적 군(또는 클레이드)에서의 이의 존재 및 이의 특징화되지 않은 기능은 백신 항원으로서 사용될 수 있는 이의 능력을 곤란하게 만든다.The circular surface protein being tested as a pneumococcal vaccine is pneumococcal surface protein A (PspA). PspA is a heterologous protein of about 70-140 kDa. The PspA structure contains alpha helix followed by proline-rich sequences at the amino terminus and ends in a series of repeat units bound by 11 cholines at the carboxy terminus. While much information about this structure is available, PspA is not structurally conserved among the various pneumococcal serotypes, and its function is not fully understood (Yother et al. J. Bacteriol. 1992; 174: 601-). 9 and Yother J. Bacteriol. 1994; 176: 2976-2985). Studies have confirmed the immunogenicity of PspA in animals (McDaniel et al. Microb. Pathogen. 1994; 17; 323-337). Despite the immunogenicity of PspA, its heterogeneity, its presence in four structural groups (or clades) and its uncharacterized function make its ability to be used as a vaccine antigen difficult.
타입-특이적인 다당류 캡슐에 대한 보호 항체를 만들 수 없는 환자에 있어서, 제 3의 보체 구성요소인 C3 및 대안적인 보체 경로의 관련 단백질들은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 대한 숙주 방어의 제 1 선을 구성한다. 보체 단백질들은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 견고한 세포벽을 통과할 수 없기 때문에, 폐렴구균 표면상의 옵소닌 C3b의 퇴적은 폐렴구균 제거의 주요한 중재인자이다. 플라즈마 C3와 폐렴구균의 상호작용은 폐렴구균성 균혈 동안 일어나는 것으로 밝혀졌으며, C3의 옵소닌 활성 단편인 C3b가 공유 결합하는 경우, 식세포성 인식 및 섭취가 시작된다(참조 : Johnston et al. J. Exp. Med 1969; 129:1275-1290, Hasin HE, J. Immunol. 1972; 109:26-31 and Hostetter et al. J. Infect. Dis. 1984; 150:653-61). C3b는 폐렴구균 캡슐 뿐만 아니라 세포벽상에도 퇴적된다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 제어하는 상기 방법은 상당히 비능률적이다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 옵소닌화를 증가시키는 방법은 상기 생물체에 의해 유도된 질병 과정을 개선시킬 수 있다. 현재 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 제한시키기 위한 방법 및 치료법이 강력히 요구되고 있다.In patients unable to make protective antibodies against type-specific polysaccharide capsules, the third complement component, C3 and related proteins of the alternative complement pathway, are the first line of host defense against Streptococcus pneumoniae infection. Configure Since complement proteins cannot penetrate the robust cell walls of Streptococcus pneumoniae, the deposition of opsonin C3b on the pneumococcal surface is a major mediator of pneumococcal clearance. The interaction of plasma C3 with pneumococcal has been found to occur during pneumococcal bacteremia, and phagocytic recognition and uptake begins when cosine C3b, an opsonin active fragment of C3, covalently binds (Johnston et al. Exp. Med 1969; 129: 1275-1290, Hasin HE, J. Immunol. 1972; 109: 26-31 and Hostetter et al. J. Infect. Dis. 1984; 150: 653-61. C3b is deposited not only on the pneumococcal capsule but also on the cell wall. This method of controlling Streptococcus pneumoniae infection is quite inefficient. Methods of increasing Streptococcus pneumoniae opsonization can improve disease processes induced by the organism. There is currently a strong need for methods and therapies for limiting Streptococcus pneumoniae infection.
발명의 요약Summary of the Invention
본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의해 발현되는 인간 보체 C3 분해 폴리펩티드(예컨대, 단백질)의 패밀리의 동정 및 사용에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게는, 예컨대, 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 결정된 바와 같이, 약 15 kDa 내지 약 25 kDa, 또는 약 75 kDa 내지 약 95 kDa의 분자량을 가진다. 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 상이한 C3 분해 균주로부터 단리될 수 있는 수많은 폴리펩티드를 포함한다.The present invention relates to the identification and use of a family of human complement C3 degrading polypeptides (eg, proteins) expressed by Streptococcus pneumoniae. The polypeptide preferably has a molecular weight of about 15 kDa to about 25 kDa, or about 75 kDa to about 95 kDa, as determined, for example, on a 10% SDS polyacrylamide gel. The present invention includes numerous polypeptides that can be isolated from different C3 degradation strains of Streptococcus pneumoniae.
하나의 일면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 상기 폴리펩티드는 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리되거나 대안적으로는 상기 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 인간 보체 단백질 C3를 분해시킨다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5를 포함하는 아미노산 서열을 가진 단리된 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "단리된"이란 자연 환경으로부터 격리되어 자연적으로 발생하는 종 뿐만 아니라 합성적인 종을 말한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "폴리펩티드"는 길이에 상관없이 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 기능적 단위를 포함하며, 이에는 인간 보체 단백질 C3를 분해시키는 폴리펩티드가 포함된다.In one aspect, the invention relates to an isolated polypeptide having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. In a preferred embodiment, the polypeptide is isolated from Streptococcus pneumoniae or alternatively the polypeptide is a recombinant polypeptide. Preferably, the isolated polypeptide degrades human complement protein C3. Preferred polypeptides of the invention are isolated polypeptides having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5, more preferably SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. As used herein, the term “isolated” refers to synthetic species as well as naturally occurring species that are isolated from the natural environment. As used herein, the term "polypeptide" refers to peptides, polypeptides and proteins, regardless of length. Preferably, polypeptides of the invention comprise one or more functional units, which include polypeptides that degrade human complement protein C3.
따라서, 본 발명은 본 발명의 C3 분해 단백질로부터 단리된 폴리펩티드 단편에 관한 것이기도 하다. 상기 단편들은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "폴리펩티드"에 포함된다. 바람직하게는, 본 발명은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 단백질로부터 유도된 15개 이상의 연속적인 아미노산의 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 15개 이상의 연속적인 아미노산의 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 일면에서, 바람직한 폴리펩티드는 인간 보체 단백질 C3를 분해시킬 수 있다.Thus, the present invention also relates to polypeptide fragments isolated from the C3 degraded protein of the present invention. Such fragments are included in the term "polypeptide" as used herein. Preferably, the present invention provides a polypeptide of at least 15 contiguous amino acids derived from a protein having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5, more preferably SEQ ID NO: 2 or A polypeptide of at least 15 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 5 is provided. In another aspect of the invention, preferred polypeptides can degrade human complement protein C3.
또 다른 일면에서, 본 발명은 바람직하게는 인간 보체 단백질 C3를 분해시키는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 단리된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 매우 엄격한 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4 또는 이들의 상보적인 가닥의 적어도 일부분에 하이브리드화된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 15개 이상의 연속적인 아미노산, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 15개 이상의 연속적인 아미노산을 포함한다.In another aspect, the invention preferably relates to an isolated polypeptide that degrades human complement protein C3, wherein the nucleic acid encoding the isolated polypeptide is SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 or at least a portion of their complementary strands. Preferably, the polypeptide comprises at least 15 consecutive amino acids, more preferably at least 15 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5.
추가적인 일면에서, 본 발명은 인간 C3 분해 활성을 감소시키거나 인간 C3를 분해시키지 않는 폴리펩티드에 관한 것이지만, 이러한 폴리펩티드 군을 엔코딩하는 핵산들은 각각 인간 C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산들, 또는 각 핵산에 대해 상보적인 가닥들에 하이브리드화되는 누클레오티드 서열을 포함하고 있다. 감소된 인간 C3 분해 활성 또는 인간 C3 분해 활성이 없는 폴리펩티드의 상기 후자 군을 본 명세서에서 "비-분해성" 폴리펩티드로서 부른다. 비-분해성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산에 의해 C3 분해 폴리펩티드와 다를 수 있다. 이러한 아미노산 변화는 하나 이상의 아미노산의 치환, 변화 또는 결실일 수 있다. 다양한 타입의 아미노산 변화를 본 명세서에 논의하였다. 또한 비-분해성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 본 발명의 바람직한 양태이다.In a further aspect, the invention relates to polypeptides that reduce human C3 degradation activity or do not degrade human C3, but nucleic acids encoding such a group of polypeptides, respectively, are nucleic acids encoding human C3 degradation polypeptides, or for each nucleic acid. It contains a nucleotide sequence that hybridizes to the complementary strands. This latter group of polypeptides without reduced human C3 degrading activity or human C3 degrading activity is referred to herein as "non-degradable" polypeptides. Non-degradable polypeptides may differ from C3 degrading polypeptides by one or more amino acids. Such amino acid changes may be substitutions, changes or deletions of one or more amino acids. Various types of amino acid changes are discussed herein. Nucleic acids encoding non-degradable polypeptides are also preferred embodiments of the present invention.
또한 본 발명은 본 발명의 면역계 자극용 폴리펩티드(이것은 바람직하게는스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리된다) 및 치료적으로 허용되는 캐리어의 유효량을 함유하는 면역계 자극용 조성물(바람직하게는, 백신)에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 면역계 자극용 조성물 또는 백신은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리된 1종 이상의 다른 면역계 자극용 폴리펩티드를 추가로 포함한다.In addition, the present invention relates to a composition for stimulating the immune system (preferably a vaccine) containing the polypeptide for stimulating the immune system of the present invention (preferably isolated from Streptococcus pneumoniae) and an effective amount of a therapeutically acceptable carrier. It is about. In one embodiment, the composition or vaccine for immune system stimulation further comprises one or more other immune system stimulating polypeptides isolated from Streptococcus pneumoniae.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(적어도 이의 일부분)에 결합(전형적으로, 특이적으로 결합)할 수 있는 항체에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이고 또 다른 양태에서, 상기 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 양태에서, 상기 항체는 항체 단편이다. 항체 또는 항체 단편은 마우스, 래트, 염소, 닭, 인간 또는 토끼로부터 수득될 수 있다.The invention also relates to antibodies capable of binding (typically, specifically binding) to a polypeptide (at least a portion thereof) of the invention. In one embodiment, the antibody is a monoclonal antibody and in another embodiment, the antibody is a polyclonal antibody. In another embodiment, the antibody is an antibody fragment. The antibody or antibody fragment can be obtained from mouse, rat, goat, chicken, human or rabbit.
또한 본 발명은 매우 엄격한 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4 또는 이들의 상보적인 가닥의 적어도 일부분에 하이브리드화될 수 있는 단리된 핵산 분자(즉, 폴리누클레오티드로서, 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 벡터와 같은 큰 분자의 일부 또는 단편일 수 있다)에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 매우 엄격한 하이브리드화 조건에는, 예컨대, 6XSSC, 5X 덴하르트, 0.5% SDS, 및 100 ㎍/ml 단편화되고 변성된 연어 정자 DNA를 65℃에서 밤새 하이드리브화시키고 2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 약 10분 동안 1회에 이어 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척한 다음에 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척하는 것이 포함된다. 하나의 양태에서, 핵산 분자는 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리되며 또 다른 양태에서, 상기 핵산 분자는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 하나의 양태에서, 상기 폴리펩티드는 인간 보체 단백질C3를 분해시킨다. 또 다른 양태에서, 핵산 분자는 인간 보체 C3를 분해시키지 않는 폴리펩티드를 엔코딩한다.The invention also provides an isolated nucleic acid molecule (ie, a polynucleotide, which is capable of hybridizing to at least a portion of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 or complementary strands thereof under very stringent hybridization conditions, which is a single strand Or double stranded, part or fragment of a large molecule, such as a vector). As used herein, very stringent hybridization conditions include, for example, 6XSSC, 5X Denhardt, 0.5% SDS, and 100 μg / ml fragmented and denatured salmon sperm DNA at 65 ° C. overnight and 2X SSC. Wash at least once for about 10 minutes at room temperature in 0.1% SDS and then once for 15 minutes at 65 ° C. and then at least once for at least 3-5 minutes at room temperature in 0.2X SSC, 0.1% SDS. Included. In one embodiment, the nucleic acid molecule is isolated from Streptococcus pneumoniae and in another embodiment the nucleic acid molecule encodes a polypeptide. In one embodiment, the polypeptide degrades human complement protein C3. In another embodiment, the nucleic acid molecule encodes a polypeptide that does not degrade human complement C3.
또 다른 양태에서, 핵산 분자는 벡터내에 존재한다(즉, 이것은 핵산 벡터의 단편이다). 벡터는 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 또한 핵산 분자를 포함하고 있는 세포를 본 발명에서 고찰하였다. 하나의 양태에서, 세포는 세균 또는 진핵 세포이다.In another embodiment, the nucleic acid molecule is present in the vector (ie, it is a fragment of the nucleic acid vector). The vector may be an expression vector capable of producing a polypeptide. In addition, the cell containing the nucleic acid molecule was considered in the present invention. In one embodiment, the cell is a bacterial or eukaryotic cell.
또한 본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 핵산 서열 또는 이들의 상보적인 가닥을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 이중 가닥 DNA 서열에 의해 전사된 RNA 분자에 관한 것이다.The invention also relates to an isolated nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 or complementary strands thereof. The present invention also relates to RNA molecules transcribed by double stranded DNA sequences comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4.
본 발명의 또 다른 일면에서, 본 발명은 포유류(특히 인간)에게서 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역 반응을 생성시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법에는 본 발명의 폴리펩티드의 치료적 유효량을 함유하는 조성물 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포유류에게 투여하여, 상기 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 생성시키는 것이 포함된다. 면역 반응은 B 세포 반응, T 세포 반응, 상피세포 반응 또는 내피세포 반응일 수 있다. 바람직한 양태에서, 조성물은 백신 조성물이다. 바람직하게는 폴리펩티드의 길이는 15개 이상의 아미노산이고 바람직하게는 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 1종 이상의 면역계 자극성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 15개 이상의 아미노산을 포함한다.In another aspect of the invention, the invention relates to a method for generating an immune response against Streptococcus pneumoniae in a mammal (particularly a human). Such methods include administering to a mammal a composition containing a therapeutically effective amount of a polypeptide of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier to generate an immune response against said polypeptide. The immune response can be a B cell response, a T cell response, an epithelial cell response or an endothelial cell response. In a preferred embodiment, the composition is a vaccine composition. Preferably the polypeptide is at least 15 amino acids in length and preferably the composition further comprises at least one immune system stimulating polypeptide from Streptococcus pneumoniae. In one embodiment, the polypeptide comprises 15 or more amino acids of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5.
또한 본 발명은 인간 보체 C3를 분해시킬 수 있는 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15 kDa 내지 약 25 kDa 또는 약 75 kDa 내지 약 95 kDa의 단리된 폴리펩티드 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애-중재된 C3 분해를 억제시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 세균을 본 발명의 폴리펩티드(적어도 이의 일부분)에 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.The invention also provides isolated polypeptides of Streptococcus pneumoniae-mediated C3 and from about 15 kDa to about 25 kDa or about 75 kDa to about 95 kDa from Streptococcus pneumoniae that can degrade human complement C3. It relates to a method for inhibiting degradation. The method comprises contacting a Streptococcus pneumoniae bacterium with an antibody capable of binding to at least a portion of the polypeptide of the invention.
또한 본 발명은 이종이식에서의 C3-중재된 염증 및 거부반응을 억제시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 이종이식에 사용된 동물의 기관의 표면상에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 예컨대, 돼지의 신장이 본 명세서에 기술되어 있는 폴리펩티드를 발현시킴으로써 이종이식 후에 C3 중재된 염증을 억제시키도록 하기 위해 특히 유리하다.The invention also relates to methods for inhibiting C3-mediated inflammation and rejection in xenografts. The method comprises expressing a polypeptide of the present invention on the surface of an organ of an animal used for xenotransplantation. The method is particularly advantageous for inhibiting C3 mediated inflammation after xenograft, for example, by exposing the kidneys of pigs to the polypeptides described herein.
또한 본 발명은 매우 엄격한 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 핵산 서열 또는 이들의 상보적인 가닥의 적어도 일부분에 하이브리드화되는 15개 이상의 누클레오티드의 영역을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.The invention also provides an isolated nucleic acid molecule comprising regions of at least 15 nucleotides that hybridize to at least a portion of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 or their complementary strands under very stringent hybridization conditions. It is about.
또한 본 발명은 SEQ ID NO6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9에 제시되는 바와 같이 핵산 서열을 가진 단리된 DNA 분자 또는 프라이머에 관한 것이다.The invention also relates to an isolated DNA molecule or primer having a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
도면의 간단한 설명Brief description of the drawings
도 1은 본 발명의 C3 분해 폴리펩티드(약 20 kDa) 유전자의 번역된 부분의 핵산 서열을 제공한다(SEQ ID NO:1).1 provides nucleic acid sequences of the translated portion of the C3 degradation polypeptide (about 20 kDa) gene of the invention (SEQ ID NO: 1).
도 2는 본 발명의 C3 분해 폴리펩티드(약 20 kDa)의 아미노산 서열을 제공한다(SEQ ID NO:2).Figure 2 provides the amino acid sequence of the C3 degradation polypeptide of the present invention (about 20 kDa) (SEQ ID NO: 2).
도 3은 본 발명에 따른 C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열(이중 가닥)과 함께 지정된 C3 분해 폴리펩티드(약 20 kDa)의 아미노산 서열을 도시한 것이다(SEQ ID NO:1-3, 여기서 SEQ ID NO:3은 SEQ ID NO:1과 상보적이다).Figure 3 shows the amino acid sequence of a designated C3 degradation polypeptide (about 20 kDa) with a nucleic acid sequence (double strand) encoding a C3 degradation polypeptide according to the present invention (SEQ ID NO: 1-3, where SEQ ID NO : 3 is complementary to SEQ ID NO: 1).
도 4는 예측된 92 kDa 아미노산 서열에 대한 핵산 서열을 제공한다(SEQ ID NO:4).4 provides nucleic acid sequences for the predicted 92 kDa amino acid sequences (SEQ ID NO: 4).
도 5는 예측된 92 kDa 아미노산 서열을 제공한다(SEQ ID NO:5).5 provides the predicted 92 kDa amino acid sequence (SEQ ID NO: 5).
도 6은 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:4의 일부분에 대한 서열 정렬을 도시한 것이다.6 shows the sequence alignment for a portion of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4.
도 7은 SEQ ID NO:5의 일부분과 함께 SEQ ID NO:2의 서열 정렬을 도시한 것이다.7 shows the sequence alignment of SEQ ID NO: 2 with a portion of SEQ ID NO: 5.
도 8은 폴리클로날 항-약 r20 kDa 혈청과 몇몇 폐렴구균 전체 세포 용해질의 웨스턴 블롯 분석결과이다. 레인 1에 분자량 마커를 런닝시키고; 레인 2에 pDF122로부터의 재조합 20 kDa 폴리펩티드를 런닝시키고; 레인 3에 타입 7로부터의 재조합 92 kDa 폴리펩티드를 런닝시키고; 레인 4는 비워놓고; 레인 5에 CP1200 전체 세포 용해질을 런닝시키고; 레인 6에 타입 3 전체 세포 용해질을 런닝시키고; 레인 7에 타입 7 전체 세포 용해질을 런닝시켰다. 항혈청은 약 20 kDa 및 약 92 kDa의 재조합 폴리펩티드를 인식하였지만, 전체 세포 용해질중에서는 더 큰 폴리펩티드만을 인식하였다.FIG. 8 shows Western blot analysis of polyclonal anti-about r20 kDa serum and some pneumococcal whole cell lysates. A molecular weight marker is run in lane 1; Running recombinant 20 kDa polypeptide from pDF122 in lane 2; Running recombinant 92 kDa polypeptide from type 7 in lane 3; Leaving lane 4 blank; Running CP1200 whole cell lysate in lane 5; Running type 3 whole cell lysate in lane 6; Type 7 whole cell lysates were run in lane 7. Antisera recognized about 20 kDa and about 92 kDa recombinant polypeptides, but only larger polypeptides in total cell lysate.
도 9는 본 발명의 20 kDa 및 92 kDa 폴리펩티드에 의해 바이오티닐화된 C3의 분해를 보여주는 자동방사선사진이다.FIG. 9 is an autoradiograph showing degradation of biotinylated C3 by the 20 kDa and 92 kDa polypeptides of the present invention.
도 10은 본 발명의 20 kDa(레인 A8) 및 92 kDa(레인 C8) 폴리펩티드에 의한 C3 분해의 쿠마시 블루-염색된 7.5% SDS-PAGE 분석결과이다.10 shows Coomassie blue-stained 7.5% SDS-PAGE analysis of C3 degradation by 20 kDa (lane A8) and 92 kDa (lane C8) polypeptides of the present invention.
도 11은 MPL와 애쥬번트된 r79 kDa 단백질을 사용하여 SC(피하) 면역화시키고 스트렙토코쿠스 뉴모니애 타입 3를 IN(비내) 시험한 CBA/CAHNxid/J 마우스의 생존을 보여주는 챠트이다.FIG. 11 is a chart showing survival of CBA / CAHN xid / J mice challenged SC (subcutaneously) with MPL and an adjuvant r79 kDa protein and IN (nasal) tested for Streptococcus pneumoniae type 3.
도 12는 실시예 8에 기술하는 SDS-PAGE 겔이다.12 is an SDS-PAGE gel described in Example 8. FIG.
본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 특히 인간 보체 단백질 C3를 분해시킬 수 있는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩티드의 동정에 관한 것이다.The present invention relates to the identification of Streptococcus pneumoniae , in particular Streptococcus pneumoniae polypeptides that can degrade human complement protein C3.
본 발명은 약 75 kD 내지 약 95 kD의 더 큰 폴리펩티드의 인간 보체 C3 분해 폴리펩티드 단편의 동정 및 단리에 관한 것이다. 상기 단편은 10% SDS-PAGE 겔 상에서 약 20 kDa(±5 kDa)의 분자량을 가지고 있다. 또한 본 발명은 C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산에 관한 것이다.The present invention relates to the identification and isolation of human complement C3 degraded polypeptide fragments of larger polypeptides from about 75 kD to about 95 kD. The fragment has a molecular weight of about 20 kDa (± 5 kDa) on a 10% SDS-PAGE gel. The invention also relates to nucleic acids encoding C3 degradation polypeptides.
몇가지 혈청형으로부터의 폐렴구균의 지수적으로 성장중인 배양물이 정의된 C3 절단 단편을 생성시키지 않으면서, 먼저 C3의 β-사슬을 분해하고 나서 α-사슬을 분해시킬 수 있음이 관찰되었다(참조 : Angel, et al. J. Infect. Dis. 170:600-608, 1994). 절단이 없는 이러한 분해 패턴은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 엘라스타제 효소 및 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)의 시스테인 단백질분해효소와 같은 다른 미생물의 생성물의 패턴과 실질적으로 다르다.It has been observed that exponentially growing cultures of pneumococci from several serotypes can first degrade the β-chain of C3 and then the α-chain without producing defined C3 cleavage fragments (see Angel, et al. J. Infect. Dis. 170: 600-608, 1994). This cleavage pattern without cleavage differs substantially from that of other microbial products such as the elastase enzyme of Pseudomonas aeruginosa and the cysteine protease of Entamoeba histolytica .
본 명세서에 사용되는 용어 "분해하다"는 단백성 분자로부터 아미노산을 제거하여 펩티드 또는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 말한다. 본 발명의 폴리펩티드는 C3b, iC3b 또는 C3d로서 공지된 절단 단편을 생성시키지 않으면서 C3를 분해시킨다. 예컨대, C3 분해 폴리펩티드가 알부민과 같은 다른 단백질들을 분해시키지 않는 것 같다는 점에서 C3를 위한 본 발명의 C3 분해 폴리펩티드에 대한 적어도 어느 정도의 선호도가 존재한다.As used herein, the term “decompose” refers to the removal of amino acids from a protein molecule to produce a peptide or polypeptide. Polypeptides of the invention degrade C3 without producing a cleavage fragment known as C3b, iC3b or C3d. For example, there is at least some preference for the C3 degradation polypeptides of the invention for C3 in that the C3 degradation polypeptide does not appear to degrade other proteins such as albumin.
약 20 kDa의 C3 분해 폴리펩티드는 야생형 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 비해 C3 분해 활성이 감소된 클론들을 동정함으로써 삽입에 의해 차단된 폐렴구균 유전자의 라이브러리로부터 단리된다. 클론들의 C3 분해 활성을 평가하기 위한 예시적인 검정을 실시예 1에 제공하였다. 감소된 C3 분해 활성을 증명하는 클론들의 서열을 근거로 하여 감소된 C3 분해 활성을 가진 클론들을 동정하고 546 bp SmaI 삽입물을 선별하였다. 상기 SmaI 단편을 균주 CP1200으로부터 만들어진 스트렙토코쿠스 뉴모니애 라이브러리를 프로빙하기 위해 사용하였다. SmaI 단편에 하이브리드화되는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 라이브러리로부터의 포지티브 클론들을 단리시키고 C3 분해 활성과 관련되어 있는 유전자의 오픈 리딩 프레임을 동정하였다. PspA의 일부분과 서열 동일성을 가진 다음의 올리고누클레오티드(SEQ ID NO:10)을 차별적 하이브리드화에 의해 C3 분해 단백질분해효소를 엔코딩하는 유전자가 PspA를 엔코딩하는 유전자와 격리되어 있는지를 확정하기 위해 사용하였다.About 20 kDa C3 degradation polypeptides are isolated from a library of pneumococcal genes blocked by insertion by identifying clones with reduced C3 degradation activity compared to wild type Streptococcus pneumoniae. Exemplary assays for assessing C3 degradation activity of clones are provided in Example 1. Clones with reduced C3 degradation activity were identified based on the sequence of clones demonstrating reduced C3 degradation activity and 546 bp SmaI inserts were selected. The SmaI fragment was used to probe the Streptococcus pneumoniae library made from strain CP1200. Positive clones from the Streptococcus pneumoniae library hybridizing to SmaI fragments were isolated and an open reading frame of genes involved in C3 degradation activity was identified. The following oligonucleotide (SEQ ID NO: 10) with sequence identity to a portion of PspA was used to confirm that the gene encoding C3 degrading protease was isolated from the gene encoding PspA by differential hybridization. .
SEQ ID NO:10SEQ ID NO: 10
GAAAACAATAATGTAGAAGACTACTTTAAAGAAGGTTAGAGAAAACAATAATGTAGAAGACTACTTTAAAGAAGGTTAGA
20 kDa 폴리펩티드의 오픈 리딩 프레임은 약 20 kDa(+/- 5 kDa)의 분자량의 폴리펩티드 또는 약 168 아미노산(SEQ ID NO:2)으로 예상되는 약 500 염기쌍(SEQ ID NO:1)의 지역만큼의 길이이다. C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 예시적인 유전자 서열을 SEQ ID NO:1로서 도 1에 제공하였고 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:2로서 도 2에 제공하였다. 도 3은 SEQ ID NO:1-3으로서 바람직한 유전자 서열을 상응하는 바람직한 번역된 폴리펩티드와 합쳐놓은 것이다.The open reading frame of a 20 kDa polypeptide is as large as a polypeptide of molecular weight of about 20 kDa (+/- 5 kDa) or an area of about 500 base pairs (SEQ ID NO: 1) that is expected to be about 168 amino acids (SEQ ID NO: 2). Length. An exemplary gene sequence encoding a C3 degraded polypeptide is provided in FIG. 1 as SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of the polypeptide is provided in FIG. 2 as SEQ ID NO: 2. 3 combines the preferred gene sequence as SEQ ID NO: 1-3 with the corresponding preferred translated polypeptide.
SEQ ID NO:2를 사용하여, 약 20 kDa 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 또는 Swiss Prot 데이터베이스에서 다른 폴리펩티드와 무관한 것으로 결정되었다. 예상된 폴리펩티드는, 특히 아미노산 80-108번 사이에서 원핵생물의 막 도메인의 프롤린이 풍부한 서열 특징을 포함하며 이는 상기 폴리펩티드가 표면에서 발현됨을 시사한다. 아미노산 서열은 분명치 않은 콜린-결합 반복단위를 나타내었다. 상층액 및 용해질 둘 모두에서 약 20 kDa(±5 kDa)에서 C3 동정된 용해 밴드를 스며들게 한 SDS-PAGE 겔 상에서의 CP 1200의 배양물로부터의 폐렴구균 용해질 및 상층액의 전기영동을 통해 SEQ ID NO:2에 의해 예상된 크기의 폴리펩티드가 C3 분해 활성을 가짐을 확정하였다(실시예 2 참조). 실시예 3에서의 경우와 같이, 20 kDa C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자는 5종의 혈청형(혈청형 1, 3, 4, 14 및 19F)을 나타내는 적어도 24개의 폐렴구균 분리물에 보존되어 있었다.Using SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of about 20 kDa polypeptide was determined to be independent of other polypeptides in the GenBank or Swiss Prot database. The anticipated polypeptides include proline-rich sequence characteristics of the prokaryotic membrane domain, particularly between amino acids 80-108, suggesting that the polypeptide is expressed on the surface. The amino acid sequence exhibited unclear choline-binding repeat units. SEQ IDENTIFICATION via electrophoresis of pneumococcal lysate and supernatant from a culture of CP 1200 on an SDS-PAGE gel infiltrating a C3 identified lysis band at about 20 kDa (± 5 kDa) in both supernatant and lysate It was confirmed that the polypeptide of the size expected by NO: 2 had C3 degradation activity (see Example 2). As in Example 3, the gene encoding the 20 kDa C3 degraded polypeptide was conserved in at least 24 pneumococcal isolates showing five serotypes (serum types 1, 3, 4, 14 and 19F). .
본 발명의 C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 대장균내의 유전자 발현 벡터내로 삽입시켰다. 재조합 C3 분해 폴리펩티드를 실시예들에서 기술하는 바와 같이 단리하였다. 통상적인 당업자는 SEQ ID NO:1에서 제공되는 바와 같은 소정의 특정 유전자 서열에 있어서, 상기 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 다양한 발현 벡터가 존재한다는 것을 알 것이다. 추가적으로, 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 생성시키고 단리하기 위해 사용될 수 있는 당분야에 공지되어 있는 다양한 방법들이 존재하며 통상적인 당업자는 본 발명의 C3 분해 검정을 통해 실시예에 제공된 발현 시스템에 추가적으로특정 발현 시스템이 지나친 실험을 할 필요없이 기능적인 지가 결정될 것임을 알 것이다. 다양한 분자적 및 면역학적 기술들은 문헌들(참조 : Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY and Harlow et al. Antibodies; A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)과 같은 기본적인 기술서에서 발견될 수 있다.The nucleotide sequence encoding the C3 degradation polypeptide of the invention was inserted into a gene expression vector in E. coli. Recombinant C3 degraded polypeptides were isolated as described in the Examples. Those skilled in the art will appreciate that for any particular gene sequence as provided in SEQ ID NO: 1, there are a variety of expression vectors that can be used to express the gene. In addition, there are a variety of methods known in the art that can be used to generate and isolate recombinant polypeptides of the invention and those of ordinary skill in the art will appreciate in addition to the expression systems provided in the Examples through the C3 degradation assays of the invention. It will be appreciated that the functionality will be determined without the need for this overexperiment. Various molecular and immunological techniques are described in Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY and Harlow et al. Antibodies; A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor , NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
본 발명의 C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 균주 CP1200으로부터의 폐렴구균 지놈 DNA 단편을 사용하여 만들어진 플라스미드 라이브러리를 사용하여 동정하였다. 플라스미드 라이브러리를 수득하기 위한 공지된 다양한 방법이 존재하지만, 바람직한 전략에 있어서, 플라스미드 라이브러리는 폐렴구균 균주 CP 1200[디.에이. 모리슨(D.A. Morrison, University of Illinois, Champagne-Urbana, Illinois)으로부터 수득되고 문헌(Havarstein LF, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1995; 92:11140-11144)에 기술된]으로부터의 폐렴구균 지놈 DNA 단편들(0.5-4.0 kb)로 Sau 3A 분해시키고 통합성 셔틀 벡터 pVA 891(ermr,cmr; 대장균의 복제 원점을 가지고 있음)의 Bam HI 부위내로 삽입시킴으로써 구성된다. 상기 라이브러리를 일렉트로포레이션에 의해 대장균 DH5α MCR 균주내로 형질전환시켰다. 임의적으로 선택된 대장균 혈질전환체 일부의 플라스미드 추출에 의해 모든 형질전환체가 재조합 플라스미드를 포함하고 있음이 밝혀졌다.Polynucleotides encoding C3 degraded polypeptides of the invention were identified using plasmid libraries made using pneumococcal genome DNA fragments from strain CP1200. There are a variety of known methods for obtaining plasmid libraries, but in a preferred strategy, the plasmid library is a pneumococcal strain CP 1200 [D.A. From Morrison (University of Illinois, Champagne-Urbana, Illinois) and described in Havarstein LF, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1995; 92: 11140-11144). Sau 3A digested with pneumococcal genome DNA fragments (0.5-4.0 kb) and inserted into the Bam HI site of the integrated shuttle vector pVA 891 (erm r , cm r ; having the origin of replication of E. coli). The library was transformed into E. coli DH5α MCR strain by electroporation. Plasmid extraction of some of the randomly selected E. coli hemotransformants revealed that all transformants contained recombinant plasmids.
플라스미드 라이브러리 DNA는 대장균 형질전환체로부터 추출되어 동종 재조합에 의한 삽입 돌연변이유발을 사용하여 CP 1200 모(母) 폐렴구균 균주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.Plasmid library DNA can be extracted from E. coli transformants and used to transform CP 1200 parental pneumococcal strains using insertion mutagenesis by homologous recombination.
폐렴구균 균주 CP 1200 세포는 CTM 배지중에서 HCl 방법을 사용하는 pH 변화를 사용하여 수용성으로 만들어 질 수 있다. 수용성 세포는 필요시까지 작은 분취량으로 -70℃에서 동결된다.Pneumococcal strain CP 1200 cells can be made water soluble using a pH change using the HCl method in CTM medium. Water soluble cells are frozen at −70 ° C. in small aliquots until needed.
본 발명의 단리된 폴리펩티드를 PBS의 존재하에 37℃에서 4시간 이상 동안 인간 보체 C3와 인큐베이션시킴으로써 C3 분해를 탐지할 수 있다. 단리된 폐렴구균 폴리펩티드가 없는 대조 샘플이 비교 목적을 위한 대조군으로서 사용된다.C3 degradation can be detected by incubating an isolated polypeptide of the invention with human complement C3 for at least 4 hours at 37 ° C. in the presence of PBS. A control sample without isolated pneumococcal polypeptide is used as a control for comparison purposes.
본 발명의 폴리펩티드는 약 15 kDa 내지 약 25 kDa; 바람직하게는 약 20 kDa; 또는 약 75 kDa 내지 약 95 kDa; 및 바람직하게는 약 92 kDa의 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 명백한 분자량을 가지고 있다. 예시적인 폴리펩티드 서열들을 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:5로 제공하였다. 당업자는 아미노산 서열에 있어서 어느 정도의 가변성이 예상되며 이러한 가변성이 본 발명의 범위를 축소시키지 않음을 알 것이다. 예를 들어, 보존된 돌연변이는 본 발명을 축소시키지 않으며또한 폴리펩티드가 인간 보체 단백질 C3를 분해시킬 수 있는 경우, 특히 폴리펩티드가 스트렙토코쿠스 뉴모니애 세균으로부터 단리되거나 본래 수득되는 경우 약 80% 미만의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 약 90% 미만의 아미노산 서열 동일성에 있어서의 변화를 축소시키지도 않는다. 또한 단백질 및 이들의 단편(모두를 폴리펩티드라고 부른다)은, 특히 이들이 인간 보체 단백질 C3를 분해시킬 수 있는 경우, 본 발명의 범위내에 존재한다.Polypeptides of the invention may comprise from about 15 kDa to about 25 kDa; Preferably about 20 kDa; Or about 75 kDa to about 95 kDa; And preferably have an apparent molecular weight on a 10% SDS-polyacrylamide gel of about 92 kDa. Exemplary polypeptide sequences are provided in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5. Those skilled in the art will appreciate that some degree of variability in amino acid sequences is expected and such variability does not reduce the scope of the present invention. For example, conserved mutations do not diminish the invention and also less than about 80% when the polypeptide can degrade human complement protein C3, especially when the polypeptide is isolated or originally obtained from Streptococcus pneumoniae bacteria. Nor does it reduce the change in amino acid sequence identity, preferably less than about 90% amino acid sequence identity. Proteins and fragments thereof, all of which are referred to as polypeptides, fall within the scope of the present invention, especially if they are capable of digesting human complement protein C3.
일부 핵산 서열 가변성은 폐렴구균 균주간에 예상되며 혈청형은 어느 정도의 핵산 가변성이다. 보존된 아미노산 치환체는 당분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 아미노산에 속하는 동일 클래스로부터의 다른 구성원을 사용하는 아미노산 치환체를 포함한다. 예를 들어, 비극성 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양전하성(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함된다. 음전하성(산성) 아미노산에는 아스파트산 및 글루탐산이 포함된다. 이러한 변화들은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점에 의해 결정된 바와 같이 명백한 분자량에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않는다. 특히 바람직한 보존성 치환체에는 양전하를 유지하기 위한 Arg 대신 Lys 및 반대; 음전하를 유지하기 위한 Asp 대신 Glu 및 반대; 유리 -OH를 유지하기 위한 Thr 대신 Ser; 및 유리 NH2를 유지하기 위한 Asn 대신 Gln이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.Some nucleic acid sequence variability is expected between pneumococcal strains and serotypes are somewhat nucleic acid variable. Conserved amino acid substituents are known in the art and include, for example, amino acid substituents using other members from the same class belonging to the amino acid. For example, nonpolar amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine and tryptophan. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. These changes are not expected to affect the apparent molecular weight as determined by polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectric point. Particularly preferred conservative substituents include Lys and vice versa instead of Arg to maintain a positive charge; Glu and vice versa instead of Asp to maintain negative charge; Ser instead of Thr to maintain free -OH; And Gln instead of Asn to maintain free NH 2 .
본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 다른 폴리펩티드들에는 인간 보체 폴리펩티드 C3를 분해시키는 폴리펩티드가 포함되며 또한 6X SSC, 5X 덴하르트, 0.5% SDS(소듐 도데실 설페이트) 및 100 ㎍/ml 단편화되고 변성된 연어 정자 DNA를 65℃에서 밤새 하이브리드화시키고 2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 약 10분 동안 1회에 이어서 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척한 다음 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척하는 것과 같은 매우 엄격한 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4에 하이브리드화되는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 가지는 것들을 본 발명에서 고찰하였다. 전형적으로, SSC 용액은 스톡 용액을 제조하기 위해 염화나트륨, 나트륨 시트레이트 및 물을 포함하고 있다.Preferred polypeptides of the invention include polypeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. Other polypeptides include polypeptides that degrade human complement polypeptide C3 and also hybridize 6X SSC, 5X Denhard, 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 100 μg / ml fragmented and denatured salmon sperm DNA at 65 ° C. overnight. And wash once for about 10 minutes at room temperature in 2X SSC, 0.1% SDS, then once for about 15 minutes at 65 ° C. and then at least once for at least 3-5 minutes at room temperature in 0.2X SSC, 0.1% SDS. Those having nucleic acids encoding polypeptides that hybridize to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 under very stringent hybridization conditions such as washing have been considered in the present invention. Typically, the SSC solution contains sodium chloride, sodium citrate and water to prepare a stock solution.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드로서 단리되거나 제조될 수 있다. 즉, 단백질 또는 이의 일부분을 엔코딩하는 핵산은 발현 벡터내로 혼입되거나 세포의 염색체내로 혼입되어 세포내에서 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 폴리펩티드는 세균 또는 또 다른 세포, 바람직하게는 진핵 세포 및 더욱 바람직하게는 동물 세포로부터 정제될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 스트렙토코쿠스 뉴모닌애 세포와 같은 폴리펩티드를 발현시키는 세포로부터 단리될 수 있다. 따라서, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 용어 "폴리펩티드"가 사용되는 경우 본 발명의 범위내에서 고려되는 것이다. 폴리펩티드는 바람직하게는 길이가 15개 이상의 아미노산이고 바람직한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5로부터의 15개 이상의 연속적인 아미노산을 가지고 있다.Polypeptides of the invention can be isolated or prepared as recombinant polypeptides. That is, a nucleic acid encoding a protein or portion thereof can be incorporated into an expression vector or incorporated into a cell's chromosome to express the polypeptide within the cell. The polypeptide may be purified from bacteria or another cell, preferably eukaryotic cells and more preferably animal cells. In addition, the polypeptide can be isolated from cells expressing the polypeptide, such as Streptococcus pneumoniae cells. Thus, a protein, peptide or polypeptide is contemplated within the scope of the present invention when the term “polypeptide” is used. The polypeptide is preferably at least 15 amino acids in length and the preferred polypeptide has at least 15 contiguous amino acids from SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5.
또한 약 15 kDa 내지 약 20 kDa 폴리펩티드 및 약 75 kD 내지 약 95 kD 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 본 발명의 일부분이다. SEQ ID NO:1 및 4는 C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 바람직한 핵산 분자이다. 당업자는 어느 정도의 치환이 C3 분해 폴리펩티드의 특성 또는 성질이 실질적으로 변화되는 정도까지는 C3 분해 폴리펩티드 서열을 변화시키지 않음을 알 것이다. 예를 들어, SEQ ID NO:1과 80% 이상의 동일성을 가진 핵산을 본 발명에서 고찰하였다. 특정 핵산 서열이 본 발명의 범위내에 속하는 지를 결정하는 방법은 특정 핵산 서열이 C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하고 있는지 및 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4와 비교했을 때 80% 이상의 핵산 동일성을 가지는 지를 고찰하는 것이다. C3 폴리펩티드를 엔코딩하는 다른 핵산 서열들은 C3 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5와 동일한 서열 또는 90% 이상의 서열 동일성을 가지지만, 핵산 서열에 대해서 변성을 포함하는 경우에 C3 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 변성 코돈이란 상이한 삼문자 코돈이 동일한 아미노산을 지정하기 위해 사용되는 것을 의미한다. 예를 들어, 하기 RNA 코돈(DNA 코돈에 상응하며, 따라서, T 대신 U를 사용함)가 각각의 특이적인 아미노산을 위한 코돈으로 상호교환적으로 사용될 수 있음은 당분야에 널리 공지되어 있다:Also nucleic acids encoding about 15 kDa to about 20 kDa polypeptides and about 75 kD to about 95 kD polypeptides are part of the present invention. SEQ ID NOs: 1 and 4 are preferred nucleic acid molecules encoding C3 degradation polypeptides. Those skilled in the art will appreciate that some degree of substitution does not alter the C3 degraded polypeptide sequence to the extent that the properties or properties of the C3 degraded polypeptide are substantially changed. For example, nucleic acids having at least 80% identity with SEQ ID NO: 1 have been considered in the present invention. A method of determining whether a particular nucleic acid sequence is within the scope of the present invention is whether the particular nucleic acid sequence encodes a C3 degraded polypeptide and has at least 80% nucleic acid identity as compared to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4. To consider. Other nucleic acid sequences encoding C3 polypeptides encode a C3 polypeptide when the C3 polypeptide has the same sequence or at least 90% sequence identity as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 but includes denaturation to the nucleic acid sequence. It includes a nucleic acid. Denatured codon means that different three letter codons are used to designate the same amino acid. For example, it is well known in the art that the following RNA codons (corresponding to DNA codons, and thus using U instead of T) can be used interchangeably as codons for each specific amino acid:
페닐알리닌(Phe 또는 F) UUU, UUC, UUA 또는 UUGPhenylalanine (Phe or F) UUU, UUC, UUA, or UUG
류신(Leu 또는 L) CUU, CUC, CUA 또는 CUGLeucine (Leu or L) CUU, CUC, CUA or CUG
이소류신(Ile 또는 I) AUU, AUC 또는 AUAIsoleucine (Ile or I) AUU, AUC or AUA
메티오닌(Met 또는 M) AUGMethionine (Met or M) AUG
발린(Val 또는 V) GUU, GUC, GUA, GUGValine (Val or V) GUU, GUC, GUA, GUG
세린(Ser 또는 S) AGU 또는 AGCSerine (Ser or S) AGU or AGC
프롤린(Pro 또는 P) CCU, CCC, CCA, CCGProline (Pro or P) CCU, CCC, CCA, CCG
트레오닌(Thr 또는 T) ACU, ACC, ACA, ACGThreonine (Thr or T) ACU, ACC, ACA, ACG
알라닌(Ala 또는 A) GCU, GCG, GCA, GCCAlanine (Ala or A) GCU, GCG, GCA, GCC
트립토판(Trp) UGGTryptophan (Trp) UGG
티로신(Tyr 또는 Y) UAU 또는 UACTyrosine (Tyr or Y) UAU or UAC
히스티딘(His 또는 H) CAU 또는 CACHistidine (His or H) CAU or CAC
글루타민(Gln 또는 Q) CAA 또는 CAGGlutamine (Gln or Q) CAA or CAG
아스파라긴(Asn 또는 N) AAU 또는 AACAsparagine (Asn or N) AAU or AAC
리신(Lys 또는 K) AAA 또는 AAGLysine (Lys or K) AAA or AAG
아스파트산(Asp 또는 D) GAU 또는 GACAspartic Acid (Asp or D) GAU or GAC
글루탐산(Glu 또는 E) GAA 또는 GAGGlutamic Acid (Glu or E) GAA or GAG
시스테인(Cys 또는 C) UGU 또는 UGCCysteine (Cys or C) UGU or UGC
아르기닌(Arg 또는 R) AGA 또는 AGGArginine (Arg or R) AGA or AGG
글리신(Gly 또는 G) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGGGlycine (Gly or G) GGU or GGC or GGA or GGG
종결 코돈 UAA, UAG 또는 UGATerminating codon UAA, UAG or UGA
또한, 특정 DNA 서열을 개질시켜 특정 세포 타입을 위해 바람직한 코돈으로 활용할 수 있다. 예를 들어, 대장균을 위한 바람직한 코돈 사용법은 공지되어 있으며, 인간을 포함하는 동물을 위한 바람직한 코돈도 마찬가지다. 이러한 변화는당업자에게 공지되어 있으며 그러므로 이러한 유전자 서열을 본 발명의 일부분으로 고찰하였다. 다른 핵산 서열에는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4로부터의 길이가 15개 이상, 바람직하게는, 30개 이상인 핵산 또는 6X SSC, 5X 덴하르트, 0.5% SDS, 및 100 ㎍/ml 단편화되고 변성된 연어 정자 DNA를 65℃에서 밤새 하이브리드화시키고 2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 약 10분 동안 세척한 다음 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척에 이어 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 3-5분 이상 동안 1회 세척하는 것과 같은 매우 엄격한 하이브리드화 조건하에서 핵산 단편이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4에 하이브리드화되는 경우, 길이가 15개 이상, 바람직하게는 30개 이상인 핵산의 다른 핵산 단편들이 포함된다.In addition, certain DNA sequences can be modified to be utilized as preferred codons for specific cell types. For example, preferred codon usage for E. coli is known, and so is the preferred codon for animals including humans. Such changes are known to those skilled in the art and therefore such gene sequences have been considered as part of the present invention. Other nucleic acid sequences include at least 15, preferably at least 30, nucleic acids or 6X SSC, 5X Denhard, 0.5% SDS, and 100 μg / ml fragments from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, and Denatured salmon sperm DNA was hybridized overnight at 65 ° C. and washed for 10 minutes at room temperature in 2 × SSC, 0.1% SDS followed by one wash at 65 ° C. for about 15 minutes followed by room temperature in 0.2 × SSC, 0.1% SDS. If the nucleic acid fragment hybridizes to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 under very stringent hybridization conditions such as one wash for at least 3-5 minutes at, a length of at least 15, preferably 30 Other nucleic acid fragments of the above nucleic acid are included.
본 발명의 핵산 분자들은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 전부, 전무(즉, 전사될 수 없는 단편, 유전자의 조절 부분을 포함하는 단편 등) 또는 일부분을 엔코딩할 수 있고 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5로부터의 9개 이상의 아미노산을 엔코딩하는 연속적인 핵산 단편을 포함한다. C3 분해 폴리펩티드의 일부분을 엔코딩하는 핵산 분자를 본 발명에서 고찰했기 때문에, 핵산 분자 전부가 C3 분해 활성을 가진 단백질 또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하지는 않을 것임이 이해될 것이다. 또한, 본 발명의 핵산은 돌연변이시킴으로써 상기 폴리펩티드의 C3 분해 활성을 제거하거나 아니면 불활성화시킬 수 있다. 그러므로, 상기 기술된 하이브리드화 요건을 충족시키는 C3 분해 활성이 없는 폴리펩티드들을 엔코딩하는 핵산 분자들을 또한 고찰하였다. 핵산 서열을 돌연변이시키거나 아니면 변화시키는 방법은 당분야에 널리 알려져 있으며 면역원성이지만 효소학적으로 불활성인 폴리펩티드의 생성을 치료적 유용성에 대해 시험할 수 있다.Nucleic acid molecules of the invention may encode all, none (ie, non-transcribed fragments, fragments comprising regulatory portions of the gene, etc.) or portions of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 and preferably Contiguous nucleic acid fragments encoding at least 9 amino acids from SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. Since nucleic acid molecules encoding portions of C3 cleavage polypeptides are contemplated herein, it will be understood that not all nucleic acid molecules will encode proteins or peptides or polypeptides having C3 cleavage activity. In addition, the nucleic acid of the present invention can be mutated to eliminate or otherwise inactivate the C3 degradation activity of the polypeptide. Therefore, nucleic acid molecules encoding polypeptides lacking C3 degradation activity that meet the hybridization requirements described above were also considered. Methods of mutating or otherwise altering nucleic acid sequences are well known in the art and can be tested for therapeutic utility in the generation of immunogenic but enzymatically inactive polypeptides.
본 발명의 핵산 분자들을 핵산 벡터내로 혼입시키거나 숙주 지놈내로 작동가능하게 혼입시킴으로써 재조합 키메라 폴리펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 하나의 양태에서, C3 분해 폴리펩티드는 벡터내의 유전자에 의해 엔코딩되며 상기 벡터는 세포내에 존재한다. 바람직하게는, 상기 세포는 세균과 같은 진핵 세포이다. 유전자 및 유전자 단편들은 유전자의 전부 또는 일부분과 또 다른 유전자의 융합으로서 존재할 수 있으며 C3 분해 폴리펩티드는 융합 단백질이 단일 단백질로서 발현되는 경우 하나 이상의 단백질의 융합 단백질로서 존재할 수 있다. 본 발명의 다양한 핵산 벡터들이 당분야에 공지되어 있으며 이에는 수많은 시판 발현 플라스미드 또는 바이러스 벡터들이 포함된다. 상기 벡터들의 사용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예시적인 벡터들을 실시예에서 사용하였지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안될 것이다.Recombinant polypeptides, including recombinant chimeric polypeptides, can be generated by incorporating the nucleic acid molecules of the invention into a nucleic acid vector or operably incorporation into a host genome. In one embodiment, the C3 degradation polypeptide is encoded by a gene in the vector and the vector is present in the cell. Preferably, the cell is a eukaryotic cell such as a bacterium. Genes and gene fragments may exist as a fusion of all or a portion of a gene with another gene and the C3 degraded polypeptide may exist as a fusion protein of one or more proteins when the fusion protein is expressed as a single protein. Various nucleic acid vectors of the invention are known in the art and include many commercially available expression plasmids or viral vectors. The use of such vectors is well known to those skilled in the art. Exemplary vectors were used in the examples, but should not be construed as limiting the scope of the invention.
또한 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15 kDa 내지 약 25 kDa; 바람직하게는 약 20 kDa; 및 약 75 kDa 내지 약 95 kDa; 바람직하게는 92 kDa의 폴리펩티드에 결합(전형적으로 특이적으로 결합)할 수 있는 항체에 관한 것이며 바람직하게는 상기 폴리펩티드는 인간 보체 C3를 분해시킬 수 있다. 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들은 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부분에 대해 바람직할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 항체를 제조하는 방법은 널리 공지되어 있으며 예컨대, 문헌(참조 : Harlow et al., Antibodies; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)에 잘 기술되어있다. 바람직한 예에서, 항체는 인간 유도된, 래트 유도된, 마우스 유도된, 염소 유도된, 닭 유도된 또는 토끼 유도된 것일 수 있다. 또한 폴리펩티드-결합 항체 단편들 및 키메라 단편들이 공지되어 잇으며 본 발명의 범위내에 존재한다.The present invention also provides about 15 kDa to about 25 kDa from Streptococcus pneumoniae; Preferably about 20 kDa; And about 75 kDa to about 95 kDa; Preferably it relates to an antibody capable of binding (typically specifically binding) to a 92 kDa polypeptide and preferably said polypeptide is capable of degrading human complement C3. Polyclonal or monoclonal antibodies may be preferred for all or part of the polypeptides of the invention. Methods for making antibodies to polypeptides are well known and are described, for example, in Harlow et al., Antibodies; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. In a preferred embodiment, the antibody may be human induced, rat induced, mouse induced, goat induced, chicken induced or rabbit induced. Polypeptide-binding antibody fragments and chimeric fragments are also known and are within the scope of the present invention.
또한 본 발명은 면역 자극성 조성물의 용도에 관한 것이다. 용어 "면역 자극성" 또는 "면역계 자극성" 조성물이란 포유류와 같은 피검자에게서 1종 이상의 세포 타입의 면역계를 활성화시키는 본 발명에 따른 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 조성물을 말한다. 바람직하게는, 면역 자극성 조성물은 정상적인, 즉, 비감염된 피검자에게 면역화 반응 또는 예방적 이로움, 전형적으로 백신을 제공한다. 그러나, 임의의 알맞은 면역 반응은 치료 응용 및 프로토콜에 있어서 피검자에게 유익하다. 면역계의 바람직한 활성화된 세포에는 호중구 또는 대식세포, T 세포, B 세포, 상피세포 및 내피세포와 같은 식세포가 포함된다. 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는 면역 자극성 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 염구하기 위한 래트, 마우스, 염소, 닭, 토끼 또는 인간 또는 동물 모델과 같은 동물에게서 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 면역 자극성 조성물은 C3 분해 폴리펩티드로부터의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 펩티드 또는 폴리펩티드의 면역 자극성 양, 예컨대, 치료적 유효량을 포함한다.The present invention also relates to the use of an immune stimulating composition. The term "immunostimulatory" or "immunostimulatory" composition refers to a protein, peptide or polypeptide composition according to the invention which activates the immune system of one or more cell types in a subject, such as a mammal. Preferably, the immune stimulating composition provides an immunization response or prophylactic benefit, typically a vaccine, to a normal, ie uninfected subject. However, any suitable immune response is beneficial to the subject in therapeutic applications and protocols. Preferred activated cells of the immune system include neutrophils or macrophages, T cells, B cells, epithelial cells and endothelial cells. Immunostimulatory compositions containing the peptides, polypeptides or proteins of the invention can be used to produce antibodies in rats, mice, goats, chickens, rabbits or animals such as humans or animal models for the purpose of streptococcus pneumoniae infection. Can be. Preferred immune stimulating compositions comprise an immune stimulating amount, such as a therapeutically effective amount, of at least one peptide or polypeptide comprising at least 15 amino acids from a C3 degradation polypeptide.
용어 "백신"이란 면역화를 위한 조성물을 말한다. 이 과정은 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 항원, 핵산 서열 또는 상보적인 서열, 예컨대, 안티-센스, 또는 항체, 또는 이들의 현탁물의 투여를 포함할 수 있으며, 여기서 투여시에, 분자는 활성적인 면역성을 생성시키고 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염 또는 콜로니형성에대한 보호를 제공할 것이다. 전형적으로, 상기 백신들은 주사가능물질인 액체 용액 또는 현탁물로서 제조된다. 주입전에 액체중의 용액 또는 현탁물을 위해 적합한 고체 형태로 제조될 수도 있다. 백신 제조는 선택적으로 에멀젼화 또는 리포좀내에 캡슐화될 수도 있다.The term "vaccine" refers to a composition for immunization. This process may involve the administration of a protein, peptide, polypeptide, antigen, nucleic acid sequence or complementary sequence, such as anti-sense, or an antibody, or suspension thereof, wherein upon administration, the molecule is active And protect against Streptococcus pneumoniae infection or colony formation. Typically, the vaccines are prepared as liquid solutions or suspensions which are injectables. It may be prepared in a solid form suitable for solution or suspension in liquid prior to injection. Vaccine preparation may optionally be encapsulated in emulsification or liposomes.
면역 자극성 조성물(백신과 같은)은 PBS(인산염 완충 염수) 또는 면역계를 자극하기 위해 숙주내로의 폴리펩티드의 주입을 위해 적합하고 안전한 것 으로서 당분야에서 인식되고 있는 또 다른 완충액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액 또는 캐리어중의 다른 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 또한 면역 자극성 조성물들은 애쥬번트 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 또는 다른 생물체로부터의 면역 자극성 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 다른 면역계 자극성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 칵테일이 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 제어하기 위해 가장 유용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이들의 단편들은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 콜로니형성 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 콜로니형성의 병리학적 결과를 막거나 제한시키기 위한 백신 제조에 사용된다.Immune stimulating compositions (such as vaccines) are pharmaceutically acceptable, such as PBS (phosphate buffered saline) or another buffer known in the art as suitable and safe for infusion of polypeptides into the host to stimulate the immune system. It may further comprise other polypeptides in a buffer or carrier. Immune stimulating compositions may also include other immune system stimulating polypeptides, such as immune stimulating proteins, peptides or polypeptides from adjuvant or Streptococcus pneumoniae or other organisms. For example, a cocktail of peptides or polypeptides may be most useful for controlling Streptococcus pneumoniae infection. Preferably one or more polypeptides or fragments thereof of the invention are used in the manufacture of a vaccine to prevent or limit the pathological consequences of Streptococcus pneumoniae colony formation or Streptococcus pneumoniae colony formation.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "치료적 유효량"이란 원하는 결과의 생성을 위해 효과적인 양을 말한다. 치료적 유효량은 건강 및 피검자의 면역계, 즉, 항체를 합성하는 물리적인 상태, 원하는 보호의 정도, 준비된 제형 및 다른 관련 인자에 따라 다르다. 치료적 유효량이 통상적인 시도를 통해 결정될 수 있는 비교적 폭넓은 범위가 될 것임이 예상된다.As used herein, "therapeutically effective amount" refers to an amount effective for producing a desired result. The therapeutically effective amount depends on the health and the immune system of the subject, ie the physical condition of the antibody synthesis, the degree of protection desired, the formulation prepared and other related factors. It is anticipated that a therapeutically effective amount will be in a relatively wide range that can be determined through routine trials.
활성 면역 자극성 성분들은 종종 캐리어로서 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 호환성인 부형제 또는 희석제와 혼합된다. 용어 "약제학적으로 허용되는 캐리어"란 조성물의 다른 성분과 호환성이고 이들의 수용에 대해 해롭지 않다는 측면에서 허용되는 캐리어(들)를 말한다. 예를 들어, 적합한 부형제는 물, 염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물이다. 추가적으로, 원하는 경우, 면역 자극성 조성물(백신을 포함하여)은 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충제 및/또는 면역 자극성 조성물의 효과를 향상시키는 애쥬번트와 같은 소량의 보조 물질을 포함할 수 있다.Active immune stimulating ingredients are often mixed with excipients or diluents which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient as carriers. The term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to an acceptable carrier (s) in the sense of being compatible with other components of the composition and not harmful to their acceptance. For example, suitable excipients are water, saline, dextrose, glycerol, ethanol and the like and combinations thereof. Additionally, if desired, immune stimulating compositions (including vaccines) may comprise small amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffers and / or adjuvants that enhance the effects of the immune stimulating composition.
효과적일 수 있는 애쥬번트 또는 캐리어의 예에는 수산화 알루미늄, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP); N-아세틸-nor-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP라고도 부름), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE라고도 부름), 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼중의 세균으로부터 추출된 세가지 구성성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로오스 디미콜레이트 및 세포벽 골격(MPL + TDM + CWS)을 포함하고 있는 RIBI가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.Examples of adjuvants or carriers that may be effective include aluminum hydroxide, N-acetyl-muramil-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP); N-acetyl-nor-muramil-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11637, also called nor-MDP), N-acetylmuryl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine -2- (1′-2′-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamine (CGP 19835A, also called MTP-PE), and in 2% squalene / twin 80 emulsion RIBI comprising three components, monophosphoryl lipid A, trehalose dicholate and cell wall backbone (MPL + TDM + CWS), extracted from bacteria of
또한 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 세균을 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15 kDa 내지 약 25 kDa 또는 약 75 kDa 내지 약 95 kDa의 단리된 폴리펩티드(전형적으로, 적어도 이의 일부분)에 결합할 수 있는 항체 또는 또 다른 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애-중재된 C3 분해를 억제시키는 방법에 관한 것이다. 약 15 kDa 내지 약 25 kDa 또는 약 75 kDa 내지 약 95 kDa의 단리된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단백질은 항체 또는 이의 단편일 수 있거나, 상기 단백질은 C3 분해 활성을 가진 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15 kDa 내지 약 25 kDa 또는 약 75 kDa 내지 약 95 kDa의 단리된 폴리펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 항체로부터의 가변성 도메인과 같은 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다.The invention also provides for the binding of Streptococcus pneumoniae bacteria to an isolated polypeptide (typically at least a portion thereof) of about 15 kDa to about 25 kDa or about 75 kDa to about 95 kDa from Streptococcus pneumoniae. A method for inhibiting Streptococcus pneumoniae-mediated C3 degradation, including contacting a polypeptide, such as an antibody or another polypeptide, which may be present. A protein capable of binding to an isolated polypeptide of about 15 kDa to about 25 kDa or about 75 kDa to about 95 kDa may be an antibody or fragment thereof, or the protein may be from Streptococcus pneumoniae with C3 degradation activity. A chimeric protein comprising an antibody binding domain, such as a variable domain from an antibody capable of specifically recognizing an isolated polypeptide of about 15 kDa to about 25 kDa or about 75 kDa to about 95 kDa.
본 발명의 단리된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리페티드는 단리되고 임의로 정제될 수 있으며, 단리된 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편들은 하나의 예에서, 인간 또는 실험 동물에서의 항체 반응을 포함하여, 면역학적 반응을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. C3 분해 능력이 없는 폴리펩티드들은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 제한하는 이들의 능력에 대해 시험될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드들은 폴리펩티드의 C3 분해 활성의 방해 또는 불활성화시키기 위한 돌연변이를 통해서와 같이 개질될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 C3 분해 활성을 억제시킬 수 있는 항체는 옵소닌 경로를 통해 C3 분해를 방지시키고 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 제거를 촉진시키기 위한 전략으로서 사용될 수 있다. 단리된 폴리펩티드들은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 치료를 위한 백신의 일부분 또는 다가나 다중 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드-함유 백신에 대한 항체를 검출하기 위한 검정에서 사용될 수 있다.The isolated Streptococcus pneumoniae polypeptides of the present invention can be isolated and optionally purified, and the isolated polypeptide or immunogenic fragments thereof, in one example, comprise an immunological response in human or experimental animals, including It can be used to generate a reaction. Polypeptides without C3 degradation capacity can be tested for their ability to limit Streptococcus pneumoniae infection. Similarly, polypeptides of the invention can be modified, such as through mutations to disrupt or inactivate the C3 degradation activity of a polypeptide. Antibodies capable of inhibiting the C3 degradation activity of the polypeptides of the present invention can be used as a strategy to prevent C3 degradation through the opsonin pathway and to promote the removal of Streptococcus pneumoniae. Isolated polypeptides can be used in assays to detect antibodies to a portion or multivalent or multiple proteins, peptides or polypeptide-containing vaccines for the treatment of Streptococcus pneumoniae or Streptococcus pneumoniae.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"란 정상적인 포유동물 피검자 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의해 콜로니형성되고, 진단되거나 스트렙토코쿠스뉴모니애 감염의 특징 또는 증상을 나타내는 포유동물 피검자에 대한 예방법 및/또는 치료법을 말한다. 용어 "치료법"이란 폐렴구균 감염 또는 다른 관련 질환의 극소수의 증상 또는 무증상을 나타내는 피검자와 같은 포유동물 피검자에게 치료 효과를 제공하는 것을 말한다. 상기 치료는 본 발명의 핵산 분자(센스 또는 안티센스), 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 항체를 투여함으로써 수행될 수 있다.Thus, as used herein, the term “treatment” is a prophylactic for a mammalian subject colonized by a normal mammalian subject or Streptococcus pneumoniae, diagnosed or exhibiting the characteristics or symptoms of a Streptococcus pneumoniae infection. And / or therapies. The term "treatment" refers to providing a therapeutic effect to a mammalian subject, such as a subject exhibiting very few symptoms or no symptoms of pneumococcal infection or other related disease. The treatment can be carried out by administering a nucleic acid molecule (sense or antisense), protein, peptide or polypeptide or antibody of the invention.
본 발명의 폴리펩티드가 척추동물 세포상에서 표면 발현되어, 예컨대, 보체 퇴적(또는 활성화)이 이종이식 또는 보체-중재된 사구체신염에서와 같은 문제가 될 수 있는지를 추가로 고찰하였다. 예를 들어, 전체 폐렴구균 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 또는 둘 모두의 일부분은 이종이식 세포내로 혼입되어 보체 퇴적(및/또는 보체-중재된 염증)을 방지시키거나 최소화시키는 표면 폴리펩티드 또는 분비된 폴리펩티드로서 발현된다.It was further considered whether the polypeptides of the invention are surface expressed on vertebrate cells such that complement deposition (or activation) may be a problem, such as in xenografts or complement-mediated glomerulonephritis. For example, portions of the entire pneumococcal polypeptide, recombinant polypeptide, or both are expressed as surface polypeptides or secreted polypeptides that are incorporated into xenografts to prevent or minimize complement deposition (and / or complement-mediated inflammation). .
본 발명의 또 다른 특정 일면은 단리된 단백질, 및 이들로부터의 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현시키는 백신 벡터를 사용하는 것에 관한 것이다. 따라서, 추가적인 일면에서 본 발명은 포유류에게서 면역 반응을 유도시키는 방법을 제공하며, 이는 포유류에게 본 발명의 단리된 단백질 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 적어도 단독 또는 혼합물을 발현시키는 백신 벡터를 제공하는 것을 포함한다. 본 발명의 단백질 및 펩티드 또는 폴리펩티드는 외래 폴리펩티드로서 단백질 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현을 위해 필요한 유전 물질을 포함하고 있는 살아있는 백신 벡터, 특히 살아있는 재조합 세균, 바이러스 또는 그 밖의 살아있는 제(agent)를 사용하여 포유류에게 운반될 수 있다. 특히, 살모넬라, 쉬젤라, 예르시니아, 비브리오, 에스케리시아 및 BCG와 같은 위장기관에 콜로니를 형성하는 세균이 백신 벡터로서 개발되어 왔으며, 이들 및 다른 예들은 문헌[참조 : J. Holmgren et al.,Immunobiol.,184, 157-179(1992) and J. McGhee et al.,Vaccine,10, 75-88 (1992)]에 논의되어 있다.Another particular aspect of the present invention relates to the use of vaccine vectors that express isolated proteins and peptides or polypeptides therefrom. Thus, in a further aspect, the present invention provides a method of inducing an immune response in a mammal, comprising providing a mammal with a vaccine vector that expresses at least alone or a mixture of isolated proteins and / or peptides or polypeptides of the invention. do. Proteins and peptides or polypeptides of the present invention use live vaccine vectors, in particular live recombinant bacteria, viruses or other live agents, which contain the genetic material necessary for the expression of the protein and / or peptide or polypeptide as a foreign polypeptide. Can be delivered to mammals. In particular, bacteria that form colonies in the gastrointestinal tract such as Salmonella, Shigella, Yersinia, Vibrio, Escherichia and BCG have been developed as vaccine vectors, and these and other examples are described in J. Holmgren et al. ., Immunobiol. , 184 , 157-179 (1992) and J. McGhee et al., Vaccine , 10 , 75-88 (1992).
본 발명의 추가적인 양태는 본 발명의 단리된 단백질 및/또는 이로부터의 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 분자의 양을 임의로 트랜스펙션-촉진제와 함께 피검자에게 투여하는 것을 포함하여 피검자, 예컨대, 포유류,에게 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 단백질 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고 있고, 면역 자극성 조성물, 예컨대, 백신내에 혼입되어 인간에게 투여되는 경우, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 병원균에 의한 인간의 후속적인 감염시에 향상된 질병을 유도함이 없이 보호를 제공한다. 트랜스펙션-촉진제들은 당분야에 공지되어 있다.Additional aspects of the invention include administering to a subject an amount of a DNA molecule encoding an isolated protein of the invention and / or a peptide or polypeptide therefrom, optionally with a transfection-promoting agent, such as a mammal, To a method for inducing an immune response, wherein the protein and / or peptide or polypeptide has immunogenicity and is incorporated into an immunostimulatory composition such as a vaccine and administered to a human, Streptococcus pneumoniae pathogen Protection is provided without subsequent induction of improved disease upon subsequent infection of the human by. Transfection-promoters are known in the art.
약 15 kDa 내지 약 25 kDa 폴리펩티드, 및 약 75 kDa 내지 약 95 kDa 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 안티센스 서열이 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 위한 백신 또는 치료학적 치료제로서 사용될 수 있는지를 추가로 고찰하였다. 안티센스 DNA는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 전부 또는 일부와 상보적인 비-코딩 서열, 즉, 상보적인 가닥으로서 정의된다. 예를 들어, 5'-ATGTCAAGC-3'에 대한 안티센스 서열은 3'-TACAGTTCG-5'이다. 동물내로의 안티센스 서열 또는 올리고누클레오티드의 운반은 동물에 의한 항체의 생성 또는 살아있는 세균 또는 다른 세포내로의 상기 서열의 혼입을 초래할 수 있으며, 이로써 92 kDa 유전자 생성물의 전부또는 일부분의 전사 및/또는 번역이 억제된다.It was further contemplated whether the antisense sequences of genes encoding from about 15 kDa to about 25 kDa polypeptides, and from about 75 kDa to about 95 kDa polypeptides, could be used as vaccines or therapeutic therapeutics for Streptococcus pneumoniae infection. Antisense DNA is defined as a non-coding sequence, ie, complementary strand, complementary to all or a portion of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4. For example, the antisense sequence for 5'-ATGTCAAGC-3 'is 3'-TACAGTTCG-5'. Delivery of an antisense sequence or oligonucleotide into an animal can result in the production of an antibody by the animal or the incorporation of said sequence into a living bacterium or other cell, thereby transcription and / or translation of all or a portion of the 92 kDa gene product. Suppressed.
안티센스 핵산 서열의 도입은 폐렴구균 또는 감염된 세포내로의 도입을 위해, 예컨대 리포좀과 같은 적합한 캐리어내로 안티센스 핵산을 로딩시킴으로써 수행될 수 있다. 전형적으로, 8개 이상의 누클레오티드를 가진 안티센스 핵산 서열은 세균의 핵산 또는 세균 메신저 RNA에 결합할 수 있다. 안티센스 핵산 서열은 세균 핵산 또는 세균 메신저 RNA의 하이브리드화 생성물의 필수적인 안정성을 제공하기 위해 전형적으로 약 15개 이상의 누클레오티드, 바람직하게는 약 30개 이상의 누클레오티드 또는 그 이상의 누클레오티드를 포함한다. 상기 서열의 도입은 바람직하게는 적어도 하나의 내인성 스트렙토코쿠스 뉴모니애 핵산 서열의 전사 또는 번역을 억제시킨다. 안티센스 핵산을 로딩시키는 방법은 미국 특허 제 4,242,046호에 의해 예시된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다.Introduction of the antisense nucleic acid sequence may be performed by loading the antisense nucleic acid into a suitable carrier such as liposomes for introduction into pneumococcal or infected cells. Typically, antisense nucleic acid sequences having eight or more nucleotides can bind to bacterial nucleic acid or bacterial messenger RNA. Antisense nucleic acid sequences typically comprise about 15 or more nucleotides, preferably about 30 or more nucleotides or more, to provide the necessary stability of the hybridization product of the bacterial nucleic acid or bacterial messenger RNA. Introduction of such sequences preferably inhibits the transcription or translation of at least one endogenous Streptococcus pneumoniae nucleic acid sequence. Methods for loading antisense nucleic acids are known in the art as illustrated by US Pat. No. 4,242,046.
또한 본 발명은 약 20 kDa(SEQ ID NO:2)의 분자량을 가진 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:1)의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 2478 염기(SEQ ID NO:4)의 오픈 리딩 프레임을 가지는 핵산을 제공한다. 본 명세서에 기술되어 있는 약 20 kDa 폴리펩티드는 C3 분해 폴리펩티드로서 추가로 특징화되었다. 더 큰 오픈 리딩 프레임, 예컨대, 2163 bp(SEQ ID NO:4)는 약 92 kDa(SEQ ID NO:5)의 추정적인 폴리펩티드를 엔코딩하고 있다.The invention also provides an open reading of 2478 bases (SEQ ID NO: 4) comprising an open reading frame of a nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoding a polypeptide having a molecular weight of about 20 kDa (SEQ ID NO: 2). A nucleic acid having a frame is provided. The about 20 kDa polypeptides described herein were further characterized as C3 degradation polypeptides. A larger open reading frame, such as 2163 bp (SEQ ID NO: 4), encodes a putative polypeptide of about 92 kDa (SEQ ID NO: 5).
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들 및 간행물들을 본 명세서내에 참조로서 명백히 인용하였다. 본 발명의 관점에서 의도된 발명을 유사하게 성공적으로 수행하도록 해주는 당업자에게 유용한 다양한 대안적인 기술 및 방법이 존재한다. 본발명이 특정한 구체예 및 실시예와 관련하여 상기 설명되었지만, 본 발명은 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 수 많은 다른 구체예, 실시예, 용도, 변형 및 시도가 상기 구체예, 실시예 및 용도로부터 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것을 당업자라면 인식할 것이다.All references and publications cited herein are expressly incorporated herein by reference. There are a variety of alternative techniques and methods useful to those skilled in the art that allow similarly successful implementation of the intended invention in view of the present invention. Although the present invention has been described above with reference to specific embodiments and examples, the present invention is not necessarily limited thereto, and numerous other embodiments, examples, uses, modifications, and attempts have been made from such embodiments, examples, and uses. Those skilled in the art will recognize that they may be made without departing from the scope of the present invention.
실시예 1Example 1
감소된 C3 분해 활성을 가진 삽입 돌연변이의 동정Identification of Insertion Mutants with Reduced C3 Degradation Activity
삽입 돌연변이체를 엘라인 투오마넨 박사(Dr. Elaine Tuomanen, Rockefeller Inst., New York, New York)부터 입수하였다. 삽입물을 가진 클론들을 감소된 C3 분해 활성을 검출하기 위한 검정에서 시험하였다. 137개 클론들을 마이크로타이터 플레이크중의 토드 휴이트(Todd Hewitt) 브로쓰중에서 실온에서 밤새 세포를 성장시킴으로써 실험하였다. 세포를 폐렴구균을 위한 합성 배지(참조 : Sicard A. M., Genetics 50:31-44, 1984)중에서 1:10으로 희석시키고 나머지 세포를 마이크로타이터 플레이트중에서 냉동시켰다. 인산염 완충 염수(PBS)중의 0.1% BSA 1 mg/ml를 함유하는 배지 100 ㎕당 C3 63 ng 또는 83 ng[문헌(참조 : Tack et al., Meth. Enzymol. 80:64-101, 1984)의 방법에 따라 인간 혈장으로부터 정제됨]을 희석된 세포 약 200 ㎕에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물 100 ㎕를 ELISA 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액을 사용하여 3회 세척하고 웰을 세척액 사이에서 5분 인큐베이션시킨 PBS중의 0.05% 트윈 20으로 채웠다. C3에 대한 항체[인간 C3-IgG 분획에특이적인 폴리클로날 말-무 페록시다제 컨쥬케이션된 염소 항체(ICN Cappel, Costa Mesa, CA)] 100 ㎕를 PBS중의 3% BSA를 사용하여 1:1200으로 희석시켰다. ELISA 플레이트를 암조건하에 37℃에서 약 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션시키고 상기와 같이 세척 완충액을 사용하여 세척하였다. 검정을 30% 과산화수소 12 ㎕를 함유하는 0.1 M 나트륨 시트레이트 완충액 30 ml중의 OPD 12 mg을 사용하여 현상시켰다. 검정 결과를 ELISA 플레이트 판독기상에서 490 nm에서 광학 밀도 판독에 의해 결정하였다.Insert mutants were obtained from Dr. Elaine Tuomanen, Rockefeller Inst., New York, New York. Clones with inserts were tested in the assay to detect reduced C3 degradation activity. 137 clones were tested by growing the cells overnight at room temperature in Todd Hewitt broth in microtiter flakes. Cells were diluted 1:10 in synthetic media for pneumococcal (see Sicard A. M., Genetics 50: 31-44, 1984) and the remaining cells frozen in microtiter plates. Of 63 ng or 83 ng of C3 per 100 μl of medium containing 1 mg / ml of 0.1% BSA in phosphate buffered saline (PBS) (Tack et al., Meth. Enzymol. 80: 64-101, 1984). Purified from human plasma according to the method] was added to about 200 μl of the diluted cells. Cells were incubated at 37 ° C. for 4 hours. 100 μl of the mixture was added to the ELISA plate and incubated at 4 ° C. overnight. Plates were washed three times with wash buffer and wells filled with 0.05% Tween 20 in PBS incubated 5 minutes between washes. 100 μl of antibody against C3 [polyclonal mal-peroxidase conjugated goat antibody specific for human C3-IgG fraction (ICN Cappel, Costa Mesa, Calif.)] Was used 1: 3 with 3% BSA in PBS. Dilute to 1200. ELISA plates were incubated at 37 ° C. for about 30 minutes to 1 hour under dark conditions and washed with wash buffer as above. The assay was developed using 12 mg of OPD in 30 ml of 0.1 M sodium citrate buffer containing 12 μl of 30% hydrogen peroxide. Assay results were determined by optical density reading at 490 nm on an ELISA plate reader.
각 클론을 4회 시험하였다. 19개 클론이 비돌연변이된 대조군에 비해 40% 미만의 C3 분해 활성을 가지는 것으로 선별되었다. 상기 19개 클론을 상기 기술한 검정에 의해 6회 스크리닝하였고 이 결과로부터 대조군에 비해 30% 미만의 C3 분해 활성을 가지는 6개 클론을 선별하였다. 이 6개 클론을 각각 11회 스크리닝하였고 가장 낮은 C3 분해 활성을 가진 2개 클론을 추가 연구를 위해 선별하였다.Each clone was tested four times. Nineteen clones were selected to have less than 40% C3 degradation activity compared to the non-mutated controls. The 19 clones were screened 6 times by the assay described above and from these results 6 clones with less than 30% C3 degradation activity compared to the control were selected. These six clones were screened 11 times each and 2 clones with the lowest C3 degradation activity were selected for further study.
클론들중 하나의 부분 서열을 입수하였고 546 bp의 SmaI 단편을 랜덤 프라이머 표지(시판용 키트, Stratagene, La Jolla, CA)에 의해32P를 사용하여 표지시켰다. SEQ ID NO:1으로부터의 546 bp SmaI 단편을 서던 블롯시에 수많은 폐렴구균 균주들의 EcoRI 및 KpnI 분해물에 하이브리드화시켰다. 또한 동일 단편을 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 CP1200으로부터의 지놈 DNA의 Sau3A 단편들의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용하였다.Partial sequences of one of the clones were obtained and 546 bp SmaI fragments were labeled using 32 P by random primer labeling (commercial kit, Stratagene, La Jolla, Calif.). The 546 bp SmaI fragment from SEQ ID NO: 1 was hybridized to EcoRI and KpnI digests of numerous pneumococcal strains in Southern blot. The same fragment was also used to screen a library of Sau3A fragments of genome DNA from Streptococcus pneumoniae strain CP1200.
3.5 kb 삽입물을 CP1200 라이브러리로부터 동정하였다. 이 삽입물을 서열분석하고 종결 코돈을 포함하는 492 염기쌍의 오픈 리딩 프레임을 동정하였다. 오픈 리딩 프레임은 168 아미노산 및 예측된 약 18,500 달톤의 분자량의 폴리펩티드를 코딩하고 있었다.3.5 kb inserts were identified from the CP1200 library. This insert was sequenced and an open reading frame of 492 base pairs containing the stop codon was identified. The open reading frame encodes a polypeptide of 168 amino acids and a molecular weight of about 18,500 Daltons predicted.
PCR 프라이머를 오픈 리딩 프레임을 증폭시키기 위해 구성하였다; BamHI 부위가 혼입된 5' PCR 프라이머; PstI 부위가 혼입된 3' 프라이머. 증폭된 삽입물을 His-태킹된 대장균 발현 벡터 pQE30(Qiagen, San Diego, CA)에 프레임적으로 연결시켰다. 수득된 플라스미드를 lac 리프레서 플라스미드 pREP4(Qiagen)를 포함하고 있는 대장균 균주 BL21(Novagen, Madison, WI)을 형질전환시키기 위해 사용하였다. 대장균 배양물을 His-태깅된 폴리펩티드를 발현시키기 위해 유도시키고 폴리펩티드를 Ni-NTA 수지(Qiagen)을 사용하여 컬럼 정제하였다. 정제된 폴리펩티드를 SDS-PAGE 겔에 의해 확인하였다.PCR primers were constructed to amplify the open reading frame; 5 'PCR primers incorporating a BamHI site; 3 'primer with PstI site incorporated. The amplified insert was frame linked to His-tagged E. coli expression vector pQE30 (Qiagen, San Diego, Calif.). The obtained plasmid was used to transform E. coli strain BL21 (Novagen, Madison, Wis.) Containing the lac refresher plasmid pREP4 (Qiagen). E. coli cultures were induced to express His-tagged polypeptides and the polypeptides were column purified using Ni-NTA resin (Qiagen). Purified polypeptide was confirmed by SDS-PAGE gel.
실시예 2Example 2
20 kDa C3 분해 폴리펩티드의 동정Identification of 20 kDa C3 Degrading Polypeptides
20 kDa 폴리펩티드의 C3 분해 능력을 결정하기 위해, C3[문헌(참조 : Tack et al., Meth. Enzymol. 80:64-101, 1084)에 따라 제조된] 0.5 mg/ml을 15% 아크릴아미드를 함유하는 소듐 도데실 설페이트(SDS) 겔(15% SDS-PAGE 겔)중에서 공중합체화시켰다. 폐렴구균 상층액을 토드 휴이트 브로쓰중에서 지수기까지 성장시킨 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 CP1200의 배양물로부터 수득하였고; 폐렴구균 용해질을 실온에서 30분 동안 5% SDS를 5 x 108세포와 인큐베이션시킴으로써 수득하였다. 용해질을 10,000 mw 컷오프가 장착된 센트리콘(Centricon) 여과 장치(Amicon, Beverly, MA)를 사용하여 10배 농축시켰다. 이 샘플을 전기영동전에 가열시키지 않았다. 상층액 및 용해질의 샘플들을 15% C3 함유 SDS-PAGE 겔에 첨가하고 전기영동을 맨 앞의 염료가 흘러나갈 때까지 150 V에서 4℃에서 수행하였다. 겔을 물중의 2.5% 트리톤 X-100(2회, 10분), 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4중의 2.5% 트리톤 X-100(2회, 10분) 및 50 mm 트리스-HCl, pH 7.4(2회, 10분) 50 ml을 사용하여 연속적으로 세척하여 SDS를 제거하였다. 세척한 후에, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4 50 ml을 겔이 담긴 디쉬에 붓고, 디쉬를 덮고 37℃에서 1.5시간 및 밤새(약 16시간) 인큐베이션시켰다. 겔을 10분 동안 쿠마시 블루를 사용하여 염색하고 완전히 탈색시켰다.To determine the C3 degradation capacity of a 20 kDa polypeptide, 0.5 mg / ml of C3 (prepared according to Tack et al., Meth. Enzymol. 80: 64-101, 1084) was added 15% acrylamide. Copolymerization in sodium dodecyl sulfate (SDS) gel (15% SDS-PAGE gel) containing. Pneumococcal supernatants were obtained from cultures of Streptococcus pneumoniae strain CP1200 grown in Todd Hewitt broth to exponential phase; Pneumococcal lysates were obtained by incubating 5% SDS with 5 × 10 8 cells at room temperature for 30 minutes. Lysates were concentrated 10-fold using a Centricon filtration device (Amicon, Beverly, MA) equipped with a 10,000 mw cutoff. This sample was not heated prior to electrophoresis. Supernatant and lysate samples were added to a 15% C3 containing SDS-PAGE gel and electrophoresis was performed at 4 ° C. at 150 V until the first dye flowed out. Gels were treated with 2.5% Triton X-100 (2 times, 10 minutes), 50 mM Tris-HCl in water, 2.5% Triton X-100 (2 times, 10 minutes) in pH 7.4 and 50 mm Tris-HCl, pH 7.4 ( 2 times, 10 minutes) SDS was removed by successive washings with 50 ml. After washing, 50 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, was poured into a dish containing gels, covered with the dish and incubated for 1.5 hours at 37 ° C. and overnight (about 16 hours). Gels were stained with Coomassie Blue for 10 minutes and completely bleached.
두개의 용해 밴드가 가시화되었는데, 그중 하나는 약 20 kDa 크기였고, 용해질 및 상층액 둘 모두에서 짙은 청색 배경에 대한 것이었다. 폐렴구균 용해질에서의 C3 분해 활성을 37℃에서 1.5시간 인큐베이션시킨 후에 관찰하였지만, Pn 상층액에서의 C3 분해 활성은 밤새 인큐베이션시킨 후에 관찰되지 않았다. 그러므로, C3 분해 활성은 세포와 주로 관련되어 있는 것 같았다.Two dissolution bands were visualized, one of which was about 20 kDa in size, against a dark blue background in both lysate and supernatant. C3 degrading activity in pneumococcal lysate was observed after 1.5 hours of incubation at 37 ° C., but C3 degrading activity in Pn supernatant was not observed after overnight incubation. Therefore, C3 degradation activity appeared to be mainly related to the cells.
실시예 3Example 3
20 kD 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자는 수많은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주들에 보존되어 있다.Genes encoding 20 kD polypeptides have been conserved in numerous Streptococcus pneumoniae strains.
다양한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주들(타입 1, 타입 3, LOO2 및 LOO3(타입 3), 타입 4, 타입 14의 임상적 단리균주 및 실험실 단리균주 CP1200, WU2, R6X,6303, 109, 110, JY1119, JY182 및 JY53)로부터 DNA를 수득하였고 SEQ ID NO:3을 상기 균주들로부터의 DNA의 20 kD 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 존재를 탐지하기 위한 프로브로서 사용하였다. 단리된 염색체 DNA를 EcoRI으로 분해시키고 전기영동에 의해 분리시켰다. 상기 DNA를 고체 지지체로 이동시키고 6X SSC, 5X 덴하르트, 0.5% SDS, 100 ㎍/ml 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA를 65℃에서 밤새 하이브리드화시키고 2X SSC중에서 실온에서 10분 동안 1회 세척하고 2X SSC, 0.1% SDS중에서 65℃에서 15분 동안 1회 세척하고 나서 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 각각 실온에서 3분 동안 2회 세척하는 하이브리드화 조건 및 세척 조건하에서 말단 표지된 SEQ ID NO:3에 하이브리드화시켰다.Various Streptococcus pneumoniae strains (Type 1, Type 3, LOO2 and LOO3 (Type 3), Type 4, Type 14 clinical isolated strains and laboratory isolated strains CP1200, WU2, R6X, 6303, 109, 110, DNA was obtained from JY1119, JY182 and JY53) and SEQ ID NO: 3 was used as a probe to detect the presence of nucleic acid encoding a 20 kD polypeptide of DNA from these strains. Isolated chromosomal DNA was digested with EcoRI and separated by electrophoresis. The DNA was transferred to a solid support and 6X SSC, 5X Denhardt, 0.5% SDS, 100 μg / ml denatured and fragmented salmon sperm DNA hybridized overnight at 65 ° C. and washed once for 10 minutes at room temperature in 2X SSC. End-labeled SEQ ID NO: under hybridization conditions and wash conditions which were washed once for 15 minutes at 65 ° C. in 2 × SSC, 0.1% SDS and then twice for 3 minutes each at room temperature in 0.2 × SSC, 0.1% SDS: Hybridized to 3.
결과는 SEQ ID NO:3이 각각의 시험된 DNA 샘플들에 동일하게 하이브리드화된 것으로 나타났으며 이는 폴리펩티드가 균주들 사이에 보존되어 있음을 나타낸다. 일부 균주에서는, 20 kDa C3 분해 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA가 92 kDa 폴리펩티드를 추정적으로 엔코딩하는 2478 bp의 더 큰 오픈 리딩 프레임의 일부인 것 같았다.The results showed that SEQ ID NO: 3 was equally hybridized to each of the tested DNA samples, indicating that the polypeptide was conserved between strains. In some strains, the DNA encoding the 20 kDa C3 degraded polypeptide appeared to be part of a larger open reading frame of 2478 bp that putatively encodes the 92 kDa polypeptide.
실시예 4Example 4
스트렙토코쿠스 뉴모니애 DNA 프로브의 서던 블롯Southern blot of Streptococcus pneumoniae DNA probe
지놈 DNA 5 ug 샘플을 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 11개 균주로부터 수득하였다. 각 샘플을 제한 효소 KpnI을 사용하여 분해시켰다. 샘플들을 아가로오스 겔상에 연속적으로 로딩시키고 전기영동에 의해 해상시켰다. 상기 겔을 포함하는 샘플들을 모세관 이동에 의해 아머샴(Amersham, Upsalla, Sweden)으로부터 시판되는Hybond-N+ 막으로 연속적으로 이동시켰다. 오픈 리딩 프레임으로부터의 540 bp SmaI 단편을T7QuickPrime 키트(Pharmacia, Piscathaway, NJ)를 사용하여 P32로 랜덤 프라이머 표지시키고 NucTrap 컬럼(Stragene, La Jolla, CA)을 사용하여 비-혼입된 누클레오티드로부터 정제하고 하이브리드화시켰다.5 ug samples of genome DNA were obtained from 11 strains of Streptococcus pneumoniae. Each sample was digested using the restriction enzyme KpnI. Samples were continuously loaded onto agarose gel and resolved by electrophoresis. Samples containing the gels were continuously transferred to a commercially available Hybond-N + membrane from Amersham, Upsalla, Sweden by capillary transfer. 540 bp SmaI fragments from open reading frames were random primer labeled with P 32 using the T7 QuickPrime kit (Pharmacia, Piscathaway, NJ) and purified from non-incorporated nucleotides using NucTrap columns (Stragene, La Jolla, Calif.) And hybridized.
하이브리드화 조건은 6X SSC, 5X 덴하르트, 0.5% SDS, 및 100 ㎍/ml 단편화되고 변성된 연어 정자 DNA를 65℃에서 밤새 하이브리드화시키고 2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 약 1분 동안 1회 세척한 다음 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척하고 나서 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 실온에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척하는 것이다. 블롯은 20 kDa 유전자가 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 시험된 모든 균주들에 존재하였음을 증명하였다.Hybridization conditions were followed by hybridization of 6X SSC, 5X Denhardt, 0.5% SDS, and 100 μg / ml fragmented and denatured salmon sperm DNA at 65 ° C. overnight and at room temperature in 2 × SSC, 0.1% SDS for about 1 minute. The wash followed by one wash at 65 ° C. for about 15 minutes, followed by one or more washes at room temperature in 0.2 × SSC, 0.1% SDS for at least 3-5 minutes. The blot demonstrated that a 20 kDa gene was present in all tested strains of Streptococcus pneumoniae.
실시예 5Example 5
2가지 DNA 프라이머를 SEQ ID NO:1으로부터 제조하였고 스트렙토코쿠스 뉴모니애(혈청형 3) 지놈 DNA로부터의 20 kDa 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 사용하였다. 제 1 프라이머인 5'-프라이머 SEQ ID NO:6는 누클레오티드 서열의 5' 말단에 ATG 개시 코돈을 포함하며, NcoI 부위가 삽입되어 있고, 정확한 리딩 프레임을 유지하기 위해 ATG 개시 코돈 이후에 삽입된 Ala 잔기를 가지고 있다. 제 2 프라이머인 3'-프라이머 SEQ ID NO:7은 누클레오티드 서열의 3' 말단에 종결 코돈을 포함하며 BamHI 부위가 삽입되어 있다.Two DNA primers were prepared from SEQ ID NO: 1 and used to amplify the nucleotide sequence encoding 20 kDa polypeptide from Streptococcus pneumoniae (serum type 3) genome DNA. The first primer, 5'-primer SEQ ID NO: 6, contains an ATG start codon at the 5 'end of the nucleotide sequence, an NcoI site inserted, and an Ala inserted after the ATG start codon to maintain an accurate reading frame It has a residue. The second primer, 3′-primer SEQ ID NO: 7, contains a stop codon at the 3 ′ end of the nucleotide sequence and has a BamHI site inserted.
5'-GGGGGCCA TGGCC TCA AGC CTT TTA CGT GAA TTG-3';(SEQ ID NO:6)5'-GGGGG CCA TGG CC TCA AGC CTT TTA CGT GAA TTG-3 '; (SEQ ID NO: 6)
5'-GGGGGGGA TCCCTA GCT ATA TGA GAT AAA CTT TCC TGC T-3';(SEQ ID NO:7)5'-GGGGG GGA TCC CTA GCT ATA TGA GAT AAA CTT TCC TGC T-3 '; (SEQ ID NO: 7)
두 프라이머를 글렌 리서치(Glen Research, Sterling, VA)로부터 구입한 시약을 사용하여 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) 380A DNA 합성기(Foster City, CA)상에서 합성하였다. 증폭을 퍼킨 엘머 써모사이클러(Perkin Elmer Thermocycler, ABI)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 동정된 PCR 생성물을 TA 테일링된 PCR 클로닝 벡터 PCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)내로 연결시키고 OneShot Top10F' 수용성 세포(Invitrogen)를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 카나마이신 저항성 형질전환체를 알칼라인 용해에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석에 의해 스크리닝하였다. 약 500 bp 삽입 단편을 동정하였고 이어서 제한 효소 NcoI 및 BamHI을 사용하여 잘라내었다. 500 bp 단편을 융점이 낮은 아가로오스 겔로부터 정제하였고 이어서 T7 프로모터를 지닌 발현 벡터 pET 28a(Novagen, Madison, WI)의 NcoI-BamHI 부위내로 연결시켰다.Both primers were synthesized on an Applied Biosystems 380A DNA synthesizer (Foster City, CA) using reagents purchased from Glen Research, Sterling, VA. Amplification was performed using the Perkin Elmer Thermocycler (ABI) according to the manufacturer's instructions. The identified PCR products were linked into TA tailed PCR cloning vector PCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) And used to transform OneShot Top10F 'soluble cells (Invitrogen). Kanamycin resistant transformants were screened by restriction enzyme analysis of plasmid DNA prepared by alkaline lysis. About 500 bp insert fragments were identified and then cut using restriction enzymes NcoI and BamHI. The 500 bp fragment was purified from a low melting agarose gel and then linked into the NcoI-BamHI site of the expression vector pET 28a (Novagen, Madison, Wis.) With the T7 promoter.
연결 혼합물을 Top10F' 세포(Invitrogen)내로 형질전환시킨 다음 카나마이신 저항성 형질전환체를 알칼라인 용해에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석에 의해 스크리닝하였다. 재조합 플라스미드(pLP505)를 BL21(Novagen) 세포내로 형질전환시킨 다음 30 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 SOB 배지중에서 성장시켰다. 세포를 0.6의 O.D.600값까지 성장시키고, 이어서 0.4 mM IPTG(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)를 사용하여 2-4시간 동안 유도시켰다. 전체 세포 용해물을 제조하고 14% SDS-PAGE 겔상에서 전기영동시켰다. 겔을 쿠마시를 사용하여 염색시키고 발현 생성물을 검출하였다. 쿠마시 염색된 겔은 28 kDa과 18 kDa 분자량 마커사이에서 밴드를 나타내었고, 이는 약 20 kDa인 것으로 결정되었다.The ligation mixture was transformed into Top 10 F ′ cells (Invitrogen) and then kanamycin resistant transformants were screened by restriction enzyme analysis of plasmid DNA prepared by alkaline lysis. Recombinant plasmid (pLP505) was transformed into BL21 (Novagen) cells and then grown in SOB medium supplemented with 30 μg / ml kanamycin. Cells were grown to an OD 600 value of 0.6 and then induced for 2-4 hours using 0.4 mM IPTG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana). Total cell lysates were prepared and electrophoresed on 14% SDS-PAGE gels. Gels were stained using Coomassie and expression products were detected. Coomassie stained gel showed a band between 28 kDa and 18 kDa molecular weight markers, which was determined to be about 20 kDa.
재조합 pLP505 플라스미드내의 삽입물의 DNA 서열을 ABI 370A DNA 서열분석기를 사용하여 수득하였다. DNA 서열을 MacVector의 Pustell DNA 매트릭스 플롯 피쳐(Oxford Molecular Group, Campbel, CA)를 사용하여 SEQ ID NO:1의 DNA 서열과 함께 정렬시켰다. pLP505 플라스미드로부터 수득된 DNA 서열인 SEQ ID NO:1 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애(혈청형 4) 지놈의 정렬을 통해 20 kDa 폴리펩티드를 코딩하고 있는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 예측된 약 92 kDa(SEQ ID NO:4)의 MW를 가진 폴리펩티드를 코팅하고 있는 더 큰 ORF, 즉, 혈청형 4 지놈의 2478 bp의 일부분일 수 있음이 밝혀졌다. DNA SEQ ID NO:4는 SEQ ID NO:5에 제시된 바와 같이 예측된 아미노산 서열을 엔코딩하고 있다.DNA sequences of inserts in recombinant pLP505 plasmids were obtained using an ABI 370A DNA sequencer. DNA sequences were aligned with the DNA sequences of SEQ ID NO: 1 using MacVector's Pustell DNA matrix plot feature (Oxford Molecular Group, Campbel, Calif.). The alignment of the DNA sequence obtained from the pLP505 plasmid, SEQ ID NO: 1 and Streptococcus pneumoniae (serum type 4) genome, resulted in about 92 kDa (ORF) encoding an open reading frame (ORF) encoding a 20 kDa polypeptide. It was found that it may be part of a larger ORF, ie 2478 bp of serotype 4 genome, that coats the polypeptide having the MW of SEQ ID NO: 4). DNA SEQ ID NO: 4 encodes the predicted amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5.
스트렙토코쿠스 뉴모니애(혈청형 4) 지놈 서열을 MacVector의 ClustalW 피쳐(Oxford Molecular Group, Campbell CA)를 사용하여 더 인스티튜트 포 지노믹 리서치(The Institute for Genomic Research, at www.tigr.org) 및/또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 수득하였다. 서열 비교를 20 kDa 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)과 예측된 92 kDa 아미노산 서열(SEQ ID NO:5)간에 수행하였다.Streptococcus pneumoniae (serum type 4) genome sequences were obtained from The Institute for Genomic Research (www.tigr.org) using MacVector's ClustalW feature (Oxford Molecular Group, Campbell CA) and And / or via NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Sequence comparisons were performed between the 20 kDa amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and the predicted 92 kDa amino acid sequence (SEQ ID NO: 5).
이용가능한 지놈 DNA(혈청형 4) 서열에 기초하여, 2478 bp ORF의 측면의 2가지 프라이머를 디자인한 다음 ABI 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다(SEQ ID NO:8 및 9). SEQ ID NO:8은 삽입된 NcoI 부위 및 정확한 리딩 프레임을 유지하기위해 ATG 개시 코돈 다음에 첨가된 "Glu" 잔기를 가진 스트렙토코쿠스 뉴모니애 5'-프라이머이다. SEQ ID NO:9는 삽입된 HindIII 부위를 가진 스트렙토코쿠스 뉴모니애 3'-프라이머이다.Based on the available genome DNA (serum type 4) sequences, two primers flanking the 2478 bp ORF were designed and synthesized using an ABI 380A DNA synthesizer (SEQ ID NOs: 8 and 9). SEQ ID NO: 8 is a Streptococcus pneumoniae 5′-primer with an “Glu” residue added after the ATG start codon to maintain the inserted NcoI site and the correct reading frame. SEQ ID NO: 9 is a Streptococcus pneumoniae 3′-primer with an inserted HindIII site.
5'-CCC GGG CCA TGG CTA AAA TTA ATA AAA AAT ATC TAG-3';(SEQ ID NO:8)5'-CCC GGG CCA TGG CTA AAA TTA ATA AAA AAT ATC TAG-3 '; (SEQ ID NO: 8)
5'-CCG GGCAAG CTTTTA CTT ACT CTC CT-3';(SEQ ID NO:9)5'-CCG GGC AAG CTT TTA CTT ACT CTC CT-3 '; (SEQ ID NO: 9)
그런 다음 약 2400 bp DNA 단편을 4종의 상이한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형(혈청형 3, 5, 6B 및 7)로부터 증폭시켜 4가지 단편을 만들었다. 4가지 단편 각각을 PCR 클로닝 벡터 PCR2.1(Invitrogen)내로 연결시킨 다음 OneShot Top10F' 세포(Invitrogen)을 형질전환시키기 위해 사용하였다. 카나마이신 저항성 형질전환체를 알칼라인 용해에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한 분석에 의해 스크리닝하였다. 혈청형 7 PCR 생성물을 포함하는 재조합 플라스미드를, 예컨대, pLP512로 동정하였다. DNA 서열을 ABI 모델 370A DNA 서열분석기를 사용하여 혈청형 7 클론으로부터 수득하였다. DNA 서열은 SEQ ID NO:4와 본질적으로 동일하였고 SEQ ID NO:5와 본질적ㅇ로 동일한 예측된 아미노산 서열을 엔코딩하고 있었다.About 2400 bp DNA fragments were then amplified from four different Streptococcus pneumoniae serotypes (serum types 3, 5, 6B and 7) to make four fragments. Each of the four fragments was linked into a PCR cloning vector PCR2.1 (Invitrogen) and then used to transform OneShot Top10F 'cells (Invitrogen). Kanamycin resistant transformants were screened by restriction analysis of plasmid DNA prepared by alkaline lysis. Recombinant plasmids containing serotype 7 PCR product were identified, eg, pLP512. DNA sequences were obtained from serotype 7 clones using an ABI model 370A DNA sequencer. The DNA sequence was essentially identical to SEQ ID NO: 4 and was encoding the predicted amino acid sequence essentially identical to SEQ ID NO: 5.
실시예 6Example 6
전체 폐렴구균의 92 kDa 폴리펩티드의 웨스턴 블롯 검출Western blot detection of 92 kDa polypeptide of whole pneumococcal
약 20 kDa 재조합 C3 분해 폴리펩티드를 플라스미드 pDF122를 포함하고 있는 대장균 균주 BLR로부터 정제하였다. 플라스미드 pDF122는 T7 파지 프로모터 시스템의 제어하에 발현되는 SEQ ID NO:1에 제시된 폴리누클레오티드를 포함하고 있다. 상기 세균 세포를 암피실린을 함유한 Hy-Soy/효모 추출물 배지중에서 로그 중기까지 성장시켜 플라스미드를 선별하였다. 재조합 폴리펩티드의 발현을 1 mM의 농도까지 IPTG를 첨가하고 추가적인 3시간 동안 인큐베이션시킴으로써 유도시켰다. 세균 세포를 원심분리에 의해 수집하고 트리스 완충 염수, pH 7.2중에 재현탁시켰다. 세포를 프렌치 프레셔(French Pressure)에서 기계적으로 용해시키고 세포 및 봉입체를 포함하는 불용성 물질을 원심분리로 펠릿화시켰다. 펠릿을 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 100 mM NaPO4, pH 8.0을 사용하여 완충된 3 M 요소중에 용해시켰다. 펠릿화 및 불용성 물질을 제거한 후에(약 100,000 x g에서 원심분리시킴), 가용성 r 20 kDa 폴리펩티드를 요소 대신 0.1% 양쪽성제(Zwittergent) 3-12(Calbiochem-Behrng)에 이어 계면활성제 대신 100 mM NaPO4pH 8.0내로 교환하였다. His-태킹된 재조합 폴리펩티드를 50 mM NaPO4완충액, pH 8.0내로 투석시키고 동일 완충액으로 평형화된 Ni 컬럼상에 흡수시켰다. 컬럼을 기저선 흡광도(OD280)가 각 완충액에 도달할 때까지 pH 7.0, 6.6 및 5.5에서 50 mM NaPO4를 사용하여 연속적으로 세척하였다. 결합된 약 r20 kDa 폴리펩티드를 50 mM NaPO4, pH 4.5를 사용하여 용리시켰다. 용리된 폴리펩티드는 SDS-PAGE 분석에서 약 90% 동종이었다.About 20 kDa recombinant C3 digested polypeptide was purified from E. coli strain BLR containing plasmid pDF122. Plasmid pDF122 contains the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1 expressed under the control of the T7 phage promoter system. Plasmids were selected by growing the bacterial cells to the mid-log phase in Hy-Soy / Yeast extract medium containing ampicillin. Expression of the recombinant polypeptide was induced by addition of IPTG to a concentration of 1 mM and incubation for an additional 3 hours. Bacterial cells were collected by centrifugation and resuspended in Tris buffered saline, pH 7.2. Cells were mechanically lysed in French Pressure and insoluble material, including cells and inclusion bodies, was pelleted by centrifugation. The pellet was dissolved in 3 M urea buffered using 100 mM NaPO 4 , pH 8.0 containing 0.1% Triton X-100. After removal of the pelletized and insoluble material (centrifuged at about 100,000 xg), the soluble r 20 kDa polypeptide was replaced with 0.1% Zwittergent 3-12 (Calbiochem-Behrng) instead of urea followed by 100 mM NaPO 4 instead of the surfactant. exchanged into pH 8.0. His-tagged recombinant polypeptides were dialyzed into 50 mM NaPO 4 buffer, pH 8.0 and taken up on Ni columns equilibrated with the same buffer. The column was washed successively with 50 mM NaPO 4 at pH 7.0, 6.6 and 5.5 until the baseline absorbance (OD 280 ) reached each buffer. Bound about r20 kDa polypeptide was eluted using 50 mM NaPO 4 , pH 4.5. Eluted polypeptide was about 90% homogeneous in SDS-PAGE analysis.
상기 폴리펩티드를 스위스-웹스터(Swiss-Webster) 마우스를 면역화시키기 위해 사용하였다. 폴리펩티드 5 ㎍ 복용량을 모노포스포릴 지질 A(Ribi Immunochemicals) 50 ㎍과 혼합시키고 마우스에게 근육내적으로 주입하였다. 동물들을 0, 4 및 6주에 면역화시켰고 8주에 사혈시켰다. 혈청을 모두 합치고 혈청이면역원에 대한 높은 타이터를 포함하고 있음이 밝혀졌다.The polypeptide was used to immunize Swiss-Webster mice. A 5 μg dose of polypeptide was mixed with 50 μg monophosphoryl lipid A (Ribi Immunochemicals) and injected intramuscularly into mice. Animals were immunized at 0, 4 and 6 weeks and bled at 8 weeks. The sera were combined and found to contain high titers for the reverse if the serum.
폐렴구균 균주 CP1200, T3 및 T7을 효모 추출물 및 원심분리에 의해 펠릿화된 세포 둘 모두를 함유하는 토드-휴이트중에서 성장시켰다. 폐렴구균 세포를 5분 동안 끓임으로써 환원 조건하에서 SDS-PAGE 크래킹 완충액중에서 용해시켰다. 용해물을 10% SDS-PAGE 겔상에 로딩하고 전기영동시켰다. 분리된 폴리펩티드를 니트로셀룰로오스상에서 일렉트로블로팅시키고 필터를 인산염 완충 염수, pH 7.4중의 5% BLOTTO를 사용하여 블로킹하였다. 폴리클로날 항혈청을 5% BLOTTO중에 1:2000으로 희석시키고 분리된 폴리펩티드를 프로빙하기 위해 사용하였다. 결합된 항체를 알칼라인 포스패타제 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG를 사용하여 검출하였다. 웨스턴 블롯을 도 8에 제시하였고 도면의 간단한 설명에서 추가로 기술하였다.Pneumococcal strains CP1200, T3 and T7 were grown in Todd-Hewitt containing both yeast extract and cells pelleted by centrifugation. Pneumococcal cells were lysed in SDS-PAGE cracking buffer under reducing conditions by boiling for 5 minutes. Lysates were loaded on 10% SDS-PAGE gels and electrophoresed. The isolated polypeptide was electroblotted onto nitrocellulose and the filter was blocked using 5% BLOTTO in phosphate buffered saline, pH 7.4. Polyclonal antiserum was diluted 1: 2000 in 5% BLOTTO and used to probe the isolated polypeptide. Bound antibodies were detected using alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse IgG. Western blots are shown in FIG. 8 and described further in the brief description of the figures.
실시예 7Example 7
20 kDa 및 92 kDa 폴리펩티드가 C3를 분해시킨다는 증거Evidence that 20 kDa and 92 kDa polypeptides degrade C3
도 9에 제시된 겔은 웨스턴 블롯이다. 이 데이터는 하기 표에 제시한 바와 같이 20 kDa 폴리펩티드 및 92 kDa 폴리펩티드를 바이오티닐화되고 메틸아민-처리된 C3와 인큐베이션시킴으로써 수득한 것이다. 상기 폴리펩티드를 T7 벡터로부터 발현시켰다.The gel shown in FIG. 9 is a Western blot. This data was obtained by incubating the 20 kDa polypeptide and the 92 kDa polypeptide with biotinylated and methylamine-treated C3 as shown in the table below. The polypeptide was expressed from a T7 vector.
메틸아민-처리된 C3: 4.46 mg/ml의 농도에서 정제된 인간 C3 500 ㎕[문헌(참조 : Tack et al., Meth. Enzymol. 80:64-101, 1984)의 방법에 따라 제조됨)를 0.1 M 트리스/0.01 M EDTA, pH 8.0중의 1 M 메틸아민(CH3NH2) 55 ㎕과 함께 37℃에서 80분 동안 인큐베이션시킨 다음 0.1 M 트리스/0.01 M EDTA, pH 8.0중에서 4℃에서 밤새 투석시켰다. 다음날, C3를 0.1 M 트리스/0.01 M EDTA중에서 1 M 메틸아민 60 ㎕와 함께 37℃에서 80분 동안 인큐베이션시킨 다음 50 mM NaHCO3중에서 4℃에서 밤새 투석시켰다.Methylamine-treated C3: 500 [mu] l of human C3 purified at a concentration of 4.46 mg / ml (prepared according to the method of Tack et al., Meth. Enzymol. 80: 64-101, 1984) Incubate with 55 μl of 1 M methylamine (CH 3 NH 2 ) in 0.1 M Tris / 0.01 M EDTA, pH 8.0 for 80 minutes at 37 ° C. and then dialyzed overnight at 4 ° C. in 0.1 M Tris / 0.01 M EDTA, pH 8.0 I was. The next day, C3 was incubated for 80 minutes at 37 ° C. with 60 μl of 1 M methylamine in 0.1 M Tris / 0.01 M EDTA and then dialyzed overnight at 4 ° C. in 50 mM NaHCO 3 .
메틸아민으로 처리된 C3의 바이오틴화 : 상기 제조된 메틸아민으로 처리된 C3 2mg을 실온에서 1㎖의 H2O 중의 1mg NSC로서 제조된 NSC-바이오틴(Pierce) 75㎕와 함께 인큐베이션시켰다. 바이오틴화된 C3를 4℃에서 pH 8.0의 50㎖ NaHCO3중에서 밤새 투석시켰다.Biotinylation of C3 Treated with Methylamine: 2 mg of C3 treated with methylamine prepared above was incubated with 75 μl of NSC-Biotin prepared as 1 mg NSC in 1 ml H 2 O at room temperature. Biotinylated C3 was dialyzed overnight at 50 ° C. in 50 mL NaHCO 3 at pH 8.0.
튜브 A 및 C로부터의 샘플을 66시간 동안의 인큐베이션 후에 제거하고, β 메르캅토에탄올과의 환원 완충액중에서 2분 동안 비등시킴으로써 환원시키고, 7.5% SDS-PAGE 상에서 전기영동시키고, 웨스턴 블로팅을 위해 니트로셀룰로오스지로 옮겼다. 웨스턴 블로팅을 표준 방법[참고문헌: Tobin et al.,PNAS USA76:4350-4354, 1979]에 따라서 1시간 동안 수행하였다. 막을 양고추냉이-페록시다아제-아비딘(1:10,000 희석비)과 함께 인큐베이션시키고 수퍼시그날 CL-HRP 서브스트레이트 시스템(Amersham)으로 전개시켜 바이오틴화된 C3 단편을 검출하였다.Samples from tubes A and C were removed after 66 hours of incubation and reduced by boiling for 2 minutes in reducing buffer with β mercaptoethanol, electrophoresed on 7.5% SDS-PAGE, and nitro for western blotting. Transferred to cellulose paper. Western blotting was performed for 1 hour according to standard methods (Ref. Tobin et al., PNAS USA 76: 4350-4354, 1979). Membranes were incubated with horseradish-peroxidase-avidin (1: 10,000 dilution ratio) and developed into a supersignal CL-HRP substrate system (Amersham) to detect biotinylated C3 fragments.
도 9에서, 레인 1은 단지 C3 (대조군)이고, 레인 2 및 3은 20 및 92kDa 폴리펩티드이며, 레인 4 및 5 도 또한 단지 C3(대조군)이다. 우측 가장자리를 따라서, 대조군 샘플에 존재하는 C3의 α-사슬, C3의 β-사슬 및 C3 단편의 위치가 도시된다. 20kDa 분해물의 C3 단편 및 92kDa 분해물의 수개 단편의 위치가 확인된다.In FIG. 9, lane 1 is only C3 (control), lanes 2 and 3 are 20 and 92 kDa polypeptides, and lanes 4 and 5 are also only C3 (control). Along the right edge, the positions of the α-chain of C3, the β-chain of C3 and the C3 fragments present in the control sample are shown. The positions of the C3 fragment of the 20 kDa digest and several fragments of the 92 kDa digest are identified.
두 번째 실험에서는 상기 표에 기재된 바와 같은 비율로 첫 번째 시험에서 사용된 시약(발현된 폴리펩티드, 바이오틴화된 C3 및 완충액)을 사용하였다. C3 대조 샘플을 0시간, 2시간, 8시간 및 24시간에 해당하는 시간에 제거하였다. 그러나, 일부 추가 분해 단편이 바이오틴화될 수 없어 쿠마시에 착색된 SDS-PAGE 겔상에서 확인될 수 없기 때문에, 상기 샘플에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하는 대신에, 7.5% SDS-PAGE 상에서 환원시켰다. 실제로, 관찰하고자 하는 것이 관찰되었다. 20(레인 A8) 및 92(레인 C8)kDa의 폴리펩티드만이 이러한 겔에서 분석되었다. 도 10의 겔은 우측 가장자리를 따라서 C3의 α-사슬 및 C3의 β-사슬의 위치를 확인시켜주고 있으며 레인 C8에서는 92kDa의 폴리펩티드를 확인시켜 주고 있다. 레인 C8에는 ~90kDa 내지 75kDa 범위의 크기에 해당하는 단편이 적어도 2개 이상 존재한다. 또한, 75kDa에서 β-사슬 아래에는 수개의 단편이 존재한다. 레인 A8에는 C3의 β-사슬 바로 아래에 주요 분해 단편이 존재한다. 이와 같이, 레인 C8의 92kDa 폴리펩티드 및 레인 A8의 20kDa 폴리펩티드 모두 C3를 분해시킨다.In the second experiment, the reagents (expressed polypeptide, biotinylated C3 and buffer) used in the first test were used at the rates as listed in the table above. C3 control samples were removed at times corresponding to 0 hours, 2 hours, 8 hours and 24 hours. However, some additional digestion fragments could not be biotinylated and could not be identified on the Coomassie stained SDS-PAGE gel, so instead of performing a Western blot on the sample, the samples were reduced on 7.5% SDS-PAGE. In fact, what was observed was observed. Only polypeptides of 20 (lane A8) and 92 (lane C8) kDa were analyzed on this gel. The gel of FIG. 10 confirms the position of the α-chain of C3 and the β-chain of C3 along the right edge, and the 92 kDa polypeptide in lane C8. In lane C8 there are at least two fragments corresponding to sizes ranging from ˜90 kDa to 75 kDa. In addition, several fragments exist below the β-chain at 75 kDa. In lane A8 there is a major degradation fragment just below the β-chain of C3. As such, both 92 kDa polypeptide of lane C8 and 20 kDa polypeptide of lane A8 degrade C3.
실시예 8Example 8
재조합성 92kDa 단백질의 제조 및 폴리클로날 항혈청의 발생Preparation of Recombinant 92kDa Protein and Development of Polyclonal Antiserum
플라스미드 pLP512에의 삽입물(실시예 5 참조)을 Nco1 및 HindIII로 삭제하였다. 예기된 크기의 단편을 저융점 아가로오스로부터 정제한 후, T7 촉진된 발현벡터 pET28a(Novagen, Madison, WI)의 Nco1-HindIII 부위로 결찰시켰다.Inserts into plasmid pLP512 (see Example 5) were deleted with Nco1 and HindIII. The fragment of expected size was purified from low melting agarose and then ligated to the Nco1-HindIII site of the T7 promoted expression vector pET28a (Novagen, Madison, Wis.).
그런 다음, 결찰 혼합물을 Top10F' 세포(Invitrogen)로 형질전환시키고, 카나마이신 내성 형질전환체를 실시예 5에서 이미 기술된 바와 같이 스크리닝시켰다. 이후, 재조합 플라스미드(pLP515)를 BL21 세포(Novagen)로 형질전환시키고 30㎍/㎖의 카나마이신이 보충된 SOB 배지에서 성장시켰다. 세포를 0.6의 O.D.600으로 성장시킨 후, 2 내지 4시간 동안 0.4mM IPTG(Boehringer Manheim, Indianapolis, IN)로 유도하였다. 완전한 세포 용해물을 제조하고 10% SDS-PAGE 겔상에서 전기영동시켰다. 상기 겔의 쿠마시에 염색은 유도전 샘플과 비교하여 약 80kDa의 새로운 밴드를 나타냈다.The ligation mixture was then transformed into Top10F 'cells (Invitrogen) and kanamycin resistant transformants were screened as previously described in Example 5. The recombinant plasmid (pLP515) was then transformed into BL21 cells (Novagen) and grown in SOB medium supplemented with 30 μg / ml kanamycin. Cells were grown to an OD 600 of 0.6 and then induced with 0.4 mM IPTG (Boehringer Manheim, Indianapolis, IN) for 2-4 hours. Complete cell lysates were prepared and electrophoresed on 10% SDS-PAGE gels. Coomassie staining of the gel showed a new band of about 80 kDa compared to the preinduction sample.
약 92kDa ORF에 의해 코딩된 재조합 단백질을 플라스미드 pLP515가 함유된 대장균 균주 BL21(Novagen)으로부터 정제하였다. 세균 세포를 50㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 SOB 배지에서 로그 중기까지 성장시켜서, 플라스미드를 선택하였다. 재조합 폴리펩티드의 발현을 위해 IPTG를 0.4mM까지 첨가시키고, 3시간 동안 계속 인큐베이션시킴으로써 유도시켰다. 세균 세포를 원심분리에 의해 수집하고, Tris-완충된 식염수(pH 7.2) 중에 재현탁시켰다. 세포를 프렌치 프레셔 셀(French Pressure Cell)에서 기계적으로 용해시키고, 봉입체를 포함하는 불용성 물질을 4℃에서 10분간 7700 x g로 원심분리기에서 펠레트화시켰다. 봉입체가 함유된 펠레트를 재가용화시키고, 가용성 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 재조합 단백질을 사용하여 마우스에서 폴리클로날 항체를 생성시켰다. 요약하면, 5㎍의 단백질을 각각의 용량에 대해 20㎍의 QS21로 보조첨가하고, 6주령 내지 8주령된 스위스 웹스터 마우스의 목 내로 피하 주입시켰다. 마우스를 0주째에 채혈하고 백신접종시키고, 4주째에 백신접종시킨 후, 6주째에 채혈하고 방혈시켰다. 10마리의 마우스를 QS21가 보조첨가된 재조합 92kDa 단백질로 백신접종시켰다. 풀링된 혈청을 1:1000 희석율로 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 다수의 혈청형으로부터의 전체 세포 용해물과 농축된 배양물 상층액을 웨스턴 블롯으로 조사하였다. 혈청은 전체 세포 용해물과 농축된 배양물 상층액 중의 분자량이 약 90kDa인 단백질에 특이적으로 반응하였다.Recombinant protein encoded by about 92 kDa ORF was purified from E. coli strain BL21 (Novagen) containing plasmid pLP515. Bacterial cells were grown in SOB medium containing 50 μg / ml kanamycin to the mid-log phase to select plasmids. IPTG was added up to 0.4 mM for expression of the recombinant polypeptides and induced by incubation for 3 hours. Bacterial cells were collected by centrifugation and resuspended in Tris-buffered saline, pH 7.2. Cells were mechanically lysed in a French Pressure Cell and insoluble material containing inclusion bodies were pelleted in a centrifuge at 7700 x g for 10 minutes at 4 ° C. Pellets containing inclusion bodies were resolubilized and soluble proteins were purified by ion exchange chromatography. Recombinant protein was used to generate polyclonal antibodies in mice. In summary, 5 μg of protein was supplemented with 20 μg of QS21 for each dose and injected subcutaneously into the neck of 6 to 8 week old Swiss Webster mice. Mice were bled at week 0 and vaccinated, at week 4, then at week 6 and bled. Ten mice were vaccinated with recombinant 92kDa protein supplemented with QS21. Pooled serum was used as a 1: 1000 dilution to examine whole cell lysates and concentrated culture supernatants from multiple serotypes of Streptococcus pneumoniae by Western blot. Serum specifically reacted to a protein having a molecular weight of about 90 kDa in total cell lysate and concentrated culture supernatant.
실시예 9Example 9
도 11의 차트에는 모노포스포필 지질 A(MPL)이 보조첨가된 실시예 8에 설명된 바와 같이 제조된 r92kDa 단백질(SEQ ID NO:5)로 백신접종시킨 CBA/CAHNxid/J 마우스의 비내(IN) 투여로부터의 결과가 요약되어 있다.The chart in FIG. 11 shows intranasal of CBA / CAHN xid / J mice vaccinated with r92kDa protein (SEQ ID NO: 5) prepared as described in Example 8 supplemented with monophosphophil lipid A (MPL). IN) results from administration are summarized.
그룹 당 10마리의 마우스를 0주째, 3주째 및 5주째에 목 부분에 피하적으로 백신접종시켰는데, 50㎍의 MPL이 보조첨가된 92kDa 각각 5㎍, 100㎍의 알루미늄 포스페이트가 보조첨가된 단백질 캐리어 CRM197에 컨쥬게이팅된 타입 3 캡슐 각각 1㎍, 또는 포스페이트 완충된 식염수(PBS) 단독을 10㎕의 샘플 부피로 백신접종시켰다. CRM 197은 디프테리아 독소의 유전적으로 무독화된 변형체이다. 각각의 마우스에게 7주째에 1 x 10 cfu's의 타입 3 스트렙토코쿠스 뉴모니애를 10㎕의 샘플 부피로 투여하였다. 비강 조직을 투여한 지 3일째에 단리시키고, 비강 조직 1g 당 타입 3 스트렙토코쿠스 뉴모니애 콜로니 형성 단위의 개수를 선택 배지 상에 플레이팅함으로써 측정하였다. 타입 3는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 3으로부터 캡슐 단리시킨 후, 단백질 캐리어 CRM 197에 환원적 소생(animation)(참조: U.S. Patent No. 5,360,897 for preparation of the Type 3 control; U.S. Patent No. 5,614,382 for genetically detoxified version of ditheria toxin; U.S. Patent 4,902,506 with regard to using CRM 197 as a carrier)을 통해 컨쥬게이션시킨다.Ten mice per group were vaccinated subcutaneously to the neck at week 0, week 3 and week 5, with protein supplemented with 5 μg and 100 μg aluminum phosphate, respectively, of 92 kDa supplemented with 50 μg MPL 1 μg each of the Type 3 capsules conjugated to carrier CRM197, or phosphate buffered saline (PBS) alone, was vaccinated with a sample volume of 10 μl. CRM 197 is a genetically detoxified variant of diphtheria toxin. Each mouse received 1 × 10 cfu's Type 3 Streptococcus pneumoniae at week 7 in a 10 μl sample volume. Three days after nasal tissue was administered, the number of type 3 Streptococcus pneumoniae colony forming units per gram of nasal tissue was measured by plating onto selection medium. Type 3 was encapsulated from Streptococcus pneumoniae serotype 3, followed by reductive animation on protein carrier CRM 197 (see US Patent No. 5,360,897 for preparation of the Type 3 control; US Patent No. 5,614,382). for genetically detoxified version of ditheria toxin; US Patent 4,902,506 with regard to using CRM 197 as a carrier.
도 11의 차트는 이러한 모델에서, 둘 모두의 네거티브 대조군, 즉, 6주령된 MPL이 보조첨가된 마우스와 처리되지 않은 마우스가 비내 투여된 경우 약 30%의 생존율을 나타낸 반면, 포지티브 대조군, 즉, 알루미늄 포스페이트가 보조첨가된 타입 3 컨쥬게이트는 실험의 종료일, 약 14일까지 치사에 대해 100% 보호를 나타내었음을 보여준다. r92kDa로 면역된 마우스가 시험된 경우, 실험의 종료일까지 100%가 생존하였는데, 이는 r92kDa 단백질이 타입 3 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의한 비내 투여로부터 치사에 대해 보호를 제공함을 나타낸다.The chart of FIG. 11 shows a survival rate of about 30% in both of these models, when both negative controls, i.e. mice supplemented with 6 weeks old MPL and untreated mice, were administered intranasally, whereas the positive controls, i.e. Type 3 conjugates supplemented with aluminum phosphate showed 100% protection against lethal by the end of the experiment, about 14 days. When mice immunized with r92kDa were tested, 100% survived until the end of the experiment, indicating that the r92kDa protein provides protection against lethality from intranasal administration by Type 3 Streptococcus pneumoniae.
실시예 10Example 10
방법Way
재조합 92kDa(r92kDa) 폴리펩티드(SEQ ID NO:5)를 하기 비로 정제된 사람 C3와 2시간, 6시간 및 26시간 동안 인큐베이션시켰다:Recombinant 92kDa (r92kDa) polypeptide (SEQ ID NO: 5) was incubated for 2 hours, 6 hours and 26 hours with human C3 purified to the following ratios:
튜브 A (대조군): C3 - 3㎕[7.2x10-12 mol]PBS/0.01% 우혈청 알부민(BSA) - 100㎕;튜브 B: r92kDa - 50㎕[5.6x10-10 mol] C3 - 3㎕[7.2x10-12 mol]PBS/0.01% BSA - 50㎕. Tube A (control) : C3-3 μl [7.2 × 10 −12 mol] PBS / 0.01% bovine serum albumin (BSA) —100 μl; Tube B : r92kDa-50ul [5.6x10-10 mol] C3-3ul [7.2x10-12 mol] PBS / 0.01% BSA-50ul.
각각의 시점(2시간, 6시간 및 26시간)에서, 20㎕의 샘플을 환원 완충액이 첨가된 튜브 A와 B로부터 분리시키고, 샘플을 100℃에서 2분간 비등시켰다.At each time point (2 hours, 6 hours and 26 hours), 20 μl of samples were separated from tubes A and B with reducing buffer added and the samples were boiled at 100 ° C. for 2 minutes.
비등시킨 후, 샘플을 환원 조건 하에서 7.5% SDS-PAGE로 전기영동시켰다. SDS-PAGE 겔을 쿠마시에 블루로 염색시켰다. 생성된 겔을 도 12에 나타내었다.After boiling, the samples were electrophoresed with 7.5% SDS-PAGE under reducing conditions. SDS-PAGE gels were stained blue with Coomassie. The resulting gel is shown in FIG.
레인 1 - 분자량 표준물질 (겔의 상부로부터 판독하여 200kDa, 116kDa, 97kDa, 66kDa, 45kDa); 레인 2 및 4 - 2시간 인큐베이션; 레인 2 - C3 대조군(튜브 A); 레인 4 - r92kDa 샘플(튜브 B); 레인 5 및 7 - 6시간 인큐베이션; 레인 5 - C3 대조군(튜브 A); 레인 7 - r92kDa 샘플(튜브 B); 레인 8 및 10 - 26시간 인큐베이션; 레인 8 - C3 대조군(튜브 A); 레인 10 - r92kDa 샘플(튜브 B).Lane 1-molecular weight standards (200 kDa, 116 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa read from the top of the gel); Lanes 2 and 4-2 hours incubation; Lanes 2-C3 control (tube A); Lane 4-r92kDa sample (Tube B); Lanes 5 and 7-6 hours incubation; Lane 5-C3 control (tube A); Lane 7-r92kDa sample (Tube B); Lanes 8 and 10-26 hours incubation; Lane 8-C3 control (tube A); Lane 10-r92kDa sample (Tube B).
겔의 해석Gel interpretation
C3의 α-사슬을 약 115kDa에서 조작하였다. C3의 β-사슬을 약 75kDa에서 조작하였다. 이들은 겔 상에서 마킹된다. 약 66kDa의 밴드는 알부민이다. 레인 2 및 4는 2시간 인큐베이션이다. 레인 2(C3 대조군)과 비교하여, 레인 4는 C3 α-사슬의 절단물 - 약 97kDa의 신규한 단편을 나타낸다. 레인 5 및 7은 6시간 인큐베이션이다. 레인 7에는 동일한 신규한 97kDa 절단 단편이 있다. 레인 8 및 10은 26시간 인큐베이션이다. 레인 8(C3 대조군)과 비교하여, 레인 10은 α-사슬의 연속된 절단물을 나타낸다.The α-chain of C3 was engineered at about 115 kDa. The β-chain of C3 was engineered at about 75 kDa. These are marked on the gel. The band of about 66 kDa is albumin. Lanes 2 and 4 are two hour incubations. Compared to lane 2 (C3 control), lane 4 shows a cleavage of the C3 α-chain—a novel fragment of about 97 kDa. Lanes 5 and 7 are 6 hour incubations. Lane 7 has the same novel 97kDa cleavage fragment. Lanes 8 and 10 are 26 hour incubations. Compared to lane 8 (C3 control), lane 10 represents a continuous cut of α-chain.
본 발명이 특정한 구체예 및 실시예와 관련하여 상기 설명되었지만, 본 발명은 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 수 많은 다른 구체예, 실시예, 용도, 변형 및 시도가 상기 구체예, 실시예 및 용도로부터 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것을 당업자라면 인식할 것이다.Although the present invention has been described above with reference to specific embodiments and examples, the present invention is not necessarily limited thereto, and numerous other embodiments, examples, uses, modifications, and attempts are made from the embodiments, examples, and uses. Those skilled in the art will recognize that they may be made without departing from the scope of the present invention.
Claims (35)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10173698P | 1998-09-24 | 1998-09-24 | |
| US60/101,736 | 1998-09-24 | ||
| US28309499A | 1999-03-31 | 1999-03-31 | |
| US09/283,094 | 1999-03-31 | ||
| PCT/US1999/022362 WO2000017370A1 (en) | 1998-09-24 | 1999-09-24 | HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING POLYPEPTIDE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010089280A true KR20010089280A (en) | 2001-09-29 |
Family
ID=26798575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020017003811A KR20010089280A (en) | 1998-09-24 | 1999-09-24 | Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1115875A1 (en) |
| JP (1) | JP2002526082A (en) |
| KR (1) | KR20010089280A (en) |
| CN (1) | CN1352691A (en) |
| AU (1) | AU6060899A (en) |
| BR (1) | BR9914066A (en) |
| CA (1) | CA2343931A1 (en) |
| IL (1) | IL142017A0 (en) |
| MX (1) | MXPA01003073A (en) |
| WO (1) | WO2000017370A1 (en) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE479756T1 (en) * | 1996-10-31 | 2010-09-15 | Human Genome Sciences Inc | STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ANTIGENS AND VACCINES |
| US6800744B1 (en) | 1997-07-02 | 2004-10-05 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics |
| WO2000037105A2 (en) | 1998-12-21 | 2000-06-29 | Medimmune, Inc. | Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines |
| US7128918B1 (en) | 1998-12-23 | 2006-10-31 | Id Biomedical Corporation | Streptococcus antigens |
| EP1950302B1 (en) | 1998-12-23 | 2012-12-05 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Streptococcus antigens |
| WO2000039299A2 (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-06 | Shire Biochem Inc. | Streptococcus antigens |
| US7074415B2 (en) | 2000-06-20 | 2006-07-11 | Id Biomedical Corporation | Streptococcus antigens |
| EP1303612A2 (en) * | 2000-06-20 | 2003-04-23 | Shire Biochem Inc. | Streptococcus antigens |
| GB0022742D0 (en) | 2000-09-15 | 2000-11-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| US7262024B2 (en) | 2001-12-20 | 2007-08-28 | Id Biomedical Corporation | Streptococcus antigens |
| ES2522525T3 (en) * | 2003-05-15 | 2014-11-14 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of sepsis |
| KR102611449B1 (en) | 2005-04-08 | 2023-12-06 | 와이어쓰 엘엘씨 | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US20070184072A1 (en) | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US7955605B2 (en) | 2005-04-08 | 2011-06-07 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US7709001B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| ES2611608T3 (en) | 2005-10-21 | 2017-05-09 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified proteases that inhibit complement activation |
| TWI457133B (en) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel composition |
| GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| PL3017827T3 (en) | 2005-12-22 | 2019-04-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine |
| EA200901578A1 (en) | 2007-06-26 | 2010-08-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | VACCINE CONTAINING CONJUGATES OF CAPSULAR POLYSACCHARIDES STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE |
| ES2678694T3 (en) | 2008-04-16 | 2018-08-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine |
| GB201003920D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method of treatment |
| GB201003924D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| SG194733A1 (en) | 2011-05-17 | 2013-12-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine against streptococcus pneumoniae |
| GB201518684D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846547A (en) * | 1996-01-22 | 1998-12-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Streptococcal C5a peptidase vaccine |
| ATE479756T1 (en) * | 1996-10-31 | 2010-09-15 | Human Genome Sciences Inc | STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ANTIGENS AND VACCINES |
| WO1998048022A1 (en) * | 1997-04-24 | 1998-10-29 | Regents Of The University Of Minnesota | HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE) |
| EP1017828A1 (en) * | 1997-09-24 | 2000-07-12 | Regents Of The University Of Minnesota | HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE) |
-
1999
- 1999-09-24 KR KR1020017003811A patent/KR20010089280A/en not_active Application Discontinuation
- 1999-09-24 AU AU60608/99A patent/AU6060899A/en not_active Abandoned
- 1999-09-24 JP JP2000574269A patent/JP2002526082A/en not_active Withdrawn
- 1999-09-24 EP EP99969446A patent/EP1115875A1/en not_active Withdrawn
- 1999-09-24 WO PCT/US1999/022362 patent/WO2000017370A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-09-24 BR BR9914066-7A patent/BR9914066A/en not_active Application Discontinuation
- 1999-09-24 CN CN99813016A patent/CN1352691A/en active Pending
- 1999-09-24 IL IL14201799A patent/IL142017A0/en unknown
- 1999-09-24 CA CA002343931A patent/CA2343931A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-24 MX MXPA01003073A patent/MXPA01003073A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6060899A (en) | 2000-04-10 |
| IL142017A0 (en) | 2002-03-10 |
| JP2002526082A (en) | 2002-08-20 |
| EP1115875A1 (en) | 2001-07-18 |
| BR9914066A (en) | 2002-04-23 |
| CA2343931A1 (en) | 2000-03-30 |
| MXPA01003073A (en) | 2002-04-24 |
| CN1352691A (en) | 2002-06-05 |
| WO2000017370A1 (en) | 2000-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20010089280A (en) | Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae | |
| AU9510598A (en) | Human complement c3-degrading proteinase from (streptococcus pneumoniae) | |
| JP5122703B2 (en) | Streptococcus C5a peptidase vaccine | |
| JP2000512487A (en) | New compound | |
| JP2001508650A (en) | Novel bacterial polypeptides and polynucleotides | |
| JPH11137267A (en) | New compound | |
| JPH1169980A (en) | Novel dna strand resolution | |
| JP2002515871A (en) | Novel LysS protein of Streptococcus pneumoniae | |
| US6323336B1 (en) | PhoH homolog | |
| JPH10191987A (en) | New 3-dehydroquninic acid synthetase | |
| US6676943B1 (en) | Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae | |
| CA2239836A1 (en) | Novel arginine deiminase | |
| US5773250A (en) | Polynucleotides encoding a transcriptional response regulator of Streptococcus pneumoniae | |
| AU740153B2 (en) | Human complement C3-degrading proteinase from streptococcus pneumoniae | |
| US5858718A (en) | Pcr a | |
| JPH11235183A (en) | Signal recognition particle polypeptide and polynucleotide | |
| JPH11155582A (en) | New glmu | |
| JP2000509984A (en) | New compound | |
| AU2420800A (en) | Human complement C3-degrading polypeptide from streptococus pneumoniae | |
| MXPA00002932A (en) | Human complement c3-degrading proteinase from streptococcus pneumoniae | |
| JPH11285390A (en) | New alcohol dehydrogenase | |
| US5866368A (en) | GreA | |
| JPH11332580A (en) | New amps | |
| JPH11318469A (en) | New fol c | |
| JPH11253175A (en) | New phoh |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |