KR102690857B1

KR102690857B1 - 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 (SARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102690857B1
Application number: KR1020210056453A
Authority: KR
Inventors: 김학성; 조현수; 김동건; 차정석; 김의진; 김다솜; 유태근
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2024-08-05
Also published as: KR20220149174A

Abstract

본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 receptor binding domain; SARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 SARS-CoV2 RBD에 결합하여 RBD와 인체의 상피세포 수용체인 안지오텐신 전환효소2 (ACE2)와의 결합을 저해함으로써 COVID-19 감염을 예방할 수 있는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 상기 폴리펩티드 생산방법 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 SARS-CoV2 RBD에 결합하는 신규한 폴리펩타이드는 RBD에 결합하여 인체 내 세포 수용체인 ACE2와의 결합을 저해하여 SARS-CoV2의 감염을 억제할 수 있으므로 코로나바이러스감염증-19 예방 및 치료제로의 개발에 유용하다.

Description

제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 (SARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드 및 이의 용도 {Novel polypeptide selective binding with receptor binding domain of SARS-CoV2 spike protein and uses thereof}

본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 receptor binding domain; SARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 SARS-CoV2 RBD에 결합하여 RBD와 인체의 상피세포 수용체인 안지오텐신 전환효소2 (ACE2)와의 결합을 저해함으로써 COVID-19 감염을 예방할 수 있는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 상기 폴리펩티드 생산방법 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

코로나바이러스(coronavirus)는 RNA 바이러스의 한 종류로 유전정보가 리보핵산(RNA)으로 이뤄진 바이러스이다. 사람과 동물의 호흡기와 소화기계 감염을 유발한다. 주로, 점막전염, 비말전파 등으로 쉽게 감염되며, 사람은 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키지만 드물게 치명적인 감염을 일으키기도 한다.

제2형 중증급성호흡기증후군-코로나바이러스(SARS-CoV2)는 중국 우한에서 출현하여 전세계로 빠르게 확산되었으며 WHO는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다. SARS-CoV-2의 감염이 확산되면서 WHO는 2020년 1월 30일 '국제적 공중보건 비상사태'(PHEIC)를 선포했으며, 코로나19 확진자가 전 세계에서 속출하자 WHO는 2020년 3월 11일 홍콩독감(1968), 신종플루(2009)에 이어 사상 세 번째로 코로나19에 대해 팬데믹(세계적 대유행)을 선포했다.

전세계적으로 약 1억명의 환자가 발생하고, 약 200만명이 사망했으며, 매일 수만에서 수십만명의 확진환자가 추가되어, 지속적으로 감염환자가 증가하는 추세에 있다(2021년 1월 18일 기준, COVID-19 Dashboard by the Center for Systems Science and Engineering (CSSE) at Johns Hopkins University (JHU)). 한국에서도, 약 8만명의 환자가 확진되었으며, 지역사회를 통한 감염으로 확산되어 매일 수백명의 확진자가 추가되고 있으며, 총 1534명의 사망자가 보고되었다(2021년 2월 17일 기준, 대한민국 중앙재난안전대책본부).

SARS-CoV2에 감염되면, 발열(83~99%), 기침(59~82%), 식욕 부진(40~84%), 피로(44~70%), 호흡곤란(31~40%), 가래 및 기침(28~33%), 및 근육통 및 기타 통증(11~35%)등의 증상이 나타나는 것으로 알려져 있으며(U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 6 April 2020.), 2~14일 이내의 잠복기를 거친 후 상기한 증상들이 발현되는 것으로 보고되었다.

SARS-CoV2는 전염력이 매우 높으며, 일반적으로, 직/간접적인 접촉, 감염자로부터 배출된 에어로졸 형태의 물방울 등을 통해 전파되는 것으로 알려져 있으며, 일부 경우에서는 무증상자로부터 전염도 가능한 것으로 보고된다(European Centre for Disease Prevention and Control. Retrieved 30 April 2020.). 또한 완치된 후에도 후유증을 앓거나 재감염되는 사례가 속속들이 보고되고 있다. 따라서, SARS-CoV2 감염 예방이 특히 강조되고 있으며, 이를 위해, 개인적/사회적 차원에서, 마스크 착용, 손 씻기, 사회적 거리두기 등을 적극적으로 수행하고 있으나, 교회를 비롯한 다양한 지역에서 감염되는 사례가 발생하고 있다.

한편, Angiotensin-converting enzyme 2(ACE2)는 전염증성 물질인 안지오텐신 II를 분해하여, 염증으로부터 신장, 폐, 심장을 보호하는 것으로 알려져 있다. 상기 ACE2는 SARS-CoV1 및 SARS-CoV2와 같은 코로나바이러스 계열의 세포진입과정에서, 바이러스의 수용체로 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 SARS-CoV2는 ACE2와 스파이크 단백질(S protein)의 결합을 중심으로, 내세포 작용 및 TMPRSS2와의 공동작용으로인한 직접 융합의 두 가지 메커니즘을 통해 작용하는 것으로 보고되었다(Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5224; 10.1016/j.cell.2020.02.052 등). 따라서, 현재 연구되는 많은 치료제 및 백신의 개발전략은 스파이크 단백질을 표적으로 하고 있다.

특히, 상기 SARS-CoV2 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)은 SARS-CoV2의 스파이크 단백질(S 단백질)에 포함된 수용체인 ACE2와 결합하는 특정 서열의 아미노산으로서, 이의 결합 구조에 대한 연구결과가 지속적으로 보고되고 있다(Nature. 30 March; Science. 3 April; Cell. 9 April).

이와 같이 SARS-CoV2의 감염 과정에서 RBD는 감염의 시발점이 되는 역할을 하므로 이를 표적할 경우 바이러스 감염 예방 및 치료 효과를 기대할 수 있다고 판단되어 전 세계적으로 수용체결합도메인을 표적하는 치료제에 대한 연구가 진행 중이다. 현재 임상시험에 진입한 대표적인 수용체 결합도메인 표적 치료제로는 Regeneron 사의 REGN-COV-2 (NCT04452318, 임상 3상), Eli Lilly-Junshi Biosciences의 JS016 (NCT04441918, 임상 3상) 등이 있다.

본 발명자들은 기존의 항체를 대체할 수 있는 비 항체 단백질 골격 (non-antibody protein scaffold)인 리피바디 (repebody)를 성공적으로 개발하였다. 리피바디는 크기가 항체의 1/5 수준이고 대장균에서 대량생산 되며 동물 실험결과 면역원성 또한 매우 낮았다. 해당 단백질 골격은 열 및 pH 안정성이 매우 우수하고 타겟에 대한 결합력을 pico-mole 수준까지 매우 용이하게 증대시킬 수 있으며 타겟에 대한 특이성이 매우 탁월함을 입증한 바가 있다.

본 발명자들은 다양한 단백질에 대해 특이적으로 결합가능한 리피바디(Repebody)라는 폴리펩타이드를 개발한 바 있으며 (대한민국 특허 제10-1356075호, 제10-1654890호, 제10-1587622호, 제10-1624702호, 제10-1624703호, 제10-1713944호, 제10-1751501호, 제10-1818152호 및 제10-1875809호), 상기 리피바디 골격을 이용하여 다양한 질환 관련 표적 단백질들에 대한 특이적인 결합 단백질 (Specific protein binder)을 성공적으로 제조하고, 세포 기반의 방법으로 생물학적인 저해효과가 있음을 검증하였고, 추가적인 연구를 활발히 진행하고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 상기 리피바디 골격을 이용하여 코로나바이러스감염증-19의 치료 및 감염 예방에 중요한 표적 단백질인 스파이크 단백질, 그중에서도 수용체 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 단백질을 성공적으로 확보하기 위해 노력한 결과, 리피바디의 구조적 특징인 모듈성과 전체 구조분석을 통해 구축한 무작위한 돌연변이 라이브러리를 바탕으로 수용체 결합도메인에 대해 특이적인 결합력을 갖는 신규한 폴리펩타이드를 제조 및 선별하였으며, 상기 리피바디가 수용체 결합도메인에 결합하여 수용체인 ACE2와의 상호작용을 저해하는 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 SARS-CoV2 RBD에 특이적으로 결합하는 리피바디(Repebody); 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입된 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물를 이용해 상기 리피바디를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리피바디를 함유하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 리피바디를 함유하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 코로나바이러스감염증-19를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, 코로나바이러스 수용체 결합 도메인(ARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 리피바디(Repebody)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 벡터가 포함되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 리피바디를 생성시키는 단계 및 상기 생성된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, SARS-CoV2 RBD에 선택적으로 결합하는 리피바디의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 리피바디를 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 SARS-CoV2 RBD에 결합하는 신규한 폴리펩타이드는 RBD에 결합하여 인체 내 세포 수용체인 ACE2와의 결합을 저해하여 SARS-CoV2의 감염을 억제할 수 있으므로 코로나바이러스감염증-19 예방 및 치료제로의 개발에 유용하다.

도 1은 SARS-CoV2 RBD와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 선별하기 위하여 무작위적인 라이브러리를 구축한 아미노산 잔기들을 표시한 리피바디(repebody)의 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 선별된 리피바디군이 SARS-CoV2에 대해 농도 구배에 따라 결합하며 이 중 E9 리피바디가 가장 강력한 결합을 가지는 것을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에서 구축한 라이브러리를 파지 표면에 디스플레이하고, SARS-CoV2 RBD에 대한 바이오 패닝을 통해 일차적으로 선별된 리피바디 클론의 결합력을 등온 적정 열량계 (Isothermal Titration Calorimetry, ITC)를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에서 선별된 E9 리피바디를 농도별로 처리하였을 때 ACE2에 대한 경쟁자로 작용하여 SARS-CoV2 스파이크 단백질과 ACE2의 결합을 저해하는 효과를 효소면역침강법 (ELISA)로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 용어 “제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 수용체결합도메인 (SARS-CoV2 RBD)”은 2019년 12월 발발한 판데믹 코로나바이러스감염증-19의 원인이 되는 바이러스 (SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 319번 아르기닌으로부터 541번 페닐알라닌까지의 서열을 말한다. 스파이크 단백질은 크게 S1, S2 도메인으로 구분되며 S1에 존재하는 수용체결합도메인은 인체 중 비강 및 호흡기 세포에서 높게 발현되는 안지오텐신 전환효소2 (ACE2)와 결합을 이룬다. 결합 이후 인간 세포막에 존재하는 TMPRSS2 단백질분해효소에 의해 스파이크 단백질은 S1, S2로 분리되며 S2 도메인이 바이러스 지질 막과 세포막의 융합을 촉진하여 바이러스 내 유전물질의 세포 침투를 유도한다.

본 발명에서는, 코로나바이러스 수용체 결합도메인 (SARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 리피바디를 선별하고, 상기 리피바디의 결합효과를 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 리피바디 개발을 위한 라이브러리에 포함된 폴리펩타이드에서 바이오패닝을 통해 SARS-CoV2 RBD에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드의 선별을 수행하고, 이들의 결합력을 개선하는 작업을 수행하였다. 그 결과 SARS-CoV2 RBD에 특이적인 리피바디를 제조하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 코로나바이러스 수용체 결합도메인 (SARS-CoV2 RBD)에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 리피바디를 개발하기 위하여, 인터날린 B (Internalin B) 단백질의 Ｎ-말단, 가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR) 의 LRR (Leucine-rich repeat) 단백질 부분이 융합된, 폴리펩타이드의 반복 모듈을 무작위적으로 포함하는 라이브러리를 구축하였다(도 1). 상기 라이브러리에 포함된 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩되거나 또는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열과 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩될 수 있다.

또한, 상기 라이브러리는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 파지미드의 형태가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "파지미드"란, 대장균을 숙주로 하는 바이러스인 파지로부터 유래된 원형의 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미하는데, 번식과 증식에 필요한 단백질 및 표면 단백질들의 서열이 포함되어 있다. 재조합 파지미드는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 파지미드는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있고, 주로 원하는 단백질을 파지의 표면 단백질과 융합하여 파지 표면에 표지하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 파지미드의 프로모터는 주로 유도성이며, 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 파지미드는 상기 라이브러리를 구성하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 및 분비하기 위한 신호 서열 또는 리더 서열인 MalEss, DsbAss 또는 PelBss를 포함하고, 파지의 표면에 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위한 히스티딘-태그와 파지 표면으로의 발현을 위한 M13 파지의 표면 단백질의 일종인 gp3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명자의 선행 특허 (제10-2012-0019927호)에 기술된 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명자들은 상기 파지미드를 포함하는 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여, 서열번호 1의 DNA 서열로 코딩되는 아미노산 서열에서 89번, 91번, 93번, 94번, 137번, 139번, 141번, 142번, 240번, 241번, 242번, 243번, 244번 및 245번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 위치의 아미노산이 변이되어, SARS-CoV2 RBD에 대한 결합력이 우수한 리피바디 형태의 신규한 폴리펩타이드(서열번호 3, 4)를 선별하였다(도 2).

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, 코로나바이러스 수용체 결합 도메인(ARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 리피바디(Repebody)에 관한 것이다

본 발명의 용어 "리피바디 (Repebody)"란, LRR 구조를 갖는 인터날린의 N-말단과 VLR의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시킨 폴리펩타이드이다. 리피바디 단백질은 구조상 오목한 지역(Concave)과 볼록한 지역(Convex)으로 나누어 질 수 있다. 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위로 알려져 있다. 이와 반대로 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 리피바디 단백질은 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질을 상기 방법으로 수용성 발현 및 단백질의 생물리화학적 성질을 향상 시킨 모든 융합 LRR 패밀리 단백질을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 인터날린 단백질은 바람직하게는 인터날린 A, 인터날린 B, 인터날린 C, 인터날린 H 및 인터날린 J로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인터날린 B 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "인터날린 B 단백질"이란, 리스테리아 (Listeria) 균주에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 다른 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 다른 LRR 패밀리 단백질들과는 다른 유형의 N-말단 구조 때문에 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 단백질의 N-말단은 반복 모듈의 접힘 (Folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 더욱 안정적인 구조를 포함하므로, 미생물에서 LRR 패밀리 단백질들의 안정적인 발현을 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "인터날린 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping motif) 및 인터날린 단백질의 반복 모듈을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단은 제한 없이 포함되나, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE"(서열번호 5) 및 반복 모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게 반복 모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN" (서열번호 6)을 포함할 수 있다. 상기 반복 모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 친수성 아미노산을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.

본 발명의 용어 "가변 림프구 수용체 (Variable Lymphocyte Receptor, VLR)"란, 먹장어와 칠성 장어에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 먹장어와 칠성 장어에서 면역 기능을 수행하는 단백질로서 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 인터날린 B 단백질의 N-말단 및 VLR 단백질이 융합된 폴리펩타이드는 인터날린 B 단백질이 융합되지 않은 VLR 단백질보다 수용성 및 발현양이 증가하므로, 이를 기반으로 한 신규한 단백질 치료제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "LRR (Leucine rich repeat) 단백질"이란, 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 의미하는 것으로, (i) 하나 이상의 LRR 반복 모듈을 갖고 있고, (ii) 상기 LRR 반복 모듈은 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어져 있고, (iii) LRR 반복 모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 쓰레오닌을, x는 모든 종류의 20가지의 아미노산을 의미하며, (iv) LRR 패밀리 단백질은 말발굽과 같은 삼차원 구조를 갖는 구조를 갖고 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것뿐 아니라, 컨센서스 디자인 (Consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리피바디는 코로나바이러스 수용체 결합도메인 (SARS-CoV2 RBD)에 결합하여 지오텐신 전환효소2(ACE2)와의 상호작용을 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명에서 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 될 수 있고, 상기 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λλλλλλλCharon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pET-21a, pET-32a 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "재조합 미생물"이란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주세포는 특별히 제한되는 것이 아니나, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 대장균 BL21(DE3), OrigamiB(DE3)를 숙주 세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (i) 상기 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 생성시키는 단계; 및 (ii) 상기 생성된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, SARS-CoV2 RBD에 선택적으로 결합하는 리피바디의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 리피바디를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 리피바디를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19) 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료는 상기 리피바디가 코로나바이러스 수용체 결합도메인과 결합하여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어 "코로나바이러스감염증-19"는 한국질병분류코드 U07.1에 해당하는 질병으로 제2형 중증급성 호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV2) 감염에 의한 발열, 기침, 폐렴 등의 증상을 동반하는 바이러스 감염성 질환을 의미한다.

본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여로 코로나바이러스감염증-19, 혹은 그로부터 야기된 하나 또는 그 이상의 증상을 억제하거나 완화하는 것뿐만 아니라 질환의 증상을 반전시키는 코로나바이러스감염증-19의 치료 또는 코로나바이러스감염증-19의 진행을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 코로나바이러스감염증-19를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료는 본 발명에서 확보한 폴리펩타이드가 코로나바이러스 수용체 결합도메인 (SARS-CoV2 RBD)와 결합하여 이루어지는 것으로, 코로나바이러스 수용체결합도메인에 결합하여 인체 감염경로인 ACE2와의 결합을 유의하게 억제하여 코로나바이러스감염증-19를 예방 또는 치료하는 것이다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 리피바디 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 리피바디를 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 코로나바이러스감염증-19를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 치료 방법은 인플라마솜의 과도한 활성으로 인하여 질병이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 단백질 구조 기반의 리피바디 라이브러리 구축

리피바디는 자연계에 존재하는 LRR 단백질들과 마찬가지로 보존된 루이신 서열을 갖는 반복 단위체 (Repeat unit)가 연속적으로 연결되어 전체 단백질 구조를 유지하는 모듈성과 전체 구조의 모양의 곡률로 인한 오목한 지역 (concave region)과 볼록한 지역 (convex region)으로 구별되는 구조적 특징을 갖는다. 상기 오목한 지역에는 항체의 상보결정지역 (complementarity determining region; CDR)처럼 초 가변영역 (hypervariable region)이 위치하여, 표적과의 결합을 매개한다. 또한, 볼록한 지역은 잘 보존되어 있는 서열을 바탕으로 LRR의 전체 구조를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 리피바디의 단백질 구조를 분석하여 하기와 같은 방식으로 무작위적인 라이브러리를 설계하였다.

구체적으로, 아민기말단 방향에 위치한 두 개의 모듈과 카르복실기 말단 방향에 위치한 루프 구조 (LRRV2, LRRV4 module, C-terminal loop)의 오목한 지역에 위치하는 열 네 개의 아미노산 잔기 89번, 91번, 93번, 94번, 137번, 139번, 141번, 142번, 240번, 241번, 242번, 243번, 244번 및 245번을 선택하여 무작위적인 돌연변이 라이브러리를 구축하였다(도 1).

그런 다음, 상기 선택한 아미노산을 NNK 동의코돈 (degenerate codon)으로 치환하도록, 라이브러리 구축을 위한 돌연변이 유발 프라이머 (mutagenic primer)를 합성하였다.

이어, 상기 프라이머들을 이용하여 두 모듈에 대한 겹침 중합효소 연쇄 반응 (overlap PCR)을 수행하며 라이브러리 DNA를 수득하고, 본 발명자의 선행 특허 (대한민국 등록특허 제1,356,075호)에 기술된 서열번호 2의 파지미드 pBEL118M에 삽입하여 최종적인 라이브러리 파지미드를 확보하였다.

상기 확보된 라이브러리를 전기천공법 (electroporation)으로 대장균 TG-1에 도입하여 형질 전환체를 수득함으로써, 2.0x108 수준의 다양성을 갖는 라이브러리를 구축하였다.

실시예 2: 리피파디 라이브러리의 파지 디스플레이를 통한 SARS-CoV2 RBD와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 선별

2-1: 리피바디 라이브러리의 패닝 과정을 통한 SARS-CoV2 RBD와 결합하는 폴리펩타이드 선별

실시예 1에서 구축한 파지 디스플레이를 사용하여 SARS-CoV2 RBD에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 선별하여 정제하였다. SARS-CoV2 RBD와 결합할 수 있는 후보를 선별하기 위하여, SARS-CoV2 RBD를 맥시바인딩 폴리스티렌 흡착튜브 (Maxibinding immunotube)에 10 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 4℃에서 16시간 동안 결합 반응시킨 후 PBS로 3회 세척시켰다. 상기 SARS-CoV2 RBD가 결합 된 튜브를 1% BSA와 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBSA)으로 상온에서 1시간동안 블로킹 (Blocking) 하였다. 그런 다음, 상기 정제된 파지를 1012 cfu/ml의 농도로 가하여 상온에서 2시간 반응시켰다.

반응이 종료된 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 총 1분간 5번씩 및 세척 후 PBS로 1번 세척하였다. 마지막으로, 1 ml의 0.2M Glycine-HCl (pH 2.2)를 상기 면역튜브에 가하고, 상온에서 10분간 반응시킴으로써, SARS-CoV2 RBD와 결합할 수 있는 리피바디 후보를 표면에 발현시킨 파지를 용출시켰다. 상기 용출액에 100 ㎕의 1.0M Tris-HCl (pH 9.0)를 가하여 중화시키고, 숙주세포인 8.9 ml 대장균 TG-1 용액 (OD600 = 0.5)에 가한 다음, 2xYT 플레이트에 도말하는 바이오패닝 (Bio-panning) 과정을 동일하게 5회 반복하여 수행하였다.

그 결과, 각 패닝 과정을 통해 SARS-CoV2 RBD와 특이적으로 결합하는 파지가 농축됨을 확인하였다. 상기 결과는 SARS-CoV2 RBD와 결합하는 라이브러리 파지가 특이적으로 증가함을 의미하는 것으로 분석되었다.

2-2: 선별된 리피바디의 SARS-CoV2 RBD에 대한 특이적인 결합여부 확인 및 서열 분석

실시예 2-1의 방법을 통하여 선별된 파지를 SARS-CoV2 RBD와 BSA가 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 효소결합 면역침강법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다. BSA 대비 SARS-CoV2 RBD의 흡광도(OD450)가 30배 이상 높은 24개의 리피바디 후보들을 선별하고, 이들 각각의 아미노산 서열을 확인한 결과, 상기 선별된 파지에서 얻어진 리피바디 클론들이 여섯 종의 다른 서열을 가진 것을 확인하였다.

이들을 별도로 정제하여 동일한 농도 조건에서 결합 정도를 비교한 결과 E9 리피바디가 가장 강한 결합력을 가지는 것을 확인하였다(도 2). 선별한 E9 리피바디는 89번 아미노산인 타이로신이 페닐알라닌으로, 91번 이소류신이 페닐알라닌으로, 93번 트레오닌이 아스파라긴으로, 94번 글라이신이 류신으로, 137번 타이로신이 류신으로, 139번 아스파라긴이 히스티딘으로, 141번 알라닌이 메티오닌으로, 142번 히스티딘이 발린으로, 240번 아스파라긴이 세린으로, 241번 세린이 페닐알라닌으로, 242번 알라닌이 이소류신으로, 243번 글라이신이 프롤린으로, 244번 세린이 류신으로, 245번 발린이 트립토판으로 치환되었음을 확인하였다(서열번호 3).

서열번호 3: Repebody-E9

ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNELNSIDQIIANNSDIKSVQGIQYLPNVRYLALGGNKLHDISALKELTNLTFLFLNLNQLQSLPNGVFDKLTNLKELVLVENQLQSLPDGVFDKLTNLTLLHLMVNQLQSLPKGVFDKLTNLTELDLSYNQLQSLPEGVFDKLTQLKDLRLYQNQLKSVPDGVFDRLTSLQYIWLHDNPWDCTCPGIRYLSEWINRHSGVVRSFIPLWAPDSAKCSGSGKPVRSIICPT

상기 선별한 E9 리피바디의 SARS-CoV2 RBD에 대한 해리상수를 등온열량측정법 (ITC)을 통해 측정한 결과 101 nM 수준의 결합력을 가지는 것을 확인하였다 도 3).

비슷한 수준의 결합력을 가지는 H6 리피바디는 서열상으로 높은 상이성을 보이며 89번 아미노산인 타이로신이 히스티딘으로, 91번 이소류신이 트레오닌으로, 93번 트레오닌이 타이로신으로, 94번 글라이신이 프롤린으로, 137번 타이로신이 글루탐산으로, 139번 아스파라긴이 타이로신으로, 141번 알라닌이 트레오닌으로, 142번 히스티딘이 알라닌으로, 240번 아스파라긴이 세린으로, 242번 알라닌이 발린으로, 243번 글라이신이 발린으로, 244번 세린이 이소류신으로, 245번 발린이 페닐알라닌으로 치환된 것을 확인하였다(서열번호 4).

서열번호 4: Repebody-H6

ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNELNSIDQIIANNSDIKSVQGIQYLPNVRYLALGGNKLHDISALKELTNLTHLTLYPNQLQSLPNGVFDKLTNLKELVLVENQLQSLPDGVFDKLTNLTELYLTANQLQSLPKGVFDKLTNLTELDLSYNQLQSLPEGVFDKLTQLKDLRLYQNQLKSVPDGVFDRLTSLQYIWLHDNPWDCTCPGIRYLSEWINKHSGVVRSSVVIFAPDSAKCSGSGKPVRSIICPT

실시예 3: 선별한 리피바디의 항원 결정부위 확인

SARS-CoV2 RBD에 결합하는 리피바디 중 SARS-CoV2 RBD의 인체 수용체인 ACE2와의 상호작용하는 부위에 결합하는 리피바디를 선별하는 것은 매우 중요하다. 항체를 비롯하여 여러 폴리펩타이드 혹은 화합물이 이러한 기작을 통해 코로나바이러스감염증-19 예방 및 치료제로서의 개발이 진행 중이다.

이러한 배경 하에, 상기 확보한 E9 리피바디가 SARS-CoV2 RBD와 ACE2의 상호작용을 억제할 수 있는지를 효소결합 면역침강법 (ELISA)을 통해 확인하였다. 구체적으로, SARS-CoV2 스파이크 단백질을 코팅한 maxibinding 플레이트에 biotinylated-ACE2와 리피바디의 혼합하여 처리하였을 때 리피바디의 경쟁적 결합으로 인해 SARS-CoV2에 결합한 ACE2 의 양이 감소하는지를 확인하였다.

그 결과, 선별한 E9 리피바디를 처리한 경우에 농도에 비례하여 ACE2의 결합 신호가 감소하였으며, 이를 통해서 E9 리피바디의 항원 결정부위가 SARS-CoV2가 ACE2와 상호작용하는 부위임을 확인할 수 있었다(도 4).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KAIST <120> Novel polypeptide selective binding with receptor binding domain of SARS-CoV2 spike protein and uses thereof <130> P21-B038 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Repebody-Library_DNA <400> 1 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtta cctggccctg ggtggcaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaacct gacgnnkctg nnkctgnnkn nkaaccaact gcagagcctg 300 ccgaatggcg tctttgataa actgacgaac ctgaaagaac tggtgctggt tgaaaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggacgg tgtcttcgat aaactgacca acctgacgnn kctgnnkctg 420 nnknnkaacc aactgcagag tctgccgaaa ggcgtgtttg acaaactgac caatctgacg 480 gaactggatc tgtcctataa ccaactgcag tcactgccgg aaggtgtttt cgacaaactg 540 acccagctga aagatctgcg cctgtaccag aatcagctga aatcggtccc ggacggcgtg 600 tttgatcgtc tgaccagcct gcagtatatc 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Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Ser 225 230 235 240 Ser Val Val Ile Phe Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265

Claims

서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, 코로나바이러스 수용체 결합 도메인(ARS-CoV2 RBD)에 선택적으로 결합하는 리피바디(Repebody).
제1항에 있어서, 상기 리피바디는 코로나바이러스 수용체 결합 도메인에 결합하여 안지오텐신 전환효소2(ACE2)와의 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 리피바디.
제1항의 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제3항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제4항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
다음의 단계를 포함하는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, SARS-CoV2 RBD에 선택적으로 결합하는 리피바디의 제조방법:
(i) 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 생성된 리피바디를 회수하는 단계.
제1항 또는 제2항중 어느 한 항의 리피바디를 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료는 상기 리피바디가 코로나바이러스 수용체 결합 도메인과 결합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물.