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KR20000016326A - System and method for carrying out and monitoring biological processes - Google Patents

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KR20000016326A
KR20000016326A KR1019980709899A KR19980709899A KR20000016326A KR 20000016326 A KR20000016326 A KR 20000016326A KR 1019980709899 A KR1019980709899 A KR 1019980709899A KR 19980709899 A KR19980709899 A KR 19980709899A KR 20000016326 A KR20000016326 A KR 20000016326A
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칼 티. 위터
커크 엠. 리리
랜디 피. 라스센
데이비드 알. 힐야드
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프레드한 아룬디프 에스
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Abstract

PURPOSE: A device and a method for heat cycling and monitoring a biological reaction such as a polymerase chain reaction. CONSTITUTION: A thermal cycling method and device is disclosed. The device comprises a sample chamber whose temperature can be rapidly and accurately modulated over a range of temperatures needed to carry out a number of biological procedures, such as the DNA polymerase chain reaction. Biological samples are placed in glass micro capillary tubes and then located inside the sample chamber. A programmable controller regulates the temperature of the sample inside the sample chamber. Monitoring of the DNA amplification is monitored by fluorescence once per cycle or many times per cycle. The present invention provides that fluorescence monitoring of PCR is a powerful tool for DNA quantification.

Description

생물학적 공정 모니터링 방법 및 시스템Biological Process Monitoring Methods and Systems

다양한 산업, 기술 및 연구 분야에서 비교적 적은 샘플을 신뢰성 있고 재현성 있게 열 싸이클링을 받게할 필요가 있다. 샘플을 반복된 열 싸이클을 받게할 필요성은 특히 생물공학 분야에서 절실하다. 생물공학 분야에서 짧은 기간에 걸쳐서 작은 샘플을 반복적으로 가열 및 냉각할 필요가 자주 발생한다. 정기적으로 수행되는 이러한 생물학적 과정은 주기적 DNA 증폭이다.In a variety of industries, technologies and research areas, relatively few samples need to be subjected to thermal cycling reliably and reproducibly. The need for samples to undergo repeated heat cycles is particularly urgent in the field of biotechnology. In the field of biotechnology, it is often necessary to repeatedly heat and cool small samples over a short period of time. This biological process that is performed regularly is periodic DNA amplification.

열안정성 DNA 폴리메라제를 사용하는 주기적 DNA 증폭은 "폴리메라제 체인 반응"이라고 널리 알려진 프라이머 특이성 DNA의 자동 증폭을 허용한다. 이러한 과정의 자동화는 통상 복수의 용기에 담긴 반응 혼합물의 조절되고 정확한 열 싸이클링을 필요로 한다. 과거에 선호되는 용기는 플라스틱 마이크로 튜브였다.Periodic DNA amplification using thermostable DNA polymerases allows for automatic amplification of primer specific DNA, well known as the "polymerase chain reaction." Automation of this process usually requires controlled and accurate thermal cycling of the reaction mixture in a plurality of vessels. In the past, the preferred container was a plastic micro tube.

시간에 대한 필요한 온도구배를 통해서 마이크로 튜브에서 샘플의 열 싸이클링을 하기 위해서 과거에는 프로그램가능한 금속 열 블럭이 사용되었다. 그러나, 짧은 기간에 걸쳐서 넓은 온도 범위에서 열블럭의 온도를 신속하고 정확하게 조절할 수 없으므로 폴리머아제 체인 반응을 수행할 때 열 제어 시스템으로서 열블럭 형태의 장치가 바람직하지 않게 되었다.Programmable metal thermal blocks have been used in the past to thermally cycle samples in microtubes through the required temperature gradient over time. However, since it is not possible to quickly and accurately control the temperature of the heat block over a wide temperature range over a short period of time, the device in the form of a heat block as a thermal control system when carrying out the polymerase chain reaction has become undesirable.

게다가, 일반적으로 사용된 마이크로 튜브는 단점이 있다. 마이크로 튜브 재료, 이의 벽두께, 및 마이크로 튜브의 모양은 그속에 담긴 샘플의 신속한 가열 및 냉각에 장애가 된다. 마이크로 튜브의 벽두께 및 플라스틱 재료는 담긴 샘플과 주변 매체간에 절연체로서 작용하여 열에너지 전달을 방해한다. 또한 마이크로튜브의 모양은 열에너지 전달에 어떠한 매체가 사용되는지에 관계없이 작은 표면적을 제시한다. 당해 분야에서 최적이 아닌 모양을 가진 마이크로 튜브의 계속된 사용은 개선된 열전달(일정한 부피의 샘플에 대해서 샘플용기의 표면적을 증가시킴으로써 가능한)의 장점이 여태까지 인식되지 않았음을 표시한다.In addition, generally used microtubes have disadvantages. The micro tube material, its wall thickness, and the shape of the micro tube impede the rapid heating and cooling of the sample contained therein. The wall thickness of the microtubes and the plastic material act as an insulator between the contained sample and the surrounding medium, hindering heat energy transfer. The shape of the microtubes also presents a small surface area, regardless of what medium is used for thermal energy transfer. Continued use of microtubes with non-optimal shapes in the art indicates that the benefits of improved heat transfer (possibly by increasing the surface area of the sample container for a constant volume of sample) have not been recognized to date.

게다가, 유체식 전환(또는 기계적 전달)을 하는 수조를 사용하는 장치가 폴리메라제 연쇄반응을 위한 열적 순환기로 사용된다. 수조는 반응에 필요한 시간대 온도 구배를 통해 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물을 싸이클링시키는데 사용되었지만 물의 높은 열질량과 플라스틱 마이크로 튜브의 낮은 열 전도성은 장치의 성능 및 반응의 수율을 크게 제한시켰다.In addition, a device using a water bath with fluidic conversion (or mechanical transfer) is used as the thermal cycler for the polymerase chain reaction. The bath was used to cycle the polymerase chain reaction mixture through the time zone temperature gradient required for the reaction, but the high thermal mass of water and the low thermal conductivity of the plastic microtubes greatly limited the performance of the device and the yield of the reaction.

수조를 사용한 장치는 성능에 있어서 제한적이다. 그 이유는 물의 열질량이 달성될 수 있는 시간에 대한 최대 온도 그래디언트를 크게 한정시키기 때문이다. 또한, 수조 장치는 크기, 물전달 호스의 수, 및 외부 온도 조절 장치로 인하여 매우 복잡하다. 게다가, 수조 장치의 누수를 탐지할 목적으로 피팅의 주기적인 보수 및 조사는 귀찮고 시간 소모적이다. 마지막으로, 샘플 튜브내 온도를 필요한 정확도로 제어하는 것이 수조장치로는 곤란하다.Apparatus using a water bath is limited in performance. This is because the thermal mass of water greatly limits the maximum temperature gradient over time. In addition, the bath apparatus is very complicated due to the size, the number of water transfer hoses, and the external thermostat. In addition, periodic maintenance and inspection of the fittings for the purpose of detecting leaks in the bath apparatus are cumbersome and time consuming. Finally, it is difficult for a bath apparatus to control the temperature in the sample tube to the required accuracy.

미국특허 3,616,264(Ray)는 생물학적 샘플을 일정한 온도로 가열 또는 냉각시키기 위해서 공기를 순환시키는 장치를 보여준다. Ray의 장치가 에어 챔버내의 온도를 일정하게 유지시키는데 다소 효과적이지만 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적 과정에 필요로 하는 시간대 온도 프로파일에 따라 주기적 방식으로 온도를 신속히 조절할 필요성에 대해서 강조하지 않는다.US 3,616, 264 to Ray shows a device for circulating air to heat or cool a biological sample to a constant temperature. Although Ray's device is somewhat effective at keeping the temperature in the air chamber constant, it does not emphasize the need to quickly adjust the temperature in a periodic manner depending on the time zone temperature profile required for biological processes such as polymerase chain reactions.

미국특허 4,420,679(Howe) 및 4,286,456(Sisti)는 가스 크로마토그래피 오븐을 발표한다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 가스 크로마토그래피 과정을 수행하는데 적합하지만 이전에 언급된 장치에 의해 제공되는 것보다 빠른 열적 싸이클링을 제공하지 못한다. 신속한 열적 순환은 많은 과정을 수행하는데 유용하다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 이러한 반응을 빠르고 효과적으로 수행하는데는 부적합하다.US Pat. Nos. 4,420,679 (Howe) and 4,286,456 (Sisti) disclose gas chromatography ovens. The devices disclosed in the Howe and Sisti patents are suitable for performing gas chromatography processes but do not provide faster thermal cycling than those provided by the previously mentioned devices. Rapid thermal cycling is useful for carrying out many processes. The devices presented in the Howe and Sisti patents are not suitable for performing this reaction quickly and effectively.

특히, 폴리메라제 연쇄반응(PCR)은 분자생물학의 기본이며 임상 실험실에서 중요한 분자공학 기술이다. 이의 유용성 및 대중성에도 불구하고 PCR에 대한 현재의 지식은 그다지 진보하지 못했다. 증폭은 시행착오에 의해 최적화되어야 하며 프로토콜은 맹목적이었다. 당해분야에서 PCR에 대한 제한된 이해는 당해분야의 숙련된 자가 이해없이 강력한 기술을 활용하는데 얼마나 만족하는가에 대한 좋은 예이다.In particular, polymerase chain reaction (PCR) is the basis of molecular biology and an important molecular engineering technique in clinical laboratories. Despite its usefulness and popularity, current knowledge of PCR has not progressed much. Amplification must be optimized by trial and error and the protocol is blind. A limited understanding of PCR in the art is a good example of how satisfied are those who utilize powerful techniques without self-understanding by those skilled in the art.

PCR과 같은 생물학적 공정은 샘플의 온도 순환을 필요로 한다. 공지기술이 온도 순환을 느리게 시킬 뿐만 아니라 PCR의 기본 원리를 무시하며 PCR을 더욱 유용하게 하는데 사용될 수 있는 기본원리를 무시한다. 따라서, PCR을 빠르게 수행하며 일어나는 반응을 분석하는 장치 및 방법을 제공한다면, 특히 이러한 반응이 실시간으로 분석된다면 당해분야에서 큰 진보일 것이다.Biological processes such as PCR require temperature cycling of the sample. Known techniques not only slow temperature cycling but also ignore the basic principles of PCR and ignore basic principles that can be used to make PCR more useful. Thus, providing a device and method for analyzing reactions occurring while performing PCR rapidly would be a major advance in the art, particularly if such reactions were analyzed in real time.

본 발명은 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적 공정을 수행하는데 사용되는 장치에 관계한다. 특히 본 발명은 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적인 반응을 열싸이클링 및 모니터링하는 방법 및 장치에 관계한다.The present invention relates to a device used to perform a biological process such as a polymerase chain reaction. In particular, the present invention relates to methods and apparatus for thermal cycling and monitoring biological reactions such as polymerase chain reactions.

도 1 은 본 발명의 개념에 따라 순환적 DNA 증폭에 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 열적 싸이클링 장치의 사시도이다.1 is a perspective view of a thermal cycling device of a biological sample that can be used for cyclic DNA amplification in accordance with the inventive concepts.

도 2 는 도 1 장치의 유체 챔버부위의 측면도이다.FIG. 2 is a side view of the fluid chamber portion of the device of FIG. 1. FIG.

도 3 은 도 1 에 도시된 장치의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.3 is an internal plan view of the fluid chamber portion of the apparatus shown in FIG.

도 4 는 본 발명의 또다른 구체예의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.4 is an interior plan view of a fluid chamber portion of another embodiment of the present invention.

도 5 는 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용하여 폴리메라제 연쇄반응에 대한 최적화된 시간대 온도 프로파일을 보여준다.5 shows an optimized time zone temperature profile for polymerase chain reaction using the thermal cycling device of the present invention.

도 6 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 어닐링 시간이 PCR 특이성 및 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.6 is a graph showing the effect of annealing time on PCR specificity and yield when using the thermal cycling device of the present invention.

도 7 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 변성 시간이 PCR 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.7 is a graph showing the effect of denaturation time on the PCR yield when using the thermal cycling device of the present invention.

도 8a 및 8b 는 본 발명의 또다른 구체예의 사시도와 단면도를 보여준다.8A and 8B show a perspective view and a cross sectional view of another embodiment of the present invention.

도 8c 는 도 8a 및 8b 에 도시된 구체예에서 생물학적 샘플을 담는 모세관 튜브와 열발생요소의 관계를 나타내는 다이아그램이다.FIG. 8C is a diagram showing the relationship between the capillary tube and the heat generating element in the embodiment shown in FIGS. 8A and 8B.

도 9a 는 4개의 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물(A-D)을 보여준다.9A shows the results of four different temperature / time profiles (A-D) and the amplification product (A-D) after 30 cycles.

도 9b 는 본 발명에 의해 사용된 또다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.9B shows another cycle of temperature / time profile used by the present invention.

도 9c-g 는 본 발명에서 사용되는 다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.9C-G show cycles of different temperature / time profiles used in the present invention.

도 10 은 본 발명에 따른 온도 기울기 제어회로의 블록선도이다.10 is a block diagram of a temperature gradient control circuit according to the present invention.

도 10a 는 생성물 변성온도로 부터 프라이머 어닐링온도로의 온도전이속도가 반응생성물 특이성에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.Figure 10a is a graph showing the effect of the temperature transfer rate from the product denaturation temperature to the primer annealing temperature on the reaction product specificity.

도 11 은 본 발명에 따라서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러의 개략도이다.11 is a schematic of a rapid temperature cycler for fluorescence detection in accordance with the present invention.

도 11a 는 도 11 의 장치의 작동을 보여주는 시간대 온도 차트이다.11A is a time zone temperature chart showing operation of the device of FIG. 11.

도 12 는 SYBR Green I 존재에서 헤파티스 B DNA의 증폭동안 시간, 온도 및 형광의 3차원 플롯이다.12 is a three-dimensional plot of time, temperature and fluorescence during amplification of Hepatis B DNA in the presence of SYBR Green I.

도 12a-c 는 3차원 플롯으로도 도시된 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광을 2차원 플롯으로 보여주는 차트이다.12A-C are charts showing time zone temperature, time zone fluorescence, and temperature band fluorescence, also shown in three-dimensional plots.

도 13 은 인간 β-글로블린 유전자의 536 베이스 쌍 조각에 대한 온도대 형광 투영도이다.FIG. 13 is a temperature band fluorescence projection of 536 base pair fragments of the human β-globulin gene. FIG.

도 14 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광대 싸이클 횟수 플롯이다.14 is a plot of the number of fluorescence cycle cycles obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 14a 는 상이한 초기 템플레이트 복제물 갯수를 표시하는 수치이다.14A is a numerical value representing the number of different initial template replicas.

도 15 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광비대 싸이클 횟수 플롯이다.15 is a plot of the number of fluorescence hypertrophy cycles obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 16 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.16 is a plot of temperature versus fluorescence ratio obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 17 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.17 is a plot of temperature versus fluorescence ratio obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 18a 는 평형 PCR 패러다임을 보여주는 그래프이다.18A is a graph showing the equilibrium PCR paradigm.

도 18b 는 동적 PCR 패러다임을 보여주는 그래프이다.18B is a graph showing the dynamic PCR paradigm.

도 18c 는 어닐링 온도 근처에서 상이한 시간/온도 프로파일을 보여주는 그래프이다.18C is a graph showing different time / temperature profiles near the annealing temperature.

도 19 는 샘플의 연속 모니터링을 위해 구성된 본 발명의 또다른 구체예를 보여준다.19 shows another embodiment of the invention configured for continuous monitoring of a sample.

도 19a-d 는 상이한 샘플 용기 구성을 보여준다.19A-D show different sample vessel configurations.

도 19e 는 도 19a-d 의 샘플용기구성이 샘플자체의 온도응답에 미치는 효과를 보여주는 차트이다.19E is a chart showing the effect of the sample container of FIGS. 19A-D on the temperature response of the sample itself.

도 19f, g 는 본 발명의 선호되는 샘플 용기의 측부 및 단부도면이다.19F, g are side and end views of a preferred sample container of the present invention.

도 19h, i 는 샘플의 형광을 탐지할 때 두가지 가능한 직사각 샘플튜브 방향을 보여준다.19H, i show two possible rectangular sample tube orientations when detecting fluorescence of the sample.

도 20 은 DNA 증폭동안 연속 모니터링을 제공하는 본 발명의 또다른 광학적 배치도이다.20 is another optical layout of the present invention that provides for continuous monitoring during DNA amplification.

도 21 은 샘플용기의 팁에서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러이다.21 is a rapid temperature cycler for fluorescence detection at the tip of a sample vessel.

도 21a-d 는 생물학적 샘플이 충진되는 복합 플라스틱/유리 용기를 보여준다.21A-D show composite plastic / glass containers filled with biological samples.

도 22 는 형광 교합 모니터링에 유용한 온도대 시간 세그멘트이다.22 is a temperature versus time segment useful for fluorescence occlusion monitoring.

도 22a 는 모세관 샘플용기의 측부보다 팁을 관찰함으로써 광 파이핑 효과를 보여주는 차트이다.22A is a chart showing the light piping effect by observing the tip from the side of the capillary sample container.

도 22b 는 두가지 상이한 크기의 모세관 샘플 튜브에 의한 광파이핑 효과를 보여주는 차트이다.22B is a chart showing the light piping effect by two different size capillary sample tubes.

도 22c 는 에피플루오데센스 탐지를 위한 신속한 온도 싸이클러를 포함하는 구체예에 의해서 수행되는 업무를 보여주는 고급 블록 선도이다.FIG. 22C is an advanced block diagram illustrating the tasks performed by an embodiment involving a rapid temperature cycler for epifluorescens detection.

도 22d 는 형광 피이드백이 반응 매개변수 조절에 사용된 PCR 반응동안 온도대 시간 플롯이다.22D is a plot of temperature versus time during a PCR reaction in which fluorescent feedback was used to adjust reaction parameters.

도 22e 는 형광 피이드백이 반응 매개변수 조절에 사용된 PCR 반응동안 형광대 시간 플롯이다.22E is a fluorescence band time plot during a PCR reaction in which fluorescent feedback was used to adjust reaction parameters.

도 23 은 온도와 형광간에 반비례 관계를 보여주는 형광대 시간 플롯이다.23 is a fluorescence band time plot showing an inverse relationship between temperature and fluorescence.

도 24 는 온도와 형광간에 반비례 관계를 보여주는 온도대 시간 플롯이다.24 is a temperature versus time plot showing the inverse relationship between temperature and fluorescence.

도 25 는 생성물 용융온도까지 초당 0.2도의 온도전이를 하는 동안 수득되는 SYBR Green I 존재하에서 3개의 상이한 PCR 생성물에 대한 형광대 온도 플롯이다.FIG. 25 is a fluorescence band temperature plot for three different PCR products in the presence of SYBR Green I obtained during a temperature transition of 0.2 degrees per second to the product melting temperature.

도 26 은 SYBR Green I의 존재하에서 상이한 농도의 PCR 생성물에 대해서 생성물 어닐링을 보여주는 형광대 시간 플롯이다.FIG. 26 is a fluorescence band time plot showing product annealing for different concentrations of PCR product in the presence of SYBR Green I.

도 27a, b 는 실행모드, 충진모드에서 도 28 에 도시된 구체예의 단면도이다.27A and 27B are cross-sectional views of the embodiment shown in FIG. 28 in a run mode and a fill mode.

도 28 은 샘플용기의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러이며 최적화된 탐지를 위해서 2차원으로 형광탐지를 시키는 본 발명의 또다른 구체예이다.FIG. 28 is another embodiment of the present invention wherein a rapid temperature cycler performs fluorescence detection at the tip of the sample vessel and fluorescence detection in two dimensions for optimized detection.

도 29 는 도 28 에 도시된 성분을 포함하는 본 발명 구체예의 외부에 대한 사시도이다.FIG. 29 is a perspective view of the exterior of an embodiment of the present invention including the components shown in FIG. 28.

도 30a-v 는 본 발명의 선호되는 구체예의 전기성분의 상세도이다.30A-V are detailed views of electrical components of preferred embodiments of the present invention.

도 31a, b 는 본 발명에 따른 샘플취급 시스템의 사시도 및 단면도이다.31A and 31B are a perspective view and a sectional view of a sample handling system according to the present invention.

도 32 는 다중 샘플 취급 트레이를 수용하는 또다른 구체예이다.32 is another embodiment of receiving multiple sample handling trays.

* 부호 설명* Code Description

10 ... 열적 싸이클링 장치 11 ... 챔버10 ... thermal cycling device 11 ... chamber

12 ... 제어기 13 ... 하우징12 ... controller 13 ... housing

14 ... 통기 도어 15 ... 하우징14 ... vent door 15 ... housing

16 ... 송풍기 장착 보오드 17 ... 솔레노이드 플랫포옴16 ... blower-mounted board 17 ... solenoid platform

18 ... 솔레노이드 19 ... 솔레노이드 전기자18 ... solenoid 19 ... solenoid armature

20 ... 로드 21 ... 상부단부20 ... Rod 21 ... Upper end

22 ... 스프링 23 ... 지지 포스트22 ... spring 23 ... support post

24 ... 전송 케이블 25 ... 입력키24 ... transmission cable 25 ... input key

26 ... 디스플레이 27 ... 샘플구획26 ... Display 27 ... Sample Section

28 ... 송풍기 29 ... 가열구획28 ... blower 29 ... heating compartment

30 ... 반응구획 31 ... 가열코일30 ... Reaction compartment 31 ... Heating coil

32 ... 배플 33 ... 배플32 ... baffles 33 ... baffles

34 ... 유체 복귀 구획 35 ... 열전쌍 센서34 ... fluid return compartment 35 ... thermocouple sensor

36 ... 입구 37 ... 출구36 ... entrance 37 ... exit

39 ... 가열구획 100 ... 장치39 ... Heating compartment 100 ... Unit

102 ... 하우징 104 ... 피트102 ... housing 104 ... feet

106 ... 브라켓 108 ... 모세관 튜브106 ... Bracket 108 ... Capillary Tube

110 ... 발포물 112 ... 램프110 ... foam 112 ... lamp

112A ... 램프 소켓 112B ... 지지부112 A ... lamp socket 112 B ... support

114 ... 하우징 입구 116 ... 팬114 ... housing opening 116 ... fan

118 ... 모터 122 ... 모터 샤프트118 ... motor 122 ... motor shaft

124 ... 패들 126 ... 챔버입구124 ... paddles 126 ... chamber inlet

128 ... 통기도어 129 ... 힌리128 ... Breathing Door 129 ... Hinri

130 ... 하우징 입구 132 ... 솔레노이드130 ... housing opening 132 ... solenoid

136 ... 경로 200 ... 열전쌍136 ... path 200 ... thermocouple

206 ... 집적회로 212 ... 회로206 ... integrated circuits 212 ... circuits

214 ... 전위차계 218 ... 연산 증폭기214 ... potentiometer 218 ... op amp

222 ... 회로 224, 226 ... 디지탈 아날로그 전환기222 ... circuits 224, 226 ... digital analog converter

230 ... 전위차계 236, 238, 244 ... 저상230 ... potentiometers 236, 238, 244 ... low phase

240 ... 합산회로 242, 246 ... 연산증폭기240 ... summing circuit 242, 246 ... operational amplifier

248 ... 트랜지스터 250 ... 공급원248 ... Transistor 250 ... Source

252, 256 ... 저장 254 ... 회로252, 256 ... storage 254 ... circuit

260 ... AC 전류원 262 ... 램프260 ... AC current source 262 ... Lamp

300 ... 온도싸이클너 302 ... 고온 공기원300 ... temperature cycler 302 ... hot air source

304 ... 저온공기원 306, 308 ... 나일론 튜브304 ... low temperature air source 306, 308 ... nylon tube

310 ... 샘플챔버 312 ... 통기구310 ... Sample chamber 312 ... Vent

314 ... 배출팬 316 ... 열전쌍314 ... drain pan 316 ... thermocouple

318 ... 샘플챔버팬 320 ... 모세관 튜브318 ... sample chamber pan 320 ... capillary tube

322 ... 카루셀 324 ... 스테핑 모터322 ... Carousel 324 ... Stepping Motor

326 ... 구동 모듈 328 ... 형광 활성화 소스326 ... drive module 328 ... fluorescence activated source

332 ... 유리 334 ... 혼채332 ... Glass 334 ... Mixed

336, 340 ... 평철 렌즈 338 ... 간섭 필터336, 340 ... flat iron lens 338 ... interference filter

342, 344 ... 실리카 윈도우 348 ... 필터342, 344 ... Silica Windows 348 ... Filters

350 ... 셔터 352 ... 셔터제어부350 ... shutter 352 ... shutter control unit

354 ... 비구면렌즈 356, 358 ... 필터354 ... Aspherical lenses 356, 358 ... Filters

360A, 360B ... 평철렌즈 362A, 362B ... 광 배증관360A, 360B ... flat iron lenses 362A, 362B ... optical doubling

364 ... 제어모듈 366A, 366B ... PMT 셔터364 ... control module 366A, 366B ... PMT shutter

400 ... 온도싸이클러 402, 404 ... 샘플홀터400 ... temperature cycler 402, 404 ... sample holter

403A ... 모세관 튜브 406, 412 ... 하우징403A ... capillary tube 406, 412 ... housing

408 ... 팬 420 ... 비구면 렌즈408 ... fan 420 ... aspherical lens

424 ... 필터 426 ... 광탐지기424 ... Filter 426 ... Photodetector

450 ... 샘플용기 451 ... 슬리이브450 ... Sample container 451 ... Sleeve

454 ... 조준렌즈 456A, B ... 필터454 ... Aiming lens 456A, B ... filter

458 ... 거울 459 ... 형광계 어셈블리458 ... Mirror 459 ... Fluorometer Assembly

466A, 466B ... 광탐지기 470 ... 구멍466A, 466B ... photodetector 470 ... hole

471 ... 배출 포트 472 ... 경로471 ... discharge port 472 ... path

474 ... 가열 카트리지 476 ... 배플474 ... heating cartridge 476 ... baffle

480 ... 카루셀 484 ... 기어480 ... Carousel 484 ... Gear

490 ... 하우징 494, 488 ... 모터490 ... housing 494, 488 ... motor

496, 486 ... 샤프트 498 ... 팬496, 486 ... shaft 498 ... fan

502 ... 온도 싸이클러 504 ... 모터502 ... temperature cycler 504 ... motor

506 ... 샤프트 514 ... 샘플용기506 ... shaft 514 ... sample container

518 ... 화살표518 ... arrows

본 발명의 목적은 생물학적 샘플의 온도를 정확히 조절하는 장치를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an apparatus for precisely controlling the temperature of a biological sample.

예정된 시간 대 온도 프로파일에 따라서 생물학적 샘플의 온도를 빠르고 정확하게 변화시키는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a thermocycling device that changes the temperature of a biological sample quickly and accurately in accordance with a predetermined time versus temperature profile.

다양한 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 적합한 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a device suitable for rapid thermal cycling of various biological samples.

매우 짧은 기간에 걸쳐 샘플이 큰 온도 그래디언트를 받게 할 수 있는 낮은 열량의 열전달 매체를 가지는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a thermocycling device having a low calorific heat transfer medium capable of subjecting a sample to a large temperature gradient over a very short period of time.

열전달 매체로서 공기를 사용하여 생물학적 샘플이 신속한 열 순환을 받게 하는 장치 제공도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide an apparatus for allowing a biological sample to undergo rapid thermal circulation using air as the heat transfer medium.

내부 히터를 사용하여 유체 챔버에 위치된 샘플을 가열하고 열순환에서 적절한 시기에 샘플을 냉각시키기 위해서 주변 유체를 챔버에 이동시켜 샘플을 냉각하는 열순환 장치 제공도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a thermocycling device that uses an internal heater to heat a sample located in the fluid chamber and to transfer the surrounding fluid to the chamber to cool the sample in order to cool the sample at a suitable time in the thermocycle.

PCR을 빠르게 수행하며 반응을 동시에 모니터링하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.It is another object of the present invention to provide a system and method for rapidly performing a PCR and simultaneously monitoring a reaction.

PCR을 빠르게 수행하며 반응을 연속으로 모니터링하고 반응이 진행되는 동안 반응 매개변수를 조절하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a system and method for rapidly performing PCR, continuously monitoring the reaction, and adjusting the reaction parameters during the reaction.

합성 핵산 유사체 또는 유도체, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)이 형광 화합물로 라벨링될 수 있다면 핵산 프로브는 상기 물질로 대체하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to replace nucleic acid probes with such substances if synthetic nucleic acid analogs or derivatives, such as peptide nucleic acids (PNAs), can be labeled with fluorescent compounds.

본 발명은 수많은 절차 또는 공정을 수행하기 위해서 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 특히 적합한 장치이다. 선호되는 예에서 장치는 생물학적 샘플 유지수단을 포함한다. 생물학적 샘플 유지수단 또는 샘플 챔버에는 열에너지 유지를 위한 절연수단과 샘플챔버 내부를 가열하는 수단이 제공된다. 특히 고출력 백열등이 샘플 챔버 내부를 가열하는 수단으로 기능을 한다. 열 절연체는 샘플 챔버 내부에 라이닝 되어서 샘플 챔버내에서 램프에 의해 발생되는 열을 유지하고 절연 수단으로서 작용한다.The present invention is a particularly suitable device for rapid thermal cycling of biological samples to perform a number of procedures or processes. In a preferred example, the device comprises biological sample holding means. The biological sample holding means or sample chamber is provided with insulating means for maintaining thermal energy and a means for heating the inside of the sample chamber. In particular, high power incandescent lamps function as a means of heating the inside of the sample chamber. The thermal insulator is lined inside the sample chamber to maintain the heat generated by the lamp in the sample chamber and to act as an insulating means.

샘플 챔버를 신속히 냉각하기 위해서, 장치는 공기를 샘플챔버에 강제 주입하는 수단과 샘플챔버에 주입된 공기를 분산시키는 수단을 포함한다. 고속팬이 공기를 샘플챔버에 주입하며 회전 패들이 공기를 챔버에 분산시키는 작용을 한다. 통기 수단은 샘플 챔버로 부터 공기를 빼내서 불필요한 열을 제거하는 수단이다. 본 발명은 샘플의 가열 및 냉각이 신속하고 균일하게 이루어질 수 있도록 한다.To rapidly cool the sample chamber, the apparatus includes means for forcing air into the sample chamber and means for dispersing the air injected into the sample chamber. The high speed fan injects air into the sample chamber and the rotary paddle serves to distribute the air into the chamber. The venting means is a means for removing unnecessary heat by bleeding air from the sample chamber. The present invention allows the heating and cooling of the sample to be done quickly and uniformly.

본 발명의 장치는 필요한 온도대 시간 프로파일을 통해서 장치를 작동시키는 제어수단을 포함한다. 본 발명은 자동화된 폴리메라제 연쇄반응을 수행하는데 특히 적합하다.The apparatus of the present invention includes control means for operating the apparatus through the required temperature versus time profile. The present invention is particularly suitable for carrying out the automated polymerase chain reaction.

본 발명의 제어기는 챔버와 샘플구획내에 위치된 샘플이 폴리메라제 연쇄반응에서 변성, 어닐링 및 신장단계에 해당하는 예정된 온도 싸이클을 받게 한다. 사용시, 본 발명의 장치는 시간 및 온도 측면에서 변성, 어닐링 및 신장단계의 신속한 최적화와 각 단계에서 온도간의 짧아진 기간(램프타임)을 허용한다.The controller of the present invention allows a sample located in the chamber and the sample compartment to undergo a predetermined temperature cycle corresponding to the denaturing, annealing and stretching steps in the polymerase chain reaction. In use, the apparatus of the present invention allows for rapid optimization of the denaturing, annealing and stretching steps in terms of time and temperature and a shorter period of time (lamp time) between temperatures in each step.

본 발명은 특이성 및 수율을 크게 증가시키면서 공지 기술의 열 순환 장치에 비해서 폴리메라제 연쇄반응의 완결에 필요한 총시간을 단축시킨다.The present invention shortens the total time required to complete the polymerase chain reaction as compared to the thermal cycling apparatus of the known art while greatly increasing the specificity and yield.

본 발명의 또다른 측면에 따르면 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링 장치 및 방법을 제공한다. 선호되는 구체예에서 다양한 형광 기술에 의해서 DNA 증폭을 연속 모니터링 하기 위해서 신속한 온도 순환을 제공하는 구조와 광학적 성분이 조합된다. 유리 모세관 샘플 튜브와 복합 플라스틱/유리샘플 튜브가 공기로 부터 신속한 열전달(15분 미만에서 30싸이클)과 반응의 동시적 광학모니터링을 허용한다. 회전체상의 단일 샘플 또는 다중샘플로 부터 형광이 연속으로 수득되며 모든 샘플은 동시에 신속한 열순환을 받는다.According to another aspect of the present invention, there is provided an apparatus and method for continuous fluorescence monitoring of DNA amplification. In preferred embodiments, the structure and optical components are combined to provide rapid temperature cycling for continuous monitoring of DNA amplification by various fluorescence techniques. Glass capillary sample tubes and composite plastic / glass sample tubes allow for rapid heat transfer from air (30 cycles in less than 15 minutes) and simultaneous optical monitoring of the reaction. Fluorescence is obtained continuously from a single sample or multiple samples on the rotor and all samples are subjected to rapid thermal cycling at the same time.

본 발명의 또다른 측면에 따르면 반응이 진행되는 과정을 모니터링하는데 광학 기술이 사용된다. 선호되는 구체예에서 형광 프로브가 반응혼합물에 첨가된다. 본 발명은 이후에 온도전이동안 적어도 한 번 형광을 모니터링하며, 특히 단일샘플 또는 다중샘플로 부터 온도전이동안 2회이상 형광이 수득된다. 선호되는 구체예에서 샘플을 순차적으로 모니터링 지점에 이동시키기 위해서 회전 카루셀이 포함되며 모든 샘플은 동시에 신속한 열 싸이클링을 받는다. 본 발명은 증폭싸이클마다 한 번 형광을 모니터링 하며 각 증폭싸이클내내 온도, 시간 및 형광을 연속 모니터링한다.According to another aspect of the invention, optical techniques are used to monitor the progress of the reaction. In a preferred embodiment a fluorescent probe is added to the reaction mixture. The invention then monitors the fluorescence at least once during the temperature transition, in particular fluorescence is obtained twice or more during the temperature transition from a single sample or multiple samples. In a preferred embodiment a rotating carousel is included to move the samples sequentially to the monitoring point and all samples are subjected to rapid thermal cycling at the same time. The present invention monitors fluorescence once per amplification cycle and continuously monitors temperature, time and fluorescence throughout each amplification cycle.

본 발명을 사용하여 온도, 시간 및 형광에 대한 3차원 플롯이 획득될 수 있다. 교합 프로브의 형광대 온도 플롯은 엑소누클레아제 절단의 누적적이고 비가역적인 신호와 인접한 프로브의 온도종속적 가역적 교합을 구별해준다. 교합 프로브는 형광이 온도 종속성 때문에 가수분해 프로브보다 유용하며 생성물 서열의 변화, 예컨대 다형성 및 돌연변이를 탐지하는데 사용될 수 있다. 이중쇄 DNA의 존재하에서 형광하는 염료를 사용하여 생성물 변성, 재어닐링 및 신장이 각 싸이클내에서 추구될 수 있다. 본 발명은 15분이내, 특히 10분이내에 반응의 분석 및 정량을 조합하는 DNA 증폭반응을 신속히 수행하는 장치 및 방법을 제공한다.Using the present invention, three-dimensional plots for temperature, time and fluorescence can be obtained. Fluorescent band temperature plots of occlusal probes distinguish between cumulative and irreversible signals of exonuclease cleavage from temperature dependent reversible occlusion of adjacent probes. Occlusal probes are more useful than hydrolysis probes because of their temperature dependence and can be used to detect changes in product sequence, such as polymorphisms and mutations. Product denaturation, reannealing and stretching can be pursued within each cycle using dyes that fluoresce in the presence of double stranded DNA. The present invention provides an apparatus and method for rapidly performing DNA amplification reactions that combine analysis and quantification of reactions within 15 minutes, in particular within 10 minutes.

도 1 에서 열적 싸이클링 장치(10)는 통기도어(14)를 통해 순환되며 샘플을 수용하는 폐쇄루우프 유체(특히 공기)챔버(11)를 포함한다. 폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 복수의 구획을 포함한다. 장치(10)는 입력키(25) 및 디스플레이(26)를 수단으로 프로그램될 수 있는 제어기(12)를 포함하여서 예정된 기간에 걸쳐서 일련의 온도를 통해 챔버(11)가 싸이클링 받을 수 있다. 챔버(11)의 열적 싸이클링은 여러 절차를 수행하는데 사용되며 특히 샘플 함유 반응 혼합물로 부터 프라이머 특이성 DNA의 증폭에 적합하다.The thermal cycling device 10 in FIG. 1 comprises a closed loop fluid (particularly air) chamber 11 which is circulated through the ventilator 14 and contains a sample. The closed loop fluid chamber 11 includes a plurality of compartments. The device 10 can include a controller 12 that can be programmed by means of an input key 25 and a display 26 so that the chamber 11 can be cycled through a series of temperatures over a predetermined period of time. Thermal cycling of chamber 11 is used to perform several procedures and is particularly suitable for amplification of primer specific DNA from sample containing reaction mixtures.

폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 박스형태로 하우징(13)에 의해 에워싸인다. 필요하다면 송풍기 장착 보오드(16)가 챔버(11)의 직사각형 섹션을 구획하고 거기에 실린더형 하부 하우징(15)을 지탱 및 고정하도록 위치될 수 있다. 혹은, 송풍기(28)의 팬이 챔버 하우징(13)내에 일체로 수용될 수 있다.The closed loop fluid chamber 11 is surrounded by the housing 13 in the form of a box. If necessary, a blower mounted board 16 may be positioned to partition the rectangular section of the chamber 11 and to support and secure the cylindrical lower housing 15 therein. Alternatively, the fan of the blower 28 may be integrally housed in the chamber housing 13.

송풍기 하우징(15)의 내부는 날개와 샤프트를 포함한다. 송풍기 모터(도시안된)는 송풍기 하우징(15) 외부, 챔버(11) 외부에 위치된다. 이러한 구성에서 날개와 샤프트는 챔버(11)내에서 순환하는 고온 유체에 노출되는 송풍기의 부분이다. 모터에 온도변화를 주며 가열 및 냉각을 겪는 챔버에 모터의 열량을 첨가시키는 챔버내 모터 장착은 단점이 된다. 챔버(11)에서 유체에 노출된 열량의 감소는 예정된 시간대 온도 프로파일을 샘플이 받게하는 기능에 있어서 장치(10)의 전체 성능에 중요하다.The interior of the blower housing 15 includes a wing and a shaft. The blower motor (not shown) is located outside the blower housing 15 and outside the chamber 11. In this configuration the vanes and shafts are part of the blower that is exposed to the hot fluid circulating in the chamber 11. Mounting a motor in a chamber that changes the temperature of the motor and adds the heat of the motor to the chamber undergoing heating and cooling is a disadvantage. The reduction in the amount of heat exposed to the fluid in the chamber 11 is important for the overall performance of the device 10 in its ability to receive a predetermined time zone temperature profile.

송풍기(28)는 낮은 열량의 프로펠러형 팬 또는 다람쥐장 형태의 팬을 사용하는 "인 라인"형 송풍기이며 팬은 분당 75세제곱피트의 최소 용량을 가진다.Blower 28 is an "in-line" blower that uses a low calorie propeller fan or squirrel field fan and the fan has a minimum capacity of 75 cubic feet per minute.

솔레노이드 플랫포옴(17)은 솔레노이드(18)를 고정시킨다. 솔레노이드 전기자(19)는 통기 도어(14)에 부착되며 통기 도어(14) 상하 지점에서 하우징(13)에 회전가능하게 부착되는 로드(20)의 상부단부에 부착된다. 그러므로 로드(20)는 통기 도어(14)를 로드의 종축 주위로 하우징(13)에 대해서 자유 회전시킬 수 있다.Solenoid platform 17 secures solenoid 18. The solenoid armature 19 is attached to the vent door 14 and attached to the upper end of the rod 20 which is rotatably attached to the housing 13 at the upper and lower points of the vent door 14. The rod 20 can therefore freely rotate the vent door 14 about the housing 13 about the longitudinal axis of the rod.

스프링(22)은 지지 포스트(23)에 의해서 한 단부에서 하우징(13)에 부착된다. 스프링(22)의 반대단부는 솔레노이드 전기자(19) 부착부에 인접한 로드(20)의 상부단부(21)에 부착된다. 스프링(22)은 두 부착점 사이에서 인장된다. 그러므로 스프링(22)은 지지포스트(23)쪽으로 상부 단부(21)를 당겨서 통기 도어(14)를 폐쇄 위치로 회전시킨다. 솔레노이드(18)가 활성화될 때 전기자(19)는 로드(20)의 상부단부(21)를 스프링(22) 당김 방향과 반대인 솔레노이드(18) 방향으로 당겨서 통기 도어(14)를 개방시킨다.The spring 22 is attached to the housing 13 at one end by a support post 23. The opposite end of the spring 22 is attached to the upper end 21 of the rod 20 adjacent the solenoid armature 19 attachment. The spring 22 is tensioned between two attachment points. The spring 22 thus rotates the vent door 14 to the closed position by pulling the upper end 21 towards the support post 23. When the solenoid 18 is activated, the armature 19 opens the vent door 14 by pulling the upper end 21 of the rod 20 in the direction of the solenoid 18 opposite to the spring 22 pulling direction.

제어기(12)는 전송 케이블(24)에 의해 챔버(11)에 전기적으로 부착된다. 케이블(24)은 송풍기 모터(도시안된)와 가열코일(31)에 전력을 공급하기도 한다. 게다가, 제어기(12)는 온도 데이타에 해당하는 신호를 수신하는 열전쌍 센서(35)와 솔레노이드 전기자를 활성화시키는 솔레노이드(18)에 연결된다.The controller 12 is electrically attached to the chamber 11 by a transmission cable 24. The cable 24 also supplies power to the blower motor (not shown) and the heating coil 31. In addition, the controller 12 is connected to a thermocouple sensor 35 for receiving a signal corresponding to temperature data and a solenoid 18 for activating the solenoid armature.

제어기(12)는 챔버(11)내에서 시간의 함수로서 예정된 온도를 달성하도록 가열코일(31), 통기도어(14), 및 송풍기를 조절하도록 프로그램되며 예정된 기간과 챔버온도에서 솔레노이드를 구동하는 릴레이 출력을 활성화시키도록 프로그램될 수 있는 공지형태의 온도 제어기일 수 있다. 도 1-3 의 구체예에서 사용하는 온도 제어기(12)는 Omega Engineering Inc.(Stanford, Connecticut)로 부터 모델번호 CN8600 프로세스 컨트롤러로 구매가능한 Partlow MIC-6000 비율 온도 제어기이다.The controller 12 is programmed to regulate the heating coil 31, the ventilator 14, and the blower to achieve a predetermined temperature as a function of time in the chamber 11 and to relay the solenoid at the predetermined time and chamber temperature. It may be a known temperature controller that can be programmed to activate the output. The temperature controller 12 used in the embodiments of FIGS. 1-3 is a Partlow MIC-6000 ratio temperature controller available as model number CN8600 process controller from Omega Engineering Inc. (Stanford, Connecticut).

도 2 및 도 3 에서, 챔버(11)의 내부는 4개의 주요 구획으로 나뉘어진다. 송풍기 구획(28)은 송풍기 하우징(15) 및 송풍기 장착판(16)으로 구성된다. 송풍기 구획(28) 전체는 팬과 샤프트로 채워진다. 송풍기는 공지된 디자인을 가진다. 송풍기 구획(26)에 위치된 팬은 유체를 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)안으로 들여보내고 출구(37)를 통해 유체를 내보낸다.2 and 3, the interior of the chamber 11 is divided into four main compartments. The blower section 28 consists of a blower housing 15 and a blower mounting plate 16. The entire blower section 28 is filled with a fan and a shaft. The blower has a known design. A fan located in blower compartment 26 introduces fluid through inlet 36 into blower compartment 28 and delivers fluid through outlet 37.

유체는 송풍기에 의해 분당 75세제곱 피트 이상의 속도로 흐를 수 있다. 그러나, 본 발명에서 중요한 점은 챔버(11)에 위치된 유체가 송풍기의 팬과 구동 샤프트 부분만을 접촉하며 송풍기 모터 자체는 송풍기 하우징(15)밖에 위치되어서 챔버(11)의 유체와의 접촉이 방지된다는 것이다. 싸이클링 과정동안 가열 또는 냉각되어야 하는 재료의 열량을 최소화하기 위해서 챔버(11) 내부에서 유체와 접촉하는 재료를 최소화 하는 것이 본 발명의 작동속도에 중요하다. 유체에 의해서 가열 또는 냉각되어야 하는 열량을 최소화 함으로써 챔버(11) 내용물을 균일한 온도가 되게 하는데 필요한 응답시간이 크게 단축된다.The fluid can be flowed by the blower at a speed of at least 75 cubic feet per minute. However, it is important in the present invention that the fluid located in the chamber 11 contacts only the fan and drive shaft portion of the blower and the blower motor itself is located outside the blower housing 15 to prevent contact with the fluid in the chamber 11. It is. It is important to the operating speed of the present invention to minimize the material in contact with the fluid inside the chamber 11 to minimize the amount of heat of the material that must be heated or cooled during the cycling process. By minimizing the amount of heat that must be heated or cooled by the fluid, the response time required to bring the contents of the chamber 11 to a uniform temperature is greatly shortened.

출구(37)를 통해 송풍기 구획(28)을 빠져나가는 유체는 가열구획(29)에 들어온다. 가열구획(29)으로 들어온 유체는 가열 코일(31)을 통과한다. 가열 코일(31)이 가열구획(29)에 들어오는 유체보다 뜨거워진다면 유체는 이 구획을 통과할 때 가열된다. 가열코일은 마이크로서포트 주위에 감긴 1000와트(125VAC) 니크롬선 코일이다. 그러나 챔버에 존재하는 유체의 가열에 적합한 모든 가열 유닛이 사용될 수 있다. 도 1-3 의 가열코일은 Johnstone Supply (Portland, Oregon)에 의해 제조된다.Fluid exiting blower section 28 through outlet 37 enters heating compartment 29. The fluid entering the heating compartment 29 passes through the heating coil 31. If the heating coil 31 is hotter than the fluid entering the heating compartment 29, the fluid is heated as it passes through this compartment. The heating coil is a 1000 watt (125 VAC) nichrome wire coil wound around the micro support. However, any heating unit suitable for heating the fluid present in the chamber can be used. The heating coils of FIGS. 1-3 are manufactured by Johnstone Supply (Portland, Oregon).

가열코일은 제어기(12)에 포함된 출력 릴레이에 의해 활성화된다. 선호되는 릴레이는 Omega Engineering Inc. (Stanford, Connecticut)에 의해 모델번호 Omega SSR 240 D25로 제조되는 25A, 125VAC 고체상태 릴레이이다.The heating coil is activated by an output relay included in the controller 12. Preferred relays are Omega Engineering Inc. A 25A, 125VAC solid state relay manufactured by Model Number Omega SSR 240 D25 by Stanford, Connecticut.

가열구획(29)을 통과하는 유체는 반응구획(30)에 통과하기 전에 배플(32, 33)에 충돌한다. 배플(32, 33)은 층흐름 유체를 파괴하여 교란을 일으켜서 균질온도에서 반응구획(30)에 도달하도록 유체를 효과적으로 혼합한다.Fluid passing through the heating compartment 29 impinges on the baffles 32 and 33 before passing through the reaction compartment 30. The baffles 32 and 33 destroy the laminar fluid and cause disturbances to effectively mix the fluid to reach the reaction compartment 30 at a homogeneous temperature.

열전쌍 센서(35)는 반응구획(30)에서 유체온도에 대응하는 전기적 입력신호를 제어기(12)에 제공한다. 열 싸이클링 장치(10)의 작동동안 온도 모니터링은 30-게이지 철-콘스탄탄 "J-형" 열전쌍으로 이루어진다. 제어기는 이 정보를 사용하여 프로그램된 시간대 온도 프로파일에 따라 가열 코일(31)을 제어하고 솔레노이드(18)를 활성화시킨다.The thermocouple sensor 35 provides the controller 12 with an electrical input signal corresponding to the fluid temperature in the reaction compartment 30. Temperature monitoring during operation of the thermal cycling device 10 consists of a 30-gauge iron-constantan "J-type" thermocouple. The controller uses this information to control the heating coil 31 and to activate the solenoid 18 according to the programmed time zone temperature profile.

반응구획(30)으로 부터 복귀 공기 구획(34)으로 통과하는 유체는 샘플 구획(27)(점선으로 도시된)을 통과한다.Fluid passing from reaction compartment 30 to return air compartment 34 passes through sample compartment 27 (shown in dashed lines).

유체 복귀 구획(34)은 샘플구획(27)에 위치된 샘플로의 열전달 때문에 약간 냉각된다. 유체 복귀 구획(34)의 유체는 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)으로 흐르고 팬의 작용에 의해 출구(37)를 통해 가열구획(39)으로 흐른다. 따라서, 통기 도어(14)가 폐쇄될 때 유체챔버(11)는 각 구획을 통해 폐쇄된 루우프 경로를 따라 유체를 연속으로 재순환시켜서 내용물이 균일한 온도가 되게 하는 폐쇄된 루우프 유체 챔버이다. 공기 챔버(11)에서 공기의 연속 순환은 샘플구획(27)내 샘플이 가능한 빨리 예정된 온도가 되게 하며 이 온도로 유지될 수 있게 한다.The fluid return section 34 is slightly cooled due to heat transfer to the sample located in the sample compartment 27. Fluid in the fluid return section 34 flows through the inlet 36 to the blower section 28 and through the outlet 37 to the heating compartment 39 by the action of a fan. Thus, when the vent door 14 is closed, the fluid chamber 11 is a closed loop fluid chamber that continuously recycles the fluid along the closed loop path through each compartment to bring the contents to a uniform temperature. Continuous circulation of air in the air chamber 11 allows the sample in the sample compartment 27 to be brought to a predetermined temperature as quickly as possible and maintained at this temperature.

장치(10)가 반응구획(27)에 위치된 재료를 주변유체(공기)온도 이상의 온도로 가능한 빨리 가열해서 냉각시키는데 사용될 때 제어기(12)는 통기 도어(14)를 개방시켜 많은 양의 주변유체를 가열된 유체가 탈출하는 동안 구획(11)에서 범람시키도록 솔레노이드(18)를 작동시키도록 프로그램될 수 있다.When the device 10 is used to heat and cool the material located in the reaction compartment 27 to a temperature above the ambient fluid (air) temperature as quickly as possible, the controller 12 opens the vent door 14 to open a large amount of ambient fluid. The solenoid 18 can be programmed to flood the compartment 11 during the escape of the heated fluid.

통기도어(14)를 개방시켜 송풍기를 연속으로 활성화시키는 동안 가열 코일(31)을 활성제거하면 주변유체가 복귀 구획(34) 및 송풍기 구획(28)으로 흐른다. 송풍기는 주변유체를 가열구획(29)으로 흐르게 하고 코일(31)에 의해 가열됨이 없이 반응구획(30)으로 직접 통과시킨다. 주변유체는 이후에 샘플구획(27)을 통과하고 통기 도어(14)를 통해 챔버(11) 밖으로 탈출한다. 챔버(11)에 위치된 재료의 최소의 열량과 송풍기 팬의 작용으로 인하여 많은 양의 주변유체가 샘플구획(27)을 통과하고 챔버(11) 밖으로 나온다. 따라서, 반응 구획(27)에 위치된 샘플 또는 재료의 신속한 냉각이 이루어진다.Deactivation of the heating coil 31 during opening of the ventilator 14 to continuously activate the blower causes the surrounding fluid to flow into the return compartment 34 and the blower compartment 28. The blower causes the surrounding fluid to flow into the heating compartment 29 and passes directly to the reaction compartment 30 without being heated by the coil 31. The peripheral fluid then passes through the sample compartment 27 and escapes out of the chamber 11 through the vent door 14. Due to the minimum amount of heat of the material located in the chamber 11 and the action of the blower fan, a large amount of surrounding fluid passes through the sample compartment 27 and exits the chamber 11. Thus, rapid cooling of the sample or material located in the reaction compartment 27 is achieved.

샘플구획(27)은 샘플을 담은 길쭉한 중공 유리 튜브와 같은 복수의 샘플이 이격된 방향에 쉽게 위치되도록 하는 크기를 가져서 유체가 각 샘플 주위에 균일하게 통과할 수 있다. 필요하다면 샘플구획(27)은 균일한 간격으로 복수의 샘플을 수용하여서 샘플챔버(27)에 샘플충진을 단순화시키도록 구성된 랙 또는 바스켓의 삽입을 허용하는 크기와 모양을 가질 수 있다.The sample compartment 27 is sized such that a plurality of samples, such as elongated hollow glass tubes containing samples, are easily located in the spaced apart direction so that fluid can pass evenly around each sample. If desired, the sample compartment 27 may be sized and shaped to accommodate insertion of a plurality of samples at uniform intervals to allow the insertion of racks or baskets configured to simplify sample filling in the sample chamber 27.

샘플구획(27)으로의 접근은 통기도어(14)를 개방위치까지 회전시켜 이루어진다. 통기도어(14)가 폐쇄위치로 부터 90도만큼 회전된다면 샘플구획(27)에 쉽게 접근할 수 있다. 또한, 폐쇄위치로 부터 통기도어(14)의 90도 회전은 복귀유체 구획(34)을 반응 구획(30)으로 부터 폐쇄시킨다. 따라서 본 발명의 장치(10)가 "냉각"모드에 있을 때 주변유체가 복귀유체구획(34)으로 직접 들어오고 폐쇄 루우프 유체 흐름 경로와 동일한 경로를 따라 송풍기 구획(28), 가열구획(29), 반응구획(30) 및 샘플구획(28)으로 흐른다. 이후에 유체는 공기챔버(11) 밖으로 나와 샘플구획(27)과 복귀 유체 구획(34) 사이에 통기도어(14)의 위치 선정에 의해 공기 복귀 구획(34)으로 복귀하는 것을 방지한다.Access to the sample compartment 27 is made by rotating the ventilator 14 to the open position. If the ventilator 14 is rotated 90 degrees from the closed position, the sample compartment 27 can be easily accessed. In addition, a 90 degree rotation of the ventilator 14 from the closed position closes the return fluid compartment 34 from the reaction compartment 30. Thus, when the apparatus 10 of the present invention is in the "cooling" mode, the peripheral fluid directly enters the return fluid compartment 34 and follows the same path as the closed loop fluid flow path, the blower compartment 28 and the heating compartment 29. , Flows into the reaction compartment 30 and the sample compartment 28. The fluid then exits the air chamber 11 and prevents return to the air return section 34 by positioning the ventilator 14 between the sample compartment 27 and the return fluid section 34.

따라서, 통기도어(14)는 주변유체를 챔버(11)에 들어오게 할뿐만 아니라 챔버(11)를 통해 유체가 루우프 형태로 재순환 하는 것을 방지할 수 있다. 대신에, 유체는 샘플구획(27)을 통과하고 이후에 챔버(11) 밖으로 나와서 샘플 내용물과 챔버(11)의 신속한 냉각을 돕는다.Thus, the ventilator 14 may not only allow the surrounding fluid to enter the chamber 11 but also prevent the fluid from being recycled to the loop through the chamber 11. Instead, the fluid passes through the sample compartment 27 and then exits the chamber 11 to aid in rapid cooling of the sample contents and the chamber 11.

본 발명의 장치(10)가 순환적 DNA 증폭에 사용될 때 시간대 온도 프로파일을 통한 반복적 순환이 필요하다. PCR동안 반응 혼합물 함유 샘플은 증폭과정의 변성, 어닐링 및 신장 단계에 대응하는 시간대 온도 프로파일을 통해 약 30회 순환되어야 한다.When the device 10 of the present invention is used for cyclic DNA amplification, iterative circulation through a time zone temperature profile is required. During PCR, the sample containing the reaction mixture should be cycled about 30 times through a time zone temperature profile corresponding to the denaturation, annealing and stretching steps of the amplification process.

본 발명의 장치(10)는 낮은 열량으로 인하여 공지기술에 비해서 단축된 시간대 온도 프로파일을 통해서 샘플을 싸이클링 받게할 수 있다. 도 1-3 구체예의 DNA 증폭응용은 30-60초후에 시간대 온도 프로파일 싸이클을 통과한다(도 5). 공지기술 사용시 동일한 싸이클은 5-10배 더 오래 걸린다. 이러한 낮은 싸이클 시간은 공지기술의 싸이클링에 비해서 PCR의 수율 및 특이성을 증가시켰다.The device 10 of the present invention is able to cycle the sample through a shorter time zone temperature profile compared to the known art due to the low calories. The DNA amplification application of the Figures 1-3 embodiment passes through a time zone temperature profile cycle after 30-60 seconds (Figure 5). The same cycle takes 5-10 times longer with the known art. This low cycle time increased the yield and specificity of PCR as compared to the cycling of the prior art.

실시예 1Example 1

폴리메라제 연쇄반응이 50ng DNA 템플레이트, 0.5㎃ 데옥시누클레오타이드, 500nM 올리고누클레오타이드 프라이머가 50mM Tris-HCl(25℃에서 pH 8.5), 3.0mM 염화마그네슘, 20mM HCl 및 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민으로 구성된 반응 버퍼에 들어있는 10㎕ 부피에서 수행된다. 내열성 폴리메라제 (Tag 폴리메라제 0/4 유닛 - Stratagene)가 첨가되고 샘플이 8㎝ 길이의 얇은 벽 모세관 튜브(Kimble, Kimax 46485-1)에 담기고 튜브의 양 단부에 공기방울이 존재하도록 단부가 실험실 가스버너로 융합된다.Polymerase Chain Reaction with 50ng DNA Template, 0.5kO Deoxynucleotide, 500nM Oligonucleotide Primer with 50mM Tris-HCl (pH 8.5 at 25 ° C), 3.0mM Magnesium Chloride, 20mM HCl and 500µg / ml Bovine This is done in a 10 μl volume contained in the reaction buffer consisting of serum albumin. Heat-resistant polymerase (Tag polymerase 0/4 unit-Stratagene) is added and the sample is immersed in an 8 cm long thin wall capillary tube (Kimble, Kimax 46485-1) and ends with air bubbles at both ends of the tube. Is fused to a laboratory gas burner.

이후에 모세관 튜브는 1㎜ 두께의 "사전 펀칭된 보오드"로 구성된 홀더(Radio Shack에 의해 제조)에 수직으로 놓인다. 혼합물은 도 5 의 시간대 온도 프로파일에 표시된 시간동안 30회 변성(90-92℃), 어닐링(50-55℃), 및 신장(72-75℃)된다. 10㎕ 탈이온수에 놓이고 열전쌍 모니터(BAT-12, Sensortek)에 연결된 소형 열전쌍(IT-23, Sensortek, Clifton, NJ)을 써서 모세관 튜브의 온도 모니터링이 수행된다. 증폭 생성물은 1.5% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분별된다. 양호한 결과가 수득되었다.The capillary tube is then placed perpendicular to a holder (manufactured by Radio Shack) consisting of a 1 mm thick "pre-punched board". The mixture is denatured (90-92 ° C.), annealed (50-55 ° C.), and stretched (72-75 ° C.) 30 times for the time indicated in the time zone temperature profile of FIG. 5. Temperature monitoring of capillary tubes is performed using a small thermocouple (IT-23, Sensortek, Clifton, NJ) placed in 10 μl deionized water and connected to a thermocouple monitor (BAT-12, Sensortek). Amplification products are fractionated by electrophoresis on 1.5% agarose gel. Good results were obtained.

본 발명의 장치(10)가 열전달 매체로서 물대신에 공기를 순환시키기 때문에 빠르게 데워질 수 있는 저열량 매체(공기)를 통해 열전달이 이루어지는 장점이 있다.Since the device 10 of the present invention circulates air instead of water as a heat transfer medium, there is an advantage that heat transfer is performed through a low calorie medium (air) that can be quickly warmed up.

샘플냉각 응답시간을 공지 공정에서 사용된 플라스틱 마이크로 튜브대신에 샘플유지에 얇은벽 유리 모세관 튜브를 사용하고 챔버(11) 내부의 재료의 열량을 최소화함으로써 매우 빠르다(도 5). 이러한 응답시간은 시간 및 온도 측면에서 폴리메라제 연쇄반응의 변성, 어닐링 및 신장 단계의 최적화를 허용한다.The sample cooling response time is very fast by using thin-walled glass capillary tubes for sample holding instead of the plastic microtubes used in known processes and minimizing the heat content of the material inside the chamber 11 (FIG. 5). This response time allows optimization of the denaturation, annealing and stretching steps of the polymerase chain reaction in terms of time and temperature.

게다가, 단축된 "램프"시간이 획득된다. 즉, 샘플의 온도는 한 온도 수준에서 다음 온도 수준이 되게 하는데 필요한 시간이 단축된다. 이것은 완전한 증폭에 필요한 시간을 감소시키고 폴리메라제 연쇄반응 프로토콜내에서 어닐링, 변성 및 효소반응의 특이성 연구를 허용한다.In addition, a shortened "lamp" time is obtained. In other words, the temperature of the sample is shortened to bring the temperature from one temperature level to the next. This reduces the time required for complete amplification and allows for the study of specificity of annealing, denaturation and enzymatic reaction within the polymerase chain reaction protocol.

필요시 샘플구획(27)내에서 적당한 온도 균일성을 달성하는데 배플(32, 33)이 사용될 수 있다. 배플(32, 33)은 반응 구획(30)의 온도 변화를 10℃에서 2℃로 감소시킨다. 필요시 반응구획(30)의 온도변화를 더욱 감소시키기 위해서 추가 배플이 사용될 수 있다. 혹은, 도 4 에 도시된 바와 같이 팬이 가열 코일(31)의 하류, 샘플구획(27)앞에 위치되어서 더욱 균일한 혼합을 할 수 있다.If desired, baffles 32 and 33 can be used to achieve adequate temperature uniformity within the sample compartment 27. The baffles 32 and 33 reduce the temperature change in the reaction compartment 30 from 10 ° C to 2 ° C. If necessary, an additional baffle may be used to further reduce the temperature change of the reaction compartment 30. Alternatively, as shown in FIG. 4, a fan may be located downstream of the heating coil 31 and in front of the sample compartment 27 to allow more uniform mixing.

장치(10)의 사용을 통해 수득된 증폭 생성물은 수동 수조 싸이클링 방법을 통해서 수득된 것과 정량적 및 정성적으로 유사하다. 그러나, 특이성 및 수율에서 향상과 반응 혼합물의 신속한 열제어가 가능하다. 도 6 은 본 발명의 열순환 장치(10)를 사용할 때 도 5 의 시간대 온도 프로파일의 변성 시간 변화가 DNA 증폭 수율에 미치는 효과를 보여준다. 밝은 수직 라인은 변성 온도에서 특정 시간에 대응한다. 수율은 변성시간이 짧을수록 크다. 이러한 신속한 응답은 공지 시스템으로는 불가능하다.The amplification products obtained through the use of the apparatus 10 are quantitatively and qualitatively similar to those obtained through the manual water tank cycling method. However, improvements in specificity and yield and rapid thermal control of the reaction mixture are possible. 6 shows the effect of the denaturation time change of the time zone temperature profile of FIG. 5 on the DNA amplification yield when using the thermocycling apparatus 10 of the present invention. Bright vertical lines correspond to specific times at denaturing temperatures. The yield is larger the shorter the denaturation time. This quick response is not possible with known systems.

도 7 은 열순환 장치(10) 사용시 도 5 의 시간대 온도 프로파일이 특이성에 미치는 효과를 보여준다(즉, 복수의 유사한 또는 "새도우" 생성물에 대응하는 특이성 생성물 수율). 램프 및 어닐링 시간이 짧을수록 생성물 특이성은 크다. 장치(10)의 신속한 온도 응답은 공지 시스템으로는 불가능한 특이성 및 수율향상을 가져왔다.FIG. 7 shows the effect of the time zone temperature profile of FIG. 5 on specificity when using thermocycling device 10 (ie, specific product yield corresponding to a plurality of similar or “shadow” products). The shorter the ramp and annealing time, the greater the product specificity. The rapid temperature response of the device 10 has resulted in specificity and yield improvements that are not possible with known systems.

장치(10)의 열용량을 감소시킴으로써 본 발명은 폴리메라제 연쇄반응에 필요한 총시간을 크게 감소시킬 수 있다. 추가로, 적은 샘플의 사용은 최대 90%까지 사용되어야 하는 값비싼 시약의 양을 감소시켜서 본 발명을 사용하여 절차를 수행하는 비용을 절감시킨다. 예컨대, 0.25 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수 있다. 어떤 경우에 0.02 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수도 있다.By reducing the heat capacity of the device 10, the present invention can greatly reduce the total time required for the polymerase chain reaction. In addition, the use of fewer samples reduces the amount of expensive reagents that must be used by up to 90%, thereby reducing the cost of performing the procedure using the present invention. For example, a capillary tube 108 with an inner diameter of 0.25 to 1.0 mm can be used. In some cases a capillary tube 108 with an inner diameter of 0.02 to 1.0 mm may be used.

본 발명의 장치(10)는 임의의 소스로 부터 DNA를 증폭하는데 유용하다.The device 10 of the present invention is useful for amplifying DNA from any source.

본 발명의 또다른 구체예가 도 8a-c 에 나타난다. 도 8a 는 사시도이고 도 8b 는 단면도이다. 도 8a-c 에서 열발생 요소는 생물학적 샘플 용기에 인접하여서 생물학적 샘플의 가열 및 냉각 시간을 더 빠르게 한다.Another embodiment of the present invention is shown in Figures 8A-C. 8A is a perspective view and FIG. 8B is a sectional view. The heat generating elements in FIGS. 8A-C adjoin the biological sample vessel to speed up the heating and cooling time of the biological sample.

도 8a-c 의 장치는 열순환이 수행되는 속도에 있어서 공지 기술에 비해 귀다한 진보를 제공한다. 즉, 30, 15, 10 내지 5분 이내에 DNA 증폭을 15 또는 30 싸이클 할 수 있다. 게다가, 장치(100)는 더 양호한 열 균일화가 가능하게 한다.The apparatus of Figures 8a-c provides a significant advance over the known art in the speed at which thermal cycling is carried out. That is, DNA amplification can be performed 15 or 30 cycles within 30, 15, 10 to 5 minutes. In addition, the device 100 allows for better thermal uniformity.

도 8a 에 하우징(102)의 일반 구성이 도시된다. 하우징(102)은 피트(104)상에 놓이며 (도 8b) 구조물을 제자리에 유지시키며 뜨거운 구조물을 주변환경으로 부터 분리시키는 작용을 한다. 도 8a 의 장치(100)에 입력키(25) 및 디스플레이(26)가 포함된다.8a shows a general configuration of the housing 102. The housing 102 rests on the pit 104 (FIG. 8B) and holds the structure in place and serves to separate the hot structure from the environment. The device 100 of FIG. 8A includes an input key 25 and a display 26.

도 8b 의 단면도에서 샘플챔버는 브라켓(106)으로 표시된다. 힌지(131)에 의해 하우징(102)에 연결된 뚜껑(138)이 개방되어서 샘플 챔버(106)에 접근할 수 있다. 샘플 챔버(106)는 원통형일 수 있다.In the cross-sectional view of FIG. 8B the sample chamber is indicated by bracket 106. A lid 138 connected to the housing 102 by the hinge 131 can be opened to access the sample chamber 106. The sample chamber 106 may be cylindrical.

샘플챔버(106)는 흑색 발포물(110)로 라이닝되어서 이의 표면은 광흡수성을 가지며 발포물의 대부분 두께는 절연성을 가진다. 흑색 발포물은 쉽게 구매할 수 있다. 발포물(110)은 통과하는 공기에 의해 쉽게 냉각되는 물질이다. 즉, 이 물질은 낮은 열전도성과 다공성 표면을 가진다.The sample chamber 106 is lined with black foam 110 so that its surface is light absorbing and most of the foam is insulating. Black foam is readily available. Foam 110 is a material that is easily cooled by the air passing through it. That is, the material has a low thermal conductivity and a porous surface.

흑색 다공성 표면은 표면에 입사하는 짧은 파장의 복사에너지를 장파 에너지로, 즉 샘플 챔버에 복사되는 열로 전환한다.The black porous surface converts short wavelength radiation incident on the surface into long wave energy, ie heat radiated in the sample chamber.

발포물(110)은 샘플챔버를 하우징의 주변공기공간으로 부터 분리시키고 램프(112)에 의해 방출된 빛을 열에너지로 전환시킨다. 발포물(110)은 다른 구조물로 대체될 수 있다. 예컨대, 한면이 흑색 도장된 폴리카보네이트 박판과 같은 흑색 비반사 표면을 가지는 재료가 유리섬유 또는 발포물과 같은 절연재료에 의해 보강될 수 있다. 다양한 기질에 도장될 수 있는 흑색 표면은 입사한 단파장의 복사에너지를 열복사에너지로 전환시키며 절연재료는 샘플챔버를 주변환경으로 부터 절연시킨다.The foam 110 separates the sample chamber from the surrounding air space of the housing and converts the light emitted by the lamp 112 into thermal energy. Foam 110 may be replaced with other structures. For example, a material having a black anti-reflective surface, such as a polycarbonate sheet painted black on one side, may be reinforced by an insulating material such as glass fiber or foam. The black surface, which can be painted on various substrates, converts the incident short wavelength radiation into thermal radiation, and the insulating material insulates the sample chamber from the environment.

램프(112)는 500와트 할로겐 램프일 수 있다. 적절한 제어장치가 사용된다면 더 높은 출력의 램프나 복수의 램프가 사용될 수 있다. 램프소켓(112A)은 지지부(112B)에 의해 하우징(102)에 부착된다. 램프(112)는 샘플챔버(106)를 필요한 온도까지 신속하고 균일하게 가열할 수 있다. 니크롬선과 같은 적외선 복사원이 본 발명의 범위내에 사용될 수도 있다.Lamp 112 may be a 500 watt halogen lamp. Higher output lamps or multiple lamps may be used if suitable controls are used. The lampholder 112A is attached to the housing 102 by the support 112B. The lamp 112 can heat the sample chamber 106 quickly and uniformly to the required temperature. Infrared radiation sources such as nichrome wire may also be used within the scope of the present invention.

도 8b 에 2개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시된다. 두 개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시될지라도 샘플챔버(106)는 여러개의 이러한 튜브를 유지할 수 있다. 얇은벽 모세관 튜브(108)는 공지 장치에 비해서 몇가지 장점을 가지며 생물학적 샘플 유지 수단으로 사용된다.Two thin wall capillary tubes 108 are shown in FIG. 8B. Although two thin-walled capillary tubes 108 are shown, the sample chamber 106 may hold several such tubes. The thin wall capillary tube 108 has several advantages over known devices and is used as a biological sample holding means.

얇은벽 모세관 튜브(108)는 접근의 용이성을 위해 구멍(140)을 통해 샘플챔버 밖으로 부분 연장될수도 있지만 특정한 용도에 적합한 다른 수많은 유체 유지 구조물과 같이 샘플챔버(106)내에 완전히 내장될 수 있다. 선호되는 얇은벽 모세관 튜브(108)는 약 10㎕의 용량을 가진다. 샘플의 부피는 적게 유지되어야 하며 샘플 유지 구조물의 표면적은 비교적 커야 하며 비교적 적은 열용량을 가져야 한다. 샘플 유지 구조물은 0.1 내지 10,000㎕의 부피를 가질 수 있다.The thin wall capillary tube 108 may extend partially out of the sample chamber through the aperture 140 for ease of access, but may be fully embedded in the sample chamber 106 like many other fluid retention structures suitable for a particular application. Preferred thin wall capillary tubes 108 have a capacity of about 10 μl. The volume of the sample should be kept low and the surface area of the sample holding structure should be relatively large and have a relatively low heat capacity. The sample retention structure may have a volume of 0.1 to 10,000 μl.

램프(112)와 절연성 발포물(110)은 함께 얇은벽 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플과 샘플챔버(106)내의 공기를 빠르고 균일하게 가열한다. 열전쌍(134)이 샘플 챔버(106)내에 포함되어서 챔버내 온도를 감지하고 샘플챔버내에서 필요한 온도를 유지시키는데 사용된다.The lamp 112 and the insulating foam 110 together heat the sample contained in the thin wall capillary tube 108 and the air in the sample chamber 106 quickly and uniformly. A thermocouple 134 is included in the sample chamber 106 to sense the temperature in the chamber and to maintain the required temperature in the sample chamber.

열전쌍(134)은 이의 열응답이 생물학적 샘플과 이를 유지하는 용기의 열응답과 일치하며 구매가능한 것이다. 이러한 열전쌍은 Idaho Labs로 부터 금속 외장 J-형 열전쌍 형태로 구매할 수 있다. 생물학적 샘플과 용기의 열응답과 열전쌍의 열응답의 일치는 PhysiTem로 부터 구매가능한 모델 IT-23 열전쌍과 같은 마이크로 열전쌍을 선택된 용기에 담긴 생물학적 샘플속에 삽입하고 샘플과 열전쌍은 동일한 온도변화를 받게 함으로써 달성된다. 테스트중인 열전쌍은 열전쌍의 열응답이 샘플 및 용기의 열응답에 일치할때까지 변화될 수 있다.The thermocouple 134 is commercially available and whose thermal response matches that of the biological sample and the container holding it. These thermocouples are available from Idaho Labs in the form of metal sheathed J-type thermocouples. The thermal response of the biological sample and the thermocouple and the thermocouple match are achieved by inserting a micro thermocouple, such as the model IT-23 thermocouple, available from PhysiTem into the biological sample in the selected container, and the sample and the thermocouple subjected to the same temperature change. do. The thermocouple under test can be varied until the thermal response of the thermocouple matches the thermal response of the sample and the vessel.

도 8b 의 배열은 기존의 장치보다 더 균일한 샘플의 가열 및 냉각을 제공한다. 기존의 장치에서 샘플을 통한 열전달은 샘플을 통한 대류에 의해 이루어진다. 샘플유지에 어떠한 구조물이 사용되든 샘플의 대류 유도 운동이 적은 생물학적 샘플(10-100㎕)의 온도차에 의해 야기된다.The arrangement of FIG. 8B provides heating and cooling of the sample more uniform than conventional devices. In conventional devices, heat transfer through the sample is by convection through the sample. Whatever structure is used to hold the sample, the convective induction motion of the sample is caused by the temperature difference of the biological sample (10-100 μl) that is low.

샘플내의 온도차의 효과는 샘플에 대한 싸이클시간이 감소될 때 더욱 제어하기 곤란하다. 샘플내 불균일 온도의 존재와 샘플내에서 "대류에 의한 혼합"에 대한 의존성은 샘플에 대한 싸이클시간을 증가시키고 생물학적 샘플에 악영향을 준다. 장치(100)는 10㎕ 샘플내의 열차이가 30초 싸이클동안 ±1℃ 미만이 되도록 가열 및 냉각을 할 수 있다.The effect of the temperature difference in the sample is more difficult to control when the cycle time for the sample is reduced. The presence of non-uniform temperature in the sample and the dependence on “mixing by convection” in the sample increases the cycle time for the sample and adversely affects the biological sample. Apparatus 100 may be heated and cooled such that trains in 10 μl samples are less than ± 1 ° C. over a 30 second cycle.

더욱 균일한 냉각 및 가열을 촉진하기 위해서 얇은벽 모세관 튜브(108)가 램프(112)와 같은 열원으로 부터 다소 떨어지는 것이 좋다. 도 8c 는 도 8a-b 에서 도시된 장치(100)에 배열된 램프(112)와 복수의 얇은벽 모세관 튜브(108)의 평면도이다.In order to promote more uniform cooling and heating, the thin-walled capillary tube 108 may be somewhat separated from a heat source such as lamp 112. FIG. 8C is a top view of the lamp 112 and the plurality of thin wall capillary tubes 108 arranged in the apparatus 100 shown in FIGS. 8A-B.

도 8c 에서 램프(112)로 부터 가장 멀리있는 (F로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)는 램프에 가장 가까운 (N으로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)와 램프(112)간의 거리보다 램프(112)로 부터 40%, 특히 25% 정도 더 멀리 있다. 예컨대 N으로 표시된 거리는 7.3㎝이고 F로 표시된 거리는 8.5㎝이다. 얇은벽 모세관 튜브(108)의 배열은 원형 또는 반원형일 수 있다.In FIG. 8C, the thin wall capillary tube 108 (indicated by F) furthest from the lamp 112 is located at a distance greater than the distance between the thin wall capillary tube 108 (indicated by N) and the lamp 112 closest to the lamp. 40%, especially 25%, from (112). For example, the distance indicated by N is 7.3 cm and the distance indicated by F is 8.5 cm. The arrangement of the thin wall capillary tube 108 may be circular or semicircular.

게다가 열발생 요소와 샘플용기간의 거리를 측정하는 점은 열발생 요소의 크기 및 종류에 따라 변한다. 예컨대, 열발생요소는 크기 및 모양이 다양한 복수 램프 또는 전기저항요소일 수 있다. 샘플 챔버벽으로 부터 샘플 용기가 위치되는 거리를 고려하는 것도 중요하다. 구멍(140)(도 8a)은 샘플용기 유지수단으로 작용하지만 다른 구조물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.In addition, the measurement of the distance between the heat generating element and the sample period varies with the size and type of the heat generating element. For example, the heat generating element may be a plurality of lamps or electric resistance elements of various sizes and shapes. It is also important to consider the distance that the sample vessel is located from the sample chamber wall. The hole 140 (FIG. 8A) serves as a sample vessel holding means but other structures may be used in accordance with the present invention.

장치(100)는 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플을 빠르고 균일하게 냉각하기도 한다. 샘플챔버(106)를 냉각하기 위해서, 하우징(102) 외부로 부터 공기가 모터(118)에 의해 구동되는 모터 샤프트(122)에 연결된 팬(116)에 의해 하부 하우징 입구(114)를 통해 하우징 내부로 들어온다. 샘플챔버의 신속한 냉각이 필요하므로 모터(118)와 팬(116)의 조합은 충분한 부피의 공기를 샘플챔버(106)에 이동시키고 이후에 공기를 샘플챔버(106) 내부에 분산시킬 수 있어야 한다. 도 8b 에 도시된 모터(118) 및 팬(116) 이외의 장치가 사용될 수 있다.The apparatus 100 may also cool the sample contained in the capillary tube 108 quickly and uniformly. To cool the sample chamber 106, inside the housing through the lower housing inlet 114 by a fan 116 connected to the motor shaft 122 driven by the motor 118 from outside the housing 102. Comes in. Since rapid cooling of the sample chamber is required, the combination of the motor 118 and the fan 116 should be able to move a sufficient volume of air into the sample chamber 106 and then disperse the air inside the sample chamber 106. Devices other than the motor 118 and fan 116 shown in FIG. 8B may be used.

액체와 다른 가스에 비해서 열전달 매체로서 공기를 사용하는 것은 저렴하며 쉽게 구할 수 있으며 쉽게 혼합되는 장점이 있다. 샘플을 담는 모세관 튜브의 높은 부피대 표면적 비는 열전달 매체로서 공기를 사용하여 신속하게 열을 전달시킨다.The use of air as a heat transfer medium over liquids and other gases has the advantage of being inexpensive, readily available and easily mixed. The high volume to surface area ratio of the capillary tube containing the sample quickly transfers heat using air as the heat transfer medium.

열싸이클중 냉각단계에서 팬(116)의 작용은 주변공기를 하우징(102)으로 들여보내는 것이다. 힌지(129)로 움직이는 통기도어(128)가 제공된다. 통기도어(128)는 솔레노이드(132)에 의해 자동으로 개방되어서 하우징(102)의 내부가 상부 하우징 입구(130)로 부터 밀폐된다. 솔레노이드(132)는 당해분야에 공지된 스테핑 모터로 대체될 수 있다. 스테핑 모터의 사용은 통기 도어(128)를 정확하고 증분적으로 샘플의 가열 및 냉각 필요성에 따라 개폐시킬 수 있게 한다. 당해분야 숙련자는 SC-149 스테핑 모터 제어기(Alpha products)를 사용하여 적절한 제어를 할 수 있다.The action of the fan 116 in the cooling phase of the heat cycle is to introduce ambient air into the housing 102. A ventilator 128 is provided that moves to the hinge 129. The ventilator 128 is automatically opened by the solenoid 132 so that the interior of the housing 102 is sealed from the upper housing inlet 130. Solenoid 132 may be replaced with a stepping motor known in the art. The use of a stepping motor allows the vent door 128 to be opened and closed accurately and incrementally according to the heating and cooling needs of the sample. One skilled in the art can use SC-149 stepping motor controllers (Alpha products) to make appropriate controls.

상부 샘플챔버 입구(126)의 위치 및 더 큰 단면적과 하부 샘플챔버 입구(120)의 배치로 인하여 실온의 공기가 샘플챔버(106)로 이동되고 분산되고 모터 샤프트(122)에 연결된 패들(124)에 의해 샘플 챔버(106)내에서 혼합된다. 패들(124)은 샘플챔버(106)내에서 분당 250미터, 특히 500미터, 더더욱 1000미터 정도의 공기 속도를 일으키기에 충분한 속도로 회전해야 한다. 고속회전하는 단일 또는 다중패들일 수 있는 패들(124)을 사용하여 공기가 샘플 챔버(106)내로 유입되거나 점선(136)으로 표시된 경로를 따라 챔버(106)로 부터 유출된다. 패들(124)의 회전은 샘플챔버(106)에 들어오는 공기의 혼합을 촉진하고 얇은벽 모세관 튜브(108)의 표면으로 부터 샘플 챔버(106)를 통과하는 공기로 가장 효과적인 열에너지 전달을 보장한다.Due to the location of the upper sample chamber inlet 126 and the larger cross-sectional area and placement of the lower sample chamber inlet 120, air at room temperature is moved to the sample chamber 106, dispersed and paddle 124 connected to the motor shaft 122. By mixing in the sample chamber 106. Paddle 124 must rotate at a speed sufficient to produce an air velocity of 250 meters per minute, in particular 500 meters, even 1000 meters, within sample chamber 106. Using paddle 124, which may be a single or multiple paddles rotating at high speed, air is introduced into or out of chamber 106 along the path indicated by dashed line 136. Rotation of the paddle 124 promotes mixing of air entering the sample chamber 106 and ensures the most efficient thermal energy transfer from the surface of the thin wall capillary tube 108 to the air passing through the sample chamber 106.

솔레노이드(132)가 통기도어(128)를 개방시키도록 활성화될 때 샘플챔버(106)에 유입된 실온의 공기는 샘플챔버 상부입구(126)와 상부 하우징 입구(130)를 통해 배출되어 샘플챔버(106)로 부터 열을 주변대기에 전달한다. 샘플 챔버(106)를 통과하고 분배된 공기의 빠른 혼합은 샘플의 균일하고 신속한 냉각을 가져온다.When the solenoid 132 is activated to open the ventilator 128, the air at room temperature introduced into the sample chamber 106 is discharged through the sample chamber upper inlet 126 and the upper housing inlet 130 to discharge the sample chamber ( 106) transfers heat to ambient air. Rapid mixing of the air passed through the sample chamber 106 and dispensed results in uniform and rapid cooling of the sample.

실시예 2Example 2

도 9a 는 4개의 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물을 보여준다. 프로파일 A와 B는 공지기술의 마이크로 튜브를 사용하는 공지 가열블럭 장치를 사용하여 수득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 온도간의 전이는 느리며 프로파일 A 및 B에 수많은 비특이성 밴드가 존재한다. 프로파일 B는 각 샘플이 각 온도에서 유지되는 시간을 제한함으로써 비특이성 밴드의 일부가 제거됨을 (프로파일 A에 비해서) 보여주는데, 이것은 시간이 짧을수록 바람직한 결과가 얻어짐을 보여준다.9A shows the results of four temperature / time profiles (A-D) and amplification products after 30 cycles. Profiles A and B are obtained using known heating block devices using known microtubes. As shown in FIG. 9A, the transition between temperatures is slow and there are numerous nonspecific bands in profiles A and B. Profile B shows that part of the nonspecific band is removed (relative to Profile A) by limiting the time each sample is held at each temperature, which shows that the shorter the time, the better the results are obtained.

프로파일 c 및 b는 도 8a-b 의 장치를 사용하여 획득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 증폭이 특이적이며 수율이 c에서 최대일지라도 (60초 신장) D에서도 적절하다(10초 신장).Profiles c and b are obtained using the apparatus of FIGS. 8A-B. As shown in FIG. 9A, although amplification is specific and the yield is maximum at c (60 second elongation), it is also appropriate for D (10 second elongation).

인간 유전자 DNA로 부터 β-글로블린의 536bp의 증폭에 최적의 시간 및 온도 역시 결정된다. 변성(93℃) 및 어닐링(55℃)이 1초 미만일 때 증폭 수율 및 생성물 특이성이 최적이다. 더 긴 변성 또는 어닐링 시간으로 잇점이 없다. 77℃에서 더 오랜 신장시간으로 수율이 증가하지만 10-20초보다 긴 신장시간으로는 변화가 거의 없다. 이러한 예기치 못한 결과는 DNA 증폭에 사용된 기존의 장치가 반응의 물리적 및 효소적 조건을 최적화하는데 필요한 조건을 최대화하지 못함을 나타낸다.The optimal time and temperature for amplifying 536 bp of β-globulin from human gene DNA is also determined. Amplification yield and product specificity are optimal when denaturation (93 ° C.) and annealing (55 ° C.) is less than 1 second. There is no advantage with longer denaturation or annealing times. Yield increases with longer elongation at 77 ° C. but little change with elongation times longer than 10-20 seconds. These unexpected results indicate that existing devices used for DNA amplification do not maximize the conditions necessary to optimize the physical and enzymatic conditions of the reaction.

추가 정보가 다음으로 부터 획득될 수 있다:Additional information can be obtained from:

Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B., and Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis △F50BLocus," 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., and Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification," THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994).Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B., and Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis ΔF 50B Locus," 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and Wittwer , Carl T., Reed, Gudrun H., and Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification," THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994).

도 9a 에 제공된 정보로 부터 샘플은 신속한 열순환이 되며 샘플의 온도는 0.5℃/초 이상의 속도로 증감된다. 폴리메라제 연쇄반응은 수행하는 본 발명의 경우에 온도변화는 30 내지 50℃에 대해서 수행된다. 열 싸이클은 40분후에 30이상의 열싸이클, 특히 20분후에 30회의 열싸이클, 더더욱 10분후에 30회의 열싸이클을 완료시키도록 충분히 빠르게 수행되는 것이 좋다.From the information provided in FIG. 9A, the sample is in rapid thermocycle and the temperature of the sample is increased or decreased at a rate of 0.5 ° C./sec or more. In the case of the present invention where the polymerase chain reaction is carried out, the temperature change is carried out for 30 to 50 ° C. The heat cycle is preferably performed fast enough to complete more than 30 heat cycles after 40 minutes, in particular 30 heat cycles after 20 minutes, and even 30 heat cycles after 10 minutes.

장치(100)는 1.0℃/초 이상, 특히 4.0℃/초 이상, 더더욱 10.0℃/초 이상의 속도로 샘플의 온도를 증감시킨다. 주변매체나 샘플용기가 아니라 생물학적 샘플이 지정된 열적 변화를 겪어야 한다. 기존의 장치의 본 발명의 장치만큼 빠르게 열적변화를 수행할 수 없으며 주변매체 및 용기의 온도가 아니라 샘플의 온도를 빠르고 균일하게 변화시키는 문제에 대한 인식이 없었다.The apparatus 100 increases or decreases the temperature of the sample at a rate of at least 1.0 ° C./sec, in particular at least 4.0 ° C./sec and even more at 10.0 ° C./sec. The biological sample, not the surrounding medium or sample vessel, must undergo a specified thermal change. There was no awareness of the problem of changing the temperature of the sample quickly and uniformly, rather than the temperature of the surrounding medium and vessel, as it was not possible to perform thermal changes as quickly as the device of the present invention of the existing devices.

도 9b 에서, 본 발명의 방법은 20℃ 이상, 특히 30℃ 이상, 더더욱 40℃ 이상의 온도범위에 걸쳐서 10℃/초이상, 특히 20℃/초이상의 속도로 열적 싸이클링을 이룰 수 있다. 도 9b 는 생물학적 샘플이 열싸이클을 받을 때 생물학적 샘플의 온도(℃)가 주변공기 또는 용기의 온도가 아님을 보여준다. 도 9b 는 74℃에서 시작되며 D로 표시된 변성온도 92℃에서 2초간 가열되는 PCR 샘플을 보여준다. 샘플은 이후에 A로 표시된 어닐링 온도 55℃까지 2초간 냉각된다. 변성온도와 어닐링온도간의 전이는 4초간 37℃로서 10℃/초 이상의 속도를 제공한다. 이후에 샘플은 도 9b 에서 E로 표시된 신장온도 74℃에서 5초간 데워진다. 변성온도, 어닐링온도 및 신장온도를 통한 샘플의 싸이클링은 30회 반복된다.In FIG. 9B, the process of the invention can achieve thermal cycling at a rate of at least 10 ° C./sec., In particular at least 20 ° C./sec. Over a temperature range of at least 20 ° C., in particular at least 30 ° C., even at least 40 ° C. 9B shows that the temperature (° C.) of the biological sample is not the temperature of the ambient air or vessel when the biological sample is subjected to a heat cycle. 9B shows PCR samples starting at 74 ° C. and heated at 92 ° C. for denaturation temperature 92 ° C. FIG. The sample is then cooled for 2 seconds to an annealing temperature of 55 ° C., indicated by A. The transition between denaturation temperature and annealing temperature gives a rate of 10 ° C./sec or higher at 37 ° C. for 4 seconds. The sample is then warmed for 5 seconds at an extension temperature of 74 ° C. indicated by E in FIG. 9B. Cycling of the sample through denaturation temperature, annealing temperature and stretching temperature is repeated 30 times.

도 9c-g 는 본 발명에 의해 달성되는 다른 선호되는 온도/시간 프로파일의 예시적인 싸이클을 보여준다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라서 지정된 공정을 수행하기 위해서 표시된 온도/시간 프로파일을 변경할 수 있을 것이다. 당해분야 숙련자는 고체 또는 액체르 통해 샘플에 열을 전도하는 공지 장치 및 방법이 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 인식할 것이다. 게다가 크로마토그래피 오븐과 같은 공기 및 전달매체를 활용하는 공지장치 및 방법은 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 알 수 있을 것이다.9C-G show exemplary cycles of another preferred temperature / time profile achieved by the present invention. One skilled in the art will be able to alter the displayed temperature / time profile to perform the designated process in accordance with the present invention. Those skilled in the art will appreciate that known devices and methods for conducting heat to a sample through a solid or liquid do not present the temperature / time profile described herein. In addition, it will be appreciated that known devices and methods utilizing air and delivery media, such as chromatography ovens, do not present the temperature / time profiles described herein.

가장 빠른 열 싸이클링 시간을 제공하기 위해서 램프(112, 도 8a, 8b)의 정격전력은 2000와트이거나 유사한 출력의 복수의 램프가 포함될 수 있다. 또한 Alpha products(모델번호 SP-127)(Darian, Connecticut)로 부터 구매가능한 하이레벨 프로그램 인터프리터와 클록과 함께 8052 마이크로컨트롤러를 사용하는 A-버스 컨트롤러/획득 시스템과 관련하여 도 10 에 나타난 온도 기울기 제어회로를 포함시키는 것이 선호된다. 마이크로컨트롤러에 사용되는 프로그램 코드는 프로그램 코드 부록에 포함된다. 부록에 제공된 프로그램 코드는 마이크로컨트롤러에 다운로드를 위한 BASIC52 파일이며 열싸이클링동안 예시적인 온도 기울기 제어를 한다. 2000와트 열 발생장치와 제어기는 20℃/초의 속도가 달성될 수 있게 한다.To provide the fastest thermal cycling time, the rated power of the lamps 112 (FIGS. 8A, 8B) may be 2000 watts or include multiple lamps of similar output. Temperature gradient control shown in FIG. 10 with respect to an A-bus controller / acquisition system using an 8052 microcontroller with a high-level program interpreter and clock available from Alpha products (Model No. SP-127) (Darian, Connecticut). It is preferred to include the circuit. Program code for the microcontroller is included in the Program Code Appendix. The program code provided in the appendix is a BASIC52 file for download to the microcontroller and provides exemplary temperature gradient control during thermal cycling. The 2000 watt heat generator and controller allow a rate of 20 ° C./sec to be achieved.

도 10 에 도시된 온도 기울기 제어회로는 샘플온도응답에 일치되는 열전쌍(200)을 포함한다. 열전쌍(200)은 당해분야에서 AD595로 알려진 집적회로(206)에 연결되며, 이의 출력은 100㎐의 컷오프 주파수로 4차 저역 필터(208)와 출력이 온도의 디지탈 표시에 사용되는 12비트 아날로그-디지탈 전환기(210)에 전달된다.The temperature gradient control circuit shown in FIG. 10 includes a thermocouple 200 that matches the sample temperature response. The thermocouple 200 is connected to an integrated circuit 206 known in the art as the AD595, the output of which is a 12-bit analogue, with a fourth order lowpass filter 208 and an output used for digital display of temperature at a cutoff frequency of 100 Hz. Delivered to the digital converter 210.

회로(206)의 출력은 측정된 기울기 회로(212)에도 전달된다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(218), 100㏀ 전위차계(214), 1㏁ 전위차계(230), 22㎌ 축전기를 포함한다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(246)의 역전 입력에 신호를 출력한다.The output of the circuit 206 is also transmitted to the measured slope circuit 212. The measured slope circuit 212 includes a 353 operational amplifier 218, a 100 kV potentiometer 214, a 1 kV potentiometer 230, and a 22 kV capacitor. The measured slope circuit 212 outputs a signal to the inverting input of the 353 operational amplifier 246.

기울기 설정 회로(222)는 양의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(226)와 음의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(224)를 포함한다. 디지탈-아날로그 전환기(224, 226)는 당해분야에서 DA147로 알려진 8비트 디지탈-아날로그 전환기이다. 기울기 설정 회로는 퍼스널 컴퓨터와 같은 또다른 디지탈 장치(도 10 에 도시안된)로 부터의 지령을 수신할 수 있다. 기울기 설정회로(228)의 출력은 합산 회로(240)에 전송된다.The slope setting circuit 222 includes a positive slope setting digital-analog converter 226 and a negative slope setting digital-analog converter 224. Digital-to-analog converters 224 and 226 are 8-bit digital-to-analog converters known in the art as DA147. The tilt setting circuit can receive a command from another digital device (not shown in FIG. 10) such as a personal computer. The output of the slope setting circuit 228 is transmitted to the summing circuit 240.

합산회로(240)는 100㏀ 저항기(236, 238, 244)와 353 연산증폭기(242)를 포함한다. 합산회로(240)의 출력은 연산증폭기(246)의 비-역전 입력에 전달되고 필요한 온도변화 기울기를 나타낸다. 연산증폭기(246)의 출력은 전력전환회로(262)내에 포함된 트랜지스터(248)에 제공된다.Summing circuit 240 includes 100 kΩ resistors 236, 238, 244 and 353 operational amplifier 242. The output of the summation circuit 240 is delivered to the non-inverting input of the operational amplifier 246 and represents the required temperature change slope. The output of the operational amplifier 246 is provided to a transistor 248 included in the power conversion circuit 262.

전력전환회로(262)는 트랜지스터(248)에 전류를 제공하는 5VDC 공급원(250)을 포함한다. 트랜지스터(248)는 330Ω 저항과 같은 저항(252)을 수단으로 3010회로(254)에 연결된 이미터를 가진다. 3010 회로(254)는 180Ω 저항과 같은 저항(256)과 직렬 연결된 출력을 포함한다. 트라이액(258)이 AC 전류원(260)으로 부터 램프(262) 또는 다른 열발생장치에 전달되는 전류 제어에 사용된다.The power conversion circuit 262 includes a 5VDC source 250 that provides a current to the transistor 248. Transistor 248 has an emitter connected to 3010 circuit 254 by means of a resistor 252, such as a 330 kΩ resistor. 3010 circuit 254 includes an output connected in series with a resistor 256, such as a 180 Hz resistor. Triac 258 is used to control the current delivered from the AC current source 260 to the lamp 262 or other heat generator.

다른 시스템 성분과 함께 도 10 에 도시된 온도기울기 제어회로는 생물학적 샘플을 30℃의 온도 범위에서 20℃/초, 특히 40℃의 온도 범위에서 20℃/초로 열 싸이클링을 받게 하며 전체 생물학적 샘플의 균일성이 유지되게 한다.The temperature gradient control circuit shown in FIG. 10 along with other system components subjects the biological sample to thermal cycling at 20 ° C./sec at 30 ° C., in particular 20 ° C./sec at 40 ° C., and provides uniformity of the entire biological sample. Keep the castle.

여기서 발표된 장치는 다음과 같은 응용분야에 사용될 수 있다: 폴리메라제 연쇄 반응; 싸이클 시이퀀싱; 리가아제 연쇄반응과 같은 다른 증폭 프로토콜. 본 발명은 샘플 챔버내에 위치된 샘플의 온도를 정확히 제어하는 장치를 제공하여서 예정된 시간대 온도 프로파일에 따라서 챔버에 위치된 샘플온도를 빠르고 정확하게 변화시킨다.The devices disclosed herein can be used in the following applications: polymerase chain reactions; Cycle sequencing; Other amplification protocols such as ligase chain reaction. The present invention provides an apparatus for accurately controlling the temperature of a sample located in a sample chamber so that the sample temperature located in the chamber can be quickly and accurately changed in accordance with a predetermined time zone temperature profile.

앞서 기술된 바와 같이 폴리메라제 연쇄 반응은 신속히 수행될 수 있다. 기술된 장치 및 방법을 사용하여 필요한 횟수의 온도 싸이클이 공지 기술에서 보다 빠르게, 예컨대 15분 미만에 완결될 수 있다. 변성시간과 어닐링 시간을 최소화함으로써 신속히 싸이클링된 증폭의 특이성 및 수율이 이전보다 개선된다. 게다가, 신속한 열전달 촉진 뿐만 아니라 광학적으로 투명한 모세관 튜브의 사용은 본 발명에 따라서 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링을 가능하게 한다.As described above, the polymerase chain reaction can be carried out quickly. The required number of temperature cycles can be completed faster in the known art, eg, in less than 15 minutes, using the apparatus and method described. By minimizing denaturation time and annealing time, the specificity and yield of rapidly cycled amplification is improved than before. In addition, the use of optically clear capillary tubes as well as rapid heat transfer promotion allows for continuous fluorescence monitoring of DNA amplification according to the present invention.

형광 프로브는 DNA 증폭을 탐지 및 모니터링 하는데 사용될 수 있다. 유용한 프로브는 이중쇄 DNA 특이성 염료와 서열특이성 프로브를 포함한다. 삽입물질 에티듐 브로마이드를 사용하여 모세관튜브 또는 마이크로 튜브에서 증폭후 UV활성화된 적색 형광이 증가한다. 서열 특이성 형광 탐지는 올리고누클레오타이드 교합 프로브를 사용하여 가능하다. 예컨대, 이중-라벨링된 형광제/로오다민 프로브는 폴리메라제 신장동안 5'-엑소누클레아제 활성에 의해 절단되고 형광단을 분리하여 형광제/로오다민 형광비를 증가시킬 수 있다.Fluorescent probes can be used to detect and monitor DNA amplification. Useful probes include double stranded DNA specific dyes and sequence specific probes. UV-activated red fluorescence is increased after amplification in capillary or microtubes using the insert ethidium bromide. Sequence specific fluorescence detection is possible using oligonucleotide occlusion probes. For example, a double-labeled fluorescent / rhoodamine probe can be cleaved by 5′-exonuclease activity during polymerase extension and separate fluorophores to increase the fluorescent / rhoodamine fluorescence ratio.

온도 싸이클링 완료후 생성물 축적을 모니터링하여 싸이클마다 한 번 또는 각 싸이클내에서 연속으로 형광이 측정될 수 있다. 본 발명과 대비하여 이전의 이용가능한 방법은 느리게 싸이클링이 이루어지며 온도 변화동안 형광의 획득 및 분석을 제시하지 않는다.After completion of the temperature cycling, the product accumulation can be monitored to measure fluorescence once per cycle or continuously within each cycle. Previously available methods in contrast to the present invention are slow cycling and do not suggest the acquisition and analysis of fluorescence during temperature changes.

본 발명은 초기 템플레이트 복제물 갯수의 정량화를 위해 싸이클마다 모니터링을 할 수 있다. 이러한 모니터링을 수행하기 위해서 각 싸이클의 신장 또는 조합된 어닐링/신장 단계동안 형광이 획득되고 생성물 농도와 관련된다. 삽입물질 YO-PRO-1을 사용하여 헤파티스 C RNA 정량분석이 당해분야에 공지된다. 형광 삽입물질의 존재하에서 PCR에 의한 헤파티스 C 바이러스 RNA의 균질 정량분석(Anal. Biochem. 229:207-213, Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, Y. Mitoma, 1995)참조. 본 발명 이전에는 각 싸이클내에서 연속 형광 모니터링이 효과적이고 정확하게 수행되지 못했다.The present invention can be monitored cycle by cycle for quantification of the initial template copy number. To perform this monitoring, fluorescence is obtained and related to product concentration during the stretching or combined annealing / extension steps of each cycle. Hepatis C RNA quantitation using insert YO-PRO-1 is known in the art. Homogeneous quantification of Hepatis C virus RNA by PCR in the presence of fluorescent inserts (Anal. Biochem. 229: 207-213, Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, Y. Mitoma, 1995). Prior to the present invention, continuous fluorescence monitoring was not performed effectively and accurately within each cycle.

연속 형광 모니터링을 제공하는 2-칼라 형광 광학과 집적된 신속한 온도 싸이클러가 발표된다. DNA 증폭에 선호되는 3개의 형광 기술이 본 발명의 특수예로서 제공된다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형광기술에서 에티듐 브로마이드의 사용에 익숙할 것이다. SYBR Green I(Molecular Probes of Eugene, Oregon)이 이중쇄 특이성 염료로 사용된다. 본 발명에 따라서 시간, 온도 및 형광이 200msec마다 획득된다. 이러한 데이타는 기존의 장치 및 방법으로는 얻을 수 없는 신속한 싸이클링동안 생성물 변성, 재어닐링 및 신장의 세부사항을 나타낸다.A rapid temperature cycler integrated with two-color fluorescence optics providing continuous fluorescence monitoring is presented. Three fluorescence techniques preferred for DNA amplification are provided as special examples of the present invention. One skilled in the art will be familiar with the use of ethidium bromide in fluorescence techniques that may be used in accordance with the present invention. SYBR Green I (Molecular Probes of Eugene, Oregon) is used as the double chain specific dye. According to the invention time, temperature and fluorescence are obtained every 200 msec. These data show details of product denaturation, reannealing and elongation during rapid cycling not available with conventional apparatus and methods.

DNA 증폭을 겪고 있는 다중샘플의 싸이클마다 한 번 모니터링은 강력한 정량도구이다. 한 싸이클내에서 연속 모니터링은 프로브 형광의 성질을 식별하여 공지기술에서는 얻을 수 없는 DNA 증폭 메카니즘에 대한 직관을 제공하며 증폭생성물과 돌연변이를 식별하기 위해서 PCR 생성물과 프로브 용융 곡선을 평가한다.Monitoring once per cycle of multiple samples undergoing DNA amplification is a powerful quantitative tool. Continuous monitoring within one cycle identifies the nature of the probe fluorescence, providing insight into the DNA amplification mechanism not available in the prior art and evaluating PCR product and probe melting curves to identify amplification products and mutations.

도 11 에서, 형광을 탐지하는 온도 싸이클러(300)가 개략적으로 도시된다. 고온 공기원(302)은 1600와트 가열코일과 팬을 포함한 시판장치이다. 냉각 공기원(304)은 Dayton(Niles, Illinois)으로 부터 모델번호 4C006B로 구매가능한 2200rpm 송풍기이다. 냉각 공기원(304)은 주변공기를 보통 제공하지만 주변공기보다 낮은 온도의 유체를 제공하는 수단을 활용할 수도 있다. 도 11 에서, 2.5㎝ 직경의 주름진 흑색 나일론 튜브(306, 308)가 고온 공기원(302)과 냉각 공기원(304)을 샘플챔버(310)에 연결시키는데 사용된다. 통기구(312)와 방출팬(314)을 샘플챔버(310) 밖으로 공기를 제거한다. 샘플챔버(310)의 내부는 외부의 빛으로 부터 차단된다.In FIG. 11, a temperature cycler 300 for detecting fluorescence is shown schematically. The hot air source 302 is a commercially available device including a 1600 watt heating coil and a fan. Cooling air source 304 is a 2200 rpm blower available from Dayton (Niles, Illinois) under model number 4C006B. Cooling air source 304 may provide a means for providing a fluid at a lower temperature than the ambient air, although normally providing ambient air. In FIG. 11, 2.5 cm diameter corrugated black nylon tubes 306, 308 are used to connect the hot air source 302 and the cooling air source 304 to the sample chamber 310. The vent 312 and the discharge fan 314 remove air from the sample chamber 310. The interior of the sample chamber 310 is blocked from external light.

샘플챔버(310)내의 샘플온도는 Idaho Technology(Idaho Falls, Idaho)로 부터 모델번호 1844로 구매가능하며 모세관 튜브에 담긴 샘플의 열응답에 일치되는 관형 금속외장 열전쌍(316)에 의해 모니터링된다. 샘플챔버(310)내의 온도 균일성은 중앙 샘플챔버팬(318)에 의해 달성된다. 샘플 챔버팬은 Idaho Technology로 부터 모델번호 1862로 구매가능한 1.7×11㎝ 팬날개와 샘플챔버(310)내에서 800 내지 1000m/분의 공기속도를 일으키는 모터(Idaho Technology, 모델번호 1861)를 포함한다.The sample temperature in the sample chamber 310 is available from Idaho Technology (Idaho Falls, Idaho) under model number 1844 and is monitored by a tubular metallic sheath thermocouple 316 that matches the thermal response of the sample contained in the capillary tube. Temperature uniformity in the sample chamber 310 is achieved by the central sample chamber pan 318. The sample chamber pan includes a 1.7 × 11 cm fan blade, available from Idaho Technology, model number 1862, and a motor (Idaho Technology, model number 1861) which produces an air velocity of 800 to 1000 m / min in the sample chamber 310. .

샘플챔버(310)내에 모세관 튜브(320)에 담긴 복수의 샘플이 회전가능한 카루셀(322)에 수직으로 위치된다. 카루셀(322)은 14㎝ 직경을 가지며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)에 의해 제어되는 400스텝/회전 스테핑 모터(324)에 회전된다. 스테핑 모터(324)는 New England Affiliated Technologies(Lawrence, Massachusetts)로 부터 모델번호 2198364로 구매가능하며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)은 New England Affiliated Technologies로 부터 모델번호 MDM7로 구매가능한 것으로서, 카루셀(322) 회전당 12,800 스텝을 제공한다.A plurality of samples contained in the capillary tube 320 in the sample chamber 310 are positioned perpendicular to the rotatable carousel 322. The carousel 322 is rotated by a 400 step / rotation stepping motor 324 having a 14 cm diameter and controlled by the microstepping drive module 326. Stepping motor 324 is available from New England Affiliated Technologies (Lawrence, Massachusetts) under model number 2198364 and microstepping drive module 326 is available from New England Affiliated Technologies under model number MDM7, carousel (322). 12,800 steps per revolution.

도 11 에서, 형광 활성화 소스(328)가 제공된다. 형광 활성화 소스(328)는 타원형 반사기로 촛점이 잡히는 75와트 크세논 아아크 소스이며, Photon Technology International (South Brunswick, New Jersey)로 부터 모델번호 A1010으로 f/2.5 타원형 반사기와 함께 구매할 수 있다. 혹은, 광방출 다이오드가 사용될 수 있다. 형광 활성화 소스(328)에 의해 방출된 빛은 Rolyn(Covina, California)로 부터 모델번호 75.0125로 구매가능한 홍채(334)를 사용하여 2㎜까지 촛점이 잡힌다. 형광 활성화 소스(328)로 부터 방출된 빛은 Rolyn으로 부터 모델번호 60.4400으로 구매가능한 저온 거울(330)상에 입사하고 Rolyn으로 부터 모델번호 65.3130으로 구매가능한 열흡수 유리(332)를 통과한다. Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 렌즈(336)를 통해 조준된 후 Omega Optical (Brattleboro, Vermont)로 부터 모델번호 470RDF40으로 구매가능한 450-490㎚ 대역 간섭 필터(338), Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 촛점 렌즈(340), Omega로 부터 구매가능한 1㎜ 실리카 창(342)을 통과한다. 기술된 활성화 경로를 사용하여 모세관 샘플 튜브(320A)의 5-7㎜ 섹션이 조사된다.In FIG. 11, a fluorescent activation source 328 is provided. Fluorescence activated source 328 is a 75 watt xenon arc source focused with an elliptical reflector and is available from Photon Technology International (South Brunswick, New Jersey) with an f / 2.5 elliptical reflector under model number A1010. Alternatively, a light emitting diode can be used. The light emitted by the fluorescent activation source 328 is focused up to 2 mm using the iris 334 available from Rolyn (Covina, California), model number 75.0125. Light emitted from the fluorescent activation source 328 is incident on the low temperature mirror 330, available from Rolyn, model number 60.4400, and passes through heat absorbing glass 332, available from Rolyn, model number 65.3130. 450-490 nm band interference filter (338), available from Omega Optical (Brattleboro, Vermont) and model number 470RDF40, after aiming through flat lens (336), available from Rolyn, model number 10.0260, model number from Rolyn It passes through a flat iron focus lens 340, available at 10.0260, a 1 mm silica window 342, available from Omega. A 5-7 mm section of capillary sample tube 320A is irradiated using the described activation pathway.

샘플(320A)로 부터 방출된 형광을 수집하기 위한 수집 경로가 도 11 을 참조로 기술될 것이다. 수집 경로의 광학성분은 다른 광학 성분상의 응축을 막기 위해서도 포함되는 1㎜ 실리카 유리(344)를 포함한다. 방출된 형광을 2×10㎜ 슬릿(348)에 촛점을 잡게 하며 Rolyn으로 부터 모델번호 17.1175로 구매가능한 비구면 렌즈(346A, 346B)가 대향하며, 슬릿은 공간 필터로서 기능을 하는 X-선 필름을 절단하여 제조된다. 공간 필터(348) 이후에 방출된 형광은 전자 셔터 제어기(352)를 통해 작동하는 35㎜ 전자 셔터에 입사한다. 35㎜ 전자셔터(350)는 Uniblitz 셔터 모델번호 VS35이며 전자 셔터 제어기(352)는 드라이버 모델번호 D122로서, 둘다 Vincent Associates (Rochester, New York)으로 부터 구매가능하다. Rolyn 모델번호 17.1175 조준 비구면 렌즈(354)가 제공된다.A collection path for collecting fluorescence emitted from sample 320A will be described with reference to FIG. 11. The optical components of the collection path include 1 mm silica glass 344, which is also included to prevent condensation on other optical components. The emitted fluorescence focuses on the 2 × 10 mm slit 348 and faces the aspherical lenses 346A, 346B, available from Rolyn, model number 17.1175, which slit the X-ray film which functions as a spatial filter. It is made by cutting. The fluorescence emitted after the spatial filter 348 enters the 35 mm electronic shutter operating through the electronic shutter controller 352. The 35 mm electronic shutter 350 is Uniblitz shutter model number VS35 and the electronic shutter controller 352 is driver model number D122, both available from Vincent Associates (Rochester, New York). A Rolyn model number 17.1175 aiming aspherical lens 354 is provided.

SYBR Green I 방출의 탐지가 요구될 때 필터(356)가 포함된다. 필터(356)는 Omega로 부터 모델 550RDF60으로 구매가능한 520-580㎚ 대역 통과 필터이며 단색 습득을 위해 사용된다. 다른 방출의 탐지를 위해 2색 필터(358)과 파장 필터(358A, 358B)의 조합이 필터블럭에 사용된다. 형광제와 로오다민 방출의 분리를 위해 Omega로 부터 모델 560 DRLP로 구매가능한 560㎚ 통과 2색 필터와 Omega로 부터 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용), Omega 모델 660DF40으로 구매가능한 580-620㎚ 대역 통과 필터(358B)(로오다민 탐지용)로 구성된 2색 필터(358)이 사용된다. 형광제와 Cy5 방출의 분리를 위해 2색 필터(358)는 Omega 모델 590 DRLP로 구매가능한 590㎚ 대역 통과 2색 필터와 Omega 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용)와 Omega 모델 670DF20으로 구매가능한 660-680㎚ 대역 통과 필터(358B)(Cy5 탐지용)가 사용된다.Filter 356 is included when detection of SYBR Green I emissions is required. Filter 356 is a 520-580 nm bandpass filter available as a model 550RDF60 from Omega and is used for monochromatic acquisition. A combination of two color filters 358 and wavelength filters 358A, 358B is used in the filter block to detect other emissions. 560 nm pass-through two-color filter available as model 560 DRLP from Omega and 520-550 nm band pass filter (358A) available as model 535DF30 from Omega for separation of fluorescent and rhodaramine emission (for fluorescence detection) A two-color filter 358 consisting of a 580-620 nm band pass filter 358B (for rhodamine detection), available as an Omega model 660DF40, is used. For separation of fluorescent and Cy5 emission, the dichroic filter 358 is a 590nm bandpass bicolor filter available with the Omega model 590 DRLP and a 520-550nm bandpass filter 358A available with the Omega model 535DF30 (fluorescent agent). Detection) and a 660-680 nm bandpass filter 358B (for Cy5 detection), available with the Omega Model 670DF20.

도 11 에서, 필터(358) 이후에 형광은 Edmund(Barrington, New Jersey)으로 부터 모델 32970으로 구매가능한 두 개의 평철 렌즈(360A, 360B)를 통해 광전 배중관(362A, 362B)상에 촛점이 잡힌다. 광전 배증관(362A, 362B)은 Hamamatsu (Middlesex, New Jersey)로 부터 모델 R928로 구매가능하며 Photon Technology International으로 부터 모델 714로 구매가능한 하우징에 수용된다. PMT 및 데이타 획득제어 모듈(364)이 또한 제공된다. 당해분야에 공지된 수동 PMT 셔터(366A, 366B)가 제공된다.In FIG. 11, the fluorescence after the filter 358 is focused on the photovoltaic tubes 362A and 362B through two flat iron lenses 360A and 360B available from Edmund (Barrington, New Jersey) as model 32970. . Photomultipliers 362A, 362B are available in Hamamatsu (Middlesex, New Jersey) as models R928 and housed in housings as models 714 from Photon Technology International. PMT and data acquisition control module 364 is also provided. Manual PMT shutters 366A, 366B known in the art are provided.

앞서 기술된 광학 성분은 5㎝ 직경을 가지며 Rolyn으로 부터 모델 90.0190으로 구매가능한 5㎝ 범용 렌즈 장착부에 장착된다. 필요한 구조성분은 black Delrin으로 부터 기계가공된다.The previously described optical component is 5 cm in diameter and is mounted on a 5 cm general purpose lens mount available as a model 90.0190 from Rolyn. The necessary structural components are machined from black Delrin.

도 11 에 도시된 장치를 사용하여 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl2, 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민, 0.5μM 프라이머, 0.5mM 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트, 5㎕ 샘플당 Tag 폴리메라제 0.2U에서 DNA 증폭이 수행된다. 인체 유전자 DNA(1분간 끓여서 변성된) 또는 정제된 증폭 생성물이 DNA 템플레이트로 사용된다. 정제된 증폭 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 수득된다[Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), S.L. Berger, A.R. Kimmel (Eds.), 대규모 및 소규모 페놀 추출 및 핵산의 침전(33-48)(Wallace, D.M. 1997) 참조]. 이어서, Centricon 30 마이크로농축기(Amicon, Danvers, MA로 부터 구매가능)를 통해 반복된 세척에 의해 프라이머가 제거된다. 템플레이트 농도는 260㎚에서 흡수에 의해 결정된다. 템플레이트의 A260/A280비는 1.7 이상이다.50 mM Tris, pH 8.5 (25 ° C.), 3 mM MgCl 2 , 500 μg / ml bovine serum albumin, 0.5 μM primer, 0.5 mM deoxynucleoside triphosphate, 5 μL Tag per device, using the device shown in FIG. 11. DNA amplification is performed at 0.2 U of polymerase. Human gene DNA (denatured by boiling for 1 minute) or purified amplification products are used as DNA templates. Purified amplification products are obtained by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation [Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), SL Berger, AR Kimmel (Eds.), Large and small scale phenol extraction and nucleic acid Precipitation (33-48) (Wallace, DM 1997)]. The primer is then removed by repeated washing through a Centricon 30 microconcentrator (commercially available from Amicon, Danvers, MA). Template concentration is determined by absorption at 260 nm. The template's A 260 / A 280 ratio is greater than 1.7.

프라이머는 표준 포스포아미다이트 화학, 예컨대 Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, NJ)에 의해 합성된다. 헤파티스 B 표면 항원 유전자의 180 염기쌍 조각은 프라이머 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1)와 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO:2) (Genbank sequence HVHEPB)를 사용하여 증폭된다. SYBR Green I은 몰레큘라 프로브(Eugene, Oregon)으로 부터 수득된다. β-액틴 프라이머와 형광제/로오다민 이중 프로브는 Perkin Elmer (Foster City, California)로 부터 모델 N808-0230으로 획득된다. 인체 β-글로블린 프라이머 RS 42/KM29(536 염기쌍) 및 PC03/PC04(110 염기쌍)은 고온공기를 사용한 모세관 튜브에서 자동화된 PCR, Nucl. Acids. Res. 17:4353-4357, (Wittwer, C.T., G.C. Fillmore, D.R. Hillyard)에 기술된다.Primers are synthesized by standard phosphoramidite chemistry such as Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, NJ). 180 base pair fragments of Hepatis B surface antigen gene were amplified using primers 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2) (Genbank sequence HVHEPB) do. SYBR Green I is obtained from a molecular probe (Eugene, Oregon). β-actin primers and fluorescent / rhoodamine double probes are obtained as model N808-0230 from Perkin Elmer (Foster City, California). Human β-globulin primers RS 42 / KM29 (536 base pairs) and PC03 / PC04 (110 base pairs) were prepared by automated PCR, Nucl. Acids. Res. 17: 4353-4357, (Wittwer, C.T., G.C.Fillmore, D.R.Hillyard).

단일 라벨링된 프로브5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-fluoresceinSingle labeled probe 5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-fluorescein

-3' (SEQ ID NO:3)와 5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-phosphate-3' (SEQ ID NO:4)은 형광제 포스포아미다이트(Glen Research (Sterling, Virginia)로 부터 모델 10-1963으로 구매가능한), Cy5 포스포아미다이트(Pharmacia로 부터 모델 27-1801-02로 구매가능)과 화학적 인산화 작용제(Glen Research로 부터 모델 10-1900)으로 구매가능)를 사용하여 합성된다. 이러한 인접한 프로브는 동일한 DNA쇄상에서 PC03/PC04 β-글로블린 프라이머쌍에 내부적으로 교합하고 한 개의 염기쌍만큼 분리된다. 프로브는 역상 C-18 HPLC에 의해 정제되고 균일성은 폴리아크릴아미드 전기영동 및 흡수성(A260과 형광단의 최대 흡수)에 의해 검사된다. 교합 프로브(β-액틴 및 β-글로블린)가 0.2μM로 각각 사용된다.-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-phosphate-3' (SEQ ID NO: 4) are model 10- 1963), Cy5 phosphoramidite (commercially available from Pharmacia as model 27-1801-02) and a chemical phosphorylation agent (commercially available from Glen Research as model 10-1900). These adjacent probes internally occupy PC03 / PC04 β-globulin primer pairs on the same DNA strand and are separated by one base pair. The probe is purified by reversed phase C-18 HPLC and uniformity is checked by polyacrylamide electrophoresis and absorption (maximum absorption of A 260 and fluorophores). Occlusal probes (β-actin and β-globulin) were used at 0.2 μM, respectively.

5㎕의 증폭샘플이 모세관 튜브(230)에 충진된다. 모세관 샘플 튜브는 Idaho Technology로 부터 모델 1705로 구매가능한 1.02㎜ 외경과 0.56㎜ 내경을 가진 튜브이다. 충진후 모세관 샘플 튜브는 부탄 화염으로 밀폐된다. 모세관 샘플 튜브는 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)의 카루셀(322)에 들어가기 이전에 광학등급 메탄올로 세정된다.5 μl of amplified sample is filled into the capillary tube 230. The capillary sample tube is a 1.02 mm outer diameter and 0.56 mm inner diameter, available as model 1705 from Idaho Technology. After filling, the capillary sample tube is closed with butane flame. The capillary sample tube is cleaned with optical grade methanol prior to entering the carousel 322 of the rapid temperature cycler 300 for fluorescence detection.

도 11 에 도시된 성분의 제어는 LabView(National Instruments, Austin, Texas)으로 알려진 그래픽 프로그램 언어와 120㎒의 클록속도로 작동하는 80486 Intel 마이크로프로세서를 사용하는 PC상용성 컴퓨터(366)에서 12-비트 다기능 입/출력 카드(National Instruments, AT-MIO-E2)를 사용하여 이루어진다. 입/출력 카드상의 아날로그 출력 채널은 민감도 제어, 즉 각 광전 배증관(362A, B)의 PMT 전압을 제어하는데 사용된다. 입/출력 카드상의 아날로그 입력채널은 광전 배증관(362A, B)으로 부터 신호를 수신한다. PC상용성 컴퓨터는 입/출력 카드를 통해서 카루셀의 운동 방향, 위치 및 속도를 제어한다. 다중 모세관 샘플튜브가 충진될 때 카루셀(322)은 100msec동안 모니터링 위치에서 각 모세관 샘플 튜브(320)를 순차적으로 위치선정한다. 단일 모세관 샘플튜브(320A)의 연속 모니터링 동안 데이타는 200mses마다 평균되고 습득한다. 온도, 시간 및 형광 2채널은 싸이클 횟수대 형광과 온도대 형광 플롯으로 표시된다. 카루셀은 최대 형광 및 신호가 습득되는 곳에 위치되어야 한다. 단일 모세관 샘플 튜브(320A)가 분석될 때 신호는 200msec마다 습득되며 광전 배증관(364)상의 적분시간상수는 50msec로 설정된다. 다중 광전배증관(366A, B)이 사용될 때 시간상수는 0.5msec로 설정되고 각 모세관 샘플튜브(320)가 각 채널에 최대 형광을 제공하는 정확한 위치를 선정하기 위해서 카루셀이 다시 회전한다. 최대 형광이 수득되는 지점에 모세관 샘플 튜브(320A)가 위치선정된 이후에 각 PMT(362A, B)의 민감도가 조절되고 모든 모세관 샘플튜브(320)의 위치를 계산 및 선정하기 위해서 카루셀이 다시 한 번 회전한다. 100msec동안 모니터링 위치에서 카루셀(322)상에 각 모세관 샘플 튜브(320)를 위치시킴으로써 신장동안 각 증폭싸이클마다 신호가 수득된다. Systronics(Salt Lake City, Utah)로부터 BCI51로 구매가능한 8051 크로스 컴파일러와 Dallas development system(Systronics로 부터 DPB2로 구매가능한)을 사용하여 Idaho Technology로 부터 Rapidcycler로 구매가능한 신속한 온도 싸이클러로 부터 온도제어 프로그램이 변경된다.The control of the components shown in FIG. 11 is 12-bit in a PC compatible computer 366 using a graphics programming language known as LabView (National Instruments, Austin, Texas) and an 80486 Intel microprocessor operating at a clock rate of 120 MHz. This is accomplished using a multifunction input / output card (National Instruments, AT-MIO-E2). The analog output channel on the input / output card is used for sensitivity control, i.e. for controlling the PMT voltage of each photomultiplier 362A, B. The analog input channel on the input / output card receives a signal from the photomultipliers 362A, B. PC compatibility computers control the carousel's direction of movement, position and speed through input / output cards. When multiple capillary sample tubes are filled, the carousel 322 sequentially positions each capillary sample tube 320 at the monitoring position for 100 msec. During continuous monitoring of a single capillary sample tube 320A, data is averaged and learned every 200 mses. Temperature, time, and fluorescence two channels are represented by cycle number versus fluorescence and temperature versus fluorescence plots. Carousel should be located where maximum fluorescence and signal are acquired. When a single capillary sample tube 320A is analyzed, the signal is acquired every 200 msec and the integral time constant on the photomultiplier tube 364 is set to 50 msec. When multiple photomultipliers 366A and B are used, the time constant is set to 0.5 msec and the carousel rotates again to select the correct position where each capillary sample tube 320 provides maximum fluorescence in each channel. After the capillary sample tube 320A has been positioned at the point where maximum fluorescence is obtained, the sensitivity of each PMT 362A, B is adjusted and the carousel is recalculated to calculate and select the positions of all capillary sample tubes 320. Rotate once. A signal is obtained for each amplification cycle during stretching by placing each capillary sample tube 320 on the carousel 322 at the monitoring position for 100 msec. Using the 8051 cross compiler (available as BCI51 from Systronics (Salt Lake City, Utah)) and the Dallas development system (available as DPB2 from Systronics), the temperature control program is available from the rapid temperature cycler available as Rapidcycler from Idaho Technology. Is changed.

사실상, 형광 탐지용 신속 온도 싸이클러(300)의 온도 응답은 도 11a 에서 시간대 온도 차트로 표시된 20-30초 싸이클(10-15분후에 30싸이클)을 허용하는 도 8a-b 의 장치로 수득되는 응답과 유사하다. 2중쇄 특이성 형광 염료가 증폭동안 존재할 경우에 더 많은 2중쇄 생성물이 형성되므로 형광이 증가한다. 특이성 DNA 서열의 동시증폭 및 탐지, Bio/Technology 10:413-417 (Higuchi, R., G. Dollinger, P.S. Walsh, R. Griffith, 1992) 참조.In fact, the temperature response of the fast temperature cycler 300 for fluorescence detection is obtained with the apparatus of Figs. 8A-B allowing a 20-30 second cycle (30 cycles after 10-15 minutes), indicated by the time zone temperature chart in Fig. 11A. Similar to the response. If double chain specific fluorescent dyes are present during amplification, more double chain products are formed, resulting in increased fluorescence. Coamplification and Detection of Specific DNA Sequences, See Bio / Technology 10: 413-417 (Higuchi, R., G. Dollinger, P. S. Walsh, R. Griffith, 1992).

형광은 온도 싸이클링동안 온도와 교란 효과의 영향을 받으며, 이것은 일정한 신장온도에서 싸이클마다 형광을 고려함으로써 제거된다. 그러나, 신속한 싸이클 증폭동안 200msec마다 온도, 시간 및 형광이 수득된다면 도 12 에 표시된 공간에 3차원 나선이 나타난다. 도 12 에 표시된 3차원 곡선은 도 12 에서 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광의 2차원 플롯으로 투영된다. 도 12 의 시간대 온도 투영은 싸이클마다 반복되고 도 11a 와 동일한 정보를 제공한다. 형광은 온도에 대해 반비례하므로 매 싸이클마다 도 12 에 도시된 시간대 온도 투영은 시간대 온도 플롯의 거울 영상이다. 생성물이 축적됨에 따라 2중쇄 생성물의 경우 형광이 모든 온도에서 증가한다. 그러나 변성온도에서 형광은 기준선으로 복귀하는데, 그 이유는 단일쇄 DNA만이 존재하기 때문이다.Fluorescence is affected by temperature and disturbing effects during temperature cycling, which is eliminated by considering fluorescence per cycle at a constant stretching temperature. However, if temperature, time, and fluorescence are obtained every 200 msec during rapid cycle amplification, three-dimensional helix appears in the space shown in FIG. The three-dimensional curve shown in FIG. 12 is projected in FIG. 12 as a two-dimensional plot of time zone temperature, time zone fluorescence, and temperature zone fluorescence. The time zone temperature projection of FIG. 12 is repeated from cycle to cycle and provides the same information as in FIG. 11A. Since fluorescence is inversely proportional to temperature, the time zone temperature projection shown in FIG. 12 for each cycle is a mirror image of the time zone temperature plot. As the product accumulates the fluorescence increases for all double chain products. However, at denaturation temperatures fluorescence returns to baseline because only single-stranded DNA is present.

도 12 에 도시된 2중쇄 염료의 온도대 형광 투영도는 시간축을 제거하고 DNA 증폭동안 쇄 상태의 온도 종속성을 보여준다. 도 12 에 도시된 온도대 형광 투영도는 헤파티스 B 바이러스 DNA의 180 염기쌍 조각에 대한 것이다.The temperature versus fluorescence projection of the double chain dye shown in FIG. 12 removes the time base and shows the temperature dependence of the chain state during DNA amplification. The temperature band fluorescence projections shown in FIG. 12 are for 180 base pair fragments of Hepatis B virus DNA.

도 13 에 도시된 온도대 형광 투영도는 인체 β-글로블린 DNA의 536 염기쌍 조각에 대한 것이다. 도 13 에 표시된 초기 싸이클은 동일하게 나타나며 저온에서 형광이 비선형으로 증가한다. 증폭이 진행함에 따라 이후 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에 상승하는 루우프로서 나타나는데 이것은 상당한 히스테리시스를 보여준다. 즉, 가열동안 관찰되는 형광이 냉각동안 형광보다 크다. 샘플이 가열될 때 형광은 변성이 나타날때까지 높다(형광에서 예리한 강하). 샘플이 변성온도로 부터 어닐링 온도로 냉각될 때 2중쇄 신호는 빠르게 증가한다. 형광은 신장동안 계속 증가하며 온도는 일정하게 유지된다.The temperature band fluorescence projections shown in FIG. 13 are for 536 base pair fragments of human β-globulin DNA. The initial cycles shown in FIG. 13 appear identical and fluorescence increases nonlinearly at low temperatures. As the amplification proceeds, the cycle then appears as a rising loop between the annealing and denaturation temperatures, which shows considerable hysteresis. That is, the fluorescence observed during heating is greater than the fluorescence during cooling. When the sample is heated the fluorescence is high until sharp degeneration (sharp drop in fluorescence). The double chain signal increases rapidly when the sample cools from denaturation temperature to annealing temperature. Fluorescence continues to increase during elongation and the temperature remains constant.

이중쇄 특이성 염료가 본 발명에 사용될 수도 있다. PCR 생성물의 쇄상태는 dsDNA의 존재하에서 형광하는 염료를 사용하여 알 수 있다. SYBR Green I이 증폭동안 존재할 때 더 많은 dsDNA가 형성됨에 따라 형광이 증가한다. 그러나, 도 26a 및 b 에 도시된 바와 같이 형광은 온도에 반비례하므로 온도 싸이클링은 복잡한 영향을 준다. 생성물이 축적됨에 따라 형광이 도 12c 에 도시된 기준선으로 복귀하는 변성온도를 제외하고는 형광이 증가한다.Double chain specific dyes may also be used in the present invention. The chain state of the PCR product can be known using dyes that fluoresce in the presence of dsDNA. When SYBR Green I is present during amplification, the fluorescence increases as more dsDNA is formed. However, as shown in FIGS. 26A and B, fluorescence is inversely proportional to temperature, so temperature cycling has a complex effect. As the product accumulates, the fluorescence increases except for the denaturation temperature at which the fluorescence returns to the baseline shown in FIG. 12C.

다중 샘플이 SYBR Green I에 대해 싸이클마다 모니터링될 때 초기 템플레이트 농도중 107-108범위가 도 14 에 표시된다. 도 14a 는 도 14 에서 상이한 플롯에 제공된 표시에 대한 부호설명이 제공된다. 데이터는 각 모세관 샘플튜브(320)의 최대형광 비율로 정규화될 때 100개의 초기 복제물이 명백히 10개의 복제물과 분리된다. 그러나, 1개의 복제물과 10개의 복제물간의 차이는 적으며 모세관 샘플튜브(320)마다 0과 1개의 평균 복제물간의 차이는 없다.When multiple samples are monitored per cycle for SYBR Green I, the range of 10 7 -10 8 of the initial template concentrations is shown in FIG. 14. FIG. 14A is provided with reference numerals for the indicia provided in the different plots in FIG. 14. When data is normalized to the maximum fluorescence rate of each capillary sample tube 320, 100 initial replicates are clearly separated from 10 replicates. However, the difference between one replica and ten replicas is small and there is no difference between zero and one average replica per capillary sample tube 320.

이중쇄 염료는 증폭 프라이머에서 고유한 특이성에 의해 좌우된다. 높은 싸이클 횟수에서 비특이성 증폭은 약 백개의 초기 템플레이트 복제물로 탐지 민감성을 제한할 수 있다(도 14). 본 발명에 의한 신속한 싸이클링을 사용하여 증폭 특이성이 더욱 개선되어 전체 DNA 증폭 성능을 향상시킨다.Double chain dyes are governed by specificity inherent in amplification primers. Nonspecific amplification at high cycle counts can limit detection sensitivity to about one hundred initial template copies (FIG. 14). The amplification specificity is further improved using the rapid cycling according to the present invention to improve the overall DNA amplification performance.

서열 특이성 프로브를 사용한 정량화는 이중쇄 DNA 염료와 유사한 동적범위를 가지지만 도 15a 및 b 에 도시된 바와 같이 음의 비교부로 부터 단일한 초기 템플레이트 조차 구별하는 것으로 나타난다.Quantification using sequence specificity probes has a dynamic range similar to that of double-stranded DNA dyes but appears to distinguish even a single initial template from the negative comparator, as shown in FIGS. 15A and 15B.

적은 수의 복제물 탐지 및 정량이 필요할 때 신호발생을 위해 교합을 필요로 하는 형광 프로브에 의해서 추가 특이성이 제공될 수 있다. 이중-라벨링된 엑소누클레아제의 절단이 한가지 방법이다(형광 프로브를 사용한 닉-번역 PCR에 의한 대립형질 판별, Nucl. Acids Res. 21:3761-3766, L.G., C.R. Connell, W. Bloch. 1993; 반대 단부에서 형광 염료를 갖는 올리고누클레오타이드를 사용하여 PCR 생성물과 핵산 교합의 탐지에 유용한 퀀칭된 프로브 시스템, PCR Meth. Appl. 4:357-362, Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, 1995 참조). 도 25 는 형광제와 로오다민 라벨간에 5개의 염기가 있는 프로브로 부터 나오는 PCR 결과를 보여준다. 45싸이클 증폭이 도 11 의 온도 싸이클러(300)를 사용하여 20분 후에 완결된다. 싸이클마다 한 번 형광비를 모니터링 함으로써 초기 템플레이트 농도의 109배 범위가 구별될 수 있다. 정량곡선은 초기 템플레이트 농도에서 10배 변화에 대해 약 3-4싸이클 이동된다. 이것은 음의 비교 신호로 부터 단일한 템플레이트 복제물을 구별할 수 있다(도 15). 적은 수의 복제물이 증폭될 때 감소된 증폭 효율로 인하여 최종형광신호가 감소될지라도 0과 백개의 복제물간의 정량화가 가능하다. 엑소누클레아제 프로브에 의해 발생된 신호는 축적적이며 간접적으로 생서물 농도에 관련된다. 그러므로 생성물의 양이 평형에 도달한 후에도 형광 신호는 계속 증가한다. 증폭 및 절단 효율의 제어에 대한 표준이 절대적인 정량화에 필요하다.Additional specificity can be provided by fluorescent probes that require occlusion for signaling when a small number of copies are detected and quantified. Cleavage of double-labeled exonuclease is one method (allele determination by nick-translation PCR using fluorescent probes, Nucl.Acids Res. 21: 3761-3766, LG, CR Connell, W. Bloch. 1993 Quenched probe systems useful for the detection of PCR products and nucleic acid engagement using oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends, PCR Meth.Appl. 4: 357-362, Livak, KJ, SJA Flood, J. Marmaro , W. Giusti, K. Deetz, 1995). Figure 25 shows PCR results from a probe with five bases between the fluorescent and rhodaramine labels. 45 cycle amplification is completed after 20 minutes using the temperature cycler 300 of FIG. By monitoring the fluorescence ratio once per cycle, a range of 10 9 times the initial template concentration can be distinguished. The quantitative curve is shifted by about 3-4 cycles for a 10-fold change in initial template concentration. This can distinguish a single template copy from the negative comparison signal (FIG. 15). When a small number of copies are amplified, the reduced amplification efficiency allows quantification between zero and one hundred copies, although the final fluorescence signal is reduced. The signals generated by the exonuclease probes are cumulative and indirectly related to the biologic concentration. Therefore, the fluorescence signal continues to increase even after the amount of product reaches equilibrium. Standards for control of amplification and cleavage efficiency are needed for absolute quantification.

5'-엑소누클레아제 프로브의 온도대 형광 플롯은 프로브 가수분해가 신호발생 메카니즘임을 확인시켜 준다. 도 16 에서, 2-온도 싸이클링의 온도대 형광 플롯이 β-액틴 엑소누클레아제 프로브에 대해 도시된다. 싸이클마다 형광비는 온도에 따라 선형으로 변하며 히스테리시스는 거의 없다. 프로브 가수분해가 일어날 때 어닐링/신장 단계동안 각 싸이클마다 신호가 증가한다. 형광제와 로오다민의 형광이 온도 증가시 감소할지라도 변화율은 로오다민이 더 커서 온도 증가시 비율이 증가한다. 5'-엑소누클레아제 프로브에서는 온도 종속적 교합 효과가 명백하지 않다.Temperature versus fluorescence plots of 5′-exonuclease probes confirm that probe hydrolysis is a signaling mechanism. In FIG. 16, a temperature band fluorescence plot of 2-temperature cycling is shown for β-actin exonuclease probe. In each cycle, the fluorescence ratio changes linearly with temperature, with little hysteresis. When probe hydrolysis occurs, the signal increases for each cycle during the annealing / extension phase. Although the fluorescence of the fluorescent agent and rhodamine decreases with increasing temperature, the rate of change is higher because of the larger rhodamine. The temperature dependent occlusion effect is not apparent with the 5'-exonuclease probe.

이에 반하여, 형광 신호가 교합에만 의존할 때 도 17 에 도시된 바와 같이 2-온도 싸이클링동안 온도대 형광비 플롯은 다양한 패턴을 보이며 히스테리시스가 명백하다. 2개의 인접한 교합 프로브, 형광제로 3' 라벨링된 상류 프로브와 Cy5으로 5'라벨링된 하류 프로브가 존재한다. 이 프로브는 1개의 염기쌍만큼 분리된다. 어닐링/신장 단계동안 프로브는 축적생성과 Cy5, 형광제로 교합하여서 형광비가 증가한다. 생성물 변성 온도까지 가열하는 동안 프로브는 65 내지 75℃에서 해리되어서 기준 레벨까지 형광비가 복귀된다. 교합동안 형광비의 변화는 공명에너지 전달로 부터 Cy5 형광의 증가 때문이다. 교합의 온도종속성은 용융곡선의 이동에 의해 돌연변이 탐지에 사용될 수 있다. 도 15b 에 도시된 대로 인접한 교합 프로브는 정량화에 매우 유용하다.In contrast, when the fluorescence signal depends only on the occlusion, the temperature-to-fluorescence ratio plot during two-temperature cycling shows various patterns and hysteresis is evident as shown in FIG. 17. There are two adjacent occlusal probes, an upstream probe labeled 3 'with fluorescent and a downstream probe labeled 5' with Cy5. This probe is separated by one base pair. During the annealing / extension phase, the probes accumulate and associate with Cy5, a fluorescent agent, increasing the fluorescence ratio. During heating to the product denaturation temperature the probe dissociates at 65-75 ° C. and the fluorescence ratio is returned to the reference level. The change in fluorescence ratio during occlusion is due to the increase in Cy5 fluorescence from resonance energy transfer. Occlusion temperature dependence can be used for mutation detection by shifting the melting curve. Adjacent occlusal probes as shown in FIG. 15B are very useful for quantification.

DNA 증폭동안 형광 모니터링은 강력한 분석기술이다. 실시간 모니터링을 제공하는 장치를 사용하여 존재하는 초기 템플레이트 복제물 갯수에 따라서 서열 특이성 탐지 및 정량화가 5 내지 20분후에 달성될 수 있다.Fluorescence monitoring during DNA amplification is a powerful analytical technique. Sequence specificity detection and quantification can be achieved after 5-20 minutes depending on the number of initial template copies present using a device that provides real-time monitoring.

게다가, 도 11-17 에 도시된 시스템과 결과는 형광염료를 사용하여 생물학적 샘플을 연속 모니터링 하는데 특히 적합하다. 예컨대, 정확한 온도조절과 이중쇄 특이성 염료를 사용하여 용융 곡선에 의해 생성물 순도가 추정될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 신속한 온도 제어로 재어닐링 반응에 의해 생성물 절대농도가 측정될 수 있다. 본 발명은 공지기술에서 이용할 수 없는 신속한 온도 변화와 엄격한 샘플내 온도 균일성을 제공한다. 공지 기술에 비해서 본 발명은 높은 부피대 표면적비를 갖는 샘플용기를 하고(예컨대 도 11 의 모세관 샘플튜브(320)를 사용함으로써) 샘플 온도의 신속한 조절을 하는 열전달 매체로서 공기를 사용한다. 예컨대, 본 발명의 샘플 용기에서 샘플을 처리할 때 수득되는 샘플 온도대 시간 플롯은 모든 샘플이 열평형에 도달하는데 수초 걸리는 공지기술의 원추형 플라스틱 튜브에 비해서 변성온도 및 어닐링 온도에서 예리한 스파이크를 보인다(신속한 온도 응답을 보인다). 게다가 본 발명의 샘플용기는 본 발명의 열싸이클 횟수와 열 균일성이 다른 구조를 사용하여 가능한 열 싸이클 횟수와 열 균일성보다 우월하기 때문에 샘플 용기로서 엣칭된 실리콘 또는 유리칩을 사용하는 것보다 개선된 결과를 제공한다.In addition, the systems and results shown in FIGS. 11-17 are particularly suitable for continuous monitoring of biological samples using fluorescent dyes. For example, product purity can be estimated by melt curve using accurate temperature control and double chain specific dyes. The absolute temperature of the product can be measured by the reannealing reaction with the rapid temperature control provided by the present invention. The present invention provides rapid temperature changes and stringent temperature uniformity that are not available in the prior art. Compared to the known art, the present invention uses air as a heat transfer medium to make a sample container having a high volume to surface area ratio (for example, by using the capillary sample tube 320 of FIG. 11) and to quickly adjust the sample temperature. For example, the sample temperature vs. time plot obtained when processing a sample in the sample vessel of the present invention shows sharp spikes at denaturation and annealing temperatures compared to known conical plastic tubes of which all samples take several seconds to reach thermal equilibrium ( Rapid temperature response). Furthermore, the sample container of the present invention is improved over the use of etched silicon or glass chips as the sample container because the number of heat cycles and the thermal uniformity of the present invention are superior to the number of thermal cycles and the thermal uniformity possible. Results.

본 발명을 사용함으로써 지금까지 이해가 적었던 DNA 증폭의 여러 측면이 구별될 수 있다. 예컨대 생성물 변성은 일초이내에 일어나지만 공지 기술에서는 변성에 10초 내지 1분이 걸린다. 본 발명에 따라서 이중쇄 염료를 사용한 실시간 형광 모니터링에 의해 생성물 용융 관찰은 더 짧은 변성시간의 사용이 효과적임을 보여준다. 또다른 예로서 "평형 효과"의 여러 원인이 제안되었지만 이들을 구별하는데 이용가능한 데이타는 적었다. 도 13 에 도시된 바와 같이 생성물 재어닐링은 신속하다. 사실상 증폭의 후반기 싸이클동안 대부분의 생성물은 프라이머 어닐링 온도에 도달하기 이전에 냉각동안 싸이클마다 재어닐링된다. 이것은 본 발명에 의해 5-10℃/초의 냉각속도로 일어난다. 더 느린 공지기술의 온도 싸이클러를 사용한 생성물 재어닐링은 변성온도와 어닐링 온도간의 전이에 더 많은 시간이 필요하므로 훨씬 더 크다. 이러한 바람직하지 않은 효과는 생성물 수율을 제한시키고 당해 분야에 공지된 "평형 효과"의 주원인이다.By using the present invention, several aspects of DNA amplification, which have not been understood so far, can be distinguished. For example, product denaturation occurs within one second, but in the known art, denaturation takes 10 seconds to 1 minute. Product melt observation by real-time fluorescence monitoring with double chain dyes according to the present invention shows that the use of shorter denaturation times is effective. As another example, several causes of the "equilibrium effect" have been proposed but little data is available to distinguish them. Product reannealing is rapid as shown in FIG. 13. In fact, during the latter cycle of amplification, most of the product is reannealed from cycle to cycle during cooling before reaching the primer annealing temperature. This takes place at a cooling rate of 5-10 ° C./sec by the present invention. Product reannealing using slower known temperature cyclers is much larger because more time is required to transition between denaturation and annealing temperatures. This undesirable effect limits product yield and is a major cause of the "equilibrium effect" known in the art.

게다가, 본 발명은 상업적으로 사용될 수 있으며 신속한 싸이클 증폭동안 형광을 연속 모니터링하는 값싼 기기를 제공한다. 본 발명의 열 싸이클러는 10-20분후에 DNA 증폭을 수행할 수 있으며 본 발명의 광학적 탐지 성분은 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 형광단을 구별한다. 본 발명의 선호되는 구체예는 예컨대 24개의 샘플을 수초에 한 번, 특히 1초에 한 번, 더더욱 매초 10회 모니터링 한다.In addition, the present invention can be used commercially and provides an inexpensive instrument for continuously monitoring fluorescence during rapid cycle amplification. The thermal cycler of the present invention can perform DNA amplification after 10-20 minutes and the optical detection component of the present invention distinguishes one, two, three or more fluorophores. A preferred embodiment of the invention monitors for example 24 samples once every few seconds, in particular once every second, even ten times every second.

열 싸이클링 및 분석을 위해서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(도 11 에서 300)에 놓이는 모세관 샘플 튜브(320)와 공지의 96웰 장치를 사용하여 샘플을 준비하는 것도 본 발명의 범위내에 있다.It is also within the scope of the present invention to prepare a sample using a known 96 well device and a capillary sample tube 320 placed in a rapid temperature cycler (300 in FIG. 11) for fluorescence detection for thermal cycling and analysis.

본 발명의 선호되는 구체예는 공정이 진행될 때 DNA 증폭과 같은 생물학적 공정의 실시간 제어 및 최적화를 위해 형광 피이드백을 활용한다. 따라서 탐지되는 형광이 온도 싸이클링 제어에 사용된다. 본 발명의 구체예와 dsDNA-특이성 염료를 사용한 연속 모니터링 기술에 의해서 탐지된 형광이 증가를 중단한 후에 열싸이클마다 신장이 종결된다. 게다가, 본 발명에 따라서 생성물이 완전 용융될때까지 온도를 증가시킴으로써 변성조건이 또한 조절된다. 형광제와 Cy5-라벨링된 올리고누클레오타이드간의 공명에너지 전달을 사용하여 프라이머 어닐링이 탐지된다. 게다가, 본 발명을 사용하여 샘플의 온도 싸이클링이 예정된 양의 생성물 형성후 자동으로 종료된다.Preferred embodiments of the present invention utilize fluorescence feedback for real-time control and optimization of biological processes such as DNA amplification as the process proceeds. Thus, the detected fluorescence is used for temperature cycling control. Elongation is terminated every ten cycles after the fluorescence detected by the embodiments of the present invention and continuous monitoring techniques using dsDNA-specific dyes stops increasing. In addition, denaturing conditions are also controlled according to the invention by increasing the temperature until the product is completely melted. Primer annealing is detected using resonance energy transfer between the fluorescent agent and Cy5-labeled oligonucleotide. In addition, the temperature cycling of the samples is automatically terminated after the predetermined amount of product formation using the present invention.

본 발명에 따라서 본 발명의 장치를 사용하여 최소의 어닐링 및 변성시간으로 신속한 온도 싸이클링을 하면 PCR 정량을 개선하며 대립유전자 특이성 증폭의 식별성을 증가시킨다. 서열화를 위한 신속한 싸이클링은 서열 모호성을 감소시키고 디누클레오타이드 반복 증폭에 있어서 "섀도우 밴딩"을 최소화 한다. 본 발명에 따라서 최대 35kb까지의 긴 PCR동안 샘플이 높은 변성온도에 가능한 적게 노출될 때 수율이 향상된다.Rapid temperature cycling with minimal annealing and denaturation times using the device of the present invention in accordance with the present invention improves PCR quantitation and increases the discrimination of allele specific amplification. Rapid cycling for sequencing reduces sequence ambiguity and minimizes "shadow banding" in dinucleotide repeat amplification. In accordance with the present invention the yield is improved when the sample is exposed to as little as possible at high denaturation temperatures during long PCR up to 35 kb.

PCR을 세가지 반응, 즉 3가지 상이한 온도에서 일어나는 변성, 어닐링, 신장(도 18a)으로 취급하는 PCR에 대한 기존의 접근방법에 비해서 본 발명은 PCR동안 동적 패러다임을 개선시킨다. PCR동안 동적 패러다임을 사용하여(도 18b) 온도대 시간 곡선은 중첩 반응간의 연속 전이로 구성된다. 본 발명의 방법 및 장치는 동적 패러다임 하에서 PCR 수행에 특히 효과적이다. 도 18c 는 55℃의 어닐링 온도 근처에서 상이한 시간/온도 프로파일을 보여주는 그래프이다. 도 18c 에서 고체 트레이스는 10㎕ 샘플에 대한 응답온도를 나타내는 중앙에 위치된 "스파이크"를 보여준다. 대조적으로 도 18c 에서 길고 짧은 세그멘트로 도시된 트레이스는 열블럭 기기를 사용하여 수득된 샘플의 온도 응답을 나타낸다. 도 18c 에서 본 발명의 구체예는 당해분야의 공지기술에 따른 온도 "평형"에 비해서 어닐링 세그멘트 "스파이크"를 발생한다.The present invention improves the dynamic paradigm during PCR as compared to the conventional approach to PCR that treats PCR as three reactions, denaturation, annealing and elongation (FIG. 18A) that occur at three different temperatures. Using a dynamic paradigm during PCR (FIG. 18B), the temperature versus time curve consists of continuous transitions between overlapping reactions. The methods and apparatus of the present invention are particularly effective for performing PCR under a dynamic paradigm. 18C is a graph showing different time / temperature profiles near the annealing temperature of 55 ° C. FIG. The solid trace in FIG. 18C shows a centrally located “spike” representing the response temperature for 10 μL sample. In contrast, the traces shown in long and short segments in FIG. 18C show the temperature response of the sample obtained using a thermal block instrument. In FIG. 18C an embodiment of the present invention produces an annealing segment "spike" as compared to the temperature "equilibrium" according to the known art.

이전의 탐지용 기기는 수많은 결함을 가진다. 5 내지 10배 더 느린 공지 기기에 비해서 본 발명의 시스템에서는 신속하고 정확한 온도 싸이클링이 제공된다. 본 발명의 시스템에 의해 제공되는 연속 형광 모니터링을 사용하여 교합의 온도 의존성이 추구될 수 있다. 온도 싸이클링 동안 교합을 추적함으로써 필요한 프로브 갯수나 스펙트럼 색상이 최소화 될 수 있다. 즉, 탐지될 각 DNA 종에 대해 상이한 형광단 라벨링된 프로브를 합성하기 보다는 동적 용융 특성에 의해 상이한 생성물과 돌연변이가 탐지될 수 있다.Previous detection devices have a number of flaws. Fast and accurate temperature cycling is provided in the system of the present invention as compared to known equipment which is 5 to 10 times slower. The temperature dependence of the occlusion can be sought using the continuous fluorescence monitoring provided by the system of the present invention. By tracking occlusion during temperature cycling, the required number of probes or spectral colors can be minimized. That is, different products and mutations can be detected by dynamic melting properties rather than synthesizing different fluorophore labeled probes for each DNA species to be detected.

가장 경제적으로 본 발명의 구체예를 제공하기 위해서 샘플 조사를 위해 크세논 아아크원이나 레이저 대신에 고밀도 발광 다이오드가 사용되어 포토다이오드가 탐지에 사용된다. 샘플은 열밀봉을 요하지 않는 96-웰 포맷으로 복합 유리/플라스틱 샘플용기나 유리 모세관 샘플튜브에 충진된다(도 21a-d). 따라서 본 발명은 저렴한 비용으로 실시간 형광 분석을 제공한다. 온도 싸이클링의 실시간 형광 제어는 증폭 품질을 개선한다. 예컨대, 샘플온도가 변성이 일어날 때 까지만 증가된다면 고온에 대한 샘플의 노출이 최소화 된다. 이것은 생성 및 효소 분해를 최소화 시킴으로써 수율을 증가시키고 높은 용융온도를 갖는 생성물의 증폭을 제한함으로써 특이성을 증가시킨다.In order to provide the most economical embodiment of the present invention, high density light emitting diodes are used instead of xenon arc sources or lasers for sample irradiation so that photodiodes are used for detection. Samples are filled in composite glass / plastic sample containers or glass capillary sample tubes in a 96-well format that does not require heat sealing (FIGS. 21A-D). Thus, the present invention provides real time fluorescence analysis at low cost. Real-time fluorescence control of temperature cycling improves amplification quality. For example, if the sample temperature is increased only until denaturation occurs, exposure of the sample to high temperatures is minimized. This increases yield by minimizing production and enzymatic degradation and increases specificity by limiting amplification of products with high melting temperatures.

도 19 는 단일 샘플의 연속 모니터링을 위한 본 발명의 구체예를 다이아그램으로 도시한다. 그러나, 도 19 및 20 에 도시된 구조는 도 11 에 도시된 장치와 같은 다중샘플을 자동 처리하는 시스템에 포함될 수 있다. 도 19 의 구체예에서 단일 샘플 홀더(402)가 온도조절된 공기흐름과 선형 광학경로의 교점에 위치된 유지 브라켓(404)에 놓인다. 샘플 홀더(402)는 바람직한 특성을 가지는 튜브(402A)를 포함한다. 본 발명에 따라서 상이한 구성의 모세관 튜브가 사용될 수 있으며 튜브(402A)는 특히 직사각형 단면을 가진다. 생물학적 샘플은 튜브(402A)의 바닥 단부(402B)에 유지된다. 캡(402)이 샘플 홀더(402)상에 또한 제공된다.19 shows diagrammatically an embodiment of the invention for continuous monitoring of a single sample. However, the structure shown in FIGS. 19 and 20 can be included in a system for automatically processing multiple samples, such as the device shown in FIG. In the embodiment of FIG. 19, a single sample holder 402 is placed in a retaining bracket 404 located at the intersection of the temperature controlled airflow and the linear optical path. Sample holder 402 includes a tube 402A having desirable properties. According to the invention capillary tubes of different configurations can be used and the tube 402A has a particularly rectangular cross section. The biological sample is held at the bottom end 402B of the tube 402A. Cap 402 is also provided on sample holder 402.

도 19a-e 는 샘플용기의 상이한 구성이 샘플의 온도응답에 미치는 효과를 비교한다. 도 19e 에 도시된 온도-시간은 도 19a-c 에 도시된 샘플용기를 사용하여 수득되는 응답에 대응한다. 도 19a-d 에 도시된 샘플용기 구성에 대한 추가 정보는 다음과 같다.19A-E compare the effect of different configurations of sample containers on the temperature response of the samples. The temperature-time shown in FIG. 19E corresponds to the response obtained using the sample vessel shown in FIGS. 19A-C. Further information on the sample container configuration shown in Figure 19a-d is as follows.

도면drawing 표면적(㎟/10㎕)Surface Area 유체칼럼길이(㎜)Fluid column length (mm) 샘플부피Sample volume 소스sauce 19A19A 7777 4747 10㎕10 μl Kimble KIMAX #46485-1Kimble KIMAX # 46485-1 19B19B 4242 13.813.8 34㎕34 μl Kimble KIMAX #46485-15Kimble KIMAX # 46485-15 19C19C 3232 88 59㎕59 μl Kimble KIMAX #34500-99Kimble KIMAX # 34500-99 19D19D 1818 N/AN / A 10㎕10 μl MICROAMPTMtube of Perkin-Elmer Cetus GeneAmp PCR System 9600MICROAMP TM tube of Perkin-Elmer Cetus GeneAmp PCR System 9600

도 19 의 장치에서, 활성화 복사원(418), 특히 LED, 더더욱 청색 LED가 샘플홀더(402)를 조사하도록 제공된다. 활성화 복사원(418)에 의해 방출된 빛은 비구면 촛점 렌즈(420) 및 활성화 대역 필터(422)를 통과하여 샘플 홀더(420)상에서 촛점이 잡힌다.In the apparatus of FIG. 19, an activating radiation source 418, in particular an LED, even more blue LED, is provided to illuminate the sample holder 402. Light emitted by the activating radiation source 418 passes through the aspheric focus lens 420 and the activation band filter 422 to be focused on the sample holder 420.

도 19 에 도시된 광학성분은 특히 광학 하우징(412)에 유지된다. 하우징(406) 역시 제공된다. 공기 덕트(414)를 통해 샘플 브라켓(404)에 유지된 샘플 홀더(402)위로 공기를 이동시키도록 팬(408)이 제공된다. 온도유닛(410)이 공기 흐름 경로에 위치되어서 샘플 홀더(404)위로 공기가 통과하는 동안 가열 또는 냉각을 시킨다. 노즐(416)은 공기를 샘플홀더(404)위로 효과적으로 안내한다.The optical component shown in FIG. 19 is particularly retained in the optical housing 412. Housing 406 is also provided. A fan 408 is provided to move air over the sample holder 402 held in the sample bracket 404 through the air duct 414. The temperature unit 410 is positioned in the air flow path to heat or cool while air passes over the sample holder 404. The nozzle 416 effectively guides air over the sample holder 404.

샘플에 의해 방출된 빛은 두 개이상의 비구면렌즈(420)와 방출대역 필터(424)를 통과하고 포토 다이오드와 같은 광탐지기(426)에 의해 수신된다.Light emitted by the sample passes through two or more aspherical lenses 420 and emission bandpass filter 424 and is received by a light detector 426 such as a photodiode.

도 19f 와 19g 는 직사각형 모세관 튜브(403A)를 활용하는 샘플 용기(403)의 측부 및 단면도면이다. 모세관 튜브(403A)는 Vitro Dynamics Inc.에 의해 구매가능하다(1㎜×3㎜×5㎜). 제 1 캡 부재(403B) 및 제 2 캡부재(403C)는 스크루(403D)에 의해 연결되며 스크루(403D)는 모세관 튜브(403A) 홀더로서도 기능을 한다.19F and 19G are side and cross-sectional views of sample vessel 403 utilizing rectangular capillary tube 403A. Capillary tube 403A is commercially available from Vitro Dynamics Inc. (1 mm x 3 mm x 5 mm). The first cap member 403B and the second cap member 403C are connected by a screw 403D, and the screw 403D also functions as a capillary tube 403A holder.

도 19h 와 19i 는 속에 담긴 샘플의 형광을 탐지할 때 직사각형 모세관 튜브(403A)의 두가지 가능한 방향을 보여준다. 도 19h 는 모서리가 활성화 및 탐지 광학장치의 축과 일직선이 되도록 배향된 직사각형 모세관 튜브(403A)를 보여준다("엣지 활성화 및 탐지"). 도 19i 는 면이 활성화 및 탐지 광학장치의 축과 일직선이 되도록 배향된 직사각형 모세관 튜브(403A)를 보여준다("페이스 활성화 및 탐지"). 놀랍게도 도 19h 에 도시된 엣지 탐지 방향으로 부터 수득된 형광신호는 도 19i 에 도시된 페이스 탐지 방향으로 부터 수득된 신호보다 3 내지 5배 더 높다. 도 19h 에 도시된 엣지 탐지 방향을 사용하여 수득되는 바람직한 특성은 형광신호를 모세관 튜브(403A)의 극단에 집중시키는 모세관 튜브(403A)에서 발생하는 총 내부반사 때문이다.19H and 19I show two possible directions of rectangular capillary tube 403A when detecting fluorescence of the sample contained therein. 19H shows a rectangular capillary tube 403A oriented such that the edge is aligned with the axis of the activation and detection optics (“edge activation and detection”). 19I shows a rectangular capillary tube 403A oriented such that the face is aligned with the axis of the activation and detection optics (“face activation and detection”). Surprisingly, the fluorescence signal obtained from the edge detection direction shown in Fig. 19H is three to five times higher than the signal obtained from the face detection direction shown in Fig. 19I. The preferred property obtained using the edge detection direction shown in FIG. 19H is due to the total internal reflection that occurs in the capillary tube 403A that concentrates the fluorescence signal at the extreme of the capillary tube 403A.

도 20 은 본 발명에 따른 또다른 광학 성분을 보여준다. 도 20 에 도시된 광학성분은 도 21 에 도시된 열 싸이클링 및 샘플 취급 구조물에 포함된다.20 shows another optical component according to the invention. The optical component shown in FIG. 20 is included in the thermal cycling and sample handling structure shown in FIG.

도 20 및 도 21 의 구체예에서는 광학적 활성화 및 탐지경로가 선형경로 보다는 에피플루오레센트 경도로서 조합된다. 도 20 및 21 에서 활성화 및 방출에너지는 활성화 경로에 사용된 2색 요소와 모세관 튜브사이에서 동일한 광학 경로를 따른다. 활성화 및 방출 세기를 둘다 증가시키기 위해서 이용되는 모세관 튜브의 길이를 따른 총 내부반사("광파이핑") 때문에 도 20 및 21 의 구체예에 사용되도록 모세관 튜브가 개조된다.20 and 21, the optical activation and detection paths are combined as epifluorescent hardness rather than linear paths. 20 and 21 the activation and emission energies follow the same optical path between the two color elements used in the activation path and the capillary tube. Capillary tubes are adapted for use in the embodiments of FIGS. 20 and 21 because of total internal reflection along the length of the capillary tubes used to increase both activation and emission intensity (“light piping”).

도 20 및 21 의 구체예에서, 최대 광 파이핑을 수용하기 위해서 광학적 축은 모세관 튜브의 길이에 평행하며 모세관 튜브의 팁은 촛점에 위치된다. 샘플의 굴절계수가 1.33이다면 방출된 빛의 12.3%가 팁으로 안내된다. 샘플을 모세관 튜브의 팁으로 이동시키는데 원심력이 사용될 수 있다.In the embodiment of FIGS. 20 and 21, the optical axis is parallel to the length of the capillary tube and the tip of the capillary tube is in focus to accommodate maximum light piping. If the sample has a refractive index of 1.33, 12.3% of the emitted light is directed to the tip. Centrifugal force can be used to move the sample to the tip of the capillary tube.

도 22a 는 모세관 튜브의 팁에서 형광을 탐지할 때 광파이핑 효과를 보여주는 것으로 모세관 샘플 용기의 측부(개방원)보다 팁(폐쇄다이아몬드)을 관찰할 때 신호세기가 10배 증가한다. 도 22b 에 표시된 바와 같이 두가지 상이한 크기의 모세관 샘플 튜브를 사용하며 SYBR Green I으로 염색된 dsDNA로 상이한 길이만큼 충진된 튜브를 사용하여 수득된 결과가 도시된다. 도 22a 및 22b 로 부터 더 많은 샘플이 튜브에 첨가될 때 형광 효율을 감소하지만 관찰된 에피플루오레센스는 증가한다.FIG. 22A shows the light piping effect when detecting fluorescence at the tip of a capillary tube, where the signal strength is increased 10 times when observing the tip (closed diamond) than the side (open circle) of the capillary sample vessel. Results obtained using two different size capillary sample tubes as indicated in FIG. 22B and using tubes filled with different lengths of dsDNA stained with SYBR Green I are shown. 22A and 22B decrease the fluorescence efficiency when more samples are added to the tube but the observed epifluorescein increases.

모세관에서 나오는 방출의 광학적 성질이 형광제 용액으로 채워진 모세관에서 나오는 형광을 470㎚에서 자극함으로써 검사된다. 모세관의 단부로 부터 나오는 방출은 방출이 미소한 파장의 형광의 결과일 경우에 기대되는 유리에 집중되기 보다는 모세관 페이스를 가로질러 균질적이다.The optical properties of the emission from the capillary are examined by stimulating the fluorescence from the capillary filled with the fluorophore solution at 470 nm. The emission from the end of the capillary is homogeneous across the capillary face rather than concentrated on the glass expected when the emission is the result of a small wavelength of fluorescence.

도 20 에 나타난 광학적 성분은 모세관 튜브의 평행 에피플루오레센트 조사를 수행한다. 도 20 에서 활성화 복사원(468)은 LEDtronics로 부터 구매가능하며 매우 밝은 LED로서 공지되는 청색 LED이다. 방출된 형광신호는 광 탐지기(466A, 466B)에 의해 인식된다. 활성화 복사원(468)과 광 탐지기(466A, 466B)는 필요한 회로를 포함하며 필터를 광탐지기(466A, 466B)와 집적시키는 장착보오드(468)상에 유지된다. 선호되는 장착 보오드는 Ealing Electronics로 부터 구매가능하며 TO5 패키지에 고성능 실리콘 포토다이오드와 0.5인치 간섭필터를 포함하는 것이다. 활성화 및 탐지성분은 관련 전자소자와 함께 장착 보오드(468)에 직접 유지된다. 광학 성분의 직경은 1.0인치 이하가 선호된다. 조준렌즈(454), 두 개의 2색 필터(456A, 456B), 거울(458), 간섭필터(460A-C) 및 비구면 촛점 렌즈(462A-C)가 복사광을 샘플로 인도한다.The optical component shown in FIG. 20 performs parallel epifluorescent irradiation of the capillary tube. The active radiation source 468 in FIG. 20 is a blue LED, commercially available from LEDtronics and known as a very bright LED. The emitted fluorescence signal is recognized by the light detectors 466A and 466B. The activating radiation source 468 and photodetectors 466A, 466B contain the necessary circuitry and are held on a mounting board 468 that integrates the filter with the photodetectors 466A, 466B. Preferred mounting boards are available from Ealing Electronics and include a high-performance silicon photodiode and a 0.5 inch interference filter in a TO5 package. The activation and detection components are held directly on the mounting board 468 along with the associated electronics. The diameter of the optical component is preferably 1.0 inch or less. Aim lens 454, two bi-color filters 456A and 456B, mirror 458, interference filter 460A-C and aspheric focus lens 462A-C guide the radiant light to the sample.

도 20 에서 분석 수행시 단지 2가지 색상/파장을 사용했을지라도 3가지 이상의 색상분석이 가능하다. 3가지 이상의 색상분석을 제공하기 위해서 도 20 에 도시된 장치는 추가 2색 필터와 광 탐지기를 수용할 수 있다. 게다가, 다색 습득을 위해 선형 광 탐지기 배열상에 파장을 동시 분리할 수 있다. 선형 광 탐지기 배열이 본 발명에 사용될 때 프리즘 또는 회절격자가 다중파장 탐지를 위해 렌즈 및 광탐지기 배열 또는 CCD와 함께 활용되는 것이 좋다. 당해 산업에서 이용가능한 한가지 선형 광 탐지기 배열은 500 내지 800㎚ 사이에서 15-30개의 10-20㎚ 파장 빈을 수집한다. 대개의 단색측정계에 사용된 격자를 위해 Littrow 자체조준 구성과 같은 다양한 광학 성분 구성이 수집효율, 스펙트럼 분해 및 공간 조건을 최상으로 조절할 수 있다. 도 20 의 장치는 도 21 의 자동 열 순환장치에 포함된다.Although only two colors / wavelengths are used when performing the analysis in FIG. 20, three or more colors can be analyzed. In order to provide three or more color analyzes, the apparatus shown in FIG. 20 can accommodate additional two-color filters and photodetectors. In addition, wavelengths can be simultaneously separated on a linear photodetector array for multicolor acquisition. When a linear photodetector array is used in the present invention, it is preferred that a prism or diffraction grating be utilized with the lens and photodetector array or CCD for multiwavelength detection. One linear light detector arrangement available in the industry collects 15-30 10-20 nm wavelength bins between 500 and 800 nm. For gratings used in most monochrome measurement systems, various optical component configurations, such as the Littrow self-aimating configuration, provide the best control of acquisition efficiency, spectral resolution and spatial conditions. The apparatus of FIG. 20 is included in the automatic thermal cycler of FIG.

도 21 은 신속한 온도 싸이클링 성분, 샘플취급 성분, 및 도 20 에 도시된 광학적 성분을 포함하는 본 발명의 또다른 구체예의 개략도로서 샘플용기의 팁에서 형광 탐지를 제공한다(에피플루오레센스). 도 21 에 도시된 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)는 특별한 장점을 제공한다.FIG. 21 is a schematic diagram of another embodiment of the present invention that includes a rapid temperature cycling component, a sample handling component, and the optical component shown in FIG. 20 to provide fluorescence detection at the tip of the sample vessel (epifluorescens). The rapid temperature cycler 400 with epifluoresce detection shown in FIG. 21 provides particular advantages.

도 21 에 도시된 구체예에서 공기는 구멍(470)을 통해 유입되고 라인(472)으로 표시된 흐름 경로를 따른다. 공기의 온도와 플라스틱/유리 샘플용기(450)의 온도는 Reheat, Inc.으로 부터 구매가능한 400와트 가열 카트리지(474)를 사용하여 조절된다. 가열 카트리지(474)는 중앙 덕트(476)내에 위치된다. 표시된 경로(472)로 공기를 이동시키기 위해서 팬(498)이 제공된다. 팬은 샤프트(496) 및 모터(494)를 경유하여 구동된다. 모터(494)는 Excap AG.로 부터 구매가능하며 최대 15,000의 rpm을 가지는 DC 회토류 브러쉬 모터이다. 플라스틱/유리 샘플튜브(450)를 가열할 때 가열 카트리지가 비례적으로 조절되고 팬이 저속(12볼트, 0.5암페어)으로 작동되어서 모든 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에 온도 균질성을 제공한다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)를 냉각할 때 가열 카트리지(474)가 작동중지되고 모터(494)가 고속으로(27볼트, 1.4암페어를 적용하여 최대속도가 획득된다) 작동된다. 팬(498)은 구멍(470)으로 공기를 유입시키고 배출포트(471)를 경유하여 배출시킨다.In the embodiment shown in FIG. 21, air enters through hole 470 and follows the flow path indicated by line 472. The temperature of the air and the temperature of the plastic / glass sample vessel 450 are controlled using a 400 watt heating cartridge 474 available from Reheat, Inc. The heating cartridge 474 is located in the central duct 476. A fan 498 is provided to move air along the indicated path 472. The fan is driven via shaft 496 and motor 494. Motor 494 is a DC rare earth brush motor available from Excap AG. With a maximum rpm of 15,000 rpm. When heating the plastic / glass sample tube 450 the heating cartridge is proportionally controlled and the pan is operated at low speed (12 volts, 0.5 amps) to provide temperature homogeneity to all plastic / glass sample vessels 450. When cooling the plastic / glass sample vessel 450 the heating cartridge 474 is deactivated and the motor 494 is operated at high speed (27 volts, 1.4 amperes at maximum speed is obtained). The fan 498 introduces air into the hole 470 and discharges it through the discharge port 471.

에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에서 24개의 플라스틱/유리 샘플 용기(450)(도 21 에 두 개가 도시된)가 가열 카트리지(474)와 중앙 덕트(476) 주위에 대칭적으로 배열된다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)는 원형 카루셀(480)에 각 플라스틱/유리 샘플용기(450)의 위치를 정확히 조절하는 (오프셋 구조로 인하여) 슬리이브(451)에 의해 수용된다. 슬리이브(451)는 황동으로 제조된다. 유리/플라스틱 샘플용기(450)의 팁이 도 21 에 도시된 광학적 촛점에 있도록 측부 및 종방향으로 정확히 조절되고 동시에 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)가 조립되도록 슬리이브(451)의 오프-축 구조물은 슬리이브(451)가 정렬되게 한다.In a rapid temperature cycler 400 with epifluorescence detection, 24 plastic / glass sample containers 450 (two shown in FIG. 21) are symmetrical around the heating cartridge 474 and the central duct 476. Is arranged. The plastic / glass sample container 450 is received by the sleeve 451 (due to the offset structure) that precisely adjusts the position of each plastic / glass sample container 450 in the circular carousel 480. The sleeve 451 is made of brass. The sleeve 451 allows the rapid temperature cycler 400 to be assembled to precisely adjust laterally and longitudinally, while simultaneously allowing epifluoresce detection, so that the tip of the glass / plastic sample container 450 is at the optical focus shown in FIG. The off-axis structure of) causes the sleeve 451 to be aligned.

카루셀(480)은 하우징(490) 위로 베어링(482)상에 지탱된다. 카루셀(480)은 샤프트(486)를 통해 모터(488)에 연결된 구동 기어(474)가 제공된 스테핑 모터(488)에 의해 위치선정된다. 스테핑 모터(488)는 New England Affiliated Technologies로 부터 구매가능한 제어기를 사용하여 마이크로 스테핑되어서 카루셀(480) 회전당 10,000 스텝 이상을 제공하여서 각 플라스틱/유리 샘플 용기(450)의 정확한 위치르 선정시킨다. 하우징(490)의 내부에는 절연재료가 제공된다. 배플(476)은 배출포트(471)를 형성하고 주변 빛을 차단하는 작용을 한다.Carousel 480 is supported on bearing 482 over housing 490. Carousel 480 is positioned by stepping motor 488 provided with a drive gear 474 connected to motor 488 via shaft 486. Stepping motor 488 is microstepped using a controller available from New England Affiliated Technologies to provide more than 10,000 steps per carousel 480 rotation to select the correct location of each plastic / glass sample vessel 450. An insulating material is provided inside the housing 490. The baffle 476 forms the discharge port 471 and serves to block ambient light.

도 21a-d 는 플라스틱/유리 샘플용기(450)의 세부도면이다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)는 한 단부가 폐쇄된 모세관 튜브 부위(450B)를 포함한다. 모세관 튜브 부위(450B)는 다양한 모양을 가질 수 있다. 그러나 샘플 온도 균일성과 신속한 온도 싸이클링을 위해서 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에 의해 유지되는 유체의 부피는 1밀리미터 이상이지 않는 것이 좋다. 예컨대, 모세관 튜브부위(450B)를 제조하는 재료는 식(cal.㎝/㎠s.℃)×100에 따라서 20 내지 35의 열전도성을 가지는 것이 좋다. 게다가, 다양한 유리의 열전도성에 관한 추가정보는 R.C. Weast & M.J. Astle, HANDBOOK OF CHEMISTRY AND PHYSICS, page E-6 (1982) (CRC Press)로부터 획득된다. 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에는 적절한 플라스틱으로 제조되며 모세관 튜브 부위(450b)의 개방단부에 연결된 저장원 부위(450c)가 제공된다. 다양한 재료가 저장원 부위(450c) 제조에 사용될 수 있지만 플라스틱 재료가 퍼넬형으로 형성되어 모세관 튜브 부위(450B)에 부착되는 것이 선호된다.21A-D are detailed views of the plastic / glass sample container 450. The plastic / glass sample vessel 450 includes a capillary tube portion 450B with one end closed. Capillary tube region 450B may have a variety of shapes. However, for sample temperature uniformity and rapid temperature cycling, the volume of fluid maintained by the plastic / glass sample vessel 450 is preferably no greater than 1 millimeter. For example, the material for producing the capillary tube portion 450B preferably has a thermal conductivity of 20 to 35 according to the formula (cal. Cm / cm 2 s. ° C.) × 100. In addition, additional information on the thermal conductivity of various glasses can be found in R.C. Weast & M.J. Astle, HANDBOOK OF CHEMISTRY AND PHYSICS, page E-6 (1982) (CRC Press). The plastic / glass sample vessel 450 is provided with a reservoir source portion 450c made of a suitable plastic and connected to the open end of the capillary tube portion 450b. Various materials may be used for the manufacture of the reservoir source 450c, but it is preferred that the plastic material is formed in a funnel shape and attached to the capillary tube region 450B.

샘플(S)은 피펫(P) 또는 적당한 기구를 사용하여 수동 또는 자동으로 복합 플라스틱/유리 샘플 용기(450)에 충진된다. 샘플의 부피는 0.01 내지 10,000㎕, 특히 0.01 내지 100㎕, 더더욱 0.01 내지 10㎕이며 5㎕가 가장 선호된다. 샘플이 각 플라스틱/유리 샘플용기(450)에 첨가되면 플라스틱/유리 샘플 용기(450)가 저속으로 원심력을 받아서 샘플을 모세관 부위(450B) 폐쇄 단부의 팁에 위치시켜서 도 21b 에 도시된 것처럼 샘플이 0.2-2.0㎝의 유체 칼럼(450A)을 형성한다. 플라스틱 플러그로 구성될 수 있는 스토퍼(450D)가 이후에 저장원 부위(450C)에 놓여서 도 21C 에 도시된 것처럼 플라스틱/유리 샘플 용기(450)를 밀봉시키고 플라스틱/유리 샘플 용기(450)가 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에서 슬리이브(451)에 놓인다. 모세관 튜브 부위(450B)를 밀봉하기 위해서 상이한 구조를 제공할 수 있다.Sample S is filled into composite plastic / glass sample vessel 450 manually or automatically using pipette P or a suitable instrument. The volume of the sample is 0.01 to 10,000 μl, in particular 0.01 to 100 μl, even 0.01 to 10 μl and 5 μl is most preferred. Once the sample is added to each plastic / glass sample vessel 450, the plastic / glass sample vessel 450 is subjected to centrifugal force at low speed to place the sample at the tip of the closed end of the capillary region 450B so that the sample is removed as shown in FIG. 21B. A fluid column 450A of 0.2-2.0 cm is formed. A stopper 450D, which may consist of a plastic plug, is then placed in the storage source portion 450C to seal the plastic / glass sample vessel 450 as shown in FIG. 21C and the plastic / glass sample vessel 450 is epiflu. It is placed in the sleeve 451 in a rapid temperature cycler 400 with oresense detection. Different structures may be provided to seal the capillary tube region 450B.

유리/플라스틱 샘플 용기(450)의 모세관 튜브 부위(450B)는 0.8㎜ 내경과 1.0㎜ 외경을 가지며 한 단부가 폐쇄되며 플라스틱 저장원(450C)을 수용하기 위해서 다른 단부가 벌어진 유리 모세관 튜브이다. 유리/플라스틱 샘플 용기(450)는 용이하고 경제적으로 제조될 수 있다. 모세관 튜브 부위(450B)의 팁(450E)의 모양은 광학적 효율을 위해 최적화 된다. 평평한 팁 뿐만 아니라 다양한 외부곡률 및 내부 곡률을 갖는 팁이 본 발명에서 사용될 수 있다.The capillary tube portion 450B of the glass / plastic sample vessel 450 is a glass capillary tube with a 0.8 mm inner diameter and a 1.0 mm outer diameter, closed at one end and opened at the other end to accommodate the plastic reservoir 450C. The glass / plastic sample container 450 can be manufactured easily and economically. The shape of the tip 450E of the capillary tube region 450B is optimized for optical efficiency. As well as flat tips, tips having various external and internal curvatures can be used in the present invention.

도 21a-d 에서 모세관 튜브에 플라스틱 충진 및 밀봉 구조물의 첨가는 바람직한 열적 특성을 유지하면서 유리 모세관 튜브의 효과적인 사용을 가능하게 한다. 샘플을 플라스틱/유리 샘플용기(450)에 첨가하고 96-웰 포맷으로 샘플이 원심력을 받게 할 수 있다. 게다가, 플라스틱/유리 샘플 용기를 에피플루오레센스 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에 적재하고 플라스틱/유리 샘플 용기(450)를 96-웰 포맷 또는 다른 포맷으로 적재할 수 있다.The addition of plastic filling and sealing structures to the capillary tubes in FIGS. 21A-D allows for the effective use of glass capillary tubes while maintaining desirable thermal properties. The sample may be added to the plastic / glass sample container 450 and subjected to centrifugal force in a 96-well format. In addition, the plastic / glass sample vessel may be loaded into a rapid temperature cycler 400 for epifluoresce detection and the plastic / glass sample vessel 450 may be loaded in a 96-well format or other format.

복합 플라스틱/유리 샘플용기(450)는 편리하고 값싼 샘플홀더를 제공한다. 도 21 에서 매초 1 내지 10회 단일 샘플로 부터 형광이 획득된다. 다중 샘플로 부터 형광을 획득할 때 카루셀(480)을 빠르게 회전시켜서 샘플이 제위치에 이동될 필요가 있다. 스테핑 모터(488)와 제어장치를 사용하여 24개의 샘플이 도 21 에 도시된 모니터링 위치에 빠르고 정확하게 이동될 수 있다.Composite plastic / glass sample container 450 provides a convenient and inexpensive sample holder. In FIG. 21 fluorescence is obtained from a single sample 1-10 times per second. When obtaining fluorescence from multiple samples, the carousel 480 needs to be quickly rotated to move the sample in place. Using the stepping motor 488 and the control, 24 samples can be moved quickly and accurately to the monitoring position shown in FIG.

각 샘플에서 나오는 형광 신호가 100msec동안 획득될 때 신호분산은 1% 미만이다. 신호획득시간을 감소시키고 변화속도를 증가시키고 반복된 샘플링으로 부터 분산계수를 관찰하는 것도 본 발명의 범위내에 있다. 24개의 샘플이 처리되고 초당 1 내지 10회전의 속도로 중단없이 카루셀이 회전될 때 각 샘플은 0.37-3.7msec의 활성화 및 탐지시간을 가진다.The signal dispersion is less than 1% when the fluorescence signal from each sample is acquired for 100 msec. It is also within the scope of the present invention to reduce signal acquisition time, increase the rate of change, and observe the dispersion coefficient from repeated sampling. Each sample has an activation and detection time of 0.37-3.7 msec when 24 samples are processed and the carousel is rotated without interruption at a rate of 1 to 10 revolutions per second.

기술된 정보를 사용하여 당해분야 숙련자는 형광신호가 소프트웨어나 하드웨어를 통해 적분되는지를 선택할 수 있다. 선호되는 구체예에서, 피크 탐지 및 적분을 위해 하위 프로그램을 갖는 LabView (National Instrument)와 같은 그래픽 프로그래밍 언어가 신속한 온도 싸이클러(400)와 관련하여 사용된다. 또다른 구체예에서, 신호가 아날로그 디지탈 전환에 최적인 수준에 도달하도록 가변적 적분시간(사용자 조절가능한 민감도 제어)으로 하드웨어에서 적분이 행해진다.Using the information described, one skilled in the art can select whether the fluorescence signal is integrated via software or hardware. In a preferred embodiment, a graphical programming language such as LabView (National Instrument) with subprograms for peak detection and integration is used in connection with the rapid temperature cycler 400. In another embodiment, the integration is done in hardware with variable integration time (user adjustable sensitivity control) so that the signal reaches an optimal level for analog digital conversion.

도 21 에 도시된 신속한 온도 싸이클러(400)를 사용하여 반응이 진행될 때 샘플의 연속 모니터링을 어닐링, 신장 및 변성의 연속 관찰에 기초하여 증폭동안 온도 싸이클링의 조건을 결정할 수 있게 한다. 이것은 모든 싸이클링 매개변수가 증폭 시작 이전에 결정되고 프로그램되는 공지기술과 대비된다. 공지 기술에 따르면 최저 용융 프라이머와 등가인 상보적 올리고누클레오타이드를 사용하여 초기 싸이클동안에 어닐링 효율이 조절된다. 많은 경우에 충분한 생성물이 형성되는 나중 싸이클동안 신장 및 변성이 dsDNA 염료를 써서 모니터링 될 수 있다. 이러한 조건은 변성 및 신장 조건이 대개의 생성물을 증폭하는데 충분하며 제 1 증폭에서 나오는 데이타가 후속 시행의 최적화에 사용될 수 있기 때문에 일반적으로 문제가 아니다.The rapid temperature cycler 400 shown in FIG. 21 is used to allow continuous monitoring of the sample as the reaction proceeds to determine the conditions of temperature cycling during amplification based on continuous observation of the annealing, stretching and denaturation. This is in contrast to the known art in which all cycling parameters are determined and programmed before the start of amplification. According to the known art, the annealing efficiency is adjusted during the initial cycle using complementary oligonucleotides that are equivalent to the lowest melting primers. In many cases elongation and denaturation can be monitored using dsDNA dyes during later cycles when sufficient product is formed. These conditions are generally not a problem because denaturing and stretching conditions are usually sufficient to amplify the product and the data from the first amplification can be used to optimize subsequent runs.

도 21 에서, 도 11 의 구체예와 관련하여 기술된 정보를 사용하여 사용자 인터페이스 및 제어부(500)가 제조될 수 있다. 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)의 선호되는 일례로서 12비트 다기능 입/출력 카드(National Instruments)로 LabView 프로그래밍 언어를 실행하는 펜티엄 마이크로컴퓨터가 데이타 습득 및 제어를 제공한다. 아날로그 출력신호가 광 탐지기(466A, 466B)와 관련된 증폭기를 조절하는데 사용된다. 아날로그 입력 채널은 열전쌍을 통한 샘플온도 측정과 포토다이오드에 의한 형광을 측정한다. 도 21 에 도시된 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)는 또한 활성화 복사원(468) 스테핑 모터(488)의 방향, 가열 카트리지(474), 및 팬(498)의 디지탈 I/O 제어를 한다.In FIG. 21, a user interface and control unit 500 can be manufactured using the information described in connection with the embodiment of FIG. 11. As a preferred example of the user interface and instrument control 500, a Pentium microcomputer running a LabView programming language with a 12-bit multifunction input / output card (National Instruments) provides data acquisition and control. An analog output signal is used to adjust the amplifiers associated with the light detectors 466A, 466B. Analog input channels measure sample temperature through thermocouples and fluorescence by photodiodes. The user interface and device control 500 shown in FIG. 21 also performs digital I / O control of the activating radiation source 468 stepping motor 488, the heating cartridge 474, and the fan 498.

dsDNA 염료 SYBR Green I 또는 형광 라벨링된 올리고 누클레오타이드 프로브를 함유하는 PCR 샘플의 연속 형광 모니터링이 각 증폭 싸이클동안 교합 및 용융을 모니터링 하는데 사용될 수 있다. 이 정보는 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)의 배열에 의해 사용되어서 열 싸이클링 조건을 개선시킬 수 있다. 온도 싸이클링 동안 교합 정보를 사용하는 장점은 다음과 같다:Continuous fluorescence monitoring of PCR samples containing dsDNA dye SYBR Green I or fluorescently labeled oligonucleotide probes can be used to monitor occlusion and melting during each amplification cycle. This information can be used by the user interface and the arrangement of the device control unit 500 to improve thermal cycling conditions. The advantages of using occlusal information during temperature cycling include:

(A) 높은 변성온도에 노출을 최소화함으로써 증폭 생성물 및 폴리메라제에 대한 열유도손상을 방지하며, 의도된 증폭생성물보다 높은 Tm을 갖는 생성물을 가려내는 변성온도를 최소화함으로써 반응특이성을 증가시키면서 각 싸이클동안 PCR생성물의 완전 변성이 일어나게 하며;(A) Minimize exposure to high denaturation temperatures to prevent heat induced damage to amplification products and polymerases, and to increase reaction specificity by minimizing denaturation temperatures to screen out products with higher Tm than intended amplification products. Allow complete denaturation of the PCR product during the cycle;

(B) 생성물 신장 완료에 필요한 시간보다 짧게 함으로써 증폭에 필요한 시간을 최소화하고, 의도된 증폭 생성물보다 긴 생성물을 가려냄으로써 반응특이성을 증가시키면서 각 싸이클에 생성물 신장에 적절한 시간을 보장함으로써 증폭 효율을 최대화하고;(B) Maximize amplification efficiency by minimizing the time required for amplification by shortening the time necessary to complete product elongation and increasing the reaction specificity by screening products longer than the intended amplification product, ensuring the appropriate time for product elongation in each cycle. and;

(C) 생성물 신장 완료에 필요한 시간보다 짧게 함으로써 증폭에 필요한 시간을 최소화하고, 생성물 신장 완료에 할당된 시간보다 짧은 시간이 필요로 하는 의도된 증폭 생성물보다 긴 생성물을 가려냄으로써 반응 특이성을 증가시키면서 각 싸이클에 생성물 신장에 적절한 시간을 보장함으로써 증폭 효율을 최대화하며;(C) minimizing the time required for amplification by shortening the time required to complete product elongation, and increasing reaction specificity by screening products longer than the intended amplified product that require less than the time allotted to complete product elongation. Maximizing amplification efficiency by ensuring adequate time for product elongation in the cycle;

(D) 수득되는 형광의 수준이나 증폭의 효율에 종속적인 열싸이클링 변화를 초기화하며, 예컨대 과증폭 및 비특이성 반응 생성물은 효율이 일정수준으로 떨어질 때 열싸이클링을 종료함으로써 최소화되고, 형광이 탐지가능해질 때 용융곡선 습득을 위해 더 느린 온도기울기를 일으키도록 온도사이클링이 변조되어서 더 느린 기울기를 이전 싸이클에서 사용될 필요가 없기 때문에 시간을 절감하며;(D) Initialize heat cycling changes dependent on the level of fluorescence obtained or the efficiency of amplification, e.g., overamplification and non-specific reaction products are minimized by terminating heat cycling when the efficiency drops to a certain level, and fluorescence is detectable Temperature cycling is modulated to produce a slower temperature gradient for melting curve acquisition when it saves time, saving time because the slower slope does not have to be used in the previous cycle;

(E) 과증폭이 비특이성 반응 생성물의 배경을 증가시키기 이전에 PCR 생성물에 대한 과증폭 손상을 최소화 하거나 용융 곡선 습득의 최기화 단계.(E) Minimizing overamplification damage to PCR products or minimizing melt curve acquisition before overamplification increases the background of nonspecific reaction products.

본 발명에 따라서 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)는 사전 프로그램된 시간/온도 설정점을 따르거나 탐지된 형광값을 수득하고 이후에 수득된 형광값을 사용하여 실시간으로 하나이상의 반응매개변수를 조절하여 수득된 결과를 최적화할 수 있다. "반응매개변수"는 반응 조절의 기초로 사용되는 매개변수이다. 이러한 반응 매개변수는 변성온도 및 시간, 프라이머 어닐링온도 및 시간, 프로브 어닐링온도 및 시간, 효소 신장 온도 및 시간, 및 싸이클 횟수를 포함한다. 일반적으로 반응의 제어는 형광데이타로부터 수득되는 반응매개변수에 기초한다. 최초의 형광 데이터는 시간에 따라 형광변화(변성, 어닐링 및 신장의 온도 특이성 속도), 온도에 따른 형광변화(생성물 또는 프로브 Tm), 또는 증폭정도의 변화(증폭수율 및 효율)로서 수득된다. 이들 속도, Tm, 및 이들의 1 차 및 2 차 도함수가 변성온도 및 시간, 프라이머 어닐링온도 및 시간, 프로브 어닐링 온도 및 시간, 효소 신장온도 및 시간, 및 싸이클 횟수와 같은 최적화된 반응 매개변수 결정에 사용된다.In accordance with the present invention, the user interface and device controller 500 may follow a pre-programmed time / temperature set point or obtain a detected fluorescence value and then adjust one or more response parameters in real time using the obtained fluorescence value. The results obtained can be optimized. "Reaction parameters" are parameters used as the basis for reaction control. Such reaction parameters include denaturation temperature and time, primer annealing temperature and time, probe annealing temperature and time, enzyme extension temperature and time, and cycle count. In general, control of the reaction is based on reaction parameters obtained from the fluorescence data. Initial fluorescence data is obtained as fluorescence change over time (temperature specificity rate of denaturation, annealing and stretching), fluorescence change over temperature (product or probe Tm), or change in amplification degree (amplification yield and efficiency). These rates, Tm, and their primary and secondary derivatives are used to determine optimized reaction parameters such as denaturation temperature and time, primer annealing temperature and time, probe annealing temperature and time, enzyme extension temperature and time, and cycle count. Used.

도 22 의 블록에 도시된 바와 같이 사용자 인터페이스 및 기기 제어부(500)(IBM 호환 컴퓨터일 수 있음)에 의해 수행된 업무(도 22c에서 블록 500A-500E)와 형광탐지를 하는 온도 싸이클러(400)의 나머지 성분에 의해 수행된 업무(블럭 500A, 500G-500S)로 업무가 분할된다. 도 22c 의 블록 다이아그램은 단지 예시적인 것이며 많은 변형이 가능하다.Temperature cycler 400 for fluorescence detection with tasks performed by user interface and device controller 500 (which may be an IBM compatible computer) as shown in block of FIG. 22 (blocks 500A-500E in FIG. 22C). The work is divided into tasks performed by the rest of the components (Block 500A, 500G-500S). The block diagram of FIG. 22C is merely illustrative and many variations are possible.

도 22c 에 도시된 배열의 장점으로서 생성물 용융 제어가 설명된다. 용융 피크 형광값이 의도된 PCR 생성물에 대해 수득되며 생성물이 완전 용융되는 온도에서 기준선 형광이 반응혼합물 함유 샘플에 대해 수득된다. 반응의 각 싸이클은 형광값을 타겟으로 사용한다. 이 실시예에서 기술된 방법은 별도의 PCR 컴퓨터에 형광값을 보내는 조건을 수용할 타임래그를 제공하기 위해서 두 단계를 사용한다. 각 생성물 용융 단계에서 형광이 중간값에 도달할때까지 온도가 증가되고 이후에 가열 장치에 공급되는 전력이 감소되어서 초당 3℃의 온도 기울기가 부과되어 PC 컴퓨터가 형광을 분석해서 생성물 변성이 일어난 다른 성분에 전달할 적절한 시간을 가지게 된다. 결과의 시간/온도 플롯은 도 22d에 도시된다. 도 22d 는 증폭생성물의 농도가 증가함에따라 20싸이클후 용융곡선에서 증가를 보여준다. 이것은 생성물 Tm이 생성물 농도의 함수이기 때문이다.Product melt control is described as an advantage of the arrangement shown in FIG. 22C. Melt peak fluorescence values are obtained for the intended PCR product and baseline fluorescence is obtained for the reaction mixture containing sample at the temperature at which the product is completely melted. Each cycle of the reaction uses a fluorescence value as a target. The method described in this example uses two steps to provide a time lag to accommodate conditions for sending fluorescence values to a separate PCR computer. In each product melting step, the temperature is increased until the fluorescence reaches a median value, and then the power supplied to the heating device is reduced, so that a temperature gradient of 3 ° C per second is imposed, which causes the PC computer to analyze the fluorescence and cause product denaturation. You will have adequate time to deliver the ingredients. The time / temperature plot of the result is shown in FIG. 22D. 22D shows an increase in the melting curve after 20 cycles as the concentration of amplification product increased. This is because product Tm is a function of product concentration.

도 22c 에 도시된 또다른 장점으로 생성물 어닐링/신장이 설명된다. 조합된 어닐링/신장온도에서 지연된 유지동안 샘플의 형광이 모니터링되고 이러한 정보는 적절한 시간이 생성물 신장에 허용되도록 사용된다. 형광이 10초 간격으로 모니터링되고 형광이 사전 설정된 비(1.00 내지 1.05)보다 증가했다면 어닐링/신장 단계가 계속된다. 그렇지 않다면 다음 생성물 용융단계가 개시된다. 조합된 어닐링/신장 온도에서 최소 20초를 부여하도록 10초의 간격이 선택된다.Another advantage shown in FIG. 22C illustrates product annealing / elongation. The fluorescence of the sample is monitored during the delayed hold at the combined annealing / extension temperature and this information is used to allow adequate time for product stretching. If the fluorescence is monitored at 10 second intervals and the fluorescence has increased above the preset ratio (1.00 to 1.05), the annealing / extension step continues. Otherwise, the next product melting step is initiated. An interval of 10 seconds is chosen to give a minimum of 20 seconds at the combined annealing / extension temperature.

도 22c 에 도시된 배열의 또다른 장점으로서 증폭 평형이 설명된다. 각 어닐링/신장단계의 끝무렵에 형광값이 수득되어 저장된다. 이 값이 최저 종말-싸이클 형광값의 1.2배만큼 증가하고 사용자 설정가능한 비율(1.00-1.02) 아래로 증가를 중단하면 열싸이클이 종결된다. 혹은, 생성물 Tm까지 0.1 내지 0.2℃/초 온도 기울기에 들어가고 샘플 형광을 연속 모니터링 함으로써 용융곡선 평가단계가 개시된다. 도 22d 에 도시된 형광/온도 플롯은 25 증폭싸이클이후에 싸이클별 형광성장비가 1.00 미만으로 떨어지고 반응이 종료됨을 보여준다. 이 방법은 각 샘플에 대해 고해상도의 용융곡선을 수득하는데 사용될 수 있다. 샘플이 증폭 평형에 도달할 때 이 샘플에 대해 용융곡선이 수득되고 또다른 반응이 증폭평형에 도달할때까지 정규적인 온도 싸이클링이 재개될 수 있다.As another advantage of the arrangement shown in FIG. 22C, amplification equilibrium is described. At the end of each annealing / extension step, fluorescence values are obtained and stored. If this value increases by 1.2 times the lowest end-cycle fluorescence value and stops increasing below the user settable ratio (1.00-1.02), the thermal cycle is terminated. Alternatively, the melt curve evaluation step is initiated by entering a 0.1-0.2 ° C./second temperature gradient up to the product T m and continuously monitoring the sample fluorescence. The fluorescence / temperature plot shown in FIG. 22D shows that after 25 amplification cycles, the per-cycle fluorescent equipment drops below 1.00 and the reaction is complete. This method can be used to obtain high resolution melt curves for each sample. When the sample reaches amplification equilibrium, the melting curve is obtained for this sample and normal temperature cycling can be resumed until another reaction reaches the amplification equilibrium.

도 22e 는 형광 교합 모니터링에 유용한 온도대 시간 세그멘트이다. 생성물 용융곡선은 변성온도까지 느린 온도 증가동안 수득된다. 일정 온도로 변성후 온도를 빠르게 낮춤으로써 생성물, 프로브 또는 프라이머 어닐링이 탐지될 수 있다. 프로브 용융곡선은 프로브 Tm온도까지 느리게 가열함으로써 수득된다. 당해분야 숙련자는 도 21 에 도시된 시스템을 활용하여 기술될 하드웨어와 소프트웨어를 사용하여 생성물, 프로브 및 프라이머의 특성에 대해서 여태까지는 이용할 수 없었던 정보를 제공하도록 온도 싸이클링동안 실시간으로 필요한 분석을 할 수 있을 것이다.22E is a temperature versus time segment useful for fluorescence occlusion monitoring. The product melt curve is obtained during slow temperature increase up to denaturation temperature. The product, probe or primer annealing can be detected by rapidly lowering the temperature after denaturation to a constant temperature. The probe melt curve is obtained by heating slowly to the probe T m temperature. One skilled in the art can use the hardware and software to be described utilizing the system shown in FIG. 21 to perform the necessary analysis in real time during temperature cycling to provide information that has not been available so far about the properties of products, probes and primers. will be.

생성물의 절대 정량화가 본 발명에 따라 수행된다. 이중쇄 DNA 형성의 연속 모니터링은 재어닐링 반응에 의해 직접적이고 절대적인 DNA 정량을 허용한다. 샘플온도는 변성온도로 부터 신속하게 떨어지고 프라이머 어닐링을 방지하기에 충분한 더 낮은 온도로 일정하게 유지된다. 생성물 재어닐링 속도는 2차 반응을 따른다. 상이한 농도의 DNA가 테스트될 때 재어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도의 특성이다(도 26). 주어진 PCR 생성물 및 온도에서 2차 속도 상수가 측정될 수 있다. 속도상수가 알려지면 미지의 DNA 농도가 재어닐링 실험 데이타로 부터 결정될 수 있다. 곡선은 LabView 프로그램 환경을 사용하여 온도 싸이클링동안 실시간으로 비선형 최소자등 회귀분석될 수 있다. 냉각은 순간적이지 않으며 일정온도 도달전에 일부 재어닐링이 일어나지만 회귀분석은 이를 허용한다. 이 기술은 순수한 PCR 생성물을 필요로 하지만 온도 싸이클링동안 수득되는 용융곡선에 의해 검증될 수 있다. 재어닐링 반응에 의한 정량화는 신호 레벨에 무관하며 샘플 부피 차이의 영향을 받지 않는다.Absolute quantification of the product is carried out according to the invention. Continuous monitoring of double chain DNA formation allows direct and absolute DNA quantification by reannealing reactions. The sample temperature quickly drops away from the denaturing temperature and remains constant at a lower temperature sufficient to prevent primer annealing. Product reanneal rate follows the secondary reaction. When different concentrations of DNA are tested, the shape of the reannealing curve is a characteristic of the DNA concentration (FIG. 26). Secondary rate constants can be measured at a given PCR product and temperature. Once the rate constant is known, unknown DNA concentrations can be determined from reanneal experimental data. Curves can be regressed for nonlinear least squares in real time during temperature cycling using the LabView program environment. Cooling is not instantaneous and some re-annealing occurs before reaching a certain temperature, but regression analysis allows. This technique requires pure PCR products but can be verified by the melting curve obtained during temperature cycling. Quantification by the reannealing reaction is independent of signal level and is not affected by sample volume differences.

도 28 은 도 21 의 구체예에 포함된 다양한 구조를 포함하는 본 발명의 또다른 구체예이다. 도 21 과 도 28 에 도시된 성분의 차이가 설명된다. 도 27a 및 27b 는 도 28 에 도시된 구체예를 각각 실행모드와 충진모드에서 단면도로 보여준다.FIG. 28 is another embodiment of the present invention including various structures included in the embodiment of FIG. 21. The difference between the components shown in Figs. 21 and 28 is explained. 27A and 27B show the embodiment shown in FIG. 28 in cross section in run and fill modes, respectively.

도 28 의 구체예는 샘플용기의 팁에서 형광을 탐지하는 신속한 온도 싸이클러(502)이며 샘플용기의 자동위치선정으로 샘플로 부터 수득되는 형광 신호를 개선한다. 도 29 는 도 28 에 도시된 성분을 포함하는 본 발명의 구체예의 외부의 사시도이다.The embodiment of FIG. 28 is a rapid temperature cycler 502 that detects fluorescence at the tip of the sample vessel and improves the fluorescence signal obtained from the sample by autopositioning the sample vessel. FIG. 29 is an external perspective view of an embodiment of the present invention including the components shown in FIG. 28. FIG.

도 28 및 29 에 도시된 바와 같이 착탈식 원형 샘플 트레이(483)는 32개의 샘플을 유지한다. 착탈식 원형 샘플 트레이(483)는 모터(488)에 의해 구동되는 카루셀(481)에 맞물리도록 온도 싸이클러(502)에 놓인다. 카루셀(481)이 회전할 때 카루셀(481)을 정확히 위치선정하는데 위치 선정기가 사용되어서 샘플이 형광계 어셈블리(459) 위에 정확히 위치된다. 형광계 어셈블리(459)는 LED 소스(459A), 3개의 포토다이오드(459B), 촛점렌즈(459C) 및 필터 어셈블리(459D)를 포함한다. 형광계 어셈블리(459)는 도 20 에 도시된 구조 및 기능과 유사하다.The removable circular sample tray 483 holds 32 samples as shown in FIGS. 28 and 29. The removable circular sample tray 483 is placed in the temperature cycler 502 to engage the carousel 481 driven by the motor 488. A positioner is used to accurately position the carousel 481 when the carousel 481 rotates so that the sample is accurately positioned over the fluorometer assembly 459. The fluorometer assembly 459 includes an LED source 459A, three photodiodes 459B, a focus lens 459C, and a filter assembly 459D. The fluorometer assembly 459 is similar in structure and function to that shown in FIG. 20.

형광계는 측부 스테핑 모터(491)에 의해 이동되는 슬라이딩 베어링(493)상에 장착된다. 카루셀(481)이 회전하면 복합 플라스틱/유리 샘플용기(450)는 카루셀 방향으로 형광계 어셈블리(459)위에 정확히 위치되며 측부 스테핑 모터(491)가 형광계 어셈블리(459)의 위치를 조정하는 동안 위치선정기(495)를 통해 위치가 기록되고 2차원으로 조절된다. 따라서, 온도 싸이클러(502)는 착탈식 샘플 트레이(483)를 사용하여 복수의 샘플을 장치에 위치시키며 샘플에서 나오는 형광신호 탐지가 개선된다.The fluorometer is mounted on the sliding bearing 493 which is moved by the side stepping motor 491. When the carousel 481 rotates, the composite plastic / glass sample vessel 450 is positioned exactly on the fluorometer assembly 459 in the carousel direction and positioned while the side stepping motor 491 adjusts the position of the fluorometer assembly 459. The positioner is recorded via the selector 495 and adjusted in two dimensions. Thus, the temperature cycler 502 uses a removable sample tray 483 to place a plurality of samples in the device and improve detection of fluorescence signals from the samples.

도 30a-v 에 도 28 및 29 에 도시된 온도 싸이클러(502)의 전기 성분의 선호되는 구성이 도시된다. 다이아그램을 명료하게 하기 위해서 당해 산업에서 통용되는 명명이 표시된다.30A-V show preferred configurations of the electrical components of the temperature cycler 502 shown in FIGS. 28 and 29. Names commonly used in the industry are shown to clarify the diagram.

해당 부분 리스트 - 메인List of Parts-Main 아이템item 수량Quantity 부호sign 부분part 1One 1One BT1BT1 3V LITHIUM3V LITHIUM 22 99 C1,C2,C3,C8,C9,C13,C18,C24,C26C1, C2, C3, C8, C9, C13, C18, C24, C26 .1UF.1UF 33 77 C4,C5,C10,C12,C14,C15,C17C4, C5, C10, C12, C14, C15, C17 1UF1UF 44 22 C7,C6C7, C6 100UF100UF 55 66 C11,C16,C19,C20,C21,C22C11, C16, C19, C20, C21, C22 18pF18pF 66 1One C23C23 47UF47UF 77 22 C25,C27C25, C27 22UF22UF 88 22 C28,C29C28, C29 10UF10UF 99 1One F1F1 1A1A 1010 1One IC1IC1 AD594AD594 1111 22 IC2,IC3IC2, IC3 DS5000FPDS5000FP 1212 1One IC4IC4 LM324LM324 1313 88 IC5,IC7,IC10,R13,R17,R18,R21,R22IC5, IC7, IC10, R13, R17, R18, R21, R22 10K10K 1414 22 IC6,IC8IC6, IC8 MS62256MS62256 1515 22 IC9,IC10IC9, IC10 DS2003DS2003 1616 1One IC11IC11 TLC1451TLC1451 1717 1One IC12IC12 74327432 1818 1One IC13IC13 PT5101PT5101 1919 1One IC14IC14 PT5102PT5102 2020 1One IC15IC15 74047404 2121 1One IC16IC16 PIC16C54PIC16C54 2222 1One IC17IC17 MAX232MAX232 2323 1One IC18IC18 LM4040LM4040 2424 1One IC19IC19 LTC1293LTC1293 2525 1One IC20IC20 LTC1286LTC1286 2626 1One IC21IC21 LM385 1.2LM385 1.2 2727 1One IC22IC22 LTC1144LTC1144 2828 22 IC23,IC24IC23, IC24 PVG612SPVG612S 2929 1One JP1JP1 HALL SENSORHALL SENSOR 3030 1One JP2JP2 FLO1FLO1 3131 1One JP3JP3 FLO3FLO3 3232 1One JP4JP4 FLO2FLO2 3333 1One JP5JP5 MAIN HEADERMAIN HEADER 3434 1One J1J1 CON2CON2 3535 1One LED1LED1 STEPSTEP 3636 1One LED2LED2 TEMPTEMP

해당 부분 리스트 - 메인List of Parts-Main 아이템item 수량Quantity 부호sign 부분part 3737 22 LED3,LED4LED3, LED4 RED/GREEN LEDRED / GREEN LED 3838 1One P1P1 SERIAL CONNECTORSERIAL CONNECTOR 3939 1One Q1Q1 2N54842N5484 4040 1010 Q2,Q3,Q4,Q5,Q6,Q7,Q8,Q9,Q10,Q11Q2, Q3, Q4, Q5, Q6, Q7, Q8, Q9, Q10, Q11 NDS351NDS351 4141 1One R1R1 4.87K 1%4.87K 1% 4242 44 R2,R4,R5,R6R2, R4, R5, R6 10K 1%10K 1% 4343 1One R3R3 2.74K 1%2.74K 1% 4444 1One R7R7 200200 4545 88 R8,R9,R10,R11,R19,R20,R28,R29R8, R9, R10, R11, R19, R20, R28, R29 470470 4646 22 R15,R12R15, R12 100100 4747 33 R14,R16,R23R14, R16, R23 1K1K 4848 44 R24,R25,R26,R27R24, R25, R26, R27 4.7K4.7K 4949 1One S1S1 TYPE JTYPE J 5050 1One Y1Y1 20.000020.0000 5151 22 Y3,Y2Y3, Y2 14.74560014.745600

해당 부분 리스트 - 파워 보오드Applicable Parts List-Power Boards 아이템item 수량Quantity 부호sign 부분part 1One 33 C1,C5,C6C1, C5, C6 330UF330UF 22 1One C2C2 47UF47UF 33 1One C3C3 1000UF1000UF 44 1One C4C4 22UF22UF 55 1One C7C7 100UF100UF 66 1One C8C8 220UF220UF 77 55 C9,C10,C11,C12,C13C9, C10, C11, C12, C13 .1UF.1UF 88 22 C15,C14C15, C14 10UF10UF 99 22 DR1,DR2DR1, DR2 IM481HIM481H 1010 1One D1D1 IN5232IN5232 1111 22 D2,D4D2, D4 IN4756IN4756 1212 22 D5,D3D5, D3 11DQ0611DQ06 1313 1One F1F1 2A2A 1414 44 IC1,IC2,IC3,IC4IC1, IC2, IC3, IC4 HCPL2630HCPL2630 1515 1One IC5IC5 LM2574hv8LM2574hv8 1616 22 IC7,IC6IC7, IC6 PVG612SPVG612S 1717 1One IC8IC8 MOC 3020MOC 3020 1818 1One IC9IC9 TLC1451TLC1451 1919 1One IC10IC10 LM324LM324 2020 1One IC11IC11 BRIDGEBRIDGE 2121 1One IC12IC12 LTC1144LTC1144 2222 1One JP1JP1 HEADER14HEADER14 2323 22 JP2,JP3JP2, JP3 4 HEADER4 HEADER 2424 1One JP4JP4 HEADER 12HEADER 12

해당 부분2 리스트 - 파워 보오드Part 2 List-Power Boards 아이템item 수량Quantity 부호sign 부분part 2525 22 L2,L1L2, L1 330UH330UH 2626 1One Q1Q1 40084008 2727 99 R1,R2,R4,R5,R6,R7,R8,R9,R10R1, R2, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 470470 2828 1One R3R3 360360 2929 77 R11,R13,R14,R16,R17,R18,R19R11, R13, R14, R16, R17, R18, R19 10K10K 3030 1One R12R12 4.7K4.7K 3131 1One R15R15 1K1K 3232 1One R20R20 261261 3333 1One R21R21 866866 3434 1One R22R22 650650 3535 1One R23R23 180180 3636 22 S1,S2S1, S2 110/220110/220 3737 1One T1T1 TRANSFORMER FLATCOMPACTTRANSFORMER FLATCOMPACT 3838 1One VR1VR1 LM2575LM2575

해당 부분 리스트 - 적분기Applicable Parts List-Integrator 아이템item 수량Quantity 부호sign 부분part 1One 22 C1,C2C1, C2 1UF1UF 22 1One C3C3 .01.01 33 1One IC1IC1 ACF2101ACF2101 44 1One IC2IC2 OPT301OPT301 55 1One IC3IC3 OPA627OPA627 66 1One IC4IC4 REF200REF200 77 1One J1J1 CON6CON6 88 1One P1P1 500500 99 1One R1R1 30M30M 1010 1One R2R2 100K100 K 1111 22 R3,R4R3, R4 10K10K 1212 22 R5,R6R5, R6 100100

해당 부분 리스트 - 홀 이펙트Corresponding parts list-Hall effect 아이템item 수량Quantity 부호sign 부분part 1One 1One IC1IC1 HAL115HAL115 22 1One J1J1 CON3CON3 33 1One R1R1 10K10K

도 28, 19, 30A-V 의 성분과 관련하여 사용된 프로그래밍 코드가 프로그래밍 코드 부록 B에 포함된다.Programming code used in connection with the components of Figures 28, 19, 30A-V is included in the programming code Appendix B.

본 발명에 따라서 적은 부피의 샘플용기에 액체 샘플, 특히 방출된 형광의 탐지에 의해 분석된 샘플을 충진하기 위해서 취급 시스템이 제공된다. 샘플용기는 1㎖ 미만의 부피를 가지며 튜브(즉, 모세관 튜브) 형태나 "평평한 모세관" 형태일 수 있으며, 이것은 모세관 공간이 가장자리를 따라 밀봉된 두 개의 간격이 떨어진 플레이트나 쉬이트에 의해 한정된다. 샘플용기는 약 1㎜, 특히 0.5㎜ 미만의 외부 표면적에 대한 부피비를 가진다. 1㎜ 미만의 내경을 가지는 모세관 튜브는 0.25㎜ 미만의 표면적에 대한 부피비를 가진다. 본 발명에 따라 사용된 용기는 광학적으로 투명한 재료로 형성된다. 선호되는 재료는 400 내지 800㎚의 파장을 가지는 빛에 대해서 광학적으로 투명하다. 이러한 재료의 사용은 용기에 의해 유지되는 액체 샘플에서 발생된 형광 신호의 탐지를 허용한다. 게다가, 형광 샘플로 부터 형광을 분석하기 위해서 낮은 표면적에 대한 부피비를 갖는 용기의 사용은 증가된 총내부반사로 인하여 더욱 효율적인 형광탐지를 가능하게 한다.According to the invention a handling system is provided for filling a small volume of sample container with a liquid sample, in particular a sample analyzed by detection of emitted fluorescence. The sample vessel has a volume of less than 1 ml and may be in the form of a tube (ie, capillary tube) or "flat capillary", defined by two spaced plates or sheets with capillary space sealed along the edges. . The sample container has a volume ratio to an external surface area of less than about 1 mm, in particular less than 0.5 mm. Capillary tubes with an inner diameter of less than 1 mm have a volume ratio to surface area of less than 0.25 mm. The container used according to the invention is formed of an optically transparent material. Preferred materials are optically transparent to light having a wavelength of 400 to 800 nm. The use of such materials allows the detection of fluorescence signals generated in liquid samples held by the container. In addition, the use of a container with a low volume to volume ratio for analyzing fluorescence from fluorescence samples allows for more efficient fluorescence detection due to increased total internal reflection.

부피에 대한 높은 표면적비(또는 표면적에 대해 낮은 부피비)를 갖는 용기는 액체 샘플을 충진하기가 곤란하다. 본 발명의 샘플취급시스템은 이러한 곤란을 극복할 수 있게 한다. 한 구체예에 따르면 높은 부피에 대한 표면적비와 개방 단부를 가지는 용기에는 용기에 액체 샘플의 충진을 수월하게 하도록 용기의 개방단부에 끼워지는 퍼넬캡이 제공된다. 퍼넬캡은 용기의 개방단부와 퍼넬캡의 샘플 전달 포트가 일직선이 되도록 용기상에 퍼넬캡을 착탈식으로 고정하는 수단, 제 1 샘플 수용 포트 및 제 2 샘플 전달 포트를 포함한다. 한 구체예에서 퍼넬캡은 플라스틱 또는 고무로 구성되며 샘플전달포트의 내경이 개방단부에 근접하여 용기의 외경에 마찰식으로 맞물리도록 형성된다. 그러나, 퍼넬캡을 용기에 연결하는 다른 수단도 가능하다. 그 예로는 접착제, 클램프, 죔쇠등이 있다. 한 구체예에서 샘플 취급 시스템은 퍼넬캡의 샘플수용 포트와 마찰식 밀봉 맞물림을 하는 플러그를 포함한다. 그러나 퍼넬 입구를 효과적으로 밀폐하여 충진된 샘플의 증발 또는 오염을 방지하는 장치나 재료가 본 발명에 사용될 수도 있다.Containers with a high surface area to volume ratio (or low volume to surface area ratio) are difficult to fill with liquid samples. The sample handling system of the present invention makes it possible to overcome this difficulty. According to one embodiment, a container having a high volume to surface area ratio and an open end is provided with a funnel cap fitted to the open end of the container to facilitate filling of the liquid sample into the container. The funnel cap includes means for detachably securing the funnel cap on the container such that the open end of the container and the sample delivery port of the funnel cap are aligned, the first sample receiving port and the second sample delivery port. In one embodiment the funnel cap is made of plastic or rubber and is formed such that the inner diameter of the sample delivery port is frictionally engaged with the outer diameter of the container in proximity to the open end. However, other means of connecting the funnel cap to the container are possible. Examples include adhesives, clamps and clamps. In one embodiment the sample handling system includes a plug that frictionally engages the sample receiving port of the funnel cap. However, devices or materials may be used in the present invention that effectively seal the funnel inlet to prevent evaporation or contamination of the filled sample.

본 발명의 용기는 형광단을 포함한 샘플에서 형광의 습득 효율 및 탐지를 개선하는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 제 1 및 제 2 차원을 갖는 부피를 한정하는 벽을 가지는 용기에 샘플을 위치시키는 단계를 포함한다. 제 1 차원은 제 2 차원보다 작으며 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비는 1㎜ 미만이다. 샘플에서 발생된 형광의 습득효율 및 탐지의 개선은 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 형광을 탐지함으로써 달성된다. 한 구체예에서, 샘플 형광은 샘플의 형광단 활성화 조사에 의해 유도되며, 샘플은 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 조사받는다. 선호된 구체예에서 형광 습득의 최적의 효율은 형광탐지축을 따라 샘플을 형광단 - 활성화 조사시켜 달성되며 형광은 최저의 표면적을 갖는 용기벽을 통해 축을 따라, 특히 용기 하부를 통한 축을 따라 탐지된다.The container of the present invention can be used in a method of improving the acquisition efficiency and detection of fluorescence in a sample comprising a fluorophore. The method includes placing a sample in a container composed of an optically transparent material and having a wall defining a volume having first and second dimensions. The first dimension is smaller than the second dimension and the ratio of volume to the outer surface area of the container is less than 1 mm. Improvement in the acquisition efficiency and detection of fluorescence generated in the sample is achieved by detecting fluorescence along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel. In one embodiment, sample fluorescence is induced by fluorophore activation irradiation of the sample, and the sample is irradiated along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel. In a preferred embodiment the optimal efficiency of fluorescence acquisition is achieved by fluorophore-activated irradiation of the sample along the fluorescence detection axis and fluorescence is detected along the axis through the vessel wall having the lowest surface area, in particular along the axis through the vessel bottom.

한 구체예에서, 생물학적 샘플의 형광은 온도 종속적이다. 예컨대, 용기는 핵산 서열을 포함하는 샘플을 포함할 수 있으며 형광체는 이중쇄 특이성 염료일 수 있다. 샘플의 온도가 변성온도까지 상승할 때 형광세기는 감소한다. 혹은 형광체가 타겟 핵산서열의 인접 지역에 교합하는 한쌍의 올리고누클레오타이드 프로브일 수 있으며, 이 경우 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 형광 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링된다. 이 구체예에서 용기와 샘플은 형광 에너지 전달쌍중 적어도 하나의 형광을 모니터링 하는 동안 가열될 수 있다.In one embodiment, the fluorescence of the biological sample is temperature dependent. For example, the container may comprise a sample comprising a nucleic acid sequence and the phosphor may be a double chain specific dye. As the temperature of the sample rises to the denaturing temperature, the fluorescence intensity decreases. Alternatively, the phosphor may be a pair of oligonucleotide probes that occupy adjacent regions of the target nucleic acid sequence, where one of the probes is labeled with a fluorophore and the other is labeled with a donor fluorophore of a fluorescent energy transfer pair. In this embodiment the vessel and the sample can be heated while monitoring the fluorescence of at least one of the fluorescence energy transfer pairs.

용기는 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 핵산서열의 증폭과 같이 샘플의 열 싸이클링을 필요로 하는 절차에서 사용될 수 있는 모세관 튜브나 평평한 모세관이다. 모세관 용기는 형광 탐지에 사용되는 장치나 열싸이클링에 사용되는 장치의 샘플 홀더에 삽입되도록 형성된다. 장치의 샘플 홀더는 단일 샘플을 유지할 수 있거나 복수의 샘플용기를 유지하는 카루셀 형태일 수 있다.The vessel is a capillary tube or flat capillary that can be used in procedures that require thermal cycling of the sample, such as amplification of target nucleic acid sequences by polymerase chain reaction. The capillary vessel is formed to be inserted into a sample holder of a device used for fluorescence detection or a device used for thermal cycling. The sample holder of the device may hold a single sample or may be in the form of a carousel holding a plurality of sample containers.

본 발명에 사용하기에 적합한 카루셀이 도 31a 및 b 에 도시된다. 카루셀(1)은 상부표면(3), 하부표면(4) 및 이들 사이에 연장된 외부 가장자리(5)를 가지는 디스크(2) 형태이다. 디스크(2)는 상부표면(3)에 복수의 방사상 정렬된 샘플 수용 포트(6A, 6B, 6C), 외부가장자리(5)에 샘플용기포트(7) 및 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)와 각 샘플 용기 포트(7)와 통하는 샘플 통로(8)를 가진다. 카루셀(1)이 고정된 샘플용기(9)와 함께 도시된다. 샘플 용기 포트(7)와 샘플통로(8)는 샘플용기(9)를 수용하여 디스크(2)에 고정하도록 형성된다. 한 구체예에서 샘플용기(9)가 카루셀(1)에 착탈식으로 고정되어서 샘플 제거를 하고 또다른 샘플 용기로 대체하여서 카루셀(1)의 다중 사용을 허용한다. 또다른 구체예에서 샘플용기(9)는 디스크에 영구 고정하거나 디스크(2)의 일체 성분으로서 형성된다. 한 구체예에서 샘플용기(9)는 샘플용기(9)와 상기 용기포트(7)에 근접한 샘플통로(8)의 적어도 일부 사이에 마찰식 접촉에 의해 디스크(2)에 고정된다. 샘플용기와 통하며 샘플용기를 고정하는 공지수단이 사용될 수 있다. 예컨대 상보적인 스크루 나사가 샘플통로(8)의 표면과 샘플용기(9)의 외면에 형성될 수 있다. 추가로 샘플용기(9)를 디스크(2)에 고정하기 위해서 접착제 또는 다른 고정수단이 사용될 수 있다. 본 발명의 카루셀의 하부 및 상부표면은 서로의 위에 다중 카루셀 스택이 형성되어서 한 스택의 다중 카루셀이 모터 드라이브 샤프트와 착탈식으로 맞물리고 도 32 에 도시된 바와 같이 동시에 회전될 수 있다.Carousels suitable for use in the present invention are shown in FIGS. 31A and B. The carousel 1 is in the form of a disc 2 having an upper surface 3, a lower surface 4 and an outer edge 5 extending therebetween. The disc 2 has a plurality of radially aligned sample receiving ports 6A, 6B, 6C on the upper surface 3, a sample container port 7 and a sample receiving port 6A, 6B, 6C on the outer edge 5; And a sample passage 8 in communication with each sample vessel port 7. The carousel 1 is shown with a fixed sample container 9. The sample vessel port 7 and the sample passage 8 are formed to receive the sample vessel 9 and to fix it to the disc 2. In one embodiment the sample container 9 is detachably secured to the carousel 1 to remove the sample and replace it with another sample container to allow multiple use of the carousel 1. In another embodiment, the sample container 9 is permanently fixed to the disk or formed as an integral component of the disk 2. In one embodiment the sample container 9 is secured to the disc 2 by frictional contact between the sample container 9 and at least a portion of the sample passage 8 proximate the container port 7. Known means for communicating with the sample container and for fixing the sample container may be used. Complementary screw screws can be formed, for example, on the surface of the sample passage 8 and on the outer surface of the sample container 9. In addition, adhesives or other fastening means may be used to secure the sample container 9 to the disc 2. The lower and upper surfaces of the carousel of the present invention are formed with multiple carousel stacks on top of each other so that multiple carousels of one stack can be detachably engaged with the motor drive shaft and rotated simultaneously as shown in FIG.

도 32 에 도시된 구체예는 카루셀(1)을 유지하고 회전시키는 스테핑 모터(504)와 구동 샤프트(506)를 포함한다. 챔버팬(508)은 화살표(512)로 표시된 공기 흐름을 발생시키는데 사용된다. 가열장치(510)는 샘플용기(9)를 통과하는 공기를 가열한다. 형광계 어셈블리(514)는 LED 소스(514A), 포토다이오드(514B), 촛점 렌즈(514C), 및 필터 어셈블리(514D)를 포함한다. 형광계 스테핑 모터(516)는 형광계 어셈블리(514)를 화살표(518) 방향으로 이동시킨다.The embodiment shown in FIG. 32 includes a stepping motor 504 and a drive shaft 506 to hold and rotate the carousel 1. Chamber fan 508 is used to generate the air flow indicated by arrow 512. The heating device 510 heats the air passing through the sample container 9. The fluorometer assembly 514 includes an LED source 514A, a photodiode 514B, a focus lens 514C, and a filter assembly 514D. The fluorometer stepping motor 516 moves the fluorometer assembly 514 in the direction of the arrow 518.

또다른 구체예에서 카루셀은 상부표면, 하부표면, 상부표면에 있는 샘플수용포트, 하부표면에 있는 샘플용기포트, 및 상기 샘플수용포트 및 샘플용기포트와 통하는 샘플통로를 가지는 디스크를 포함한다. 샘플용기포트와 샘플통로는 샘플용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성된다. 샘플용기는 디스크의 하부 표면에 대해 방사상 연장하는 예각으로 유지된다.In another embodiment, the carousel comprises a disk having an upper surface, a lower surface, a sample receiving port on the upper surface, a sample container port on the lower surface, and a sample passage through the sample receiving port and the sample container port. The sample vessel port and the sample passage are formed to receive the sample vessel and secure it to the disc. The sample container is maintained at an acute angle extending radially with respect to the lower surface of the disc.

한 구체예에서, 디스크의 샘플통로는 디스크의 상부 및 하부 표면에 평행한 중심축을 가지는 제 1 부위와 디스크의 상부 및 하부 표면과 예각을 형성하는 중심축을 가지는 제 2 부위를 포함한다. 이 구체예에서 샘플용기포트와 샘플통로는 샘플용기를 수용하여 샘플용기가 디스크의 하부표면에 대해 예각으로 디스크로 부터 연장되도록 샘플용기를 디스크에 고정된다.In one embodiment, the sample passageway of the disk comprises a first portion having a central axis parallel to the upper and lower surfaces of the disk and a second portion having a central axis forming an acute angle with the upper and lower surfaces of the disk. In this embodiment, the sample vessel port and the sample passage receive the sample vessel and secure the sample vessel to the disc such that the sample vessel extends from the disc at an acute angle to the lower surface of the disc.

카루셀(1)에는 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)를 폐쇄하는 수단이 제공된다. 폐쇄수단은 샘플수용포트(6)에 끼워져서 샘플통로의 인접벽에 마찰식으로 맞물리는 플러그, 또는 샘플 수용포트의 구멍을 효과적으로 밀폐하여 충진된 샘플의 증발 또는 오염을 방지하기 위해 상부표면에 적용되는 접착제 테이프일 수 있다. 카루셀(1)은 회전을 위해 구동 샤프트와 착탈식으로 맞물린다. 마찰식 맞물림 또는 스크루, 볼트, 잠금핀 또는 클램프를 사용할 수도 있다. 한 구체예에서 디스크(2)는 구동 샤프트(도 32 에서 (506)) 수용을 위해 형성된 중앙구멍을 갖는 링으로 형성된다. 구동 샤프트의 단부에는 디스크(2)를 제자리에 위치시키는 구조물이 제공된다.The carousel 1 is provided with means for closing the sample receiving ports 6A, 6B, 6C. The closing means are fitted in the sample receiving port 6 and applied to the upper surface to prevent the evaporation or contamination of the filled sample by effectively sealing a hole in the sample receiving port or a plug that frictionally engages the adjacent wall of the sample passage. It can be an adhesive tape. The carousel 1 is detachably engaged with the drive shaft for rotation. Frictional engagement or screws, bolts, locking pins or clamps may be used. In one embodiment the disc 2 is formed from a ring having a center hole formed for receiving a drive shaft (506 in FIG. 32). At the end of the drive shaft is provided a structure for positioning the disk 2 in place.

본 발명의 카루셀(1)은 액체샘플을 샘플용기(9)에 전달하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서 샘플용기(9)는 도입된 샘플의 하나이상의 성분과 작용하는 예정된 혼합물(예컨대, 시약 혼합물)을 함유한 모세관 용기이다. 한 구체예에 따르면 예정된 혼합물은 모세관 샘플용기를 샘플용기 포트에 위치시키기 이전에 샘플용기에 첨가된다. 혹은, 샘플용기가 예정된 혼합물로 사전 포장된다. 예정된 혼합물은 샘플과 반응하여 탐지가능한 신호를 발생하거나 유도 생성물을 생성하는 시약을 포함할 수 있다.The carousel 1 of the present invention can be used to deliver a liquid sample to the sample container 9. In one embodiment the sample vessel 9 is a capillary vessel containing a predetermined mixture (eg, reagent mixture) to act with one or more components of the introduced sample. According to one embodiment, the predetermined mixture is added to the sample container prior to placing the capillary sample container in the sample container port. Alternatively, the sample container is prepackaged with the intended mixture. The predetermined mixture may comprise a reagent that reacts with the sample to generate a detectable signal or to generate an inducible product.

카루셀(1)의 샘플통로(8)에는 액체 샘플상에 편향력이 없으면 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)를 통해 전달된 액체샘플이 샘플용기포트(7)로 흐르는 것을 방지하는 장벽이 제공된다. "장벽"은 샘플 수용포트로 전달된 액체샘플이 샘플용기포트에 자유롭게 흐르는 것을 방지하는 구조물이다. 본 발명의 카루셀의 샘플 통로에 사용하는 장벽은 샘플통로에 형성된 오목부 또는 우물, 샘플통로의 표면으로 부터 연장된 돌출부 또는 환형 림, 방향밸브 또는 폐쇄위치로 편향된 플랩을 포함한다.The sample passage 8 of the carousel 1 is provided with a barrier to prevent the liquid sample transferred through the sample receiving ports 6A, 6B, 6C from flowing to the sample container port 7 if there is no deflection force on the liquid sample. do. A "barrier" is a structure that prevents a liquid sample delivered to a sample receiving port from flowing freely through the sample container port. The barrier used in the sample passage of the carousel of the present invention includes a recess or well formed in the sample passage, a protrusion or annular rim extending from the surface of the sample passage, and a flap deflected to the directional valve or the closed position.

장벽은 액체 샘플이 샘플통로에 존재하며 장벽에 의해 차단된 액체샘플에 대해 편향력을 적용함으로써 장벽을 극복할 수 있도록 형성된다. 샘플상에 편향력 적용은 카루셀 회전에 의해 발생된 구심력에 의해 제공된다. 그러므로, 상부표면에 다중 샘플수용포트(6A, 6B, 6C)를 가지는 카루셀에서 샘플이 다양한 샘플수용 포트에 첨가되고 장벽은 액체샘플을 국지화하며 샘플이 샘플용기 포트에 흐르는 것을 방지한다. 모든 샘플이 각 수용 포트에 전달된 이후에 카루셀이 회전되어 샘플은 각 샘플 용기 포트와 부착된 샘플용기에 전달된다.The barrier is formed so that the liquid sample is present in the sample passage and overcomes the barrier by applying a biasing force to the liquid sample blocked by the barrier. The application of deflection force on the sample is provided by the centripetal force generated by the carousel rotation. Therefore, in a carousel having multiple sample receiving ports 6A, 6B, 6C on its upper surface, the sample is added to the various sample receiving ports and the barrier localizes the liquid sample and prevents the sample from flowing through the sample container port. After all samples have been delivered to each receiving port, the carousel is rotated and the sample is delivered to each sample container port and attached sample container.

한 구체예에서, 카루셀의 각 샘플통로는 단일샘플용기포트 및 복수의 샘플수용포트와 통한다. 이 구체예에서 샘플통로는 다중 샘플 수용포트와 통하도록 분지를 형성하는 중심통로를 포함하거나 도 31a 및 b 에 도시된 대로 다중 샘플 수용포트(6A, 6B, 6C)가 디스크 중심으로 부터 방사상 연장되는 공통축을 따라 정렬되며, 상기 각 포트는 샘플용기포트에 수용된 샘플용기와 한 통로를 통해서 통한다. 샘플통로에는 액체샘플상에 편향력이 없을 경우 복수의 샘플 수용포트중 하나에 첨가된 샘플이 샘플용기포트에 흐르는 것을 방지하는 하나이상의 장벽(9A)이 제공될 수 있다. 게다가, 각 샘플 통로에는 장벽위로 샘플을 전달하는데 상이한 편향력을 필요로 하는 다중장벽이 제공될 수 있다. 이 구체예에 따르면 각 샘플 수용포트에 샘플을 전달한 이후에 각 샘플이 카루셀 회전속도 조절에 의해서 샘플용기포트 및 샘플용기에 선택적으로 전달될 수 있다.In one embodiment, each sample passage of the carousel is in communication with a single sample vessel port and a plurality of sample receiving ports. In this embodiment, the sample passage includes a central passage that forms a branch to communicate with the multiple sample receiving ports or the multiple sample receiving ports 6A, 6B, 6C extend radially from the center of the disk as shown in FIGS. 31A and 31B. Aligned along a common axis, each port communicates through a passageway with the sample container housed in the sample container port. The sample passage may be provided with one or more barriers 9A that prevent the sample added to one of the plurality of sample receiving ports from flowing into the sample container port if there is no deflection on the liquid sample. In addition, each sample passage may be provided with multiple barriers that require different deflection forces to deliver the sample over the barrier. According to this embodiment, after delivering the sample to each sample receiving port, each sample may be selectively delivered to the sample container port and the sample container by adjusting the carousel rotation speed.

예컨대, 제 1 샘플이 제 1 샘플수용포트에 전달되고 제 2 샘플이 제 2 샘플수용포트에 전달되고, 제 1 및 제 2 샘플수용포트는 공통 통로와 통하며 제 1 및 제 2 샘플수용포트에는 제 1 및 제 2 샘플의 흐름을 막는 장벽이 제공된다. 장벽은 하나이상의 샘플수용포트를 통해 샘플 통로에 사전 충진된 시약, 촉매, 효소, 오일 등의 예정된 양이 있는 키트의 일부로서 디스크가 제공될 수 있게 한다.For example, the first sample is delivered to the first sample receiving port and the second sample is delivered to the second sample receiving port, the first and second sample receiving ports are through a common passage and the first and second sample receiving ports are Barriers are provided to block the flow of the first and second samples. The barrier allows the disc to be provided as part of a kit with a predetermined amount of reagents, catalysts, enzymes, oils, etc., prefilled in the sample passage through one or more sample receiving ports.

한 구체예에서 제 2 샘플수용포트의 장벽은 제 1 샘플수용 포트에 전달된 샘플이 관련 장벽을 통과하는데 필요한 편향력보다 큰 편향력이 제 2 샘플수용 포트에 전달된 샘플의 관련 장벽을 통과하도록 적용되도록 형성된다.In one embodiment the barrier of the second sample receiving port is such that a deflection force greater than the deflection force required for the sample delivered to the first sample receiving port to pass through the associated barrier passes through the associated barrier of the sample delivered to the second sample receiving port. It is formed to be applied.

이 구체예에서, 제 1 속도로 카루셀의 회전은 제 1 샘플을 샘플 용기포트와 샘플용기에 전달하지만 제 2 샘플은 샘플용기포트와 샘플용기에 흐르는 것이 방지된다. 증가된 제 2 속도로 회전은 제 2 샘플상에 구심력을 증가시켜서 제 2 샘플이 샘플 용기포트와 샘플용기에 전달되게 한다. 이러한 원리에 기초하여 다양한 샘플이 공통통로와 통하는 다중샘플용기 포트에 전달되어서 모든 샘플이 충진된 이후에 각 샘플이 카루셀의 회전속도 조절에 의해 한 번에 하나씩 또는 동시에 샘플용기포트 및 샘플용기에 전달될 수 있다. 한 구체예에서 형광단을 포함하는 제 1 샘플이 제 1 샘플 용기 포트에 첨가되고 오일을 함유한 제 2 샘플이 제 2 용기 포트에 전달된다. 카루셀이 회전되어서 제 1 샘플을 샘플용기에 전달하고 이후에 오일이 전달된다. 오일(또는 제 1 샘플을 샘플 용기내에 효과적으로 밀폐시키는 다른 액체)는 제 1 샘플의 증발을 감소시키고 제 1 샘플의 오염가능성을 감소시킨다.In this embodiment, rotation of the carousel at the first speed transfers the first sample to the sample vessel port and the sample vessel while preventing the second sample from flowing into the sample vessel port and the sample vessel. Rotation at increased second speed increases the centripetal force on the second sample so that the second sample is delivered to the sample vessel port and the sample vessel. Based on this principle, various samples are delivered to the multi-sample container port through the common channel so that after each sample is filled, each sample is delivered to the sample container port and the sample container one at a time or at the same time by adjusting the rotation speed of the carousel. Can be. In one embodiment a first sample comprising a fluorophore is added to a first sample vessel port and a second sample containing oil is delivered to a second vessel port. The carousel is rotated to deliver the first sample to the sample container, after which the oil is delivered. Oil (or other liquid that effectively seals the first sample into the sample container) reduces the evaporation of the first sample and reduces the likelihood of contamination of the first sample.

한 실시예에서, 다중 샘플 카루셀이 다중샘플을 동시에 취급하는데 사용된다. 카루셀은 디스크 구조물의 상부표면에 다중샘플수용포트를 가지며 디스크에 부착된 샘플용기와 유체가 통하는 디스크형 구조물이다. 샘플수용포트에 첨가된 샘플은 카루셀 회전에 의해 해당 샘플용기에 전달된다. 카루셀은 각 샘플용기와 통하는 다중 샘플 수용포트를 가진다. 제 1 샘플 수용포트에 첨가된 또다른 샘플을 갖는 용기에 전달하기 위해 사용자에 의해 샘플용기와 통하는 제 2 샘플수용포트에 시약이 첨가되거나 예정된 시약이 제작자에 의해 제 2 샘플수용포트에 수용될 수 있다. 즉, 카루셀, 샘플용기 및 예정된 시약이 사전포장된 형태이다. 샘플과 함께 시약이 카루셀의 회전에 의해 샘플용기에 전달된다. 수성샘플 보호용 오일은 샘플용기(및 제 1 및 제 2 샘플 수용 포트)와 액체가 통하는 제 3 샘플 수용 포트에 첨가되거나 오일이 제작자에 의해 카루셀에 첨가될 수 있다.In one embodiment, multiple sample carousels are used to handle multiple samples simultaneously. The carousel is a disk-shaped structure having a multi-sample receiving port on the upper surface of the disk structure and communicating with the sample container attached to the disk. The sample added to the sample receiving port is transferred to the sample container by carousel rotation. The carousel has multiple sample receiving ports through each sample container. Reagents may be added to the second sample receiving port by the user to communicate with the sample container for delivery to a container having another sample added to the first sample receiving port, or a predetermined reagent may be received by the manufacturer in the second sample receiving port. have. That is, the carousel, the sample container, and the predetermined reagent are prepackaged. Reagents along with the sample are delivered to the sample vessel by rotation of the carousel. The aqueous sample protective oil may be added to a third sample receiving port through which the sample container (and the first and second sample receiving ports) and the liquid communicate, or the oil may be added to the carousel by the manufacturer.

혹은, 샘플, 시약 및 샘플보호용 오일이 단일한 샘플수용포트에 전달될 수 있다. 카루셀은 제 2 또는 후속 샘플 또는 다른 조성물이 샘플수용포트에 전달되기 이전에 각 조성물 또는 샘플을 각 용기에 전달하도록 회전될 수 있다.Alternatively, the sample, reagent and sample protective oil may be delivered to a single sample receiving port. The carousel may be rotated to deliver each composition or sample to each container before the second or subsequent sample or other composition is delivered to the sample receiving port.

본 발명의 선호되는 샘플용기 카루셀은 공통 샘플용기와 유체가 통하며 방사상으로 정렬된 3개의 샘플수용 포트를 포함한다. 이 구체예에서 1 내지 5㎕의 오일, 특히 염색된 블랙이 사전포장된 형태로 존재하거나 방사상으로 가장 안쪽의 샘플 수용 포트에 전달된다. 오일은 미네랄 오일과 Znica Inc.(Wilminton, DE)으로부터 구매가능한 Waxoline Blak OBP와 같은 0.01 내지 1% 유기 블랙 염료를 포함한다. 1 내지 9㎕의 시약 마스터 혼합물이 사전 포장된 형태로 존재하거나 방사상 최외곽 샘플수용포트에 전달된다. 시약 마스터 혼합물은 필요한 반응 성분의 일부 또는 전부를 포함한다. 테스트될 템플레이트 핵산을 포함한 액체샘플이 방사상 중간 샘플 수용 포트에 수동 또는 자동으로 전달된다. 이후에 샘플을 시약 구획에 전달하지만 혼합물을 샘플용기에 전달하기에는 불충분한 속도로 디스크가 회전된다. 샘플과 시약은 디스크 회전속도의 신속한 변화에 의해 혼합될 수 있다. 이후에 샘플과 시약혼합물(오일은 아님)을 샘플용기로 이동시키는 고속으로 디스크가 회전된다. 이후에 샘플에 오일을 전달하기 위해서 더 높은 회전속도로 디스크가 회전된다. 오일은 낮은 밀도로 인하여 수성 샘플을 보호하며 염료 함량 때문에 빛의 통과를 차단한다. 카루셀 회전속도 변화에 의한 오일, 시약 및 샘플의 선택적 전달이 다음의 조합에 의해 달성된다: 1) 유체가 통하는 통로의 직경변화; 2) 유체가 통하는 통로에 존재하는 물리적 장벽의 직경변화; 3) 디스크 중심으로 부터 각 샘플 수용포트의 반경에 대한 구심력의 종속성 사용.The preferred sample container carousel of the present invention comprises three sample receiving ports in fluid communication with a common sample container and arranged radially. In this embodiment 1-5 μl of oil, especially dyed black, is present in prepackaged form or delivered radially to the innermost sample receiving port. The oils include mineral oils and 0.01 to 1% organic black dyes such as Waxoline Blak OBP, available from Znica Inc. (Wilminton, DE). 1-9 μl of reagent master mixture is present in prepackaged form or delivered to the radial outermost sample receiving port. The reagent master mixture contains some or all of the required reaction components. Liquid samples containing template nucleic acids to be tested are delivered manually or automatically to radial intermediate sample receiving ports. The disk is then rotated at a rate insufficient to deliver the sample to the reagent compartment but to deliver the mixture to the sample vessel. Samples and reagents can be mixed by rapid change in disk rotation speed. The disc is then rotated at high speed to transfer the sample and reagent mixture (but not the oil) into the sample vessel. The disc is then rotated at a higher rotational speed to deliver oil to the sample. The oil protects the aqueous sample due to its low density and blocks light passage due to the dye content. Selective delivery of oils, reagents and samples by varying carousel rotation rates is achieved by the following combinations: 1) change in diameter of the passage through which the fluid flows; 2) change in diameter of the physical barrier present in the passage through which the fluid flows; 3) Use of centripetal force dependence on the radius of each sample receiving port from the disc center.

본 발명의 카루셀은 카루셀을 회전시키는 구동 샤프트 및 모터(도 32 에서 506, 504)와 착탈식으로 맞물릴 수 있다. 게다가, 본 발명의 각 카루셀은 서로의 위에 쌓여져서 동시 회전을 위해 구동 샤프트와 맞물린다(도 32). 본 발명의 또다른 측면에 따르면 샘플용기내에 유지된 샘플의 형광을 모니터링하는 장치가 제공된다(도 32, 514). 샘플 용기는 광학적으로 투명한 재료를 포함하고 제 1 차원이 제 2 차원보다 적고 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜ 미만이도록 제 1 및 제 2 차원을 갖는 부피를 한정하는 벽을 가진다. 한 구체예에서 장치는 챔버 샘플용기홀더, 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플을 조사하도록 위치된 발광원, 및 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플용기로 부터 나오는 형광을 탐지하도록 위치된 광탐지기를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서 발광원과 광탐지기는 상승 및 하강될 수 있는 (도 32 에서 화살표(518)로 표시된) 플랫포옴상에 장착된다. 이 구체예에서 발광원과 광탐지기는 각 카루셀이 서로의 위에 축적되어 동시 회전을 위해 구동 샤프트와 맞물릴 때 다중 카루셀의 샘플 용기로 부터 나오는 형광을 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 측정하도록 위치될 수 있다(도 32).The carousel of the present invention can be detachably engaged with a drive shaft and a motor (506, 504 in FIG. 32) for rotating the carousel. In addition, each carousel of the present invention is stacked on top of one another to engage the drive shaft for simultaneous rotation (FIG. 32). According to another aspect of the invention there is provided an apparatus for monitoring the fluorescence of a sample held in a sample container (FIGS. 32, 514). The sample vessel comprises a material that is optically transparent and has walls defining a volume having the first and second dimensions such that the first dimension is less than the second dimension and the ratio of the volume to the outer surface area of the vessel is less than 1 mm. In one embodiment the device comprises a chamber sample vessel holder, a light source mounted in the chamber and positioned to irradiate the sample along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel, and the second dimension of the vessel mounted to the chamber. And a photodetector positioned to detect fluorescence coming from the sample vessel along an axis parallel to the wall. In one embodiment of the invention, the light source and the light detector are mounted on a platform (indicated by arrow 518 in FIG. 32) that can be raised and lowered. In this embodiment, the light source and the photodetector produce an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel, where the fluorescence from the multiple carousel sample vessels when each carousel accumulates on top of each other and engages the drive shaft for simultaneous rotation. Can be positioned to measure accordingly (FIG. 32).

한 구체예에서, 샘플용기 홀더는 복수의 모세관 튜브를 유지하는 카루셀을 포함하며 카루셀은 상기 챔버에 회전가능하게 장착된다. 발광원은 튜브 하부를 통해 모세관 튜브를 조사하도록 위치되며 광탐지기는 모세관 튜브 하부를 통해 형광을 탐지하도록 장착된다. 추가로 장치에는 상기 카루셀을 회전시키는 스테핑 모터와 카루셀을 모터에 연결하는 수단이 제공된다.In one embodiment, the sample vessel holder includes a carousel that holds a plurality of capillary tubes and the carousel is rotatably mounted to the chamber. The light source is positioned to irradiate the capillary tube through the bottom of the tube and the photodetector is mounted to detect fluorescence through the bottom of the capillary tube. The apparatus is further provided with a stepping motor for rotating the carousel and a means for connecting the carousel to the motor.

형광 탐지 장치의 챔버에는 챔버와 공기가 통하게 장치에 장착된 히터(도 32, 510) 및 팬(도 32, 508), 예정된 시간 및 온도 매개변수를 사용하여 챔버온도를 신속히 순환시키기 위한 제어기가 제공된다. 이 장치는 카루셀에 의해 유지된 샘플용기에서 폴리메라제 연쇄반응을 수행할 수 있다. 특히, 이 장치는 반응의 진행이 실시간으로 모니터링될 수 있기 때문에 PCR반응 수행방법을 개선하며 반응동안 온도 및 시간 매개변수의 조절이 가능하여 증폭된 타겟 핵산서열의 수율 및 순도를 최적화할 수 있다.The chamber of the fluorescence detection device is provided with a heater (FIGS. 32, 510) and a fan (FIGS. 32, 508) mounted to the device in air communication with the chamber, and a controller for rapidly circulating the chamber temperature using predetermined time and temperature parameters. do. This device can perform polymerase chain reaction in a sample vessel held by carousel. In particular, the device can monitor the progress of the reaction in real time, improve the method of performing the PCR reaction and can adjust the temperature and time parameters during the reaction to optimize the yield and purity of the amplified target nucleic acid sequence.

게다가, 본 발명에 따라서 타겟 서열의 인접지역에 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 유효량을 생물학적 샘플에 첨가하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 타겟 핵산서열 증폭을 개선하는 방법이 제공되며, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 형광에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되어서 두 프로브가 타겟 서열과 교합할 때 도너 및 받게 형광단이 0-15 누클레오타이드, 특히 서로의 1-5 누클레오타이드내에 있고, 폴리메라제 연쇄반응을 사용하여 타겟 핵산서열을 증폭하고, 폴리메라제 연쇄반응동안 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛으로 샘플을 조사하여 상기 샘플에서 나오는 형광을 측정하는 단계를 포함하며, 형광 단계에서 발생된 데이타에 따라서 온도 및 시간 매개변수를 조절하는 단계를 포함한다.Furthermore, according to the present invention there is provided a method for improving target nucleic acid sequence amplification of a biological sample comprising the step of adding to the biological sample an effective amount of two nucleic acid probes that occupy adjacent regions of the target sequence. Labeled as donor fluorophore and the other as donor fluorophore of a fluorescence energy transfer pair so that when the two probes associate with the target sequence, the donor and receive fluorophores are 0-15 nucleotides, especially 1-5 nucleotides of each other. In the tide, amplifying the target nucleic acid sequence using a polymerase chain reaction, and irradiating the sample with light of a selected wavelength absorbed by the donor fluorophore during the polymerase chain reaction to determine the fluorescence emitted from the sample. And adjusting the temperature and time parameters in accordance with the data generated in the fluorescence step. It should.

따라서 본 발명에 따라서 PCR반응 수행에 개선된 장치가 제공된다. 이 장치는 챔버, 상기 챔버와 공기가 통하게 장착된 히터 및 팬, 복수의 샘플용기를 유지하는 카루셀을 포함한다. 이 장치와 관련하여 사용되는 샘플용기는 광학적으로 투명한 재료를 포함하며 제 1 차원이 제 2 차원보다 크고 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜ 미만이도록 제 1 및 제 2 차원을 가지는 부피를 한정하는 벽을 가진다. 카루셀은 챔버에 회전가능하게 장착된다. 장치는 또한 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플용기를 조사하는 발광원과 상기 챔버에 장착되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플용기에서 나오는 형광을 측정하는 광탐지기를 포함한다. 게다가 장치에는 상기 카루셀에 의해 유지된 모세관 튜브를 위치시켜서 조사 및 형광 탐지를 하도록 카루셀을 회전시키는 스테핑 모터가 설비된다. 실시간 PCR 반응 모니터링과 탐지된 형광에 따른 반응매개변수 결정으로 반응을 최적화하도록 반응조건을 조절할 수 있다. 선호되는 구체예에서 반응의 상태를 나타내는 하나이상의 값이 시각적으로 인식가능한 방식으로 실시간으로 표시된다.Thus, according to the present invention, an improved apparatus for performing a PCR reaction is provided. The apparatus includes a chamber, a heater and fan mounted in air communication with the chamber, and a carousel holding a plurality of sample containers. The sample vessel used in connection with this device comprises an optically transparent material and defines a volume having the first and second dimensions such that the first dimension is larger than the second dimension and the ratio of the volume to the outer surface area of the vessel is less than 1 mm. To have a wall. The carousel is rotatably mounted to the chamber. The device is also mounted to the chamber and emits light from the sample vessel along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel and the sample vessel along the axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel. It includes a photodetector to measure the emitted fluorescence. In addition, the apparatus is equipped with a stepping motor for positioning the capillary tube held by the carousel to rotate the carousel for irradiation and fluorescence detection. Real-time PCR reaction monitoring and reaction parameter determination according to the detected fluorescence can be used to adjust the reaction conditions to optimize the reaction. In preferred embodiments one or more values indicative of the state of the reaction are displayed in real time in a visually recognizable manner.

본 발명의 카루셀은 액체샘플을 모세관 샘플용기에 전달하는데 사용된다. 카루셀은 상부표면, 하부표면, 이들 사이에 연장된 외부 가장자리, 상부표면에 있는 샘플수용포트, 외부가장자리에 있는 샘플 용기포트, 및 샘플수용포트와 샘플용기 포트와 통하는 샘플 통로를 가지는 디스크를 포함한다. 샘플용기포트와 샘플통로는 샘플용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성된다. 액체샘플을 모세관 샘플용기에 전달하기 위해 카루셀을 사용하는 방법은 액체샘플을 수용하고 샘플용기를 유지하는 카루셀 선택단계, 액체샘플을 카루셀의 샘플수용포트에 전달하는 단계, 샘플용기를 샘플용기포트에 위치시키는 단계, 카루셀을 회전시켜 샘플을 모세관 샘플용기에 전달하는 단계를 포함한다.The carousel of the present invention is used to deliver a liquid sample to a capillary sample container. The carousel comprises a disk having an upper surface, a lower surface, an outer edge extending therebetween, a sample receiving port on an upper surface, a sample container port on an outer edge, and a sample passageway communicating with the sample receiving port and the sample container port. . The sample vessel port and the sample passage are formed to receive the sample vessel and secure it to the disc. The method of using carousel to deliver a liquid sample to a capillary sample container includes a carousel selection step for accommodating the liquid sample and holding the sample container, delivering the liquid sample to the sample receiving port of the carousel, and placing the sample container into the sample container port. Positioning, rotating the carousel to deliver the sample to the capillary sample container.

본 발명은 샘플에서 타겟 핵산 서열의 존재를 탐지하는 시스템에도 관계한다. 이 시스템은 타겟 핵산 서열의 인접지역에 교합하는 한쌍의 올리고누클레오타이드 프로브를 포함하며, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 형광 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링된다. 도너 형광단 방출과 받게 형광단 흡수는 25% 미만 중첩하며 받게 형광단은 10,000M-1-1이상의 피크 흡광계수를 가지며 두 프로브가 타겟 서열과 교합할 때 도너 및 받게 형광단은 서로의 15 누클레오타이드내에 있다. 또다른 구체예에서, 도너 형광단 방출과 받게 형광단 흡수는 20% 미만 중첩하고 두 프로브와 타겟 서열의 교합시 도너 및 받게 형광단은 서로의 5 누클레오타이드, 특히 3 누클레오타이드내에 있다.The invention also relates to a system for detecting the presence of a target nucleic acid sequence in a sample. The system includes a pair of oligonucleotide probes that occupy contiguous regions of the target nucleic acid sequence, one of which is labeled with a fluorophore and the other is labeled with a donor fluorophore of a fluorescent energy transfer pair. The donor fluorophore emission and receiving fluorophore absorption overlaps less than 25%, and the receiving fluorophore has a peak extinction coefficient of 10,000 M −1 cm −1 or greater and when the two probes associate with the target sequence, It is in nucleotides. In another embodiment, the donor fluorophore emission and the received fluorophore uptake overlap less than 20% and the donor and receive fluorophores are within 5 nucleotides of each other, particularly 3 nucleotides, upon engagement of the two probes with the target sequence.

본 발명은 예정된 온도대 시간 프로파일에 따라서 또는 실시간으로 하나 이상의 반응 매개변수를 조절하고 생물학적 샘플의 온도를 신속 정확하게 변화시키고 생물학적 샘플이 정확하게 열 싸이클링을 받게 하는 장치를 제공한다. 본 발명은 또한 매우 짧은 기간에 걸쳐 큰 온도 구배로 샘플이 열순환을 받게 하는 낮은 열량의 열전달 매체를 사용한 열 싸이클링 장치를 제공하며 다양한 생물학적 샘플이 신속한 열 싸이클링을 받게 하는 장치를 제공한다.The present invention provides an apparatus that adjusts one or more reaction parameters in accordance with a predetermined temperature versus time profile or changes the temperature of a biological sample quickly and accurately and allows the biological sample to undergo precise thermal cycling. The present invention also provides a thermal cycling device using a low calorific heat transfer medium that allows a sample to undergo thermal cycling over a very short period of time with a large temperature gradient and provides a device that allows various biological samples to undergo rapid thermal cycling.

게다가, 본 발명은 열전달 매체로서 공기를 사용하여 생물학적 샘플이 신속한 열 싸이클링을 받게 하는 장치를 제공하며 PCR을 빠르게 수행하며 반응을 동시에 모니터링하는 방법 및 시스템을 제공한다. 또한 본 발명은 PCR을 수행하여 반응이 진행중일 때 반응은 연속 모니터링하여 반응이 진행중일 때 반응 매개변수를 조절하는 시스템 및 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides an apparatus for allowing a biological sample to undergo rapid thermal cycling using air as a heat transfer medium, and provides a method and system for rapidly performing PCR and simultaneously monitoring a reaction. The present invention also provides a system and method for performing a PCR to continuously monitor the reaction when the reaction is in progress to adjust the reaction parameters when the reaction is in progress.

신속한 열 싸이클링을 하는 온-라인 DNA 분석 시스템에 관한 정보는 미국특허 출원 08/381,703 (1995, 1, 31 출원)에 발견된다.Information regarding on-line DNA analysis systems for rapid thermal cycling is found in US Patent Application 08 / 381,703 (1995, 1, 31 applications).

Claims (117)

(a) 제 1 용기에 제 1 생물학적 샘플을 담고;(a) containing a first biological sample in a first container; (b) 섭씨온도로 표시된 제 2 온도(T2) - 제 1 온도(T1)와 동일하게 제 1 온도로 부터 제 2 온도로 제 1 생물학적 샘플의 온도를 수초이내에 상승시키고;(b) raising the temperature of the first biological sample in seconds from the first temperature to the second temperature equal to the second temperature T 2 -same as the first temperature T 1 in degrees Celsius; (c) 10초 미만의 제 1 유지기간동안 제 2 온도 이상의 온도에서 제 1 생물학적 샘플을 유지시키고;(c) maintaining the first biological sample at a temperature above the second temperature for a first maintenance period of less than 10 seconds; (d) 섭씨온도는 표시된 제 2 온도(T2) - 제 1 온도(T1)와 동일하게 제 2 온도로 부터 제 1 온도로 제 1 생물학적 샘플의 온도를 하강시키고;(d) the celsius lowers the temperature of the first biological sample from the second temperature to the first temperature equal to the indicated second temperature T 2 -first temperature T 1 ; (e) 20초 미만의 제 2 유지기간동안 제 1 온도 이하의 온도에서 제 1 생물학적 샘플을 유지시키는 단계를 포함하는 제 1 생물학적 샘플이 신속한 열 싸이클링을 받게 하는 방법.(e) maintaining the first biological sample at a temperature below the first temperature for a second retention period of less than 20 seconds, wherein the first biological sample is subjected to rapid thermal cycling. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플을 제 1 용기에 담는 단계가 10,000㎕ 미만의 제 1 생물학적 샘플을 제 1 용기에 담는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the step of containing the first biological sample in the first container comprises the step of containing less than 10,000 μl of the first biological sample in the first container. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플을 제 1 용기에 담는 단계가 제 1 생물학적 샘플을 10,000㎕ 미만의 부피를 가지는 제 1 용기에 담는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the step of containing the first biological sample in the first container comprises the step of containing the first biological sample in a first container having a volume of less than 10,000 μl. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플을 제 1 용기에 담는 단계가 적어도 일부가 유리로 제조된 제 1 용기에 일정부피의 생물학적 샘플을 담는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the step of holding the first biological sample in the first container comprises the step of holding a volume of the biological sample in a first container made of at least a portion of glass. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플의 온도 상승단계가 제 1 생물학적 샘플의 온도를 (T2-T1)/4 만큼 제 1 온도(T1)로 부터 제 2 온도(T2)로 수초이내에 상승시키는 것임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the step of raising the temperature of the first biological sample is several seconds from the first temperature (T 1 ) to the second temperature (T 2 ) by (T 2 -T 1 ) / 4. Increasing within a second time. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플의 온도 상승단계가 제 1 생물학적 샘플의 온도를 (T2-T1)/10 만큼 제 1 온도(T1)로 부터 제 2 온도(T2)로 수초이내에 상승시키는 것임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the step of raising the temperature of the first biological sample is several seconds from the first temperature (T 1 ) to the second temperature (T 2 ) by the temperature of the first biological sample (T 2 -T 1 ) / 10. Increasing within a second time. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플의 온도 상승단계가 초당 1℃ 이상의 제 1 속도로 제 2 온도와 20℃ 이상 차이가 나는 제 1 온도로 부터 제 2 온도로 제 1 생물학적 샘플의 온도를 상승시키는 것임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the step of raising the temperature of the first biological sample raises the temperature of the first biological sample from the first temperature to the second temperature that is at least 20 ° C. different from the second temperature at a first rate of at least 1 ° C. per second. Characterized in that the method. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플의 온도 상승단계가 초당 10℃ 이상의 제 1 속도로 제 2 온도와 20℃ 이상 차이가 나는 제 1 온도로 부터 제 2 온도로 제 1 생물학적 샘플의 온도를 상승시키는 것임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the step of raising the temperature of the first biological sample raises the temperature of the first biological sample from the first temperature to the second temperature that is at least 20 ° C. different from the second temperature at a first rate of 10 ° C. or more per second. Characterized in that the method. 제 1 항에 있어서, 제 1 생물학적 샘플의 온도 상승 단계가 초당 20℃ 이상의 속도로 제 1 온도로 부터 제 2 온도로 제 1 생물학적 샘플의 온도를 상승시키는 것임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the step of raising the temperature of the first biological sample is to raise the temperature of the first biological sample from the first temperature to the second temperature at a rate of at least 20 ° C. per second. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 유지기간이 10초 미만임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the first and second retention periods are less than 10 seconds. 제 1 항에 있어서, 제 1 및 제 2 유지기간이 1초 미만임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the first and second retention periods are less than one second. 제 1 항에 있어서, 복수의 생물학적 샘플을 복수의 용기에 담는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 further comprising the step of containing the plurality of biological samples in the plurality of containers. PCR 샘플을 유지하며 1밀리미터 미만의 샘플을 유지하는 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 제 1 측부, 제 2 측부 및 단부를 가지는 샘플용기;A sample container consisting of an optically transparent material for holding a PCR sample and holding a sample of less than 1 millimeter, the sample container having a first side, a second side, and an end; PCR 샘플을 모니터링 위치에 위치시키는 수단;Means for positioning a PCR sample at a monitoring location; PCR 샘플을 가열하는 수단;Means for heating a PCR sample; PCR 샘플을 냉각하는 수단;Means for cooling the PCR sample; 가열수단과 냉각수단을 반복적으로 작동시켜서 PCR 샘플이 열싸이클링을 받도록 하는 제어수단;Control means for repeatedly operating the heating means and the cooling means to allow the PCR sample to undergo thermal cycling; 샘플을 광학적으로 활성화 시켜서 샘플이 형광을 하게 하는 수단;Means for optically activating the sample to cause the sample to fluoresce; 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단을 포함하는 PCR을 수행하며 온도 싸이클링동안 실시간으로 반응을 모니터링하기 위한 시스템.A system for performing a PCR comprising means for detecting fluorescence of an activated sample and for monitoring the reaction in real time during temperature cycling. 제 13 항에 있어서, 탐지된 형광에 따라서 반응 매개변수를 결정하는 수단과 반응 매개변수에 따라서 제어수단을 조절하는 수단을 더욱 포함하는 시스템.14. The system of claim 13, further comprising means for determining a reaction parameter in accordance with the detected fluorescence and means for adjusting the control means in accordance with the reaction parameter. 제 14 항에 있어서, 반응 매개변수에 따라서 제어수단을 조절하는 수단을 더욱 포함하는 시스템.15. The system of claim 14, further comprising means for adjusting the control means in accordance with reaction parameters. 제 15 항에 있어서, 반응 매개변수에 따라서 가열수단과 냉각수단의 작동시기를 변경하기 위해서 가열수단과 냉각수단의 작동을 조절하는 제어장치를 더욱 포함하는 시스템.The system according to claim 15, further comprising a control device for adjusting the operation of the heating means and the cooling means to change the timing of operation of the heating means and the cooling means in accordance with the reaction parameters. 제 15 항에 있어서, 반응 매개변수에 따라서 생물학적 샘플기 가열 및 냉각되는 속도를 변경하기 위해서 가열수단과 냉각수단의 작동을 조절하는 제어장치를 더욱 포함하는 시스템.16. The system of claim 15, further comprising a control device that controls the operation of the heating means and cooling means to vary the rate at which the biological sampler is heated and cooled in accordance with the reaction parameters. 제 13 항에 있어서, 샘플용기가 적어도 일부가 유리로 제조되며 10,000㎕ 미만의 부피를 가지는 용기임을 특징으로 하는 시스템.The system of claim 13, wherein the sample container is a container at least partially made of glass and having a volume of less than 10,000 μl. 제 13 항에 있어서, 모니터링 위치에 PCR 샘플을 위치시키는 수단이 회전가능한 카루셀을 포함함을 특징으로 하는 시스템.The system of claim 13, wherein the means for positioning the PCR sample at the monitoring location comprises a rotatable carousel. 제 13 항에 있어서, 샘플을 광학적으로 활성화 시키는 수단과 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단을 위치시키는 수단을 더욱 포함하여서 탐지되는 형광을 최적화 시킴을 특징으로 하는 시스템.14. The system of claim 13, further comprising means for optically activating the sample and means for locating the means for detecting fluorescence of the activated sample. 제 13 항에 있어서, PCR 샘플 가열수단이 공기 히터임을 특징으로 하는 시스템.The system of claim 13, wherein the PCR sample heating means is an air heater. 제 13 항에 있어서, 냉각수단이 주변공기를 샘플 용기에 전달하는 공기 이동장치를 포함함을 특징으로 하는 시스템.14. The system of claim 13, wherein the cooling means comprises an air mover for delivering ambient air to the sample vessel. 제 13 항에 있어서, 제어수단이 마이크로프로세서를 포함함을 특징으로 하는 시스템.The system of claim 13 wherein the control means comprises a microprocessor. 제 13 항에 있어서, 샘플을 광학적으로 활성화 시키는 수단이 방출된 복사에너지가 샘플용기의 측부에 입사하도록 위치된 광 방출기 구조를 포함함을 특징으로 하는 시스템.14. The system of claim 13, wherein the means for optically activating the sample comprises a light emitter structure positioned such that the emitted radiation is incident on the side of the sample container. 제 24 항에 있어서, 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단이 샘플 용기의 측부로 부터 방출된 복사에너지가 탐지되도록 위치된 광 탐지기 구조를 포함함을 특징으로 하는 시스템.25. The system of claim 24, wherein the means for detecting fluorescence of the activated sample comprises a light detector structure positioned to detect radiant energy emitted from the side of the sample vessel. 제 13 항에 있어서, 샘플을 광학적으로 활성화시키는 수단이 방출된 복사에너지가 샘플용기의 단부에 입사하도록 위치된 광 방출기 구조를 포함함을 특징으로 하는 시스템.14. The system of claim 13, wherein the means for optically activating the sample comprises a light emitter structure positioned such that the emitted radiation is incident on the end of the sample vessel. 제 26 항에 있어서, 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단이 샘플 용기의 단부로 부터 방출된 복사에너지가 탐지되도록 위치되는 광 탐지기 구조를 포함함을 특징으로 하는 시스템.27. The system of claim 26, wherein the means for detecting fluorescence of the activated sample comprises a light detector structure positioned to detect radiant energy emitted from an end of the sample vessel. 제 13 항에 있어서, 탐지된 형광에 따라서 적어도 하나의 반응 매개변수를 결정하는 수단이 생성물 용융온도, 생성물 용융시간, 생성물 재어닐링 온도, 생성물 재어닐링 시간, 프로브 용융온도, 프로브 용융시간, 프라이머 어닐링/신장 온도 또는 프라이머 어닐링/신장시간에서 선택된 적어도 하나의 반응매개변수를 결정하는 수단을 포함함을 특징으로 하는 시스템.The method of claim 13, wherein the means for determining at least one reaction parameter in accordance with the detected fluorescence comprises product melting temperature, product melting time, product reannealing temperature, product reannealing time, probe melting temperature, probe melting time, primer annealing. Means for determining at least one reaction parameter selected from / extension temperature or primer annealing / extension time. 제 13 항에 있어서, 활성화된 샘플의 형광 탐지수단이 생성물이 완전 용융되었다고 탐지할 때 샘플을 냉각하는 수단을 제어수단이 포함함을 특징으로 하는 시스템.The system of claim 13, wherein the control means comprises means for cooling the sample when the fluorescence detection means of the activated sample detects that the product is completely melted. 제 13 항에 있어서, 활성화된 샘플의 형광 탐지수단이 더 이상 생성물 생성이 없다고 탐지할 때 샘플을 가열하는 수단을 제어수단이 포함함을 특징으로 하는 시스템.14. The system of claim 13, wherein the control means includes means for heating the sample when the fluorescence detection means of the activated sample detects that there is no longer product production. 제 13 항에 있어서, 광학적 활성화 수단이 샘플 용기의 제 1 측부와 작용하도록 위치되며 형광 탐지수단이 샘플용기의 제 2 측부와 작용하도록 위치됨을 특징으로 하는 시스템.14. The system of claim 13, wherein the optical activation means are positioned to act with the first side of the sample vessel and the fluorescence detection means is positioned to act with the second side of the sample vessel. 제 13 항에 있어서, 광학적 활성화 수단이 샘플 용기의 단부와 작용하도록 위치되며 형광 탐지수단이 샘플 용기의 단부와 작용하도록 위치됨을 특징으로 하는 시스템.14. The system of claim 13, wherein the optical activation means are positioned to act with the end of the sample vessel and the fluorescence detection means is positioned to act with the end of the sample vessel. 복수의 PCR 샘플을 유지하며 1밀리미터 미만의 샘플을 유지하는 광학적으로 투명한 모세관 튜브로 구성되며 밀봉된 단부와 개방된 단부를 가지며 또다른 단부상에 밀봉가능한 폐쇄부를 갖는 복수의 샘플용기;A plurality of sample containers consisting of optically transparent capillary tubes for holding a plurality of PCR samples and for holding samples less than 1 millimeter and having a sealed end and an open end and having a sealable seal on another end; 복수의 샘플용기를 유지하며 샘플용기를 유지하는 회전가능한 카루셀을 포함하는 수단;Means for holding a plurality of sample containers and including a rotatable carousel for holding the sample containers; 고온유체를 복수의 샘플용기와 강제 접촉시키는 수단;Means for forcibly contacting the hot fluid with the plurality of sample containers; 냉각유체를 복수의 샘플용기와 강제 접촉시키는 수단;Means for forcibly contacting the cooling fluid with the plurality of sample containers; 고온유체 및 냉각유체를 샘플용기와 접촉시키는 수단을 반복적으로 작동시켜서 PCR 샘플이 열 싸이클링을 받게 하는 수단;Means for repeatedly operating the means for contacting the hot fluid and the cooling fluid with the sample vessel to cause the PCR sample to undergo thermal cycling; 샘플을 광학적으로 활성화시켜서 샘플이 형광을 발휘하게 하는 수단;Means for optically activating the sample to cause the sample to fluoresce; 제 1 파장과 제 2 파장에서 활성화된 샘플의 형광을 탐지하는 수단;Means for detecting fluorescence of a sample activated at a first wavelength and a second wavelength; 탐지된 형광에 따라서 적어도 하나의 매개변수를 결정하고 시각적으로 인식가능한 방식으로 반응 매개변수를 실시간으로 표시하는 수단을 포함하는 PCR을 수행하여 온도 싸이클링 동안 반응을 실시간으로 모니터링하는 시스템.12. A system for real-time monitoring of a reaction during temperature cycling by performing PCR comprising means for determining at least one parameter in accordance with the detected fluorescence and displaying the reaction parameter in real time in a visually recognizable manner. 제 33 항에 있어서, 반응이 실시간으로 조절되도록 반응 매개변수에 따라서 반복 작동하는 수단을 조절하는 수단을 더욱 포함하는 시스템.34. The system of claim 33, further comprising means for adjusting the means for repeating operation in accordance with the response parameters such that the response is adjusted in real time. 제 33 항에 있어서, 탐지된 형광에 따라서 적어도 하나의 반응 매개변수를 결정하고 시각적으로 인식가능한 방식으로 반응 매개변수를 실시간으로 표시하는 수단이 변성온도 및 시간, 프라이머 어닐링온도 및 시간, 프로브 어닐링온도 및 시간, 효소 신장 온도 및 시간, 또는 싸이클 횟수에서 선택된 반응 매개변수를 결정하는 수단을 포함함을 특징으로 하는 시스템.34. The method of claim 33, wherein the means for determining at least one reaction parameter in accordance with the detected fluorescence and displaying the reaction parameter in a visually recognizable manner in real time comprises: denaturation temperature and time, primer annealing temperature and time, probe annealing temperature. And means for determining a selected reaction parameter in time, enzyme extension temperature and time, or cycle number. 생물학적 샘플을 제공하고;Providing a biological sample; 샘플의 온도를 제 1 온도로 상승시키고;Raise the temperature of the sample to a first temperature; 1초인 제 1 기간보다 적은 기간내에 샘플 냉각을 시작하고;Start sample cooling in less than a first period of one second; 제 1 온도보다 낮은 제 2 온도까지 샘플의 온도를 낮추고;Lowering the temperature of the sample to a second temperature lower than the first temperature; 제 1 기간보다 적은 기간동안 제 2 온도에 샘플을 유지하고;Maintaining the sample at the second temperature for less than the first period; 제 2 온도보다 높은 제 3 온도까지 제 2 온도로 부터 샘플의 온도를 상승시키는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법.Raising the temperature of the sample from the second temperature to a third temperature higher than the second temperature. 제 36 항에 있어서, 제 1 온도로 샘플온도를 상승시키는 단계와 제 2 온도로 샘플온도를 하강시키는 단계가 20분후에 30회 이상 수행됨을 특징으로 하는 방법.37. The method of claim 36 wherein the step of raising the sample temperature to the first temperature and the step of lowering the sample temperature to the second temperature is performed at least 30 times after 20 minutes. 제 36 항에 있어서, 제 1 기간이 0.2초 미만임을 특징으로 하는 시스템.37. The system of claim 36, wherein the first period of time is less than 0.2 seconds. 핵산 증폭을 시킬 생물학적 샘플을 제공하고;Providing a biological sample for nucleic acid amplification; 생물학적 샘플이 제 1 온도로 부터 제 2 온도로 온도 전이를 겪게 하며;The biological sample undergoes a temperature transition from the first temperature to the second temperature; 샘플로 부터 복사에너지가 방출되도록 온도전이동안 생물학적 샘플을 활성화시키고;Activating the biological sample during the temperature transition so that radiant energy is released from the sample; 온도전이동안 적어도 한 번 샘플로 부터 방출되는 복사에너지를 탐지하여 적어도 하나의 반응 매개변수를 결정하는 단계를 포함하는 증폭진행 모니터링하면서 핵산 증폭을 수행하는 방법.Detecting nucleic acid emitted from the sample at least once during the temperature transition to determine at least one reaction parameter. 제 39 항에 있어서, 복사에너지 탐지단계가 생성물 용융온도 결정단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein detecting the radiant energy comprises determining a product melting temperature. 제 39 항에 있어서, 복사에너지 탐지단계가 프로브 용융온도 결정단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein detecting the radiant energy comprises determining a probe melting temperature. 제 39 항에 있어서, 생물학적 샘플이 온도 전이를 겪게 하는 단계가 생물학적 샘플의 온도를 초당 2.5℃ 이상의 속도로 증가시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39 wherein the step of causing the biological sample to undergo a temperature transition comprises increasing the temperature of the biological sample at a rate of at least 2.5 ° C per second. 제 39 항에 있어서, 생물학적 샘플이 온도전이를 겪게 하는 단계가 10초 정도의 기간동안 생물학적 샘플의 온도를 40℃ 이상 증가시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein causing the biological sample to undergo a temperature transition comprises increasing the temperature of the biological sample by at least 40 [deg.] C. over a period of about 10 seconds. 제 39 항에 있어서, 온도전이동안 생물학적 샘플을 활성화시키는 단계가 생물학적 샘플을 광학적으로 활성화시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein activating the biological sample during the temperature transition comprises optically activating the biological sample. 제 39 항에 있어서, 샘플로 부터 방출되는 복사에너지 탐지단계가 샘플에서 방출된 복사에너지를 광학적으로 탐지하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein detecting the radiant energy emitted from the sample comprises optically detecting radiant energy emitted from the sample. 제 39 항에 있어서, 샘플로 부터 방출되는 복사에너지 탐지단계가 샘플에서 방출된 복사에너지를 전이동안 두 번이상 탐지하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein detecting radiant energy emitted from the sample comprises detecting radiant energy emitted from the sample more than once during transition. 제 39 항에 있어서, 샘플로 부터 방출되는 복사에너지 탐지단계가 샘플에서 방출된 복사에너지를 온도전이동안 두 번이상 탐지하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein detecting radiant energy emitted from the sample comprises detecting radiant energy emitted from the sample more than once during the temperature transition. 제 39 항에 있어서, 생물학적 샘플이 온도전이를 겪게 하는 단계가 생물학적 샘플에서 생성물이 완전 용융될때까지 생물학적 샘플의 온도를 증가시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.40. The method of claim 39, wherein causing the biological sample to undergo a temperature transition comprises increasing the temperature of the biological sample until the product completely melts in the biological sample. 제 1 부피를 가지며 속에 담긴 생물학적 샘플을 수용하는 부위;A site having a first volume and containing a biological sample contained therein; 수용부위에 놓인 생물학적 샘플이 반응부위에 이동할 수 있도록 수용부위와 유체 연결이 되며 제 1 부피보다 적으며 1밀리리터 미만인 제 2 부피보다 크지 않은 내부 부피를 가지며 식(cal.㎝/㎠s.℃)×10에 따라서 20 내지 35의 열전도성을 가지는 재료로 구성된 반응부위를 포함하는 핵산증폭동안 생물학적 샘플 유체를 유지하는 용기.The biological sample placed at the receiving site is in fluid communication with the receiving site so as to be able to move to the reaction site and has an internal volume of less than the first volume and no larger than the second volume of less than 1 milliliter. A container for holding a biological sample fluid during nucleic acid amplification comprising a reaction site comprised of a material having a thermal conductivity of 20 to 35 in accordance with x10. 제 49 항에 있어서, 수용부위가 플라스틱 재료를 포함함을 특징으로 하는 용기.50. The container of claim 49, wherein the receiving portion comprises a plastic material. 제 49 항에 있어서, 수용부위가 퍼넬형태로 형성된 플라스틱재료를 포함함을 특징으로 하는 용기.50. The container of claim 49, wherein the receiving portion comprises a plastic material formed in the form of a funnel. 제 49 항에 있어서, 수용 부위에 착탈식으로 삽입되는 스토퍼를 더욱 포함함을 특징으로 하는 용기.50. The container of claim 49, further comprising a stopper removably inserted at the receiving site. 제 49 항에 있어서, 제 2 부피가 10,000㎕ 미만임을 특징으로 하는 용기.50. The container of claim 49, wherein the second volume is less than 10,000 μl. 제 49 항에 있어서, 반응부위의 적어도 일부가 투명함을 특징으로 하는 용기.The vessel of claim 49 wherein at least a portion of the reaction site is transparent. 제 1 생물학적 샘플을 유지하는 제 1 유지수단;First retaining means for holding a first biological sample; 제 2 생물학적 샘플을 유지하는 제 2 유지수단;Second holding means for holding a second biological sample; 모니터링 위치가 아닌 곳에 있는 제 1 및 제 2 유지수단을 모니터링 위치로 이동시키는 수단;Means for moving the first and second retaining means in a non-monitoring position to the monitoring position; 비-모니터링 위치와 모니터링 위치에 있는 제 1 및 제 2 유지수단을 반복적으로 가열 및 냉각하여 제 1 및 제 2 생물학적 샘플의 열 싸이클링을 수행하는 열싸이클링 수단;Heat cycling means for repeatedly heating and cooling the first and second retaining means in the non-monitoring position and the monitoring position to perform thermal cycling of the first and second biological samples; 생물학적 샘플이 모니터링 위치에 있을 때 제 1 및 제 2 유지수단에서 생물학적 반응을 확인하며 생물학적 샘플에서 방출된 복사에너지 탐지 수단을 포함하는 모니터링 수단;Monitoring means for identifying a biological response at the first and second holding means when the biological sample is in the monitoring position and including means for detecting radiant energy emitted from the biological sample; 생물학적 반응의 진행이 열 싸이클링 동안 탐지되도록 이동수단, 열 싸이클링 수단, 및 모니터링 수단의 작동을 조절하는 제어수단을 포함하는 생물학적 반응을 수행하여 그 진행을 모니터링하는 시스템.A system for monitoring the progress of conducting a biological reaction comprising control means for regulating the operation of the means of movement, the thermal cycling means, and the monitoring means such that the progress of the biological reaction is detected during thermal cycling. 제 55 항에 있어서, 모니터링 수단이56. The method of claim 55, wherein the monitoring means 활성화 복사에너지를 방출하는 활성화 소스;An activation source that emits activation radiation; 모니터링 위치에 위치된 샘플이 복사에너지를 방출하도록 활성화 복사에너지를 모니터링 위치로 안내하는 수단;Means for directing activating radiation to a monitoring location such that a sample located at the monitoring location emits radiation; 방출된 복사에너지를 전기적 신호로 전환시키는 수단;Means for converting the emitted radiation into an electrical signal; 전기적 신호를 반응 매개변수로 처리하는 수단;Means for processing an electrical signal into a response parameter; 반응 매개변수를 표시하는 수단;Means for displaying reaction parameters; 반응 매개변수를 기록하는 수단을 포함함을 특징으로 하는 시스템.And means for recording the reaction parameters. 제 56 항에 있어서, 반응 매개변수가 변성온도 및 시간, 프라이머 어닐링 온도 및 시간, 프로브 어닐링 온도 및 시간, 효소신장온도 및 시간, 또는 싸이클 횟수에서 선택됨을 특징으로 하는 시스템.59. The system of claim 56, wherein the reaction parameter is selected from denaturation temperature and time, primer annealing temperature and time, probe annealing temperature and time, enzyme extension temperature and time, or cycle count. 제 56 항에 있어서, 활성화 소스가 크세논 램프 또는 발광 다이오드에서 선택되는 광방출 소스를 포함하고;57. The method of claim 56, wherein the activation source comprises a light emitting source selected from a xenon lamp or light emitting diode; 방출된 복사에너지를 전기적 신호로 전환시키는 수단이 광 배증관 또는 포토 다이오드에서 선택되는 광탐지장치를 포함하고;Means for converting the emitted radiant energy into an electrical signal comprises a photodetector selected from an optical doubling tube or photodiode; 전기적 신호를 반응매개변수로 처리하는 수단이 마이크로프로세서를 포함함을 특징으로 하는 시스템.And a means for processing the electrical signal into a response parameter comprises a microprocessor. 제 58 항에 있어서, 방출된 복사에너지를 전기적 신호로 전환시키는 수단이 광 배증관 또는 포토 다이오드에서 선택되는 제 1 광 탐지장치와 제 2 광탐지장치를 포함함을 특징으로 하는 시스템.59. The system of claim 58, wherein the means for converting the emitted radiation into an electrical signal comprises a first photodetector and a second photodetector selected from photomultipliers or photodiodes. (a) 제 1 파장에서 핵산 증폭의 진행과 관련된 복사에너지를 방출하는 물질을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하여 핵산 증폭을 겪게 하며;(a) providing a biological sample comprising a substance releasing radiation associated with the progress of nucleic acid amplification at a first wavelength to undergo nucleic acid amplification; (b) 제 1 온도와 제 1 온도와 상이한 제 2 온도를 포함하는 제 1 범위에서 샘플의 온도를 조절하고;(b) adjusting the temperature of the sample in a first range comprising a first temperature and a second temperature different from the first temperature; (c) 샘플의 온도가 제 1 범위내에 있을 때 생물학적 샘플에 의해 방출된 복사에너지를 복수 횟수로 탐지하고;(c) detecting the radiant energy emitted by the biological sample a plurality of times when the temperature of the sample is within the first range; (d) 제 2 온도와 제 2 온도와 상이한 제 3 온도를 포함하는 제 2 범위에서 샘플의 온도를 조절하고;(d) adjusting the temperature of the sample in a second range comprising a second temperature and a third temperature different from the second temperature; (e) 샘플의 온도가 제 2 온도범위내에 있을 때 생물학적 샘플에 의해 방출된 복사에너지를 복수횟수로 탐지하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법.(e) detecting a plurality of times of radiant energy emitted by the biological sample when the temperature of the sample is within a second temperature range. 제 60 항에 있어서, (f) 단계 (c) 또는 (e)에서 탐지된 복사에너지에 따라서 증폭반응의 적어도 하나의 매개변수를 조절하는 단계를 더욱 포함하는 방법.61. The method of claim 60, further comprising (f) adjusting at least one parameter of the amplification reaction according to the radiant energy detected in step (c) or (e). 제 60 항에 있어서, 제 1 범위에서 샘플의 온도를 조절하는 단계가 생성물 용융이 완료될 때 샘플의 온도를 제 1 범위에서 조절하는 것을 중단하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.61. The method of claim 60, wherein adjusting the temperature of the sample in the first range comprises stopping adjusting the temperature of the sample in the first range when product melting is complete. 제 60 항에 있어서, 제 2 범위에서 샘플의 온도를 조절하는 단계가 프라이머 용융이 완료될 때 샘플의 온도를 제 2 범위에서 조절하는 것을 중단하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.61. The method of claim 60, wherein adjusting the temperature of the sample in the second range comprises stopping adjusting the temperature of the sample in the second range when primer melting is complete. 제 60 항에 있어서, 제 3 범위에서 샘플의 온도를 조절하는 단계가 생성물 축적이 유효수준에 도달할 때 샘플의 온도를 제 3 범위에서 조절하는 것을 중단하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.61. The method of claim 60, wherein adjusting the temperature of the sample in the third range comprises stopping adjusting the temperature of the sample in the third range when product accumulation reaches an effective level. 제 60 항에 있어서, 생물학적 샘플에 의해 방출된 복사에너지를 복수횟수로 탐지하는 단계가 400 내지 800㎚의 범위에서 생물학적 샘플에서 방출된 복사에너지를 탐지하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.61. The method of claim 60, wherein detecting the radiant energy emitted by the biological sample a plurality of times comprises detecting radiant energy emitted from the biological sample in the range of 400 to 800 nm. 상부 표면, 하부 표면, 이들 사이에 연장되는 외부 가장자리, 상부표면에 있는 샘플 수용 포트, 외부 가장자리에 있는 샘플용기포트 및 상기 샘플수용포트와 샘플용기포트와 통하는 샘플 통로를 가지는 디스크를 포함하며 상기 샘플 용기 포트와 통로는 샘플 용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성되는 샘플을 유지하고 샘플을 분석용 샘플용기에 전달하는 카루셀.A sample comprising a disk having an upper surface, a lower surface, an outer edge extending therebetween, a sample receiving port on an upper surface, a sample container port on an outer edge, and a sample passageway through the sample receiving port and the sample container port; The container port and passageway is a carousel that holds a sample formed to receive a sample container and secure it to a disk and deliver the sample to an analytical sample container. 제 66 항에 있어서, 샘플 수용 포트에 대한 폐쇄부를 더욱 포함하는 카루셀.67. The carousel of claim 66, further comprising a closure to the sample receiving port. 제 66 항에 있어서, 상기 통로가 샘플 수용 포트를 통해 전달된 액체샘플이 상기 액체 샘플상에 편향력이 없이 샘플 용기 포트로 흐르는 것을 방지하는 장벽을 포함함을 특징으로 하는 카루셀.67. The carousel of claim 66, wherein said passageway comprises a barrier that prevents a liquid sample delivered through a sample receiving port from flowing into said sample container port without deflection on said liquid sample. 제 66 항 또는 68 항에 있어서, 샘플 용기 포트에 수용된 샘플용기를 더욱 포함함을 특징으로 하는 카루셀.69. The carousel of claim 66 or 68, further comprising a sample container housed in the sample container port. 제 69 항에 있어서, 샘플용기가 1㎜ 이상의 표면적에 대한 부피비를 가지는 모세관 튜브임을 특징으로 하는 카루셀.The carousel of claim 69, wherein the sample container is a capillary tube having a volume ratio to a surface area of at least 1 mm. 제 66 항에 있어서, 상기 통로가 샘플용기포트, 샘플수용포트 및 상기 상부 표면에 형성된 하나 이상의 추가 포트와 통함을 특징으로 하는 카루셀.67. The carousel of claim 66, wherein said passageway communicates with a sample container port, a sample receiving port and one or more additional ports formed on said top surface. 제 71 항에 있어서, 상기 통로가 샘플 수용포트를 통해 전달된 액체 샘플이 상기 액체 샘플상에 편향력 없이 샘플 용기 포트에 흐르는 것을 방지하는 장벽을 포함함을 특징으로 하는 카루셀.72. The carousel of claim 71, wherein said passageway comprises a barrier that prevents a liquid sample delivered through a sample receiving port from flowing to a sample vessel port without biasing said liquid sample. 제 72 항에 있어서, 상기 통로가 추가 포트를 통해 전달된 액체 샘플이 상기 액체 샘플상에 편향력 없이 샘플 용기 포트에 흐르는 것을 방지하는 추가 장벽을 포함함을 특징으로 하는 카루셀.73. The carousel of claim 72, wherein said passageway comprises an additional barrier that prevents the liquid sample delivered through the additional port from flowing into the sample vessel port without deflection on said liquid sample. 제 72 항 또는 73 항에 있어서, 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트간의 통로에 예정된 시약 혼합물을 더욱 포함하는 카루셀.74. The carousel of claim 72 or 73, further comprising a reagent mixture predetermined in the passageway between the sample receiving port and the sample container port. 제 72 항 또는 73 항에 있어서, 샘플용기포트에 수용된 샘플용기를 더욱 포함하는 카루셀.74. The carousel of claim 72 or 73, further comprising a sample container housed in a sample container port. 제 74 항에 있어서, 샘플용기포트에 수용된 샘플 용기를 더욱 포함하는 카루셀.75. The carousel of claim 74, further comprising a sample container housed in a sample container port. 제 76 항에 있어서, 샘플 용기가 1㎜ 이상의 표면적에 대한 부피를 가지는 모세관 튜브임을 특징으로 하는 카루셀.77. The carousel of claim 76, wherein the sample vessel is a capillary tube having a volume for a surface area of at least 1 mm. 제 75 항에 있어서, 샘플 용기가 1㎜ 이상의 표면적에 대한 부피를 가지는 모세관 튜브임을 특징으로 하는 카루셀.76. The carousel of claim 75, wherein the sample vessel is a capillary tube having a volume for a surface area of at least 1 mm. 챔버;chamber; 제 1 크기가 제 2 크기보다 작으며 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜ 미만이도록 제 1 및 제 2 크기를 갖는 부피를 형성하는 벽과 광학적으로 투명한 재료를 포함하는 샘플용기를 유지하는 샘플용기 홀더;A sample holding a sample container comprising an optically transparent material and a wall forming a volume having a first and second size such that the first size is less than the second size and the ratio of the volume to the outer surface area of the container is less than 1 mm. Container holder; 용기의 제 2 크기를 따른 벽에 평행한 축에 따라 샘플용기를 조사하도록 상기 챔버에 장착되며 위치선정되는 광 방출 소스;A light emission source mounted to and positioned in the chamber to irradiate the sample vessel along an axis parallel to the wall along the second size of the vessel; 용기의 제 2 크기에 따른 벽에 평행한 축에 따라 샘플 용기로 부터 나오는 형광을 측정하도록 상기 챔버에 장착되고 위치선정된 광 탐지기를 포함하는 샘플용기내에 유지된 샘플의 형광을 모니터링하는 장치.A device for monitoring the fluorescence of a sample held in a sample container comprising a photo detector mounted and positioned in the chamber to measure fluorescence coming from the sample container along an axis parallel to the wall according to the second size of the container. 제 79 항에 있어서, 샘플 용기 홀더가 복수의 모세관 튜브를 유지하는 카루셀을 포함하고 상기 카루셀이 상기 챔버에 회전가능하게 장착되며 상기 장치가 상기 카루셀을 회전하는 스테핑 모터와 상기 카루셀을 상기 모터에 연결하는 수단을 더욱 포함함을 특징으로 하는 장치.80. The stepper motor of claim 79, wherein the sample vessel holder includes a carousel that holds a plurality of capillary tubes, the carousel is rotatably mounted to the chamber, and the device connects the carousel to the motor and the stepping motor to rotate the carousel. The apparatus further comprises means for. 제 79 항에 있어서, 상기 챔버에 히터와 팬이 더욱 설비되며 챔버의 온도를 빠르게 순환시키도록 챔버 및 제어기와 공기흐름이 교환됨을 특징으로 하는 장치.80. The apparatus of claim 79, wherein the chamber is further equipped with a heater and a fan and the airflow is exchanged with the chamber and the controller to rapidly circulate the temperature of the chamber. 챔버;chamber; 챔버와 공기가 통하게 장착되는 히터 및 팬;A heater and a fan in air communication with the chamber; 복수의 샘플 용기를 유지하며 상기 챔버에 회전가능하게 장착되는 카루셀;A carousel rotatably mounted to said chamber while holding a plurality of sample containers; 제 1 차원이 제 2 차원보다 작으며 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜미만이도록 제 1 및 제 2 차원을 가지는 부피를 한정하는 벽과 광학적으로 투명한 재료를 포함하는 샘플 용기;A sample container comprising a wall and an optically transparent material defining a volume having a first and second dimension such that the first dimension is less than the second dimension and the ratio of the volume to the outer surface area of the container is less than 1 mm; 용기의 제 2 차원에 따른 벽에 평행한 축을 따라 적어도 하나의 샘플 용기를 조사하도록 상기 챔버에 장착되며 위치선정되는 발광원;A light emitting source mounted and positioned in the chamber to irradiate at least one sample vessel along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel; 용기의 제 2 차원에 따른 벽에 평행한 축을 따라 적어도 하나의 샘플용기로부터 나오는 형광을 측정하도록 상개 챔버에 장착되며 위치선정된 광탐지기를 포함하는 PCR 반응 수행 장치.And a photodetector mounted to the upper chamber and positioned to measure fluorescence coming from the at least one sample vessel along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel. 샘플 전달 포트를 가지는 용기와 상기 용기를 충진시키는 퍼넬캡을 포함하는 생물학적 샘플 취급 시스템으로서 상기 용기는 광학적으로 투명한 재료로된 벽을 포함하고, 상기 벽은 외부 용기 표면적에 대한 용기 부피의 비가 1㎜미만이도록 부피를 한정하며, 상기 퍼넬 캡은 제 1 샘플 수용 포트, 제 2 샘플 전달 포트, 및 용기상에 퍼넬캡을 착탈식으로 고정하는 수단을 가져서 퍼넬캡의 샘플 전달 포트와 용기의 샘플 전달 포트가 일직선이 되는 생물학적 샘플 취급 시스템.A biological sample handling system comprising a vessel having a sample delivery port and a funnel cap filling the vessel, the vessel comprising a wall of optically transparent material, the wall having a ratio of vessel volume to outer vessel surface area of 1 mm. Wherein the funnel cap has a first sample receiving port, a second sample delivery port, and means for detachably securing the funnel cap on the container such that the sample delivery port of the funnel cap and the sample delivery port of the container Straight biological sample handling system. 제 83 항에 있어서, 퍼넬캡이 샘플 수용 포트와 마찰식 밀폐 맞물림을 하는 플러그를 더욱 포함하는 시스템.84. The system of claim 83, wherein the funnel cap further comprises a plug in frictional engagement with the sample receiving port. 제 83 항에 있어서, 용기가 모세관 튜브임을 특징으로 하는 시스템.84. The system of claim 83, wherein the vessel is a capillary tube. 제 83 항에 있어서, 용기 외부 표면적에 대한 용기 부피의 비가 0.25㎜미만임을 특징으로 하는 시스템.84. The system of claim 83, wherein the ratio of vessel volume to vessel exterior surface area is less than 0.25 mm. 챔버;chamber; 챔버와 공기가 통하게 장착되는 히터 및 팬과 사전 한정된 초기 온도 및 시간 매개벼수에 따라 챔버온도를 순환시키는 제어기;A controller for circulating the chamber temperature in accordance with a predetermined initial temperature and time parameter number and a heater and fan mounted in air communication with the chamber; 제 1 차원이 제 2 차원보다 작으며 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜미만이도록 제 1 및 제 2 차원을 갖는 부피를 한정하는 벽과 광학적으로 투명한 재료를 포함하는 복수의 샘플 용기를 유지하며 상기 챔버에 회전가능하게 장착되는 카루셀;Hold a plurality of sample vessels comprising walls and optically transparent material defining a volume having the first and second dimensions such that the first dimension is less than the second dimension and the ratio of the volume to the outer surface area of the vessel is less than 1 mm. A carousel rotatably mounted to the chamber; 용기의 제 2 차원에 따른 벽에 평행한 축을 따라 적어도 하나의 샘플 용기를 조사하도록 상기 챔버에 장착되며 위치선정되는 발광원;A light emitting source mounted and positioned in the chamber to irradiate at least one sample vessel along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel; 용기의 제 2 차원에 따른 벽에 평행한 축을 따라 적어도 하나의 샘플 용기에서 나오는 형광을 탐지하도록 상기 챔버에 장착되며 위치선정되는 광탐지기;A photodetector mounted and positioned in the chamber to detect fluorescence from at least one sample vessel along an axis parallel to the wall along the second dimension of the vessel; 탐지된 형광에 기초하여 반응의 상태를 표시하는 수단을 포함하는 PCR을 수행하여 반응을 실시간으로 모니터링하는 시스템.A system for monitoring the reaction in real time by performing a PCR comprising means for displaying the status of the reaction based on the detected fluorescence. 제 87 항에 있어서, 하나 이상의 반응 매개변수가 실시간으로 조절되도록 제어기를 조절하는 수단을 더욱 포함하는 시스템.88. The system of claim 87, further comprising means for adjusting the controller such that one or more response parameters are adjusted in real time. 제 87 항 또는 88 항에 있어서, 카루셀이 상부표면, 하부표면, 이들 사이에 연장되는 외부 가장자리, 상부표면에 있는 샘플 수용 포트, 외부가장자리에 있는 샘플용기포트 및 상기 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트와 통하는 샘플 통로를 가지는 디스크를 포함하며 상기 샘플 용기 포트와 통로는 샘플 용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성됨을 특징으로 하는 시스템.89. The device of claim 87 or 88, wherein the carousel has an upper surface, a lower surface, an outer edge extending therebetween, a sample receiving port on an upper surface, a sample container port on an outer edge, and the sample receiving port and a sample container port; And a disk having a sample passage therethrough, wherein the sample vessel port and passage are configured to receive and secure the sample vessel to the disk. 제 87 항 또는 88 항에 있어서, 샘플용기가 0.02 내지 1.0㎜의 내경을 가지는 모세관 튜브임을 특징으로 하는 시스템.89. The system of claim 87 or 88, wherein the sample container is a capillary tube having an inner diameter of 0.02 to 1.0 mm. 제 89 항에 있어서, 카루셀의 통로가 샘플 수용포트를 통해 전달된 액체샘플이 상기 액체샘플상에 편향력이 없이 샘플 용기 포트로 흐르는 것을 방지하는 장벽을 포함함을 특징으로 하는 시스템.90. The system of claim 89, wherein the passage of the carousel comprises a barrier that prevents the liquid sample delivered through the sample receiving port from flowing into the sample vessel port without deflection on the liquid sample. 제 89 항에 있어서, 샘플 수용 포트를 통해 전달된 액체샘플상에 편향력을 제공하도록 카루셀을 회전시키는 모터를 더욱 포함하는 시스템.90. The system of claim 89, further comprising a motor to rotate the carousel to provide a biasing force on the liquid sample delivered through the sample receiving port. 샘플을 수용하고, 샘플용기를 유지하기 위해 카루셀을 선택하며,To accept the sample, select the carousel to hold the sample container, 상기 카루셀은 상부표면, 하부표면, 이들 사이에 연장되는 외부가장자리, 상부표면에 있는 상부 수용 포트, 외부 가장자리에 있는 샘플 용기 포트 및 상기 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트와 통하는 샘플 통로를 가지는 디스크를 포함하며 상기 샘플 용기 포트와 통로는 샘플 용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성되며;The carousel comprises a disk having an upper surface, a lower surface, an outer edge extending therebetween, an upper receiving port at an upper surface, a sample container port at an outer edge, and a sample passageway communicating with the sample receiving port and the sample container port. The sample vessel port and passageway are configured to receive a sample vessel and secure it to a disc; 액체샘플을 샘플 수용 포트에 전달하고;Delivering a liquid sample to the sample receiving port; 모세관 샘플 용기를 샘플 용기 포트에 위치시키고;Placing the capillary sample vessel in the sample vessel port; 카루셀을 회전시켜 샘플을 보내고 샘플 용기에 전달하는 단계를 포함하는 액체 샘플을 모세관 샘플 용기에 첨가하는 방법.A method of adding a liquid sample to a capillary sample container comprising rotating the carousel to send the sample and deliver the sample to the sample container. 제 93 항에 있어서, 샘플용기를 샘플 용기 포트에 위치시키기 이전에 샘플용기에 예정된 혼합물을 첨가하는 단계를 더욱 포함하는 방법.95. The method of claim 93, further comprising adding a predetermined mixture to the sample vessel prior to placing the sample vessel in the sample vessel port. 제 93 항에 있어서, 액체 샘플을 샘플 수용 포트에 전달하기 이전에 예정된 혼합물을 샘플 통로에 위치시키는 단계를 더욱 포함하는 방법.94. The method of claim 93, further comprising placing the predetermined mixture in the sample passageway prior to delivering the liquid sample to the sample receiving port. 제 94 항 또는 95 항에 있어서, 예정된 혼합물이 액체샘플 분석용 시약을 포함함을 특징으로 하는 방법.98. The method of claim 94 or 95, wherein the predetermined mixture comprises a reagent for analyzing liquid samples. 샘플을 수용하고, 샘플용기를 유지하기 위해 카루셀을 선택하며,To accept the sample, select the carousel to hold the sample container, 상기 카루셀은 상부표면, 하부표면, 이들 사이에 연장되는 외부가장자리, 상부표면에 있는 상부 수용 포트, 외부 가장자리에 있는 샘플 용기 포트 및 상기 샘플 수용 포트와 샘플 용기 포트와 통하는 샘플 통로를 가지는 디스크를 포함하며 상기 샘플 용기 포트와 통로는 샘플 용기를 수용하여 디스크에 고정하도록 형성되며, 샘플 수용 포트를 통해 전달된 액체 샘플이 액체 샘플상에 편향력없이 샘플 용기 포트에 흐르는 것을 방지하는 장벽을 상기 통로가 포함하며;The carousel comprises a disk having an upper surface, a lower surface, an outer edge extending therebetween, an upper receiving port at an upper surface, a sample container port at an outer edge, and a sample passageway communicating with the sample receiving port and the sample container port. And the sample vessel port and passageway are configured to receive the sample vessel and secure it to the disc, and the passageway provides a barrier that prevents the liquid sample delivered through the sample receiving port from flowing through the sample vessel port without bias on the liquid sample. Includes; 액체샘플을 샘플 수용 포트에 전달하고;Delivering a liquid sample to the sample receiving port; 모세관 샘플 용기를 샘플 용기 포트에 위치시키고;Placing the capillary sample vessel in the sample vessel port; 카루셀을 회전시켜 샘플을 보내고 샘플 용기에 전달하는 단계를 포함하는 액체 샘플을 모세관 샘플 용기에 첨가하는 방법.A method of adding a liquid sample to a capillary sample container comprising rotating the carousel to send the sample and deliver the sample to the sample container. 제 97 항에 있어서, 상기 통로가 샘플 용기 포트, 샘플 수용포트 및 상기 상부표면에 형성된 적어도 하나의 추가 포트와 통하며, 카루셀이 회전되기 이전에 추가 포트를 통해 제 2 액체를 통로에 전달하는 추가단계를 포함하여서 카루셀이 회전되어 액체 샘플과 제 2 액체에 편향력을 제공할 때 이들이 모세관 용기에 전달 되는대로 혼합됨을 특징으로 하는 방법.98. The method of claim 97, wherein the passage is in communication with a sample vessel port, a sample receiving port and at least one additional port formed on the upper surface, the additional passage for delivering a second liquid through the additional port before the carousel is rotated. And when the carousel is rotated to provide deflection to the liquid sample and the second liquid, as they are delivered to the capillary vessel. 제 98 항에 있어서, 추가 포트를 통해 통로에 전달되는 상기 제 2 액체상에 편향력이 없으면 제 2 액체가 샘플용기 포트에 흐르는 것을 방지하는 추가 장벽을 상기 통로가 포함함을 특징으로 하는 방법.99. The method of claim 98, wherein said passageway comprises an additional barrier that prevents the second liquid from flowing into the sample vessel port if there is no deflection force on said second liquid delivered to said passageway through said additional port. 제 99 항에 있어서, 상기 추가장벽을 카루셀이 예정된 회전속도로 회전되어 제 1 샘플을 모세관 샘플 용기에 전달할 때 제 2 액체 샘플이 샘플 용기 포트로 흐르는 것을 방지하며, 제 2 액체를 모세관 용기로 전달하는 더 높은 제 2 회전속도로 카루셀을 회전시키는 추가단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.107. The method of claim 99, wherein the additional barrier prevents the second liquid sample from flowing into the sample vessel port when the carousel is rotated at a predetermined rotational rate to deliver the first sample to the capillary sample vessel, and the second liquid is transferred to the capillary vessel. Rotating the carousel at a higher second rotational speed. 제 97 항, 98 항, 99 항 또는 100 항에 있어서, 샘플 용기를 샘플 용기 포트에 위치시키기 이전에 샘플용기에 예정된 혼합물을 첨가하는 단계를 더욱 포함하는 방법.101. The method of claim 97, 98, 99 or 100, further comprising adding a predetermined mixture to the sample container prior to placing the sample container in the sample container port. 제 97 항, 98 항, 99 항 또는 100 항에 있어서, 카루셀을 회전시키기 위해 카루셀을 스테핑 모터에 연결하는 단계를 더욱 포함하는 방법.101. The method of claim 97, 98, 99, or 100, further comprising coupling the carousel to the stepping motor to rotate the carousel. 제 101 항에 있어서, 예정된 혼합물이 샘플 분석용 시약을 포함함을 특징으로 하는 방법.102. The method of claim 101, wherein the predetermined mixture comprises reagents for sample analysis. 타겟 핵산 서열의 인접지역 교합하는 한쌍의 올리고누클레오타이드 프로브를 포함하는 것으로, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되며 다른 하나는 형과 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되며, 도너 형광단 방출과 받게 형광단 흡수는 25% 미만으로 중첩되며 받게 형관단을 100,000M-1cm-1이상의 피크 흡광계수를 가지며 카겟 서열과 두 프로브의 교합시 도너 및 받게 형광단은 서로의 15누클레이타이드내에 있는 샘플에서 타겟 핵산 서열의 존재를 탐지하는 수단.A pair of oligonucleotide probes that occlusion of the target nucleic acid sequence, one of which is labeled with a fluorophore and the other is labeled with a donor fluorophore of type and energy transfer pair, and a donor fluorophore The emission and receiving fluorophore absorption overlaps less than 25% and the receiving end has a peak extinction coefficient of at least 100,000 M -1 cm -1 and the donor and receiving fluorophores are 15 nucleotides of each other when occupying the Carget sequence and the two probes. Means for detecting the presence of a target nucleic acid sequence in a sample within. 제 104 항에 있어서, 공명에너지 전달쌍이 도너로서 형광제를 포함함을 특징으로 하는 시스템.107. The system of claim 104, wherein the resonance energy transfer pair comprises a fluorescent agent as a donor. 제 105 항에 있어서, Cy5가 받게 형광단임을 특징으로 하는 시스템.107. The system of claim 105, wherein Cy5 is a fluorophore to receive. 제 104 항에 있어서, 프로브가 타겟 핵산서열에 교합될 때 도너 및 받게 형광단이 서로의 0-5누클레오타이드내에 있음을 특징으로 하는 시스템.107. The system of claim 104, wherein the donor and recipient fluorophores are within 0-5 nucleotides of each other when the probe is associated with the target nucleic acid sequence. 제 1 차원이 제 2 차원보다 적으며 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 1㎜미만이도록 제 1 및 제 2 차원을 가지는 부피를 한정하는 벽과 광학적으로 투명한 재료를 포함하는 샘플용기에 샘플을 넣고;The sample is placed in a sample vessel comprising a wall and an optically transparent material defining a volume having the first and second dimensions such that the first dimension is less than the second dimension and the ratio of the volume to the outer surface area of the vessel is less than 1 mm. ; 용기의 제 2 차원을 다른 벽에 평행한 축을 따라 평광을 탐지하는 단계를 포함하는 형광단을 포함하는 샘플에서 형광의 탐지 및 습득효율을 증가시키는 방법.A method for increasing the efficiency of detecting and acquiring fluorescence in a sample comprising a fluorophore comprising detecting flatness along an axis parallel to another wall of the second dimension of the vessel. 제 108 항에 있어서, 형광이 샘플의 형광단 활성화 조사에 의해 유도되며 용기의 제 2 차원을 따른 벽에 평행한 축을 따라 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 108, further comprising irradiating the sample along an axis that is induced by fluorophore activation irradiation of the sample and parallel to the wall along the second dimension of the vessel. 제 108 항에 있어서, 형광이 샘플의 형광단 활성화 조사에 의해 유도되며 형광 탐지축을 따라 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 108, wherein the fluorescence is induced by irradiation with fluorophore activation of the sample and further comprises irradiating the sample along the fluorescence detection axis. 제 108 항, 109 항 또는 110 항에 있어서, 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 0.5㎜미만임을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 108, 109 or 110, wherein the ratio of volume to external surface area of the container is less than 0.5 mm. 제 108 항, 109 항 또는 110 항에 있어서, 용기의 외부 표면적에 대한 부피의 비가 0.25㎜미만임을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 108, 109 or 110, wherein the ratio of volume to external surface area of the container is less than 0.25 mm. 제 108 항, 109 항 또는 110 항에 있어서, 용기가 모세관 튜브임을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 108, 109 or 110, wherein the vessel is a capillary tube. 제 108 항, 109 항 또는 110 항에 있어서, 용기가 가장자리가 밀봉된 두 개의 간격이 떨어진 플레이트 또는 쉬이트를 포함함을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 108, 109 or 110, wherein the container comprises two spaced apart plates or sheets with sealed edges. 제 108 항에 있어서, 형광이 가장 작은 표면적을 갖는 용기의 벽을 통해서 축을 따라 탐지됨을 특징으로 하는 방법.109. The method of claim 108, wherein fluorescence is detected along an axis through the wall of the vessel having the smallest surface area. 제 115 항에 있어서, 샘플이 형광 탐지축을 따라 조사됨을 특징으로 하는 방법.118. The method of claim 115, wherein the sample is irradiated along the fluorescence detection axis. 제 115 항에 있어서, 용기가 모세관튜브이고 형광이 모세관튜브의 하부를 통해 축을 따라 탐지됨을 특징으로 하는 방법.116. The method of claim 115, wherein the vessel is a capillary tube and fluorescence is detected along an axis through the bottom of the capillary tube.
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