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KR102728630B1 - 게놈-규모 t 세포 활성 어레이 및 그의 사용 방법 - Google Patents

게놈-규모 t 세포 활성 어레이 및 그의 사용 방법 Download PDF

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KR102728630B1
KR102728630B1 KR1020187013118A KR20187013118A KR102728630B1 KR 102728630 B1 KR102728630 B1 KR 102728630B1 KR 1020187013118 A KR1020187013118 A KR 1020187013118A KR 20187013118 A KR20187013118 A KR 20187013118A KR 102728630 B1 KR102728630 B1 KR 102728630B1
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예일 유니버시티
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Abstract

본 발명은 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA), 뿐만 아니라 이들 어레이를 제조하는 방법 및 면역 조정제를 확인하기 위해 이들을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

게놈-규모 T 세포 활성 어레이 및 그의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2015년 10월 14일자로 출원된, 미국 가특허 출원 번호 62/241,466에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
공동-신호전달 표면 수용체-리간드 경로는 T 세포 생물학적 네트워크를 엄격히 조절하는 T 세포 활성화 및 억제에 필수적이다. 지난 수십년 동안, 이 분야는 공동-신호전달 분자 및 경로를 표적화하고 자가면역 질환 및 다양한 암을 포함한 많은 질환을 퇴치하는 면역조정 요법 접근법의 개발을 목격하여 왔다. PD-1/B7-H1 (PD-L1) 경로를 표적화하는 항체의 임상 시험의 최근 성공 및 FDA 규제 승인은, 광범위한 진행성 인간 암에서 최소 유해 효과를 갖는 전례가 없는 임상 반응을 제공한 바 있다 (Brahmer, JR et al., N Engl J Med 366(26): 2455-2465, 2012; Topalian, SL et al., N Engl J Med 366(26): 2443-2454, 2012). 이러한 유형의 치료는 효능, 독성, 및 지속성의 관점에서 다른 요법보다 우월하고 암 치료에 대한 종양-부위 T 세포 면역 조정 전략의 이익을 나타낸다 (Sznol M and Chen L, Clin Cancer Res 19(5): 1021-1034, 2013). 그러나, 흥미로운 반응에도 불구하고, 암 환자의 대부분은 항-PD-1 요법에 반응하지 않는다. 따라서, PD-1/B7-H1 경로 이외에도 어떤 다른 요인이 1차 및 획득된 면역 저항성에 수반되는지 (Sznol M and Chen L, Clin Cancer Res 19(5): 1021-1034, 2013) 및 어떤 추가적인 메카니즘이 면역-회피를 담당하는지를 결정할 강력한 필요가 있다. 어떻게 인간 세포 표면 분자가 T 세포 반응을 조절하는지에 대한 포괄적인 이해는 신규 면역 조정제를 확인하는 것을 보조할 것이고 새로운 면역요법제의 개발에 대한 중요한 방향을 나타낸다.
막 단백질은 세포의 기능화에서 중대한 역할을 한다. 소통은 가장 중요한 역할 중 하나이며, 여기서 세포 표면 단백질은 수용체로서 작용하고 세포 사이의 신호를 전달 또는 내부 및 외부 환경 사이의 상호작용을 매개할 수 있다. 세포가 정보를 모으고 신호를 전하는 방식으로 작용하는 것 이외에, 막 단백질은 또한 수송체로서 기능할 수 있고 세포 막을 가로질러 물질의 교환을 제어하는 것과 연관된다. 막 단백질은 보다 접근가능하기 때문에 치료제에 대한 표적으로서 특정한 관심대상이다. 그러나, 대부분의 인간 막 단백질의 면역 기능에 관하여 알려진 것은 거의 없고, 게놈 수준에서 T 세포 활성을 검정하는 널리 확립된 시스템은 전혀 없다. 따라서, 성공률을 확장하고 항-종양 및 자가면역 면역요법의 완전한 이점을 취하기 위해 약물 잠재력을 갖는 신규 면역-조절 막 단백질을 확인할 수 있는 조성물 및 방법에 대해 진행중이고 충족되지 않은 필요가 존재한다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, T 세포 생물학적 네트워크를 조절하는데 수반되는 인간 막 단백질의 확인을 가능하게 하는 신규 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA: genome-scale T cell activity array)의 개발을 기반으로 한다. GS-TCAA는 새로운 세포-기반 형광 리포터 시스템을 사용한 모든 인간 막 유전자의 90% 초과에서의 상이한 T 세포 활성 예컨대 증식, 억제, 및 소진의 연구를 가능하게 한다. 이 접근법은 어떻게 인간 세포-표면 분자가 T 세포 반응을 조절하고 신규 면역 조정제의 확인을 보조하는지에 대한 포괄적 이해를 제공한다. GS-TCAA를 사용하면, 자가면역 질환 및 암에 존재하는 알려지지 않은 공동-신호전달 분자 및 경로를 확인함으로써 치료가 표적화되고, 확인되고, 개발될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 포함하는 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 포함하며, 여기서 각각의 복수의 웰은 막 연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 제1 세포로서, 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 단백질의 제1 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 복수의 인간 막 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 형질감염되어 있는 제1 세포; 세포 표면 상의 수용체 및 리포터 유전자를 발현하는 제2 세포를 포함하며; 여기서 수용체 및 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 사이의 상호작용은 1차 신호를 제공하고 제2 세포주의 활성을 자극하고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 고체 지지체 구조는 다중-웰 플레이트이다. 다른 실시양태에서, 다중-웰 플레이트는 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 및 1536-웰 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 세포는 인간 293T 세포이다. 다른 실시양태에서, 제1 세포는 면역-관련 어댑터를 발현하는 인간 293T.2A 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역-관련 어댑터는 DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD3E로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 세포는 면역 세포이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 Jurkat 세포, 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 소진된 T 세포, 무반응성 T 세포 및 조절 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 세포독성 관련 리포터 구축물, 아폽토시스 관련 리포터 구축물 및 증식 관련 리포터 구축물로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 구축물에 함유된다. 다른 실시양태에서, 세포독성 관련 리포터 구축물은 형광-기반 리포터 구축물이다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 관련 리포터 구축물은 형광-기반 리포터 구축물이다. 일부 실시양태에서, 형광-기반 리포터 구축물은 T 세포 관련 전사 반응성 요소에 이어서 최소 CMV 프로모터 및 GFP 리포터 유전자를 함유한다. 다른 실시양태에서, T 세포 관련 전사 반응 요소는 NF-kb, NF-AT, AP-1, EGR2, MAPK 및 PI3K로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증식 관련 리포터 구축물 내의 리포터 유전자는 시토카인 유전자이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IFN-감마, TNF-알파 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 수용체 유전자, 이뮤노글로불린 유전자, 수송체 유전자 및 신호전달 유전자로부터 선택된 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 약 1,000 - 7,000개의 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 약 2,000 - 5,000개의 유전자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 약 4,000 - 7,000개의 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포의 활성은 세포 증식, 세포 억제, 세포 소진, 세포 아폽토시스, 및 세포로부터의 시토카인 방출로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제조하는 방법을 포함하며, 방법은 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 제공하는 것; 막 연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 제1 세포를 각각의 복수의 웰 내로 배양하는 것; 제1 세포를, 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 단백질의 제1 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 복수의 인간 막 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 형질감염시키는 것; 및 세포 표면 상의 수용체 및 리포터 유전자를 발현하는 제2 세포를 각각의 복수의 웰 내로 공동-배양하여, 그에 의해 게놈-규모 T 세포 활성 어레이를 제조하는 것을 포함하며, 여기서 수용체 및 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 사이의 상호작용은 1차 신호를 제공하고 제2 세포주의 활성을 자극하고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 고체 지지체 구조는 다중-웰 플레이트이다. 일부 실시양태에서, 다중-웰 플레이트는 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 및 1536-웰 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 세포는 인간 293T 세포이다. 다른 실시양태에서, 제1 세포는 면역-관련 어댑터를 발현하는 인간 293T.2A 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역-관련 어댑터는 DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD3E로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 세포는 면역 세포이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 Jurkat 세포, 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 소진된 T 세포, 무반응성 T 세포 및 조절 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 세포독성 관련 리포터 구축물, 아폽토시스 관련 리포터 구축물 및 증식 관련 리포터 구축물로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 구축물에 함유된다. 다른 실시양태에서, 세포독성 관련 리포터 구축물은 형광-기반 리포터 구축물이다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 관련 리포터 구축물은 형광-기반 리포터 구축물이다. 일부 실시양태에서, 형광-기반 리포터 구축물은 T 세포 관련 전사 반응성 요소에 이어서 최소 CMV 프로모터 및 GFP 리포터 유전자를 함유한다. 다른 실시양태에서, T 세포 관련 전사 반응 요소는 NF-kb, NF-AT, AP-1, EGR2, MAPK 및 PI3K로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증식 관련 리포터 구축물 내의 리포터 유전자는 시토카인 유전자이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IFN-감마, TNF-알파 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 수용체 유전자, 이뮤노글로불린 유전자, 수송체 유전자 및 신호전달 유전자로부터 선택된 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 약 1,000 - 7,000개의 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 약 2,000 - 5,000개의 유전자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 약 4,000 - 7,000개의 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포의 활성은 세포 증식, 세포 억제, 세포 소진, 세포 아폽토시스, 및 세포로부터의 시토카인 방출로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 측면은 면역 조정제를 확인하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제공하는 것; 제1 세포에서의 복수의 인간 막 유전자 중 하나의 발현을 가능하게 하는 것; 제1 세포 및 제2 세포를 공동-배양하는 것; 제2 세포에서의 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하는 것; 및 리포터 유전자의 발현 수준을 대조군 제2 세포에서의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하며, 여기서 대조군 제2 세포는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 형질감염되어 있지 않은 대조군 제1 세포와 공동-배양되는 것을 포함하며, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 억제한다는 것을 나타내며, 그에 의해 면역 조정제를 확인한다.
일부 실시양태에서, 면역 조정제는 FOLH1, FAS, IL3RA, CD248, THBD, B7.1, GJB1, OX40L, 4-1BBL 및 B7.2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 면역 조정제는 FLT1, CXCR6, SEMA6a, RHCE, FCRLA, TNFRSF19, SEC22b, B3GNT1, NFAM1, LY6 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제는 FLT1, SEMA6a, SEC22b 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 자동화된다. 다른 실시양태에서, 방법은 로봇공학을 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 로봇 액체 취급 기술을 사용하여 수행된다. 다른 실시양태에서, 방법은 자동화된 플레이트 취급 시스템을 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 기능적 검정, 생체내 검정, 수용체 어레이 검정, 생물정보학 검정, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 검정을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 시험관내 기능적 검정은 복수의 인간 막 유전자 중 하나 및 막-연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 제2 세포를 1차 T 세포와 함께 배양하는 것; 및 증식 검정, 아폽토시스 검정 및 시토카인 방출 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된 시험관내 기능적 검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 T 세포는 인간 1차 CD8 세포 및/또는 인간 1차 CD4 세포이다.
일부 실시양태에서, 수용체 어레이 검정은 면역 조정제의 상호작용 단백질을 확인하기 위해 수행된다. 다른 실시양태에서, 수용체 어레이는 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 포함하며, 여기서 각각의 복수의 웰은 복수의 수용체 유전자 중 하나에 의해 코딩된 수용체의 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 복수의 수용체 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 형질감염되어 있는 세포; 태그와 융합된 면역 조정제를 포함하는 재조합 단백질; 태그에 특이적인 형광 표지화된 항체를 포함하며; 여기서 검출가능한 형광 신호는 면역 조정제가 수용체와 상호작용한다는 지표이다.
일부 실시양태에서, 태그는 마우스 IgG2a Fc 태그, 인간 IgG1 Fc 태그, FLAG 태그 및 6xHis 태그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제는 면역 조정제의 전장 단백질이다. 다른 실시양태에서, 면역 조정제는 면역 조정제의 세포외 도메인이다.
일부 실시양태에서, 생체내 검정은 면역 조정제를 자가면역 질환 또는 암에 대한 동물 모델에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 인간 흑색종 세포 및 종양-반응성 T 세포가 주사된 NOD-scid IL2R감마널 마우스 모델이다. 다른 실시양태에서, 동물 모델은 인간화 마우스 모델이다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 마우스 모델은 면역-환자-유래 이종이식편 (면역-PDX) 모델이다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 확인된 면역 조정제의 유효량을 대상체에게 투여하여, 그에 의해 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 것을 포함하는, 자가면역 질환 또는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 면역 조정제는 FOLH1, FAS, IL3RA, CD248, THBD, B7.1, GJB1, OX40L, 4-1BBL 및 B7.2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 면역 조정제는 FLT1, CXCR6, SEMA6a, RHCE, FCRLA, TNFRSF19, SEC22b, B3GNT1, NFAM1, LY6 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 확인된 면역 조정제의 조절제의 유효량을 대상체에게 투여하여, 그에 의해 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 것을 포함하는, 자가면역 질환 또는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 방법을 특색으로 한다.
일부 실시양태에서, 면역 조정제는 FOLH1, FAS, IL3RA, CD248, THBD, B7.1, GJB1, OX40L, 4-1BBL 및 B7.2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 면역 조정제는 FLT1, CXCR6, SEMA6a, RHCE, FCRLA, TNFRSF19, SEC22b, B3GNT1, NFAM1, LY6 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제의 조절제는 면역 조절제의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 증가시킨다. 다른 실시양태에서, 면역 조정제의 조절제는 면역 조절제의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킨다.
본 발명은 하기 도면 및 상세한 설명에 의해 예시되며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
도 1A는 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)에 대한 기본 원리를 그래픽으로 도시한다. 간략하게, 막 연관 항-인간 CD3 항체 ScFv를 안정하게 발현하는 293T.2A 세포 (293T.2A/m.항-CD3)는 Jurkat/리포터 세포에서의 T 세포 활성화를 자극하고 검출가능한 GFP 신호를 생성한다. cDNA 라이브러리로부터의 개별 막 유전자의 형질감염은 잠재적으로 T 세포 활성의 결과에 영향을 미친다. 분자가 효과적이지 않으면, GFP 신호는 유사하게 남아있을 것이다. 분자가 자극성이면, 더 강한 GFP 신호가 검출될 것이다. 분자가 억제성이면, 더 약한 GFP 신호가 관찰될 것이다. 도 1B는 CD5L 유전자의 신호 펩티드 서열을 함유하고 항-CD3 ScFv 및 막 부착 서열에 의해 플랭킹되어 있는 막 연관 항-인간 CD3 항체 ScFv 구축물을 그래픽으로 도시한다. 도 1C는 T 세포 관련 전사 인자 반응 요소 (TFRE)에 이어서 최소 CMV 프로모터 및 GFP 리포터 유전자를 함유하는 GFP 리포터 구축물을 그래픽으로 도시한다.
도 2A는 T 세포 활성에 대해 자극성인 막 유전자를 검출하기 위해 m.항-CD3 구축물로 형질감염된 293T.2A 세포 및 GFP 리포터를 발현하는 Jurkat 세포를 사용하는 것의 효능을 도시한다. 간략하게, 293T.2A 세포는 모의 구축물 (ctr), 다른 T 세포 관련 막 유전자 (예를 들어, B7.2, B7-H1, B7-H3 및 B7-H4)의 존재 또는 부재 하의 m.항-CD3 플라스미드로 일시적 형질감염되었고 이어서 정제된 인간 T 세포 또는 PBMC와 공동-배양되었다. 티미딘 혼입에 의해 나타낸 T 세포 증식은 48시간 후에 제시되었다. 도 2B는 m.항-CD3 플라스미드 형질감염의 존재 또는 부재 하의 293T.2A 세포가 Jurkat/NF-Kb GFP 세포와 공동-배양되었을 때, GFP 신호가 공동-배양 12시간 후에 m.항-CD3의 존재 하의 세포에서만 검출된다는 것을 도시하는 영상이다. 데이터는 1536 영상화 플레이트에서 수득되었다.
도 3은 T 세포 활성에 대한 자극 또는 억제 기능 중 어느 하나를 갖는 것으로 GS-TCAA로부터 확인된 막 유전자를 도시하는 영상의 시리즈이다. 간략하게, 293T.2A 세포는 모의 구축물 (ctr), 다른 T 세포 관련 막 유전자의 존재 또는 부재 하의 m.항-CD3 플라스미드로 형질감염되었고 이어서 Jurkat/NF-Kb GFP 세포와 공동 배양되었다. GFP 신호는 공동-배양 12시간 후에 검출되었다. 데이터는 1536 영상화 플레이트에서 수득되었다.
도 4는 T 세포 활성에 대한 자극 또는 억제 기능 중 어느 하나를 갖는 것으로 GS-TCAA로부터 확인된 막 유전자를 도시한다. 간략하게, 293T.2A 세포는 모의 구축물 (ctr), 다른 T 세포 관련 막 유전자의 존재 또는 부재 하의 m.항-CD3 플라스미드로 형질감염되었고 이어서 Jurkat과 공동-배양되었다. IFN-γ 방출은 정량화되었다.
도 5는 GS-TCAA 히트의 대표적인 분석을 도시하는 그래프이다. T 세포 활성에 대한 자극 기능을 갖는 막 유전자로 형질감염된 세포는 대조군보다 더 높은 GFP 판독치를 갖고, T 세포 활성에 대한 억제 기능을 갖는 막 유전자로 형질감염된 세포는 더 낮은 GFP 판독치를 생성하였다.
도 6은 온코민 데이터베이스 (온코민(Oncomine), 써모 피셔(Thermo Fisher))의 분석을 통한 다양한 유형의 암에서의 FLT1의 차등 발현을 도시하는 그래프이다.
도 7은 온코민 데이터베이스 (온코민, 써모 피셔)의 분석을 통한 다양한 유형의 암에서의 SEMA6a의 차등 발현을 도시하는 그래프이다.
도 8은 온코민 데이터베이스 (온코민, 써모 피셔)의 분석을 통한 다양한 유형의 암에서의 SEC22b의 차등 발현을 도시하는 그래프이다.
도 9는 온코민 데이터베이스 (온코민, 써모 피셔)의 분석을 통한 다양한 유형의 암에서의 GP1BA의 차등 발현을 도시하는 그래프이다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 신규 면역 조정제, 예를 들어, T 세포를 조절하는 면역 조정제를 확인하는데 사용될 수 있는 신규 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)의 개발을 기반으로 한다. GS-TCAA는 새로운 세포-기반 형광 리포터 시스템을 사용한 모든 인간 막 유전자의 90% 초과에서의 상이한 T 세포 활성 예컨대 증식, 억제, 및 소진의 연구를 가능하게 한다. 이 접근법은 어떻게 인간 세포-표면 분자가 T 세포 반응을 조절하고 신규 면역 조정제의 확인을 보조하는지에 대한 포괄적 이해를 제공한다. GS-TCAA을 사용하면, 자가면역 질환 및 암에 존재하는 알려지지 않은 공동-신호전달 분자 및 경로를 확인함으로써 치료가 표적화되고, 확인되고, 개발될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 한 실시양태에서, 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA), 뿐만 아니라 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 사용하여 면역 조정제를 확인하는 것에 관한 방법을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 면역 조정제 및/또는 면역 조정제의 조절제를 대상체에게 투여함으로써 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 방법 및 조성물을 포함한다.
I. 정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 용어의 의미 및 범위는 명확하여야 하지만, 임의의 잠재적인 모호성의 사례에서, 본원에 제공된 정의는 임의의 사전 또는 외재성 정의보다 우선한다.
본 발명을 기재하는 맥락에서 (특히, 하기 청구범위의 맥락에서) 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에 달리 나타내지 않거나 또는 맥락에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 (즉, 하나 이상) 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함한" 및 "함유하는"은 달리 나타내지 않는 한, 개방형 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지는 않는"의 의미)로서 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은, 본원에 달리 나타내지 않는 한, 단지 상기 범위 내에 언급되거나 또는 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 작용하도록 의도되고, 각각의 별개의 값은 개별적으로 언급되는 것처럼 같이 본 명세서 내에 포함된다. 본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 10-40, 20-50, 5-35 등으로 이루어진 군으로부터의 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 기재된 바와 같이, 용어 "웰"은 일반적으로, 별개일 수 있거나 (예를 들어, 단리된 샘플을 제공하기 위함) 또는 하나 이상의 다른 한정된 구역과 소통 (예를 들어, 웰 내의 하나 이상의 샘플 사이의 유체 소통을 제공하기 위함) 할 수 있는, 용기 내의 한정된 구역을 지칭한다. 예를 들어, 기판 상에서 성장된 세포는 살아있는 세포를 위한 배양 배지를 또한 함유할 수 있는 웰 내에 정상적으로 함유된다. 기판은 임의의 적합한 물질, 예컨대 플라스틱, 유리 등을 포함할 수 있다. 플라스틱은 통상적으로 시험관내 세포의 유지 및/또는 성장을 위해 사용된다.
"다중-웰 플레이트"는 어레이에서 1개 초과의 웰을 포함하는 기판의 예이다. 본 발명에 유용한 다중-웰 플레이트는 임의의 다양한 표준 포맷 (예를 들어, 2, 4, 6, 24, 96, 384, 또는 1536개 등의 웰을 갖는 플레이트)의 것일 수 있지만, 또한 하기 추가의 세부사항에서 기재된 바와 같은 비-표준 포맷의 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 어레이 및 방법에 사용하기에 적합한 세포는 박테리아 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 어레이 및 방법에 사용하기에 적합한 세포는 진균 세포, 예컨대 효모 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 어레이 및 방법에 사용하기에 적합한 세포는 척추동물 세포, 예를 들어, 조류 또는 포유동물 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 어레이 및 방법에 사용하기에 적합한 세포는 포유동물 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 조혈 기원의 것이고 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 포함한다. 면역 세포는 선천성 면역계의 세포 및 적응성 면역계의 세포를 포함한다. 면역 세포는, 예를 들어, 림프구, 예컨대 B 세포 및 T 세포; 천연 킬러 세포; 및 골수 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구를 포함한다.
한 실시양태에서, 면역 세포는 선천성 면역계의 세포이다. "선천성 면역계"는 보다 특이적인 적응성 면역계가 특이적인 항체 및/또는 T 세포를 생산할 수 있을 때까지 작용제에 대한 신체의 반응을 제어하는 비특이적인 면역계이다 (Modlin et al., N. Engl. J. Med 1999, 340:1834-1835). 선천성 면역계는 일반적으로 식세포 (예를 들어, 호중구, 단핵구, 및 대식세포); 염증 매개체를 방출하는 세포 (예를 들어, 호염기구, 비만 세포, 및 호산구); 자연 킬러 세포 (NK 세포); 및 수지상 세포 (DC)를 수반한다. 대조적으로, "적응성" 또는 "획득된, 면역계"는 그의 반응에서 매우 특이적이다. 그것은 병원체로의 감염에 대한 적응으로서 개체의 수명 동안 발생하기 때문에 적응성 면역계라 불린다. 적응성 면역은 백신 (항원)에 반응하여 또는 항체를 투여함으로써 인위적으로 획득될 수 있거나, 또는 감염에 의해 자연적으로 획득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원 제시 세포"는 그들의 표면 상에서 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체화된 외래 항원을 디스플레이하는 세포를 지칭하며, 상기 세포는 그들의 T 세포 수용체를 사용하여 T 세포에 의해 인식된다. 항원 제시 세포는 MHC 분자를 구성적으로 발현하는 세포 (예를 들어, B 림프구, 단핵구, 수지상 세포, 및 랑게르한스 세포) 뿐만 아니라 MHC 분자를 구성적으로 발현하지 않는 다른 항원 제시 세포 (예를 들어, 각질세포, 내피 세포, 성상세포, 섬유모세포, 및 핍지교세포)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포" (즉, T 림프구)는 포유동물 (예를 들어, 인간)로부터의, 흉선세포, 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포 등을 포함한 T 세포 계열 내의 모든 세포를 포함하도록 의도된다. T 세포는 CD4 또는 CD8 중 어느 하나를 발현하지만 둘 다는 발현하지 않는 성숙 T 세포, 및 T 세포 수용체를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 T 세포 집단은 그들의 시토카인 프로파일 및 그들의 기능을 기반으로 하여 정의될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "나이브 T 세포"는 동족 항원에 노출되어 있지 않아 활성화되지 않은 T 세포, 또는 기억 세포를 포함한다. 나이브 T 세포는 순환하지 않고 인간 나이브 T 세포는 CD45RA+이다. 나이브 T 세포가 항원을 인식하고 비제한적으로 항원의 양, 투여 경로 및 투여 시기에 따라 추가적인 신호를 제공받는 경우에, 이들은 T 세포의 다양한 하위세트, 예를 들어, 이펙터 T 세포로 증식 및 분화할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 T 세포"는 항원을 제거하는 기능을 하는 (예를 들어, 다른 세포의 활성화를 조절하는 시토카인을 생산함으로써 또는 세포독성 활성에 의함) T 세포를 포함한다. 용어 "이펙터 T 세포"는 T 헬퍼 세포 (예를 들어, Th1 및 Th2 세포) 및 세포독성 T 세포를 포함한다. Th1 세포는 지연형 과민성 반응 및 대식세포 활성화를 매개하는 반면 Th2 세포는 B 세포에 도움을 제공하고 알레르기 반응에서 중대하다 (Mosmann and Coffman, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173; Paul and Seder, 1994, Cell 76, 241-251; Arthur and Mason, 1986, J. Exp. Med. 163, 774-786; Paliard et al., 1988, J. Immunol. 141, 849-855; Finkelman et al., 1988, J. Immunol. 141, 2335-2341).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 T 세포"는 IL-2, IL-4, IL-5, 및 IL-12의 낮은 수준을 생산하는 T 세포를 포함한다. 조절 T 세포는 이펙터 T 세포보다 더 낮은 수준일지라도, TNFα, TGFβ, IFN-γ, 및 IL-10을 생산한다. TGFβ가 조절 T 세포에 의해 생산된 우세한 시토카인일지라도, 시토카인은 Th1 또는 Th2 세포에서보다 더 낮은 수준, 예를 들어, Th1 또는 Th2 세포에서보다 한 자릿수 더 적게 생산된다. 조절 T 세포는 세포의 CD4+CD25+ 집단에서 발견될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Waldmann and Cobbold. 2001. Immunity. 14:399] 참조). 조절 T 세포는 활성적으로 활성화 신호 (예를 들어, 항원 및 항원 제시 세포 또는 MHC의 맥락에서 항원을 모방하는 신호, 예를 들어, 항-CD3 항체 플러스 항-CD28 항체)로 배양물에서 자극되어 있는 Th1, Th2, 또는 나이브 T 세포의 증식 및 시토카인 생산을 활성적으로 억제한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소진된 T 세포"는 T-세포 기능의 단계별 및 진행성 손실을 특징으로 하고 반응 세포의 물리적 결실을 형성할 수 있는 기능부전 T 세포를 지칭한다. 소진된 T 세포는 만성 감염 및 암 동안 발생할 수 있다. 예를 들어, 소진은 만성 림프구성 맥락수막염 바이러스 감염 동안 널리 정의되고 통상적으로 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 감염을 포함한 유의한 공중 보건 관심을 갖는 많은 만성 감염 후에, 뿐만 아니라 종양 생장 동안 발생하는, 항원-지속성의 조건 하에 발생한다 (예를 들어, 문헌 [John Wherry, Nature Immunology 12, 492-499, 2011] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "무반응성 T 세포"는 기능적으로 비활성화되고 심지어 항원이 완전 공동-자극의 존재 하에 직면하게 될 때에도 생산성 반응을 시작할 수 없는 T 세포를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Macian F. et al., Curr Opin Immunol. 2004, 16(2):209-16] 참조). T 세포 무반응은 림프구가 항원 직면 후에 본질적으로 기능적으로 비활성화되지만, 저반응성 상태에서 연장된 시간 기간 동안 살아있는 채로 남아있는 관용 메카니즘이다. CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다에 영향을 미치는 T 세포 무반응의 모델은 2개의 광범위한 카테고리에 속한다. 하나의 클로날 무반응은 주로 성장 정지 상태이지만, 다른 적응성 관용 또는 생체내 무반응은 증식 및 이펙터 기능의 보다 일반화된 억제를 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Schwartz RH. Annu Rev Immunol. 2003;21:305-34] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 조정제"는 GS-TCAA를 사용하여 확인된 면역계를 조절할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 어레이 및 방법에 의해 확인된 면역 조정제는 T 세포 활성을 조절하는 분자이다. 예를 들어, 면역 조정제는 T 세포 활성을 증가시킬 수 있거나 또는 T 세포 활성을 감소시킬 수 있다. 면역 조정제는 자가면역 질환 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 조정제의 조절제"는 상기 기재된 바와 같은 면역 조정제의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 면역 조정제의 조절제는 면역 조정제의 발현 및/또는 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 조정제의 조절제는 면역 조정제에서 직접적으로 작용하며, 예를 들어, 그것은 면역 조정제에 결합하고 그의 기능을 활성화 또는 억제하는 항체이다. 면역 조정제의 조절제는 또한 자가면역 질환 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
용어 "배양하는"은 다양한 종류의 배지 상에서의 또는 그 내에서의 세포 또는 유기체의 시험관내 번식을 지칭한다. 배양물에서 성장된 세포의 후손은 (즉, 형태학상으로, 유전적으로, 또는 표현형적으로) 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상호작용한다"는 분자 사이의 검출가능한 상호작용을 포함하는 것으로, 예컨대, 예를 들어, 형광 기반 검출 방법, 효모 2개의 하이브리드 검정, 염색질 면역침전, 또는 공동-면역침전을 사용하여 검출될 수 있는 것으로 의미된다. 용어 "상호작용한다"는 또한 분자 사이의 "결합" 상호작용을 포함하는 것으로 의미된다. 상호작용은 자연에서 단백질-단백질 또는 단백질-핵산일 수 있다.
용어 "형질감염"은, 핵산, 단백질 또는 다른 거대분자가 발현되거나 또는 세포에서 생물학적 기능을 갖도록, 핵산, 단백질 또는 다른 거대분자의 표적 세포 상에의 전달을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다.
용어 "형광"은 보다 짧은 파장을 갖는 광자의 분자 흡수에 의해 촉발된 광의 방출인 "형광" (또는 "광발광")을 나타낼 수 있는 임의의 물질 또는 작용제를 지칭한다. 따라서 형광은 형관단으로부터 유래되는 보다 긴 파장 형광 "방출"과 구별되는 "여기 광원"에 따른다. 형광 방출의 검출은 단지 방출 광에 대해서만 반응하고 여기 광에 대해서는 반응하지 않는 검출기를 요구한다.
II. 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)
한 측면에서, 본 발명은 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 특색으로 한다. 본 발명의 어레이는 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 포함하며, 여기서 각각의 복수의 웰은 제1 세포 및 제2 세포를 포함한다. 제1 세포는 막 연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하고, 또한 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 단백질의 제1 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 복수의 인간 막 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 형질감염되어 있다. 제2 세포는 제1 세포 상에서 제시된 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편과 상호작용하는 세포 표면 상의 수용체를 발현하고, 제2 세포의 활성을 자극하기 위해 1차 신호를 제공한다. 게다가, 제2 세포는 리포터 유전자를 발현하며, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 제1 세포 내로 형질감염되는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
본 발명에 사용된 고체 지지체 구조는 배양된 세포를 보유하고 그의 성장을 용이하게 하는데 적합한 임의의 지지체일 수 있다. 고체 지지체로서 사용되기에 적합한 물질은 플라스틱, 유리, 중합체, 금속 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 고체 지지체는 다중-웰 플레이트이다. 본 발명에 유용한 다중-웰 플레이트는 임의의 다양한 표준 포맷, 예를 들어, 4-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 및 1536-웰 플레이트 중 임의의 것일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 사용된 다중-웰 플레이트는 비-표준 포맷, 예를 들어, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 1500 또는 적어도 2000개의 웰을 갖는 플레이트일 수 있다.
본 발명의 어레이에 사용하기에 적합한 세포는 진핵 및 원핵 세포의 모든 유형을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 특히, 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 어레이에 사용된 세포는 유전적으로 조작된 세포, 예컨대 적어도 하나의 이종 핵산 서열로 형질전환되어 있는 세포이다. 이러한 핵산 분자는 T 세포 수용체, 또는 임의의 인간 막 단백질을 코딩할 수 있다. 유전적으로 조작된 세포는 하나 초과의 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열, 또는 분자는 DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA의 하이브리드 또는 유도체일 수 있다. 본 발명의 어레이에 사용하기 위한 핵산 분자는 핵산 분자의 발현을 제어하는 조절 영역 (예를 들어, 전사 또는 번역 제어 영역), 전장 또는 부분 코딩 영역, 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 분자의 임의의 부분은 하기에 의해 생산될 수 있는 것으로 이해되어야 한다: (1) 그의 천연 환경으로부터 분자를 단리하는 것; (2) 재조합 DNA 기술 (예를 들어, PCR 증폭, 클로닝)을 사용하는 것; 또는 (3) 화학적 합성 방법을 사용하는 것. 유전자는, 예를 들어, 해당 유전자에 의해 코딩된 세포 표면 수용체의 생산을 제어하는 조절 영역 (예컨대, 전사, 번역 또는 번역 후 조절 영역을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 뿐만 아니라 코딩 영역 자체와 같은 천연 세포 표면 수용체 유전자와 관련된 모든 핵산을 포함한다.
핵산 분자는 단백질을 코딩하는 천연 핵산 분자의 기능적 등가물 또는 단백질에 의해 결합될 수 있는 천연 핵산 서열의 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 천연 핵산 분자의 기능적 등가물은 뉴클레오티드가 이러한 서열에 의해 코딩된 생성물의 기능에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 이러한 분자 내에 삽입, 결실, 치환, 및/또는 도치되어 있는 천연 대립유전자 변이체 및 변형된 핵산 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 인간 막 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 리포터 유전자이다.
이종 핵산 분자 (예를 들어, 핵산 분자를 코딩하는 이종 세포 표면 수용체)의 본 발명의 어레이에 사용하기에 적합한 세포 내로의 형질전환은 유전자가 세포 내로 삽입될 수 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 형질전환 기술은 형질감염, 레트로바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션, 박테리아 전염 및 스페로플라스트 융합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 어레이에 사용하기에 적합한 세포 내로 형질전환된 핵산 분자는 염색체외 벡터 상에 남아있을 수 있거나 (일시적 형질감염) 또는 세포 게놈 내로 통합될 수 있다 (안정적 형질감염). 안정한 세포주를 생성하기 위해, 관심 유전자 및 적합한 바이러스 전사 프로모터는 성장 억제 화합물, 예컨대 항생제, 예를 들어, 네오마이신에 대한 저항성을 부여하는 선택가능한 마커를 함유하는 적합한 벡터 예컨대 플라스미드 또는 레트로바이러스 내로 삽입된다. DNA 구축물은 세포 내로 도입되고 숙주 세포주의 게놈 내로 안정하게 통합되어 조작된 세포가 저항성인 적절한 항생제의 존재 하에 선택적으로 배양될 수 있는 안정한 세포주를 제공한다. 대안적으로, 숙주 세포의 일시적 형질도입은 아데노바이러스 벡터를 사용하여 적합하게 수행될 수 있다. 벡터 DNA 분자는 숙주 염색질 내로 통합하지 않지만 세포 유형에 따라, 전형적으로 24-96시간의 수명을 갖는 염색체외 분자로서 존재한다.
세포에서의 본 발명의 핵산 분자의 발현은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 간략하게, 핵산 분자는 유전자가 숙주 세포 내로 형질전환될 때 유전자의 구성적 또는 조절된 발현에 영향을 미칠 수 있도록 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결되는 이러한 방식으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "재조합 분자"는 발현 벡터 상에서 적어도 하나의 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된 유전자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "발현 벡터"는 숙주 세포를 형질전환할 수 있고, 숙주 세포 내에서 복제할 수 있고, 작동가능하게 연결된 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 그들의 고유한 특징에 따라 높은 또는 낮은 카피 수로 복제할 수 있다. 생산된 단백질의 양을 제어할 수 있는 전사 제어 서열은 전사의 개시, 신장, 및 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 전사 개시를 제어하는 것들, 특히 프로모터 및 상류 활성화 서열이다.
발현 시스템은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법을 사용하여 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 임의의 알려진 제어 요소로부터 구축될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press]을 참조하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 이들 유전자가 발현되고 개별적으로 세포 표면 상에 디스플레이되게 하는 방식으로 제1 세포에 형질감염된다. 이를 달성하기 위해, 실시예 섹션에서 기재된 최적화된 역 형질감염 프로토콜이 사용될 수 있다. 대안적으로, 유전자의 발현 및 개별 디스플레이는 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, 리포펙션 및 CRISPR을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 알려진 유전자 전달 기술에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 고체 지지체 구조에서의 제1 세포는 인간 막 유전자의 형질감염 및 발현에 적합한 관련 기술분야에 알려진 임의의 표준 세포, 예를 들어, 인간 293T 세포일 수 있다. 대안적으로, 제1 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 제1 세포의 또 다른 예는 COS-7 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 제1 세포는 면역-관련 어댑터를 발현하는 인간 293T.2A 세포이다. 면역-관련 어댑터의 예는 DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD3E를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 제2 세포는 제1 세포 상에서 디스플레이된 단백질과의 상호작용 시 활성이 조정된 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 어레이에서의 제2 세포는 면역 세포, 예를 들어, T 세포이다. 예시적인 T 세포는 Jurkat 세포, 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 소진된 T 세포, 무반응성 T 세포 및 조절 T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 제2 세포는 골수-유래 억제 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 어레이에서의 제2 세포는 세포 검정 센서 또는 검출가능한 리포터, 예를 들어, 형광 단백질을 발현하거나, 또는 효소를 발현하는 리포터 유전자를 안정하게 발현하도록 조작되어 세포 검정 판독을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 리포터 유전자의 발현을 구동하는 유도성 전사 제어 요소를 포함하는 구축물에 함유된다. 일부 실시양태에서, 리포터 구축물은 세포독성 관련 리포터 구축물이다. 다른 실시양태에서, 리포터 구축물은 아폽토시스 관련 리포터 구축물이다. 또 다른 실시양태에서, 리포터 구축물은 증식 관련 리포터 구축물이다.
리포터 유전자 기술은 신호 전달 및 유전자 발현과 연관된 세포 이벤트를 모니터링하는데 광범위하게 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 리포터 유전자는 배경에 비해 쉽게 구별될 수 있는 용이하게 측정가능한 표현형을 갖는 세포, 예를 들어, T 세포의 활성에 대한 인간 막 유전자의 효과의 검출을 가능하게 하는 유전자를 지칭하는데 사용된다. 리포터 유전자 구축물은, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현을 위해 T 세포 관련 전사 반응성 요소를 사용하여 리포터 유전자의 발현을 구동하는 유도성 전사 제어 요소로 구성된다. 예시적인 T 세포 관련 전사 반응성 요소는 NF-kB, NF-AT, AP-1, EGR2, MAPK 및 PI3K를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 어레이에 사용하기에 적합한 리포터 유전자는 효소, 형광 단백질, 광-단백질, 융합 단백질 및 에피토프 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 효소 리포터 유전자의 예는 베타-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-락타마제, 루시페라제 및 니트로리덕타제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 형광 단백질의 예는 아에쿼레아 빅토리아 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그의 변이체 (예를 들어, 시안 형광 단백질 및 황색 형광 단백질)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 광-단백질은 에쿼린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 본 발명의 리포터 유전자는 시토카인 유전자이다. 예시적인 시토카인 유전자는 IFN-감마, TNF-알파 및 IL-10을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 수행될 수 있는 리포터 유전자 검정의 하나의 예는 GFP 또는 임의의 그의 변이체, 예컨대 EGFP, YFP, 또는 BFP로부터 유래될 수 있는 형광 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 도입에 의해 조작된 세포를 이용하며 (Shaner, N. C, et al., Nat. Methods, 2005, 2(12), 905-9), 핵산 분자는 발현 제어 서열, 예를 들어, NF-kB, NF-AT, AP-1, EGR2, MAPK 및 PI3K를 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 관련 전사 반응성 요소의 제어 하에 및 그에 작동가능하게 연결되어 있다. 이어서 GFP 또는 기능적 GFP 유사체의 형광 방출은 T 세포의 활성을 측정하는 수단으로서 모니터링된다. 방법은 제2 세포의 전체 활성에 대한 제1 세포 내로 형질감염된 막 유전자의 효과를 검출하고 비교하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 어레이는 또한 복수의 인간 막 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리를 함유한다. cDNA 라이브러리를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 간략하게, cDNA 라이브러리를 구축하는 전형적인 방법에서, mRNA는 먼저 특정한 세포로부터 단리되고 이어서 과정의 연속 단계에서 상이한 효소 및 알칼리로 처리된다. 병행하여, 벡터 (예를 들어, 플라스미드 pBR322)는 합성된 cDNA의 삽입이 가능한 방식으로 처리된다. cDNA 및 전처리된 벡터의 어닐링 후에, 적합한 숙주 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) K12의 균주)는 벡터-cDNA 구축물로 형질전환되고, 적합한 기판 상에 위치되고 인큐베이션된다. 이 방식으로 수득된 형질전환된 세포로부터의 모든 콜로니는 cDNA 라이브러리를 구축한다 (Gubler et al., Gene, 25(2-3): 263-269, 1983). 일부 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 약 1,000-7,000개의 유전자, 약 2,000-5,000개의 유전자, 약 4,000-7,000개의 유전자 또는 약 100-5,000개의 유전자를 포함한다. 예를 들어, 복수의 인간 막 유전자는 적어도 약 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 또는 7000개의 인간 막 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 모든 인간 막 유전자의 90% 초과를 포괄하는 6,000개 초과의 인간 막 유전자를 포함한다.
본 발명의 어레이에 사용하기 위한 막 유전자는 인간 막 게놈의 완전 스펙트럼을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 막 유전자는 수용체 유전자이다. 다른 실시양태에서, 막 유전자는 신호전달 유전자이다. 또 다른 실시양태에서, 막 유전자는 이뮤노글로불린 유전자이다. 일부 실시양태에서, 막 유전자는 수송체 유전자이다.
본 발명의 어레이는 세포 증식, 억제, 소진, 세포독성, 아폽토시스, 및 T 세포 상의 T 세포 수용체가 항원-제시 세포 상의 항원/MHC 복합체 또는 MHC의 맥락에서 항원을 모방하는 신호 (예를 들어, 항-CD3 항체)와의 상호작용을 발생하는 시토카인 방출을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 T 세포 활성에 대한 스크리닝을 가능하게 한다. 본원에 사용된 바와 같이, T 세포의 "활성화"는 T 세포 증식, T 세포 분화, 및/또는 세포 생성물 (예를 들어, 시토카인)의 생산을 유발하는 T 세포에서의 신호 전달 경로의 유도를 지칭한다.
본 발명에 따르면, T 세포 수용체 (TCR)는, 본원에 기재된 바와 같이, 구체적으로 T 세포의 항원 수용체를 지칭한다. CD3, CD4, CD8, CD28, CTLA-4, CD45, CD43 및 Thy-1을 포함하나 이에 제한되지는 않는, T 세포 반응에서 중요한 T 세포에 의해 발현된 다양한 다른 수용체가 있다는 것은 관련 기술분야에서 인지된다. T 세포 수용체는 T 세포 수용체 및/또는 세포 내로 형질전환된 이종 핵산 분자를 코딩하는 자연 발생 유전자의 발현에 의해 생산될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 바와 같은 막 단백질은 자연 발생 유전자의 발현에 의해 및/또는 세포 내로 형질전환된 이종 핵산 분자의 발현에 의해 세포에서 생산될 수 있다.
본 발명의 어레이에서, 제1 세포 (예를 들어, 항원 제시 세포로서 작용하는 인간 293T.2A 세포)는 이러한 세포가 생존 세포로서 유지될 수 있고 신호 전달 경로를 활성화시키는 다른 세포와 상호작용하는 조건 (예를 들어, 배양 배지, 온도, 산소, CO2, 인큐베이션 시간) 하에 제2 세포 (예를 들어, T 세포)와 배양된다. 이와 같이, 세포는 세포 성장에 필요한 구성성분, 예컨대 탄소, 질소 및 미량 영양소를 함유하는 임의의 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 이러한 세포를 위한 적합한 배양 배지 및 성장 조건의 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준 내이다.
III. 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제조하는 방법
본 발명은 또한 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 복수의 웰은 제1 세포 및 제2 세포를 포함한다. 제1 세포는 형질감염되어 막 연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 안정하게 발현하도록 한다. 제2 세포는 제1 세포 상에서 제시된, 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 상호작용하는 세포 표면 상의 수용체를 발현하고, 제2 세포의 활성을 자극하는 1차 신호를 제공한다. 본 발명의 방법은 또한 막 연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 제1 세포를 각각의 복수의 웰 내로 배양하는 것; 제1 세포를, 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 단백질의 제1 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 복수의 인간 막 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 형질감염시키는 것; 및 각각의 복수의 웰 내로 세포 표면 상의 수용체 및 리포터 유전자를 발현하는 제2 세포와 공동-배양하는 것을 수반한다. 제2 세포는 리포터 유전자를 발현하며, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 제1 세포 내로 형질감염되는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포의 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 방법에 사용된 고체 지지체 구조는, 상기에 기재된 바와 같이, 배양된 세포를 보유하고 그의 성장을 용이하게 하는데 적합한 임의의 지지체일 수 있다. 한 실시양태에서, 고체 지지체는 다중-웰 플레이트이다. 본 발명에 유용한 다중-웰 플레이트는 임의의 다양한 표준 포맷, 예를 들어, 4-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 및 1536-웰 플레이트의 것일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 사용된 다중-웰 플레이트는 비-표준 포맷, 예를 들어, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 1500 또는 적어도 2000개의 웰을 갖는 플레이트일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 세포는 상기 기재된 바와 같은 진핵 및 원핵 세포의 모든 유형을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 특히, 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 세포는 유전적으로 조작된 세포, 예컨대 적어도 하나의 이종 핵산 서열에 의해 형질전환되어 있는 세포이다. 이러한 핵산 분자는 T 세포 수용체, 인간 막 단백질, 또는 리포터를 코딩할 수 있다. 이러한 핵산 분자는 관련 기술분야에 알려진 임의의 분자 생물학 기술, 또는 섹션 II에서 상기 기재된 바와 같은 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.
이러한 이종 핵산 분자 (예를 들어, 핵산 분자를 코딩하는 이종 막 단백질)의 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 세포 내로의 형질전환은, 상기 기재된 바와 같이, 유전자가 세포 내로 삽입될 수 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 복수의 인간 막 유전자는 이들 유전자가 발현되고 개별적으로 세포 표면 상에서 디스플레이되게 하는 방식으로 제1 세포에서 형질감염된다. 이를 달성하기 위해, 실시예 섹션에서 기재된 최적화된 역 형질감염 프로토콜이 사용될 수 있다. 대안적으로, 유전자의 발현 및 개별적인 디스플레이는 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, 리포펙션 및 CRISPR을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 알려진 유전자 전달 기술에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 고체 지지체 구조에서의 제1 세포는 인간 막 유전자의 형질감염 및 발현에 적합한 관련 기술분야에 알려진 임의의 표준 세포, 예를 들어, 인간 293T 세포일 수 있다. 대안적으로, 제1 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 제1 세포의 또 다른 예는 COS-7 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 제1 세포는 면역-관련 어댑터를 발현하는 인간 293T.2A 세포이다. 면역-관련 어댑터의 예는 DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD3E를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 제2 세포는 활성이 제1 세포 상에서 디스플레이된 단백질과의 상호작용 시 조정되는 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에서의 제2 세포는 면역 세포, 예를 들어, T 세포이다. 예시적인 T 세포는 Jurkat 세포, 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 소진된 T 세포, 무반응성 T 세포 및 조절 T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 제2 세포는 골수-유래 억제 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에서의 제2 세포는 세포 검정 센서 또는 검출가능한 리포터, 예를 들어, 형광 단백질을 발현하거나, 또는 효소를 발현하는 리포터 유전자를 안정하게 발현하도록 조작되어 세포 검정 판독을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 리포터 유전자의 발현을 구동하는 유도성 전사 제어 요소를 포함하는 구축물에 함유된다. 일부 실시양태에서, 리포터 구축물은 세포독성 관련 리포터 구축물이다. 다른 실시양태에서, 리포터 구축물은 아폽토시스 관련 리포터 구축물이다. 또 다른 실시양태에서, 리포터 구축물은 증식 관련 리포터 구축물이다.
T 세포의 활성에 대한 인간 막 유전자의 효과를 검출하는데 사용된 리포터 유전자는 관련 기술분야에 알려진 임의의 표준 방법에 의해 생성될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 리포터 유전자 구축물은 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현을 위한 T 세포 관련 전사 반응성 요소를 사용하여 리포터 유전자의 발현을 구동하는 유도성 전사 제어 요소로 구성된다. 예시적인 T 세포 관련 전사 반응성 요소는 NF-kB, NF-AT, AP-1, EGR2, MAPK 및 PI3K를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 적합한 리포터는 효소, 형광 단백질, 광-단백질, 융합 단백질 및 에피토프 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 효소 리포터의 예는 베타-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-락타마제, 루시페라제 및 니트로리덕타제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 형광 단백질의 예는 아에쿼레아 빅토리아 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그의 변이체 (예를 들어, 시안 형광 단백질 및 황색 형광 단백질)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 광-단백질은 에쿼린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 본 발명의 리포터 유전자는 시토카인 유전자이다. 예시적인 시토카인은 IFN-감마, TNF-알파 및 IL-10을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법에서, 제1 세포 (예를 들어, 항원 제시 세포로서 작용하는 인간 293T.2A 세포)는 제2 세포 (예를 들어, T 세포)와 함께 배양된다. 용어 "배양하는"은 다양한 종류의 배지 상에서의 또는 그 내에서의 세포 또는 유기체의 시험관내 번식을 지칭한다. 배양물에서 성장된 세포의 후손은 모 세포와 (예를 들어, 형태학상으로, 유전학적으로, 또는 표현형적으로) 완전히 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 세포는 이러한 세포가 생존 세포로서 유지되고 신호 전달 경로를 활성화하기 위해 다른 세포와 상호작용할 수 있는 조건 (예를 들어, 배양 배지, 온도, 산소, CO2, 인큐베이션 시간) 하에 배양된다. 이에 따라, 세포는 세포 성장에 필요한 구성성분, 예컨대 탄소, 질소 및 미량 영양소를 함유하는 임의의 적합한 배양 배지 내에 배양될 수 있다. 이러한 세포를 위한 적합한 배양 배지 및 성장 조건의 결정은 관련 기술분야의 기술 내에 있다.
본 발명의 방법에 사용된 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지 예컨대 햄 F10™ (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지™ (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지™ (DMEM) (시그마)가 세포 배양에 적합하다. 게다가, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 번호 Re. 30,985]에 기재된 임의의 배지가 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있으며, 이들의 전체 교시는 본원에 참조로 포함된다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 나트륨 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 젠타마이신 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도에서 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려질 수 있는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 이전에 사용된 바와 같고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
IV. 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 사용하는 스크리닝 검정
본 발명은 또한 자가면역 질환 및/또는 암의 치료에서 잠재적인 치료 용도를 가질 수 있는 면역 조정제를 확인하는 방법을 제공한다. 방법은 섹션 II에서 기재된 바와 같은 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제공하여, 제1 세포에서의 복수의 인간 막 유전자 중 하나의 발현을 가능하게 하는 것; 제1 세포 및 제2 세포를 공동-배양하는 것; 제2 세포에서의 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하는 것; 및 리포터 유전자의 발현 수준을 대조군 제2 세포에서의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 수반하며, 여기서 대조군 제2 세포는 복수의 인간 막 유전자 중 하나로 형질감염되어 있지 않은 대조군 제1 세포와 공동-배양된다. 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 공동-신호전달 분자로서 작용하고 세2 세포주의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 제2 세포주의 활성을 억제한다는 것을 나타낸다.
최적의 T 세포 활성화는 TCR/CD3 복합체를 통한 항원-특이적인 1차 신호 및 2차 신호전달에 수반된 공동-신호전달 둘 다를 요구한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 면역 조정제는 면역계, 특히 T 세포 활성을 조절한다. 예를 들어, 면역 조정제는 T 세포 활성을 조절하는 공동-신호전달 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제는 T 세포 활성을 활성화시킨다. 다른 실시양태에서, 면역 조정제는 T 세포 활성을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 면역 조정제는 자가면역 질환 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 조정제는 FOLH1, FAS, IL3RA, CD248, THBD, B7.1, GJB1, OX40L, 4-1BBL 및 B7.2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 면역 조정제는 T 세포 활성을 증가 또는 증진시킨다. 대안적으로, 면역 조정제는 FLT1, CXCR6, SEMA6a, RHCE, FCRLA, TNFRSF19, SEC22b, B3GNT1, NFAM1, LY6 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 면역 조정제는 T 세포 활성에 대한 억제 효과를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제는 FLT1, SEMA6a, SEC22b 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은, 바람직하게는 고처리량 스크리닝 포맷에서, 많은 약물 확인 및 발견 스킴으로 사용하기에 적합한 광범위한 세포-기반 스크리닝 접근법을 제공한다. 자동화된 고처리량 스크리닝은, 예를 들어, 문헌 [Burbaum et al., 1997, Current Opinion in Chemical Biology,1:72-78; 및 Schullek et al., 1997, Analyt. Biochem. 246:20-29]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 로봇공학, 예를 들어, 로봇 액체 취급 시스템을 사용하여 수행된다. 비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 고처리량 스크리닝에서, 액체 취급 작업은 로봇 테칸 프리덤 EVO200 액체 취급 플랫폼에 의해 수행될 수 있다. 스크리닝을 위해 필요한 다른 장비 (예를 들어, 인큐베이터, 플레이트 세척기, 플레이트 취급 시스템, 플레이트 판독기)는, 필요에 따라, 자동화된 기능화에 적합화될 수 있거나, 또는 자동화된 모듈로서 상업적으로 구입될 수 있다. 예를 들어, 검정을 통한 샘플의 운동은 자동화 플레이트 취급 시스템 (매트릭스 플레이트메이트 플러스(Matrix PlateMate Plus), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 수행될 수 있다.
"고처리량 스크린"은, 본원에 사용된 바와 같이, 동시에 스크리닝될 복수의 후보 작용제, 샘플 또는 시험 화합물을 제공하는 검정을 지칭한다. 이러한 검정의 예는 소량의 시약 및 샘플을 사용하여 다수의 검정이 동시에 수행될 수 있기 때문에 특히 편리한 미세역가 플레이트의 사용을 포함한다. 본 발명의 방법은 96-웰, 384-웰 및 1536-웰 포맷을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다중-웰 포맷에서 용이하게 수행되고 자동화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 검정은 스펙트럼 (예를 들어, 형광) 특성에서의 변화를 검출하기 위해 현미경 영상화를 사용하여 세포에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 검정은 다중-웰 포맷에서 수행되고 스펙트럼 특징은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 결정된다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 장치는, 예를 들어, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices) (플렉스스테이션(FLEXstation)™ 마이크로플레이트 판독기 및 유체 전달 시스템 또는 FLIPR™ 시스템)로부터, 하마마츠(Hamamatsu) (FDSS 6000), 퍼킨엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시스(PerkinElmer Life and Analytical Sciences) (셀룩스(CellLux)™)로부터 상업적으로 입수가능한, "VIPR" 전압 이온 프로브 판독기 (오로라, 바이오사이언스 코포레이션(Bioscience Corp.), 미국 캘리포니아주) 및 인셀 이미저(InCell Imager) (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences))이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 GFP 검출 장치는 인셀 이미저이다. 다른 실시양태에서, 본 발명에서의 방법의 영상화 분석은 셀프롤리퍼(Cellprolifer) 소프트웨어를 사용하여 수행된다.
통합된 액체 취급을 갖는 여러 상업적 형광 영상화 시스템은 상업적으로 입수가능하다. 이들은 퍼킨 엘머 셀룩스-셀룰러 플루오레센스 워크스테이션 및 하마마츠 FDSS6000 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 여기/방출 특징은 각각의 형광단에 대해 상이하고, 따라서, 기기는 각각의 검정을 위해 선택된 형광단을 검출하기 위해 구성된다. 적절한 형광단의 선택 및 각각의 실험을 위해 선택된 형광단을 검출하기 위한 기기의 구성은 통상의 기술자의 수준 내이다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 세포 영상화를 위한 구성은 컴퓨터 시스템이 장착된 현미경의 사용을 수반할 수 있다. 컴퓨터는 사용자 지침서를, 일련의 파라미터 필드로의 사용자 입력의 형태로, 또는 미리 프로프래밍된 지침서, 예를 들어, 다양한 상이한 특이적인 작업을 위해 미리 프로그래밍된 형태로 제공받기 위한 적절한 소프트웨어를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 이들 지침서를 시스템의 구성성분의 작업을 제어하기 위한 (예를 들어, 유체 취급 요소, 로봇 요소 및/또는 레이저를 제어하기 위한) 적절한 언어로 임의적으로 전환한다. 컴퓨터는 또한 시스템의 다른 구성성분으로부터, 예를 들어, 검출기로부터 데이터를 제공받을 수 있고, 데이터를 해석하여, 인간 판독가능 포맷으로 사용자에게 제공하거나, 또는 사용자에 의한 임의의 프로그래밍에 따라, 추가의 작업을 개시하기 위한 데이터를 사용할 수 있다. 이러한 구성의 한 예인, 칼 자이스(Carl Zeiss)로부터의 아토(ATTO)의 아토플루오르(Attofluor)™ 레이션비전(RatioVision)™ 실시간 디지털 형광 분석기는, 살아있는 세포에서의 형광 프로브의 분석을 위한 완전히 통합된 워크 스테이션이며 시편을 제조하였다 (아토(ATTO), 메릴랜드주 록빌).
잠재적인 치료 면역 조정제가 본 발명의 방법 및 어레이를 기반으로 하여 확인된 후에, 시험관내 기능적 검정 및 생체내 마우스 모델 분석이 검증을 위해 추구될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 시험관내 기능적 검정, 생체내 검정, 수용체 어레이 검정, 생물정보학 검정, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 검정과 조합하여 게놈-규모 T 세포 활성 어레이를 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 시험관내 기능적 검정은 증식 검정, 아폽토시스 검정 또는 시토카인 (예를 들어, IFN-g, IL-2 또는 IL-10) 방출 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 알려진 임의의 표준 T 세포 검정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험관내 기능적 검정은 복수의 인간 막 유전자 중 하나를 발현하는 제2 세포 및 막-연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 1차 T 세포와 배양하는 것 및 T 세포 검정을 수행하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 1차 T 세포는 임의의 유형의 1차 세포를 포함한다. 예시적인 1차 세포는 인간 1차 CD8 세포 또는 인간 1차 CD4 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법은 수용체 어레이 기술과 조합하여 수행될 수 있다. 수용체 어레이 기술은 표적 단백질의 반대-수용체를 스크리닝하기 위해 널리 확립된 기술이다 (Zhu Y et al., Nat Commun, 4: 2043, 2013; Yao S et al., Immunity, 34(5): 729-740, 2011). 간략하게, 수용체 어레이는 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 포함하며, 여기서 각각의 복수의 웰은 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질감염되어 있는 세포를 포함한다. 표적 유전자 (분비된 단백질을 코딩함) 또는 표적 유전자의 세포외 도메인 (막횡단 단백질, 예를 들어, 면역 조정제를 코딩함)은 태그 유전자 (마우스 IgG2a Fc, 인간 IgG1 Fc, FLAG, 또는 6xHIS)에 유전학적으로 융합되어 이전에 기재된 바와 같은 융합 유전자를 제조한다 (Chapoval, AI. et al., Mol Biotechnol 21(3): 259-264, 2002). 개별 융합 유전자의 293T 세포 내로의 형질감염 시, 정제된 재조합 융합 단백질을 사용하여 수용체 어레이에 대하여 스크리닝한다. 태그에 대하여 형광-표지화된 2차 항체를 적용하여 표적 단백질, 예를 들어, 본 발명의 방법을 기반으로 하여 확인된 면역 조정제의 형질감염된 293T 세포로의 결합을 검출하고 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템을 사용하여 스크리닝되고 CDS 8200 소프트웨어에 의해 분석된다. 상기 참고문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 방법에 의해 확인된 면역 조정제의 치료 잠재력은 예를 들어, 면역 질환 또는 암에 대한 동물 모델에서 추가로 생체내 시험될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체내 검정은 면역 조정제를 자가면역 질환 또는 암에 대한 동물 모델에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 자가면역 질환 또는 암에 대한 동물 모델은 관련 기술분야에 알려진 자가면역 질환 또는 암에 대한 임의의 유형의 동물 모델, 예를 들어, 인간 흑색종 세포 및 종양-반응성 T 세포가 주사된 NOD-scid IL2R감마널 마우스 모델을 포함한다. 다른 실시양태에서, 동물 모델은 마우스 모델이다. 대안적으로, 동물 모델은 래트 모델, 토끼 모델, 또는 원숭이 모델이다. 또 다른 실시양태에서, 동물 모델은 인간화 마우스 모델, 예를 들어, 면역-환자-유래 이종이식편 (면역-PDX) 모델이다.
본 발명의 방법은 또한 생물정보학적 분석과 조합하여 수행될 수 있다. 생물정보학적 접근법을 활용하여 자가면역 질환 및 암과 연관된 유전자를 범위축소할 수 있다. 다중 엄격한 기준은 질환의 진행 동안 유의미하게 변하는 유전자를 확인하기 위해 선택되고 질환 발병기전에 대한 잠재적인 서명 유전자이다. 한 실시양태에서, 등급화 시스템은 특이적인 자가면역 질환 또는 암에서 단지 조절된 특이적인 유전자를 확인하기 위해 설정된다. 대안적으로, 상이한 자가면역 질환 또는 암 중에서 공통인 유전자가 선택될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 실시예 섹션에서 기재된 특이적인 선택 기준이 사용될 수 있다.
V. 치료 방법
한 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환 또는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은, 자가면역 질환 또는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 확인된 면역 조정제의 유효량을 투여하여, 그에 의해 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 확인된 면역 조정제의 조절제의 유효량을 자가면역 질환 또는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 그에 의해 대상체에서 자가면역 질환 또는 암을 치료한다.
일부 실시양태에서, 면역 조정제는 FOLH1, FAS, IL3RA, CD248, THBD, B7.1, GJB1, OX40L, 4-1BBL 및 B7.2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 면역 조정제는 FLT1, CXCR6, SEMA6a, RHCE, FCRLA, TNFRSF19, SEC22b, B3GNT1, NFAM1, LY6 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 면역 조정제의 조절제는 상기 기재된 바와 같은 면역 조정제의 발현 및/또는 활성 수준을 조절할 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제의 조절제는 면역 조절제의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제의 조절제는 면역 조절제의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 면역 조정제의 조절제는 면역 조정제에 결합하고 그의 기능을 활성화 또는 억제한다. 면역 조정제의 예시적인 조절제는 면역 조정제에 특이적인 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 면역 조정제에 특이적인 소분자, 및/또는 면역 조정제에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 조정제의 조절제는 자가면역 질환 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 기반으로 하여 확인된 면역 조정제, 및/또는 면역 조정제의 조절제는 비경구 투여 (예를 들어, 주사, 주입)를 포함한 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있고, 피하, 복강내, 폐내, 및 비강내에 의해, 및 목적하는 경우에 국부 치료, 병변내 투여를 위해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피내 또는 피하 투여를 포함한다. 게다가, 본 발명의 방법을 기반으로 하여 확인된 면역 조정제, 및/또는 면역 조정제의 조절제는, 특히 감소하는 용량으로, 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투여는 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 주어질 수 있다. 투여 경로는 투여가 단기적 또는 만성적인지 여부와 같은 다양한 인자에 따라 선택될 수 있다. 다른 투여 방법은 예를 들어, 목적하는 부위에 가까이 위치된 카테터를 통해 국소, 특히 경피, 경점막, 직장, 경구 또는 국부 투여를 포함하여 고려된다. 주사, 특히 정맥내가 관심 대상이다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 면역 조정제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 면역 조정제의 조절제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 면역 조정제 또는 면역 조정제의 조절제의 치료 유효량은 대상체에서 질환을 치료하기에 충분한 양이다. 본원에 기재된 바와 같은 면역 조정제 및/또는 면역 조정제의 조절제의 치료 유효 투여량은 대상체마다 다소 달라질 것이고, 대상체의 연령, 체중, 및 상태 및 전달 경로와 같은 인자에 따를 것이다. 이러한 투여량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 절차에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 질환은 자가면역 질환 또는 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "치료하다"는 환자, 예를 들어, 질환을 앓고 있거나 또는 발생할 위험이 있는 환자에게 이익을 부여하는 임의의 유형의 치료를 지칭한다. 치료하는 것은 환자의 상태를 개선시키거나 (예컨대 하나 이상의 증상의 경감), 질환의 발병 또는 진행을 지연하는 목적으로 취하는 행동 및 삼가는 행동을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, "자가면역 질환"은 신체에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직에 대한 신체의 비정상적인 면역 반응으로부터 발생하는 그러한 질환이며, 류마티스 관절염 (RA), 소아 만성 관절염 (JCA), 갑상선염, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 경피증, 당뇨병, 그레이브스병, 알레르기, 동종 이식, 예컨대, 비제한적으로, 신장 이식, 심장 이식, 골수 이식, 간 이식, 췌장 이식, 소장 이식, 폐 이식 및 피부 이식과 연관된 급성 또는 만성 면역 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 바와 같이, 용어 "암"은 신체의 인접하는 조직 또는 다른 부분으로 퍼질 수 있는 세포의 비제어된, 비정상적인 성장에 의해 야기된 일군의 질환 중 하나를 지칭한다. 암 세포는, 암 세포가 백혈병에서와 같이, 함께 덩어리가 되거나, 또는 분산된 세포로서 존재하는, 고형 종양을 형성할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료되는데 적합한 암의 유형은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 부신암, 항문암, 담관암
방광암, 골암, 뇌/CNS 종양, 유방암, 캐슬만병, 자궁경부암
결장/직장 암, 자궁내막암, 식도암, 안암, 담낭암,
위장암, 신장암, 후두 및 하인두 암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 피부의 림프종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 구강 및 구인두 암, 골육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암
망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 피부암, 소장암
위암, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 윌름스 종양.
제약 제제
본 발명의 방법을 기반으로 하여 확인된 면역 조정제, 및/또는 본 발명의 면역 조정제의 조절제를 포함하는 제약 제제는 목적하는 순도를 갖는 단백질 또는 핵산을 임의적인 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여, 수성 용액, 동결건조된 또는 다른 건조된 제제의 형태로 저장하기 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(Tween)™, 플루로닉스(Pluronics)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원의 제제는 또한 필요에 따라 치료될 특정한 적응증을 위한 1종 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질환이 치료될 경우에, 면역 조정제 또는 면역 조정제의 조절제를 함유하는 본 발명의 제제는 자가면역 질환을 치료하기 위해 알려진 약물, 예컨대 하기와 조합될 수 있다: 메틸프레드니솔론, 케나로그, 메드롤, 프레드니솔론, 코르테프, 히드로코르티손, 코르티손, 트리암시놀론 아세토니드, 셀레스톤 솔루스판, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 오라프레드 ODT, 베리프레드 20, 솔루-메드롤 또는 메틸프레드니솔론 나트륨. 암이 치료될 경우에, 면역 조정제 또는 면역 조정제의 조절제를 함유하는 본 발명의 제제는 암을 치료하기 위해 알려진 약물, 예컨대 하기와 조합될 수 있다: 아비라테론 아세테이트, 아비트렉세이트 (메토트렉세이트), 아브락산 (파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제제), 애드세트리스 (브렌툭시맙 베도틴), 아도-트라스트주맙 엠탄신, 아드리아마이신 (독소루비신 히드로클로라이드), 아드루실 (플루오로우라실), 아파티닙 디말레에이트, 아피니토르 (에베롤리무스), 알다라 (이미퀴모드), 알데스류킨, 알렘투주맙, 알림타 (페메트렉세드 이나트륨), 알록시 (팔로노세트론 히드로클로라이드), 암보클로린 (클로람부실), 암보클로린 (클로람부실), 아미노레불린산, 아나스트로졸, 아프레피탄트, 아레디아 (파미드로네이트 이나트륨), 아리미덱스 (아나스트로졸), 아로마신 (엑세메스탄), 아라논 (넬라라빈), 삼산화비소, 아르제라 (오파투무맙), 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미, 아바스틴 (베바시주맙), 악시티닙, 아자시티딘, 벤다무스틴 히드로클로라이드, 베바시주맙, 벡사로텐, 벡사르 (토시투모맙 및 I 131 아이오딘 토시투모맙), 블레오마이신, 보르테조밉, 보술리프 (보수티닙), 카바지탁셀, 카보잔티닙-S-말레이트, 캄파트 (알렘투주맙), 캄프토사르 (이리노테칸 히드로클로라이드), 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르필조밉, 세뉴 (로무스틴), 세루비딘 (다우노루비신 히드로클로라이드), 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 클라펜 (시클로포스파미드), 클로파라빈, 코메트리크 (카보잔티닙-S-말레이트), 코스메겐 (닥티노마이신), 크리조티닙, 시클로포스파미드, 시포스 (이포스파미드), 시타라빈, 다브라페닙, 다카르바진, 다코겐 (데시타빈), 닥티노마이신, 다사티닙, 다우노루비신 히드로클로라이드, 데시타빈, 데가렐릭스, 데니류킨 디프티톡스, 데노수맙, 덱스라족산 히드로클로라이드, 도세탁셀, 독소루비신 히드로클로라이드, 에푸덱스 (플루오로우라실), 엘리텍 (라스부리카제), 엘렌스 (에피루비신 히드로클로라이드), 엘록사틴 (옥살리플라틴), 엘트롬보팍 올라민, 에멘드 (아프레피탄트), 엔잘루타미드, 에피루비신 히드로클로라이드, 에르비툭스 (세툭시맙), 에리불린 메실레이트, 에리벳지 (비스모데깁), 에를로티닙 히드로클로라이드, 에르위나제 (아스파라기나제 에르위니아 크리산테미), 에토포시드, 에베롤리무스, 에비스타 (랄록시펜 히드로클로라이드), 엑세메스탄, 파레스톤 (토레미펜), 파슬로덱스 (풀베스트란트), 페마라 (레트로졸), 필그라스팀, 플루다라 (플루다라빈 포스페이트), 플루다라빈 포스페이트, 플루오로플렉스 (플루오로우라실), 플루오로우라실, 폴린산, 폴로틴 (프랄라트렉세이트), 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈 히드로클로라이드, 겜투주맙 오조가미신, 겜자르 (겜시타빈 히드로클로라이드), 글리오트리프 (아파티닙 디말레에이트), 글리벡 (이마티닙 메실레이트), 할라벤 (에리불린 메실레이트), 헤르셉틴 (트라스투주맙), 하이캄틴 (토포테칸 히드로클로라이드), 이브리투모맙 티욱세탄, 이클루식 (포나티닙 히드로클로라이드), 이포스파미드, 이마티닙 메실레이트, 이미퀴모드, 인리타 (악시티닙), 인트론 A (재조합 인터페론 알파-2b), 아이오딘 131 토시투모맙 및 토시투모맙, 이필리무맙, 이레사 (게피티닙), 이리노테칸 히드로클로라이드, 이스토닥스 (로미뎁신), 익사베필론, 자카피 (룩솔리티닙 포스페이트), 제브타나 (카바지탁셀), 카드실라 (아도-트라스트주맙 엠탄신), 케옥시펜 (랄록시펜 히드로클로라이드), 케피반스 (팔리페르민), 키프롤리스 (카르필조밉), 라파티닙 디토실레이트, 레날리도미드, 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류프롤리드 아세테이트, 로무스틴, 루프론 (류프롤리드 아세테이트, 마르퀴보 (빈크리스틴 술페이트 리포솜), 마툴란 (프로카르바진 히드로클로라이드), 메클로레타민 히드로클로라이드, 메게이스 (메게스트롤 아세테이트), 메게스트롤 아세테이트, 메키니스트 (트라메티닙), 메르캅토퓨린, 메스나, 메타졸라스톤 (테모졸로미드), 메토트렉세이트, 미토마이신, 모조빌 (플레릭사포르), 머스타르겐 (메클로레타민 히드로클로라이드), 뮤타마이신 (미토마이신 C), 밀로사르 (아자시티딘), 밀로타르그 (겜투주맙 오조가미신), 나노입자 파클리탁셀 (파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제제), 나벨빈 (비노렐빈 타르트레이트), 넬라라빈, 네오사르 (시클로포스파미드), 뉴포젠 (필그라스팀), 넥사바르 (소라페닙 토실레이트), 닐로티닙, 놀바덱스 (타목시펜 시트레이트), 엔플레이트 (로미프롤스팀), 오파투무맙, 오마세탁신 메페숙시네이트, 온카스파르 (페가스파르가제), 온탁 (데니류킨 디프티톡스), 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제제, 팔리페르민, 팔로노세트론 히드로클로라이드, 파미드로네이트 이나트륨, 파니투무맙, 파조파닙 히드로클로라이드, 페가스파르가제, 페그인터페론 알파-2b, PEG-인트론 (페그인터페론 알파-2b), 페메트렉세드 이나트륨, 페르투주맙, 플라티놀 (시스플라틴), 플라티놀-AQ (시스플라틴), 플레릭사포르, 포말리도미드, 포말리스트 (포말리도미드), 포나티닙 히드로클로라이드, 프랄라트렉세이트, 프레드니손, 프로카르바진 히드로클로라이드, 프로류킨 (알데스류킨), 프롤리아 (데노수맙), 프로막타 (엘트롬보팍 올라민), 프로벤지 (시푸류셀-T), 퓨린톨 (메르캅토퓨린), 라듐 223 디클로라이드, 랄록시펜 히드로클로라이드, 라스부리카제, 재조합 인터페론 알파-2b, 레고라페닙, 레블리미드 (레날리도미드), 류마트렉스 (메토트렉세이트), 리툭시맙, 로미뎁신, 로미프롤스팀, 루비도마이신 (다우노루비신 히드로클로라이드), 룩솔리티닙 포스페이트, 시푸류셀-T, 소라페닙 토실레이트, 스프리셀 (다사티닙), 스티바르가 (레고라페닙), 수니티닙 말레이트, 수텐트 (수니티닙 말레이트), 실라트론 (페그인터페론 알파-2b), 시노비르 (탈리도미드), 신리보 (오마세탁신 메페숙시네이트), 타핀라 (다브라페닙), 타목시펜 시트레이트, 타라빈 PFS (시타라빈), 타르세바 (에를로티닙 히드로클로라이드), 탈그레틴 (벡사로텐), 타시그나 (닐로티닙), 탁솔 (파클리탁셀), 탁소테레 (도세탁셀), 테모다르 (테모졸로미드), 테모졸로미드, 템시롤리무스, 탈리도미드, 토포사르 (에토포시드), 토포테칸 히드로클로라이드, 토레미펜, 토리셀 (템시롤리무스), 토시투모맙 및 I 131 아이오딘 토시투모맙, 토텍트 (덱스라족산 히드로클로라이드), 트라메티닙, 트라스투주맙, 트레안다 (벤다무스틴 히드로클로라이드), 트리세녹스 (삼산화비소), 타이커브 (라파티닙 디토실레이트), 반데타닙, 벡티빅스 (파니투무맙), VelP, 벨반 (빈블라스틴 술페이트), 벨케이드 (보르테조밉), 벨사르 (빈블라스틴 술페이트), 베무라페닙, 베페시드 (에토포시드), 비아두르 (류프롤리드 아세테이트), 비다자 (아자시티딘), 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 비노렐빈 타르트레이트, 비스모데깁, 보락세이즈 (글루카르피다제), 보리노스타트, 보트리엔트 (파조파닙 히드로클로라이드), 웰코보린 (류코보린 칼슘), 잘코리 (크리조티닙), 젤로다 (카페시타빈), 엑스제바 (데노수맙), 엑소피고 (라듐 223 디클로라이드), 엑스탄디 (엔잘루타미드), 예르보이 (이필리무맙), 잘트랩 (Ziv-아플리베르셉트), 젤보라프 (베무라페닙), 제발린 (이브리투모맙 티욱세탄), 지네카드 (덱스라족산 히드로클로라이드), Ziv- 아플리베르셉트, 졸레드론산, 졸린자 (보리노스타트), 조메타 (졸레드론산), 및 자이티가 (아비라테론 아세테이트).
활성 성분은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 패키징될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
일반적으로, 조성물의 성분은 단위 투여 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 사쉐와 같은 기밀 용기 내에 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서, 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 투여 방식이 주입인 경우에, 조성물은 멸균 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병에 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우에, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 중 1종 이상은 작용제의 양 및 농도를 표시하는 기밀 밀봉된 용기에 액체 형태로 공급된다.
활성제는, 전형적으로 주사가능한 용액으로서 제조된, 비경구 투여에 적합한 제약 조성물에 혼입될 수 있다. 주사가능한 용액은 플린트 또는 앰버 바이알, 앰플 또는 예비-충전된 시린지에 액체 또는 동결건조된 투여 형태로 구성될 수 있다. 액체 또는 동결건조된 투여 형태는 완충제 (예를 들어, L-히스티딘, 나트륨 숙시네이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트, 나트륨 클로라이드), 동결보호제 (예를 들어, 수크로스 트레할로스 또는 락토스), 벌킹제 (예를 들어, 만니톨), 안정화제 (예를 들어, L-메티오닌, 글리신, 아르기닌), 아주반트 (히알루로니다제)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어, 액체, 반-고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액 (예를 들어, 주사가능한 및 주입가능한 용액), 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜, 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 적용에 따른다. 전형적인 투여 방식은 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 주사 또는 경구 투여를 포함한다.
본원에 기재된 면역 조정제 또는 면역 조정제의 조절제를 포함하는 제약 조성물은 특정한 조직에의 투여를 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 다양한 기관에서 결합 조직 및/또는 종양 부위에 면역 조정제 또는 면역 조정제의 조절제를 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 방법은 인간 상에서 수행된다. 추가의 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 마우스 또는 다른 비-인간 동물 상에서 수행되지 않는다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 임의의 방식으로 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 전체 내용, 뿐만 아니라 도면은, 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1. 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)의 구축
추후 면역요법을 위한 표적의 인간 게놈-전반 연구를 수행하기 위해, 게놈-규모 T 세포 활성 어레이를 개발하였다. GS-TCAA 구축을 위해, 인간 막 게놈의 90%를 커버하는, 6402개 인간 막 cDNA를 퀴아젠 미니 프렙 키트를 사용하여 제조하고, 정량화하고, 희석하였다.
최적의 T 세포 활성화는 TCR/CD3 복합체를 통한 항원-특이적인 1차 신호, 및 2차 신호전달에 수반된 공동-신호전달 둘 다를 요구한다. 기능적 T 세포 검정을 설정하기 위해, 기저 T 세포 활성화를 자극하는 293T 세포 기반 인공 항원 제시 세포주를 디자인하였고, 형광 리포터를 T 세포 활성의 지시자로 사용하였다 (도 1A). 구체적으로, 293T.2A 세포를 활성 어레이를 위해 사용하였다. 이들 293T.2A 세포는 면역-관련 막 유전자의 최적의 발현을 위한 주요 면역-관련 어댑터 (DAP10/DAP12/FcRγ/CD3E)를 발현하는 조작된 293T 세포였다. 게다가, 293T.2A 세포를 추가로 조작하여 CD14 GPI 앵커에 연결된 OKT-3 모노클로날 항체의 막 형태 scfv인, 막 연관 항-CD3 항체 ScFv를 발현하였다 (도 1B). 이들 293T.2A/m.항-CD3 세포는 항원 제시 세포 및 개별 막 유전자를 발현하는 세포 둘 다로서 작용한다.
GFP 리포터의 제어 하에 있는 T 세포 관련 전사 인자 반응성 요소 (TFRE) (예컨대 NF-kb, NF-AT, AP-1, 또는 EGR2)를 함유하는 여러 구축물을 본 검정을 위해 디자인하였고 T 세포 활성의 지시자로 사용하였다 (도 1C). 예를 들어, NF-KB-GFP를 안정하게 발현하는 Jurkat 세포주를 수득하였다. 이들 세포는 293T.2A 세포와 공동-배양될 때 가시적 GFP 신호를 생성하지 않았다. 그러나, 유의한 GFP 신호를 막 항-CD3 항체 및 면역-관련 막 유전자를 발현하는 293T.2A 세포와 밤새 공동-배양한 후에 관찰하였다 (도 2A 및 2B). Jurkat 세포주 이외에, 나이브 또는 이펙터 T 세포, 소진된, 무반응성 T 세포 또는 Treg를 포함한 1차 면역 세포가 또한 포함되었다.
활성 어레이에 대한 판독은 시토카인 (IFN-감마, TNF-알파 또는 IL-10)을 포함한 증식 관련 리포터, 및 T 세포 세포독성 또는 아폽토시스의 형광-기반 신호-검출을 포함하였다. 증식 검정을 위해, 293T.2A.m.항-CD3 세포를 T 세포 공동-배양 직전에 조사하였다 (10,000 라드). 약 72시간 후에, 1 μl CCK-8 시약 (도진도(Dojindo))을 플레이트의 각각의 웰 내로 로딩하였고 엔비전(Envision) 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)에 의해 450 nm에서 흡광도 판독 전에 2-시간 인큐베이션이 이어졌다. 세포독성 검정을 위해, RFP를 안정하게 발현하는 293T.2A.m.항-CD3을 사용하였다. 간략하게, GS-TCAA 플레이트에서의 유전자 플라스미드를 RFP를 보유하는 293T.2A.m.항-CD3 세포 내로 역으로 형질감염시켰다. 24시간 후에, 플레이트를 인큐사이트(IncuCyte)™ 키네틱 카스파제-3/7 아폽토시스 검정 시약 (에센 바이오사이언스(Essen Bioscience)) 플러스 OKT3 예비-활성화된 또는 알로-PBMC 활성화된 인간 PBMC와 함께 첨가하였다. 공동-배양 후에 상이한 시점에서의 RFP 및 GFP 신호 둘 다를 인셀 분석기 (GE)에 의해 검출하였다. T 세포 아폽토시스 검정을 위해, OKT3 예비-활성화된 또는 알로-PBMC 활성화된 인간 PBMC를 셀트레이스 바이올렛 염료 (써모 피셔)로 표지화하고 플레이트 내로 로딩하기 전에 인큐사이트™ 키네틱 카스파제-3/7 아폽토시스 검정 시약 (에센 바이오사이언스)과 혼합하였다. 공동-배양 후에 상이한 시점에서의 RFP 및 GFP 및 셀트레이스 바이올렛 신호 둘 다를 인셀 분석기 (GE)에 의해 검출하였다. T 세포 세포독성을 (% RFP+GFP+ 세포/RFP+ 세포)에 의해 계산하였고, T 세포 아폽토시스를 (% 셀트레이스 바이올렛+ GFP+ 세포/셀트레이스 바이올렛+ 세포)에 의해 계산하였다.
실시예 2. 게놈-규모 T 세포 활성 어레이의 검출 및 스크리닝
T 세포 활성 어레이를 위한 스크리닝 시스템을 최적화하기 위해, 1536-웰 플레이트 내의 293T/m.항-CD3 세포의 형질감염 효율을 시험하였고 이들 2개 세포 공동-발현 시스템에서의 T 세포 활성에 요구된 최적의 조건을 결정하였다. 게다가, 인셀 영상화 시스템을 사용하는 GFP 검출을 또한 활성 어레이에 대해 최적화하였다.
유전자 클론을 자동 플레이트 취급 시스템 (매트릭스 플레이트메이트 플러스, 써모 사이언티픽)에 대한 최적화된 프로토콜을 사용하여 그라이너 1536-웰 영상화 플레이트 내로 옮겼다. 각각의 GS-TCAA 세트는 4개의 1536-웰 영상화 플레이트를 함유한다. 어레이 스크리닝을 위해, 이들 유전자가 개별적으로 293T.2A/m.항-CD3 세포의 세포 표면 상에 디스플레이되도록, 최적화된 역 형질감염 프로토콜을 활용하였다. cDNA 라이브러리 플라스미드를 개별적으로 미니-프렙한 후에 OptiMEM (4 μg/ml) 중에 희석하고 각각의 웰에 200 μl 플라스미드 용액을 갖는 384-딥-웰 플레이트 (VWR)로 옮겼다. 다양한 유전자를 함유하는 4개의 384 플레이트로부터의 2 μl의 플라스미드 용액을 로봇 액체 취급 시스템 (플레이트메이트, 써모 사이언티픽)에 의해 낮은 베이스 1536-웰 플레이트 (그라이너)의 각각의 웰 내로 옮겨 수용체 어레이 플레이트를 생성하였다. 전체 인간 막 수용체 어레이는 4개의 1536-웰 플레이트를 함유한다. 명시되지 않는 한, 이들 1536-웰 플레이트를 추가로 호일링하고 추후 실험을 위해 -80℃에서 저장하였다.
게놈-규모 T 세포 활성 어레이 설정을 위해, 4개의 1536-웰 플레이트를 함유하는 일련의 인간 수용체 어레이를 -80℃에서 가져왔고 용액이 완전히 해동될 때까지 인큐베이터에 두었다. 어레이 플레이트를 스피닝 (600 g, 2분)하였고 이어서 역 형질감염시켰다. 간략하게, 1536-웰 어레이 플레이트를 웰당 로봇 분배기 (멀티드롭 콤비(Multidrop Combi), 써모 사이언티픽)로 리포펙타민 3000 (7 μl 리포/ml)을 함유하는 2 μl optiMEM을 분배하고 초고속 오비탈 진탕기에 의해 1분 동안 신속하게 진탕하였다. 모든 플레이트를 실온에서 20분 동안 저장한 후 T 세포 자극을 위해 293T.2A.m.항-CD3을 멀티드롭에 의해 첨가하였다 (웰당 4 μl 중 2000개 세포). 그 후, 플레이트를 추가로 스피닝 (1000 g, 4분)하여 37℃에서 인큐베이션 전에 각각의 웰의 내부에 버블을 제거하였다. T 세포 수용체 세포 또는 1차 T 세포 (4000개 세포), 예컨대 상이한 GFP 리포터를 갖는 조작된 Jurkat 세포주를 형질감염 24시간 후에 어레이 플레이트 내로 로딩하였다. T 세포를 293T 기반 T 세포 자극제와 공동-배양 12시간 후에 플레이트 영상화를 인셀 영상화 분석기 (GE)에 의해 수행하였다. 셀프로파일러(Cellprofiler) 소프트웨어를 사용하여 최적의 영상화 분석 후에, 잠재적인 조절 기능을 갖는 유전자 후보를 확인하였다. 예를 들어, 분자가 T 세포 활성을 조정하는데 효과적이지 않은 경우에, GFP 신호는 유사하게 남아있을 것이다. 분자가 T 세포 활성을 위한 조절 신호로서 작용한다면, 상대적으로 더 강한 GFP 신호가 검출될 것이다. 대안적으로, 분자가 억제성인 경우에, 훨씬 더 약한 GFP 신호가 관찰될 것이다. 도 3에 입증된 바와 같이, 293T.2A/m.항-CD3 세포 단독은 T 세포 활성화를 자극하고 기저 신호로서 작용할 수 있는 검출가능한 GFP 신호를 생성하였다. B7.1, B7.2, OX40L 또는 4-1BBL의 발현은 그들 각각이 T 세포 활성을 위한 자극 신호로서 작용된다는 것을 나타내는 형광 신호를 증가시켰다. 대조적으로, 293T.2A/m.항-CD3 세포를 B7-H1 또는 B7-H4로 형질감염시키는 것은 감소된 형광 신호를 야기하였고, 이는 이들 분자가 T 세포 활성을 억제하였다는 것을 시사한다.
대안적으로, 특이적인 시토카인의 방출은 리포터로서 사용될 수 있고 T 세포 활성의 지시자로서 작용한다. 시토카인 검출을 위해, 상청액을 공동-배양 24 또는 48시간 후에 수집하였고 ELISA (이바이오사이언스(eBoscience))에 의해 정량화하였다. 도 4에 제시된 바와 같이, GJB1 및 FOLH1의 발현은 T 세포로부터 IFN-γ의 방출을 자극한 반면, FLT1, SEMA6a, SEC22b 및 GP1BA의 발현은 IFN-γ 방출을 감소시켰다.
어레이 스크리닝을 위해, 각각의 T 세포 리포터 세포를 삼중으로 플레이트 내에 스크리닝하였고 각각의 유전자의 평균값을, 어레이에서의 GFP 양성 대상의 밀도를 기반으로 하여, 계산하고 등급화하였다. Jurkat T 세포 활성에 대한 자극 기능을 갖는 막 유전자로 형질감염된 세포는 대조군보다 더 높은 GFP 판독을 가질 수 있고, T 세포 활성에 대한 억제 기능을 갖는 막 유전자로 형질감염된 세포는 더 낮은 GFP 판독을 유발하였다. 모든 GFP 신호를 정규화하고 셀프로파일러 소프트웨어 (브로드 인스티튜트(Broad Institute))에 의해 각각의 웰 내에 GFP 양성 대상 및 총 GFP 밀도 둘 다로 정량화하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, T 세포 활성에 대한 자극 및 억제 기능을 갖는 여러 유전자를 확인하였다. 이들 GS-TCAA 스크리닝으로부터 억제 기능을 갖는 상위 후보, 예를 들어, FLT1, SEMA6a, SEC22b, 및 GP1Ba를 추가의 검증을 위해 함께 풀링하였다.
실시예 3. 암/자가면역 질환을 치료하는 잠재력을 갖는 신규 면역 조절 유전자의 검증
GS-TCAA 연구로부터 수득된 유전자 후보의 기능을 추가로 검증하기 위해, 시험관내 기능적 검정을 1차 인간 T 세포로 수행하였다. 게다가, 생물정보학 접근법을 활용하여 자가면역 질환 및/또는 암과 연관된 유전자를 범위축소하였다. 여러 상위 유전자 후보를 또한 수용체 어레이 시스템에서의 잠재적인 반대-수용체 확인을 위해 스크리닝하고 인간화 마우스 PDX 모델을 포함한 인간화 마우스 질환 모델에서 암/자가면역 질환의 치료 잠재력을 시험하기 위해 생체내 연구를 선택하였다.
시험관내 T 세포 기능적 검정
GS-TCAA 분석으로부터 확인된 상위 유전자 후보를 1차 T 세포를 사용하는 시험관내 기능적 검정에 의해 검증하였다. 293T.2A/m.항-CD3 세포를 유전자 후보로 형질감염시키고 인간 1차 CD8 또는 CD4 세포와 공동-배양하였다. T 세포 증식, 아폽토시스, 및 시토카인 (예를 들어, IFN-g, IL-2 또는 IL-10)의 방출을 위한 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
수용체 어레이 기술 (RAT)
알려지지 않은 반대-수용체를 스크리닝하기 위해, 수용체 어레이 기술을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Zhu Y et al., Nat Commun, 4: 2043, 2013; Yao S et al., Immunity, 34(5): 729-740, 2011). 간략하게, 표적 유전자 (분비된 단백질을 코딩함) 또는 표적 유전자의 세포외 도메인 (막횡단 단백질을 코딩함)을 태그 유전자 (마우스 IgG2a Fc, 인간 IgG1 Fc, FLAG, 또는 6xHIS)에 유전적으로 융합시켜, 이전에 기재된 바와 같은 융합 유전자를 제조하였다 (Chapoval, AI. et al., Mol Biotechnol 21(3): 259-264, 2002). 개별 융합 유전자의 293T 세포 내로의 형질감염 시, 정제된 재조합 융합 단백질을 사용하여 수용체 어레이에 대하여 스크리닝하였다. 태그에 대한 형광-표지화된 2차 항체를 적용하여 감염된 293T 세포에 대한 표적 단백질의 결합을 검출하고 어플라이드 바이오시스템즈 8200 세포 검출 시스템을 사용하여 스크리닝하고 CDS 8200 소프트웨어에 의해 분석하였다.
세포-기반 검정은 수용체 어레이 기술을 사용하는 큰 규모 스크리닝 및 T 세포-관련 표면-분자 상호작용의 스크리닝을 가능하게 하는 모든 인간 막 cDNA의 대략 90%를 스크리닝한다. 세포-기반 고처리량 스크리닝을 위한 강건하고 안정된 시스템을 확립하였고, 초-고처리량 수용체-리간드 스크리닝을 위한 이 혁신적인 시스템의 개발은 로봇공학을 사용하여 확대되었고 최초 384 웰-플레이트 포맷에서 1,536 웰-플레이트 포맷으로 수용체 어레이를 업그레이드시켰다.
자동화를 위해 테칸 프리덤(Tecan Freedom) EVO 200 액체 취급 플랫폼을 활용하여, 1,536-웰 플레이트 포맷을 스크리닝할 때 시약의 사용에서의 4-5배 감소 및 증가된 감수성을 달성하였다. 형질감염 절차를 최적화하고 목적하는 단백질의 높은 발현 수준이 1,536 웰-플레이트 포맷에서 5 ng의 개별 플라스미드 및 리포펙타민의 혼합물로 형질감염시켜 달성하였다는 것을 입증하였다. 전형적으로, 형질감염 12시간 후에, 각각의 웰 중에 293T 세포의 50-70%가 형질감염된 플라스미드를 발현하였다. 새로운 플라스미드가 시스템 내로 혼입되었을 때, 무작위로 선택된 웰 내에 이들의 발현을 특이적인 모노클로날 항체로 조사함으로써 품질 제어 실험을 수행하였다. 이 최적화 및 업그레이드는 취급 시간을 감소시키고 전체적인 스크니링을 시간, 비용, 및 노동에서 4-배 더 효율적인 스크리닝으로 개선시켰다.
따라서, 수용체 어레이 기술을 사용함으로써, T 세포 활성 어레이로부터 선택된 유전자 후보에 대한 상호작용 단백질을 확인하였다. 상호작용 단백질의 확인은 확인된 유전자 후보의 면역 기능에 관한 추가적인 통찰을 제공하고 마우스 종양 모델에서 치료 잠재력을 시험하기 위한 생체내 연구를 위한 후보의 선택을 용이하게 할 것이다.
인간 암의 생체내 마우스 모델
상위 검증된 표적에 특이적인 항체 또는 상위 후보를 위한 재조합 단백질을 암 모델에서 그들의 치료 잠재력을 시험하기 위해 생성하였다. 624개 인간 흑색종 (GP100+ HLA-A2+) 세포 및 종양-반응성 T 세포를 NOD-scid IL2R감마널 마우스 내로 주사하였다. 이들 마우스는 유전자 후보 및/또는 유전자 후보의 항체로의 수회 라운드 치료를 제공받았고, 종양 부위에서 종양 성장 및 면역 세포 경관 또는 이펙트 기능을 조심스럽게 모니터링하였다.
환자-유래 이종이식편 (PDX)
종양 미세환경 (TME)의 이종성을, 암 환자로부터 수집된 치료 전 및 치료 시 종양 시편에서 면역조직화학 (IHC), 멀티플렉스-면역형광 (멀티플렉스-IF) 및 질량 분광측정법 (CyTOF) 분석과 조합하여 검사하였다. 이들 기술의 조합은 인간 TME에서 기계적 상호작용을 확인하기 위한 툴로서 사용될 수 있다. 구체적으로, TME의 면역학적 구성성분에서의 차이를 검사하고, 획득된 저항성의 기준선에서의 및 순간에서의 샘플과 비교하였다. 면역-환자-유래 이종이식편 (면역-PDX) 모델로 알려진, 인간화 마우스 모델을 개발하였고 인간 TME를 연구하기 위해 이들 분석과 동시에 사용할 수 있다. 이들 연구는 질환 미세환경에서의 반응, 저항성, 및 획득된 저항성의 메카니즘을 밝히는데 긴요하며, 결국 미세환경의 특이적인 저항성 메카니즘을 기반으로 하는 바이오마커 개발 및 추가적인 요법을 위한 기저를 제공한다.
생물정보학적 접근법
생물정보학적 접근법을 활용하여 자가면역 질환 및 암과 연관된 유전자를 범위축소하였다. 다중 엄격한 기준은 질환의 진행 동안 유의하게 변하는 유전자를 확인하기 위해 선택되고 질환 발병기전에 대한 잠재적인 서명 유전자이다.
잠재적인 유전자 후보의 GS-TCAA 및 추가의 기능 검증 후에, 등급화 시스템을 설정하여 특이적인 자가면역 질환 또는 암에서 단지 조절된 특이적인 유전자를 확인하였다. 대안적으로, 상이한 자가면역 질환 또는 암 중에서 공통인 유전자가 선택될 수 있다.
예를 들어, 단지 막횡단 및 분비된 단백질을 코딩하는 유전자는, 주로 이들 분자의 치료 항체 또는 재조합 단백질로 추후 조작을 위한 용이성으로 인해 선택된다. 게다가, 이 선택은 GS-TCAA 및 수용체 어레이 기술의 조합을 사용하여 반대-수용체 및 기능의 확인을 가능하게 한다. 두번째 기준은 하나 초과의 질환과 공유되는 그러한 유전자를 선택하는 것이다. 상향-조절된 유전자가 관심 표적화된 질환의 각각에서 존재하는 경우에 1로 점수화된 등급화 시스템이 이용된다. 더 높은 수는 유전자가 상이한 질환 중에서 공유된다는 것을 나타낸다. 이는 상이한 자가면역 질환 또는 암 유형의 기저가 되는 공통 메카니즘을 밝혀낸다.
단일 질환과 독특하게 연관된 유전자는 하나의 특정한 질환과 특이적으로 연관되지만 다른 자가면역 질환 또는 암 유형과는 연관되지 않은 유전자를 확인하기 위한 선택 기준을 기반으로 하여 선택된다. 후속적으로, 컷오프로서 적어도 2-배 변화를 갖는 특이적인 질환에서 상향-조절된 또는 하향-조절된 유전자가 선택된다. 이는 주로 통계적 고려에 기인한다. 특이적인 면역 기능과 연관될 수 있는 특이적인 단백질 도메인을 갖는 유전자의 목록, 예를 들어, Ig 슈퍼패밀리 분자가 확인된다. 처음에 특이적인 유전자를 이들 기준으로 확인한 후에, 이들 표적에 대한 반대-수용체 스크리닝을 수용체 어레이 기술을 사용하여 수행하고, 면역-관련 기능적 연구는 이들 분자 및 그의 반대-수용체가 면역 조정을 위한 잠재적인 표적인지 또는 아닌지 여부를 결정한다.
자가면역 질환에서 및 암 미세환경에서 상향-조절되는 유전자 및 단백질을 확인하였다. 주요 데이터베이스, 예컨대 NCBI, 온코민, TCGA 암 데이터베이스, 예일 내부 암 데이터베이스 및 인간 단백질 아틀라스를 사용하여, 다양한 질환 중에 공유되는 차등 발현된 유전자를 또한 확인하였다. 후속적으로, 유전자 세트 강화 분석 (GSEA)을 사용하여, 면역계, 시토카인/케모카인 신호전달, 또는 인터페론 신호전달, 및 자가면역 질환 및 암의 생성 및 진행에서 중요한 역할을 하는 항원 제시 경로와 관련된 유전자를 확인하였다. 최종적으로, 상향-조절된, 공유된 질환 유전자를 그의 세포하 위치에 의해 카테고리화하고, 막 단백질은 이들이 더 용이하게 치료제에 접근가능하므로 주목된다. 특정 유전자의 경우에, 분석을 수행하여 막횡단 유전자가 자가면역 질환 및 암에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는, FcR-유사 유전자, HLA-관련 유전자, 및 공동자극 분자 (CD86, B7-H1 일명 CD274, 및 CTLA4)를 포함한 이뮤노글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 구성원인지 여부를 결정하였다.
자가면역 질환에서 및 암 미세환경에서 하향-조절되는 유전자 및 단백질을 확인하기 위해, 유사한 접근법이, 다양한 질환 중에 공유되는 유전자를 확인하기 위한 공개적이고 접근가능한 데이터베이스의 생물정보학 분석을 사용함으로써 취해진다.
GS-TCAA 스크리닝으로부터 확인된 T 세포 활성에 대한 억제 기능을 갖는 후보, 예를 들어, FLT1, SEMA6a, SEC22b, 및 GP1Ba를 다양한 유형의 암에서의 그의 발현 수준에 대해 추가로 분석하였다. 도 6-9에 입증된 바와 같이, FLT1, SEMA6a, SEC22b, 및 GP1Ba의 발현 수준은 상이한 유형의 암에서 차등적으로 조절되는 것으로 제시되었다. 예를 들어, SEC22b의 발현은 다수의 암 예컨대 신암, 전립선암, 간암, 유방암, 두경부암, 위암, 결장직장암 및 부신암에서 상향조절되는 반면, SEC22b는 특이적으로 폐암에서 하향조절되었다 (도 8). 이 생물정보학 분석은 면역 조정제를 확인하는데 있어서 GS-TCAA의 유의성을 추가로 확증하고 이들 면역 조정제가 암 및/또는 자가면역 질환의 치료를 위한 잠재적인 치료 표적으로서 작용할 수 있다는 것을 시사한다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 초과하지 않는 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

Claims (65)

  1. 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 포함하는 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA: Genome-Scale T Cell Activity Array)이며,
    여기서 각각의 상기 복수의 웰은
    막 연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 제1 세포로서, 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 단백질의 상기 제1 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 복수의 인간 막 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 감염되어 있는 제1 세포;
    세포 표면 상의 수용체 및 리포터 유전자를 발현하는 제2 세포
    를 포함하며;
    여기서 상기 수용체 및 상기 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 사이의 상호작용은 1차 신호를 제공하고 상기 제2 세포의 활성을 자극하고,
    여기서 상기 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 상기 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 상기 제2 세포의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 상기 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 상기 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 상기 제2 세포의 활성을 억제한다는 것을 나타내는 것인
    어레이.
  2. 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제조하는 방법이며,
    복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 제공하는 것;
    막 연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 제1 세포를 각각의 상기 복수의 웰 내로 배양하는 것;
    상기 제1 세포를, 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 단백질의 상기 제1 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 상기 복수의 인간 막 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 형질감염시키는 것; 및
    세포 표면 상의 수용체 및 리포터 유전자를 발현하는 제2 세포를 각각의 상기 복수의 웰 내로 공동-배양하여, 그에 의해 게놈-규모 T 세포 활성 어레이를 제조하는 것
    을 포함하며,
    여기서 상기 수용체 및 상기 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 사이의 상호작용은 1차 신호를 제공하고 상기 제2 세포의 활성을 자극하고,
    여기서 상기 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 상기 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 상기 제2 세포의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 상기 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 상기 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 상기 제2 세포의 활성을 억제한다는 것을 나타내는 것인
    방법.
  3. 제1항에 있어서, 고체 지지체 구조가 다중-웰 플레이트인 어레이.
  4. 제3항에 있어서, 다중-웰 플레이트가 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 및 1536-웰 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
  5. 제1항에 있어서, 제1 세포가 (a) 인간 293T 세포; 또는 (b) 면역-관련 어댑터를 발현하는 인간 293T.2A 세포인 어레이.
  6. 제5항에 있어서, 면역-관련 어댑터가 DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD3E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
  7. 제1항에 있어서, 제2 세포가 면역 세포인 어레이.
  8. 제7항에 있어서, 면역 세포가 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 또는 T 세포인 어레이.
  9. 제8항에 있어서, T 세포가 Jurkat 세포, 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 소진된 T 세포, 무반응성 T 세포 및 조절 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
  10. 제1항에 있어서, 리포터 유전자가 세포독성 관련 리포터 구축물, 아폽토시스 관련 리포터 구축물 및 증식 관련 리포터 구축물로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 구축물에 함유되는 것인 어레이.
  11. 제10항에 있어서,
    (a) 세포독성 관련 리포터 구축물이 형광-기반 리포터 구축물이거나; 또는
    (b) 아폽토시스 관련 리포터 구축물이 형광-기반 리포터 구축물이거나; 또는
    (c) 증식 관련 리포터 구축물 내의 리포터 유전자가 시토카인 유전자인 어레이.
  12. 제11항에 있어서, 형광-기반 리포터 구축물이 T 세포 관련 전사 반응성 요소에 이어서 최소 CMV 프로모터 및 GFP 리포터 유전자를 함유하는 것인 어레이.
  13. 제12항에 있어서, T 세포 관련 전사 반응 요소가 NF-kb, NF-AT, AP-1, EGR2, MAPK 및 PI3K로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
  14. 제11항에 있어서, 시토카인이 IFN-감마, TNF-알파 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
  15. 제1항에 있어서, 상기 복수의 인간 막 유전자가, (a) 수용체 유전자, 이뮤노글로불린 유전자, 수송체 유전자 및 신호전달 유전자로부터 선택된 유전자; 또는 (b) 1,000 - 7,000개의 유전자; 또는 (c) 2,000 - 5,000개의 유전자; 또는 (d) 4,000 - 7,000개의 유전자를 포함하는 것인 어레이.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포의 상기 활성이 세포 증식, 세포 억제, 세포 소진, 세포 아폽토시스, 및 세포로부터의 시토카인 방출로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 어레이.
  17. 면역 조정제를 확인하는 방법이며,
    제1항의 게놈-규모 T 세포 활성 어레이 (GS-TCAA)를 제공하는 것;
    제1 세포에서의 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나의 발현을 가능하게 하는 것;
    제1 세포 및 제2 세포를 공동-배양하는 것;
    제2 세포에서의 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하는 것; 및
    상기 리포터 유전자의 발현 수준을 대조군 제2 세포에서의 상기 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하며, 여기서 대조군 제2 세포는 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 형질감염되어 있지 않은 대조군 제1 세포와 공동-배양되는 것
    을 포함하며,
    여기서 상기 리포터 유전자의 발현 수준에서의 증가는 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 상기 디스플레이된 단백질이 자극 공동-신호전달 분자로서 작용하고 상기 제2 세포의 활성을 자극한다는 것을 나타내고, 여기서 상기 리포터 유전자의 발현 수준에서의 감소는 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나에 의해 코딩된 상기 디스플레이된 단백질이 억제 공동-신호전달 분자로서 작용하고 상기 제2 세포의 활성을 억제한다는 것을 나타내며, 그에 의해 상기 면역 조정제를 확인하는 것인
    방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역 조정제가, (a) FOLH1, FAS, IL3RA, CD248, THBD, B7.1, GJB1, OX40L, 4-1BBL 및 B7.2로 이루어진 군, 또는 (b) FLT1, CXCR6, SEMA6a, RHCE, FCRLA, TNFRSF19, SEC22b, B3GNT1, NFAM1, LY6 및 GP1BA로 이루어진 군, 또는 (c) FLT1, SEMA6a, SEC22b 및 GP1BA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 자동화되거나 또는 로봇공학을 사용하여 수행되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 로봇 액체 취급 기술 또는 자동화된 플레이트 취급 시스템을 사용하여 수행되는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 시험관내 기능적 검정, 생체내 검정, 수용체 어레이 검정, 생물정보학 검정, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 검정을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (a) 시험관내 기능적 검정이 상기 복수의 인간 막 유전자 중 하나 및 막-연관 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 상기 제2 세포를 1차 T 세포와 배양하는 것; 및 증식 검정, 아폽토시스 검정 및 시토카인 방출 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된 시험관내 기능적 검정을 수행하는 것이거나;
    (b) 상기 수용체 어레이 검정이 상기 면역 조정제의 상호작용 단백질을 확인하기 위해 수행되는 것이거나; 또는
    (c) 상기 생체내 검정이 상기 면역 조정제를 자가면역 질환 또는 암에 대한 동물 모델에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 1차 T 세포가 인간 1차 CD8 세포 및 인간 1차 CD4 세포 중 적어도 하나인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 수용체 어레이가 복수의 웰을 포함하는 고체 지지체 구조를 포함하는 것이며,
    여기서 각각의 상기 복수의 웰은
    상기 복수의 수용체 유전자 중 하나에 의해 코딩된 수용체의 상기 세포 상에서의 디스플레이를 가능하게 하는 방식으로 복수의 수용체 유전자를 코딩하는 cDNA 라이브러리로 감염되어 있는 세포;
    태그와 융합된 면역 조정제를 포함하는 재조합 단백질;
    태그에 특이적인 형광 표지화된 항체
    를 포함하며,
    여기서 검출가능한 형광 신호는 상기 면역 조정제가 상기 수용체와 상호작용한다는 지표인 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    (i) 상기 태그가 마우스 IgG2a Fc 태그, 인간 IgG1 Fc 태그, FLAG 태그 및 6xHis 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이거나; 또는
    (ii) 상기 면역 조정제가 상기 면역 조정제의 전장 단백질이거나; 또는
    (iii) 상기 면역 조정제가 상기 면역 조정제의 세포외 도메인
    을 포함하는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서,
    (i) 상기 동물 모델이 인간 흑색종 세포 및 종양-반응성 T 세포가 주사된 NOD-scid IL2R감마널 마우스 모델이거나; 또는
    (ii) 상기 동물 모델이 인간화 마우스 모델이거나; 또는
    (iii) 상기 인간화 마우스 모델이 면역-환자-유래 이종이식편 (면역-PDX) 모델인 방법.
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  32. 제2항에 있어서, 고체 지지체 구조가 다중-웰 플레이트인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 다중-웰 플레이트가 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 및 1536-웰 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제2항에 있어서, 제1 세포가 (a) 인간 293T 세포; 또는 (b) 면역-관련 어댑터를 발현하는 인간 293T.2A 세포인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역-관련 어댑터가 DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD3E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제2항에 있어서, 제2 세포가 면역 세포인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 면역 세포가 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 또는 T 세포인 방법.
  38. 제37항에 있어서, T 세포가 Jurkat 세포, 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 소진된 T 세포, 무반응성 T 세포 및 조절 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제2항에 있어서, 리포터 유전자가 세포독성 관련 리포터 구축물, 아폽토시스 관련 리포터 구축물 및 증식 관련 리포터 구축물로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 구축물에 함유되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    (a) 세포독성 관련 리포터 구축물이 형광-기반 리포터 구축물이거나; 또는
    (b) 아폽토시스 관련 리포터 구축물이 형광-기반 리포터 구축물이거나; 또는
    (c) 증식 관련 리포터 구축물 내의 리포터 유전자가 시토카인 유전자인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 형광-기반 리포터 구축물이 T 세포 관련 전사 반응성 요소에 이어서 최소 CMV 프로모터 및 GFP 리포터 유전자를 함유하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, T 세포 관련 전사 반응 요소가 NF-kb, NF-AT, AP-1, EGR2, MAPK 및 PI3K로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 시토카인이 IFN-감마, TNF-알파 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제2항에 있어서, 상기 복수의 인간 막 유전자가, (a) 수용체 유전자, 이뮤노글로불린 유전자, 수송체 유전자 및 신호전달 유전자로부터 선택된 유전자; 또는 (b) 1,000 - 7,000개의 유전자; 또는 (c) 2,000 - 5,000개의 유전자; 또는 (d) 4,000 - 7,000개의 유전자를 포함하는 것인 방법.
  45. 제2항에 있어서, 상기 제2 세포의 상기 활성이 세포 증식, 세포 억제, 세포 소진, 세포 아폽토시스, 및 세포로부터의 시토카인 방출로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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Journal of Immuological Methods 362 (2010) 131-141 (2010.09.19.) 1부.*

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