KR102683360B1 - 사이토카인 및 항체를 발현하는 세포외 소포체, 이를 제조하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사이토카인 및 항체를 발현하는 세포외 소포체, 이를 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 사이토카인을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1벡터 및 항체를 암호화하는 유전자를 포함하는 제2벡터를 면역세포에 형질전환함으로써, 사이토카인 및 항체를 모두 세포막 표면에 발현하는 면역세포를 제조하고, 사이토카인 및 항체를 모두 표면에 발현하는 세포외 소포체를 상기 면역세포로부터 제조하는 방법을 제공하며, 타겟 세포에 따라 특정 사이토카인 또는 특정 항체가 발현될 수 있도록 제1벡터 및 제2벡터를 조합하여 특정 항체로 타겟할 수 있는 세포에 원하는 사이토카인 반응이 유도할 수 있고, 인체에 안전하면서 우수한 항암 효과를 나타내는 새로운 항암제로 상기 세포외 소포체를 제공하고, 본 발명의 상기 세포외 소포체의 내부에 암에 대한 치료 효과를 나타내는 약물 또는 생리활성물질을 봉입함으로써, 특정 암세포에 약물 또는 생리활성물질을 전달하는 용도로 활용될 수 있는 새로운 암 치료 수단을 제공한다.
Description
본 발명은 사이토카인 및 항체를 발현하는 세포외 소포체, 이를 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포외 소포체(Extracellular vesicle; EV)는 세포로부터 유래된 나노 사이즈의 소포체를 의미하며, 분비 형태 및 크기에 따라 엑소좀(exosomes), 마이크로베시클(microvesicles), 엑토좀(ectosomes), 마이크로파티클(microparticles), 막 소포체(membrane vesicles), 나노베시클(nanovesicles), 외막 소포체(outer membrane vesicles) 등으로 분류된다. 세포외 소포체는 세포의 주요 성분인 핵산 및 단백질을 포함하여 세포간 소통의 주요 수단이다.
최근에 암환자들에서 세포외 소포체의 분비량이 증가되는 경우가 보고되었으며, 암환자에서 특이적으로 나타나는 특정 단백질의 변화가 관찰됨에 따라, 세포외 소포체가 암을 진단하는 마커로 활용될 가능성이 주목되고 있다. 또한, 세포외 소포체는 인체 내에서 안정성이 높으며 면역 반응을 유발하지 않기 때문에, 내부의 약물을 포함하면 체내의 타겟 세포에 선택적으로 약물을 전달하는 것이 가능하며, 세포외 소포체를 다양한 세포로부터 분리 및 정제하는 것이 용이하므로 세포외 소포체를 약물 전달체로 활용하는 연구가 진행되고 있다.
한편, 암은 비정상적인 세포의 성장으로 발병되는 질환으로, 국내에서는 사망원인의 1위를 차지할 정도로 암 환자의 사망률이 높은 것으로 보고되었다. 암의 종류는 수십 종에 이르며, 주로 발병된 조직의 위치에 따라 암을 분류한다. 암은 양성종양과 악성종양으로 구분되는데, 양성종양은 비교적 성장 속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 이동되는 전이가 발생하지 않는 반면, 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특성을 가져 생명을 위협한다.
암의 치료 방법은 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법 등이 사용되고 있으나, 오랜 연구에도 불구하고 치료를 진행한 암 환자의 50% 이상이 사망한 것으로 보고되었다. 다양한 치료 방법들을 적용함에도 불구하고 암을 치료하는 것이 어려운 이유는 암 환자를 치료하기 위해 외과적 수술로 암을 제거하여도 환자의 다른 조직으로 암세포가 전이되어 암이 재발되거나, 초기 치료 단계에서는 항암제로 종양의 크기가 감소하다가 치료 도중 또는 치료가 끝난 이후에 항암제에 내성을 나타내는 암세포들로 인하여 암이 급격하게 악화되기 때문이다.
특히, 통상적으로 주로 사용되는 화학 요법인 항암제는 주로 암세포의 증식을 억제하는 기작을 통해 항암 효과를 나타내는 약물로 약 60여 종의 다양한 종류가 개발되었다. 그러나 대부분의 항암제는 암세포뿐만 아니라 정상 세포에도 비선택적으로 작용하기 때문에, 탈모, 극심한 피로감, 구토, 오심, 피부 및 손톱의 변색, 신경계 부작용 등의 심각한 부작용을 나타내는 문제가 있다.
기존의 항암제의 문제점을 극복하기 위해 암세포에 특이적으로 작용되는 치료 방법으로 표적 항암제, 면역세포를 이용한 항암 치료 등이 개발되었다. 그러나 이러한 치료 방법들은 환자의 특성에 따라 치료 효율의 차이나 나타나며, 면역계의 과도한 활성으로 인한 급성 염증 질환이 발병되는 등의 문제점이 해결되지 않았다. 따라서 암세포에 특이적인 새로운 치료 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 암의 새로운 치료 수단으로서 사이토카인 및 항체가 막 표면에 발현된 세포외 소포체를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 암의 새로운 치료 수단으로서 암에 치료 효과를 나타내는 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 상기 세포외 소포체를 포함하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포외 소포체를 포함하는 조성물로, 상기 세포외 소포체의 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포외 소포체를 제조하는 방법으로서, 사이토카인을 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 링커 도메인, 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 제1벡터를 제조하는 단계; 항체를 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 링커 도메인, 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 제2벡터를 제조하는 단계; 렌티 바이러스를 이용하여 상기 제1벡터 및 제2벡터로 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 제1벡터 및 제2벡터로 형질전환된 세포를 배양한 배양액으로부터 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 사이토카인을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1벡터 및 항체를 암호화하는 유전자를 포함하는 제2벡터를 면역세포에 형질전환함으로써, 사이토카인 및 항체를 모두 세포막 표면에 발현하는 면역세포를 제조하고, 사이토카인 및 항체를 모두 표면에 발현하는 세포외 소포체를 상기 면역세포로부터 제조할 수 있으며, 상기 세포외 소포체는 타겟 세포에 따라 특정 사이토카인 또는 특정 항체가 발현될 수 있도록 제1벡터 및 제2벡터를 조합하여 특정 항체로 타겟할 수 있는 세포에 원하는 사이토카인 반응이 유도할 수 있고, 인체에 안전하면서 우수한 항암 효과를 나타내는 새로운 항암제로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 세포외 소포체는 내부에 암에 대한 치료 효과를 나타내는 약물 또는 생리활성물질을 봉입함으로써, 특정 암세포에 약물 또는 생리활성물질을 전달하는 용도로 활용될 수 있으므로, 새로운 암 치료 수단으로 제공될 수 있다.
도 1은 본 발명의 세포외 소포체를 제조하기 위한 벡터의 구성 및 세포외 소포체를 제조하는 방법을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 세포외 소포체를 제조하기 위해 사용될 면역세포를 혈액 샘플에서 분리하고 그 특성을 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 세포외 소포체를 제조하기 위해 사이토카인 및/또는 항체가 발현되도록 형질전환된 면역세포에서 사이토카인 및/또는 항체가 발현되는지 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 세포외 소포체의 암세포 특이적 세포독성을 평가한 결과이다.
도 5는 사이토카인 IL-2의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 세포외 소포체에서 항체가 표면에 발현됨에 따른 암세포 특이성을 평가한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 세포외 소포체의 항체 특이성을 검증한 결과이다.
도 8은 형광염색된 세포외 소포체를 비소세포 폐암세포(A549) 이식 마우스에 처리 시, 암세포 특이적으로 타깃팅되는 것을 ‘형광, 발광 및 컴퓨터 단층 영상 장비 시스템’ 및 ‘공초점 형광 현미경’으로 확인한 것이다.
도 2는 본 발명의 세포외 소포체를 제조하기 위해 사용될 면역세포를 혈액 샘플에서 분리하고 그 특성을 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 세포외 소포체를 제조하기 위해 사이토카인 및/또는 항체가 발현되도록 형질전환된 면역세포에서 사이토카인 및/또는 항체가 발현되는지 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 세포외 소포체의 암세포 특이적 세포독성을 평가한 결과이다.
도 5는 사이토카인 IL-2의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 세포외 소포체에서 항체가 표면에 발현됨에 따른 암세포 특이성을 평가한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 세포외 소포체의 항체 특이성을 검증한 결과이다.
도 8은 형광염색된 세포외 소포체를 비소세포 폐암세포(A549) 이식 마우스에 처리 시, 암세포 특이적으로 타깃팅되는 것을 ‘형광, 발광 및 컴퓨터 단층 영상 장비 시스템’ 및 ‘공초점 형광 현미경’으로 확인한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
암세포에 특이적인 새로운 치료 방법의 개발이 요구됨에 따라 본 발명의 발명자들은 면역계를 활성화시키는 사이토카인과 암세포를 선택적으로 표적하는 항체가 표면에 발현된 세포외 소포체를 제조하고, 이의 암세포 특이적인 세포독성을 확인함으로써, 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 암의 예방 또는 치료용 수단, 및 약물 또는 생리활성물질 전달용 담체로 제공한다.
본 발명은 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 제공한다.
상기 세포외 소포체는 MBC(membrane bound cytokine) 플랫폼으로 제조될 수 있으며, 상기 MBC 플랫폼은 "사이토카인 또는 항체를 암호화하는 유전자-링커 도메인- 막관통 도메인"으로 구성되며, 이를 통해 상기 사이토카인 또는 항체는 막관통 단백질에 연결된 링커에 결합되어 세포 외부로 분비되지 않고 세포 막에 부착된 형태로 발현된다.
도 1과 같이, 본 발명에서는 면역세포에 MBC 플랫폼을 적용하여 특정 사이토카인 및 항체를 세포막 표면에 발현하는 면역세포를 제작하였고, 이를 통해 특정 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 제조하였다.
상기 세포외 소포체를 구성하는 인지질 이중막은 막관통 단백질을 포함하고, 상기 막관통 단백질은 링커를 통해 상기 사이토카인 또는 항체와 결합되어 있다. 구체적으로 상기 사이토카인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 IL-2이고, 상기 항체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 얼비툭스(Erbitux)의 scFv일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커는 서열번호 3 내지 13으로 표시되는 아미노산 서열들 중에서 선택된 어느 하나를 1 내지 20번 반복하는 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포외 소포체는 사이토카인 또는 항체를 암호화하는 유전자; 링커를 암호화하는 링커 도메인; 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 벡터;로 형질전환된 세포에서 유래된다.
구체적으로 상기 세포외 소포체를 제조하기 위한 벡터는 사이토카인인 IL-2(Interleukin-2) 또는 항체인 얼비툭스(Erbitux)의 scFv를 암호화하는 유전자를 포함하고, 상기 유전자의 말단은 링커 도메인 및 PDGF(platelet-derived growth factor) 수용체의 막관통 도메인이 순차적으로 연결된 형태를 가짐으로, 상기 벡터를 세포에 형질전환하여 발현하면, 사이토카인 또는 항체가 세포 외부로 분비되지 않고 막관통 단백질에 연결된 링커에 결합되기 때문에, 사이토카인 또는 항체가 형질전환된 세포막 표면에 부착된 형태로 발현된다.
상기 막관통 도메인은 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자(Platelet-derived growth factor; PDGF) 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin; CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor; NGF) 수용체, 간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor; HGF) 수용체, 에프린(Ephrin; Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체 및 RYK(Related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 수용체에 포함된 막관통 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포는 보조 T 세포, CD8+ T 세포, 수지상 세포, 호중구 세포, 호산구 세포, 호염기구 세포, 대식세포, 단핵구 세포, 자연살해세포, B 세포, 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 혈액줄기세포 및 유도만능줄기세포(iPSc)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포외 소포체는 암세포에 특이적인 세포 독성을 가짐으로써 항암 효과를 나타내며, 상기 세포외 소포체는 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 담체로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 흑색종, 결장암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 구체적으로 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있음. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함함. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포외 소포체를 포함하는 조성물로, 상기 세포외 소포체의 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 약물은 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 생리활성물질은 펩타이드, 단백질, 호르몬제 및 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 세포외 소포체를 제조하는 방법으로서, 사이토카인을 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 링커 도메인, 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 제1벡터를 제조하는 단계; 항체를 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 링커 도메인, 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 제2벡터를 제조하는 단계; 렌티 바이러스를 이용하여 상기 제1벡터 및 제2벡터로 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 제1벡터 및 제2벡터로 형질전환된 세포를 배양한 배양액으로부터 세포외 소포체를 분리하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 면역세포 분리
본 발명의 세포외 소포체를 제조하기 위해 사용될 면역세포로 인간 CD8+ T 림프구를 혈액으로부터 분리하였다. 항응고제가 처리된 혈액 샘플에 피콜(Ficoll)을 처리한 후 원심분리하여 백혈구연층(buffy coat)을 수득하였다. 분리된 백혈구연층은 10%의 우태아혈청, 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지(Hyclone)에서 하루 동안 배양한 후, 배지의 상등액에 현탁되어 있는 세포들을 수집하여 실험에 사용하였다. 제조사의 설명서에 따라 CD8+ T 림프구 분리용 키트인 human CD8+ T cell isolation kit (MACS)를 사용하여 수집된 세포로부터 primary CD8+ T 림프구를 분리하였다. 분리된 primary CD8+ T 림프구에 CD3-APC, CD8-FITC, 및 CD56-PE 항체(MACS)를 처리하고, 유세포 분석을 통해 CD8+ T 림프구가 80% 이상의 정확도로 분리되었음을 확인하였다(도 2).
실시예 2. 세포 배양
HEK-293FT 세포(인간 배아 신장 세포)는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(Hyclone)에서 배양하고, A549-luc 세포(인간 비소세포성 폐암 세포)는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지(Hyclone)에서 배양하였다. 인간 혈액에서 분리된 primary CD8+ T 림프구는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 50 IU/mL의 재조합 IL-2(R&D systems), CD3/CD28/CD2 T cell activator(STEMCELL)가 첨가된 RPMI 1640 배지(Hyclone)에서 배양하였다.
실시예 3. 렌티 바이러스 제조
본 발명에 따라 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 제조하기 위해, 사이토카인을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1벡터 및 항체를 암호화하는 유전자를 포함하는 제2벡터를 제조하고, 렌티 바이러스를 이용하여 두 벡터를 각각 세포에 형질전환하였다.
구체적으로 제1벡터는 사이토카인으로 IL-2를 암호화하는 유전자, 링커 도메인 및 PDGF 수용체의 막관통 도메인을 포함하고, 제2벡터는 갖는 얼비툭스(Erbitux)의 scFv를 암호화하는 유전자, 링커 도메인 및 PDGF 수용체의 막관통 도메인을 포함한다. 각 제1벡터 및 제2벡터는 논문(Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 May 14;110(20):8099-104)을 참조하여 제작하였다.
제조된 제1벡터 및 제2벡터로 세포를 형질전환하기 위해 사용될 렌티 바이러스는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. HEK-293FT 세포를 약 5 X 106 세포 농도로 DMEM(Hyclone) 배지가 담긴 100파이 플레이트에 접종하였다. pCMVD(# PS100001; Origene) 및 pVSVg(# 1733; Addgene) 바이러스 벡터를 상기 제1벡터 또는 제2벡터와 1:1:1의 비율로 혼합하였고, 제조사의 설명에 따라 Turbofect(Thermo fisher scientific) 사용하여 세포에 처리하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고, 10%의 우태아혈청, 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 신선한 DMEM 배지로 교체하였다. 48 시간 배양 후, 바이러스를 포함하는 배지 상등액을 수득하여 원심분리하고, 계면활성제가 없는 셀룰로오스 아세테이트(Surfactant-free cellulose acetate; SFCA) 막 여과 장치(0.45 μm; Corning)를 이용하여 세포 파편들을 제거하였다. 각 렌티 바이러스의 역가는 제조사의 설명서에 따라 Lenti-X p24 신속 역가 키트(# 632200; Takara)를 사용하여 측정하였다. 제1벡터를 포함하는 제1 렌티 바이러스 및 제2벡터를 포함하는 제2 렌티 바이러스는 각각 분주하여 -80℃에서 동결하여 보관하였다.
실시예 4. 렌티 바이러스를 이용한 면역세포의 형질전환
본 발명에 따른 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 제조하기 위해, 상기 실시예 3에서 제조된 렌티 바이러스들로 면역세포를 형질전환하였다.
형질전환된 면역세포를 제조하기 위해, 실시예 3에서 제조된 제1 렌티 바이러스 또는 제2 렌티 바이러스를 100 MOI(Multiplicity of infection) 농도로 10 μg/mL의 폴리브렌(polybrene)과 함께 primary CD8+ T 림프구에 처리되었다. 각 렌티 바이러스가 처리된 세포 혼합물을 30℃에서 1,200 g로 90분 동안 원심분리하여 회전접종(spinoculation)하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 여분의 바이러스를 제거하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 10% 우태아혈청을 포함하는 신선한 DMEM 배지로 교체하였다.
형질전환 되지 않은 림프구 C를 대조군으로 사용하고, IL-2 유전자를 포함하는 제1 렌티 바이러스로만 형질전환된 림프구 I, 얼비툭스(Erbitux)의 scFv 유전자를 포함하는 제2 렌티 바이러스로만 형질전환된 림프구 E, 및 상기 두 개의 렌티 바이러스로 모두 형질전환된 림프구 D로 표기하였다.
실시예 5. 형질전환된 면역세포에서 사이토카인 및 항체의 발현 확인
본 발명에 따른 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 제조하기 위해, 실시예 4에서 제조된 형질전환된 면역세포에서 사이토카인 및 항체가 발현되는지 확인하였다.
실시예 4에서 제1 렌티 바이러스 및/또는 제2 렌티 바이러스로 형질전환된 림프구들로부터 mRNA를 제조사의 설명서에 따라 키트(mRNA extraction kit, # 9767; TaKaRa)로 추출하고, 나노드롭(nanodrop, DS-11 Series Spectrophotometer; DeNovix)을 이용하여 추출된 mRNA의 농도를 측정하였다. 추출된 mRNA 100 ng을 제조사의 설명서에 따라 키트(SuperScript III First-Strand Synthesis System, Ref. 18080-051; invitrogen)로 cDNA로 합성하였다.
각 림프구들에서 IL-2 유전자 및/또는 얼비툭스(Erbitux)의 scFv 유전자의 발현 수준을 하기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)으로 분석하였다.
| 유전자 | 염기서열 | 서열번호 | |
| IL-2 | F | AGACCCAGGGACTTAATCAG | 14 |
| R | ACAATGGTTGCTGTCTCATC | 15 | |
| Erbitux | F | GGCCCAGCCGGCCAT | 16 |
| R | ATTTAGGCCCCCGAGGCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCA | 17 | |
도 3에 나타난 바와 같이, 대조군이 비해 형질전환된 림프구들에서는 각각 IL-2 유전자 발현은 약 104 배 증가하고, 얼비툭스(Erbitux)의 scFv 유전자의 발현 수준은 약 105 배 증가하는 것으로 확인되었다. 특히, 두 개의 렌티 바이러스로 모두 형질전환된 D 림프구에서는 IL-2 유전자 및/또는 얼비툭스(Erbitux)의 scFv 유전자의 발현 수준이 모두 증가하는 것으로 나타났다.
또한, 상기 primary CD8+ T 림프구에서 IL-2 및/또는 얼비툭스(Erbitux)의 발현 수준을 확인하기 위해 웨스턴 블랏으로 각 단백질 발현 수준을 측정하였다. 세포를 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 이후, 얼비툭스(Erbitux)의 일차 항체(R&D system, #MAB9626), FLAG의 일차 항체(CST, #8146), beta-Actin(CST, #4970)과 반응 후 HRP가 접합된 이차 항체로 반응하였다. Enhanced chemiluminescence(ECL) 검출 시약(# 34095; Thermo Scientific, # RPN2209; GE Healthcare)을 사용하여 이미지를 시각화하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 제1 렌티 바이러스로만 형질전환된 I 림프구에서는 IL-2만 발현되고, 제2 렌티 바이러스로만 형질전환된 E 림프구에서는 얼비툭스(Erbitux)만 발현되며, 두 개의 렌티 바이러스로 모두 형질전환된 D 림프구에서는 IL-2 및 얼비툭스(Erbitux)가 모두 발현되는 것으로 나타났다.
실시예 6. 세포외 소포체 분리정제
본 발명에 따른 사이토카인 및 항체를 표면에 발현하는 세포외 소포체를 제조하기 위해, 실시예 4에서 제조된 형질전환된 면역세포에서 세포외 소포체를 분리하였다.
실시예 4의 대조군 C 림프구 또는 형질전환된 D 림프구를 각각 1 x 106 세포/ml 농도로 우태아혈청이 포함되지 않은 RPMI 배지에 접종하고 72 시간 배양하였다. 각 세포를 배양한 배양액의 상등액을 300 g, 2,500 g, 및 10,000 g로 순차적으로 연속 원심분리하였다. 원심분리된 상등액을 0.2 μm 주사기 필터로 여과하고, 120,000 g에서 원심분리하여 세포외 소포체의 펠릿을 수득하였다. 수득된 펠릿은 PBS에 현탁하고, -80℃에서 동결 보존하였다.
형질전환 되지 않은 림프구 C로부터 수득한 세포외 소포체를 CE로, 제1 및 제2 렌티 바이러스들로 형질전환된 림프구 D부터 수득한 세포외 소포체를 DE로 표기하였다.
실시예 7. 세포외 소포체에 의한 암세포 특이적 세포 독성 분석
본 발명에 따라 제조된 세포외 소포체의 암세포 특이적 세포 독성을 평가하기 위해, 암세포 또는 정상세포에 대한 세포외 소포체의 세포독성을 분석하였다.
인간 비소세포성 폐암세포인 A549-luc 세포와 정상 세포인 HEK 세포를 각각 5 x 103 세포/well의 농도로 96 well plate에 하루 동안 배양하였다. 실시예 6에서 제조된 세포외 소포체를 각각 0 ng/ml, 10 ng/ml, 또는 100 ng/ml 농도로 세포에 처리하고 48 시간 배양하였다. 세포 사멸 정도는 CellTiter 96 AQueous Assay(Promega, #G5421)로 분석하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 정상 세포인 HEK 세포에서는 세포외 소포체를 처리하여도 세포가 사멸되지 않았으나, 암세포인 A549-luc 세포에서는 세포외 소포체를 처리함에 따라 세포가 사멸되는 것으로 나타났다. 특히, 형질전환 되지 않은 림프구 C로부터 수득한 세포외 소포체 CE로 처리하는 경우 보다 제1 및 제2 렌티 바이러스들로 형질전환된 림프구 D부터 수득한 세포외 소포체 DE로 처리하는 경우, 암세포가 사멸되는 정도가 더 크게 나타났다.
상기 결과는 본 발명의 세포외 소포체는 암세포만 사멸시키는 암세포 특이적 세포독성을 나타내기 때문에, 정상세포에 영향을 주지 않고 암세포만 제거할 수 있는 안전한 항암제로 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 8. IL-2에 의한 세포 독성 분석
상기 실시예 7에서 나타난 세포독성이 IL-2에 의한 것인지 확인하기 위해, 세포외 소포체 대신 IL-2를 처리하는 것을 제외하고 실시예 7과 동일한 방법으로 세포 독성을 평가하였다.
인간 비소세포성 폐암세포인 A549-luc 세포와 정상 세포인 HEK 세포를 각각 5 x 103 세포/well의 농도로 96 well plate에 하루 동안 배양하였다. 실시예 6에서 제조된 IL-2를 각각 0 IU/ml, 10 IU/ml, 또는 100 IU/ml 농도로 세포에 처리하고 48 시간 배양하였다. 세포 사멸 정도는 CellTiter 96 AQueous Assay(Promega, #G5421)로 분석하였다.
도 5에서 나타난 바와 같이, IL-2는 암세포 혹은 정상세포 모두에서 세포 독성을 보이지 않았으며, 상기 실시예 7에서 나타난 세포독성은 세포외 소포체의 표면에 발현된 IL-2에 의한 것이 아니며, 세포외 소포체 자체에 암세포 특이적 세포독성을 나타내는 것이 확인되었다.
실시예 9. 항체가 표면에 발현된 세포외 소포체의 암세포 특이성 평가
본 발명에 따라 항체가 표면에 발현된 세포외 소포체의 암세포 특이성 평가하기 위해, 실시예 6의 세포외 소포체에 형광을 표지하여 암세포의 특이성을 분석하였다.
인간 비소세포성 폐암세포인 A549-luc 세포 및 정상 세포인 HEK 세포를 1 x 104 세포/well의 농도로 8 well chamber에 하루 동안 배양하였다. 배양된 세포에 DID(Molecular Probes, #V-22887)로 염색된 세포외 소포체를 100 ng/ml의 농도로 3 시간 처리하였다. 이 후 세포를 인산완충식염수(PBS)로 1회 세척하고, 4% 포름알데하이드로 고정하고, 식염수로 3회 세척 후, 핵을 염색하기 위해 DAPI를 처리하였다. 공초점 현미경을 이용하여 염색된 세포 이미지를 분석하였다.
또한, 인간 비소세포성 폐암세포인 A549-luc 세포 및 정상 세포인 HEK 세포를 1 x 104 세포/well의 농도로 12 well plate에 배양하고, DID(Molecular Probes, #V-22887)로 염색된 세포외 소포체를 100 ng/ml의 농도로 하고, 상기와 동일한 과정으로 세척 및 고정한 후 유세포 분석기로 분석하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 형질전환 되지 않은 림프구 C로부터 수득한 세포외 소포체(Con-EV) 및 제1 렌티 바이러스로만 형질전환된 림프구 I로부터 수득한 세포외 소포체(IL2-EV)로 처리된 경우에서는 세포외 소포체가 정상세포 또는 암세포에 결합되지 않아 관찰되지 않았으며, 제1 및 제2 렌티 바이러스들로 형질전환된 림프구 D부터 수득한 세포외 소포체(Double-EV)로 처리된 경우 암세포에서만 DID로 염색된 세포외 소포체가 세포에 결합된 것이 관찰되었다.
이는 표면에 항체를 발현하는 세포외 소포체(Double-EV)만이 암세포를 인지하여 결합된 것이며, 암세포 특이성을 갖는 것을 입증한다.
실시예 10. 항체가 표면에 발현된 세포외 소포체의 암세포 특이성 검증
본 발명에 따라 항체가 표면에 발현된 세포외 소포체의 암세포 특이성 검증하기 위해, 세포외 소포체를 처리하기 전 경쟁적 항체를 처리하고 세포외 소포체의 암세포 특이성이 유지되는지 분석하였다.
실시예 6에서 제조된 세포외 소포체는 항체로 얼비툭스(Erbitux)의 scFv를 발현하고 있으며, 얼비툭스(Erbitux)의 scFv는 암세포에서 과발현되는 EGFR(pidermal growth factor receptor)에 결합한다. 따라서 상기 세포외 소포체에서 항체에 따른 암세포 특이성을 검증하기 위해 EGFR에 경쟁적으로 결합하는 항체를 이용하였다.
인간 비소세포성 폐암세포인 A549-luc 세포 및 정상 세포인 HEK 세포를 1 x 104 세포/well의 농도로 8 well chamber에 배양하였다. EGFR에 특이적으로 결합하는 경쟁적 항체를 각 세포에 1 시간 선처리하고, 이 후 DID(Molecular Probes, #V-22887)로 염색된 세포외 소포체를 100 ng/ml의 농도로 3 시간 처리하였다. 세포를 인산완충식염수(PBS)로 1회 세척하고, 4% 포름알데하이드로 고정하였다. 이후 식염수로 3회 세척 후, human Fc를 인식하는 2차 항체(FITC 형광 부착)와 상온에서 1시간 동안 반응 후 식염수로 3회 세척되었다. 식염수로 3회 세척 후, 핵을 염색하기 위해 DAPI를 처리하였다. 공초점 현미경을 이용하여 염색된 세포 이미지를 분석하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 항체를 발현하는 세포외 소포체는 실시예 9와 동일하게 암세포 특이성이 유지되는 것으로 나타났지만, EGFR에 특이적으로 결합하는 경쟁적 항체로 선처리된 암세포에서는 세포외 소포체가 관찰되지 않았다. 이는 경쟁적 항체로 인해 암세포의 EGFR가 가려질 경우, 세포외 소포체가 암세포를 인지하지 못하는 것을 의미한다. 따라서 상기 결과는 본 발명의 세포외 소포체는 표면에 발현된 항체에 의해 암세포를 타겟팅한다는 것을 입증한다.
실시예 11. 동물모델에서의 세포외 소포체의 항체 특이적 타깃팅 검증
표면에 부착된 항체에 의해 암세포 특이적 타깃팅이 가능하다는 것을 검증하기 위해, 형광염색된 세포외 소포체를 비소세포성 폐암 세포주(A549) 이식 마우스 모델에 처리하였다.
BALB/c 누드 마우스(수컷, 6주령)를 구입 후 1주의 안정화를 거친 후 비소세포성 폐암 세포주(A549)를 5 x 106 세포/마우스의 수로 피하주입(subcutaneous injection)하고 종양의 부피가 100 mm3이 될 때까지 기다렸다. 종양의 부피는 장축 x (단축)2 x 0.5 로 계산하였다. 종양의 부피가 100 mm3가 된 후에는 DID(Molecular Probes, #V-22887)에 의해 염색된 세포외 소포체 20 ug을 마우스 미정맥(tail vein injection)을 통하여 주입하였다. 세포외 소포체 주입 24 시간 후, 경추탈골을 통해 마우스들을 sacrifice한 후, 각 장기들(종양, 심장, 폐, 간, 비장, 그리고 콩팥)을 dissection하여 ‘형광, 발광 및 컴퓨터 단층 영상 장비 시스템(IVIS)’을 이용하여 형광세기를 관찰하였다. 그 결과 도 8의 왼쪽 이미지에서 볼 수 있듯이 표면에 항체를 발현하는 세포외 소포체(DE)가 종양에 더 많이 전달되어 강한 형광을 보이는 것을 확인할 수 있었다. (PBS; 인산완충생리식염수 주입 대조군, CE; 대조군 세포외 소포체 처리 그룹, DE; IL-2와 Erbitux를 동시에 발현하는 세포외 소포체 처리 그룹)
또한 종양의 동결절편을 제작하기 위해, 종양을 4% 포름알데하이드로 고정 후 PBS로 3회 세척하였으며, 그 후 30% sucrose 용액에서 over night으로 incubation하였다. 그 후 종양을 OCT compound으로 -20℃에서 고정, 냉동 절편 후 슬라이드에 위치시키고 DAPI로 핵 염색 후 공초점 형광 현미경을 통해서 형광세기를 분석하였다. 그 결과 도 8의 오른쪽 이미지에서 볼 수 있듯이, 표면에 항체를 발현하는 세포외 소포체(DE)가 종양의 냉동절편의 단면에서 더 많이 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. (PBS; 인산완충생리식염수 주입 대조군, CE; 대조군 세포외 소포체 처리 그룹, DE; IL-2와 Erbitux를 동시에 발현하는 세포외 소포체 처리 그룹)
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Kyungpook National University
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of preparing the same, and Use of the same
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<160> 17
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2
<400> 1
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 2
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E-scFv
<400> 2
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr
165 170 175
Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
180 185 190
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Lys
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-1
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-2
<400> 4
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-3
<400> 5
Ser Arg Ser Ser Gly
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-4
<400> 6
Ser Gly Ser Ser Cys
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-5
<400> 7
Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-6
<400> 8
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 9
Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys
1 5
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 10
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-9
<400> 11
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-10
<400> 12
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker-11
<400> 13
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe
1 5 10
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2-f
<400> 14
agacccaggg acttaatcag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2-r
<400> 15
acaatggttg ctgtctcatc 20
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erbituxc-f
<400> 16
ggcccagccg gccat 15
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Erbituxc-r
<400> 17
atttaggccc ccgaggcctt tcagctccag cttggtccca 40
Claims (14)
- 사이토카인 및 항체를 표면에 동시에 발현하는 세포외 소포체로,
상기 사이토카인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 IL-2이고,
상기 세포외 소포체는 T 세포에서 유래된 것이고,
상기 세포외 소포체는 암세포에 특이적인 세포 독성을 가짐으로써 항암 효과를 나타내는 암세포 사멸용 세포외 소포체. - 제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체를 구성하는 인지질 이중막은 막관통 단백질을 포함하고, 상기 막관통 단백질은 링커를 통해 상기 사이토카인 또는 항체와 결합된 것을 특징으로 하는 세포외 소포체.
- 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 얼비툭스(Erbitux)의 scFv인 것을 특징으로 하는 세포외 소포체.
- 제2항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 3 내지 13으로 표시되는 아미노산 서열들 중에서 선택된 어느 하나를 1 내지 20번 반복하는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포외 소포체.
- 제2항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 사이토카인 또는 항체를 암호화하는 유전자; 링커를 암호화하는 링커 도메인; 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 벡터;로 형질전환된 T 세포에서 유래된 것을 특징으로 하는 세포외 소포체.
- 제5항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자(Platelet-derived growth factor; PDGF) 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin; CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor; NGF) 수용체, 간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor; HGF) 수용체, 에프린(Ephrin; Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체 및 RYK(Related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 수용체에 포함된 막관통 도메인인 것을 특징으로 하는 세포외 소포체.
- 제5항에 있어서, 상기 T 세포는 보조 T 세포, 또는 CD8+ T 세포인 것을 특징으로 하는 세포외 소포체.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 담체로 사용되는 것을 특징으로 하는 세포외 소포체.
- 제1항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 결장암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 세포외 소포체를 포함하는 조성물로, 상기 세포외 소포체의 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 생리활성물질은 펩타이드, 단백질, 호르몬제 및 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.
- 제1항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 세포외 소포체를 제조하는 방법으로서,
사이토카인을 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 링커 도메인, 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 제1벡터를 제조하는 단계;
항체를 암호화하는 유전자, 링커를 암호화하는 링커 도메인, 및 막관통 단백질를 암호화하는 막관통 도메인을 포함하는 제2벡터를 제조하는 단계;
렌티 바이러스를 이용하여 상기 제1벡터 및 제2벡터로 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 제1벡터 및 제2벡터로 형질전환된 세포를 배양한 배양액으로부터 세포외 소포체를 분리하는 단계;를 포함하는 방법.
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-
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Non-Patent Citations (4)
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|---|
| Blood Cells Mol Dis. 2005 Sep-Oct,35(2):158-68. |
| J Immunother. 2016 Feb-Mar, 39(2):60-70. |
| Nat Commun. 2019 Sep 25,10(1):4355. |
| PLoS One. 2012, 7(11): e49723. |
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