KR20000013852A - 신규 미생물 및 이를 이용한 엘- 쓰레오닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물의 발효에 의한 L-쓰레오닌(threonine)을 제조함에 있어서, L-메치오닌(methionine), L-이소로이신(isoleucine)을 동시에 요구하는 에스케리차(Escherichia) 속의 균주를 이용하여 플로로피루베이트(fluoro pyruvate)에 감수성을 나타내며 디아미노석신산(diaminosuccinic acid)과 알파메칠세린(α-methylserine)에 내성을 갖는 변이주를 분리하여 글루코스 등의 당류를 탄소원으로 호기적 배양에의한 고농도의 L-쓰레오닌을 발효액내에 축적시키는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 미생물 및 이를 이용한 엘-쓰레오닌의 제조방법

L-쓰레오닌(threonine)은 필수 아미노산(amino acid)의 일종으로서 쌀의 제 2 제한 아미노산이다. 지금까지 알려진 바로는 아미노산 수액제제, 종합아미노산제제의 의약용도와 식품의 영양강화제나 건강음료 등의 용도로 사용되고 있다. 최근에는 L-라이신과 함께 사료에 첨가되므로 그 수요가 급증하고 있는 아미노산 중의 하나이다. 발효법에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법은 상당수 공지되었는데 대표적으로는 세라티아속(Serratia sp) L-쓰레오닌 생산균으로부터 아스파르토 키나제(asparto kinase), 호모세린 키나제(homoserine kinase), 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dihydrogenase), 쓰레오닌 신타제(threonine synthase)의 유전정보를 함유한 DNA절편을 재조합하여 다량의 쓰레오닌을 생산하는 방법인 일본특허공보 평5-10076호와 프로비 덴시아(Providencia sp)속에 속하고 메치오닌(methionine) 대사길항 물질에 내성을 가지는 균주를 이용해 유전자를 재조합하여 DNA를 삽입시켜 생산성을 증가시킨 방법(일본특허공보 평1-289493호)이 있다. 또한 에스케리차(Escherichia)를 이용하여 쓰레오닌 대사길항 물질에 내성을 가지고 생육중 메치오닌이나 디아미노피멜릭산(Diaminopimelic acid)의 요구성을 가지는 균주를 이용하는 방법(일본특허공보 소56-10037호), L-세린(serine)과 에사이오닌(ethionine)에 내성을 가지는 균주를 이용하는 방법(유럽특허 91103569.9호)이 알려져 있다.

L-쓰레오닌을 생산하는 통상의 에스케리차 속 미생물의 배양시 배양중 통기교반의 한계에 의해 발효액내에 용존산소 농도가 저하되고 용존산소 농도의 고갈로 혐기성 발효가 진행되어 유기산중 아세트산이 축적되며 L-쓰레오닌의 생산성이 저하되어, 본 발명은 친주인 에스케리차 속 균주 DSM 454의 기본특성을 변화시켜 배양상 물리적 인자의 문제를 해결함과 동시에 L-쓰레오닌의 생산성을 향상시키는데 그 목적이 있다.

본 발명의 신균주가 친주에 비하여 현저하게 L-쓰레오닌을 배양액내에 축적시키는 원인에 대하여 확실하게 밝혀지지는 않았으나 L-쓰레오닌의 유사물질인 알파메칠세린의 내성에 의해 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 L-쓰레오닌의 저해나 억제 등이 해제되었고, 플로로피루베이트 감수성부여에 의해 일반적인 미생물이 생육을 위해 생합성 하고 있는 구연산회로를 친주보다 적게 회전하고 있어 생육에 필요한 산소의 양이 적게 필요하게 되며 회전량의 감소로 포스포에놀피루베이트카르복실레이즈에 의해 L-쓰레오닌 전구물질 공급이 충분하게 되는 것으로 판단되어진다. 또한 디아미노석신산 내성에 의해 L-쓰레오닌 생합성 관련효소들의 저해나 억제 등의 간섭이 해제되어 배양액에 L-쓰레오닌이 다량축적되는 것으로 판단된다.

본 발명자들은 L-쓰레오닌을 생산하는 에스케리차 속의 미생물 DSM 454 균주발효시 발효중 통기교반의 한계에 의해 발효액내 용존산소 농도가 저하되고 용존산소 농도의 고갈로 혐기성 발효가 진행되어 아세트산이 축적되고 L-쓰레오닌의 생산성이 저하되는 문제를 해결하기 위하여 연구를 하던중 플로로피루베이트(fluoro pyruvate)에 감수성을 나타내며 디아미노석신산(diaminosuccinic acid) 과 알파메칠세린(α-methylserine)에 내성을 나타내는 균주가 통기교반이 저하된 상태에서도 배양액내에 다량의 L-쓰레오닌을 축적하게 된다는 사실을 발견하였다.

본 발명의 균주는 통상적인 변이처리 방법으로서 자외선 조사나 화학변이 유기제인 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘), DES(디에틸설페이트)로 L- 메치오닌, L-이소로이신을 동시에 요구하는 공시균주 에스케리차 콜리 ATCC21272를 변이처리하여 얻은 콜로니(colony)를 알파메칠세린 40mM 이 첨가된 것과 첨가되지 않은 최소 한천 평판 배지에 레플리카하여 37℃에서 2-3일간 배양한후 알파메칠세린이 첨가된 평판 배지상에서 생육하는 콜로니들을 분리하고 최소 액체 배지로 친주와 비교하여 균주의 특성변화를 확인하여 알파메칠세린에 내성을 갖는 DSM454균주를 분리하였다. 또한 DSM454균주를 재 변이처리하여 플로로피루베이트가 40mM 첨가된 최소 한천 평판배지와 플로로피루베이트가 첨가되지 않는 최소한천 평판배지에 레플리카하여 37℃에서 2-3일간 배양하였다. 그리고 플로로피루베이트가 첨가된 평판 배지상에서 생육하지 못하나 플로로피루베이트가 첨가되지 않은 평판 배지상에서 생육하는 콜로니들을 분리하여 최소 액체배지로 친주 DSM454 균주와 비교하여 균주의 특성변학를 확인한 후 선별된 균주를 상기와 같은 방법으로 재 변이처리하여 디아미노석신산이 2.5g/L 첨가된 평판 배지상에서 생육하는 콜로니들을 분리하였다. 이들을 친주 DSM454 균주와 비교하여 균주의 특성변화를 확인하고 플로로피루베이트 감수성 및 디아미노석신산 내성의 특성이 명확한 신균주DSM9806(KCCM 10133)을 분리하였다. 이들 변이주의 선별을 위한 완전 액체배지조성은 효모엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 육즙 0.3%, 염화나트륨 0.5%, 포도당 0.5%, pH7.0이며, 완전 한천 평판배지는 완전 액체 배지조성에 한천을 2% 첨가한 것을 사용하였다. 또한 알파메칠세린(α-methylserine) 내성을 확인하기 위하여는 40mM, 플로로피루베이트 감수성을 확인하기 위하여는 40mM, 디아미노석신산 내성을 확인하기위하여는 2.5g/L를 첨가하였다. 친주의 특성변화 확인을 위한 최소 한천 평판배지조성은 과당(fructose) 5.0%, 유안 1.4%, 제1인산칼륨 0.2%, 황산 마그네슘 0.1%, 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid) 100mg/L, 한천 2%, pH 7.3 이며, 영양요구성을 확인하기 위해서는 L-메치오닌 200mg/L 과 L-이소로이신 200mg/L을 각각 첨가하였다.

이와 같은 방법으로 분리하여 명명한 신균주 DSM9806 (KCCM 10133) 은 표1.의 특성비교에 나타난 바처럼 공시균주 ATCC 21272 와 같이 L-메치오닌과 L-이소로이신의 요구성을 갖고 있으며 친주 DSM454와 같이 알파메칠세린(α-methylserine)에 내성을 가지며, 플로로피루베이트에 감수성과 디아미노석신산에 내성을 가진 변이주임을 확인할 수 있었다.

표 1. 신균주 DSM9806(KCCM 10133) 의 특성비교

주(1) : 최소 한천평판 배지에서 각각의 첨가물질을 첨가한 상태에서 24시간 배양한 균주의 생육정도(- : 생육안함, + : 생육함, ++ : 생육잘함, +++ : 생육잘함)

이와 같은 성질을 가지는 신균주 DSM9806(KCCM 10133) 와 변이처리전의 친주 DSM454를 생산배지(실시예 1참조)에서 72시간 진탕배양한 배양 종료액을 50배 희석하여 610nm에서 흡광도 (베크만 DU-70)를 측정한 결과 신균주 DSM9806(KCCM 10133)는 0.603, 친주인 DSM454 균주는 0.907이었으며 L-쓰레오닌의 축적농도는 신균주 DSM9806 (KCCM 10133)은 16.32mg/ml, 친주인 DSM454는 12.35mg/ml으로 신균주 DSM9806 (KCCM 10133)이 낮은 생육도에서도 친주보다 생산성이 증가한 결과를 보였다.

본 발명의 신균주가 에스케리차 속 DSM9806 (KCCM 1013) 균주가 친주 DSM 454에 비하여 현저하게 L-쓰레오닌을 발효액내에 축적시키는 원인에 대하여 확실하게 밝혀지지는 않았으나 L-쓰레오닌의 유사물질인 알파메칠세린의 내성에 의해 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 L-쓰레오닌의 저해나 억제 등이 해제되었고, 플로로피루베이트 감수성부여에 의해 일반적인 미생물이 생육을 위해 생합성하고 있는 구연산회로를 친주보다 적게 회전하고 있어 생육에 필요한 산소의 양이 적게 필요하게 되며 회전량의 감소로 포스포에놀피루베이트카르복실레이즈에 의해 L-쓰레오닌 전구물질 공급이 충분하게 되는 것으로 판단되어 진다. 또한 디아미노석신산 내성에 의해 L-쓰레오닌 생합성 관련효소들의 저해나 억제 등의 간섭이 해제되어 발효액에 L-쓰레오닌이 다량축적되는 것으로 생각되어 진다. L-쓰레오닌 발효의 발효조건은 탄소원으로써 슈크로스, 포도당, 원당 분해액등이 사용가능하며 질소원으로서는 암모니아가스, 암모니아수, 요소, 유안, 염화암모늄, 인산암모늄 등을 이용할 수 있다. 그의 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지이면 또한 이용이 가능하다.

본 발명의 신균주를 발효조에서 배양함에 있어서 발효관리 조건은 다음과 같다. 발효온도는 30℃ 내외에서 통기량은 0.8∼1.5vvm, 교반기 회전수는 500-700rpm으로 3-4일간 배양한다. 발효중 pH 는 6.5-7.0로 암모니아수 또는 액화 암모니아를 이용 자동조절한다. 발효 종료후 배양액내에 축적된 L-쓰레오닌은 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리하여 L-쓰레오닌 조결정을 얻는다.

다음의 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 것으로 이들 실시예가 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

＜ 실시예 1 ＞

* 사용균주 : 신균주 DSM9806(KCCM 0133), 친주 DSM454

* 전배양배지 조성 :

포도당 0.5%, 효모 엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, 염화나트륨0.5%, 육즙 0.3%, pH 7.0

* 생산배지 조성 :

포도당 10%, 옥수수침지액 3%, 제이인산칼륨 0.1%, 황산제일철 21mg/L, 황산 망간2mg/L, 유안 0.5%, L-메치오닌 200mg/L, L-이소로이신 200mg/L, 탄산칼슘 5%(별도 멸균 첨가), pH 7.0

* 전배양 방법 :

18Φ × 185mm의 시험관에 각각 5㎖의 전배양 배지를 분주한 후 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후에 신균주 DSM9806(KCCM 10133), 친주 DSM454를 각각 일백금니씩 접종하여 30℃에서 20시간, 분당 120회 왕복 진탕 배양한 것을 전배양액으로 하였다.

* 생산배양 방법 :

500ml 사카구찌 플라스크에 각각 70ml 정도의 쓰레오닌 생산균주를 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한다. 냉각후 신균주 DSM9806(KCCM 10133), 친주 DSM454의 전배양액을 1%접종하여, 30℃에서 72시간, 분당 120회 왕복 진탕배양한다. 발효종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 신균주 DSM 9806 (KCCM 10133)은 16.32mg/㎖, 친주 DSM 454는 12.35mg/㎖이었다.

＜ 실시예 2 ＞

* 사용균주 : 신균주 DSM 9806 (KCCM 10133), 친주 DSM 454

* 1차 전배양 배지조성 : 실시예1의 전배양 배지와 동일

* 2차 전배양 배지조성 :

글루코스 2%, 옥수수침지액 3%, 제이인산칼륨 0.1%, 황산제일철 2㎖/L, 황산 망간 2㎖/L, 유안 0.05%, 요소 0.6%, L- 메치오닌200㎎/L, L-이소로이신 200㎎/L pH7.0

* 생산배지 조성:

포도당 10%, 옥수수 침지액 3%, 제이인산 칼륨 0.1%, 황산제일철 2㎖/L, 황산 망간 2㎖/L, 유안 0.5%, L-메치오닌 200mg/L, L-이소로이신 200mg/L, pH7.0

* 전 배양 방법:

실시예 1과 동등한 방법으로 DSM9806(KCCM 10133), 친주 DSM454가 각각 배양된 1차 전배양액을 50㎖의 2차 전배양 배지가 121℃에서 15분간 멸균되어 냉각된 50㎖ 사카구찌 플라스크에 각각 1%씩 접종한다. 접종후 30℃에서 24시간 분당 120회 왕복 진탕배양한 것을 2차 전배양액으로 한다.

* 생산 배양 방법:

생산배지를 5L 소형 발효조에 2L사입하고 121℃에서 15분간 가압살균한다. 냉각후 신균주 DSM 9806 (KCCM 10133), 친주 DSM 454 의 종배양액을 각각 2% 접종하고, 교반 7000rpm, 통기 0.8-1.5VVM의 조건으로 30℃에서 72시간 배양한다. 이때 추가당은 당농도가 1-3%를 유지할 수 있도록 추가하고, pH조절은 암모니아수로서 6.5-7.0로 유지시킨다.

발효종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 신균주 DSM9806(KCCM 10133)은 80.6mg/ml , 친주 DSM 454는 42.6mg/ml이었다. 발효 종료액 1L를 원심분리법으로 균체를 제거한후 이온교환수지에 흡착, 분리, 정제한 L-쓰레오닌의 결정은 신균주 DSM9806(KCCM 10133) 68.51mg/ml, 친주 DSM 454는 36.21mg/ml이었다.

＜ 실시예 3 ＞

실시예 2와 동일한 배지조건과 전배양 조건으로 신균주 DSM9806 (KCCM -10133), 친주 DSM 454를 접종하여 실시예 2항의 생산방법중 교반속도만 500RPM으로 하향조절하여 배양한다. 발효종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 신균주 DSM9806 (KCCM 10133)은 75.41mg/ml, DSM 454는 37.4mg/ml이었다. 발효 종료액 1L를 원심분리법으로 균체를 제거한 후 이온교환주지에 흡착, 분리, 정제한 L-쓰레오닌의 결정은 신균주 DSM9806 (KCCM 10133) 64.10㎎/ml, 친주DSM 454는 31.79mg/ml이었다.

＜ 비교예 1 ＞

실시예 1과 동일한 조건으로 친주 DSM 454, 공시균주 ATCC21272를 접종하여 실시예 1항과 전배양 배지와 생산배지중 공시균주 ATCC21272의 경우는 글루코스를 슈크로스로 대체하여 실시예 1의 배양방법으로 배양하였다.

발효종료후 배양액내의 L-쓰레오닌의 축적량은 친주 DSM454는 12.67mg/ml, 공시균주 ATCC 21272는 4.02mg/ml이었다.

본 발명의 신균주는 쓰레오닌의 생합성경로가 특이적으로 변형되어 통상의 에스케리차 콜리 균주배양시 배양중 통기교반의 한계에 의해 배양액내 용존산소 농도가 저하되고 용존산소 농도의 고갈로 혐기성 발효가 진행되어 아세트산이 축적되고 L-쓰레오닌의 생산성이 저하되던 기존의 문제를 해결하여 통기교반이 저하된 상태에서도 배양액내에 다량의 L-쓰레오닌을 축적할 수 있는 기술을 개발하였다. 또한 균체 증식으로 인한 통기교반의 문제점인 미생물 배양시 배지조성의 양으로 제어하는 일반적인 방법과는 달리 미생물의 기본특성을 변화시켜 배양상 물리적 인자를 해결한데 그 의의가 크다고 하겠다.

Claims (3)

1. L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 신규 미생물 에스케리차 콜리 DSM 9806 (KCCM-10133, 98.7.16 한국종균협회 기탁).
2. L-쓰레오닌의 생산에 있어서 L-메치오닌, L-이소로이신을 동시에 요구하는 에스케리챠속 미생물에 알파메칠세린의 내성, 플로로피루베이트 감수성과 디아미노석신산에 대한 내성을 부여하여 L-쓰레오닌을 제조함을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.
3. 제 2항에 있어서, L-메치오닌, L-이소로이신을 동시에 요구하고 알파메칠세린의 내성, 플로로피루베이트 감수성, 디아미노석신산 내성을 부여한 에스케리차 콜리DSM 9806 (KCCM-10133, 98.7.16 한국종균협회 기탁)균주를 이용하여 L-쓰레오닌을 제조함을 특징으로 하는 발효에 의한 L-쓰레오닌의 제조방법.