KR20010020342A - 종양치료용 맥관형성 길항제의 아데노바이러스-매개 종양내 전달방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 치료용 유전자 요법에 관한 것이다. 본 발명은 좀더 구체적으로 말하면, 종양의 생장 또는 전이, 또는 이들 모두의 억제를 위하여, 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 예를 들면, 결손 아데노바이러스 벡터를 이용하여 종양 세포 중으로 도입하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 우로키나제의 아미노 말단 단편(ATF)을 발현하는 결손 아데노바이러스의 전달은 종양의 생장 및 전이를 억제한다. 이러한 효과는 주사부위내 및 이의 바로 근처에서 혈관신생의 현저한 억제와 상관되어 있다. 안지오스타틴의 크링글 1 내지 3을 발현하는 결손 아데노바이러스 벡터의 전달은 종양 생장 및 종양발생을 억제하고, 종양 세포의 아폽토시스를 유도한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 바이러스 벡터를 제공한다.

Description

종양치료용 맥관형성 길항제의 아데노바이러스-매개 종양내 전달방법{ADENOVIRUS-MEDIATED INTRATUMORAL DELIVERY OF AN ANGIOGENESIS ANTAGONIST FOR THE TREATMENT OF TUMORS}

세포 이동은 세포 활성화와 부착력을 브리지하는 협동과정인 반면에, 주변세포 단백질분해와 이의 억제(예를 들면, 플라스미노겐 활성자 억제제 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제자에 의해 트리거링됨) 간의 평형이 붕괴된다(1-3). 우로키나제 플라스미노겐 활성자(uPA)는 이러한 과정에 있어서 중요한 역할자인데, 그 이유는 세포 표면 수용체(uPAR)에 결합함으로써 이동세포의 표면에서 단백질 분해 캐스케이드를 개시하기 때문이다(4,5). uPA의 이의 수용체와의 결합은 세포 표면에서 플라스미노겐/플라스민 전환을 대폭 강화시킨다(6). 플라스민은 피브로넥틴, 비트로넥틴 또는 라미닌 같은 외세포 매트릭스의 성분을 직접 분해할 수 있는 광범위 특이성 세린 프로테아제이다. 플라스민은 또한 불활성 지모겐을 활성 메탈로프로테이나제로 전환시킴으로써 스트로마의 국소분해를 간접적으로 촉진한다(7). 이동세포(invadopodes) 선단부의 uPAR의 선택적 분포는 이들 자신이 분비하거나 이웃 스트로마 세포에 의해 분비된 uPA를 명백히 집중시킨다(8). uPAR은 또한 비트로넥틴에 대한 uPA-의존형 결합에 의해 설명되는 바와 같이 외세포 매트릭스와의 세포 부착에 직접 관여되는 데(9), 그 이유는 uPAR이 수개의 인테그린 분자의 결합 성질을 조절하기 때문이다(10). 최종적으로, uPA 및 플라스민은 혈관 내피 생장 인자(VEGF), 간세포 생장 인자(HGF), 섬유아세포 생장 인자(FGF) 및 변형 생장 인자 β(TGFβ)와 같은 형태발생 인자의 방출을 활성화하거나 유도함으로써 세포 형태발생에 어느정도 관여된다(11,12).

종합해보면, 이들 관찰결과는 uPA/uPAR 시스템이 세포 활성화, 부착 및 운동을 조화시킴으로써 세포의 이동을 조절함을 시사한다. 이러한 논거는 종양의 침습성 가장자리에서 증진된 uPA 활성의 존재와 상관관계가 있는 임상적 관찰에 의해 지지된다(13,14). DMBA와 크로톤 오일에 의해 유도된 그 흑색종은 uPA-결핍 마우스에서 악성단계로 진행하지 않으며 이는 또한 종양 발생과 진행에 있어 uPA의 역할을 지지한다(15).

uPA는 아미노 말단 단편(ATF, 아미노산 1-135)으로도 알려져 있는 자신의 경쇄 단편에 의해 uPAR에 결합된다. 이러한 상호작용은 종 제한적이며(16), 마우스와 인간 사이에는 보존되어 있지 않은 아미노산 19-32가 중요한 ATF의 EGF-유사 도메인(잔기 1-46)을 수반한다(17,18). uPA/uPAR 복합체의 ATF-매개 붕괴는 시험관내에서 종양세포 이동 및 침습을 억제한다(19). 키메릭 인간 ATF-기본 길항제의 복강내 거환 주사도 1차 종양 생장에 심각하게 영향을 미치지 않으면서, 무흉선 마우스 내에 이식된 인간 종양 세포의 폐 전이 억제에 사용될 수 있다(20). 추가의 연구에 따르면 쥐 ATF로부터 유도된 합성 펩티드의 복강내 주사가 1차 종양 생장 및 폐 전이 모두의 억제에 효과적인 것으로 보고되어 있다(21). 이러한 결과는 종양과 내피 세포 모두의 운동성 조절에 uPA/uPAR 복합체의 역할과 일치한다(22). 키메릭 쥐 ATF-기본 길항제가 인공 bFGF-풍부 외세포 매트릭스내 혈관 생장을 억제할 수 있다는 사실(23)은 생체내 맥관형성 조절에 uPA/uPAR 연루를 더욱 지지한다.

혈관형성, 또는 맥관형성은 기존 혈관의 모세관 생장으로부터 발생한다. 맥관형성은 배 발생, 상처 치유 및 조직이나 기관 재생과 같은 다수의 생리학적 과정에 필수이다. 신 혈관의 비정상적인 생장은 당뇨성 망막증과 종양 생장, 및 종양의 원거리 전이와 같은 병리상태에서 발생한다(38,24). 실험적인 연구와 임상적인 연구 모두는 맥관형성 과정이 스위치 온 되지 않으면 증식과 아폽토시스의 균형을 이룬 비율에 기인하여 1차 종양 및 전이가 잠복상태로 잔류함을 보여준다(39).

내피세포의 생장은 양성 및 음성 인자 모두에 의해 긴밀하게 조절된다. 종양 맥관형성의 개시는 혈관 내피 생장 인자(VEGF) 및 산 또는/및 기본 섬유아세포 생장 인자(bFGF)와 같은 종양-방출 맥관형성 인자의 상향조절에 의해, 또는 트롬보스폰딘 및 안지오스타틴 같은 지혈 인자의 하향조절에 의해 트리거링될 수 있다(39). 지혈 인자의 재구성 및 맥관형성 자극 인자의 제거 모두는 종양 맥관형성 억제를 위한 가능한 임상적 전략을 구성한다(40,41). 지혈-기본 요법은 내피 세포가 하나의 종양 유형에서 다른 유형으로 변화되지 않기 때문에 모든 고형 종양에 적용되어야 하며, 이는 이러한 항암연구의 임상적 타당성을 더욱 강조한다. 따라서, 맥관형성을 표적으로 하는 요법은 임상적 실행에 매우 적당한 것으로 보인다.

다수의 생리학적 지혈 인자는 순환 단백질의 단백질 분해성 절단시 유도된다. 이는 안지오스타틴(32), 엔도스타틴(42), 프로락틴의 16 kDa 단편(43), 또는 혈소판 인자-4(44)에 대한 경우이다. 안지오스타틴은 루이스 폐암(LLC)을 지닌 마우스에서 처음 분리되었으며, 분자의 처음 4 개의 크링글을 포함하는 플라스미노겐(Plg)의 38 kDa 내부 단편(aa 98-440)으로 동정되었다(32; WO95/29242;US 5,639,725). 안지오스타틴은 GM-CSF-촉진된 종양-침윤성 마크로파지로부터의 메탈로엘라스타제에 의한 Plg의 가수분해 뒤에 생성되는 것으로 나타났다(45). 6 가지의 상이한 종양 모델에서 정제된 안지오스타틴의 복강내 거환 주사는 어떠한 명백한 독성도 없이, 1차 종양 생장의 억제에 매우 효과적인 것으로 증명되었다(46). 종양 맥관형성의 안지오스타틴-매개 억제는 외관상 종양 세포를 이들의 증식속도를 상쇄시키는 좀더 높은 아폽토시스 속도로 추진한다. 이러한 연구에서, 종양 생장은 통상적으로 안지오스타틴 분자의 제거 뒤에 재개되며, 이는 최적 임상적 혜택을 위한 장기 전달 달성의 중요성을 강조한다(46). 재조합 단백질을 이용한 시험관내 연구는 안지오스타틴의 지혈활성이 크링글 1 내지 3에 의해 대부분 매개되며, 따라서 크링글 4에 대해서는 활성이 적음을 시사한다(47). 대부분의 지혈인자의 경우, 안지오스타틴이 이의 작용을 발휘하는 분자적 경로에 대해서는 알려진 것이 거의 없다.

지혈요법이 생체내 치료수준의 장기 유지를 요하게 됨에 따라, 재조합 단백질의 연속 전달은 비용이 많이 들고 번거롭게 될 것이다. 상응하는 유전자를 바이러스 벡터로 직접 생체내 전달하는 방법이 이러한 문제점에 대한 매력적인 해결책을 구성한다. 현재로는 대부분의 암 유전자 요법이 종양 세포를 표적으로 하는 파괴적인 전략에 의존하므로(48), 지혈인자의 바이러스-매개 유전자 전달은 개념적으로 상이하고 가능하게는 상승효과적인 암 대처법을 의미한다.

이러한 결과에도 불구하고, 종양, 특히 화학요법이 잘 듣지않는 종양에 대한 효과적인 치료법이 여전히 필요하다.

본 발명은 종양 치료를 위한 효과적인 방식을 확립함으로써 이러한 요구에 부응한다.

다양한 참조문헌이 본 명세서에 특정번호로 인용되며, 이들은 실시예 뒤에 자세히 실려있다. 본원에서 인용되는 참조문헌 중 어느 것도 본원에 개시된 본 발명을 설명하거나 제안하는 것으로 해석되어서는 않된다.

발명의 개요

본 발명은 유리하게는, 종양에 대한 매우 효과적인 유전자 요법을 제공한다. 사실, 본 발명의 특정 양태에서, 무흉선 쥐 모델에서 인간 종양 세포에 의해 발현된 쥐 우로키나제 ATF는 예기치 않게도 종양발생을 효과적으로 억제한다. 다른 양태에서, 쥐 모델에서 종양 세포에서 발현된 안지오스타틴은 맥관형성 차단 뿐만 아니라, 종양 생장 및 종양발생을 억제하고, 종양 세포 아폽토시스를 유도하였다.

광범위한 일면에서, 본 발명은 항-맥관형성 인자의 발현을 제공하는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 종양세포 중으로 도입하는 단계를 포함하는, 종양의 생장 또는 전이, 또는 이들 모두를 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터이고; 좀더 바람직하게는 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 이하에 예시된 특정 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 결손 아데노바이러스 벡터이다.

본 발명의 방법은 본원에서 기술하는 바와 같이 다수의 암 치료에 유용하다. 예를 들면, 특정 양태에서, 종양은 폐암 또는 유방암이다.

또한, 본 발명은 형질도입된 종양 세포에 의한 항-맥관형성 인자의 발현의 이점을 최초로 증명한다. 따라서, 맥관형성 단백질에 대한 가용성 수용체와 같은 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자, 또는 맥관형성 길항제가 본 발명의 실행에서 전달될 수 있다. 특정 양태에서, 항-맥관형성 인자는 EGF-유사 영역을 지니는 우로키나제의 아미노 말단 단편의 서열을 포함하며, 단 인자는 우로키나제가 아니다. 예를 들면, 항-맥관형성 인자는 ATF-이뮤노글로불린 또는 ATF-인간 혈청 알부민을 포함하는 키메릭 단백질일 수 있다. 후술되는 바람직한 양태에서, 항-맥관형성 인자는 대략 아미노산 잔기 1번부터 약 잔기 135번까지의 우로키나제의 아미노산 서열을 갖는 우로키나제의 아미노 말단 단편이다. 특정 일면에서, 우로키나제는 쥐의 우로키나제이다. 더욱 바람직한 일면에서. 우로키나제는 인간 우로키나제이다.

대안의 양태에서, 항-맥관형성 인자는 안지오스타틴, 특히 안지오스타틴의 크링글 1 내지 3이다. 특히 바람직한 양태에서, 항-맥관형성 인자는 대략 아미노산 잔기 1번부터 대략 잔기 333번까지의 플라스미노겐의 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐(Plg)의 아미노 말단 단편이다. 다른 바람직한 양태에서, 항-맥관형성 인자는 인간 플라스미노겐으로부터의 아미노 말단 단편(안지오스타틴)이다.

관련 양태에서, 본 발명은 종양의 생장 또는 전이, 또는 이들 모두를 억제하기 위한 약제의 제조에 있어 항-맥관형성 인자의 발현을 제공하는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터의 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 예를 들면, 후술되는 바와 같이, 종양의 생장 또는 전이, 또는 이들 모두를 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 바이러스 벡터의 용도를 제공한다.

당연히, 전술한 방법과 용도 외에도, 본 발명은 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 신규한 바이러스 벡터를 제공한다. 바람직한 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 더욱 바람직한 양태에서, 바이러스 벡터는 결손 아데노바이러스 벡터이다. 본 발명의 바이러스 벡터는 전술한 바와 같이, 임의의 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 제공할 수 있다. 예를 들면, 항-맥관형성 인자는 EGF-유사 도메인을 갖는 우로키나제의 아민 말단 단편의 서열을 포함할 수 있으며, 단 인자는 우로키나제가 아니다. 바람직한 양태에서, 항-맥관형성 인자는 아미노산 잔기 1번부터 약 잔기 135까지의 우로키나제의 아미노산 서열을 갖는 우로키나제의 아미노 말단 단편이다. 이러한 양태에서, 우로키나제는 쥐 우로키나제, 또는 바람직하게는 인간 우로키나제일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 바이러스 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 종양 치료용 항-맥관형성 인자의 전달에 의한 유전자 요법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적은 항-맥관형성 인자의 전달용 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적은 종양 치료용 유전자 요법에 의한 우로키나제의 아미노 말단 단편(ATF)을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 일 목적은 종양 치료용 유전자 요법에 의해 안지오스타틴을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적은 종양 치료용 유전자 요법에 의해, 안지오스타틴, 특히 안지오스타틴의 크링글 1 내지 3을 제공하는 것이다.

본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적은 하기 상세한 설명과 실시예, 및 첨부 도면에서 좀더 상세히 설명한다.

본 발명은 종양치료용 유전자 요법에 관한 것이다. 본 발명은 좀더 구체적으로는, 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 종양세포 중으로, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터를 이용하여 도입시켜 종양의 생장 또는 전이, 또는 이들 모두를 억제하는 것에 관한 것이다.

도 1: 바이러스 AdmATF의 분자적 특징규명. 패널 A:AdmATF 및 AdCO1의 구조. Ad5 염색체는 36 kb 길이이고 역 말단 반복부에 의해 경계지워진다. Y는 캡시드화 시그널을 의미한다. 두 바이러스는 Ad5 E11 유전자가 결여되어 있기 때문에 생장에 대해 결손이다. 이들은 또한, 영역 E3에 1.9 kb Xbal 결실을 운반한다. 바이러스 AdmATF의 mATF 발현 카세트를 Ad5 염색체 아래에 개략적으로 나타내었다(일정 축척에 따라 도시하지는 않았음). 아데노바이러스 벡터에 대한 고찰을 위해서는 참조문헌(38) 참조. 패널 B:mATF 발현의 분석. MDA-MB-231 세포를 AdCO1(레인 2) 또는 AdmATF(레인 3)에 의해 24 시간 감염시키거나, 모의 감염시키며(레인 1), 전체 폴리(A+)RNA를 노던 블롯 분석한다. ATF-암호화 RNA(0.5 kb)를 표시하였다(화살표). 1.7 kb 분자가 또한 검출되며(별표), 아데노바이러스 pIX 유전자로부터의 폴리아데닐화 시그널의 이용과 일치하는 크기이다. 패널 C:293-감염세포에 의한 ATF 분비의 분석. 모의 감염 세포(레인 1), 또는 AdCO1으로(레인 2) 또는 AdmATF(레인 3)로 감염시킨 배양 배지를 폴리클로날 항-마우스 uPA 항체와 웨스턴 블롯 분석한다.

도 2: 바이러스 AdmATF의 기능적인 특징규명. 패널 A:AdmATF-감염세포의 배양배지는 LLC 세포에서 플라스민 전환을 억제한다(실시예의 방법부 참조). 293은 비 감염세포의 상등액을 나타낸다. 패널 B:AdmATF에 의한 LLC의 감염(우측 패널)은 AdCO1으로 감염된 LLC 세포의 것에 비해(좌측 패널) 세포 침습성을 특이적으로 억제한다. 막의 1.2 mm 세공이 가시적이다.

도 3: AdmATF의 종양내 주사는 동유전자형(syngeneic) 마우스에서 LLC 종양 생장을 억제한다. 종양 세포(2 x 10⁶세포)가 C57BL/6 마우스 중으로 피하주사된다. 6일 경과 후, 마우스에 PBS, 또는 AdCO1 또는 AdmATF의 10⁹PFU를 종양내 주사하고 종양 생장을 모니터한다. 평균치를 이의 표준 편차와 나타내었다(n = 10). 스튜던트 테스트로 통계를 낸다.

도 4: AdmATF의 종양내 주사는 LLC 종양 혈관신생을 억제한다. 패널 A:감염 후 10일째 되는 날에 추출한 AdCO1-처리(좌측) 및 AdmATF-처리 그룹으로부터의 대표적인 종양을 나타내었다. 감염 후 20일째 되는 날에 추출한 대표적인 종양을 패널 B(AdCO1으로 주사) 및 패널 C(AdmATF로 주사)에 나타내었다. 모든 사진은 동일 배율에서 취하였다. AdmATF-주사 종양이 특히, 감염 후 제일 늦은 시간에서 이들의 AdCO1-주사 대조구보다 한층 작았음에 주목하라(패널 B와 C를 비교).

도 5: AdmATF의 종양내 주사는 누드 마우스에서 MDA-MB-231 종양 생장을 억제한다. 종양은 3 x 10⁶MDA-MB-231 세포의 피하주사에 의해 이식된다. 후 이식 11일째 되는 날에, 마우스에 PBS, 또는 AdmATF 또는 AdCO1의 10⁹PFU를 종양내 주사하고, 종양 생장을 모니터한다. 평균치를 이의 표준편차와 나타내었다.

도 6: AdmATF의 종양내 주사는 종양내 및 종양주변 맥관형성을 억제한다. 패널 A:종양 절편의 vWF 면역염색. AdCO1-(A) 및 AdmATF-처리 그룹(B)으로부터 준비한 파라핀에 묻은 MDA-MB-231 종양 절편을 감염 후 52일째 되는 날에 폴리클로날 항-vWF 혈청으로 드러나게 한다. 패널 C 및 D:감염 후 20일째 되는 날에 AdCO1(C) 또는 AdmATF(D)로 주사한 종양의 피부내 종양주변 혈관신생의 현미경 평가.

도 7: (A)재조합 아데노바이러스. Ad5 게놈은 36 kb 길이의 염색체이다. 바이러스 AdK3 및 AdCO1은 E1 유전자의 치사 결실에 의해 유도되며(뉴클레오티드 위치 382 내지 3446);이들은 또한 영역 E3내에 비-치사성 1.9 kb Xbal 결실을 운반한다(참조문헌 37 참조). 안지오스타틴 발현 카세트는 Ad5 염색체 아래에 나타내었다. 플라스미노겐 분비 시그널은 검은색 박스로 표시하였고;+1은 CMV-구동 전사 개시를 의미하며;AATAAA는 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널을 의미한다. (B)감염세포로부터의 안지오스타틴 분비 분석. 인간 Plg(레인 1) 100 ng, AdK3(레인 2) 또는 AdCO1(레인 3)으로 감염된 HMEC-1, AdK3(레인 5) 또는 AdCO1(레인 5)으로 감염된 C6, 및 AdK3(레인 6) 또는 AdCO1(레인 7)으로 감염된 MDA-MB-231로부터의 배양배지를 웨스턴 블롯 분석한다. (C)C6 종양 추출물내 안지오스타틴의 면역검출; 종양을 누드 마우스에 정착시키고 AdCO1(레인 1) 또는 AdK3(레인 2)의 10⁹PFU를 투여한 다음 감염 후 10일째 되는 날에 웨스턴 블롯 분석한다. 안지오스타틴(36-38 kDa) 및 Plg(92 kDa)에 상응하는 시그널이 표시되었다(각각 화살표와 별표).

도 8: (A)내피 세포 증식 억제. C6(패널 1), MDA-MB-231(패널 2) 및 HMEC-1(패널 3)에 AdK3() 또는 Ad-CO1(□)를 주사한다. HMEC-1 세포(패널 4)를 AdK3-() 또는 AdCO1-감염 C6 교종 세포(□)로부터의 상등액과 배양한다. (B)HMEC-1 세포내 MPM-2 포스포에피토프의 검출. 모의 감염 세포(레인 1), AdCO1-감염 세포(레인 2), 및 AdK3-감염 세포(레인 3). (C)간접 면역염색에 의해 AdCO1(패널 1) 또는 AdK3(패널 2)로 감염된 HMEC-1에서 MPM-2 에피토프를 검출하고 프로피디움 아이오다이드 염색에 의해 DNA 함량을 검출해내며, 유동 혈구계산에 의해 정량한다(방법 참조). 스튜던트 t 테스트를 통계분석에 이용한다.

도 9: AdK3은 종양 생장을 억제한다. C6 교종(패널 A) 및 MDA-MB-231(패널 B)을 무흉선 마우스에 피하 이식한다(방법 참조). 종양이 20 mm³(0일)의 크기에 도달하였을 때, 마우스에 PBS(□), 또는 10⁹PFU 또는 AdK3() 또는 AdCO1()를 종양내 주사한다. 평균치를 이의 표준편차와 나타내었다.

도 10: AdK3는 C6 종양 생장 및 맥관형성을 억제한다. AdCO1-처리(패널 A) 및 AdK3-처리 그룹(패널 B)으로부터의 종양을 감염 후 10일째 되는 날에 나타내었다. AdCO1(패널 C) 또는 AdK3(패널 D)로 주사한 대표적인 종양의 주변에서 혈관신생 정도를 감염 후 5일째 되는 날에 나타내었다. AdCO1-주사(패널 E) 또는 AdK3-주사 종양(패널 F)으로부터의 파라핀에 묻은 C6 절편을 감염 후 10일째 되는 날에 vWF 면역염색한다. AdCO1-주사(패널 G) 또는 AdK3-주사 종양(패널 H)으로부터의 절편에서 TUNEL법으로 아폽토시스 세포의 비율을 검출한다. AdCO1- 및 AdK3-주사 종양에 대해 동일 배율이 사용되었다.

도 11: AdK3의 용량 의존 효과. C6 세포를 무흉선 마우스에 이식하기에 앞서, C6 세포를 시험관내에서 24 시간, AdCO3(패널 A) 또는 Ad3K(패널 B)로 감염시키고 비감염 C6 세포와 1(□), 1:2() 및 1:4()의 비율로 혼합한다. 종양의 크기를 20일 동안 측정한다. 평균치를 이의 표준편차와 나타내었다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 종양의 유전자 요법을 위한 방법 및 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 벡터는 종양 생장 또는 종양 전이, 또는 이들 모두를 억제한다. 이러한 방법 및 벡터는 종양을 예기치 않게 유리한 정도로 억제함으로써 작용한다.

본 발명은 부분적으로는, 우로키나제의 아미노 말단 단편(ATF) 및 안지오스타틴의 유전자 요법 전달을 수반하는 실험에 근거한다. ATF는 세포 표면 수용체(uPAR)에 결합하는 우로키나제(uPA)의 길항제, 및 내피 세포 이동 억제제이다. 종양 생장 및 전이에 대한 uPA/uPAR 상호작용의 중요성을 평가하기 위하여, CMV 프로모터로부터의 쥐 ATF를 발현하는 결손 아데노바이러스(AdmATF)를 작제한다. AdmATF의 1회 종양내 주사는 두 상이한 쥐 모델에서 미리 정착시킨 종양의 생장을 억제하며, 종양 전이를 지연시킨다. 이러한 효과는 주사부위내, 및 바로 근처에서 혈관신생의 현저한 억제와 상관관계가 있다. 이러한 효과의 크기는 인간-유도된 종양의 맥관형성 억제를 위한 쥐 ATF의 능력에서 특히 주목할 만하다. 특정 예로서, 전(前)활성화 펩티드 및 크링글 1 내지 3(47)을 포함하여, 인간 Plg로부터의 N 말단 단편(aa 1-333)을 발현하는 결손 아데노바이러스를 작제하고(AdK3) 상이한 쥐 종양 모델에서의 이의 시험관내 및 생체내 활성을 평가한다. AdK3 벡터는 종양 생장, 종양 맥관형성, 및 종양발생을 억제하고, 종양 세포 아폽토시스를 유도한다.

길항제의 종양내 아데노바이러스 매개 전달은 맥관형성을 표적화함으로써 강력한 항종양 성질을 보여준다.

정의

하기 정의된 용어는 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되며, 본 발명의 범위와 실행을 이해하는 데 도움이 된다.

특정 양태에서, "약" 또는 "대략"이란 용어는 주어진 값이나 범위의 20%, 바람직하게는 10%, 더욱 바람직하게는 5%내를 의미한다.

"항-맥관형성" 인자는 특히 내피 세포 이동을 차단함으로써 맥관형성을 억제하는 분자이다. 이러한 인자에는 억제성인 맥관형성 단백질의 단편(예를 들면, 우로키나제의 ATF), 맥관형성 억제 인자, 예를 들면, 안지오스타틴 및 엔도스타틴; 및 맥관형성 인자의 가용성 수용체, 예를 들면, 우로키나제 수용체 또는 FGF/VEGF 수용체가 포함된다. 플라스미노겐의 아미노 말단 단편으로부터 유도되는 "안지오스타틴"이란 용어에는 크링글 1 내지 3을 갖는 안지오스타틴의 항-맥관형성 단편이 포함된다. 일반적으로, 본 발명에 사용하기 위한 항-맥관형성 인자는 본 발명의 벡터를 사용하여 종양 중으로 전달된 유전자에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩티드이다.

폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유도되고 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 성질을 보유하는 임의 동족체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이체이다. 폴리펩티드 또는 단백질의 상이한 변이체가 자연에서 존재할 수 있다. 이러한 변이체는 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 상이함을 특징으로 하는 대립유전자 변이일 수 있거나, 상이한 스플라이싱 또는 후-해독 변형을 수반할 수 있다. 당업자는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 첨가, 또는 대치를 갖는 변이체를 생성시킬 수 있다. 이러한 변이체에는 특히, (a)하나 이상의 아미노산 잔기가 보존성 또는 반-보존성 아미노산으로 치환되는 변이체, (b)하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 또는 단백질에 첨가되는 변이체, (c)아미노산 중 하나 이상이 치환 그룹을 포함하는 변이체, 및 (d)폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 다른 폴리펩티드와 융합되는 변이체가 포함될 수 있다. 유전학적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소학적 기술을 포함하여 이러한 변이체 수득 기술은 당업자에 공지되어 있다.

대안적인 mRNA 스플라이싱 형태 및 대안적인 후-해독 변형 형태를 포함한 이러한 대립유전자 변이체, 동족체, 단편, 유도체, 돌연변이체,및 변형체가 폴리펩티드의 생물학적 성질을 보유하는 폴리펩티드의 유도체를 생성하면, 이들은 본 발명의 범위내에 포함시킨다.

일반적인 분자 생물학

본 발명에 따라, 당업계내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다[참조문헌:Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(본원에서는 "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization[B.D. Hames ＆ S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames ＆ S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture[R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc.(1994)].

따라서, 하기의 용어가 본원에 나타나면 후술되는 정의를 갖게된다.

"벡터"는 본 발명에 따른 핵산을 숙주세포로 전달하기 위한 수단이다. "벡터"란 용어에는 핵산을 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 중으로 도입하기 위한 바이러스 및 비-바이러스 수단 모두가 포함된다. 비-바이러스 벡터에는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 생중합체가 포함된다. 바이러스 벡터에는 좀더 상세히 후술되는 바와 같이, 레트로바이러스, 아데노-수반 바이러스, 폭스, 배큘로바이러스, 백시니아, 허프스 심플렉스, 엡스타인-바 및 아데노바이러스 벡터가 포함된다. 본 발명에 따른 핵산 외에도, 벡터는 하나 이상의 조절 영역, 및/또는 핵산 전달 결과(조직으로의 전달, 발현 지속기간 등)의 선별, 측정, 및 모니터링에 유용한 선별 마커를 함유할 수 있다.

"조절 영역"은 제 2 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 영역은 특정 핵산의 발현에 본래 관여하는 서열(상동 영역)을 포함할 수 있거나 또는 상이한 기원의 서열(상이한 단백질 또는 심지어는 합성 단백질의 발현에 관여하는)을 포함할 수 있다. 특히, 서열은 특이적 또는 비-특이적 방식 및 유도성 또는 비-유도성 방식으로 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 진핵세포 또는 바이러스 유전자 또는 유도된 서열의 서열일 수 있다. 조절 영역에는 복제기원, RNA 스플라이싱 부위, 인핸서, 전사 종결 서열, 폴리펩티드를 표적 세포의 분비 경로로 지시하는 시그널 서열, 및 프로모터가 포함된다. "이종 근원"으로부터의 조절 영역은 발현된 핵산과 자연스럽게 연계되지 않는 조절 영역이다. 상이한 종으로부터의 조절 영역, 상이한 유전자, 하이브리드 조절 서열 및 사실상 발생하지 않지만 당분야의 통상의 기술을 지닌 자에 의해 고안된 조절 서열로부터의 조절 영역이 이종 조절 영역에 포함된다.

"카세트"는 특정 제한 부위에서 벡터로 삽입될 수 있는 DNA의 단편을 의미한다. DNA의 단편은 해당 폴리펩티드를 암호화하고 카세트 및 제한 부위는 전사 및 해독을 위한 적절한 판독 프레임에서 카세트의 삽입을 보장하도록 고안된다.

이러한 DNA가 세포 내부로 도입될 경우 세포는 외생 또는 이종 DNA에 의해서 "형질감염" 되었다. 형질전환된 DNA가 표현형 변화를 수행하는 경우 세포는 외생 또는 이종 DNA에 의해서 "형질전환" 또는 "형질도입"된다.

"이종" DNA는 세포 또는 세포의 염색체 부위에 본래 존재하지 않는 DNA를 의미한다. 바람직하게는, 이종 DNA에는 세포와 이질적인 유전자가 포함된다.

"핵산"은 뉴클레오티드라는 공유 결합된 아단위로 이루어진 중합체 화합물이다. 핵산에는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있는 폴리리보핵산(RNA)과 폴리데옥시리보핵산(DNA)이 포함된다. DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 반-합성 DNA가 포함된다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 또는 핵산 서열의 서열을 센스 서열이라 한다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거치는 DNA 분자이다.

DNA "암호화 서열"은 적합한 조절 서열의 조절 하에 배치시 생체내 또는 시험관내 세포내에서 폴리펩티드로 전사되고 해독되는 이본쇄 DNA 서열이다. 암호화 서열의 범위는 5' (아미노) 말단에서의 개시 코돈과 3' (카복실) 말단에서의 해독 종결 코돈에 의해서 결정된다. 폴리아데닐화 시그널 및 해독 종결 서열은 보통 암호화 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.

전사 및 해독 조절 서열은 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 종결자 등이다. 진핵세포에서, 폴리아데닐화 시그널은 조절 서열이다.

"프로모터 서열"은 세포에 RNA 폴리머라제를 결합시키고 다운스트림(3' 방향) 암호화 서열의 해독을 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명의 정의의 목적상, 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해서 3'말단에 결합되고 업스트림(5' 방향)으로 신장되어 백그라운드 이상의 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는 데 필요한 최소수의 염기 또는 요소를 포함한다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1으로 맵핑함으로써 통상적으로 정의됨) 및 RNA 폴리머라제의 결합을 맡는 단백질 결합 도메인(일치 서열)이 발견될 것이다.

암호화 서열은 RNA 폴리머라제가 암호화 서열을 mRNA로 전사하고, 이어서 이것이 임의로 트랜스-RNA 스플라이싱되고 암호화 서열에 의해서 암호화된 단백질로 해독될 때, 세포 내에서 전사 및 해독 조절 서열의 "조절 하에" 존재한다.

"시그널 서열"은 세포 표면에 발현될 단백질의 암호화 서열의 개시부에 포함된다. 이러한 서열은 폴리펩티드를 전위시키기 위해서 숙주 세포로 인도하는 시그널 펩티드, 성숙한 폴리펩티드로의 N-말단을 암호화한다. "전위 시그널 서열"이라는 용어는 본원에서 이러한 부류의 시그널 서열을 의미하는 것으로 사용된다. 전위 시그널 서열은 진핵세포 및 원핵세포 기원의 각종 단백질과 연계되어 발견될 수 있고, 종종 두 유형 모두의 유기체에서 기능성이다.

"상응하는"이라는 용어는 본원에서 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 상이하던 간에, 유사 또는 상동 서열을 의미하는 것으로 사용된다. 핵산 또는 아미노산 서열 정렬은 공간을 포함할 수 있다. 따라서, "상응하는"이라는 용어는 서열 유사성을 의미하는 것이지 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 수를 의미하는 것이 아니다.

본 발명의 다양한 양태는 적합한 유전자 치료 벡터 및 프로모터, 항-맥관형성 단백질 및 치료 전략에 관하여 하기에서 더욱 상세하게 기재될 것이다. 이러한 다양한 섹션으로의 구성은 본 발명의 이해를 촉진하려는 것이지 제한하려는 것이 아니다.

유전자 치료 벡터

상기와 같이, "벡터"는 본 발명에 따른 핵산의 숙주 세포로의 전달을 위한 임의의 수단이다. 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스, 허프스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-수반 바이러스이다. 따라서, 항-맥관형성 단백질 또는 이의 폴리펩티드 도메인 단편이 바이러스 벡터를 사용하거나 DNA의 직접 도입을 통하여 생체내, 생체외 또는 시험관내로 도입된다. 표적화된 조직에서의 발현은 트랜스제닉 벡터를 예를 들면, 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드를 이용하여 특정 세포로 표적화함으로써 또는 조직-특이성 프로모터를 사용함으로써 또는 둘 다를 사용하여 수행될 수 있다.

생체내 또는 생체외 표적화 및 치료 절차에 보통 사용되는 바이러스 벡터는 DNA-기본 벡터와 레트로바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터를 작제하고 사용하기 위한 방법이 당분야에 공지되어 있다[참조문헌: Miller and Rosman, BooTechniques 7:980-990 (1992)]. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 복제 결손이고, 즉, 표적 세포에서 자발적으로 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 복제 결손 바이러스 벡터의 게놈은 감염된 세포에서의 바이러스 복제에 필수적인 적어도 하나의 영역이 부족하다. 이러한 영역은 제거되거나(전부 또는 일부), 당분야 기술자에게 공지된 여타의 기술에 의해서 비-기능성으로 될 수 있다. 이러한 기술에는 전체 제거, 치환(기타 서열, 특히 삽입된 핵산에 의해서), 부분 결실 또는 하나 이상의 염기의 필수(복제를 위한) 영역으로의 첨가가 포함된다. 이러한 기술은 시험관내(분리된 DNA에서) 또는 현장에서, 유전자 조작 기술을 사용하거나 돌연변이유발제로의 처리에 의해서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 복제 결손 바이러스는 바이러스 입자의 캡슐화에 필수적인 게놈의 서열을 보유한다.

DNA 바이러스 벡터에는 감쇠 또는 결손 DNA 바이러스, 예를 들면, 허프스 일본쇄 바이러스(HSV), 파필로마바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV) 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 전부 또는 거의 전부 바이러스 유전자가 부족한 결손 바이러스가 바람직하다. 결손 바이러스는 세포로의 도입 후 감염되지 않는다. 결손 바이러스 벡터의 사용은 특이적인 국한된 영역에서 벡터가 다른 세포를 감염시킬 염려없이 세포로 투여되게 한다. 따라서, 특정 조직이 특이적으로 표적화될 수 있다. 특정 벡터의 예에는 결손 허프스 바이러스 1 (HSV1) 벡터[참조문헌: Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], 당단백질 L-유전자가 부족한 결손 허프스 바이러스 벡터(특허 공개 RD 371005 A), 또는 기타 결손 허프스 바이러스 벡터(1994년 9월 29일자 국제 특허 공개 제WO 94/21807호; 1994년 4월 2일자 국제 특허 공개 제WO 92/05263호); 감쇠된 아데노바이러스 벡터, 예를 들면, 문헌[참조: Statford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); La Salle et al., Science 259:988-990 (1993)]에 기재된 벡터; 및 결손 아데노-수반 바이러스 벡터[참조문헌: Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. biol. 8:3988-3996 (1988)]가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 생체내 투여를 위해서, 적합한 면역억제 처리가 바이러스 벡터 및 형질감염 세포의 면역-불활성화를 피하기 위해서 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터와 병행하여 사용된다. 예를 들면, 면역억제 사이토킨, 예를 들면, 인터류킨-12(IL-12), 인터페론-γ(IFN-γ) 또는 항-CD4 항체가 바이러스 벡터에 대한 체액성 또는 세포성 면역 반응을 차단하기 위해서 투여될 수 있다 [참조문헌: Wilson, Nature Medicine (1995)]. 또한, 최소수의 항원을 발현시키도록 공학처리된 바이러스 벡터를 사용함이 유리하다.

아데노바이러스 벡터. 바람직한 양태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 실시예에 예시된 바와 같이, 결손 아데노바이러스 벡터는 종양 생장 및 종양형성 억제의 예상치 않게 효율적인 효과에 의해 예시된 바와 같이 그 자체가 항-맥관형성 억제제 ATF 및 안지오스타틴의 운반에 특히 효과적인 것으로 나타났다. 아데노바이러스는 본 발명의 핵산을 각종 세포 유형으로 효율적으로 운반하기 위해서 변형될 수 있는 진핵세포 DNA 바이러스이다. 이러한 혈청형 중에서, 본 발명의 범위 내에 유형 2 또는 유형 5 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스를 사용함이 바람직하다(WO 94/26914 참조). 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 이러한 동물 기원의 아데노바이러스에는 개, 소, 마우스(예: Mavl, [참조문헌: Beard et al., Virology 75 (1990) 81]), 양, 돼지, 조류 및 원숭이(예: SAV) 기원이 포함된다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스(예를 들면, 맨하탄 또는 A26/61 균주(ATCC VR-800))이다.

바람직하게는, 본 발명의 복제 결손 아데노바이러스 벡터는 ITR, 캡시드화 서열 및 해당 핵산을 포함한다. 좀더 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터의 적어도 E1 영역은 비-기능성이다. E1 영역에서의 결실은 바람직하게는 Ad5 아데노바이러스 서열의 뉴클레오티드 455 내지 3329(PvuII-BgIII 단편) 또는 382 내지 3446(HinfII-Sau3A 단편)까지 뻗어있다. 기타 영역, 특히 E3 영역(WO 95/02697), E2 영역(WO 94/28938), E4 영역(WO 94/28152, WO 94/12649 및 WO 95/02697), 또는 후기 유전자 L1-L5의 일부가 또한 변형될 수 있다.

바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역에 결실(Ad 1.0)을 지닌다. E1-결실 아데노바이러스의 예가 본원에 참조로 인용되는 EP 185,573에 기재되어 있다. 다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E4 영역에 결실(Ad 3.0)을 지닌다. E1/E4 결실 아데노바이러스의 예가 본원에 참조로 인용되는 WO 95/02697 및 WO 96/22378에 기재되어 있다. 또다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E4 영역 및 핵산 서열이 삽입되는 E1 영역에 결실을 지닌다(본원에 참조로 인용되는 FR94 13355 참조).

본 발명에 따른 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 당분야 기술자에게 공지된 여타의 기술에 의해서 제조될 수 있다[참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 특히 아데노바이러스와 특히 해당 DNA 서열을 운반하는 플라스미드 사이의 상동성 재조합에 의해서 제조될 수 있다. 상동성 재조합은 아데노바이러스와 플라스미드의 적합한 세포주로의 공형질감염에 이어서 수행된다. 사용되는 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소에 의해서 형질전환될 수 있어야 하고 (ii) 재조합 결손 아데노바이러스의 게놈의 일부를 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위한 통합된 형태로 보충할 수 있는 서열을 포함해야 한다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 게놈에 통합된 Ad5 아데노바이러스(12 %)의 좌측부를 포함하는 인간 배 신장 세포주 293[참조문헌: Graham et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59]와 출원 WO 94/26914 및 WO 95/02697에 기재된 바와 같이 E1 및 E4 기능을 보완할 수 있는 세포주이다. 재조합 아데노바이러스는 당분야 통상의 기술자에게 익히 공지된 표준 분자생물학 기술을 사용하여 회수되고 정제된다.

아데노-수반 바이러스. 아데노-수반 바이러스(AAV)는 안정하고 부위-특이적인 방식으로 이들이 감염시킨 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 상대적으로 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 아데노-수반 바이러스는 세포 생장, 형태 또는 분화에 대한 어떠한 영향도 유도하지 않으면서 광범위한 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있고 인간 병리에 수반되는 것으로 보이지 않는다. AAV 게놈은 클로닝되고 서열화되고 특징규명되었다. AAV는 약 4700 개의 염기를 포함하고 각 말단에 바이러스 복제 기원의 역할을 하는 약 145 개의 역 말단 반복 (ITR) 영역을 포함한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 수행하는 2 개의 필수 영역: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자에 수반되는 rep 유전자를 포함하는 게놈의 좌측부; 및 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap를 포함하는 게놈의 우측부로 세분된다.

시험관내 및 생체내 유전자 전달을 위해 AAV로부터 유도된 벡터의 사용이 기재되어 있다(WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528 참조). 이들 공개문헌에는 rep 및/또는 cap 유전자가 해당 유전자에 의해서 결실되고 치환된 다양한 AAV-유도 작제물, 및 시험관내(배양 세포로) 또는 생체내(기관으로 직접) 해당 유전자 전달을 위한 이들 작제물의 용도가 기재되어 있다. 본 발명에 따른 복제 결손 재조합 AAV가 2 개의 AAV 역 말단 반복(ITR) 영역에 의해서 플랭킹된 해당 핵산 서열을 함유하는 플라스미드와 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드를 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)로 감염된 세포주로 공형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 생성된 AAV 재조합체는 표준 기술에 의해서 정제된다.

그러므로, 본 발명은 또한 게놈이 AAV ITR에 의해서 플랭킹된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 AAV-유도 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 AAV로부터 2 개의 ITR에 의해서 플랭킹된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 플라스미드는 핵산 서열을 경우에 따라 리보솜 벡터(슈도-바이러스)로 혼입된 플라스미드를 이용하여 전달하기 위해 그 자체로 사용될 수 있다.

레트로바이러스 벡터. 다른 양태에서 유전자는 예를 들면, Anderson 등의 미국 특허 제5,399,346호; Mann 등의 1983, Cell 33:153; Temin 등의 미국 특허 제4,650,764호; Temin 등의 미국 특허 제4,980,289호; Markowitz 등의 1988, J. Virol. 62: 1120; Temin 등의 미국 특허 제5,124,263호; EP 453242, EP 178220; Bernstein 등의 Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; Doughery 등에 의해 1995년 3월 16일에 공개된 국제 특허 공개 제WO 95/07358호; 및 Kuo 등의 1993, Blood 82:845에 기재된 바와 같이 레트로바이러스 벡터로 도입될 수 있다. 레트로바이러스 게놈에는 2 개의 LTR, 캡시드화 서열 및 3 개의 암호화 영역 (gag, pol 및 env)이 포함된다. 재조합 레트로바이러스 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전부 또는 일부 결실되고 해당 이종 핵산 서열로 치환된다. 이러한 벡터는 상이한 유형의 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MoMuLV("마우스 몰로니 백혈병 바이러스"), MSV("마우스 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"); SNV("비장 괴사 바이러스"); RSV("라우스 육종 바이러스") 및 프렌드 바이러스로부터 작제될 수 있다.

일반적으로, 핵산 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서, LTR, 캡시드화 서열 및 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 작제한다. 이러한 작제물이 플라스미드에서 부족한 레트로바이러스 기능을 트랜스로 공급할 수 있는 패키징 세포주를 형질감염시키기 위해서 사용된다. 따라서, 일반적으로, 패키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 패키징 세포주, 특히 세포주 PA317(US 3,861,719); PsiCRIP 세포주(WO 90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주(WO 89/07150)가 선행 기술에 기재되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스 벡터는 전사 활성을 억제하기 위한 LTR 내의 변형 및 gag 유전자의 일부를 포함할 수 있는 광범위한 캡시드화 서열을 함유할 수 있다[참조문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 재조합 레트로바이러스 벡터는 당분야 통상의 기술자들에게 공지된 표준 기술에 의해서 정제된다.

레트로바이러스 벡터는 감염성 입자로서 기능하거나 단일 순환의 형질감염을 수행하도록 작제될 수 있다. 전자의 경우에, 바이러스는 옹코진 형질전환을 맡는 것들을 제외한 모든 이의 유전자를 보유하고 이종 유전자를 발현시키기 위해서 변형된다. 비-감염성 바이러스 벡터는 바이러스 패키징 시그널을 파괴하기 위해서 제조되지만, 이종 유전자와 패키징 시그널을 함유하도록 공학처리된 공-도입 바이러스를 패키징하도록 요구되는 구조 유전자를 보유한다. 따라서, 생성된 바이러스 입자는 추가의 바이러스를 생성할 수 없다.

표적화된 유전자 운반이 1995년 10월에 공개된 국제 특허 공개 WO 95/28494에 기재되어 있다.

비-바이러스 벡터. 또한, 벡터는 생체내에 형질감염 부형제를 함유하지 않는 핵산으로서 또는 형질감염 촉진제, 예를 들면, 리포펙션과 함께 도입될 수 있다. 지난 10 년간, 시험관내 핵산의 캡시드화 및 형질감염을 위한 리포좀의 사용이 증가해 왔다. 리포좀 매개 형질감염으로 직면한 어려움과 위험을 제한하도록 고안된 합성 양이온 지질이 마커를 암호화하는 유전자의 생체내 형질감염을 위한 리포좀을 제조하기 위해서 사용될 수 있다[참조문헌: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al., Science 259: 1745-1748 (1993)]. 양이온 지질의 사용은 음으로 하전된 핵산의 캡슐화를 촉진할 수 있고 또한 음으로 하전된 세포막과의 융합을 촉진할 수 있다[참조문헌: Felgner and Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. 핵산의 전달에 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물이 국제 특허 공개 WO 95/18863 및 WO 96/17823 및 미국 특허 제5,459,127호에 기재되어 있다. 외생 유전자를 생체내 특정 기관으로 도입하기 위한 리포펙션의 사용은 확실한 실용적인 장점이 있다. 리포좀의 특정 세포로의 분자 표적화는 한 영역의 이익을 나타낸다. 형질감염을 특정 세포 유형으로 인도함은 세포 이종성을 지닌 조직, 예를 들면, 간, 신장 및 뇌에 특히 유리하다는 것이 명백하다. 지질은 표적화의 목적상 다른 분자에 화학적으로 커플링된다(상기의 Mackey 등의 문헌 참조). 표적화된 펩티드, 예를 들면, 호르몬 또는 신경전달물질 및 단백질, 예를 들면, 항체, 또는 비-펩티드 분자가 리포좀에 화학적으로 커플링될 수 있다.

기타 분자가 또한 생체내 핵산, 예를 들면, 양이온 올리고펩티드(예를 들면, 국제 특허 공개 WO 95/21931), DNA 결합 단백질로부터 유도된 펩티드(예를 들면, 국제 특허 공개 WO96/25508) 또는 양이온 중합체(예를 들면, 국제 특허 공개 WO95/21931)의 형질감염을 촉진시키기에 유용하다.

생체내 벡터를 네이키드 DNA 플라스미드로서 도입함이 가능하다. 유전자 치료를 위한 네이키드 DNA 벡터는 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 유전자 건의 사용 또는 DNA 벡터 수송자의 사용[참조문헌: Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut 등의 1990년 3월 15일자 캐나다 특허원 제2,012,311호; Williams 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]에 의해서 원하는 숙주 세포로 도입될 수 있다. 수용체-매개 DNA 운반 접근법이 또한 사용될 수 있다[참조문헌: Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)].

핵산은 또한 네이키드 DNA로서 투여될 수 있다. 네이키드 DNA의 포유동물 근육 조직으로의 제형 및 투여 방법이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제5,580,859호와 제5,589,466호에 기재되어 있다.

조절 영역. 본 발명의 벡터로부터의 항-맥관형성 인자의 발현은 임의의 조절 영역, 즉, 당분야에 공지된 프로모터/인핸서 요소에 의해서 조절될 수 있지만, 이들 조절 요소는 발현을 위해 선택된 숙주 표적 종양에서 기능성이어야 한다.

조절 영역은 종양에서의 기능성 전사를 위한 프로모터 영역, 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위에 대한 시그널을 규정하는 해당 유전자의 3'에 위치하는 영역을 포함할 수 있다. 모든 이러한 요소는 발현 카세트를 구성한다.

본 발명에 사용될 수 있는 프로모터에는 구조 프로모터 및 조절된(유도가능한) 프로모터가 포함된다. 프로모터는 본래 핵산의 발현을 책임진다. 프로모터는 또한 이종 근원으로부터의 것일 수 있다. 특히, 프로모터는 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 감염시키기를 원하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 프로모터는 사용된 아데노바이러스를 포함하는, 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이에 관하여, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자 등의 프로모터가 언급될 수 있다.

또한, 프로모터는 조직-특이적 또는 우세한 발현을 허용하는 활성화 또는 조절 서열(들)(에놀라제 및 GFAP 프로모터 등)의 첨가에 의해서 변형될 수 있다. 또한, 핵산이 프로모터 서열을 함유하지 않는 경우, 이것은 이러한 서열의 바이러스 게놈 다운스트림으로와 같이 삽입될 수 있다.

본 발명의 실행에 유용한 임의의 프로모터는 편재성 프로모터(예를 들면, HPRT, 비멘틴, 액틴, 튜불린), 중간 필라멘트 프로모터(예를 들면, MDR형, CFTR, 인자 VIII), 조직-특이적 프로모터(예를 들면, 평활근에서의 액틴 프로모터), 분열 세포에서 우선적으로 활성화되는 프로모터, 자극에 반응하는 프로모터(예를 들면, 스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체), 테트라사이클린-조절 전사 조절자, 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 레트로바이러스 LTR, 메탈로티오네인, SV-40, E1a 및 MLP 프로모터이다. 테트라사이클린-조절 전사 조절자 및 CMV 프로모터가 본원에 참조로 인용되는 WO 96/01313, US 5,168,062 및 5,385,839에 기재되어 있다.

따라서, 유전자 발현을 조절하기 위해서 사용될 수 있는 프로모터에는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 초기 프로모터 영역[참조문헌: Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310], 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터[참조문헌: Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797], 허프스 티미딘 키나제 프로모터[참조문헌: Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445], 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열[참조문헌: Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42]; 원핵세포 발현 벡터, 예를 들면, b-락타마제 프로모터[참조문헌: Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3713], 또는 tac 프로모터[참조문헌: DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8:21-25; "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94]; 효모 및 기타 균류로부터의 프로모터 요소, 예를 들면, Gal4 프로모터, ADC(알콜 디하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리성 포스페이트 프로모터; 및 조직 특이성을 나타내거나 트랜스제닉 동물에 사용되어 온 동물 전사 조절 영역: 췌장 아시나 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역[참조문헌: Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515]; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역[참조문헌: Hanahan, 1985, Nature 315:115-122], 림포이드 세포에서 활성인 이뮤노글로불린 유전자 조절 영역[참조문헌: Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444], 고환, 유방, 림포이드 및 마스트 세포에서 활성인 마우스 포유동물 종양 바이러스 조절 영역[참조문헌: Leder et al., 1986, Cell 45:485-495], 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역[참조문헌: Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276], 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역[참조문헌: Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 198, Science 235:53-58], 간에서 활성인 알파 l-항트립신 유전자 조절 영역[참조문헌: Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171], 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역[참조문헌: Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94], 뇌의 올리고덴드로사이트에서 활성인 수초 기본 단백질 유전자 조절 영역[참조문헌: Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712], 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역[참조문헌: Sani, 1985, Nature 314:283-286], 및 시상하부에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 조절 영역[참조문헌: Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378]이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

항-맥관형성 단백질을 암호화하는 유전자

본 발명의 벡터는 항-맥관형성 단백질을 암호화하는 유전자를 본 발명에 따른 종양으로 운반하기 위해서 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 항-맥관형성 인자는 EGF형 도메인을 함유하는 우로키나제의 아미노 말단 단편(ATF)이다. 이러한 단편은 아미노산 잔기 약 1번부터 약 135번까지의 ATF에 상응한다.

다른 양태에서, ATF는 본원에 참조로 인용되는 융합 단백질, 예를 들면, 이뮤노글로불린 또는 인간 혈청 알부민[WO 93/15199]으로서 제공될 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 효과적인 ATF는 우로키나제, 예를 들면, 마우스 우로키나제로부터 유도될 수 있지만, 인간 우로키나제 ATF가 바람직하다. 또한, 본 발명은 특정 아미노산 잔기의 인간 ATF로부터의 상응하는 잔기로의 치환에 의해 변형된 비-인간 우로키나제 ATF의 투여를 고려한다. 예를 들면, 마우스 ATF는 하기와 같이 하나 이상의, 바람직하게는 모든 아미노산 잔기에서 변형될 수 있다: 티로신-23을 아스파라긴으로; 아르기닌-28을 아스파라긴으로; 아르기닌-30을 히스티딘으로; 및 아르기닌-31을 트립토판으로. 따라서, 임의의 근원으로부터의 우로키나제 ATF는 인간화될 수 있다. 이것은 암호화 서열을 기존의 분자 생물학 기술을 사용하여 변형시킴으로써 쉽게 달성된다.

기타 항-맥관형성 단백질을 암호화하는 유전자가 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 유전자에는 크링글 1 내지 3을 포함하는 안지오스타틴을 포함하는 안지오스타틴 암호화 유전자[참조문헌: O'Reilly et al., Cell 79:315-328 (1994); WO 95/29242; US 5,639,725]; 메탈로프로테이나제의 조직 억제[참조문헌: Johnson et al., J. Cell. Physiol. 160:194-202(1994)]; FGF 또는 VEGF의 억제제; 및 엔도스타틴[WO 97/15666]이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 양태에서, 항-맥관형성 인자는 안지오스타틴, 특히 안지오스타틴의 크링글 1 내지 3이다. 특히 바람직한 양태에서, 항-맥관형성 인자는 아미노산 잔기 1번부터 약 333번까지의 플라스미노겐의 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐(Plg)의 아미노-말단 단편이다. 다른 바람직한 양태에서, 플라스미노겐/안지오스타틴의 아미노 말단 단편은 인간 플라스미노겐(안지오스타틴)이다.

다른 양태에서, 본 발명은 가용성 VGF/VEGF 수용체 및 가용성 우로키나제 수용체가 포함되지만 이에 제한되지 않는 맥관형성 인자를 위한 가용형의 수용체를 암호화하는 유전자의 투여를 제공한다[참조문헌: Wilhem et al., FEBS Letters 337:131-134 (1994)].

일반적으로, 맥관형성에 수반되는, 내피 세포 활성화 및 이동에 길항하는 단백질 또는 가용성 수용체를 암호화하는 유전자가 유전자 치료 벡터 및 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, ATF 또는 안지오스타틴의 유전자 치료 운반이 상기에 지적되고 하기에 예시될 이유로 이에 관하여 특히 효과적임이 특히 주목할만하다.

항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자는 게놈 DNA이든 cDNA이든 간에 임의의 근원, 특히 인간 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 이러한 유전자를 수득하기 위한 방법은 상기에 기재된 바와 같이 당분야에 익히 공지되어 있다[참조문헌: 상기의 Sambrook et al., 1989].

뉴클레오티드 암호화 서열의 축퇴성으로 인하여, 항-맥관형성 인자 유전자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 기타 핵산 서열이 본 발명의 실행에 사용될 수 있고 이들은 본 발명의 청구 범위에 포함되는 것으로 간주된다. 이들에는 대립유전자, 다른 종으로부터의 상동성 유전자, 및 서열내에서 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해서 변형되고 이에 따라 사일런트 변화를 일으키는 항-맥관형성 인자의 전부 또는 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 항-맥관형성 인자 유도체에는 주요 아미노산 서열로서 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 보존된 아미노산 치환을 유발하는 서열 내의 잔기를 대신하여 치환되는 변형된 서열을 포함하는 항-맥관형성 인자 단백질의 전부 또는 일부의 아미노산 서열을 함유하는 것들이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기는 유사한 극성의 다른 아미노산에 의해서 치환될 수 있고, 이는 기능성 등가물로서 기능하며 사일런트 변화를 유발한다. 서열내 아미노산에 대한 치환체는 아미노산이 속하는 부류의 기타 멤버 중에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 방향족 환 구조를 포함하는 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된(산성) 아미노산에는 아스파트산 및 글루탐산이 포함된다. 이러한 변형은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점에 의해서 측정되는 바와 같이 겉보기 분자량에 영향을 미칠 것으로 기대될 것이다.

특히 바람직한 치환은

- 양전하가 유지될 수 있도록 Arg 대신에 Lys로 및 역으로;

- 음전하가 유지될 수 있도록 Asp 대신에 Glu로 및 역으로;

- 유리-OH가 유지될 수 있도록 Thr 대신에 Ser로; 및

- 유리 CONH₂가 유지될 수 있도록 Gln 대신에 Asn으로이다.

본 발명의 항-맥관형성 인자 유도체 및 동족체를 암호화하는 유전자는 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해서 생성될 수 있다. 이러한 생성을 유발하는 조작은 유전자 또는 단백질 수준에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 클로닝된 항-맥관형성 인자 서열은 당분야에 공지된 다수 전략 중 일부에 의해서 변형될 수 있다[참조문헌: 상기 Sambrook et al., 1989]. 서열은 적절한 부위에서 제한 엔도뉴클레아제로 분해될 수 있고, 이어서 원하는 경우 추가로 효소 변형되고, 분리되고, 시험관내에서 연결된다. 항-맥관형성 인자의 유도체 또는 동족체를 암호화하는 유전자의 생성시, 변형된 유전자가 원하는 활성이 암호화되는 유전자 영역내, 해독 종결 시그널에 의해서 중단되지 않는, 항-맥관형성 인자 유전자와 동일한 해독 판독 프레임 내에서 존재함을 보장하는 것에 주의를 기울여야 한다.

또한, 항-맥관형성 인자-암호화 핵산 서열은 해독, 개시 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴하거나, 암호화 영역에서의 변이를 생성하고/하거나 신규 엔도뉴클레아제 부위를 형성시키거나 선재하는 것을 파괴하거나, 추가의 시험관내 변형을 촉진시키기 위해서, 키메릭 유전자를 형성시키기 위해서 시험관내 또는 생체내에서 돌연변이될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 변형은 돌연변이된 항-맥관형성 인자 유전자 산물의 기능적 활성을 증진한다. 당분야에 공지된 돌연변이를 위한 임의의 기술에는 시험관내 부위-지향성 돌연변이[참조문헌: Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem, 253:6551; Zoller and Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710], TAB^R링커(Pharmacia) 등의 사용이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 부위 지향성 돌연변이를 위해 PCR 기술이 바람직하다[참조문헌: Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principes and Applicant for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70].

치료 표적 및 전략

본 발명에 따른 방법은 종양을 치료할 수 있게 한다. 본 발명에 따라서, 다양한 주사, 주입, 직접 적용 등의 현명한 선택에 의해서 대다수 종양 세포를 특이적이고 일방적으로 감염시킴이 가능하다.

약학 조성물. 본 발명에 따른 이의 사용을 위해서, 다양한 형태의 벡터, 핵산-지질 조성물 또는 네이키드 DNA가 바람직하게는 주사가능한 제형을 위해 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 배합된다. "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 인간에게 투여시 생리학적으로 용인되고 전형적으로 알러지 또는 유사 부적절한 반응, 예를 들면, 위 불편감, 현기증 등을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제국에 의해서 승인되거나 미국 약전 또는 기타 동물, 좀더 상세하게는 인간에 사용하기 위해 일반적으로 인식되는 약전에 수록된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 화합물이 투여되게 하는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학 담체는 멸균액, 예를 들면, 물 및 오일일 수 있고, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들면, 낙화생유, 대두유, 광유, 호마유 등이 포함된다. 물 또는 염 수용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 바람직하게는 담체로서, 특히 주사 용액으로 사용된다. 적합한 약학적 담체가 E.W. Martin에 의해 "Remington's Pharmaceutical Science"에 기재된다. 이들은 특히 등장성 멸균 염용액(모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이들 염의 혼합물)이거나 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가시 주사 용액이 구성되는 건조, 특히 동결-건조 조성물일 수 있다.

바람직한 멸균 주사제는 용액 또는 비독성 비경구 허용 용매 또는 희석제 중의 현탁물일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체의 예는 염수, 완충 염수, 등장 염수(예를 들면, 모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 또는 이들 염의 혼합물), 링거 용액, 덱스트로스, 물, 멸균수, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 배합물이다. 1,3-부탄디올 및 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 완화 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산, 예를 들면, 올레산이 또한 주사제로의 용도가 발견되었다.

"치료 유효량"이라는 용어는 본원에서 숙주의 활성, 기능 및 반응에서 임상적으로 상당한 결손을 적어도 약 15 %, 바람직하게는 적어도 50 %, 좀더 바람직하게는 적어도 90 % 감소시키고, 가장 바람직하게는 억제하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 사용된다. 또한, 치료 유효량은 숙주에서 임상적으로 중요한 증상에 있어서의 개선을 유발하기에 충분하다.

투여에 사용되는 바이러스 용량은 다양한 파라미터의 함수로서, 특히, 고려되는 투여 부위(종양), 주사횟수, 발현될 유전자, 원하는 치료 기간의 함수로서 적응될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 10⁴내지 10¹⁴pfu, 바람직하게는 10⁶내지 10¹¹pfu 용량의 형태로 제형되고 투여된다. pfu(플라크 형성 단위)라는 용어는 바이러스 용액의 감염력에 상응하고 적당한 세포 배양물을 감염시키고 일반적으로 15 일 후, 감염된 세포의 플라크 수를 측정함으로써 측정된다. 바이러스 용액의 pfu 측정 기술은 문헌에 익히 기록되어 있다.

바람직한 양태에서, 조성물은 항-맥관형성 인자 유전자, 예를 들면, ATF 유전자(AdATF) 또는 안지오스타틴(AdK3)을 약 1x10⁹pfu/100 μl의 농도로 함유하는 아데노바이러스를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 종양으로의 투여에 특히 유용하다.

종양. 본 발명은 종양, 특히 고형 종양에 관한 것이다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 고형 종양의 예에는 육종 및 암종: 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 임파관육종, 임파관내피육종, 활막성종양, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 기저세포암, 선암, 한선암, 피지선암, 유두암, 유두선암, 낭선암, 척수암, 기관지암, 신장세포암, 간종양, 담낭관암, 융모막암, 정성피종, 배아암, 빌름스 종양, 경부암, 고환 종양, 폐암, 소 세포 폐암, 방광암, 내피암, 신경교종, 성세포종, 수아세포종, 두개인두관 종양, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청음 신경종, 핍지신경교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아종이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

다른 양태에서, 증식이상 변화(예를 들면, 화생 및 이형성)가 내피 조직, 예를 들면, 경부, 식도 및 폐에서 치료되거나 억제된다. 따라서, 본 발명은 신형성 또는 암, 특히 과형성, 화생 또는 가장 상세하게는 이형성으로 이루어진 비-신형성 세포 생장이 일어나는 곳에 선행 진행이 공지되거나 예상되는 증상의 치료를 제공한다 (이러한 비정상적 생장 증상을 검토하기 위해 문헌[참조: Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79] 참조). 과형성은 구조 또는 기능에 있어 현저한 변화없이 조직 또는 기관에 있어 세포 수의 증가를 수반하는 조절된 세포 증식의 형태이다. 한 예로서, 자궁 과형성은 종종 자궁암을 진행시킨다. 화생은 한 유형의 성체 또는 완전히 분화된 세포가 다른 유형의 성체 세포를 대신하여 치환되는 조절된 세포 생장의 형태이다. 화생은 내피 또는 연결 조직 세포에서 발생할 수 있다. 전형적인 화생은 다소 무질서한 화생 내피를 수반한다. 이형성은 종종 암의 전조이고 주로 내피에서 발견되고; 이것은 세포의 가장 무질서한 형태이고, 개별 세포 균일성 및 세포의 건축 배위에 있어 감소를 수반한다. 이형성 세포는 종종 비정상적으로 거대한 짙게 염색되는 핵을 지니고, 다형성을 나타낸다. 이형성은 특징적으로 만성 자극상태 또는 염증이 존재하는 곳에서 발생하고, 종종 경부, 호흡 경로, 구강, 및 담낭에서 발견된다. 이러한 장애의 검토를 위해서, 문헌[참조: Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia]을 참조한다.

본 발명은 또한 비-악성 종양 및 맥관형성에 의해서 증가된 부적절한 세포 또는 조직 생장을 수반하는 기타 장애를 본 발명 벡터의 치료 유효량을 부적절한 생장을 수행하는 조직에 투여함으로써 치료함에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 동정맥(AV) 기형, 특히 두개골내 부위의 치료에 유용한 것으로 생각된다. 본 발명은 또한 염증 및 혈관 증식을 특징으로 하는 피부병 상태인 건선; 면역 및 가능한 혈관 증식과 연계된 상태인 양성 전립선 비대를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 기타 과증식 장애의 치료가 또한 고려된다.

투여방법. 본 발명에 따라서, 종양으로의 투여의 바람직한 경로는 종양으로의 직접 주사이다. 종양은 예를 들면 자기 공명 이미징 또는 컴퓨터-보조 단층 촬영법과 같은 당해 분야에 유용한 기술, 및 정위 주사로 투여된 치료 조성물을 이용하여 이미징될 수 있다.

달리, 종양 표적이 특정 항원에 의해 특징화된다면, 본 발명의 벡터는 앞서 기술된 항원에 표적화될 수 있고, 적절한 형태, 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 복강내, 심실내로 전신 또는 부분계 투여될 수 있다.

복합 치료. 본 발명의 방법이 종양 생장 및 전이의 억제에 효과적이지만, 본 발명의 벡터 및 방법은 수술, 방사선, 화학요법 및 기타 유전자 요법(이에 한정되지 않음)을 포함하는 기타 치료 모델과 함께 유리하게 이용된다.

예를 들어, 본 발명의 벡터는 일산화질소 억제제와 함께 투여될 수 있는데, 이는 혈관수축 활성을 가지고 종양으로 혈액 흐름을 줄여준다.

또다른 양태에서, 본 발명의 벡터는 택솔, 택소테르 및 기타 택소이드(이에 한정되지 않음)[예, 미국 특허 4,857,653; 4,814,470; 4,924,011; 5,290,957; 5,292,921; 5,438,072; 5,587,493; 유럽 특허 0 253 738; 및 국제 특허 공개 WO91/17976, WO93/00928, WO93/00929 및 WO9601815에 기재]와 같은 화학치료제, 또는 시스-플라틴(및 기타 플라틴 삽입 화합물), 에토포시드 및 에토포시드 포스페이트, 블레오마이신, 미토마이신 C, CCNU, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 이포스파미드 등과 함께 투여될 수 있다.

또다른 양태에서, 본 발명의 벡터는 또다른 종양 유전자 요법, 예를 들면 앞서 기재된 p53 또는 CTS-1[WO97/04092]과 같은 이의 유사체, 티미딘 키나제(TK), 항-RAS 일본쇄 항체, 인터페론-α 또는 인터페론-γ 등(이에 한정되지 않음)과 함께 투여될 수 있다. 유전자 치료를 위한 벡터는 바이러스 벡터 또는 네이키드 DNA와 같이 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 단일 벡터(바이러스 또는 DNA)를 사용하여 항-맥관형성 인자 및 또다른 종양 치료 인자 모두를 암호화하는 유전자를 전달한다.

또다른 일면에서, 본 발명은 종양 및 암과 같은 증식 이상 치료에 유용한 단백질의 발현과 함께 항-맥관형성 인자 유전자의 조절된 발현을 제공하며, 이때 이종 유전자는 숙주 면역 시스템 메카니즘에 의해 종양 세포의 표적화를 촉진하는 표적 마커 또는 면역조절 사이토킨을 암호화한다. 면역조절(또는 면역-효과기) 분자용 이종 유전자의 예는 인터페론-α, 인터페론-γ, 인터페론-β, 인터페론-ω, 인터페론-τ, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β, 인터루킨-2, 인터루킨-7, 인터루킨-12, 인터루킨-15, B7-1 T 세포 공자극 분자, B7-2 T 세포 공자극 분자, 면역 세포 부착 분자(ICAM)-1 T 세포 공자극 분자, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-마크로파아지 콜로니 자극 인자, 및 이들의 조합물(이에 한정되지 않음)을 포함한다.

본 발명의 하기의 실시예를 참조하면 좀더 이해가 잘 될 것이며, 이는 예시적이면서 비제한적으로 제공된다.

실시예 1: 종양 생장 및 전이를 억제하는 ATF를 이용한 유전자 치료

실시예 1은 uPA/uPAR 길항제 ATF(우로키나제의 아미노 말단 단편)의 발현이 종양 생장 및 전이를 억제함을 입증한다. CMV 프로모터로부터 쥐 ATF(AdmATF)를 발현시키는 결손 아데노바이러스를 작제한다. AdmATF의 종양내 1회 주사가 두가지 상이한 쥐 모델에서 미리-정착된 종양의 생장을 억제하고, 종양 전이를 지연시킨다. 이들 효과는 주사 부위에 인접한 부근내, 및 부근에서 뚜렷한 신혈관 형성 억제와 상관된다. 이러한 효과의 정도는 인간-유도된 종양의 맥관형성을 억제하는 쥐 ATF의 능력에서 특히 뚜렷하다.

방법

재조합 아데노바이러스. AdmATF는 CMV 프로모터로부터 쥐 ATF 유전자를 발현시키는 E1-결손 재조합 아데노바이러스이다. 플라스미드 pDB1519 16을 출발 물질로 사용하여 성숙 uPA의 잔기 135 뒤에 종결 코돈을 도입한다. 간단히 말하면, uPA-암호 서열(단일 펩티드 포함)을 분리하고, NsiI으로 제한한 다음, 잔기 128-135 뒤에 종결 코돈을 합성 단편 형태로 재도입한다. ATF 개방 판독 프레임을 CMV 프로모터와 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널 서열 사이에 삽입하여, 플라스미드 pEM8-mATF를 제조한다. 이 플라스미드도 ATF 발현 카세트가 E1 유전자 대신 위치 382와 3446 사이에 삽입되는 것을 제외하고는 Ad5 게놈의 최초 6.3 kb를 운반한다(도 1A). pEM8-mATF와 ClaI-제한된 AdRSVbGal DNA 25간의 상동 재조합에 의해 AdmATF를 293 세포에서 작제한다. 개개 바이러스 플라크를 연질 아가에서 자란 293-유도된 세포 단층상으로 분리하고, 새로운 293 세포 상으로 증폭시킨 다음 바이러스 DNA를 26 추출한다. EcoRI, EcoRV 및 AvrII+NdeI 제한 분석은 재조합 아데노바이러스의 동정 및 콜로니 능력을 확인시킨다. AdCO1은 E1 대신 트랜스유전자 발현 카세트를 운반하지 않는 것을 제외하고는 AdmATF와 일치하는 결손 대조구 아데노바이러스이다. 두 바이러스를 293, Ad5 27의 E1 유전자를 조직적으로 발현시키는 인간 배 신장 세포에서 증식시킨다. 바이러스 스톡을 제조하고 25에 기재된 바와같이 적정한다. 달리 언급이 없으면, MDA-MB-231 세포 및 루이스 폐암(LLC) 세포는 300 PFU/세포의 감염 중복도(MOI)로 감염된다. 이들 감염 중복도는 바이러스 AdRSVbGal 25를 사용할 경우 각각 80 및 65% b-갈락토시다제-발현 세포중으로 이동하는 것으로 앞서 나타나 있다.

노던 블롯 분석. 비유착성 MDA-MB-231 세포 배양물을 AdmATF 또는 AdCO1으로 감염시키고, 총 RNA를 RNAZOL 과정에 의해 감염 후(p.i.) 24시간째에 추출한 다음, 폴리아데닐화된 RNA를 정제한다. 샘플을 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 흘리고, 하이본드 N 막상으로 옮긴다(Amersham). 막을 42℃, 50% 탈이온화된 포름아미드, 0.2% SDS, 5배의 Denhardt 용액 10 ㎖에서 1시간 동안 변성된 초음파처리된 연어 정자 DNA(100 ㎍/㎖)와 미리하이브리드화시킨 다음, 쥐 uPA cDNA의 랜덤-프라이밍된(³²P)-라벨된 1.2 kb Xbal-HindIII 단편과 함께 밤새 배양한다(16). 막을 50℃에서 1시간 동안 2배의 SSC/0.1% SDS로 2회, 30분간 0.1배의 SSC로 1회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 Kodak XAR-5 필름에 노출시킨다.

웨스턴 블롯 분석. 바이러스-감염된 세포의 상등액을 감염 후 24시간째에 모아, 니트로셀룰로스 막으로 옮기기 이전에, 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔(400㎍ 단백질/레인)에 흘린다(Schleicher ＆ Schuell). 블로킹 완충액에서 1시간 동안 배양한 후, 막을 쥐 uPA에서 자란 폴리클로날 혈청과 함께 1시간 동안 배양한 다음(벨기에 루벵의 Pr.R Lijnen), 추가 1시간 동안 홀스-래디쉬 퍼록시다제-접합된 염소 항-토끼 혈청(Dako)과 함께 배양한다. 막을 PBS-Tween 완충액에서 3회 세척하고, 5분간 3-아미노-9-에틸-카바졸(AEC)과 함께 배양한다.

세포-결합 단백질분해의 억제. LLC 세포 단층을 글리신-HCl(pH 3)에서 3분간 산성화한데 이어, 0.5 M HEPES 완충액에서 배양시켜 네이티브 uPA를 세포 표면 수용체로부터 우선 해리시킨다. 세포를 37℃에서 20분간 AdCO1-및 AdmAT-감염된 293 세포의 상등액과 함께 배양한다. PBS/0.1% BSA에서 3회 세척한 후, 세포를 37℃에서 20분간 1 nM 쥐 uPA와 함께 배양한다(벨기에 루벵의 Pr.R Lijnen). 비결합된 uPA를 PBS로 세척하여 제거하고, 0.4 μM의 인간 플라스미노겐 및 플라스민 S-2251을 첨가하여 세포-결합 uPA를 정량한다(스웨덴의 Kabi Vitrum).

시험관내 침습 분석. 감염 24시간 후, LLC 세포를 1 mM EDTA로 분리하고, PBS로 세척한 다음, 0.1% BSA로 보충된 FCS-유리 MDEM 배지에서 재현탁시킨다. [19]에 기재된 바와같이 침습 분석을 트랜스웰 유닛에서 수행한다. 간단하게는, 1.2 ㎛ 세공 크기의 폴리카보네이트 필터(Transwell, Costar)를 160 ㎍ Matrigel(Becton Dickinson)로 코팅한 다음 건조한다. 트랜스웰 유닛의 하부 챔버를 10 ng/㎖ EGF를 함유하는 인간 섬유아세포-조건화된 배지로 채우고, 상부 챔버를 3 x 10⁵감염 세포로 시이딩한다. 37℃에서 24시간 배양 후, 하부 챔버에 이르는 세포수를 Giesma로 염색한 뒤 광학 현미경으로 측정한다.

동유전자형 종양 모델. 루이스 폐암을 C57BL/6 동유전자형 마우스상으로 연속 계대한다. 간단하게는, LLC 종양으로 피하 이식된 C57BL/6를 종양이 600-1200 mm³용적에 이를 때 희생시킨다. 종양 세포를 0.9% 식염액에 재현탁시킨 다음 무명체를 통해 여과시키고, 2 x 10⁶세포(0.5 ㎖)를 6-7주간 자란 C57BL/6 암컷 마우스의 등에 피하 이식한다. 5일 후, 종양이 대략 20 mm³의 크기에 이르면, 0.2 ㎖의 PBS(n=8), 또는 10⁹PFU (0.2 ㎖)의 AdCO1(n=10) 또는 AdmATF(n=10)로 주사한다. 1차 종양의 크기를 감염 5, 10 및 15일째에 측정한다. 감염 16일째에, 폐 전이 수를 65 mg BrdU의 복강내 주사 후 3시간째에 평가한다. 폐 조직을 제거하고, 아세트산 포름알데히드(AFA)에서 밤새 고정시킨 다음, 파라핀 절편을 4 N HCl에서 15분간 배양하고, 중화시킨 다음 37℃에서 45분간 퍼록시다제-라벨된 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체(Boehringer)와 배양하기 전에 PBS/0.5% BSA/0.1% Tween 20에서 15분간 2회 세척하고, AEC.BrdU-양성 병소를 25배율의 광학 현미경으로 정량한다.

무흉선 쥐 모델. 배양된 MDA-MB-231 세포(ATCC HTB 26)를 수거, 세척, PBS에서 1.5 x 10⁷세포/㎖로 재현탁 후, 3 x 10⁶세포를 6-7주간 자란 누드 마우스의 등에 피하 주사한다. 종양이 15-20 mm³의 용적에 이르면(즉, 11일 후), 동물에 AdmATF(n=5) 또는 AdCO1(n=5), 또는 PBS 10⁹PFU의 종양내 주사하고, 종양 크기를 감염 52일까지 모니터링한 후, [28]에 기재된 바와같이 동물을 죽여 종양내 혈관형성 정도를 평가한다. 간단하게는, 종양 조직을 AFA에서 밤새 고정시키고, 100% 에탄올로 옮겨, 파라핀에 묻은 다음 5 ㎛ 두께 부위를 제조한다. 톨루엔 처리 및 재가수분해 후, 부위를 37℃에서 15분간 2 ㎍/㎖ 단백질분해효소 K로 투과시킨다. 내생성 퍼록시다제 활성을 0.3% H₂O₂로 15분간 억제시킨다. 부위를 PBS로 세척하고, 7.5% BSA에서 15분간 배양한 다음, 인간 vWF(Dako)에서 자란 토끼 폴리클로날 혈청과 함께 30분간 배양한다. PBS로 2회 세척 후, 부위를 바이오티닐화된 염소 항-토끼 IgG 항체와 함께 30분간 배양하고, 세척한 다음, AEC의 첨가 이전에 15분간 스트렙타비딘-퍼록시다제와 함께 배양한다. 신혈관 핫스팟을 저배율로 우선 확인하고 vWF-양성 미세혈관을 정량한다. Meyer의 헤마톡실린을 [28]에 기재된 바와같이 대조염색용으로 사용한다.

종양 정착상 AdmATF 감염을 평가하기 위해, 유착성 MDA-MB-231 세포를 AdmATF 또는 AdCO1으로 50 PFU/세포의 MOI로 우선 감염시킨다. 세포를 감염 24 후에 세척하고, 120 ㎕의 PBS에서 재현탁시키며, 80㎕의 아이스-콜드 Matriger과 혼합한 다음, 1.3 x 10⁶세포를 누드 마우스의 등에 피하 이식한다. 이식후 51일간 종양 정착 및 생장이 뒤따른다.

결과

AdmATF의 분자 및 기능 특성. AdmATF는 CMV 프로모터로부터 쥐 ATF를 발현시키는 결손 재조합 아데노바이러스이지만 AdCO1은 "효과없는" 대조구 아데노바이러스이다(도 1A). 감염 이전에 기능성 uPA 길항제를 발현시키는 능력과 관련해 AdmATF를 특징화하는데 시험관내 연구를 우선적으로 수행한다. AdCO1이 아닌 AdmATF로 24시간 동안 감염된 MDA-MB-231 세포에서 추출된 폴리(A+) RNA의 노던 분석으로 ATF 유전자 발현을 입증한다(도 1B). AdmATF-감염 세포에 의한 ATF 분비는 웨스턴 블롯 분석에 의해 293, LLC 및 MDA-MB-231 세포의 경우에 증명된다. 예를 들어, 성숙 펩티드(15.3 kDa)의 것에 상응하는 분자량을 지닌 ATF-특이성 폴리펩티드는 AdmATF로 24시간 동안 감염된 293 세포의 배지에서 유일하게 검출된다.

ATF는 세포 표면 수용체에 결합하는 uPA(uPAR)의 유력한 길항제이고, 이 복합체의 파괴는 비활성 플라스미노겐에서 플라스민으로의 전환을 상당히 억제하는 것으로 알려져있다. LLC 세포-결합 플라스민 전환을 측정하여 AdmATF-감염 세포에 의해 분비된 ATF의 기능을 평가한다. 선행조건으로, 본 출원인은 LLC 세포가 uPA를 분비하고 uPAR을 발현시키는 것을 의미하는 상당한 수준의 세포-결합 uPA 활성(자료는 도시되지 않음)을 나타내는지를 체크했다. 플라스민 전환/활성은 내생성 uPA가 AdmATF-감염된 293 세포의 상등액과 함께 배양되고 1 nM 쥐 uPA를 첨가하기 전에 약산 처리에 의해 세포 표면으로부터 미리 제거될 때 상당히 감소된다(도 2A).

uPA/uPAR 복합체도 세포 운동성에 중요하다. 시험관내 세포 침습 분석을 이용하여 AdmATF의 기능을 확인한다. LLC 세포를 AdmATF 또는 AdCO1으로 감염시키고, 매트릭스-코팅막을 통해 이동하는 세포수를 24시간 후에 측정한다(도 2B). 데이터의 정량화는 AdmATF 감염이 AdCO1 대조구 감염에 비해 65%(n=5)의 LLC 침습을 억제함을 입증하고 있다.

AdmATF의 종양내 주사는 종양 생장 및 전이를 억제함. 본 출원인은 AdmATF의 종양내 1회 투여와 관련된 항종양 효과를 평가하기 위해 우선적으로 루이스 폐암-C57B1/6 동유전자형 모델을 사용했다. 피하 이식 후 5일째에, 종양에 10⁹PFU의 AdmATF, 10⁹PFU의 AdCO1, 또는 PBS로 주사하고, 감염 후 15일간 종양 생장을 모니터링한다. 도 3에서 알 수 있듯이, AdmATF-처리된 그룹에서 총체적 억제가 특이적으로 관찰된다. 감염 후 16일째에 동물을 희생시켜, BrdU-양성 병소의 수를 헤아려 폐 전이를 넘버링한다. 전이는 PBS(n=8)가 주사된 모든 동물에서 나타나지만, ADCO1- 및 AdmATF-처리된 그룹에서는 각각 7/9, 및 단지 3/9가 양성으로 나타났다. BrdU-양성 병소/폐 부위의 평균수도 AdCO1-처리된(6.3)그룹 및 PBS-처리된(6.6) 그룹에 비해 AdmATF-처리된 그룹(2.7)에서 감소된다. 따라서 AdmATF의 종양내 1회 투여가 이러한 고도의 공격성 모델에서 종양 생장 및 전이를 상당히 억제한다. 개개 실험에서, 종양-함유 동물을 AdCO1 또는 AdmATF로 감염시키고, 육안 관찰을 위해 종양을 감염 후 10일 및 20일째에 추출한다. AdCO1-감염된 LLC 종양이 두 시점에서 강한 혈관형성을 나타내는 반면, AdmATF-처리된 그룹의 종양은 단지 최저한도의 혈관형성을 행한다(도 4).

AdmATF의 항종양 효과는 혈관형성 수준에서 행해짐. 종양 생장을 위한 혈관형성의 유일한 억제를 특이적으로 평가하기 위해, 본 출원인은 무흉선 마우스로 이식된 인간-유도된 MDA-MB-231 유방암 모델에서 쥐 uPA/uPAR 길항제의 아데노바이러스-매개 전달을 연구했다. 종양 세포에서 쥐 ATF의 직접적인 기능은 쥐 uPA가 쥐 uPAR보다 200배 덜 효과적으로 인간 uPAR에 결합하기 때무에 이 모델에서 최소임에 틀림없다. 피하 종양 세포 접종 후 11일 째에, 동물에 10⁹PFU의 AdmATF, 10⁹PFU의 AdCO1, 또는 PBS를 종양내 주사하고, 감염 후 52일간 종양 생장을 모니터링한다. 감염 후 32일까지는 중요한 효과가 나타나지 않지만, AdCO1-감염된 그룹이 아닌, AdmATF-감염된 그룹에서 종양 생장이 억제됨을 알 수 있다. 감염 52일째에 마우스를 희생시켜 von Willebrand Factor(vWF)-면역반응성 혈관의 가시적 관찰로 종양내 맥관형성을 평가한다(도 6A). AdCO1-주사된 종양 부위 18-20과 비교해 평균 4-6 혈관을 AdmATF-처리된 종양 부위에서 검출한다. AdmATF가 주사된 종양도 AdCO1-처리된 대응물과 비교해 주변 신혈관 형성을 거의 나타내지 않는다(도 6B). AdCO1-감염된 그룹에서 4/5 동물에 존재하는 거대 종양과 대조적으로, 제한된 크기의 종양은 AdmATF-처리된 그룹(n=5)에서 단지 한 동물에서 나타난다. 또한, AdmATF-감염된 종양 세포의 접종 후 전개된 종양은 AdCO1-감염된 세포의 접종 후 전개된 것보다 적게 혈관형성된다(자료는 도시되지 않음).

토의

본 출원인은 종양(19.20)과 내피세포(22,23) 둘 표면에서 아미노-말단, 비-촉매, 우로키나제 단편(ATF), 수용체에 결합하는 우로키나제의 유력한 길항제의 국부 전달과 관련된 항종양 효과를 연구해왔다. CMV 프로모터로부터 쥐 기원의 분비성 ATF 분자(AdmATF)를 발현시키는 결손 아데노바이러스의 종양내 투여에 의해 ATF를 생체내로 전달시킨다. 바이러스 감염(29)결과 일어나는 비-특이성 세포독성 효과를 없애기 위해, 연구동안 "효과없는" 이소게닉 아데노바이러스(AdCO1)를 대조구 바이러스로 이용한다. 이는 재조합 아데노바이러스가 감염(30)을 위해 종양 생장 및 맥관형성(31)과 다소 관련된 세포 표면 수용체인, aVb3 인테그린을 이용하기 때문에 중요한 대조구이다.

AdmATF의 종양내 1회 주사는 종양 생장을 감소시키고(도 3) 공격성 LLC-C5BL/6 동유전자형 쥐 모델에서 폐로 전이되는 것을 지연시키는데 효과적이다. 쥐 ATF는 종양 세포의 침습을 억제함으로써 겉보기에 부분적으로 효과를 나타내고(도 2B), 이 결과는 AdmATF 감염 후의 세포-결합 단백질분해의 억제와 일치한다(도 2A). ATF-기본 길항제도 내피세포 운동성(22,23)의 유력한 억제제이고, 이는 종양 길항제의 억제도 이 모델에서 관찰된 효과에 기여할 수 있음을 암시한다. 실제로, AdmATF가 주사된 LLC 종양은 AdCO1-감염된 대조구 종양에 비해 거의 혈관형성을 나타내지 않는다(도 4). 이러한 특이 AdmATF-매개 종양 생장 억제는 감염 후 후기 시간에서 분명하지만 초기 시간에는 신혈관 형성동안 생장 영양분을 제공하기 위해 보다 작은 종양(전형적으로 300 mm³이하, 도 3 및 도 5 참조)에 대한 필요성이 줄어든 결과로 인해 억제가 그렇게 크지 않다(24 참조).

AdmATF-처리된 그룹의 생존율이 AdCO1-처리된 그룹(25일 이하)과 비교해 다지 약간 확장(종양 이식 후 30일 이하)될 때 폐로의 LLC 세포 전이의 억제는 단지 일시적이다. 종양 세포 전이에 대한 AdmATF 주사 효과는 종양 세포가 AdmATF 감염 후 동결되고/동결되거나, 혈관계로 진입하는데 이용되는 혈관이 거의 존재하지 않기 때문인 것으로 설명되어질 수 있다. 이러한 전이는 결국 약간의 종양 세포가 AdmATF 주사 시점에서 혈관계에 이미 이를 수 있다는 암시하에 일어난다. 달리, E1-제거된 아데노바이러스 감염도 전형적으로는 트랜스유전자 산물(29)에 대해 면역내성인 C57BL/6마우스에서 감염된 세포의 빠른 제거와 관련되며, ATF는 생체내에서 매우 짧은 반감기를 나타내는 소분자이다.

임상 전 데이터는 uPA/uPAR 복합체가 중요하게는 내피세포의 것을 포함한, 세포 이동 조절과 관련됨을 지적하고 있다. 예를 들어, 연장된 생체내 반감기를 지닌 ATF-IgG 융합 단백질은 bFGF-풍부한 Matrigerl 쥐 모델(23)에서 맥관형성 및 종양 생장을 억제함을 보여준다. 본 연구는 uPA/uPAR 길항제의 항종양 효과가 본질적으로는 종양내 및 주변 맥관형성을 조절하여 수행되지만, AdmATF-매개 유전자 전달의 항종양 효과는 종양 및 내피세포 모두가 동유전자형 종양 모델에서 잠재적 표적일 때, 다계승적일 수 있고, 이는 mATF가 MDA-MB-231(32)을 포함해, 인간 세포의 표면에서 uPA/uPAR 복합체 형성의 약한 길항제이기 때문에 MDA-MB-231/무흉선 쥐 모델에서의 경우가 아님을 증명해준다. MDA-MB-231 모델에서 나타난 뚜렷한 특성은 종양 생장(도 5) 및 종양내 및 부근에서 신혈관 형성을 억제하는 AdmATF의 효능이다. 반면, 대조구 아데노바이러스로 감염된 종양은 이웃한 용기를 "유인"할 수 있다. AdmATF의 항종양 특성은 이 모델에서 감염 후 종양 생성의 감소된 효능에 의해 추가로 설명된다.

악성 종양은 종양을 퇴치하는데 맥관형성을 표적화하는 중요한 멀리 떨어진 부위에서 중요 기관의 기능을 침범 및 제거하기 때문에 생명-위협적이다(33; 34 참조), 우선, 1차 종양의 생장은 필요한 영양분을 제공하는 신혈관 형성에 좌우된다. 둘째, 전이는 신혈관 형성없이 아폽토시스를 겪는 것으로 보고되고 있다(35). 또한, 종양내부에서 자라는 모세관은 "리키"하고; 혈관계(37)중으로 종양 세포의 효과적인 침투에 선행조건인, 단편화된 기저막(36)을 나타낸다. 이러한 연구를 종합한 결과는 중요한 종양 효과가 세포 표면에서 uPA/uPAR 기능의 유력한 길항제를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 1차 종양내 투여 후에 달성될 수 있고, 이들 효과는 대부분 맥관형성의 억제로 인한 것임을 보여준다. 이러한 접근법을 침습 고형 종양에 적용함은 암 유전자 치료에 특히 효과적인데 이는 다발성 임상 효과가 종양 맥관형성의 억제 후에 기대되기 때문이다.

실시예 2: 생체내 종양을 억제하는 안지오스타틴을 이용한 유전자 치료

실시예 2는 인간 플라스미노겐(안지오스타틴 K3)의 아미노 말단 단편의 발현이 유사분열 차단과 관련된 내피세포 증식을 막아 생체내 종양 생장을 억제함을 입증한다. 인간 플라스미노겐(안지오스타틴 K3)의 N-말단 단편의 국부 전달에 이은 항종양 효과는 두 이종이식 쥐 모델에서 연구되어왔다. 안지오스타틴 전달은 CMV 프로모터로부터 분비성 안지오스타틴 K3 분자(AdK3)를 발현하는 결손 아데노바이러스에 의해 달성된다. 시험관내 연구에서, AdK3는 내피세포 증식을 선택적으로 억제하고, M기-촉진 인자에 의해 유도된 G2/M 전이를 파괴한다. AdK-감염된 내피세포는 M기 인단백질의 하류조절과 상관된 표시된 유사분열 차단을 보여준다. 종양 생장의 상당한 차단 이후 무흉선 마우스에서 자란 미리-정착된 래트 C6 신경교종 또는 인간 MDA-MB-231 유방암으로 AdK3를 종양내 1회 주사하며, 이는 종양내 및 부근에서 신혈관 형성의 억제와 관련된다. AdK3 요법도 대조구 아데노바이러스와 비교해 아폽토틱 종양 세포를 10배 증가시킨다. 데이터는 항-맥관형성 단백질의 거환 주사가 미해결된 약리학적 문제를 여전히 나타내기 때문에 표적화된 항-맥관형성이 아데노바이러스-매개 유전자 전달을 이용하여, 항-맥관형성 인자를 전달시키는 유망한 방법을 나타낸다는 사실을 지지한다.

방법

AdK3의 작제. AdK3는 CMV 프로모터로부터 인간 플라스미노겐의 N-말단 단편(잔기 333까지)을 발현시키는 E1-결손 재조합 아데노바이러스이다. 플라스미드 PG5NM1 19로부터 인간 Plg cDNA를 얻는다. 성숙 Plg의 최초 326 잔기 앞의, Plg의 18 aa 시그널 펩티드를 암호화하는 단편을 플라스미드 pXL2675의 BamHI과 ScaI 부위 사이에 우선 아클로닝한다. 종결 코돈 앞의 잔기 327-333을 암호화하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드를 CMV 프로모터와 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널 사이의 포함물 앞에 첨가한다. 이러한 발현 카세트를 플라스미드 pCO5의 EcoRV와 BamHI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pCO5-K3를 생성한다. pCO5-K3와 ClaI-제한된 AdRSVβgal DNA[25] 사이의 상동 재조합에 의해 AdK3를 293 세포에서 작제한다. 개개 플라크를 293-유도된 세포 단층상으로 분리해내고, 새로운 293 세포상으로 증폭시켜 [25]에 기재된 바와같이 바이러스 스톡을 제조한다. AdCO1은 발현 카세트를 운반하는 것을 제외하고는 AdK3와 일치하는 대조구 바이러스이다.

세포주 유지 및 감염. C6 신경교종 세포(ATCC CCL-107) 및 MDA-MB 231 세포(ATCC HTB 26)를 10% 태 송아지 혈청(FCS)을 지닌 DMEM에서 배양한다. 5% FCS로 바이러스 감염을 수행한다. 인간 미세모세관 내피세포(HMEC-1)[49]를 20% FCS, 1 mM L-글루타민, 1 ㎍/㎖ 하이드로코르티손, 10 ng/㎖ 내피세포 생장 인자로 보충된 MCDB 131에서 배양한 다음 10% FCS 및 3 ng/㎖의 재조합 인간 b-FGF를 지닌 것을 제외하고는 동일한 배지에서 감염을 수행한다(R ＆ D 시스템). 바이러스 AdRSVβGal로 감염시킨 후 X-GAL 염색으로 판단시 감염 중복도(MOI)가 80%-100% 감염 세포 사이에서 얻어지도록 선택한다.

웨스턴 블롯 분석. 비유착성 세포를 300 플라크-형성 단위(PFU)/세포의 MOI로 AdK3 또는 AdCO1로 감염시킨다. 세포 배양물 상등액을 감염 후(p.i.)48 내지 96시간 째에 모은다. K3 안지오스타틴 분자의 생체내 면역 분석을 위해, 종양을 감염후 10일째에 모아, 액체 질소에서 얼린다음, 분말화시키고, 용해 완충액(10 mM NEM, 1% 트리톤 100배, 1 mM PMSF, 0.1 M NH₄OH)으로 추출한 다음 4℃에서 12000 rpm으로 원심분리한다. 니트로셀룰로스 막(Schleicher ＆ Schuell)으로 옮기기 전에, 300 ㎍ 단백질을 지닌 샘플을 1% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 흘린다. 100 ng의 인간 Plg(Stago)를 대조구로 흘린다. 블로킹 완충액(TBS-5% 우유-0.05% Tween 20)에서 2시간 동안 배양한 후, 막을 항-인간 Plg MAb A1D12[50]으로 1시간, 홀스래디쉬 퍼록시다제-결합된 염소 항-마우스 혈청(Biosys)으로 1시간 동안 배양한다. 세척 후, 막을 ECL 생물형광 키트(Amersham, UK)로 검출한다. MPM-2 포스포에피토프를 검출하기 위해, 추출물을 감염 후 96시간째에 HMEC-1 세포로부터 제조하고 특정 유사분열 MPM-2 MAb(DAKO)로 프로빙한다.

증식 분석. 종양 또는 HMEC-1 세포에 12시간 동안 지시된 MOI로 AdK3 또는 AdCO1를 감염시킨다. 세포를 1 mM EDTA로 모아, PBS로 2회 세척한 다음 재현탁시킨다. 이들을 96-웰 배양 플레이트(5000 세포/웰)로 시이딩하고 72시간 동안 배양한다. 또한, HMEC-1 세포를 AdK3 또는 AdCO1-유도된 C6 신경교종 세포의 40, 20 또는 10% 상등액을 함유하는 MCDB131 배지에서 배양한다. 바이러스-감염된 C6 세포의 상등액을 감염후 96 시간째에 모아, 56℃에서 30분간 가열하여 바이러스를 비활성화시키고, 10배 농축한 다음 PBS로 투석한다. MTS 테트라졸리움 화합물(Promega)을 이용한 세포 증식 분석 키트로 세포를 정량한다.

피브린 매트릭스 모델에서 모세관 튜브의 형성. 이 모델은 600 MOI로 12시간 동안 AdK3 또는 AdCO1으로 감염된 송아지 폐동맥 내피세포(CPAE)(ATCC CCL 209)를 이용하여 Pepper 등의 방법[51]에 따라 고안한다.

완전 혈액 용해 분석. 80 U/㎖ 조직-플라스미노겐 활성제, 감염후 4일 째 AdK3 또는 AdCO1으로 얻어진 250 ㎕ 배양 상등액, 및 건강한 기증자로부터 모아진 500 ㎕ 시트레이트-항-응고된 완전 혈액을 혼합하여 전체 혈액 응고 용해를 수행한다. 트롬빈 1 U/㎖ 및 12 mM Ca⁺⁺를 첨가시켜 응고를 촉진한다. 응고 용해의 정도는 용해 시간 및 [52]에 기재된 바와같이 가용성 D-이합체의 동역학에 따라 결정된다.

면역유동 혈구계산. 300 PFU/세포의 MOI로 HMEC-1을 AdK3 또는 AdCO1으로 96시간 동안 감염시킨다. 세포를 모아, 100배의 트리톤을 투과시킨 다음, [53]에 기재된 바와같이 유사분열 MPM-2 항체로 배양하기 이전에, 실온에서 3시간 동안 아이오다이드 프로피디움(20 ㎍/㎖) 및 리보뉴클레아제 A(100 ㎍/㎖)와 함께 배양한다. FITC-결합된 항-마우스 IgG 항체를 이용하여 MPM-2 포스포에피토프를 검출한다. Coulter EPICS 프로필 II 유동 혈구계산기에서 실험을 수행하고 멀티사이클 소프트웨어로 데이터를 분석한다(캘리포니아 샌디에고의 Phoenix Flow Systems).

무흉선 쥐 모델. 배양된 C6 신경교종 세포 및 MDA-MB-231 세포를 수거, 세척, 각각 1.5 x 10⁷및 0.25 x 10⁷세포/㎖의 PBS로 재현탁한 다음 200 ㎕의 용적을 6-7주간 자란 누드 마우스의 등에 피하 주사한다. 종양이 20 mm³용적에 이르면, 동물에 AdK3(n=6), 또는 AdCO1(n=6) 또는 PBS(n=6) 10⁹PFU를 종양내 주사한다. 종양 크기를 C6 신경교종 모델의 경우 감염 후 10일동안, 및 MDA-MB-231 모델의 경우 감염후 42 일동안 모니터링한다.

종양 정착 및 진행시 AdK3감염의 효과를 평가하기 위해, 누드 마우스의 등(n=6)에 피하 접종하기 이전에, MDA-MB-231 및 C6 세포를 24시간 동안 각각 50 및 100 PFU/세포 MOI로 감염시킨다. 감염된 MDA-MB-231 세포는 감염된 C6 세포보다 발암성이 적어 피하 이식(10⁶MDA-MB-231 또는 0.25 x 10⁶C6 세포)이전에 80 ㎕의 아이스-콜드 Matrigel(Becton Dickinson)을 120 ㎕의 PBS에 첨가할 수 있다. 감염후 25일(MDA-MB-213) 또는 22일(C6)동안 종양을 정착 및 생장시킨다. 스튜던트 t-테스트를 통계 분석에 이용한다.

면역조직화학. 종양 조직을 알콜 포르말린 아세트산에 고정하고, 파라핀에 파묻은 다음 5 ㎛ 부위를 제조한다. 톨루엔 처리 및 재가수분해 후, 부위를 마이크로웨이브 오븐에서 10 mM 시트레이트 완충액(pH 6.0)에서 5분간 3회 전처리하고, 3% H₂O₂로 5분간 중단시켜 내생성 퍼록시다제 활성을 제거하며, PBS로 세척한 다음, 인간 von Willebrand 인자(vWF; Dako, 1:200 희석)에서 자란 토끼 폴리클로날 혈청으로 60분간 배양한다. 3회 세척 후, 부위를 바이오티닐화된 염소 항-토끼 IgG 항체와 30분간 배양하고, 세척한 다음, 3-아미노-9-에틸카바졸의 첨가 이전에 스트렙타비딘-퍼록시다제와 30분간 배양한다. Meyer의 헤마톡실린을 대조염색으로 이용한다. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 dUTP-바이오틴 닉 말단 라벨링법(TUNEL)(Boehringer Mannheim)을 이용하는 키트로 부위내의 아폽토틱 세포를 검출한다. 세포 증식을 위해 세포 핵 항원(PCNA) 염색 과정은 바이오티닐화된 마우스 항-PCNA 항체(Pharmingen, 1:100 희석) 다음에 스트렙타비딘 퍼록시다제 및 기질 출현을 포함한다.

결과

AdK3의 분자 특성. 재조합 AdK3는 안지오스타틴 분자[47]의 최초 세개의 크링글 도메인을 포함하는 인간 Plg의 CMV-유도 N-말단 단편을 운반하는 반면, AdCO1은 발현 카세트를 암호화하지 않는 "이소게닉" 대조구 아데노바이러스이다(도 7A). HMEC-1, C6 및 MDA-MB-231 세포의 경우 Mab A1D12 면역블롯팅에 의해 AdK3로 감염 후 2-3일째에 배양 배지에서 K3 분자의 분비를 입증하지만, AdCO1으로 감염후에는 시그널이 검출되지 않는다(도 7B). 분비된 면역반응성 펩티드는 36 및 38 kDa의 이중 분자량으로 나타나고, 이는 대부분 Plg[54,55]에 기재된 바와같이 Asn289에서 N-글리코실화의 상이한 정도를 반영한다.

AdK3의 기능적 특징규명. AdK3에 의한 HMEC-1의 형질유도는 AdCO1(P<0.005)으로 감염된 세포와는 대조적으로, 50 MOI 30%, 150 MOI 74%, 및 300 MOI 97%에서 감염후 3일째에 용량-의존성 방법으로 bFGF-자극된 증식을 억제한다. AdK3는 MDA-MB-231 및 C6 세포 증식에 영향을 미치지 않는다(도 8A). 이러한 효과를 유발하는 K3 분자의 파라크라인 잠재성을 평가하기 위해, 바이러스-감염된 C6 신경교종 세포로부터 바이러스-유리 배양 배지를 HMEC-1 세포에 첨가한다. 도 8A에서 설명하듯이, 본 출원인은 C6 세포-분비된 안지오스타틴(p<0.001)에 의한 HMEC-1 세포 증식의 용량-의존성 억제를 관찰했다. AdK3의 첨가도 55% 평균 감소와 함께 피브린 겔에서 CPAE 세포의 모세관 형성을 상당히 억제한다(도시되지 않음). 또한, tPA에 의해 유도된 완전 혈액 응고 용해는 AdK3-감염된 C6 세포의 세포 배양 상등액의 첨가로 억제되지 않고, D-이합체의 생성은 최초 3시간(1200 ng/㎖ 대 1150 ng/㎖)동안 근본적으로 변함이 없다.

AdK3는 내피세포의 유사분열을 억제함. 안지오스타틴이 HMEC-1의 유사분열을 억제할 수 있는지 여부를 알아보기 위해, 동시 DNA 염색과 함께, M기 동안 특이적으로 존재하는 포스포릴화된 단백질에 결합하는 MAb MPM-2로 라벨링된 세포를 이용하여 유동 면역혈구계산을 수행한다. 결과는 AdK3-감염된 HMEC-1 세포의 유사분열이 AdCO1 감염에 비해 82% 감소했고; AdCO1 대조구 감염 후의 27%에 비해 G2/M pic내의 단지 5% HMEC-1 세포가 AdK3로 감염된 후 MPM-2의 경우 양성을 보인다(도 8C). HMEC-1 추출물로부터 웨스턴 블롯을 수행하여 최소한 16 유사분열 인단백질이 40 내지 200 kDa 범위 겉보기 분자량을 지닌 MPM-2에 의해 일반적으로 나타날 때 MPM-2 양성 단백질을 검출한다. 비-감염된 또는 AdCO1-감염된 HMEC-1 세포의 대조구 추출물과 비교할 때, AdK3-감염된 세포의 추출물은 뚜렷이 감소된 수준의 MPM2-반응성 인단백질을 나타낸다(도 8B).

AdK3는 종양 생장을 억제함. 안지오스타틴의 국부 분비를 유도하기 위해, AdK3 1회 용량 10⁹PFU를 20 mm³의 미리-정착된 인간 MDA-MB-231 유방암 및 무흉선 마우스에서 자란 래트 C6 신경교종 종양에 주사하고, 종양 생장을 모니터링한다. 도 9A에 도시하듯이, AdK3-주사된 그룹에서 나온 C6 종양은 AdCO1 또는 PBS 대조구 그룹에서 나온 것보다 상당히 작고; 감염후 10일째에, AdK3-주사된 종양은 평균 용적 278±14 mm³에 이르는 반면 AdCO1- 및 PBS-주사된 종양 각각의 경우(p<0.05)는 1403±142 mm³또는 1583±259 mm³에 이른다. 이러한 80% 억제는 안지오스타틴-면역반응성 물질의 검출과 상관 관계가 있다(도 7C). 도 9B에 도시되 있듯이, 종양 생장은 감염후 42일째에: AdK3-처리된 종양의 경우 80±4 mm³이고 AdCO1-의 경우 563±137 mm³및 PBS-주사된 종양의 경우 530±69 mm³(p<0.05)로 MDA-MB-231 종양 모델에서 유사하게 억제된다(85%).

AdK3는 맥관형성을 억제하고 생체내 종양 세포 아폽토시스를 유도함. AdCO1으로 감염된 C6 종양은 AdK3-감염된 대응물보다 좀더 많이 혈관을 형성하는 것으로 나타났다(도 10, 패널 A-B). 종양내 맥관형성을 [28]에 기재된 바와같이 종양 부위의 vWF-면역염색에 의해 분석한다. vWF-양성 핫스팟을 우선 저배율로 국부화하고, vWF-양성 용기를 200배율로 헤아린다(도 10, 패널 E-F). 결과는 AdCO1-주사된 대조구(14±4; n=5, p<0.005)와 비교할 때 AdK3-주사된 종양(5±2 vWF-양성 혈관/필드)내의 종양내 혈관형성의 뚜렷한 감소를 나타낸다. PBS-주사된 그룹에서 종양은 동일한 수의 혈관(14±3)을 나타내는데, 이는 사용된 감염 조건이 종양 맥관형성을 억제하지 않음을 나타낸다. 육안으로 볼때, AdK3로 주사된 C6 종양은 AdCO1-처리된 대응물과 비교해 주변 신혈관 형성을 거의 나타내지 않는다(도 10, 패널 C-D). MDA-MB-231 종양 부위(AdK3의 경우 4.8±1.2 vWF-면역반응성 혈관/필드 대 AdCO1의 경우 15±3, p=0.02)내에서 유사한 결과가 얻어진다.

TUNEL법(방법 참조)에 의해 C6 종양 샘플을 이용하여 종양 세포 아폽토시스를 제자리 정량한다. 결과는 감염후 10일째에 AdK3-주사된 C6 종양에서 아폽토시스 세포의 뚜렷한 증가를 나타낸다(20±9 대 대조구 종양의 경우 1-2 아폽토틱 세포/필드, p<0.01)(도 10, 패널 G-H). 반면, 종양 세포 증식율은 PCNA 면역염색으로 분석시 세가지 동물 그룹 서로간에 상이하지 않다(도시되지 않음). 10배 유도된 Ad-안지오스타틴 요법은 정제된 안지오스타틴의 매일 주사로 얻어진 보고된 결과와 유사한, 이들 세포의 증식에 영향을 미침이 없이 아폽토틱 종양 세포에서 증가한다.

AdK3는 발암성을 억제함. 종양 맥관형성의 억제가 발암성을 억제하는지 여부를 알기 위해, 누드 마우스의 등에 주사하기 전에 MDA-MB-231 및 C6 세포를 우선 24시간 동안 감염시킨다. 5일 후, AdCO1-감염된 그룹의 모든 마우스는 평균 27.4±3.41 mm³의 크기를 지닌 과혈관형성된 C6 종양을 발전시키는 반면, AdK3-감염된 그룹의 20% 동물은 12일 후 종양이 존재하지 않는다(도 11). 남은 동물은 거의 혈관형성되지 않는 매우 작은 종양(평균 크기 0.42±0.05 mm³)을 나타낸다. 22일 후, AdK3 그룹내에서 관찰된 종양은 AdCO1 그룹(n=5, p<0.005; 도 11)보다 적어도 5배 더 작다. MDA-MB-231 종양 모델을 이용하여 유사한 관찰을 행한다(도시되지 않음).

토의

안지오스타틴은 전이를 잠재적인 상태로 만드는, 1차 종양에 의해 분비된 맥관형성의 생리 병리학적 억제제인 것으로 여겨져 왔다. 따라서 1차 종양에서 안지오스타틴의 치료 잠재성을 평가하고자 한다. 그러나, 안지오스타틴은 혈액순환[46]시 빠르게 제거되기 때문에 인간 안지오스타틴의 전신 및 복강내 거환 주사는 어려운 약리학적 문제를 예고해 왔다. 안지오스타틴의 세포증식억제성 종양내 농도를 유지하는데는 실제로 고 용량의 정제된 안지오스타틴의 장기 노출을 필요로 한다[46]. 안지오스타틴 cDNA를 암호화하는 재조합 바이러스를 이용한 종양 및 주변 조직의 형질유도는 안지오스타틴의 일정한 종양내 농도를 달성하는데 좀더 효과적인 방법을 나타내는지는 불명확하다. 아데노바이러스가 이러한 방법에 적당한데 이는 이들이 안지오스타틴 생성을 위해 광범위한 영역을 표적화하는, 증식 및 비-증식 세포([37]참조) 모두에서 치료 수준으로 트랜스유전자를 효과적으로 발현시키기 때문이다. 따라서, 예비활성 펩티드 및 크링글 1-3(AdK3)를 포함한, 인간 Plg로부터 N-말단 단편(aa 1-333)을 발현시키는 결손 아데노바이러스를 작제한다.

인간 Plg[50]에 특이적인 Mab A1D12의 사용은 우선 AdK3로 감염된 세포의 배양 배지에서 안지오스타틴의 효과적인 분비를 입증한다. 안지오스타틴 분자에서 N-말단 예비-활성 펩티드의 포함은 항-맥관형성 활성에 영향을 미치지 못하는데 이는 AdCO1-이 아닌 AdK3-감염된 내피세포가 시험관내 증식에서 뚜렷한, 용량-의존성 차단을 보인다(도 8A). 또한, MDA-MB-231 또는 C6 종양 세포의 증식은 내피세포의 안지오스타틴의 제한 활성을 입증하는 AdK3-감염에 의해 영향을 받지 않는다. AdK3-감염된 종양 세포 배양액에서 바이러스-유리 상등액도 내피세포 증식을 억제하는데, 이는 형질유도된-종양세포에서 분비된 안지오스타틴의 파라크라인 효과를 설명한다.

크링글 도메인은 피브린에 결합된 Plg 및 피브린 파괴에 중요하기 때문에, 혈전용해, 생체내 혈전증에 대한 생리학적 보호에서 이러한 치료 효과를 분석하는데 필수적이다. 배양 배지에서 분비된 안지오스타틴은 시험관내에서 tPA-유도된 완전 혈액 응고 용해를 억제하지 못한다. 이 실험이 생체내 혈전용해동안 피브린에 결합하는 안지오스타틴과 Plg간의 해로운 경쟁을 배제하지는 못하지만, 이는 맥관형성 효과가 생체내 플라스미노겐-의존성 혈전용해를 없애는데 필요한 것 이하의 농도에서 달성될 수 있음을 나타낸다. 이는 또한 내피세포가 안지오스타틴을 인식하고 Plg를 파괴하지 못하는 수용체를 나타냄을 암시하고 있다.

AdK3로 감염된 내피세포의 유동 혈구계산 분석은 MPM-2 MAB[56]의 경우 유사분열 집단 양성의 완전한 소실을 입증한다. 면역블롯 분석은 대조구 내피세포와는 대조적으로, MPM-2 MAb에 반응성인 M기 인단백질이 실제로는 안지오스타틴-처리된 내피세포에서 하류조절됨을 나타낸다. 이러한 관찰은 안지오스타틴이 내피세포의 증식을 파괴하는 메카니즘을 정의하는데 도움이 된다.

본 발명자는 안지오스타틴이 cdc2 및 이의 결합된 조절 아단위인 사이클린 B로 이루어진 M기 촉진 인자(MPF)(57)에 의해 유도된 G2/M 전이를 붕괴시킴을 발견하였다. MPM-2 MAb와 반응성을 띠는 MPF 포스포릴화 단백질은 세포 구조의 주요 변형 및 유사분열로의 효율적인 진행을 위한 활성에 관여된다. 활성 MPF가 AdK3-형질도입된 내피세포에 부족한 이유는 좀더 연구되어야 할 과제이다.

AdCO1이 아닌 AdK3의 1회 종양내 주사는 두 가지 미리 설정된 이종이식 쥐 모델에서 1차 종양 생장을 현저히 억제하는 것으로 나타났다. 종양 생장에 대한 이러한 억제 효과는 종양 추출물내 안지오스타틴-면역반응성 물질의 검출과 함께(도 7c), 종양내 및 이의 근처에서(도 10) 현저히 감소된 혈관신생과 밀접하게 상관관계가 있다. C6 교종은 VEGF 과발현으로 인하여 고도로 혈관신생된 종양이다(58). 흥미롭게도, AdK3-형질도입된 C6 교종은 신속하고 광범위한 생장을 지원하기 위해 종양 매스내에 혈관 네트워크를 확립하는 데 명백히 실패하였고(도 10), 이러한 실패는 종양 생장의 80% 이상 억제로 해석되었다. 종양 절편의 vWF 면역염색은 또한 AdK3-처리 종양내 혈관신생의 현저한 감소를 나타내었고; 성숙한 관강을 갖는 잘 형성된 혈관이 대조구 C6 종양에서는 빈번하게 관찰되었으나, AdK3-처리 C6 교종에서는 관찰되지 않았다(도 10). 혈관밀도의 이러한 감소는 종양 세포 아폽토시스에 있어 10배 증가와 관련되어 있으며 종양 세포 증식 지표에는 어떠한 명백한 변형도 없으며, 아마도 (i)내피-유도된 파라크라인 인자의 결핍, (ii)영양소 지지물의 감소, 및 (iii)종양 세포의 저산소증 트리거링된 p53-의존형 아폽토시스 때문인 듯 하다(59,60). MDA-MB-231 유방암 모델에서, AdK3의 1회 종양내 주사도 이와 유사하게 종양 맥관형성 및 생장의 현저한 억제를 유도하였다.

이러한 연구 과정에서, AdK3-형질도입된 C6 및 MDA-MB-231 세포는 AdK3-감염세포가 이식 후 가시적인 종양으로 발전하는 것을 장기간 지연시킴으로써 반영되는 바와 같이 낮은 종양발생 가능성을 보인다.

재조합 아데노바이러스를 사용하는 지혈요법은 실험적으로 가능하고 효율적인 것으로 나타났다. 하나 이상의 지혈인자를 전달할 확률 또한 종양 생장 저지에 상승작용한다. 또한, 세포독 접근법과의 연계가 악성 질환의 임상적 결과를 개선하는 데 특히 효능이 있을 것으로 구상된다.

참조문헌

본 발명의 배경과 실시예에서 특정 숫자로 인용된 하기 참조 인용문헌은 전부 참조로 본원에 인용된다.

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핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 설명을 위해 제공됨을 숙지하여야 한다.

다양한 간행물이 본원에서 인용되는 데 이들의 기재내용은 전부 본원에서 참조로 인용된다.

Claims (30)

1. 종양 세포내 항-맥관형성 인자의 발현을 제공하는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 결손 아데노바이러스 벡터를 종양 중으로 도입시키는 단계를 포함하는, 종양 생장 억제방법.
2. 제 1 항에 있어서, 종양이 폐암 또는 유방암인 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 항-맥관형성 인자가 EGF-유사 도메인을 지니는 우로키나제의 아미노 말단 단편의 서열을 포함하고, 단 인자가 우로키나제가 아닌 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 항-맥관형성 인자가 약 아미노산 잔기 1번부터 약 잔기 135번까지의 우로키나제의 아미노산 서열을 갖는 우로키나제의 아미노 말단 단편인 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 우로키나제가 쥐 우로키나제인 방법.
6. 제 4 항에 있어서, 우로키나제가 인간 우로키나제인 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 항-맥관형성 인자가 안지오스타틴인 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 안지오스타틴이 크링글 1 내지 3을 포함하는 방법.
9. 제 7 항에 있어서, 안지오스타틴이 약 아미노산 잔기 1번부터 약 잔기 333번까지의 플라스미노겐(Plg)의 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐의 아미노 말단 단편인 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 플라스미노겐이 인간 플라스미노겐인 방법.
11. EGF-유사 도메인을 지니는 우로키나제의 아미노 말단 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 종양 중으로 도입하는 단계를 포함하고, 단 유전자가 우로키나제를 암호화하지 않으며, 유전자가 종양 세포내 유전자의 발현을 제공하는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합되는, 종양의 생장 또는 전이, 또는 이들 모두의 억제방법.
12. 제 11 항에 있어서, 우로키나제의 아미노 말단 단편이 약 아미노산 잔기 1번부터 약 잔기 135번까지의 우로키나제의 아미노산 서열을 갖는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 우로키나제가 쥐 우로키나제인 방법.
14. 제 12 항에 있어서, 우로키나제가 인간 우로키나제인 방법.
15. 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 결손 아데노바이러스 벡터.
16. 제 15 항에 있어서, 항-맥관형성 인자가 EGF-유사 도메인을 지니는 우로키나제의 아미노 말단 단편의 핵산 서열을 포함하고, 단 인자가 우로키나제가 아닌 바이러스 벡터.
17. EGF-유사 도메인을 지니는 우로키나제의 아미노 말단 단편을 암호화하는 유전자를 포함하고, 단 유전자가 우로키나제를 암호화하지 않는 결손 아데노바이러스 벡터.
18. 제 17 항에 있어서, 우로키나제의 아미노 말단 단편이 아미노산 잔기 1번부터 약 잔기 135번까지의 우로키나제의 아미노산 서열을 갖는 바이러스 벡터.
19. 제 18 항에 있어서, 우로키나제가 쥐 우로키나제인 바이러스 벡터.
20. 제 18 항에 있어서, 우로키나제가 인간 우로키나제인 바이러스 벡터.
21. 제 15 항에 있어서, 항-맥관형성 인자가 안지오스타틴인 바이러스 벡터.
22. 제 21 항에 있어서, 안지오스타틴이 크링글 1 내지 3을 포함하는 바이러스 벡터.
23. 제 21 항에 있어서, 안지오스타틴이 아미노산 잔기 1번부터 약 잔기 333번까지의 플라스미노겐의 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐의 아미노 말단 단편의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
24. 제 23 항에 있어서, 플라스미노겐이 인간 플라스미노겐인 바이러스 벡터.
25. 제 15 항 내지 24 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
26. 종양 생장 억제용 약제의 제조에 있어서 제 15 항 내지 24 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터의 용도.
27. 종양의 생장, 또는 전이 또는 이들 모두의 억제용 약제의 제조에 있어서 제 16 항 내지 20 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터의 용도.
28. 종양 생장 억제 및 아폽토시스 유도용 약제의 제조에 있어서 제 21 항 내지 24 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터의 용도.
29. 종양의 생장 또는 전이, 또는 이들 모두의 억제용 약제의 제조에 있어서, 항-맥관형성 인자의 발현을 제공하는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된, EGF-유사 영역을 지니는 우로키나제의 아미노 말단 단편을 암호화하는 유전자를 포함하고, 단 유전자가 우로키나제를 암호화하지 않는 벡터의 용도.
30. 제 26 항 내지 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 폐암 또는 유방암인 용도.