KR20010012096A

KR20010012096A - 스트렙토콕커스 뉴모니애로부터의 사람 보체 ｃ3-분해 프로테이나아제

Info

Publication number: KR20010012096A
Application number: KR1019997009773A
Authority: KR
Inventors: 마가렛 케이. 호스테터; 게리 던니; 락시미 에스. 난디와다
Original assignee: 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타
Priority date: 1997-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2001-02-15
Also published as: AU7156698A; KR100544594B1; WO1998048022A1; CA2283755A1; EP0977872A1; BR9809405A; WO1998048022A9; JP2001523960A; AU740153B2; CN1253589A

Abstract

본 발명은 S.뉴모니애로부터 발현된 사람 보체 C3 분해 프로테이나아제 부류를 확인하는 방법 및 용도에 관한 것이다. 프로테이나아제의 분자량은 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 약 24kD 내지 약 34kD으로 측정되었다. 본 발명의 바람직한 프로테이나아제는 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함한다.

Description

스트렙토콕커스 뉴모니애로부터의 사람 보체 Ｃ3-분해 프로테이나아제 {HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE}

본 출원은 "스트렙토콕커스 뉴모니애로부터의 사람 보체 C3-분해 프로테이나아제"라는 명칭으로 1997년 4월 27일 출원된 출원(일련 번호 제 60/044,316호)의 이점을 청구하고 있다.

박테리아 스트렙토콕커스 뉴모니애(S. pneumoniae)로 인한 호흡 감염은 년간 500,000건의 폐렴 및 47,000의 사망을 초래하는 것으로 추정된다. 균혈성 폐렴구균 감염에 대해 가장 높은 감염율을 갖는 사람은 두 살 미만의 유아나 노인들이다. 이러한 집단에 있어서, S.뉴모니애는 박테리아성 폐렴 및 뇌막염을 초래할 수 있는 원인이 된다. 유아 및 노인 둘 모두는 박테리아 콜로니화, 국부 또는 전신 감염, 또는 정제된 폴리사카라이드로의 백신화 후 폐렴구균 캡슐 폴리사카라이드에 대한 보호 항체의 합성이 결여되어 있다. S. 뉴모니애는 HIV 감염에 걸린 성인 및 어린이 둘 모두에 침해하는 박테리아 호흡 질환을 초래하는 원인이다[참조: Connor et al. Current Topics in AIDS 1987; 1:185-209 and Janoff et al. Ann. Intern. Med. 1992;117(4):314-324.]

심한 감염에 대해 가장 위험성이 있는 것으로 증명된 개인은 현 캡슐 폴리사카라이드 백신에 대한 항체를 만들 수 없다. 그 결과, 임상적 시도에서 네가지의 컨쥬게이트 백신이 존재하게 된다. 콘쥬게이트 백신은 항체 반응을 증가시키려는 시도에서 단백질 담체 또는 보조제에 커플링된 폐렴구균 캡슐 폴리사카라이드로 구성된다. 그러나, 임상적인 시도에서 일반적으로 콘쥬게이트 백신에 대한 다른 잠재적인 문제점이 존재한다. 예를 들어, 미국에서 가장 널리 보급된 폐렴구균성 혈청형은 이스라엘, 서유럽 또는 스칸디나비아와 같은 곳에서 가장 보편적인 혈청형과는 상이하다. 따라서, 한 지리적 공간에서 유용할 수 있는 백신은 다른 곳에서는 유용할 수 없다. 현재 구입가능한 캡슐 폴리사카라이드 백신을 변형시키거나, 지리적 혈청형 변이성을 적합하게 하기 위한 캡슐 백신에 대해 단백질 콘쥬게이트를 개발하기 위한 잠재적 필요성은 방해되는 재정적 및 기술적 복잡화를 수반한다. 따라서, 다양한 악성 혈청형중 세계적으로 유지되는 면역원성 표면 노출된 단백질에 대한 연구가 폐렴구균 감염의 예방 및 광범위하게 보호되는 폐렴구균 백신의 제형에 가장 중요하다. 게다가, 세계적으로 보면 페니실린 및 세팔로스포린 내성 폐렴구균으로 인해 더욱 급박하게 효과적인 백신을 필요로 하게 되었다[참조: Baquero et al.J.Antimicrob. Chemother. 1991;28S;31-8].

수개의 폐렴구균 단백질은 폐렴구균 캡슐 폴리사카라이드에 대한 콘쥬게이션되기 위한 것으로 제안되거나, S. 뉴모니애에 대한 면역성을 자극하기 위한 단일 면역원으로서 제안되었다. 호흡관의 상피 세포에 대한 S. 뉴모니애의 부착에 관련된 것으로 보고된 표면 단백질은 PsaA, PspC/CBP112 및 IgA1 프로테이나아제를 포함한다[참조: Sampson et al. Infect. Immun. 1994;62:319-324, Sheffield et al. Microb. Pathogen. 1992;13:261-9, and Wani, et al. Infect. Immun. 1996;64:3967-3974.] 이러한 부착에 대한 항체는 호흡 상피 세포로 폐렴구균의 결합을 억제하여, 콜로니화를 감소시킬 수 있다. 뉴몰리신(pneumolysin), 오토리신(autolysin), 뉴라미니다아제(neuraminidase) 또는 히아룰로니다아제와 같은 다른 시토졸 페렴구균 단백질은 백신 항원으로서 제안되는데, 그 이유는 항체가 S.뉴모니애로 감염된 환자에서 이러한 단백질의 독성 효과를 잠재적으로 차단할 수 있다. 그러나, 이러한 단백질은 전형적으로 S.뉴모니애의 표면에 위치하지 않으며, 이들은 세포가 용해 및 괴사되는 경우, 박테리아로부터 분비되거나 방출된다[참조: Lee et al. Vaccine 1994; 12:875-8 and Berry et al. Infect. Immun. 1994;62:1101-1108.]. 면역원으로서 이러한 시토졸 단백질의 사용이 S. 뉴모니애 감염의 최근의 결과를 개선시킬 수 있는 반면, 이러한 단백질에 대한 항체는 폐렴구균성 치사를 증진시키거나, 초기 또는 그 이후의 폐렴구균성 콜로니화를 예방할 수 없다.

폐렴구균성 백신으로서 시험될 원형 표면 단백질은 폐련구균 표면 단백질 A(PspA)이다. PspA는 70 내지 140kDa의 이종 단백질이다. PspA 구조는 아미노 말단에서 알파 나산형을 포함하며, 일련의 11개의 콜린 결합에서의 말단은 카르복시 말단에서 반복된다. 이것의 구조에 관련된 많은 정보가 유용함에도 불구하고, PspA는 다양한 폐렴구균성 혈청형중 구조적으로 보존되지 않으며, 이것의 기능이 완전히 공지된 것은 아니다[참조: Yother et al. J.Bacteriol. 1992;174:601-9 and Yother J.Bacteriol. 1994;176:2976-2985]. 연구로 동물중의 PspA의 면역원성이 확인되었다[참조: McDaniel et al. Microb. Pathogen. 1994;17;323-337]. PspA의 면역원성에도 불구하고, PspA의 이종성, 네가지 구조적 기(또는 클래이드(clade))에서의 이들의 존재, 및 이것의 비특징화된 기능은 백신 항원으로서 사용되는 이들의 능력을 복잡하게 한다.

유형 특이적 폴리사카라이드 캡슐에 대한 보호 항체를 만들 수 없는 환자에 있어서, 보체 즉, C3의 세번째 요소 및 대안적인 보체의 결합된 단백질은 S.뉴모니애 감염에 대한 숙주 방어의 첫 번째 라인을 구성한다. 보체 단백질은 S.뉴모니애의 견고한 세포 벽을 관통할 수 없기 때문에, 폐렴구균성 표면상으로 증착되는 옵소닌 C3b는 폐렴구균 제거의 주요한 매개체이다. C3b, C3의 옵소닌 활성 단편의 공유적 결합이 식세포 인지 및 섭취를 개시하는 경우, 폐렴구균과 플라즈마 C3와의 상호작용은 폐렴구균 균혈증 동안 발생하는 것으로 공지되어 있다[참조: Johnston et al. J.Exp. Med 1969;129:1275-1290, Hasin HE, J.Immunol. 1972;109:26-31 and Hostetter et al. J.Infect.Dis. 1984;150:653-61]. C3b는 폐렴구균 캡슐 뿐만 아니라 세포 벽상에 증착된다. S.뉴모니애를 제어하기 위한 이러한 방법은 아주 비효과적이다. S.뉴모니애 옵소닌화를 증대시키기 위한 방법은 이러한 유기체에 의해 유도된 질환 진행을 호전시킬 수 있다. 일반적으로, S.뉴모니애 감염을 제한하기 위한 방법 및 요법이 강하게 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 S.뉴모니애에 의해 발현된 사람 보체 C3 분해 프로테이나아제류의 동일물 및 용도에 관한 것이다. 상기 단백질은 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 측정된 바에 따르면 24kD 내지 약 34kD의 분자량을 갖는다. 본 발명은 S.뉴모니애의 상이한 C3 분해 계통으로부터 분리가능한 많은 단백질을 포함한다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 본 발명은 서열 번호:2와 80% 이상이 동일한 서열을 포함하며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 분리된 단백질에 관한 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 단백질은 S. 뉴모니애로부터 분리되거나, 대안적으로 단백질은 재조합 단백질이다. 바람직하게는, 단백질은 사람 보체 단백질 C3과 결합한다. 바람직한 구체예에서, 단백질은 10% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분자량이 약 24kDa 내지 약 34kDa인 것으로 측정되었다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열 번호:2를 포함하는 분리된 단백질이다.

본 발명은 또한 본 발명의 C3 분해 프로테이나아제로부터의 펩티드 및 바람직하게는 서열 번호:2와 80% 이상이 동일한 서열을 포함하며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 분리된 단백질로부터의 15개 이상의 연속적인 아미노산의 펩티드, 더욱 바람직하게는 서열 번호:2로부터의 15개 이상의 연속적인 아미노산의 펩티드에 관한 것이다.

청구항 9의 단백질은 재조합 단백질이다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명은 서열 번호:2로부터의 15개 이상의 연속적인 아미노산의 펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 단백질은 서열 번호:2를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 분자량이 약 24kDa 내지 약 34kDa으로 측정되었다. 또한, 바람직한 단백질은 사람 보체 단백질 C3를 분해한다. 본 발명의 바람직한 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 1 내지 50을 포함하는 단백질 및 도 1A의 핵산 1246 내지 1863을 포함하는 핵산 단편을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명은 사람 보체 단백질 C3를 분해하는 단백질에 관한 것이며, 상기 단백질을 코드화하는 핵산은, 6X SSC, 5X 덴하드트(Denhardt), 0.5% SDS, 및 65℃에서 밤새 혼성화시키고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 약 10분 동안 1회 세척시키고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척시키고, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척시킨 100㎍/ml의 단편화되고 변성화된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에서 서열 번호:1과 혼성화된다.

또한, 본 발명은 서열 번호:2와 서열이 80% 이상 동일하며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 단백질로부터의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 유효량의 면역 시스템 자극 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 면역 시스템 자극 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 단백질은 S.뉴모니애로부터 분리된다. 한 구체예에서, 면역 시스템 자극 조성물은 S.뉴모니애로부터의 하나 이상의 다른 면역 자극 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 추가로 포함한다.

또한, 본 발명은 서열 번호:2와 서열이 80% 이상 동일하며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체이며, 다른 구체예에서는 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 구체예에서 항체는 항체 단편이다. 항체 또는 항체 단편은 마우스, 쥐, 사람 또는 토끼로부터 수득될 수 있다.

또한, 본 발명은 6X SSC, 5X 덴하드트, 0.5% SDS, 및 밤새 65℃에서 혼성화시키고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 약 10분동안 1회 세척하고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척한 후, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척한 100㎍/ml의 단편화되고 변성된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에 서열 번호:1과 혼성화될 수 있는 핵산 단편에 관한 것이다. 한 구체예에서, 핵산 단편은 S.뉴모니애로부터 분리되며, 다른 구체예에서, 핵산 단편은 단백질의 한 부분 이상을 코드화한다. 한 구체예에서, 단백질은 사람 보체 C3를 분해하며, 다른 구체예에서, 핵산 단편은 사람 보체 C3를 분해하지 않는 단백질을 코드화한다.

또 다른 구체예에서, 핵산 단편은 핵산 벡터내에 있으며, 벡터는 단백질의 한 부분 이상을 유도할 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 핵산 단편을 포함하는 세포가 또한, 본 발명에서 고찰된다. 한 구체예에서, 상기 세포는 박테리아이거나 진핵 세포이다.

추가로 본 발명은 핵산 서열 gctcccagtatgcgtactcgtaaggtagagggaagaaaaaaactagctag을 포함하는 분리된 핵산 단편에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하여 S.뉴모니애로에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다: 동물에 치료 유효량의 단백질의 한 부분 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 단백질을 코드화하는 핵산은 6X SSC, 5X 덴하드트, 0.5% SDS, 및 밤새 65℃에서 혼성화시키고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 약 10분동안 1회 세척하고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척한 후, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척한 100㎍/ml의 단편화되고 변성된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에 서열 번호:1과 혼성화시킨 단계; 및 단백질에 대한 면역 반응을 획득하는 단계. 한 구체예에서, 면역 반응은 B 세포 반응이며, 다른 구체예에서, 면역 반응은 T 세포 반응이다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 백신 조성물이다. 바람직하게는, 단백질의 한 부분 이상은 약 15개 이상의 아미노산 길이이며, 또한 바람직하게는, 조성물은 S.뉴모니애로부터의 하나 이상의 다른 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 단백질은 서열 번호:2의 15개 이상의 아미노산을 포함한다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 삽입 변이를 포함하는 박테리아에 관한 것이며, 삽입 변이는 사람 보체 C3를 분해할 수 있는 단백질을 코드화하는 유전자에서 발생한다. 한 구체예에서, 박테리아는 삽입 중복 변이를 포함한다.

본 발명은 추가로 사람 보체 C3에 결합하여 분해할 수 있는, S.뉴모니애로부터의 약 24kDa 내지 약 34kDa의 분리된 부분 및 하기 단계를 포함하여 S.뉴모니애 매개 C3 분해를 억제하는 방법에 관한 것이다: S.뉴모니애 박테리아를 서열 번호:2와 서열이 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질에 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계. 본 발명은 추가로 서열 번호:1의 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 단편 및 서열 번호:1을 포함하는 이중 가닥 DAN 서열에 의해 전사된 RNA 단편에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1A에는 본 발명의 C3 분해 프로테이나아제의 유전자 서열이 기재되어 있으며, 도 1B에는 이의 아미노산 서열이 기재되어 있다.

도 2는 본 발명에 따른 삽입 중복 변이의 도해이다.

도 3은 본 발명의 삽입 중복 변이로부터 삽입물의 제한 분석의 도해이다.

본 발명은 스트렙토콕커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 관한 것이며, 특히 본 발명은 사람 보체 단백질 즉, C3를 분해할 수 있는 S.뉴모니애의 동일물에 관한 것이다.

본 발명은 10% SDS-PAGE 겔상에서 약 29kDa(±5)(서열 번호:1을 기재로 하는 약 27.5kDa의 예견된 크기를 가짐)의 분자량을 갖는 3C 분해 프로테이나아제 및 C3 분해 프로테이나아제를 코드화하는 핵산을 확인하고 분리하는 방법에 관한 것이다. 상기 단백질은 원래 C3가 주입된 SDS-PAGE 겔상의 폐렴구균 용해물의 전기영동에 의해 확인되었다. 여러 혈청형으로부터의 폐렴구균의 지수 증식 배양물이 규정된 C3 절단 단편을 생산하지 않으면서 먼저 β-사슬을 분해한 후, α 사슬을 분해할 수 있다는 것이 관찰되었다[참조: Angel, et al. J.Infect.Dis. 170:600-608,1994]. 절단 없는 이러한 분해 패턴은 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 에라스타아제 부분 및 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)의 시스테인 프로테이나아제와 같은 다른 미생물 생성물과 사실상 상이하다. 본 발명에 따르는 C3 분해 단백질을 코드화하는 유전자 서열(서열 번호:1)은 도 1A에 제공되어 있으며, 단백질의 아미노산 서열(서열 번호:2)은 도 1B에 제공되어 있다.

본원에 사용된 용어 "분해(degrade)"는 단백질을 아미노산, 펩티드 및/또는 폴리펩티드 단편으로 절단할 수 있는 효소에 대한 것이다. 본 발명의 단백질은 폴리아크릴아미드 겔에서 관찰되는 특정 절단 단편을 생성시키지 않으면서 C3를 분해한다.

약 29kDa의 C3 분해 프로테이나아제는 야생형 S.뉴모니애와 비교되는 증가된 C3 분해 활성을 갖는 클론을 확인하므로써 삽입적으로 차단된 폐렴구균 유전자의 라이브러리로부터 분리되었다. C3에 대한 본 발명의 C3 분해 프로테이나아제는, 예를 들어, C3 분해 프로테이나아제가 알부민과 같은 다른 단백질을 대부분 분해하지 않는다는 점에서 적어도 다소 유리하다. 삽입 중복 돌연변이 유발을 수행하고, 증가된 C3 분해 활성을 갖는 클론을 확인하는 전형적인 방법이 실시예 1에 제공되어 있다.

C3 분해 프로테이나아제를 코드화하는 유전자는 4개의 개방형해독틀을 포함하는 영역내에 함유되며, 동종 재조합에 의해 세번째 개방형해독틀의 차단은 C3 분해를 심각하게 손상시킨다. ORF3는 약 726 뉴클레오티드를 포함하며, 번역된 단백질의 서열은 진뱅크(GenBank) 또는 스위스프롯 데이타베이스(SwissProt database)에 등록된 단백질과의 상동물을 사실상 공유하지 않는다.

본 발명의 C3 분해 프로테이나아제를 코드화하는 전길이 유전자는 대장균에서의 발현을 위해 유전자 발현 벡터내로 삽입되었다. 재조합 C3 분해 프로테이나아제를 실시예에서와 같이 분리하였다. 당업자는 도 1에 제공된 바와 같이 제공된 특정 유전자 서열에 있어서, 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있는 발현 벡터가 다양하다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 재조합 단백질을 생성하고 분리하는데 사용될 수 있는 다양한 방법이 당해분야에 공지되어 있으며, 당업자는 또한, 과도한 실험 없이 본 발명의 C3 분해 분석이 실시예에 제공된 발현 시스템 이외의 특정 발현 시스템의 존재 여부를 측정할것이라는 것을 인지할 수 있다. 다양한 분자 및 면역 기법은 삼브룩 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 및 할로(Harlow) 등의 문헌[Antibodies; A Laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring harbor Laboratory Press, 1988]과 같은 기본 기법 교본에서 발견될 수 있다.

본 발명의 C3 분해 단백질을 코드화하는 유전자는 계통 CP1200으로부터의 폐련구균 게놈성 DNA 단편으로 제조된 플라스미드 라이브러리를 사용하여 확인되었다. 플라스미드 라이브러리를 수득하는 다양한 방법이 공지되어 있지만, 바람직한 방법으로서, 플라스미드 라이브러니를 폐렴구균성 계통 CP 1200(D.A. Morrison, University of Illinois, Champagne-Urbana, Illinois로부터 수득되었으며, 문헌[Havarstein LF, et al. Proc. Natl. Acad.Sci.(USA) 1995;92:11140-11144]에 기재되어 있음)으로부터의 Sau 3A 절단된 폐련구균성 게놈성 DNA 단편(0.5-4.0kb)로 구성시켰으며, 통합되는 셔틀 벡터 pVA 891(erm^r, cm^r; 대장균에 대한 복제 오리진을 가짐)의 Bam HI 부위에 삽입시켰다. 이 라이브러리로 일렉트로포레이션(electroporation)을 이용하여 대장균 DHLα MCR 계통을 형질전환시켰다. 총 14000 대장균 형질전환체를 일렉트로포레이션에 의해 수득하였다. 일부 불규칙하게 선택된 대장균 형질전환체의 플라스미드 추출물은 이들 모두가 재조합 플라스미드에 함유되어 있음을 나타냈다.

플라스미드 라이브러리 DNA를 대장균 형질전환체로부터 추출하고, 삽입 돌연변이유발 동종 재조합을 이용하여 CP 1200 어미 폐렴구균 계통을 형질전환시키는데 사용하였다.

폐련구균 계통 CP 1200 세포를 CTM 배지에서 HCl 처리로의 pH 변화를 이용하여 콤피텐트 세포를 제조하였다. 콤피텐트 세포를 필요할 때 까지 적은 분취물중에서 -70℃에서 냉동시켰다. 8천 폐렴구균 형질전환체를 이러한 방법을 이용하여 생성시켰다.

개별적인 폐렴구균 형질전환체를 C3를 분해할 수 있는 이들의 능력을 기준으로 하여 이들의 변형된 표현형 특성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 박테리아 배양물을 약 2 시간 내지 약 4 시간 동안 C3과 함께 인큐베이팅시키고(0.83㎍의 C3/배양물의 ml), 샘플중의 비분해된 C3의 남은 양을 사람 보체 C3에 특이적인 HRP-콘쥬게이트된 염소 폴리클로날 항체를 이용하여 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정하였다. 분석을 표준화시켜, 비분해된 C3를 함유하는 웰은 O.D. 490 = ~1.0이 되게 하였다. 분해된 C3를 함유하는 웰은 항-C3 항체에 결합하는 이들의 저하된 능력으로부터 유도된 감소된 광학 밀도를 갖는다. 변이 및 어미 계통의 광학 밀도는 네거티브 대조군의 광학 밀도와 비교되었다. 네거티브 대조군은 상이한 농도의 C3를 함유하는 배지에서 배양시켰다. C3 분해 활성의 백분율은 샘플 대 대조군의 광학 밀도의 비로서 측정하였다. 어미 계통 CP 1200으로부터의 약 29kDa C3-분해 단백질의 능력과 비교되는 증가된 C3 분해 활성(약 2-2.2배 더 높은 능력)을 갖는 네가지 변이(SN3, SN4, SN5 및 SN6)를 확인하였다. 이러한 발견은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확실하게 되었다.

변이 SN3, SN4, SN5 및 SN6로부터의 총 DAN를 분리하고, 대장균 DH5α MCR로의 일렉트로포레이션을 위해 사용하였다. 폐렴구균 게놈내의 통합된 플라스미드로부터의 플라스미드 DNA의 낮은 절제 비율은 소량의 유리 플라스미드 DNA를 생성시킬 수 있으며, 이러한 DAN는 DAN가 대장균으로 형질전환될 경우 회수될 수 있다. 이는 플라스미드의 추가의 특징화를 허용한다. 폐렴구균으로의 플라스미드의 재형질전환은 원래 변이의 표현형을 입증한다.

천연 C3 분해 단백질 및 변이 SN3, SN4, SN5 및 SN6로부터의 단백질 샘플을 C3와 함께 인큐베이팅시키고, 환원 조건하의 7.5% SDS-PAGE 겔상에서 분리하였다. C3 분해 능력을 C3에 대한 HRP 콘쥬게이트된 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 평가하였다. 변이 SN4 및 변이 SN4-4G를 추가적인 실험에 사용하였다. 변이 SN4-4G를 CP 1200를 SN4로부터 회수한 재조합 플라스미드 pLSN4a로 재형질전환시킨 후, 확인하였다. 변이 SN4 및 변이 SN4-4G 둘 모두는 4시간 인큐베이팅 후에 C3를 거의 완전히 분해하였다. 천연 C3 분해 단백질은 4시간 후 C3를 분해하지만, C3 분해는 변이 SN4 및 변이 SN4-4G를 이용한 비교 가능한 인큐베이션과 비교할 경우 완전하지 않다.

변이 SN4로부터의 단백질을 코드화하는 플라스미드를 추가의 연구를 위해 선택하였다. 플라스미드 pLSN4a(변이 SN4를 코드화함)를 야생형 CP 1200 계통을 재형질전환시키는데 사용하였다. 이는 증가된 C3 분해 능력을 갖는 48 폐렴구균 변이를 유도하였다. 제한 엔도뉴클레아제 Hind Ⅲ로의 절단은 플라스미드 pLSN4a가 약 ~7.8kb이며, 약 ~2.3kb의 삽입물을 포함한다는 것을 입증하였다.

플라스미드 pLSN4a를 서던 혼성화 실험에서 혼성화 프로브로써 사용하여 폐렴구균 변이로부터의 염색체 DNA 샘플에서의 삽입물의 존재를 증명하였다. 상기 결과는 삽입물(pLSN4a) 및 변이 SN3 및 SN4중의 삽입물의 오리진을 또한 갖는 벡터가 염색체 DNA중에 통합된다는 것을 확인시켜 준다. 변이 SN3 및 SN4 둘 모두는 크기가 약 ~2.2kb 및 약 ~5.8kb인 두개의 혼성화 접합 단편으로 구성되어 있다. 이러한 단편은 또한, 이들의 어미 계통 CP1200에 존재한다. 크기가 약 ~4.2kb 및 약 ~3.5kb인 두개의 다른 혼성화 단편이 존재하며, 이러한 두개의 단편은 총 약 ~7.8kb(pLSN4a는 ~7.8kb임)이다. 이러한 두 밴드는 또한 삽입 샘플을 갖는 벡터에도 존재하였다. 삽입물 및 벡터 둘 모두는 EcoR I 부위를 포함하였으며, 재조합 플라스미드를 나타냈다. 분석은 유전자 중복이 SN4 변이 계통에서 발생하여, 증진된 C3 분해 활성이 SN4 변이에서 C3 분해 단백질을 증가시키는데 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.

2338bp 삽입물의 약 1kb의 서열을 주형으로서 전체 pLSN4a를 이용하여 측정하였다. 주형으로서 단지 삽입물(PCR 생성물)을 갖는 나머지 서열(약 ~ 1338bp)을 ICBR(University of Florida)에 의해 시퀀싱하였다. 둘 모두의 상보적 가닥을 시퀀싱하였다. 상기 결과는 하기 도식에 제공된 상대적인 위치를 갖는 네개의 개방형해독틀이 존재함을 나타냈다.

상기 ORF의 유도된 아미노산 서열과 시험된 단백질 데이타베이스로부터의 단백질 서열 사이의 현저한 상동성은 발견되지 않았다. 본 발명의 C3 분해 프로테이나아제를 코드화하는 ORF3 핵산 서열은 도 1A에 제공되었으며, 서열 번호:1로 나타내었다. 이러한 C3 분해 프로테이나아제의 아미노산 서열은 도 1B에 제공되어 있으며, 서열 번호:2로 나타내었다.

삽입물에서 네개의 개방형해독틀(세개는 완전하며, 하나는 부분적임)중 ORF3를 이것이 가장 큰 삽입물을 함유하기 때문에 추가의 실험을 위해 선택하였다. ORF3(PCR 생성물) 영역의 620bp 내부(도 1A의 핵산 1246 내지 핵산 1863)를 플라스미드 pVA 891의 Hind Ⅲ 부위와 결찰시키고, 구성물을 CP 1200 콤피텐트 세포로 형질전환시켜 프로테이나아제 활성을 약화시켰다. 형질전환체를 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 SDS-PAGE 겔상에서 분리한 후, C3를 분해하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. ORF3 붕괴 변이는 이들의 어미 계통 CP 1200과 비교하여 빈약한 능력을 갖고 있다.

전체의 ORF3 유전자(PCR 생성물)를 pet-28b(+)의 Nde I 및 Bam H I 부위로 클로닝하였다. 벡터는 단백질의 N-말단에서 His-태그에 위치한다. 안정화를 위해 플라스미드 구성물은 대장균(DHLαMCR) 계통으로 형질전환된 후, 단백질 발현을 위해 대장균(BL 21 DE3) 프로테이나아제 부족 계통으로 형질전환되었다.

구성물(ORF3를 갖는 pet 28b(+))을 포함하는 BL 21 DE3 계통을 ORF3 단백질 발현을 위해 유도하였다. 야기되고 비야기된 배양물의 총 세포 단백질 추출물을 C3 분해 능력에 대해 시험하였다. 불용성 단백질 분획으로부터 유도된 샘플중의 발현된 His-태그된 ORF3 단백질은 10% SDS-PAGE 겔상에서 약 ~29 kDa(±5kDa)이었다.

유도된 BL21 DE3 배양물로부터의 ORF3 단백질의 용해화를 하기 성분을 갖는 샘플로 처리하므로써 수행하였다: a) TES(50mM, 1mM, 1M); b) 6mM G-HCl + 1mM DTT; c) 6mM G-HCl + 1mM DTT + 1% 트윈 20; 및 d) 6mM G-HCl +1mM DTT + 1% 트리톤 X-100. "c" 및 "d" 둘 모두의 처리는 가용성 단백질을 유도하였다. "c" 처리는 추가의 단백질 연구에 사용하기 위한 용해가능한 재조합 C3 분해 단백질을 생성시키는데 사용하였다.

구아니딘-HCl 및 DTT를 투석에 의해 발현된 His-태그된 ORF3 단백질 샘플로부터 제거하였다. 상기 단백질을 니켈 칼럼 정제화로 처리하고, 용리된 His-태그된 단백질을 10% SDS-PAGE 겔상에서 시각화하였다.

ORF3에 의해 코드화된 분리된 단백질을 PBS의 존재하에 37℃에서 4 시간 동안 사람 보체 C3와 인큐베이팅하였다. 단백질 샘플 없이 대조군 샘플을 비교 목적을 위해 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 샘플을 환원 조건하에서 SDS-PAGE 겔상에서 진행시키고, 사람 보체 C3에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 C3의 구조를 분석하였다. 결과는 샘플이 ORF3 영역에 의해 코드화되는 단백질을 함유하며, 상기 단백질이 사람 C3 단백질을 분해한다는 것을 나타내었다. C3 분자의 α 및 β 사슬 둘 모두는 분해가능하였다. 이러한 실험에서, α 사슬은 거의 완전하게 분해되며, β 사슬 또한 분해되지만, 다소 적은 정도로 분해된다.

본 발명의 C3 분해 단백질은 CppA 프로테이나아제로서 나타내었으며, 본 발명의 유전자를 cppA로서 나타내었다. 본 발명의 단백질은 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 약 29kDa(±5 kDa)의 명백한 분자량을 가지며, 바람직하게는 약 24kDa 내지 약 34kDa의 분자량을 갖는다. 상기에 설명된 바와 같이, 실시예 5는 프로테이나아제가 S.뉴모니애 계통을 거쳐 보존된다는 것을 나타낸다. 그러나, 당업자는 아미노산 서열에서의 일부 변이성이 예상되며, 이러한 변이성은 본 발명의 범위를 벗어나지 않아야 한다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 예를 들어, 보전된 변이는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며, 약 80% 미만, 바람직하게는 약 90% 미만의 아미노산 서열 동일성에서의 변이가 발생하지 않으며, 여기에서 단백질은 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있으며, 특히 단백질은 S.뉴모니애 박테리아로부터 분리되거나 원래 수득된 것이다.

일부 핵산 서열 변이성은 일부 아미노산 변이성인 계통중에서 예상될 수 있다. 보존된 아미노산 치환은 당해분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 아미노산에 속하는 동일한 부류로부터 다른 요소를 이용하는 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 극성 중성 단백질은 글리신,세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성적으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음성적으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 이러한 대안물은 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 등전점에 의해 측정된 바와 같이 명백한 분자량에 영향을 미치지 않는 것으로 예상된다. 특히 바람직한 보존성 치환체는 Arg에 대한 Lys를 포함하나, 반대로 양전하를 유지하며; Asp에 대한 Glu를 포함하나, 반대로 음전하를 유지하며; Thr에 대한 Ser을 포함하여, 유리 -OH가 유지되며; Asn에 대한 Gln을 포함하여, 유리 NH₂를 유지한다(여기에 제한되는 것은 아님). 본 발명의 바람직한 단백질은 서열 번호:2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 사람 보체 단백질 C3를 분해하며, 6X SSC, 5X 덴하드트, 0.5% SDS, 및 65℃에서 밤새 혼성화되고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 약 10분 동안 세척시키고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척시키고, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 3-5분 이상 1회 이상 세척시킨 100㎍/ml의 단편화되고 변성화된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에서 서열 번호:1과 혼성화되는 단백질을 코드화하는 핵산을 갖는 단백질을 포함하는 그 밖의 단백질이 또한 본 발명에서 고찰된다. 단백질의 폴리펩티드 또는 펩티드단편은 또한 이용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 단백질은 서열 번호:2의 아미노산 1-50을 포함한다.

본 발명의 단백질은 재조합 단백질로서 분리되거나 제조될 수 있다. 이는 단백질을 코드화하는 핵산 또는 단백질의 일부가 발현 벡터내로 통합되거나, 세포의 염색체내로 통합되어 세포내의 단백질을 발현시킬 수 있다. 단백질은 박테리아 또는 다른 세포, 바람직하게는 진핵 세포 및 더욱 바람직하게는 동물 세포로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어, S.뉴모니애 세포로부터 분리될 수 있다. CppA 프로테이나아제의 펩티드는 또한, 본 발명에서 고려된다. 상기 펩티드는 바람직하게는 15개 이상의 아미노산 길이이며, 바람직한 펩티드는 서열 번호:2로부터의 15개 이상의 서열 아미노산을 갖는 펩티드이다. 다른 바람직한 단백질 단편은 서열 번호:2의 아미노산 1-50을 포함한다.

CppA 프로테이나아제를 코드화하는 핵산 또한, 본 발명의 일부이다. 서열 번호:1은 CppA 프로테이나아제를 코드화하는 바람직한 핵산 단편이다. 당업자는 일부 치환이 CppA 프로테이나아제의 특성 또는 성질이 사실상 변화되는 정도로 CppA 프로테이나아제 서열을 변형시키지 않을 것이라는 것을 인지할 수 있을 것이다. 예를 들어, 서열 번호:1과 80% 이상이 동일한 핵산 또한, 본 발명에서 고찰된다. 특정 핵산 서열이 본 발명의 범위내에 있는지의 여부를 측정하기 위한 방법은 특정 핵산 서열이 C3 분해 프로테이나아제를 코드화하는지, 서열 번호:1과 비교하여 80% 이상의 동일한 핵산을 갖는지의 여부를 고찰하는 것이다. CppA 프로테이나아제를 코드화하는 그밖의 핵산 서열은 CppA를 코드화하는 핵산을 포함하며, CppA는 서열 번호:2와 동일하거나 90% 이상이 동일하지만, 이는 핵산 서열에 대한 축퇴를 포함한다. 축퇴 코돈은 세개의 상이한 문자 코돈이 동일한 아미노산을 지정하는데 사용될 수 있다는 것을 뜻한다. 예를 들어, 하기 RNA 코돈(및 따라서, U 대신 T로 치환된 상응하는 DNA 코돈)은 각각 특이적 아미노산을 코드하기 위해 교환적으로 사용될 수 있다는 것은 당해분야에 널리 공지되어 있다:

페닐알라닌(Phe 또는 F) UUU 또는 UUC

류신(Leu 또는 L) UUA, UUG, CUU, CUC, CUA 또는 CUG

이소류신(Ile 또는 I) AUU, AUC 또는 AUA

메티오닌(Met 또는 M) AUG

발린(Val 또는 V) GUU, GUC, GUA, GUG

세린(Ser 또는 S) UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC

프롤린(Pro 또는 P) CCU, CCC, CCA, CCG

트레오닌(Thr 또는 T) ACU, ACC, ACA, ACG

알라닌(Ala 또는 A) GCU, GCG GCA, GCC

티로신(Tyr 또는 Y) UAU 또는 UAC

히스티딘(His 또는 H) CAU 또는 CAC

글루타민(Gln 또는 Q) CAA 또는 CAG

아스파라긴(Asn 또는 N) AAU 또는 AAC

리신(Lys 또는 K) AAA 또는 AAG

아스파르트산(Asp 또는 D) GAU 또는 GAC

글루탐산(Glu 또는 E) GAA 또는 GAG

시스테인(Cys 또는 C) UGU 또는 UGC

아르기닌(Arg 또는 R) CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGC

글리신(Gly 또는 G) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGG

말단 코돈 UAA, UAG 또는 UGA

추가로, 특정 DNA 서열은 특정 세포 유형에 바람직한 코돈을 사용하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 대장균에 대한 바람직한 코돈 사용은 공지되어 있으며, 이는 동물 및 사람에 대해서도 바람직하다. 이러한 변화는 당업자에 공지되어 있으며, 따라서, 이러한 유전자 서열은 본 발명의 일부로서 고찰된다. 다른 핵산 서열은 서열 번호:1로부터의 30개 이상의 핵산을 갖는 단편, 또는 단편이 6X SSC, 5X 덴하드트, 0.5% SDS, 및 65℃에서 밤새 혼성화되고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 약 10분 동안 세척시키고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척시키고, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 3-5분 이상 1회 이상 세척시킨 100㎍/ml의 단편화되고 변성화된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에서 서열 번호:1과 혼성화된 30개 이상의 핵산을 갖는 그밖의 핵산 단편을 포함한다.

본 발명의 핵산 단편은 서열 번호:2의 모두 또는 일부를 코드화하거나, 아무것도(즉, 전사되지 않는 단편, 유전자의 조절 부분 등을 포함하는 단편 등) 코드화시킬 수 없으며, 바람직하게는 서열 번호:2로부터의 9개 이상의 아미노산을 코드화하는 연속적인 핵산 단편을 함유한다. CppA 프로테이나아제의 일부를 코드화하는 핵산 단편이 본 발명에 고찰되기 때문에, 어떠한 핵산 단편 C3 분해 활성을 갖는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코드화할 것이라는 것은 잘 이해될 것이다. 추가로, 본 발명의 핵산은 본 단백질의 C3 분해 활성을 제거하거나 불활성화되도록 변성될 수 있다. 따라서, 상기에 설명된 혼성화 요건을 충족시키는 C3 분해 활성이 없는 단편이 또한 고찰된다. 핵산 서열을 변이시키거나 그렇지 않으면 변형시키는 방법은 당해분야에 널리 설명되어 있으며, 면역원성이며, 효소적으로 불활성한 단백질의 생성물이 치료학적 유용성에 대해 시험될 수 있다. 바람직한 핵산 단편은 gct ccc agt atg(청구항 34)를 포함한다.

본 발명의 핵산 단편은 핵산 벡터내로 통합될 수 있거나, 숙주 게놈으로 안정적으로 통합되어 재조합 키메라 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 생성할 수 있다. 다양한 핵산 벡터는 당해분야에 공지되어 있으며, 시중에서 구입 가능한 많은 발현 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 벡터의 사용은 당해분야의 범위내에 포함된다. 실례적인 벡터는 실시예에 사용되지만, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

본 발명은 또한, S.뉴모니애로부터의 약 29kDa의 단백질, 바람직하게는 약 24kDA 내지 약 34kDa의 단백질에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이며, 단백질은 사람 보체 C3를 분해할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질의 부분 또는 단백질의 모든 부분에 대해 제조될 수 있다. 유사하게는, 모노클로날 항체는 본 발명의 약 29kDa C3 분해 단백질의 모든 단편 또는 펩티드 단편에 대해 제조될 수 있다. 단백질에 대한 항체를 제조하는 방법은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 할로 등(상기 문헌)에 의해 잘 설명되어 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 항체는 사람, 쥐, 마우스 또는 토끼 유도될 수 있다. 단백질 결합 항체 단편 및 키메라 단편 또한, 공지되어있으며, 본 발명의 범위내에 속한다.

본 발명은 또한, 면역 자극 조성물의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "면역 자극" 또는 "면역 시스템 자극"은 하나 이상의 세포 유형의 면역 시스템을 활성화시키는 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 조성물에 관한 것이다. 면역 시스템의 바람직하게 활성화된 세포는 T 세포 및 B 세포 뿐만 아니라 대식 세포와 같은 식세포를 포함한다. 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 면역 자극 조성물은 S.뉴모니애 감염을 연구하기 위한 쥐, 마우스, 토끼, 사람 또는 동물 모델과 같은 동물에서 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 바람직한 면역 자극 조성물은 Cpp 프로테이나아제로부터의 15개 이상의 아미노산을 포함하는, 면역 자극 양의 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 면역 자극 조성물은 PBS 또는 면역 시스템을 자극시키기 위해 숙주에 단백질을 도입시키는데 적합하고 안정적인 것으로 당해분야에 공지된 그 밖의 완충액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액중의 다른 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 면역 자극 조성물은 또한, S.뉴모니애 또는 다른 유기체로부터의 면역 자극 단백질 또는 펩티드, 또는 보조제와 같은 다른 면역 시스템 자극 단백질을 포함한다. 예를 들어, 펩티드 단편의 칵테일은 S.뉴모니애 감염을 조정하는데 매우 유용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 하나 이상의 단백질 단편은 백신 제조에 사용되어, S.뉴모니애 콜로니화 또는 S.뉴모니애 콜로니화의 병원성 결과에 대해 보호하거나 억제한다.

본 발명은 또한, S.뉴모니애 박테리아를 S.뉴모니애로부터의 약 24kDa 내지 약 34kDa의 분리된 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 다른 단백질과 같은 단백질과 접촉시키는 것을 포함하여, S.뉴모니애 매개 C3 분해를 억제하는 방법에 관한 것이다. 약 24kDa 내지 약 34kDa의 분리된 단백질에 결합할 수 있는 단백질은 항체 또는 이들의 단편일 수 있거나, 단백질은 C3 분해 활성을 갖는 S.뉴모니애로부터의 약 24kDa 내지 약 34kDa의 분리된 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체로부터 가변 도메인과 같은 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다.

본 발명의 분리된 S.뉴모니애 단백질은 분리되고 정제될 수 있으며, 분리된 단백질 또는 이것의 면역원성 단편은 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. C3 분해 활성이 없는 단백질의 펩티드 또는 폴리펩티드 단편은 S.뉴모니애 감염의 영향을 제한하는 이들의 능력에 대해 시험될 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 단백질은 예컨데, 단백질의 C3 분해 능력을 차단하거나 불활성화시키는 변이를 통해 변형될 수 있다. 분리된 단백질은 S.뉴모니애에 대한 항체를 검출하는 분석에 사용될 수 있거나, S.뉴모니애 치료에 대한 다가 또는 다중 단백질 또는 펩티드 함유 백신의 일부로서 사용될 수 있다.

본 발명의 단백질은 척추 세포상에서 표면 발현될 수 있으며, 예를 들어, 상보적 증착(또는 활성화)이 문제가 되는 곳, 예컨데, 이종이식부 또는 상보 조절된 사구체 신염부에서 C3를 분해하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 또는 이들의 일부는 이종이식 세포로 통합되거나, 상보적 증착(및/또는 상보적 조절된 염증)을 예방하거나 면역화시키기 위해 표면 단백질 또는 분비된 단백질로서 발현될 수 있다.

본원에 언급된 모든 참조 및 문헌은 특히 본원에 참조 문헌으로서 인용되었다. 본 문헌에서 의도된 본 발명을 성공적으로 수행할 수 있는 당업자에게 유용한 많은 대안적인 방법 및 공정이 있다. 본 발명이 특정 구체예 및 실시예와 함께 상기에 언급되어 있으며, 본 발명은 반드시 제한되는 것이 아니어서, 다수의 다른 구체예, 실시예, 용도, 상기 구체예, 실시예 및 용도로부터의 변형이 본 출원의 발명 범위를 벗어 나지 않으면서 이루어질 수 있다.

실시예 1

삽입 중복 변이의 유도 및 선택된 변이로부터의 재조합 플라스미드의 회수

바람직한 구체예에서, 삽입 중복 면역원을 본 발명의 S.뉴모니애로부터의 C3 분해 단백질을 코드화하는 유전자를 분리하는데 사용하였다. 닥터 모리슨의 실험실(Dr. Morrsion's lab, University of Illinois at Chicago)로부터 원래 수득된 폐렴구균 계통 CP 1200(RX1의 유도체; Morrison, D.A., et al.J.Bacteriol., 156:281-290, 1983)의 0.5-4.0kb 염색체 단편으로 플라스미드 라이브러리를 만들고, 닥터 마르시나(Dr.Marcina, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA)로부터 수득된 Bam HI 셔틀 벡터 pVA 891(erm^r, cm^rMarcina, F.L. et al. Gene 25:145-150, 1983,)에 삽입시켰다. pVA891은 에리스로마이신(erm) 및 클로람페니콜(cm)에 대한 내성 마커를 가지고 있다. 벡터는 대장균에 대한 복제 오리진을 가지지만, 오리진은 연쇄상 구균에서 비복제적이다. 재조합 플라스미드는 상동 재조합에 의해 폐렴구균 염색체 DNA로 통합될 경우에 살아남을 수 있다.

대장균 DH5 α MCR 콤피텐트 세포를 Bio-Rad 실험실 방식(Richmond, CA)에 제공된 공정에 따라 제조하였으며, 라이브러리를 Bio-Rad 유전자 펄스(Bio-Rad Gene Pulser) 장치(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 콤피텐트 세포를 형질전환시켰다.

대장균 세포를 10%의 글리세롤의 존재하에 LB 브로쓰에서 -80℃하의 소량의 분취물중에 냉동 원액으로서 유지시켰다. 상기 세포를 적합한 항체(에리스로마이신 200㎍/ml, 클로람페니콜 15 또는 30㎍/ml 또는 카나마이신 30㎍/ml)를 함유하는 LB 또는 TB 브로써, 또는 LB 아가 플레이트내에서 성장시켰다.

일렉트로포레이션은 1-2kV/cm 전압 및 200Ω의 콘덴서하에 0.1cm 큐벳에서 수행하였다. 클로람페니콜(cm, 30㎍/ml), 에리스로마이신(erm, 300㎍/ml) 또는 erm과 crm의 배합물(200㎍/ml + 15㎍/ml)중 하나를 함유하는 LB 배지상에서 형질전환체를 선택하였다.

총 1400개의 대장균 형질전환체를 라이브러리로부터 수득하였다. 불규칙하게 선택된 대장균 형질전환체의 플라스미드 추출 및 제한 분석은 재조합 플라스미드의 존재를 드러낸다.

플라스미드 또는 재조합 플라스미드를 폴리에틸렌 글리콜 침전 공정(Kreig.P. and Melton.D., in Promega Protocols and Applications p. 106, 1985-86) 또는 변형된 알칼린 용해 미니프렙 프로토콜(Xiang. C., et al., Biotechniques. 17:30-32, 1994), 변형된 알칼린 추출 공정(Birnboim H C and J Doly., Nucl. Acids Res. 7:1513-1523, 1979) 또는 CsCl-에티듐 브로마이드 구배 방법 또는 키아겐 키트(Qiagne kit)(Plasmid midi kit., Chartsworth, CA)에 의해 대장균 계통으로부터 추출하였다. DNA를 함유하는 용액을 진클린 Ⅱ 키트(GeneClean Ⅱ kit)(BIO 101, La Jolla, Ca) 또는 키아겐 키트(겔로부터 DNA 추출., Chartsorth, CA)에 의해 아가로스 겔로부터 직접 세척하였다. DNA를 위자드 DNA 클린 업 키트(Wizard DNA clean up kit)(Promega Corp., Madison, WI)으로 세척하였다. 증포고딘 유전자 생성물을 또한, 위자드 PCR 클린 업 키트(Promega Corp., Madison, WI)로 세척하였다.

플라스미드로 폐렴구균 세포를 형질전환시켰다. 폐렴구균 계통을 항상 10%의 글리세롤의 존재하에 THB에서 -80℃에서 소량의 분취물중에 냉동 원액으로서 유지시켰다. 폐렴구균 세포를 CAT(Morrison, D.A., et al., 1983, 상기 언급된 문헌) 또는 THB 배지(브로스 또는 아가)에서 진탕하지 않으면서 성장시켰다. 형질전환 실험에 있어서는, 완전한 형질전환(CTM) 브로스(Morrison, D.A., et al., 1983) 또는 THB+0.5% 효모 브로스(Yother Janet., et al.J.Bacteriol. 168:1463-1456, 1986)를, ELISA 실험에 있어서는, SMP, 합성 배지(표 1 참조)를 사용하였다. 에리스로마이신(0.05㎍/ml)을 폐렴구균 변이에 대한 선택적인 항체 마커로서 사용하였다.

표 1. SMP-합성 배지

SMP 용액 # 1(최종 용량 2리터):

NaCl 10.0g; NH₄Cl 4.0g; KCl 0.8g; Na₂HPO₄0.24g; MgSO4 0.048g; CaCl₂0.020g; FeSO_4·7H₂O 0.00011g; 트리베이스 9.68g; H₂O를 1리터가 되게 첨가, pH는 7.55, 그 후, 하기 아미노산을 첨가: L-아르기닌 400mg; L-아스파라긴 20mg(모노히드레이트 22.8mg); 글리신 240mg; L-히스티딘 300mg; L-이소류신 13.10mg; L-류신 13.10mg; L-리신 840mg; L-메티오닌 360mg; (소량의 메티 2.6mg); L-발린 11.70mg; 우라실 2mg. 최종 용량이 2리터가 되게 함.

SMP 용액 2(비타민):

바이오틴 0.075mg; 클로린 25mg; 닉틴아미드 3.0mg; ca 판토테네이트 12.0mg; 피리독살 HCl 3.0mg; 리보플라빈 1.5mg; 티아민 3.0mg; L-시스테인 HCl 0.5g; L-글루타민 0.1g; Na 피루베이트 4.0g; 물을 첨가하여 50ml가 되게 함.

재구성 SMP: ml

용액 #1로 시작 100

용액 #2 1

용액 #3(25% 글루코오스) 1.6

용액 #4(4% BSA) 첨가 2

폐렴구균 계통 CP 1200 세포를 CTM 배지에서 "pH 변화에 의한 능력 유도"(닥터 모리슨의 실험실(Univ. of Illinois at Chicago, Ill)로부터 수득된 공정)에 의해 능력을 갖게하고, 콤피텐트 세포를 필요할 때 까지 소량의 분취량에서 -70℃에서 냉동시켰다. 본 공정에서, 125ml의 CTM에 1.20ml의 1M HCl(9mM의 최종 농도) 및 4ml의 O.D.(550nm) 값이 0.2인 냉동된 폐렴구균 원액 세포를 첨가하였다. 이러한 배양물을 37℃에서 인큐베이팅시키고, 배양물의 O.D. 해독을 3시간 인큐베이팅 후 20분 간격으로 수행하였다. 배양물의 O.D.가 0.156(550nm)에 도달할 때 까지, 1.2ml의 1N NaOH를 37℃에서 첨가하였다. 완만하게 배양물을 혼합시킨 후, 1ml의 배양물을 '0' 시간 샘플로서 회수하고, 100㎕의 글리세롤과 혼합시키고, 선냉동된 금속 블롯상에서 유지시켰다. 유사하게는, 10ml의 샘플을 13, 17, 21 및 25분에 각각 채취하고, 각각의 샘플을 선냉동된 1ml의 글리세롤에 직접 첨가하였다. 각각 시간의 샘플을 -70℃에서 소량의 분취물중에 냉동시켰다. 100㎕의 세포에 1㎕의 DNA(약 250ng)를 첨가하고, 37℃에서 25분 동안 형질전환을 위해 인큐베이팅시키므로써 각각 시간의 샘플에 대한 능력을 시험하였다. 형질전환 배양물을 희석시키고, 선택 배지(에리스로마이신 0.05㎍/ml)상에 플레이팅시켰다. 가장 높은 형질전환 효과를 나타낸 시간의 샘플을 추가의 형질전환 시험에 사용하였다. 폐렴구균 계통 CP1200으로의 대장균 형질전환체로부터 추출된 재조합 플라스미드 라이브러리의 형질전환은, 플라스미드가 상동성 재조합을 통해 CP1200 염색체로 삽입된다는 것을 나타내는 약 8,000 폐렴구균 형질전환체를 산출하였다.

폐렴구균 염색체 DNA의 추출을 닥터 도날드 에이. 모리슨(University of Illinois at Chicago)의 실험실에서 이용했던 방법을 약간 변경시켜 수행하였다. 폐렴구균 세포를 THB중에서 550nm O.D.가 0.3-0.4가 되도록 성장시킨 후, 얼음 위에서 신속히 냉각시키고, 0.5M EDTA를 첨가하여, 최종 농도가 10mM이 되게 한 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 10,000g에서 원심분리하고, 펠렛을 1:10 부피로 차가운 STE(50mM 트리스-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0) 및 0.1M NaCl)중에 재현탁시켰다. 두번째 원심분리 후, 세포를 1/100 부피로 차가운 STE에 재현탁시키고, 1% 트리톤 X-100으로 용해시키고, 37℃에서 5-10분 동안 자기용해를 위해 인큐베이팅시켰다. 1%의 SDS를 첨가한 후, 세포를 50-60℃에서 5분 동안 증탕기에서 교반시켰다. RNase(100㎍/ml) 및 프로테이나아제 K(50㎍/ml)를 연속적으로 첨가하여, 각각 2 시간 및 1 시간 동안 인큐베이팅시켰다. 세포를 페놀/클로로포름의 1 부피로 두번 추출하고, 클로로포름의 1 부피로 한번 세척하고, 상청액을 에탄올 침전을 위해 모았다. 침전물을 70% 에탄올로 2회 세척하고, 펠렛을 모으고, 필요에 따라 TE(10mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) 또는 물에 재현탁시켰다.

플라스미드 라이브러리 DNA를 폴리에틸렌 글리콜 침전 공정(Kreig.P. and Melton.D. 1985 상기에 언급된 문헌)에 의해 풀링된 대장균 형질전환체로부터 추출하고, 닥터 모리슨(University of Illinois at Chicago)으로부터 수득된 방법에 이어 CP1200, 즉 어머 폐렴구균 계통을 형질전환시키는데 사용하였다. 폐렴구균 형질전환에 있어서, 냉동된 폐렴구균 콤피텐트 세포를 얼음상에서 녹이고, 100㎕의 이러한 콤피텐트 세포에 200ng 내지 1000ng의 플라스미드 라이브러리를 별도의 에펜도르프 튜브내에서 첨가하였다. 이 튜브를 37℃의 중탕기에서 약 25분 내지 35분 동안 인큐베이팅시키고, 혼합물을 CAT 배지에서 1/10으로 희석시키고, 약 1-1.7시간 동안 추가로 인큐베이팅시켰다. 최종 인큐베이팅 후, 상기 혼합물을 오보레이 공정에 의해 플레이팅하였다(방법은 닥터 모리슨(University of Illinois at Chicago)에 의해 획득된 것임). 오버레이 공정은 하기와 같은 작은 페트리디쉬에 네개의 상이한 아가 층(THB 또는 CAT)을 붓는 것을 포함한다: a) 첫 번째 또는 기부 층: 3ml의 아가; b) 두 번째 또는 세포 층: 1.5ml의 아가와 1.5ml의 필요한 농도의 박테리아 세포를 함유하는 브로스; c) 세 번째 층: 3ml의 아가; d) 네 번째 층 또는 상단 층: 4x의 필요한 농도의 항체를 함유하는 3ml의 아가(에리스로마이신, 0.05㎍/ml x 4 = 6㎍/ml). 플레이트를 37℃에서 인큐베이팅시켰다. 개별적인 형질전환체를 스태브 접종(stab inoculation)에 의해 100㎕의 THB 및 에리스토마이신(0.05㎍/ml)을 함유하는 미세적정 플레이트의 각각의 웰로 이동시켰다. 미세적정 플레이트에서 회수된 형질전환체를 SMP 배지에서 1:10으로 희석시키고, 초기 로그 페이스(log phase)까지 성장시키고, ELISA에 의해 C3를 분해할 수 있는 이들의 능력에 대해 스크리닝하였다.

재조합 플라스미드의 자발적인 절제는 낮은 빈도로 이러한 종류의 폐렴구균 변이에서 발생하여, 이러한 변이의 염색체 DNA 제조물은 종종 낮은 수준의 플라스미드 DNA를 포함한다[참조: Pearce B J., et al., Mol. Microb. 9(5):1037-1050, 1993]. 대장균의 일렉트로포레이션은 추가적인 연구를 위해 대장균중의 플라스미드 구성물을 분리하기에 매우 효과적인 방법이다. 흥미있는 각각의 폐렴구균 변이로부터의 염색체 DNA(2㎕의 최종 용량중의 100ng-200ng)를 대장균 DH5α MCR 콤피텐트 세포로 일렉트로포레이션하여, 재조합 플라스미드를 갖는 대장균 형질전환체를 수득하였다. 회수된 재조합 플라스미드중 하나(pLSN4a)(표 2 참조)를 다시 형질전환을 위해 야생형 CP1200 폐렴구균 계통으로 유입시켰다. 형질전환체 SN4-4G의 C3 분해 능력을 ELISA에 의해 다시 평가하였다.

DNA 단편을 트리스-붕산염 EDTA(TBE) 완충제 또는 트리스-아세트산 EDTA(TAE) 완충제를 갖는 아가로스 겔(0.5% 내지 1.0%)에서 수평 전기영동에 의해 분석하였다[참조: Sambrook, J.E. Fritsch and T.Maniatis. 1989]. 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)으로부터의 Gibco BRL, Hindi Ⅲ 또는 Hind Ⅲ/EcoRI 절단된 람다 DNA로부터의 하나의 kb 래더를 분자량 표준물로서 사용하였다.

지브코 BRL 라이프 테크놀로지(Gibco BRL Life Technology, Grand Island, NY.), 뵈링거 만하임(Indianapolis, IN.), 프로메가 코포레이션(Promega Corp., Madison, WI.), 베세다 리서치 래보러토리스(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD.) 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩., 인코포레이티드(New England Biolabs., Inc., Beverly, MA.)으로부터의 제한 엔도뉴클레아제, 송아지 장 포스파타아제, T4 DNA 리가아제를 상기 제조업자 지시에 따라 사용하였다.

DNA 단편을 서던 혼성화에 의해 분석하였다. 혼성화시키고, 키트에 제공된 지시에 따라 제니우스 방사능 DAN 라벨링 및 검출 키트(뵈링커 만하임 바이오케미칼(Indianapolis, IN))를 사용하여 검출하기 위해 DNA를 겔로부터 MSI 마그나그래피 나일론 막(MSI Magnagraph nylon membrane)(마이크론 세퍼레이션, 인코포레이티드(Micron Separations, Inc., Westboro, MA))으로 이동시켰다. 폐렴구균 또는 대장균 배양으로부터의 염색체 또는 플라스미드 DNA를 초반부에 설명된 바와 같이 분리하였다. 각 샘플중 약 100ng-400ng을 필요한 제한 효소로 절단하고, 0.7% 아가로스 겔상에서 진행시키고, 마그나그래피 나일론 막상으로 밤새 트랜스블롯팅하였다. 공정의 나머지는 제조업자의 지시에 따라 수행하였다.

본 실시예 및 하기 실시예에 사용된 박테리아 계통 및 플라스미드는 하기 표 2에 요약하였다.

표 2. 박테리아 계통 및 플라스미드 구성물

^a, 폐렴구균 계통 CP 1200의 불규칙한 염색체 단편으로 구성되어, Em^r결정 셔틀 벡터 pVA 891로결찰되고, 삽입 중복 돌연변이 유발을 위해 CP1200을 형질전환시키는데 사용되었다.^b, 삽입된 플라스미드를 문헌에 설명된 바와 같이 폐렴구균 변이로부터 대장균에서 회수하였다. 각각의 폐렴구균 변이로부터 회수된 재조합 플라스미드의 상이한 종류에 대해서는 표 3을 참조하기 바란다.

^*, cppA 유전자.^**, 620bp, cppA 유전자의 내부 단편.

실시예 2

변형된 C3 분해 활성을 갖는 변이의 확인

개별적인 폐렴구균 형질전환체를 이들의 변형된 C3 분해 활성을 위해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 폐렴구균 형질전환체를 미세적정 플레이트에서 로그 페이스까지 에리스로마이신(0.05㎍/mg)의 존재하에 THB에서 개별적으로 성장시켰다. SMP 박테리아 배양물을 로그 페이스까지 성장시키고, 2-4시간 동안 C3(0.83㎍의 C3/배양물의 ml)와 함께 인큐베이팅하였다. C3와 인큐베이팅한 후, 100㎕의 각각 개별적인 형질전환체를 플레이트된 ELISA로 이동시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 PBS(10μM 포스페이트 완충 염수 + 0.05% 트윈-20)으로 3회 세척하였다. 사람 보체 C3에 특이적인 HRP-콘쥬게이트된 염소 폴리클로날 항체 100㎕(48mg/ml의 1:10000 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이팅하였다. 각각의 미세적정 플레이트를 상기에 설명된 바와 같이 PBS로 세척하였다. 100㎕의 30% OPD(30ml의 시트레이트 완충제(200mM Na₂HPO₄및 100mM 시트르산-pH 5.0)중의 12mg의 O-페닐렌디아민(짐드(Zymed, South San Francisco, CA)) 및 12㎕의 30% H₂O₂)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 각각의 웰에 50㎕의 2.5M H₂SO₄를 첨가하므로써 반응을 중단시켰다. 샘플중에 남아있는 비분해된 C3의 양을 사람 보체 C3에 특이적인 HRP-콘쥬게이트된 염소 폴리클로날 항체에 의해 검출하였다. 분석을 표준화시켜, 비분해된 C3를 함유하는 웰의 O.D.490이 ~1.0이 되게 하였다. 분해된 C3를 갖는 웰을 항-C3 항체의 감소된 결합으로 인해 감소된 광학밀도를 갖는다. 변이 및 어미 계통의 광학밀도를 네거티브 대조군(상이한 농도의 C3를 갖는 배지)의 광학밀도와 비교하여, C3 분해 활성의 백분율을 계산하였다. 이들의 어미 CP1200의 활성과 비교하여 증가된 C3 분해 능력(2.2배-표 3)을 갖는 네개의 변이, 즉 SN3, SN4, SN5 및 SN6를 발견하였다. 이러한 발견은 폐렴구균 변이 SN4에 대한 웨스턴 면역블롯팅에 의해 후에 확인되었다. SN4-S10(붕괴된 cppA 유전자)는 또한, 감소된 C3 분해 활성을 갖는 CP1200의 변이이다.

표 3. 폐렴구균 계통의 과할성 변이 및 폐렴구균 계통의 어미에 의한 C3 분해에 대한 ELISA 결과

^**, 4개의 개별적인 실험에 대한 최소 평균, 상이한 시간에서 수행.

^**, 네거티브 샘플은 단지 C3만 가지며, 박테리아 세포는 함유하지 않는 배지이다.

ECL 웨스턴 블롯팅 프로토콜을 이용하여 면역블롯팅을 수행하였다[참조: Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL.]. 냉동 원액 배양으로부터의 플라스미드가 있거나 없는 대장균 배양물 또는 페렴구균 변이를 THB 또는 LB에서 로그 페이스까지 성장시키고, C3(0.83㎍의 C3/ml)와 함께 2-4시간 동안 인큐베이팅시키고, 배양물을 원심분리하고(2,500 rpm, 15분 동안, 실온 또는 4℃), 상청액을 모았다. 배양물의 광학밀도를 조심스럽게 모니터링하고, C3와 인큐베이팅 처리하기 전에, 샘플을 균등하게 하였다. 동일한 양의 비분해된 C3를 함유하는 모든 모아진 상청액을 환원 조건하에서 7.5% 또는 10% SDS-PAGE 겔에 가하였다. 겔을 1시간 동안 니트로셀룰로오스막으로 트랜스블롯팅시켰다(75볼트; 4℃). 본 실시예의 단백질을 이동시키고, 후속 실시예에서 1시간 동안 70 볼트에서 토우빈 완충제(1리터 용적 pH 8.3의 3.03g 트리스, 14.4g 글리신 및 200mL 메탄; Towbin et al. (1979) PNAS:4350-4354)중에서 호퍼 이동 장치(Hoeffer transfer apparatus)를 이용하여 겔로부터 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키거나, 겔을 50% 메탄올 및 10% 아세트산중에 제조된 0.125% 코매시 블리언트 블루 R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)(Pierce, Rockford, IL)으로 염색하였다.

블롯을 1시간 동안(실온) 또는 밤새(4℃) 완만하게 교반시키면서 10% 탈지유(탈지유 분말)중에서 인큐베이팅시켰다. 블롯을 TTBS(0.1% 트윈, 20mM 트리스, 137mM 염수 완충액)로 여러번 세척하고, 3X TTBS+3% BSA중에 제조된 IgG 분획(ICN 파마슈티컬스/카펠, Costa Mesa, CA), 폴리클로날 항체, HRP-콘쥬게이트된 염수 항사람 C3와 1:1000으로 희석시켜 1시간 동안 완만하게 교반시키면서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅된 블롯을 다시 TTBS로 여러번 세척하고, 화학발광제(1:1의 2X 루미놀/증폭제 및 2X 안정적인 과산화물 용액(Pierce, Rockford, IL))에서 1분 동안 인큐베이팅시켰다. 이러한 블롯을 암실에서 5초 내지 수초 동안 필름에 노출시켜, 필름을 현상하였다. SDS-PAGE 겔은 항상 미리 염색된 200kd 내지 19kd인 고분자량의 마커(베세다 리서치 래보러토리스, life Sciences, Grand Island, NY)를 함유하였다. 세척 및 인큐베이팅을 완만하게 교반하면서 실온에서 수행하였다.

과활성적인 페렴구균 변이, SN3, SN4, SN5 및 SN6로부터의 염색체 DAN의 대장균 DH5α MCR 콤피텐트 세포로의 일렉트로포레이션은 회수된 재조합 플라스미드를 갖는 대장균 형질전환체를 증가시킨다. 대장균 DH5α MCR 형질전환체, LSN3, LSN4, LSN5, LSN6, LSN4G는 플라스미드를 함유하였다(폐렴구균 변이, SN3, SN4, SN5, SN6 및 SN4-4G 변이 각각으로부터의 표 2). 상이한 구성물을 함유하는 상세한 대장균 계통은 표 2에 기재되어 있다. 제한 분석(Hind Ⅲ)은 삽입물이 실제로 재조합 플라스미드라는 것을 나타내주었다. 상이한 크기의 재조합 플라스미드를 각각의 과활성적인 폐렴구균 변이로부터 수득되었다. 재조합 플라스미드, 변이 SN3 및 SN4로부터 회수된 pLSN3 및 pLSN4는 동일한 크기(~7.8kb)를 가졌으며, 이들 삽입물의 크기는 ~2.4kb이었다. 폐렴구균 변이 SN5로부터 수득된, 삽입물 크기가 ~11kb인 재조합 플라스미드, pLSN5는 약 5.6kb이었다. 네 번째 폐렴구균 변이, SN6는 두개의 상이한 ~6.5kb 및 ~10.5kb의 재조합 플라스미드, pLSN6_a및 pLSN6_b를 가지며, 이는 각각 1.1kb 및 5.1kb의 삽입물을 갖는다. 이러한 폐렴구균 변이는 또한, 서던 혼성화에 의해 시험되었다. 과활성 폐렴구균 변이 SN4를 추가의 C3 분해 연구를 위해 선택하여, 변이 SN4로부터 회수된 재조합 플라스미드 pLSN4를 완전한 연구를 위해 처리하였다.

플라스미드 pLSN4를 폐렴구균 변이의 EcoRI 절단된 염색체 DNA 샘플에 대한 프로브로써 사용하였으며, 이는 변이 SN3 및 SN4에서 벡터 + 삽입물(pLSN4)의 통합을 확실하게 하였다. SN3 및 SN4 둘 모두의 과활성 변이는 어머 계통 CP1200에 또한 존재하는 ~2.2kb 및 ~5.8kb의 크기를 갖는 두개의 혼성화 단편을 포함하였다. ~4.2 및 ~3.5의 두개의 다른 혼성화 벡터/삽입 접합 단편이 있으며, 이러한 두개는 모두 총 ~7.8kb(pLSN4는 ~7.8kb임)를 제공하였다. 이러한 두개의 밴드는 또한, EcoRI 절단된 pLSN4 DNA 샘플중에 존재하였다. 삽입물 및 벡터 둘 모두는 EcoRI 부위를 가지며, 재조합 플라스미드를 나타내었다. 다른 과활성 변이, SN5 및 SN6의 패턴은 이러한 변이가 이들의 삽입된 재조합 플라스미드에 있어서 상이한 삽입물을 가질 수 있다는 것을 암한다.

동일한 플라스미드 pLSN4를 사용하여 어미 폐렴구균 계통 CP1200을 재형질전환시켜 과활성에 있어서 이들의 관계를 확인하였다. 예상된 바와 같이, 수득된 변이 SN4-4G(표 2)는 강화된 C3 분해의 표현형을 재유도하였다.

실시예 3

C3 분해 유전자의 분리 및 확인

이중 가닥 DNA 서열 분석을 재조합 플라스미드 pLSN4의 삽입 부분상에서 수행하였다. 이러한 삽입물은 C3 분해 과활성과 관련이 있기 때문에, 본 발명자는 상응하는 유전자 또는 유전자의 중복의 조절 영역에서 삽입물을 관찰할 수 있을 것이라고 예상하였다; 그러나, 단백질 데이타베이스 탐색을 기초로 하여 조절 영역에서의 삽입은 나타나지 않았다. 이는 유전자 중복의 가능성을 암시하는 것이다. 세개의 완전한 개방형해독틀(ORFs), 및 이러한 ORFs의 유도된 아미노산 서열과 진뱅크, 블라스트 및 스위스프롯 데이타베이스(GenBank, Blast and SwissProt database)의 탐색에서 제공된 단백질 사이의 현저한 상동성이 없는 하나의 부분적인 개방형해독틀이 있다. 예비 데이타(Cathryn A S., et al., J. Inf. Dis. 170:600-608, 1994)는 C3 분해 프로테이나아제(배출되는 단백질)가 관련된 세포 벽에 있을 수 있다는 것을 암시하며, 따라서, 본 발명자는 시그널 서열, 프롤린 풍부 도메인 또는 LPXTG 모티프의 존재를 조사하였다. 네개의 ORF는 이러한 서열 패턴을 가지지 않았으며, 본 발명자는 추가 분석을 위해 가장 큰 ORF인 OFR3를 선택하였다.

플라스미드 pLSN4a의 이중 가닥 DNA를 CsCl 구배/에티듐 브로마이드 단리를 이용하여 제조하고, 주형으로서 이용하였다. 올리고누클레오티드 프라이머를 지브코 BRL 또는 올리고 1000M DNA 합성기(Beckman Instruments Inc. La Brea, CA)에 의해 적용된 바이오시스템 391 자동화된 합성기로 합성하였다. 디데옥시 사슬 말단기 방법(Sanger F., et al., Proc. Natl. Acad. Scie. (USA) 82:1074-1078, 1977)을 이용하고, 시퀀시나아제 2.0(U.S. Biochem) 및 [α-³⁵S]dATP(Amersham life Sciences, Arlington Heights, IL)을 이용하여, 시퀀시나아제 버젼 2.0(Amersham life sciences)에 의해 제시된 바와 같이 장치:20110 마크로포어 전기영동 유닛(Macrophor Electrophoresis unit)(LKB Bromma)으로 시퀀싱을 수행하였다.

과활성 폐렴구균 상동성 재조합 변이 SN4로부터 회수된 재조합 플라스미드 pLSN4중의 삽입물(도 3 참조)은 시험된 약 20개의 효소중 Hinc Ⅱ, Nru I, EcoR I, Cla I, EcoR V 및 Hpa I에 대한 제한 부위를 갖는 것으로 여겨지며, 이러한 데이타는 서열 데이타와 서로 관련되었다.

시퀀싱 데이타를 살펴본 후, Hind Ⅲ 제한 부위를 함유하는, cppA 유전자의 620pb의 삽입 단편(ORF3의 삽입)을 오버행으로 유전자 증폭(프라이머에 대해서 표 4 참조)에 의해 생성시켰다. 이러한 단편을 벡터 pVA891내의 Hind Ⅲ 부위내로 서브클로닝하고, 대장균으로 일렉트로포레이션시키고, 삽입물의 존재에 대해서 시험하였다. 최종적으로, 이러한 서브클론으로 wt CP1200 폐렴구균 콤피텐트 세포를 형질전환시켜, 야생형 CP1200에서 원래 cppA 유전자를 불활성화시켰다.

필요한 DNA 단편의 5' 및 3' 말단에 상보적인 프라이머(프라미어의 서열 및 증폭 순화 조건에 대해서는 표 4 참조)를 갖는 하이바이드 옴니진 머신(Hybaid Omnigene machine)을 사용하여 DNA 증폭을 수행하였다. 모든 프라이머를 양쪽 말단에 제한 부위를 포함하도록 구성시켰다. 증폭 반응(최종 용적 0.1ml)에 물로 최종 용적을 100㎕으로 맞춘 10㎕의 10X 벤트 완충액(최종 농도, 1X 함유물: 10mM KCl, 10mM(NH₄)SO₄, 20mM 트리스-HCl(25℃에서 pH 8.8), 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100), 4㎕의 100mM MgSO₄(최종 농도 4mM), 3㎕의 10mM dNTP(최종 농도 300μM), 50ng 주형, 1μM 프라이머 및 1㎕의 2000유닛/ml 벤트 폴리머라아제(최종 농도 2 유닛: 효소를 10mM KCl, 0.1M EDTA, 10μM 트리스-HCl(pH 7.4), 1mM DTT, 0.1% 트리톤 X-100중에 처리하였다)을 사용하였다. 벤트 완충액, 벤트 폴리머라아제 효소 및 MgSO₄를 뉴 잉글랜드 바이오랩(MA)로부터 구입하고, dNTP는 지브코 BRL로부터 구입하였다.

추가적인 서열을 적용된 바이오시스템 모델 373a DNA 시퀀서(Applied Biosystems Model 373a DNA sequencer)(DNA Sequencing Core Facility, Interdisciplinary Center for Biotechnology Research(ICBR), University of Florida, Gainesville, FL)를 사용하여 형광 시퀀싱을 통해 생성시켰다. 로보틀로 워크스테이션(Robotlo Workstation(ABI Catalyst 800)) 및 퍼킨 엘머-세투스 PEC 9600 열순환기(Perkin Elmer-Cetus PEC 9600 thermocycler)를 열 시퀀싱 반응에 사용하였다. 주형, 플라스미드 pLSN4a로부터의 전체 삽입물을 나타내는 증폭된 유전자 생성물을 키아젠 키트(Qiagen kit)에 의한 0.7% 아가로스 겔로부터 직접 세척하였다. 시퀀싱 분석을 GCG 소프트웨어 패키지에서 이용가능한 프로그램(파스타, 블라스타 및 그밖의 프로그램)으로 수행하였다.

표 4. 프라이머의 서열 및 유전자 증폭 순환 조건

* pLSN4, 과활성 폐렴구균 변이 SN4로부터 회수된 재조합 플라스미드(상기 표 및 텍스트 참조); 이는 완전히 시퀀싱되었다; cppA를 나타내는 ORF3는 어미 폐렴구균 계통 CP1200에서 cppA(ORF3)을 붕괴하는데 사용되는 cppA(ORF3) 유전자 내부의 일부이다.

실시예 4

C3 분해 단백질 분리 및 연구

과활성 변이의 로그 페이스 배양물 및 이들의 어미 계통을 C3와 함께 2-4시간 동안 인큐베이팅하고, 배양 상청액을 환원조건하에 7.5% SDS-PAGE 겔상에서 진행시키고, C3에 대한 HRP-콘쥬게이트된 폴리클로날 항체를 면역블롯팅하므로써 이들의 증가된 C3 분해 능력을 시험하였다. 이러한 실험은 변이 SN4 및 SN4-4G(SN4로부터 회수된 재조합 플라스미드 pLSN4를 갖는 CP1200의 재형질전환에 의해 수득)가 C3 분해에 있어서 이들의 어미 계통 CP1200 보다 더욱 활성적이라는 것을 입증하였다. α 및 β 사슬 C3 둘 모두는 4시간 인큐베이팅 후 변이에 의해 완전히 분해되는 반면, 어미 계통에 있어서는 분해가 불완전하였다. CppA 단백질이 C3 α 사슬을 우선적으로 분해하는 것으로 보여진다.

cppA 유전자의 620bp 삽입 부분을 pVA891의 Hind Ⅲ 부위에 결찰시키고, 이 구성물로 CP1200 콤피텐트 세포를 형질전환시켰다. 수득된 형질전환체를 이들의 C3를 분해하는 능력에 대해 시험하였다. ORF3 변이는 빈약한 활성을 갖는 것으로 확인되었다. C3 분자의 ∝ 사슬은 분해되었으며, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 어미 계통 CP1200과 비교할 경우, β 사슬은 덜 분해되었다. 변이에서 활성의 완전한 결손 보다는 감소된 활성이 변이에서 다른 C3 분해 프로테이나아제를 코드화하는 다른 완전한 기능적 유전자의 존재에 대한 가능성을 암시하였다.

전체 cppA 유전자를 증폭시키고, pet-28b(+)의 Nde I 및 Bam H I 부위에 클로닝시키고(Novagen, INC. Madison, WI), 유전자를 이것의 N-말단 영역에서 His-Tag와 혼입시켰다. 전체 유전자를 서열 분석에 의해 확인된 바와 같이 프레임내의 벡터내에 위치하였다. 플라스미드 구성물로 안정화를 위해 대장균 DH5 ∝ MCR 계통을 형질전환시키고, 삽입물의 존재를 증명한 후, 벡터 및 삽입물로 발현을 위해 대장균 BL 21 D3(Novagen) 프로테이나아제 결손 계통을 형질전환시켰다. 플라스미드 구성물을 함유하는 클로니를 카나마이신(30㎍/ml)을 함유하는 LB 배지에서 선택하였다.

단백질을 적은 스케일 또는 큰 스케일 제조를 위해 페트 시스템 매뉴얼(Pet System manual)(Madison, WI)에 따라 분리하였다. 구성물(pet 28b(+)::ORF3(cppA 유전자)을 함유하는 BL 21 DE3 계통을 IPTG에 의해 유입시키고, 발현된 단백질, CppA를 용해시켰다. 용해를 위해, 유입된 박테리아 배양물을 원심분리하고, 펠렛을 TES(50mM 트리스; 1mM EDTA; 100mM NaCl)중에 재현탁시켰다. 재현탁물을 얼음상에서 초음파(고출력 세팅에서 6 x 15 sec 펄스: 약 50 왓트) 처리하고, 원심분리하여 펠렛을 모았다. 펠렛을 TES(50mM 트리스; 1mM EDTA; 100mM NaCl)으로 두번 세척하고, 최종적으로 펠렛을 6mM G-HCl + 1mM DTT + 1% 트윈-20으로 3시간 동안 4℃에서 처리하였다.

용해된 단백질을 1:10으로 TTS(1% 트윈, 50mM 트리스, 0.7M NaCl)으로 희석시키고, TTS(1% 트윈, 50mM 트리스, 0.7M NaCl)에 대해 투석시켜 구아니딘-HCl, DTT 및 EDTA를 제거하였다. 투석된 CppA 단백질을 페트 시스템 매뉴얼 설명서(Pet system manual instructions)(Novagen, INC. Madison, WI)를 이용하여 니켈 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 니켈 칼럼(2.5ml)을 붓고, 구아니딘-HCl, DTT 및 EDTA를 제거한 후, 발현된 His-태그된 CppA 단백질을 정제를 위해 니켈 칼럼에 처리하였다. 용리된 분획을 10% SDS-PAGE 겔 및 코매시 블리언트 블루 R-250에 의해 His-태그된-CppA 단백질에 대해 시험하였다. 상기 단백질을 얼음상에서 4℃로 유지시키거나, 사용할 때 까지 -80℃에서 소량의 분취물중에 냉동시켰다.

CppA 단백질(반응 혼합물의 ml 당 약 600ng)을 사람 보체 C3(반응 혼합물의 ml 당 0.83㎍의 C3)와 함께 4시간 동안 37℃에서 PBS 및 네거티브 대조군의 존재하에, 단백질을 동시에 개시시키지 않으면서 인큐베이팅하였다. 상기 샘플을 환원 조건하에서 7.5% 또는 10% SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다(ECL 웨스턴 블롯팅 프로토콜-Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL).

상기에 설명된 바와 같이, 전체 ORF3 유전자의 PCR 생성물을 아미노 말단 위치에서 His-태그로 pet 벡터 pET28b(+)(Novagen, Madison, WI)으로 서브클로닝하고, 구성물을 대장균에서 안정화시킨 후, 프로테아제 결함 계통 대장균 BL 21 DE3(표 2)에 유입시켰다. 상기 구성물을 갖는 대장균 BL 21 DE3을 IPTG에 의해 유입처리하였다. 유도되고 비유도된 배양물의 총 세포 단백질 추출물을 시험하였다. 발현된 Hig-태그된 ORF3 단백질(~29kd)을 10% SDS-PAGE 겔상에서 유입된 단백질 샘플의 불용성 분획에서 확인하였다.

하기 시제를 4℃에서 3시간 또는 실온에서 1시간 동안 용해화에 사용하였다: TES(50mM 트리스, 1mM EDTA, 1M NaCl; (b) 6mM G-HCl + 1mM DTT; (c) 6mM G-HCl +1mM DTT + 1% 트윈 20; (d) 6mM G-HCl + 1mM DTT + 1% 트리톤 X-100. "c" 및 "d" 둘 모두의 처리는 발현된 단백질을 용해가능하게 하여, 10% SDS-PAGE 겔상에서 관찰되었다. "c" 시제로의 처리는 후속 큰 스케일 제조를 위해 선택되었다. 용해된 단백질을 투석시킨 후, 니켈 칼럼을 통해 정제시키고, 이것의 C3에 대한 기능에 대해 시험하였다.

본 실시예 및 상기에 사용된 SDS-PAGE 겔에 있어서, 총 세포 단백질 또는 가용성 또는 불용성 단백질 분획을 Pet-시스템 매뉴얼(Madison, WI)에 따라 추출하였다. 단백질을 렘리(Laemmli, U.K., Nature 227:680-685, 1970)에 의한 불연속 시스템에서 SDS-PAGE 겔(7.5%, 10% 또는 15% 재용해된 겔 및 4.5% 적층 겔)에 의해 분리하였다. 간단하게, 샘플을 로딩 완충액(샘플중의 최종 농도는 7.57mg/ml의 트리스, 2% SDS, 10% 글리세롤 및 1.25mg/ml의 프롬페놀 블루, ± 5% β-멀캅토에탄올임)과 혼합시키고, 5분 동안 끓이거나 분해 겔상에 직접 로딩하였다. 선염색된 고분자량 표준물(단백질 마커(kd):리소자임, 14,300; β-락토글루불린, 18,400; 탄산탈수소효소, 29,000; 오브알부민, 43,000; 소태혈정 알부민, 68,000; 포스포릴라아제 B, 97,400 미오신, 200,00(베세다 리서치 래모러토리스, life sciences, Grand Land, NY)을 겔상에 포함시켰다. 큰 SDS-PAGE 겔을 14시간 동안 15mA에서 또는 20시간 동안 10mA에서 전기영동시켰다. 미니 겔을 일정한 전압(100-150 볼트)하에서 약 2-3시간 동안 전기영동시켰다.

발현된 단백질을 C3와 인큐베이팅시키고, 존재하는 C3의 양을 웨스턴 면역블롯팅에 의해 평가하였다.

면역블롯팅 분석은 발현된 단백질을 함유하는 샘플이 C3 분자를 분해한다는 것을 나타내었다. 비분해된 C3를 사람 보체 C3에 대해 특이적인 폴리클로날 항체에 의해 검출하고, 이는 네거티브 샘플의 경우에 현상된 필름상에서 명백히 관찰되었다. C3의 ∝ 및 β 사슬 둘 모두는 어떤 ORF3 단백질도 함유하지 않는 네거티브 대조군과 비교하여 ORF3 단백질의 활성에 영향을 받기 쉬운 것으로 여겨진다.

실시예 5

임상 분리에서 C3 분해 유전자의 보존

유전자 cppA의 보존을 시험하기 위해, cppA의 삽입 단편을 프로브로서 사용하여, 서던 혼성화에 의해 폐렴구균 분리물의 상이한 임상(혈청형)의 EcoRI 절단된 게놈성 DNA내의 유전자 cppA의 존재를 측정하였다. 동일한 실험에 있어서, 폐렴구균 어미 CP1200 및 과활성 변이 SN4 및 SN4-4G(둘 모두의 변이는 동일한 플라스미드를 함유-표 2 참조)을 포함시켜 변이에서 cppA 유전자의 중복을 확인하였다. 서던 혼성화를 프로브로서 유전자의 비방사능 DIG 라벨된 삽입 단편을 이용하여 수행하였다. 임상적 분리물, 유형1, 유형3, 유형 14F 및 악성 유형 23F는 약 2.3kb의 혼성화된 밴드를 나타냈으며, 이는 또한, 대조군 폐렴구균 계통 CP1200 및 SN4 변이에 나타났다. 이러한 공통적인 밴드는 cppA 유전자가 시험된 모든 분리물에 존재한다는 것을 나타낸다. SN4 변이는 또한, 유전자 중복을 나타내는 약 3.5kb를 갖는 두번째 밴드를 함유하였다. 3.5kb 크기는 플라스미드 pLSN4가 EcoRI에 대한 두개의 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위(하나는 삽입 영역 및 두 번째는 벡터내에서)를 갖는다는 관찰과 일관된 것이다. 따라서, EcoRI으로의 제한 절단은 재조합 플라스미드로부터 약 4.175kb(3.531kb의 벡터 + 0.649kb의 삽입물) 및 3.539kb(~1.67kb 형태의 삽입물 + 벡터로부터 약 1.869kb)을 유도하였다. cppA 유전자를 삽입물의 1.67kb 부분 상에서 분리하여, 재조합 플라스미드의 ~3.539kb 제한된 단편이 cppA를 함유하여, 단지 이 밴드만이 삽입된 cppA 유전자의 단편인 프로브에 혼성화될 것이다; 따라서, 중복된 cppA 유전자를 갖는 변이의 경우, ~3.5kb에서 두 번째로 혼성화된 밴드는 중복된 cppA 유전자를 나타내었다.

서열 목록

(1) 일반적 사항:

(ⅰ) 출원인: 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타, 등

(ⅱ) 발명의 명칭: 스트렙토콕커스 뉴모니애로부터의 사람 보체 C3-분해 프로테이나아제

(ⅲ) 서열의 수: 9

(ⅳ) 연락처:

(A) 주소: 뮤팅, 라쉬 ＆ 겝하트, 피.에이.

(B) 스트리트: 119 노쓰 훠쓰 스트리트, 슈트 203

(C) 도시: 미네아폴리스

(D) 주: 미네소타

(E) 국가: 미국

(F) 우편 번호: 55401

(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 작업 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatnetIn Release #1.0, 버젼 #1.30

(ⅵ) 우선 출원 상황:

(A) 출원 번호: 60/044,316

(B) 출원일: 1998년 4월 24일

(C) 분류:

(ⅶ) 현재 출원 상황:

(A) 출원 번호: PCT/US98/08281

(B) 출원일: 1998년 4월 24일

(C) 분류:

(ⅷ) 변리사/대리인 상황:

(A) 성명: 뮤팅, 앤 엠.

(B) 등록 번호: 33,977

(C) 참고/서류 번호: 111.00580201

(ⅸ) 통신처:

(A) 전화: 612-305-1217

(B) 팩스: 612-305-1228

(2) 서열 번호 1에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 726 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :1:

ATGAATGTAA ATCAGATTGT ACGGATTATT CCTACTTTAA AAGCTAATAA TAGAAAATTA 60

AATGAAACAT TTTATATTGA AACCCTTGGA ATGAAGGCCT TGTTAGAAGA ATCGGCCTTT 120

CTGTCACTAG GTGACCAAAC GGGTCTTGAA AAGCTGGTTT TAGAAGAAGC TCCCAGTATG 180

CGTACTCGTA AGGTAGAGGG AAGAAAAAAA CTAGCTAGAT TGATTGTCAA GGTGGAAAAT 240

CCCTTAGAAA TTGAAGGAAT CTTATCTAAA ACAGATTCGA TTCATCGATT ATATAAAGGT 300

CAAAATGGCT ACGCTTTTGA AATTTTCTCA CCAGAAGATG ATTTGATTTT GATTCATGCG 360

GAAGATGACA TAGCAAGTCT AGTAGAAGTA GGAGAAAAGC CTGAATTTCA AACAGATTTG 420

GCATCAATTT CTTTAAGTAA ATTTGAGATT TCTATGGAAT TACATCTCCC AACTGATATC 480

GAAAGTTTCT TGGAATCATC TGAAATTGGG GCATCCCTTG ATTTTATTCC AGCTCAGGGG 540

CAGGATTTGA CTGTGGACAA TACGGTTACC TGGGACTTAT CTATGCTCAA GTTCTTGGTC 600

AATGAATTAG ACATAGCAAG TCTTCGCCAG AAGTTTGAGT CTACTGAATA TTTTATTCCT 660

AAGTCTGAAA AATTCTTCCT TGGTAAAGAT AGAAATAATG TTGAATTGTG GTTTGAAGAA 720

GTATGA 726

(2) 서열 번호 2에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 241 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: 단백질

(ⅹⅰ) 서열 설명 :2:

Met Asn Val Asn Gln Ile Val Arg Ile Ile Pro Thr Leu Lys Ala Asn

1 5 10 15

Asn Arg Lys Leu Asn Glu Thr Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Gly Met Lys

20 25 30

Ala Leu Leu Glu Glu Ser Ala Phe Leu Ser Leu Gly Asp Gln Thr Gly

35 40 45

Leu Glu Lys Leu Val Leu Glu Glu Ala Pro Ser Met Arg Thr Arg Lys

50 55 60

Val Glu Gly Arg Lys Lys Leu Ala Arg Leu Ile Val Lys Val Glu Asn

65 70 75 80

Pro Leu Glu Ile Glu Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Ile His Arg

85 90 95

Leu Tyr Lys Gly Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Glu Ile Phe Ser Pro Glu

100 105 110

Asp Asp Leu Ile Leu Ile His Ala Glu Asp Asp Ile Ala Ser Leu Val

115 120 125

Glu Val Gly Glu Lys Pro Glu Phe Gln Thr Asp Leu Ala Ser Ile Ser

130 135 140

Leu Ser Lys Phe Glu Ile Ser Met Glu Leu His Leu Pro Thr Asp Ile

145 150 155 160

Glu Ser Phe Leu Glu Ser Ser Glu Ile Gly Ala Ser Leu Asp Phe Ile

165 170 175

Pro Ala Gln Gly Gln Asp Leu Thr Val Asp Asn Thr Val Thr Trp Asp

180 185 190

Leu Ser Met Leu Lys Phe Leu Val Asn Glu Leu Asp Ile Ala Ser Leu

195 200 205

Arg Gln Lys Phe Glu Ser Thr Glu Tyr Phe Ile Pro Lys Ser Glu Lys

210 215 220

Phe Phe Leu Gly Lys Asp Arg Asn Asn Val Glu Leu Trp Phe Glu Glu

225 230 235 240

Val

(2) 서열 번호 3에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 333 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :3:

CAGGAAGCTT GATCTTGAAA TTTCTATGAC TCC 33

(2) 서열 번호 4에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 36 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :4:

CGAGAAGCTT GATCCTGTCG AAATCAAAGC AGGACG 36

(2) 서열 번호 5에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 33 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :5:

CAGGAAGCTT TGAAACAATT TATATTGAAA CCC 33

(2) 서열 번호 6에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 35 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :6:

CGAGAAGCTT CAAGGAAGAA TTTTTCAGAC TTAGG 35

(2) 서열 번호 7에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 36 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :7:

GGGGAATTCC ATATGAATGT AAATCAGATT GTACGG 36

(2) 서열 번호 8에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 36 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :8:

CGCCGCGGAT CCTCATACTT CTTCAAACCA CAATTC 36

(2) 서열 번호 9에 대한 사항:

(ⅰ) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 50 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ⅱ) 서열의 종류: DNA(게놈성)

(ⅹⅰ) 서열 설명 :9:

GCTCCCAGTA TGCGTACTCG TAAGGTAGAG GGAAGAAAAA AACTAGCTAG 50

Claims

서열 번호:2의 서열과 80% 이상이 동일하며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 분리된 단백질.
제 1 항에 있어서, 단백질이 S.뉴모니애(S. pneumoniae)로부터 분리됨을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항에 있어서, 단백질이 사람 보체 단백질 C3와 결합함을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항에 있어서, 단백질이 재조합 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항에 있어서, 단백질이 분리된 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항에 있어서, 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 측정된 분자량이 약 24kDa 내지 약 34kDa임을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항에 따른 단백질로부터 15개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드.
서열 번호:2를 포함하는 분리된 단백질.
서열 번호:2로부터 15개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드.
서열 번호:2를 포함하는 단백질로서, 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 측정된 분자량이 약 24kDa 내지 약 34kDa임을 특징으로 하는 단백질.
제 10 항에 있어서, 단백질이 S.뉴모니애로부터 분리됨을 특징으로 하는 단백질.
제 10 항에 있어서, 단백질이 재조합 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
제 10 항에 있어서, 단백질이 사람 보체 단백질 C3를 분해함을 특징으로 하는 단백질.
서열 번호:2의 아미노산 1-50을 포함하는 단백질.
도 1a의 핵산 1246 내지 1863을 포함함을 특징으로 하는 핵산 단편.
사람 보체 단백질 C3를 분해하는 단백질로서, 이러한 단백질을 코드화하는 핵산이 6X SSC, 5X 덴하드트(Denhardt), 0.5% SDS, 및 65℃에서 밤새 혼성화시키고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS중에서 약 10분 동안 1회 세척시키고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척시키고, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척시킨 100㎍/ml의 단편화되고 변성된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에서 서열 번호:1과 혼성화됨을 특징으로 하는 단백질.
서열 번호:2의 서열과 80% 이상이 동일하며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 단백질로부터 15개 이상의 아미노산을 포함하는, 유효량의 면역 시스템 자극 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 면역 시스템 자극 조성물.
제 17 항에 있어서, 단백질이 S.뉴모니애로부터 분리됨을 특징으로 하는 조성물.
제 15 항에 있어서, S.뉴모니애로부터 하나 이상의 다른 면역 자극 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역 시스템 자극 조성물.
서열 번호:2의 서열과 80% 이상이 동일하며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
제 20 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 항체.
제 20 항에 있어서, 항체가 항체 단편임을 특징으로 하는 항체.
제 20 항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체임을 특징으로 하는 항체.
제 20 항에 있어서, 항체가 마우스, 쥐, 사람 또는 토끼로부터 얻어짐을 특징으로 하는 항체.
6X SSC, 5X 덴하드트, 0.5% SDS, 및 65℃에서 밤새 혼성화시키고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 약 10분 동안 1회 세척시키고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척시키고, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척시킨 100㎍/ml의 단편화되고 변성된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에서 서열 번호:1과 혼성화될 수 있는 핵산 단편.
제 25 항에 있어서, S.뉴모니애 게놈으로부터 분리됨을 특징으로 하는 핵산.
제 25 항에 있어서, 핵산 단편이 단백질의 일부 또는 전부를 코드화함을 특징으로 하는 핵산.
제 27 항에 있어서, 단백질이 사람 보체 C3를 분해함을 특징으로 하는 핵산.
제 27 항에 있어서, 핵산 단편이 사람 보체 C3를 분해하지 않는 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 핵산 단편.
제 25 항에 있어서, 핵산 벡터내에 존재함을 특징으로 하는 핵산.
제 30 항에 있어서, 벡터가 단백질의 일부 또는 전부를 유도할 수 있는 발현 벡터임을 특징으로 하는 핵산.
제 25 항에 따르는 핵산을 포함하는 세포.
제 32 항에 있어서, 세포가 박테리아 세포 또는 진핵 세포임을 특징으로 하는 세포.
핵산 서열 gctcccagtatgcgtactcgtaaggtagagggaagaaaaaaactagctag을 포함하는 분리된 핵산 단편.
동물에 치료 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는 조성물을 투여하는 단계로서, 이러한 단백질을 코드화하는 핵산이 6X SSC, 5X 덴하드트, 0.5% SDS, 및 밤새 65℃에서 혼성화시키고, 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 약 10분 동안 1회 세척하고, 65℃에서 약 15분 동안 1회 세척시키고, 실온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 3-5분 이상 동안 1회 이상 세척시킨 100㎍/ml의 단편화되고 변성된 연어 정액 DNA의 혼성화 조건하에서 서열 번호:1과 혼성화되는 단계; 및 단백질에 대한 면역 반응을 획득하는 단계를 포함하여, 동물에서 S.뉴모니애에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
제 35 항에 있어서, 면역 반응이 B 세포 반응임을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 면역 반응이 T 세포 반응임을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 단백질의 일부 도는 전부의 길이가 15개 이상의 아미노산임을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 조성물이 S.뉴모니애로부터의 하나 이상의 그밖의 단백질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 단백질이 서열 번호:2의 15개 이상의 아미노산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
삽입 변이를 포함하는 박테리아로서, 삽입 변이가 사람 보체 C3를 분해할 수 있는 단백질을 코드화하는 유전자내에 존재함을 특징으로 하는 박테리아.
제 41 항에 있어서, 박테리아가 삽입 중복 변이를 포함함을 특징으로 하는 박테리아.
사람 보체 C3에 결합할 수 있으며, 분해할 수 있는 스트렙토콕커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 약 24kDa 내지 약 34kDa의 분리된 단백질.
스트렙토콕커스 뉴모니애 박테리아를 서열 번호:2의 아미노산을 갖는 단백질과 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하여, 스트렙토콕커스 뉴모니애 매개 C3 분해를 억제시키는 방법.
서열 번호:1의 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 단편.
서열 번호:1를 포함하는 이중 가닥 DNA 서열에 의해 전사된 RNA 단편.