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KR102685748B1 - 항암 융합 폴리펩타이드 - Google Patents

항암 융합 폴리펩타이드 Download PDF

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KR102685748B1
KR102685748B1 KR1020177035641A KR20177035641A KR102685748B1 KR 102685748 B1 KR102685748 B1 KR 102685748B1 KR 1020177035641 A KR1020177035641 A KR 1020177035641A KR 20177035641 A KR20177035641 A KR 20177035641A KR 102685748 B1 KR102685748 B1 KR 102685748B1
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피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하
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Abstract

본 개시물은 CD137 및 GPC3 모두에 특이적인 융합 폴리펩타이드를 제공하며, 융합 폴리펩타이드는 GPC3-양성 종양 세포에 CD137 클러스터링과 활성화를 유도하는데 유용할 수 있다. 그러한 융합 폴리펩타이드는 예를 들어 각종 종양들과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방을 위한 항암제 및/또는 면역조절제로서 많은 약학적 적용에 사용될 수 있다. 본 개시물은 또한 여기에 기술된 융합 폴리펩타이드를 제조하는 방법 및 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시물은 또한 그러한 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 및 그러한 융합 폴리펩타이드 및 핵산 분자의 생성 방법에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 하나 이상의 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물뿐만 아니라 그러한 융합 폴리폴리펩타이드의 치료적 및/또는 진단적 용도를 개시한다.

Description

항암 융합 폴리펩타이드
글리피칸-3(Glypican-3, GPC3)은 글리코실-포스파티딜이노시톨이 고정된 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(glycosyl-phosphatidylinositol-anchored heparin sulfate proteoglycans)의 글리피칸 패밀리에 속하는 종양태아성 항원(oncofetal antigen)이다. GPC3는 발생 동안 태아 간 및 태반에서 발현되고 정상 성인 조직에서 하향-조절되거나 침묵된다. GPC3 유전자에서 돌연변이 및 고갈은 인간의 Simpson-Golabi-Behmel 또는 심슨 변형장애 증후군의 원인이 된다. GPC3는 다양한 암 그리고 특히 간세포 암종("HCC"), 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종에서 발현된다(He, H. et al Applied Immunohistochem Mol Morphol. 17:40-6 (2009); Jakubovic and Jothy; Ex. MoI. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)). HCC는 전 세계적으로 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인이다. HCC는 매년 약 백만 명이 사망한다(Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)).
HCC와 같은 GPC3 발현 암들에 대한 효과적인 치료는 GPC3를 표적으로 하고 또한 항-종양 효과를 생산하는 치료 화합물을 필요로 한다.
CD137은 보조-자극 면역 수용체이며 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor, TNFR) 슈퍼 패밀리의 구성원이다. 주로 활성화된 CD4+T 및 CD8+T 세포, 활성화된 B 세포 및 자연살해(NK) 세포에서 발현되나 휴지기 단핵세포 및 수지상세포(Li, S. Y. et al., Clin Pharmacol 2013 5(Suppl 1):47-53) 또는 내피세포(Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244(1):197-217)에서도 발견될 수 있다. CD137은 면역 반응 조절에 중요한 역할을 담당하므로 암 면역요법의 표적이 된다. CD137 리간드(CD137L)는 CD137의 유일하게 알려진 천연 리간드이며, 활성화된 B 세포, 단핵세포 및 비장의 수지상세포와 같은 몇 가지 유형의 APC에서 구성 요소로서 발현되며, T 림프구에서 유도될 수 있다.
CD137L은 멤브레인 결합 형태 그리고 가용성 변이체로 존재하는 삼량체 단백질이다. 그러나 가용성 CD137L이 CD137을 활성화하는 능력은 예를 들어, CD137 발현 림프구에 한정되며, 효과를 유도하기 위해서는 큰 농도가 요구된다(Wyzgol, A. et al., J Immunol 2009 Aug 1; 183(3):1851-1861). 자연적으로 CD137을 활성화하는 방식은 CD137-양성 세포와 CD137L-양성 세포를 결합시키는 것이다. 곧이어, CD137 활성화는 TRAF1, 2 및 3을 통한 신호전달(Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244(1):197-217, Yao, S. et al., Nat Rev Drug Disc 2013 Feb; 12(2):130-146) 및 CD137 양성 T 세포에서 추가적인 동반 후속 효과들을 유도하여 대립 세포 상에서 CD137L를 통한 클러스터링에 의해 유도되는 것으로 생각된다. 그들의 각각의 동족 표적을 인식함으로써 활성화된 T-세포의 경우, CD137의 보조자극에 의해 유도된 효과들은 더욱 향상된 활성화, 향상된 생존 및 증식, 전-염증성 사이토카인의 생산 및 개선된 살상 능력이다.
암세포의 제거를 위한 CD137 보조자극의 이점은 여러 가지 전임상 인-비보 모델에서 입증되었다. 예를 들어, 종양에 대한 CD137L의 강제 발현은 종양 거부를 유도한다(Melero, I. et al., Eur J Immunol 1998 Mar; 28(3):1116-1121). 마찬가지로, 종양에 대한 항-CD137 scFv의 강제 발현은 종양의 CD4+ T-세포 및 NK-세포 의존적 제거를 초래한다(Ye, Z. et al., Nat Med 2002 Apr; 8(4):343-348, Zhang, H. et al., Mol Canc Ther 2006 Jan; 5(1):149-155, Yang, Y. et al., Canc Res 2007 Mar 1; 67(5):2339-2344). 전신 투여된 항-CD137 항체 역시 종양 성장의 지연을 초래하는 것으로 입증되었다(Martinet, O. et al., Gene Ther 2002 Jun; 9(12):786-792).
CD137은 인간 종양에서 자연적으로 발생하는 종양-반응성 T 세포에 대한 우수한 마커이며(Ye, Q. et al., Clin Canc Res: 2014 Jan 1; 20(1):44-55), 항-CD137 항체들은 입양 T-세포 요법에 적용하기 위한 CD8+ 흑색종 종양 침윤 림프구의 확장 및 활성을 개선하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다(Chacon, J. A. et al., PloS One 2013 8(4):e60031).
CD137 보조자극의 잠재적 치료 이점에 대한 전임상 입증은 CD137, BMS-663513(Jure-Kunkel, M. et al., 미국특허 제7288638호) 및 PF-05082566(Fisher, T. S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61(10):1721-1733)를 표적으로 하는 치료 항체들의 개발을 촉진시켰다; 둘 다 현재 초기 임상 시험 중이다.
그러나 항체와 같은 2가 CD137-바인더는 그 자체로 T-세포 또는 NK-세포 상에 CD137을 클러스터링하기에 충분하지 않고, 활성이 결여된 3가의 가용성 CD137L과 유사하게 효율적인 활성화를 유도한다는 것이 최근에서야 평가되었다. 전임상 마우스 모델을 이용한 최근 간행물들에서, 다른 항-TNFR 항체들의 작용 방식이 사실상 Fc-감마-수용체 발현 세포 상에서 Fc-감마 수용체들과 그들의 Fc-부분을 통한 항체들의 상호작용을 필요로 한다는 생체 내 증거가 제시되었다(Bulliard, Y. et al., J Exp Med 2013 Aug 26; 210(9):1685-1693, Bulliard, Y. et al., Immunol Cell Biol 2014 Jul; 92(6):475-480). 따라서 현재 임상 개발 중인 항체들의 작용 방식은 종양 부근의 Fc-γ-발현 세포의 존재에 거의 무작위적으로 의존할 수 있는 Fc-감마 수용체들을 통한 비-표적화된 클러스터링이 지배적일 수 있다.
따라서, 특정 종양을 표적으로 하는 작용 방식으로 CD137을 클러스터링하고 활성화하는 치료제의 생성에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
이러한 충족되지 않은 요구를 충족하기 위해, 본 출원은 다음 특성들이 있는 융합 폴리펩타이드를 통해 CD137 및 종양 항원 GPC3를 동시에 결합시키는 신규한 접근법을 제공한다:
(a) CD137에 대한 결합 특이도; 및
(b) GPC3에 대한 결합 특이도
이 융합 폴리펩타이드는 종양 세포에서 발현되는 GPC3를 통해 림프구에서 CD137의 종양-표적-의존적 활성화를 제공하도록 설계된다. 그러한 분자는 GPC3 양성 종양 근처에 위치한 T 세포 및/또는 NK 세포를 추가로 활성화할 것으로 기대된다. 그러한 이중특이성은 항-GPC3 또는 항-CD137 항체들보다 개선된 치료 효과를 나타낼 수 있다.
정의
다음 목록은 본 명세서 전반에 사용된 용어, 문구 및 약어를 정의한다. 여기에서 나열되고 정의된 모든 용어는 모든 문법적 형태를 포함하고자 한다.
여기에 사용된 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, "CD137"은 인간 CD137을 의미하며, 인간 CD137의 변이체, 이성질체 및 종 상동체들을 포함한다. CD137은 "4-1BB" 또는 "tumor necrosis factor receptor superfamily member 9(TNFRSF9)" 또는 "induced by lymphocyte activation(ILA)"라고도 한다. 인간 CD137은 UniProt Q07011에 정의된 전장 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, "GPC3"는 인간 GPC3를 의미하고, 인간 GPC3의 변이체, 이성질체 및 종 상동체들을 포함한다. GPC3는 "Glypican-3", "glypican proteoglycan 3", "GPC3", "OTTHUMP00000062492", "GTR2-2" "SGB", "DGSX", "SDYS", "SGBS", "OCI-5" 및 "SGBSl"라고도 하며, 상호교환적으로 사용된다. 인간 GPC3는 UniProt P51654에 정의된 전장 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 의미한다. 여기에 사용된 바와 같이, "검출 가능한 친화도"는 일반적으로 적어도 약 10-5 M 이하의 친화도 상수로 선택된 표적에 결합하는 능력을 의미한다. 낮은 친화도는 일반적으로 ELISA와 같은 일반적인 방법들로는 더는 측정할 수 없어 2차적으로 중요하다.
여기에 사용된 바와 같이, 선택된 표적(이 경우, CD137 및/또는 GPC3)에 대한 본 개시물의 단백질(예를 들어, 리포칼린의 뮤테인) 또는 이의 융합 폴리펩타이드의 "결합 친화도"는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다(따라서, 뮤테인-리간드 복합체의 KD 값이 측정됨). 그러한 방법들은 형광 적정, 경쟁적 ELISA, 등온 적정 열량계(ITC)와 같은 열량 측정 방법들 그리고 표면 플라즈몬 공명(BIAcore)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 그러한 방법들은 당업계에 잘 확립되어 있으며, 이의 예시들 역시 아래 구체적으로 기재되어 있다.
또한, 각각의 바인더 및 그의 리간드 간의 복합체 형성은 각각의 결합 파트너의 농도, 경쟁자의 존재, pH 및 사용된 버퍼 시스템의 이온 강도 및 해리 상수 KD의 측정에 사용된 실험 방법(예를 들어, 형광 적정, 경쟁적 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 등) 또는 심지어 실험 데이터의 평가에 사용되는 수학적 알고리즘과 같은 많은 상이한 인자들에 의해 영향을 받는다는 것을 특히 덧붙인다.
따라서, KD 값(각각의 바인더와 그의 표적/리간드 간에 형성된 복합체의 해리 상수)이 주어진 리간드에 대한 특정 리포칼린 뮤테인의 친화도를 측정하는데 사용되는 방법과 실험 설정에 의존하여 특정 실험 범위 내에서 변할 수 있음은 숙련된 자에게 역시 명백하다. 이는 KD 값이 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(Biacore), 경쟁적 ELISA 또는 직접 ELISA에 의해 측정되는지에 따라 측정된 KD 값 또는 저항 범위에서 약간의 오차가 있을 수 있음을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, "뮤테인", "돌연변이 된" 존재(단백질 또는 핵산인지 여부), 또는 "돌연변이체"는 자연적으로 발생하는(야생형) 핵산 또는 단백질 "레퍼런스" 스캐폴드와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 상기 용어는 또한 여기에 기술된 바와 같이 뮤테인의 단편들 및 변이체들을 포함한다. 본 발명의 리포칼린 뮤테인, 이의 단편 또는 변이체들은 바람직하게는 여기에 기술된 바와 같이 CD137 및/또는 GPC3에 결합하는 기능을 보유한다.
여기에 사용된 용어 "단편"은 본 개시물의 뮤테인과 관련하여 N-말단 및/또는 C-말단이 짧아진 즉, N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 중 적어도 하나가 결핍된 전장의 성숙한 인간 눈물 리포칼린 또는 인간 리포칼린 2로부터 유래된 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 그러한 단편들은 성숙한 리포칼린의 1차 서열의 적어도 10개, 20개 또는 30개 이상의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있고, 보통 성숙한 리포칼린의 면역분석법으로 검출할 수 있다. 일반적으로, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인 또는 본 개시물에 따른 조합 또는 여기에 기술된 융합 단백질의 대응하는 단백질 리간드 CD137 및/또는 GPC3와 관련하여 여기에 기재된 용어 "단편"은 본 개시물에 따른 뮤테인에 의해 인식되거나 및/또는 결합되는 전장 리간드의 능력을 보유하는 N-말단 및/또는 C-말단이 짧아진 단백질 또는 펩타이드 리간드에 관한 것이다.
여기에 사용된 용어 "돌연변이 유발"은 성숙한 리포칼린의 주어진 서열 위치에서 자연적으로 발생하는 아미노산이 각각의 천연 폴리펩타이드 서열에서 이 특정 위치에는 존재하지 않은 적어도 하나의 아미노산에 의해 치환될 수 있도록 실험 조건이 선택된다는 것을 의미한다. 용어 "돌연변이 유발"은 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의해 서열 세그먼트의 길이의 (부가적인)변형 역시 포함한다. 따라서, 예를 들어, 선택된 서열 위치에서 하나의 아미노산이 3개의 무작위 돌연변이의 스트레치로 대체되어 야생형 단백질의 각 세그먼트의 길이와 비교하여 2개의 아미노산 잔기의 삽입을 유도하는 것은 본 개시물의 범주에 내에 있다. 그러한 삽입 또는 결실은 본 개시물에서 돌연변이 유발에 적용될 수 있는 임의의 펩타이드 세그먼트에서 서로 독립적으로 도입될 수 있다. 본 개시물의 하나의 예시적인 구현예에서, 선택된 리포칼린 스캐폴드의 루프 AB에 몇 가지 돌연변이의 삽입이 도입될 수 있다(참고. 국제특허출원 제WO2005/019256호, 여기에 그 전체가 참고로 포함됨).
용어 "무작위 돌연변이 유발"은 특정 서열 위치에서 미리 결정된 단일 아미노산(돌연변이)이 존재하지 않지만 돌연변이 유발 동안 내정된 서열 위치에서 적어도 두 개의 아미노산이 특정 확률로 포함될 수 있음을 의미한다.
"동일성"은 그들의 유사성 또는 관계를 측정하는 서열의 특성이다. 본 개시물에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 본 개시물의 폴리펩타이드의 서열을 문제의 서열과 (대응하는) 정렬 후 이들 두 서열 중 더 긴 부분에 있는 잔기의 수와 관련하여 쌍으로 동일한 잔기들의 비율을 의미한다. 서열 동일성은 동일한 아미노산 잔기의 수를 총 잔기의 수로 나누고 생성물에 100을 곱하여 측정한다.
용어 "상동성"은 여기에서 그것의 통상적인 의미로 사용되며, 본 개시물의 폴리펩타이드의 선형 아미노산 서열(예를 들어, 본 개시물의 임의의 리포칼린 뮤테인)에서 동등한 위치에서 보존적 치환(예를 들어, 글루타메이트 잔기가 아스파테이트 잔기로 교환)으로 간주되는 아미노산뿐만 아니라 동일한 아미노산을 포함한다.
서열 상동성 또는 서열 동일성의 비율은 여기에서 예를 들어, BLASTP 프로그램, version blastp 2.2.5를 사용하여 측정될 수 있다(November 16, 2002; cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl . Acids Res. 25, 3389-3402). 이 구현예에서, 상동성의 비율은 바람직하게는 야생형 단백질 스캐폴드를 쌍 비교에서 레퍼런스로 사용하여 프로펩타이드 서열을 포함하는 전체 폴리펩타이드 서열의 정렬(매트릭스: BLOSUM 62; 갭 코스트: 11.1; 컷오프 값은 10- 3로 설정)에 기초한다. BLASTP 프로그램 결과를 정렬을 위해 프로그램에서 선택된 아미노산의 총수로 나눈 값으로 표시되는 "양"의 수(일치하는 아미노산)의 백분율로 계산된다.
특히 야생형 리포칼린과 상이한 리포칼린(뮤테인)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 야생형 리포칼린의 아미노산 서열에서 특정 위치에 대응하는지를 측정하기 위해, 숙련된 기술자는 당업계에 널리 공지된 수단과 방법들, 예를 들어, 수동으로 또는 Basic Local Alignment Search Tool 또는 ClustalW를 나타내는 BLAST2.0 또는 서열 정렬을 생성하기에 적합한 임의의 다른 적합한 프로그램과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용한 정렬을 사용할 수 있다. 따라서, 야생형 리포칼린은 "대상 서열" 또는 "레퍼런스 서열"로 제공할 수 있고, 여기에 기술된 야생형 리포칼린과 상이한 리포칼린의 아미노산 서열은 "질의 서열"로 제공한다. 용어 "레퍼런스 서열" 및 "야생형 서열"은 여기에서 상호교환적으로 사용된다. 바람직한 야생형 리포칼린은 각각 SEQ ID NO: 1(Tlc) 또는 SEQ ID NO: 2(NGAL)에 제시되어 있다. 본 발명의 리포칼린 뮤테인이 각각 Tlc 또는 NGAL에 기초하는지에 따라 대응하는 야생형 리포칼린의 레퍼런스 서열 또는 야생형 서열로 사용될 수 있다.
"갭"은 아미노산의 첨가 또는 결실의 결과인 정렬에서 공백이다. 따라서, 정확하게 동일한 서열의 두 개의 복제물은 100% 동일성을 갖지만, 덜 고도로 보존되고 결실, 첨가 또는 대체를 가진 서열은 더 낮은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다. 당업자는 몇몇 컴퓨터 프로그램들을 표준 파라미터를 사용한 서열 동일성 측정에 이용할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, Blast(Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402), Blast2(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410) 및 Smith-Waterman(Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197).
본 개시물에 사용된 용어 "변이체"는 예를 들어, 치환, 결실, 삽입 또는 화학적 변형에 의한 아미노산 서열의 변형을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 유도체들 관한 것이다. 그러한 변형은 일부 구현예들에서, 단백질 또는 펩타이드의 기능을 감소시키지 않는다. 그러한 변이체들은 하나 이상의 아미노산이 그들의 각각의 D-입체이성질체에 의해 대체되거나, 자연적으로 발생하는 20개의 아미노산 이외의 아미노산들, 예를 들어, 오르니틴, 하이드록시프롤린, 시트룰린, 호모세린, 하이드록시라이신, 노르발린에 의해 대체된 단백질들을 포함한다. 그러나 그러한 치환들 역시 보존적일 수도 있는데, 즉, 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 대체된다. 보존적 치환들의 예는 다음 그룹의 구성원 간의 교체이다: 1) 알라닌, 세린 및 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 라이신; 5) 이소루신, 루신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 본 개시물의 리포칼린 뮤테인 또는 본 개시물에 따른 조합 또는 여기에 기술된 융합 단백질의 대응하는 단백질 리간드 CD137 및/또는 GPC3와 관련하여, 여기에 기술된 바와 같이 UniProt에 기탁된 CD137 또는 GPC3 레퍼런스 단백질과 같은 야생형 CD137 또는 GPC3와 각각 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입과 같이 하나 이상을 갖는 각각 CD137 또는 이의 단편에 관한 것이다. CD137 변이체 각각은 바람직하게는 여기에 기술된 바와 같이 UniProt에 기탁된 CD137 또는 GPC3 레퍼런스 단백질과 같은 야생형 인간 CD137 또는 GPC3와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성을 가진다.
"네이티브 서열"에 의한 리포칼린은 자연에서 유래된 대응하는 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 리포칼린을 의미한다. 따라서, 네이티브 서열 리포칼린은 임의의 유기체, 특히 포유동물에서 유래된 각각의 자연적으로-발생하는 리포칼린의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러한 네이티브 서열 폴리펩타이드는 자연에서 분리되거나 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "네이티브 서열" 폴리펩타이드는 특히 리포칼린의 자연적으로-발생하는 절단되거나 분비된 형태, 그 대신에 접합된(spliced) 형태와 같은 자연적으로-발생하는 변이체 형태 및 리포칼린의 자연적으로-발생하는 대립형질 변이체들을 포함한다. 폴리펩타이드 "변이체"는 네이티브 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적으로 활성이 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 그러한 변이체들은, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 첨가 또는 결실된 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 변이체는 네이티브 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 80%, 예를 들어, 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 포함하여 적어도 약 70%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 예시적인 예로서, 첫 번째 4개의 N-말단 아미노산 잔기들(His-His-Leu-Leu) 및 마지막 2개의 C-말단 아미노산 잔기들(Ser-Asp)은 단백질의 생물학적 기능에 영향을 주지 않으면서 본 개시물의 눈물 리포칼린(Tlc) 뮤테인에서 결실될 수 있다. 또한, 다른 예시적인 예로서, 특정 아미노산 잔기들이 단백질의 생물학적 기능에 영향을 주지 않으면서 본 개시물의 리포칼린 2(NGAL) 뮤테인에서 결실될 수 있다(예를 들어, Lys-Asp-Pro, 위치 46-48).
본 개시물에 따라 사용될 때, 용어 "위치"는 여기에 묘사된 아미노산 서열 내 아미노산 또는 여기에 묘사된 핵산 서열 내 뉴클레오타이드의 위치를 의미한다. 하나 이상의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열 위치와 관련하여 여기에 사용된 용어 "대응하다" 또는 "대응하는"을 이해하기 위해, 대응하는 위치는 선행하는 뉴클레오타이드/아미노산의 수로만 측정되는 것은 아니다. 따라서, 치환될 수 있는 본 개시물에 따른 주어진 아미노산의 위치는 (돌연변이 또는 야생형) 리포칼린의 다른 곳에서 아미노산의 결실 또는 첨가로 인해 다양할 수 있다. 유사하게, 치환될 수 있는 본 개시물에 따른 주어진 뉴클레오타이드의 위치는 프로모터 및/또는 임의의 다른 조절 서열 또는 유전자(엑손과 인트론을 포함하여)를 포함하여 뮤테인 또는 야생형 리포칼린 5'-비번역 영역(UTR)의 다른 곳에서 결실 또는 추가 뉴클레오타이드로 인해 다양할 수 있다.
따라서, 본 개시물에 따른 대응하는 위치의 경우, 뉴클레오타이드/아미노산의 위치가 유사한 이웃하는 뉴클레오타이드/아미노산보다 표시된 수가 다를 수 있지만, 교환, 결실 또는 첨가될 수 있는 상기 이웃하는 뉴클레오타이드/아미노산 또한 하나 이상의 대응하는 위치에 포함된다.
또한, 본 개시물에 따른 레퍼런스 스캐폴드에 기초한 리포칼린 뮤테인의 대응하는 위치의 경우, 리포칼린 중 매우-보존된 전체 폴딩 패턴에 비추어 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 표시된 수가 다를지라도, 뉴클레오타이드/아미노산의 위치는 (돌연변이 또는 야생형) 리포칼린의 다른 위치에 구조적으로 대응하는 것으로 이해하는 것이 바람직하다.
여기에 사용된 단어 "검출하다", "검출", "검출 가능한" 또는 "검출하는"은 정량적 및 정성적 수준 둘 다, 그리고 이의 조합으로 이해된다. 따라서, 이것은 관심 있는 분자의 정량적, 반-정량적 및 정성적 측정을 포함한다.
"대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 용어 "포유동물"은 여기에서 포유동물로 분류된 임의의 동물을 지칭하는데 사용되며, 단지 몇 가지 예시적 예를 들자면, 인간, 가정용 및 농가의 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완동물, 예를 들어, 양, 개, 말, 고양이, 소, 생쥐, 돼지, 유인원, 예를 들어 필리핀 원숭이 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 여기에서 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 유익하거나 바람직한 결과를 얻기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"시료"는 임의의 대상체에서 얻은 생물학적 시료로 정의된다. 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 소변, 대변, 정액 또는 조직을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
여기에 개시된 융합 폴리펩타이드의 "서브유닛"은 폴리펩타이드의 아미노산의 스트레치로 정의되며, 스트레치는 표적을 향하여 결합 모티프를 제공하는 것과 같은 상기 폴리펩타이드의 독특한 기능 유닛을 말한다.
여기에 기술된 "융합 폴리펩타이드"는 둘 이상의 서브유닛을 포함하고, 이들 서브유닛 중 적어도 하나는 GPC3에 결합하고 추가의 서브유닛은 CD137에 결합한다. 융합 폴리펩타이드 내에서, 이들 서브유닛은 공유 또는 비-공유결합으로 연결될 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 둘 이상의 서브유닛 간의 번역 융합이다. 번역 융합은 추가의 서브유닛의 코딩 서열과 프레임 내 하나의 서브유닛에 대한 코딩 서열을 유전자 조작하여 생성될 수 있다. 서브유닛 둘 다 링커를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 배치될 수 있다. 그러나 본 개시물의 융합 폴리펩타이드의 서브유닛은 화학적 링커에 의해서도 연결될 수도 있다.
본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 의해 포함될 수 있는 "링커"는 여기에 기술된 융합 폴리펩타이드의 둘 이상의 서브유닛을 연결한다. 결합은 공유 또는 비-공유결합일 수 있다. 바람직한 공유결합은 아미노산 간의 펩타이드 결합과 같은 펩타이드 결합에 의한 것이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 링커는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 아미노산을 포함한다. 바람직한 링커들은 여기에 기술되어 있다. 다른 바람직한 링커는 화학적 링커들이다.
도 1은 표적 GPC3 및 CD137과 관련하여 이중특이적인 본 출원에서 기술된 융합 폴리펩타이드의 디자인에 대한 개요를 제공한다. 세 가지 접근법이 사용되었다: 도 1(A)에서 융합 폴리펩타이드의 제1세트는 CD137에 특이적인 항체(예를 들어, SEQ ID NOs: 34 및 35의 항체) 및 GPC3에 특이적인 리포칼린 뮤테인(예를 들어, SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인)에 기초한다. 생성된 폴리펩타이드는 항체의 네 개의 말단 중 어느 하나에 대한 리포칼린 뮤테인의 단일 융합이다. 모든 융합은 그러한 신축성 (G4S)3 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 49의 링커)와 같은 링커에 의해 연결된다; 도 1(B)에서, 융합 폴리펩타이드의 제2세트는 조작된 IgG4-Fc 단편(SEQ ID NO: 73)에 융합된 두 개의 리포칼린 뮤테인(예를 들어, SEQ ID NO: 10의 GPC3-특이 리포칼린 뮤테인 및 SEQ ID NO: 26의 CD137-특이 리포칼린 뮤테인)에 기초한다; 그리고, 도 1(C)에서, 융합 단백질의 제3세트는 (G4S)2 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 48의 링커)와 같은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 두 개의 리포칼린 뮤테인(예를 들어, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 26)에 기초하며, 그로 인해 GPC3-특이 리포칼린 뮤테인은 CD137-특이 리포칼린 뮤테인(예를 들어, SEQ ID NO: 46)에 융합되거나, GPC3-특이 리포칼린 뮤테인과 두 개의 CD137-특이 리포칼린 뮤테인이 서로 융합된다(예를 들어, SEQ ID NO: 47로).
도 2는 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인의 표적 GPC3에 대한 특이도를 측정한 대표 실험을 제공한다. GPC3를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 시험 물질을 적정하였다. 결합된 물질은 실시예2에 기술된 바와 같이 HRP-표지된 항-인간 NGAL-특이 항체를 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 1에 제공된다.
도 3은 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41의 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NOs: 34 및 35의 항체의 표적 CD137에 대한 특이도를 측정한 대표 실험을 제공한다. 인간 CD137의 Fc-융합을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 시험 물질을 적정하였다. 결합된 물질은 실시예 3에 기술된 바와 같이 dHRP-표지된 항-인간 IgG Fc 항체를 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 2에 제공된다.
도 4는 표적 GPC3 및 CD137 둘 다에 동시에 결합하는 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41의 융합 폴리펩타이드의 능력을 측정한 대표 실험을 제공한다. 재조합 CD137-Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 융합 단백질의 적정을 수행하였다. 이후에, 일정 농도의 비오틴화 된 인간 GPC3를 첨가하였고, 실시예 4에 기술된 바와 같이 HRP-표지된 엑스트라비딘을 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 3에 제공된다.
도 5는 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41의 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인의 표적 GPC3에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명을 통해 측정한 대표 실험을 제공한다. 비오틴화 된 GPC3를 센서 칩 상에 고정하고, 융합 폴리펩타이드 및 리포칼린 뮤테인의 결합은 실시예 5에 기술된 바와 같이 농도별로 분석하였다. 생성된 KD 값은 표 4에 제공된다.
도 6은 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41의 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NOs: 34 및 35의 항체의 비오틴화 된 CD137-Fc 융합에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명을 통해 측정한 대표 실험을 제공한다. 비오틴화 된 CD137-Fc를 센서 칩 상에 고정하고, 융합 단백질의 결합은 실시예 6에 기술된 바와 같이 농도별로 분석하였다. 생성된 KD 값은 표 5에 제공된다.
도 7은 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 리포칼린 뮤테인-Fc 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인의 표적 GPC3에 대한 특이도를 측정한 대표 실험을 제공한다. GPC3를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 시험 물질을 적정하였다. 결합된 물질은 실시예 7에 기술된 바와 같이 HRP-표지된 항-인간 NGAL-특이 항체를 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 6에 제공된다.
도 8은 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 리포칼린 뮤테인-Fc 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 26의 리포칼린 뮤테인의 CD137에 대한 특이도를 측정한 대표 실험을 제공한다. 인간 CD137의 Fc-융합을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 시험 물질을 적정하였다. 결합된 물질은 실시예 8에 기술된 바와 같이 HRP-표지된 항-인간 IgG Fc 항체를 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 7에 제공된다.
도 9는 표적 GPC3 및 CD137에 동시에 결합하는 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 리포칼린 뮤테인-Fc 융합 폴리펩타이드의 능력을 측정한 대표 실험을 제공한다. 재조합 CD137-Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 리포칼린 뮤테인-Fc 융합 폴리펩타이드의 적정을 수행하였다. 이후에, 일정 농도의 비오틴화 된 인간 GPC3를 첨가하였고, 실시예 9에 기술된 바와 같이 HRP-표지된 엑스트라비딘을 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 8에 제공된다.
도 10은 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 리포칼린 뮤테인-Fc 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인의 표적 GPC3에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명을 통해 측정한 대표 실험을 제공한다. 비오틴화 된 GPC3을 센서 칩 상에 고정하고, 융합 폴리펩타이드 및 리포칼린 뮤테인의 결합은 농도별로 분석하였다. 생성된 KD 값은 표 9에 제공된다.
도 11은 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 리포칼린 뮤테인-Fc 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 26의 리포칼린 뮤테인의 비오틴화 된 CD137-Fc에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명을 통해 측정한 대표 실험을 제공한다. 비오틴화 된 CD137-Fc을 센서 칩 상에 고정하고 융합 폴리펩타이드 및 리포칼린 뮤테인의 결합은 농도별로 분석하였다. 생성된 KD 값은 표 10에 제공된다.
도 12는 SEQ ID NOs: 53 및 54의 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인의 표적 GPC3에 대한 특이도를 측정한 대표 실험을 제공한다. GPC3를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고 시험 물질을 적정하였다. 결합된 물질은 실시예 12에 기술된 바와 같이 HRP-표지된 항-인간 NGAL-특이 항체를 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 11에 제공된다.
도 13은 표적 GPC3 및 CD137 둘 다에 동시에 결합하는 SEQ ID NOs: 53 및 54의 융합 폴리펩타이드의 능력을 측정한 대표 실험을 제공한다. 재조합 CD137-Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 융합 단백질의 적정을 수행하였다. 이후에, 일정 농도의 비오틴화 된 인간 GPC3를 첨가하였고, 실시예 13에 기술된 바와 같이 HRP-표지된 엑스트라비딘을 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다.
도 14는 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 두 개의 이중특이적 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 8의 리포칼린 뮤테인의 표적 GPC3에 대한 특이도를 측정한 대표 실험을 제공한다. GPC3를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 시험 물질을 적정하였다. 결합된 물질은 실시예 14에 기술된 바와 같이 HPR-표지된 인간 NGAL-특이 항체를 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 12에 제공된다.
도 15는 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 두 개의 이중특이적 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 26의 리포칼린 뮤테인의 표적 CD137에 대한 특이도를 측정한 대표 실험을 제공한다. 인간 CD137의 Fc-융합을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고 시험 물질을 적정하였다. 결합된 물질은 실시예 15에 기술된 바와 같이 HPR-표지된 항-인간 IgG Fc 항체를 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 13에 제공된다.
도 16은 표적 GPC3 및 CD137에 동시에 결합하는 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 두 개의 이중특이적 융합 폴리펩타이드의 능력을 측정한 대표 실험을 제공한다. 재조합 CD137-Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 융합 단백질의 적정을 수행하였다. 이후에, 일정 농도의 비오틴화 된 인간 GPC3를 첨가하였고, 실시예 16에 기술된 바와 같이 HPR-표지된 엑스트라비딘을 통해 검출하였다. EC50 값, 자유 파라미터로서의 최대 시그널 및 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다. 생성된 EC50 값은 표 14에 제공된다.
도 17은 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 두 개의 이중특이적 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 8의 리포칼린 뮤테인의 표적 GPC3에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명을 통해 측정한 대표 실험을 제공한다. 비오틴화 된 GPC3를 센서 칩 상에 고정하고, 융합 폴리펩타이드의 결합을 농도별로 분석하였다. 생성된 KD 값은 표 15에 제공된다.
도 18은 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 두 개의 이중특이적 융합 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 26의 리포칼린 뮤테인의 CD137-Fc에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명을 통해 측정한 대표 실험을 제공한다. 인간 CD137-Fc를 센서 칩 상에 고정하고, 융합 폴리펩타이드의 결합을 농도별로 분석하였다. 생성된 KD 값은 표 16에 제공된다.
도 19는 플라스틱 배양 접시 상에 코팅될 때 T-세포 반응을 보조-자극하는 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드의 능력을 조사한 대표 실험을 제공한다. 융합 폴리펩타이드를 농도별로 플라스틱 접시에 항-인간 CD3 항체와 함께 코팅하고, 이후에, 정제된 T-세포를 가용성 항-인간 CD28 항체의 존재에서 코팅된 표면상에서 배양하였다. 상등액 IL-2 수준은 실시예 19에 기술된 바와 같이 전기화학발광(ELC) 분석에 의해 측정되었다. 음성 대조군으로, 인간 IgG4 이소타입 대조군을 사용하였다.
도 20은 GPC3-표적-의존적 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극하는 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NO: 44 그리고 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 능력을 조사한 대표 실험을 제공한다. 대조군으로, SEQ ID NOs: 34 및 35의 단일특이적, CD137-결합 항체를 사용하였다. 실험에서, 항-인간 CD3 항체(+) 또는 이소타입 대조군(-)을 플라스틱 배양 접시 상에 코팅하고, 이어서 GPC3-양성 HepG2 세포를 상기 접시에서 밤새도록 배양하였다. 다음날, 정제된 T-세포를 1㎍/mL의 이중특이적 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 44, SEQ ID NOs: 45 또는 SEQ ID NOs: 34 및 35의 대조군 항체의 존재에서 코팅된 표면상에서 배양하였다. 상등액 IL-2 수준은 실시예 20에 기술된 바와 같이 전기화학발광 분석에 의해 측정되었다.
도 21은 GPC3-표적-의존적 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극하는 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 능력을 조사한 대표 실험을 제공한다. 실험에서, 항-인간 CD3 항체를 플라스틱 배양 접시 상에 코팅하고, 이후에, GPC3-양성 Hep3B-세포를 상기 접시 상에서 밤새도록 배양하였다. 다음날, 정제된 T-세포를 이중특이적 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NO: 44(A) 및 SEQ ID NO: 45(C)의 다양한 농도의 존재에서 코팅된 표면상에서 배양하였다. 상등액의 IL-2는 ELISA로 측정되었다. GPC3에 대한 이중특이적 융합 폴리펩타이드의 결합을 차단하기 위해, 과량의 SEQ ID NO: 10의 존재에서 SEQ ID NO: 44 (B) 및 SEQ ID NO: 45 (D) 둘 다에 대해 실험을 수행하였다. 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다.
도 22는 상이한 세포주로 T-세포 활성화를 보조-자극하는 시험 물질의 능력을 조사한 대표 실험을 제공한다. 사용된 세포주는 GPC3 양성 HepG2 및 GPC3 음성 SKBR-3 및 MCF7이었다. 실험에서, 항-인간 CD3 항체를 플라스틱 배양 접시 상에 코팅하고, 이후에, 연구중인 세포주를 상기 접시에서 밤새도록 배양하였다. 다음날, 정제된 T-세포를 다음과 같은 이중특이적 융합 폴리펩타이드의 다양한 농도의 존재에서 3일 동안 코팅된 표면상에서 배양하였다: (A) SEQ ID NO: 44(원형), SEQ ID NO: 45(사각형) 또는 대조군 항체 트라스투주맙(삼각형). (B) 항-CD137 항체 SEQ ID NOs: 74 및 75. 상등액 IL-2 수준은 전기화학발광-기반 분석에 의해 측정되었다. 표시된 IL-2의 상대적인 반응은 시험 물질의 존재 및 부재("백그라운드")에서 얻은 반응의 비율에 해당한다.
도 23은 이중특이적 융합 폴리펩타이드, 대조군 항체인 트라스투주맙 및 양성 대조군인 케이홀 림펫 헤모시아닌(KLH)의 인 비트로 T 세포 면역원성 평가 결과를 제공한다. 분석은 32명의 기증자와 전 세계 인구 분포를 반영한 인간 백혈구 항원(HLA) 동종형을 사용하여 실시예 23에 기술된 바와 같이 PBMC-기반 포맷을 사용하여 수행하였다: (A) 자극 지수(시험 물질의 존재 대 부재에서 증식). 평균 응답은 막대로 표시된다. 응답 기증자(자극 지수 > 2)를 정의하는 임계치는 점선으로 표시된다. (B) 응답자의 수.
도 24는 실시예 24 및 25에 기술된 바와 같이, FcgRI, FcgRIII 및 FcRn에 대한 폴리펩타이드의 친화도에 대한 대표 실험을 제공한다.
도 25는 마우스에서 이중특이적 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 약물동력학 분석 결과를 제공한다. 수컷 CD-1 마우스(3마리/시점)에 10mg/kg의 투여량으로 융합 폴리펩타이드를 정맥내 주사하였다. 약물 수준은 샌드위치 ELISA를 사용하여 표적 GPC3 및 CD137을 통해 전체 이중특이적 구조물을 검출함으로써 검출되었다. 2-구획 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다.
도 26은 필리핀 원숭이에서 이중특이적 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 약물동력학 분석 결과를 제공한다. 수컷 필리핀 원숭이는 3mg/kg의 투여량으로 60분 동안 정맥내 주입을 통해 시험 물질을 받았다. 약물 수준은 샌드위치 ELISA를 사용하여 표적 GPC3 및 CD137을 통해 전체 이중특이적 구조물을 검출함으로써 검출되었다. 2-구획 모델을 사용하여 데이터를 조정하였다.
일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 임의의 순서로 적어도 두 개의 서브유닛을 포함한다: 제1 서브유닛은 GPC3에 특이적인 전장 면역글로불린, 이의 항원-결합 도메인 또는 리포칼린 뮤테인을 포함하고, 제2 서브유닛은 CD137에 특이적인 전장 면역글로불린, 이의 항원-결합 도메인 또는 리포칼린 뮤테인을 포함한다.
일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 또한 제3 서브유닛을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 CD137에 특이적인 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제3 서브유닛은 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함한다.
일부 구현예들에서, 하나의 서브유닛은 도 1에 필수적으로 기술된 바와 같이 다른 서브유닛에 연결될 수 있다.
예를 들어, 도 1A에 도시된 바와 같이 하나의 리포칼린 뮤테인은 펩타이드 결합을 통해 면역글로불린 중쇄 도메인(VH)의 C-말단, VH의 N-말단, 면역글로불린 경쇄(VL)의 C-말단, 및/또는 VL의 N-말단에 연결될 수 있다. 일부 특정 구현예들에서, 리포칼린 뮤테인 서브유닛은 그의 N-말단 및/또는 그의 C-말단에서 면역글로불린 서브유닛에 융합될 수 있다. 예를 들어, 리포칼린 뮤테인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH)의 C-말단 및/또는 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단에 펩타이드 결합을 통해 연결될 수 있다. 또 다른 일부 구현예들에서, 펩타이드 결합은 링커, 특히 예를 들어, SEQ ID NO: 49에 나타낸 바와 같이, 비구조식 (G4S)3 링커일 수 있다.
다른 예시적 예로서, 도 1B에 도시된 바와 같이 하나의 리포칼린 뮤테인은 펩타이드 결합을 통해 면역글로불린-Fc 단편의 C-말단 또는 N-말단에 연결될 수 있다.
추가적인 예로서, 도 1C에 도시된 바와 같이, 하나의 리포칼린 뮤테인은 펩타이드 결합을 통해 하나 이상의 다른 리포칼린 뮤테인에 연결될 수 있다.
이와 관련하여, 하나의 서브유닛은 그것의 N-말단 및/또는 그것의 C-말단에서 다른 서브유닛에 융합될 수 있다. 예를 들어, 하나의 서브유닛은 전장 면역글로불린을 포함하고, 다른 서브유닛은 펩타이드 결합을 통해 제2 서브유닛의 N-말단과 상기 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH)의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 다른 구현예들에서, 제3 서브유닛은 펩타이드 결합을 통해 제3 결합 도메인의 N-말단과 상기 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 또 다른 구현예들에서, 펩타이드 결합은 링커, 특히 예를 들어, SEQ ID NO: 49에 나타낸 바와 같이, 비구조식 (G4S)3 링커이거나, 예를 들어, SEQ ID NO: 48에 나타낸 바와 같이, 비구조식 (G4S)2 링커일 수 있다.
일부 구현예들에서, 제3 서브유닛은 제3 서브유닛의 리포칼린 뮤테인의 N-말단과 제1 서브유닛의 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단에 결합된 펩타이드에 의해 제1 서브유닛에 연결된다.
본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 관련된 일부 구현예들에서, 그의 서브유닛 중 하나는 전장 면역글로불린을 포함하고, 폴리펩타이드는 GPC3 및 CD137과 동시에 결합하고, Fc 수용체-양성 세포에 대한 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능은 동시에 보존될 수 있다.
본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 관련된 일부 다른 구현예들에서, 그의 서브유닛 중 하나는 전장 면역글로불린을 포함하고, 폴리펩타이드는 GPC3 및 CD137과 동시에 결합하고, 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능, 즉, Fc 감마 또는 FcRn 수용체-양성 세포에 결합하는 것은 단백질 조작에 의해 감소하거나 완전히 억제될 수 있다. 이것은 예를 들어, IgG2 또는 IgG4와 같은 Fc 감마 또는 FcRn 수용체들과의 낮은 상호작용을 보이는 백본을 사용하여 달성될 수 있다. Fc-감마 수용체들에 대한 추가 결합을 줄이기 위해, F234A 돌연변이 및/또는 L235A 돌연변이와 같이 IgG 백본에 돌연변이가 도입될 수 있다. 또한, IgG4 백본과 관련하여, S228P 돌연변이는 IgG4 절반-항체의 교환을 최소화하기 위해 도입될 수 있다. 일부 또 다른 구현예들에서, 천연 글리코실화 모티프를 제거하기 위해 융합 폴리펩타이드의 면역글로불린 중쇄에서 추가적인 N297A 돌연변이가 존재할 수 있다.
일부 구현예들에서, 종양 세포에서 GPC3와 면역계, 예컨대, T-세포 또는 NK-세포 유래의 효과기 세포의 표면에서 CD137과 동시에 결합함으로써, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 GPC3-의존적 효과기 세포 활성화를 나타낼 수 있어 면역계의 효과기 세포는 GPC3-발현 종양 세포를 적극적으로 용해한다.
일부 추가 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, Chacon, J. A. et al., PloS one 2013 8(4):e60031에서 필수적으로 기술된 바와 같이 표적-의존적 종양-침윤 림프구의 엑스-비보 확장을 입증하는 분석에서 측정될 때, 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함된 면역글로불린과 동등하거나 더 우수한 수준의 GPC3-의존적 CD137 활성화를 입증할 수 있다. 일부 추가 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, Kohrt, H. et al, J Clin Invest. 2012 Mar;122(3):1066-75에서 필수적으로 기술된 것과 유사하게, 인간 간세포 암종("HCC"), 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종의 인-비보 이종이식 모델에서 측정될 때, 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함된 면역글로불린과 동등하거나 더 우수한 수준의 GPC3-의존적 CD137 활성화를 입증할 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 포함된 면역글로불린의 Fc 부분은 체내에서의 안정성과 지속성에 중요한 융합 폴리펩타이드의 혈청 수준을 유지하는 데 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피세포 및 식세포의 Fc 수용체에 결합할 때, 융합 폴리펩타이드는 내재화되고 혈류로 재순화되어 체내 반감기를 향상시킬 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 포함된 CD137-특이 서브유닛은 SEQ ID NO: 26의 리포칼린 뮤테인과 같이 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인일 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 포함된 CD137-특이 서브유닛은 단클론 항체(예를 들어, SEQ ID NOs: 34 및 35의 항체 또는 SEQ ID NO: 51 및 52의 항체)와 같이 CD137에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 포함된 GPC3-특이 서브유닛은 SEQ ID NO: 8의 리포칼린 뮤테인 또는 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인과 같이 GPC3에 특이적인 리포칼린 뮤테인일 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 포함된 CD137-특이 서브유닛은 GPC3에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에서, CD137-특이 서브유닛은 GPC3-특이 서브유닛에 융합된다.
일부 더 특정한 구현예들에서, GPC3-특이 서브유닛은 리포칼린 뮤테인을 포함하고, CD137-특이 서브유닛은 단클론 항체를 포함한다.
일부 추가 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 두 개의 GPC3-특이 서브유닛과 한 개의 CD137-특이 서브유닛을 갖는다. 일부 더 특정한 구현예들에서, GPC3-특이 서브유닛들 각각은 리포칼린 뮤테인을 포함하고, CD137-특이 서브유닛들 각각은 단클론 항체를 포함한다. 일부 추가 구현예들에서, 두 개의 GPC3-특이 서브유닛은 동일하다. 일부 또 다른 구현예들에서, 세 개의 서브유닛은 도 1A에 구조적으로 도시된 바와 같이 서로 융합된다. 일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 SEQ ID NOs: 36 및 37, 38 및 39, 40 및 41, 또는 42 및 43으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 다른 특정 구현예들에서, GPC3-특이 서브유닛은 리포칼린 뮤테인을 포함하고, CD137-특이 서브유닛은 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 일부 추가 구현예들에서, 두 개의 서브유닛은 도 1C에 구조적으로 도시된 바와 같이 서로 융합된다. 일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 추가 특정 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 두 개의 CD137-특이 서브유닛과 한 개의 GPC3-특이 서브유닛을 갖는다. 일부 더 특정한 구현예들에서, GPC3-특이 서브유닛은 리포칼린 뮤테인을 포함하고, CD137-특이 서브유닛들은 각각 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 일부 추가 구현예들에서, 두 개의 CD137-특이 서브유닛은 동일하다. 일부 추가 구현예들에서, 세 개의 서브유닛은 도 1C에 구조적으로 도시된 바와 같은 서로 융합된다. 일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 추가 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에서, GPC3-특이 서브유닛은 리포칼린 뮤테인을 포함하고 CD137-특이 서브유닛은 리포칼린 뮤테인을 포함하며, 두 개의 서브유닛은 면역글로불린-Fc 단편에 융합된다. 일부 추가 구현예들에서, 두 개의 서브유닛은 도 1B에 구조적으로 도시된 바와 같이 면역글로불린-Fc 단편에 각각 융합된다. 일부 특정 구현예들에서, 면역글로불린-Fc 단편은 IgG4-Fc 단편이다. 일부 추가 구현예들에서, IgG4-Fc 단편은 S228P 돌연변이를 갖고 인-비트로 및 인-비보에서 IgG4 절반-항체 교환을 최소화하도록 조작된다. 일부 구현예들에서, IgG4-Fc 단편은 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 44 또는 SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 포함된 면역글로불린은 IgG2 또는 IgG4 백본을 가진다. 일부 추가 구현예들에서, IgG4 백본은 S228P, N297A, F234A 및 L235A으로 구성된 군으로부터 선택된 다음의 돌연변이들 중 어느 하나를 가진다. 일부 추가 구현예들에서, IgG2 백본은 N297A, F234A 및 L235A로 구성된 군으로부터 선택된 다음의 돌연변이들 중 어느 하나를 가진다.
일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 폴리펩타이드가 실시예 3, 실시예 8 또는 실시예 15에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, 적어도 약 5 nM 이하, 예컨대, 약 1 nM 이하, 약 0.6 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 0.4 nM 이하, 또는 약 0.3 nM 이하의 EC50 값으로 CD137에 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기 리포칼린 뮤테인 또는 항체 및 폴리펩타이드가 실시예 8 또는 실시예 15에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, SEQ ID NO: 26의 리포칼린 뮤테인과 같이 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함되는 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인, 또는 SEQ ID NOs: 34 및 35의 항체 또는 SEQ ID NOs: 51 및 52의 항체와 같이 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함되는 CD137에 특이적인 항체의 EC50 값과 적어도 동등하거나 그보다 우수한 EC50 값으로 CD137에 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 실시예 6, 실시예 11 또는 실시예 18에 필수적으로 기술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에서 측정될 때, 적어도 약 5 nM 이하, 예컨대, 약 1 nM 이하, 약 0.6 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 0.3 nM 이하, 약 200 pM 이하, 약 150 pM 이하, 약 100 pM 이하 또는 약 70 pM 이하, 또는 약 2 pM 이하의 KD의 친화도로 CD137에 결합할 수 있다.
다른 양태에서, 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 폴리펩타이드가 실시예 2, 실시예 7, 실시예 12 또는 실시예 14에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, 적어도 약 5 nM 이하, 예컨대, 약 1 nM 이하, 약 0.6 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 0.4 nM 이하, 약 0.3 nM 이하, 또는 약 0.2 nM 이하의 EC50 값으로 GPC3에 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 실시예 7, 실시예 12 또는 실시예 14에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 상기 리포칼린 뮤테인 및 융합 폴리펩타이드가 측정될 때, SEQ ID NO: 8의 리포칼린 뮤테인 또는 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인과 같이 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함되는 GPC3에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 EC50 값에 필적할만한 EC50 값으로 GPC3에 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 실시예 5, 실시예 10 또는 실시예 17에 필수적으로 기술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에서 측정될 때, 적어도 약 5 nM 이하, 예컨대, 약 1 nM 이하, 약 0.3 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 50 pM 이하, 약 20 pM 이하 또는 약 10 pM 이하의 KD의 친화도로 GPC3에 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, CD137 및 GPC3 둘 다에 특이적인 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 상기 융합 폴리펩타이드가 실시예 4, 실시예 9, 실시예 13 또는 실시예 16에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, CD137 및 GPC3에 동시에 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, CD137 및 GPC3 둘 다에 특이적인 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 상기 융합 폴리펩타이드가 실시예 4, 실시예 9, 실시예 13 또는 실시예 16에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, 적어도 약 10 nM 이하, 예컨대, 약 8 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 2.5 nM 이하, 약 2 nM 이하 또는 약 1.5 nM 이하의 EC50 값으로 CD137 및 GPC3에 동시에 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, CD137 및 GPC3 둘 다에 특이적인 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 실시예 19에서 필수적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 실시예 19에서 필수적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 T-세포의 자극의 존재에서 IL-2 생산을 유도할 수 있고, 더 높은 코팅 농도에서 더 강한 IL-2 유도 경향을 나타낼 수도 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 실시예 19에서 필수적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 T-세포의 항-CD3 자극의 부재에서 IL-2 생산을 유도하지 않는다. 일부 추가 구현예들에서, CD137 및 GPC3 둘 다에 특이적인 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 실시예 19에서 필수적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 차선의 농도에서 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극된 T-세포의 활성화를 보조-자극할 수 있다.
일부 구현예들에서, CD137 및 GPC3 둘 다에 특이적인 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 실시예 20에서 필수적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 실시예 20에서 필수적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 IL-2 생산을 유도할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 실시예 20에서 필수적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 GPC3 표적-의존적 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극할 수 있다.
A. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 예시적인 면역글로불린
일부 구현예들에서, 융합 폴리펩타이드와 관련하여, 제1 결합 도메인은 GPC3 또는 CD137에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린은 IgG1, IgG2 또는 IgG4일 수 있다. 추가 구현예들에서, 면역글로불린은 GPC3 또는 CD137에 대한 단클론 항체이다. GPC3-결합 면역글로불린의 예시적인 예는 GC33이다(Cancer Sci. 2014 Apr;105(4):455-62). CD137-결합 항체의 예시적인 예는 BMS-663513(Jure-Kunkel, M. et al., 미국특허 제7,288,638호) 및 PF-05082566(Fisher, T. S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61(10):1721-1733)이다.
B. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 예시적인 GPC3 -특이 리포칼린 뮤테인
본 개시물의 일 양태는 약 1 nM 이하의 KD로 측정된 친화도로 인간 글리피칸-3(GPC3)에 결합할 수 있는 리포칼린 뮤테인을 제공한다. 보다 바람직하게는, 뮤테인은 약 1 nM 또는 0.2 nM 이하의 KD로 측정된 친화도를 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시물은 리포칼린 뮤테인에 관한 것으로, 여기서, 상기 뮤테인은 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 위치에 대응하는 하나 이상의 위치에서 치환, 바람직하게는 여기에 기술된 치환을 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 개시물의 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 서열 위치에 대응하는 서열 위치에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 또는 그 이상, 예를 들어, 21, 22, 23, 24, 25 및 26개의 치환을 포함한다.
추가 특정 구현예들에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 4-17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 서열(SEQ ID NO: 2)과 적어도 70% 동일성을 가진다. 바람직하게는, 상기 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 서열 위치에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 또는 그 이상, 예컨대, 21, 22, 23, 24, 25 및 26개의 돌연변이 된 아미노산 잔기들을 포함한다.
일부 추가 구현예들에서, 진핵세포에서 발현을 용이하게 하기 위해, 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 65번 위치에서 천연 N-글리코실화 부위 Asn은 예를 들어, 65번 위치에서 Asn이 Asp로의 돌연변이에 의해 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인의 대응하는 서열 위치에서 제거된다. 더욱이, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인 상에 N-글리코실화 부위(Asn-X-Ser/Thr)가 존재하지 않은 것이 바람직하다.
일부 다른 구현예들에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 예를 들어, 안정성을 추가로 최적화하기 위해 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28번 서열 위치에 대응하는 서열 위치에서 돌연변이를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 본 개시물의 뮤테인은 GPC3의 길항제이다.
여기에 사용된 바와 같이, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 결합 특이도가 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이기 때문에 그 표적과 하나 이상의 레퍼런스 표적을 구별할 수 있다면 표적(여기서, GPC3)에 "특이적으로 결합한다". "특이적 결합"은 예를 들어, 웨스턴 블랏, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-검사, FACS, IHC 및 펩타이드 스캔에 따라 측정될 수 있다.
마찬가지로, 다른 양태에서, 본 개시물은 hNGAL 뮤테인에 관한 것으로, 상기 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 및/또는 134의 위치에 대응하는 하나 이상의 위치에서 치환, 바람직하게는 여기에 기술된 치환을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시물은 hNGAL 뮤테인을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20, 또는 그 이상, 예컨대 21, 22, 23, 24, 25 및 26개의 치환, 바람직하게는 여기에 기술된 치환을 포함한다.
유사하게, 본 개시물은 8개의 β-가닥이 하나의 말단에서 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결되어 결합 포켓을 형성하는 실린더형 β-주름진 시트 슈퍼세컨더리 구조 영역을 갖는 hNGAL 유래의 리포칼린 뮤테인에 관한 것으로, 상기 4개의 루프 중 적어도 3개 각각의 적어도 하나의 아미노산이 돌연변이되어 있으며, 상기 리포칼린은 검출 가능한 친화도로 주어진 비-천연 표적으로서 GPC3에 결합하는데 효과적이다. 유리하게는 리포칼린 뮤테인은 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 위치에서 아미노산에 대응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 위치(들)에서 치환, 바람직하게는 여기에 기술된 치환을 포함한다. 본 개시물은 또한 이들 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
따라서, 위를 감안하면, 숙련된 기술자는 여기에 기술된 바와 같이 hNGAL에서 돌연변이 된 어느 아미노산 위치가 hNGAL 이외의 스캐폴드의 아미노산에 대응하는지를 쉽게 측정할 수 있는 위치에 있다. 구체적으로, 숙련된 기술자는 상기 뮤테인의 어느 아미노산(들)이 상기 상이한 리포칼린의 아미노산 서열의 각각의 아미노산(들)에 대응하는지를 측정하기 위해 다른 뮤테인의 아미노산 서열과 여기에 기술된 뮤테인 특히 본 개시물의 hNGAL 뮤테인의 아미노산 서열을 정렬시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 숙련된 기술자는 상기 상이한 리포칼린의 아미노산 서열의 어느 아미노산이 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 위치(들)에서 아미노산에 대응하는지를 측정할 수 있다.
GPC3를 겨냥하거나 특이적인 본 개시물의 단백질은 정의된 단백질 스캐폴드를 기반으로 하는 특이-결합 단백질 뮤테인의 임의의 수를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, "뮤테인", "돌연변이 된" 개체(단백질 또는 핵산) 또는 "돌연변이체"는 자연적으로 발생하는(야생형) 핵산 또는 단백질 "레퍼런스" 스캐폴드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 바람직하게는, 교환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상, 예컨대, 21, 22, 23, 24, 25 및 26개이다. 그러나, 본 개시물의 뮤테인은 여전히 GPC3에 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
일부 바람직한 구현예들에서, 본 개시물에 따른 뮤테인은 0.5 nM 이하, 0.3 nM 이하 및/또는 0.2 nM 이하를 포함하여 약 1 nM 이하의 K D로 인간 또는 마우스 GPC3에 결합한다. 본 개시물의 뮤테인은 GPC3의 성숙하고, 접힌 생활성 형태의 하나 이상의 연속, 불연속 또는 구조 에피토프(들)에 특이적으로 결합한다.
선택된 표적(본 경우에는 GPC3)에 대한 본 개시물의 단백질(예를 들어, 리포칼린의 뮤테인)의 결합 친화도는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다(따라서, 뮤테인-리간드 복합체의 KD 값이 측정됨). 그러한 방법은 형광 적정, 경쟁적 ELISA, 등온 적정 열량계(ITC)와 같은 열량 측정 방법들 그리고 표면 플라즈몬 공명(BIAcore)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 그러한 방법들은 당업계에 잘 확립되어 있으며, 이의 예시들도 아래에 구체적으로 기재되어 있다.
본 개시물의 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 인간 리포칼린 2에 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시물의 단백질은 SEQ ID NO:　2의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 단백질과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 95% 동일성을 포함하여 적어도 90% 동일성을 가질 수 있으며, 그러한 뮤테인은 SEQ ID NOs: 4-17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
본 개시물은 또한 SEQ ID NOs: 4-17의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 단백질들의 구조 동족체들을 포함하며, 이에 관하여 약 60%, 바람직하게는 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 92% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과의 아미노산 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가진다.
상기와 비슷하게, 본 개시물의 뮤테인은 바람직하게는 GPC3의 길항제로 작용한다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 뮤테인은 GPC3 분자가 그의 동족 리간드에 결합하거나 그렇지 않고 상호작용하는 능력을 억제함으로써 GPC3의 길항제로 작용할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시물은 GPC3에 특이적으로 결합하는 인간 리포칼린 2의 뮤테인을 포함한다. 이러한 의미에서, GPC3는 야생형 인간 리포칼린 2의 비-천연 리간드로 간주될 수 있고, 여기서 "비-천연 리간드"는 생리학적 조건하에서 인간 리포칼린 2에 결합하지 않는 화합물을 지칭한다. 본 발명자들은 특정 위치들에서 돌연변이를 갖도록 인간 리포칼린 2와 같은 야생형 리포칼린을 조작함으로써 비-천연 리간드에 대한 높은 친화도와 높은 특이도가 가능함을 입증하였다. 한 양태에서 성숙한 인간 리포칼린 2의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 임의의 서열 위치들을 인코딩하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및/또는 20개의 뉴클레오타이드 삼중항(들)에서, 뉴클레오타이드 삼중항의 서브세트에 의해 이들 위치에서 치환을 허용함으로써 무작위 돌연변이 유발이 수행될 수 있다.
또한, 리포칼린은 성숙한 인간 리포칼린 2의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 및/또는 175의 서열 위치들에 대응하는 서열 위치들의 적어도 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개를 포함하여 임의의 하나 이상에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 갖는 뮤테인을 생성하는데 이용될 수 있다.
서열 위치 36에서 치환은 예를 들어 치환 Leu 36 → Val 또는 Arg일 수 있다. 서열 위치 40에서 치환은 예를 들어 치환 Ala 40 → Leu, Val 또는 Gly일 수 있다. 서열 위치 41에서 치환은 예를 들어 치환 Ile 41 → Leu, Arg, Met, Gly 또는 Ala일 수 있다. 서열 위치 49에서 치환은 예를 들어 치환 Gln 49 → Pro 또는 Leu일 수 있다. 서열 위치 52에서 치환은 예를 들어 치환 Tyr 52 → Arg 또는 Trp일 수 있다. 서열 위치 68에서 치환은 예를 들어 치환 Asn 65 → Asp일 수 있다. 서열 위치 68에서 치환은 예를 들어 치환 Ser 68 → Val, Gly, Asn 또는 Ala일 수 있다. 서열 위치 70에서 치환은 예를 들어 치환 Leu 70 → Arg, Ser, Ala 또는 Val일 수 있다. 서열 위치 72에서 치환은 예를 들어 치환 Arg 72 → Asp, Trp, Ala, 또는 Gly일 수 있다. 서열 위치 73에서 치환은 예를 들어 치환 Lys 73 → Gly, Arg, Asn, Glu 또는 Ser일 수 있다. 서열 위치 76에서 치환은 예를 들어 치환 Cys 76 → Val 또는 Ile일 수 있다. 서열 위치 77에서 치환은 예를 들어 치환 Asp 77 → His, Met, Val, Leu, Thr 또는 Lys일 수 있다. 서열 위치 79에서 치환은 예를 들어 치환 Trp 79 → Lys, Ser 또는 Thr일 수 있다. 서열 위치 81에서 치환은 예를 들어 치환 Arg 81 → Gly일 수 있다. 서열 위치 87에서 치환은 예를 들어 치환 Cys 87 → Ser일 수 있다. 서열 위치 96에서 치환은 예를 들어 치환 Asn 96 → Arg, Asp, Gln 또는 Pro일 수 있다. 서열 위치 100에서 치환은 예를 들어 치환 Tyr 100 → Gly, Glu, Pro 또는 Gln일 수 있다. 서열 위치 103에서 치환은 예를 들어 치환 Leu 103 → Glu, Gln, Asn, Gly, Ser 또는 Tyr일 수 있다. 서열 위치 105에서 치환은 예를 들어 치환 Ser 105 → Ala일 수 있다. 서열 위치 106에서 치환은 예를 들어 치환 Tyr 106 → Asn, Ser 또는 Thr일 수 있다. 서열 위치 125에서 치환은 예를 들어 치환 Lys 125 → Glu일 수 있다. 서열 위치 127에서 치환은 예를 들어 치환 Ser 127 → Arg 또는 Tyr일 수 있다. 서열 위치 132에서 치환은 예를 들어 치환 Tyr 132 → Trp 또는 Ile일 수 있다. 서열 위치 134에서 치환은 예를 들어 치환 Lys 134 → Ala 또는 Phe일 수 있다. 서열 위치 136에서 치환은 예를 들어 치환 Thr 136 → Ile일 수 있다. 서열 위치 175에서 치환은 예를 들어 치환 Cys 175 → Ala일 수 있다. 현저하게, 레퍼런스 서열에서 대응하는 아미노산을 치환하는 임의의 아미노산은 대응하는 보존적 아미노산에 의해 교환될 수 있다. 특히, 보존적 치환들은 다음 그룹의 구성원들 사이의 대체물이다: 1) 알라닌, 세린 및 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 라이신; 5) 이소루신, 루신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페날알라닌, 트립신 및 트립토판.
일 구현예에서, GPC3에 결합하는 본 개시물의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물들을 포함한다:
(a) Leu 36 → Val; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Val; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Trp; Lys 73 → Arg; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Gln; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Ala;
(b) Leu 36 → Val; Ala 40 → Val; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Lys 73 → Gly; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe;
(c) Leu 36 → Val; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Met; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Leu 70 → Ala; Lys 73 → Asn; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe;
(d) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(e) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Gly; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(f) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Val; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Pro; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(g) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Tyr; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(h) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Val; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Pro; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;
(i) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Leu; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Ser; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe;
(j) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Cys 76 → Val; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Thr; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Cys 175 → Ala;
(k) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Gly; Lys 73 → Glu; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gln; Leu 103 → Asp; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala; 또는
(l) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Ser; Cys 76 → Val; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala.
넘버링은 바람직하게는 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)에 관련된다. 따라서, 본 개시물의 교시에 따르면, 숙련된 기술자는 성숙한 hNGAL의 바람직한 레퍼런스 서열(SEQ ID NO: 2)에서 어느 아미노산이 상기 (a) 내지 (l)에서 기술된 것들에 대응하는지 쉽게 측정할 수 있다; 레퍼런스 서열에서 상기 아미노산을 돌연변이 시키기 위해.
C. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 예시적인 CD137-특이 리포칼린 뮤테인
한 양태에서, 본 개시물은 CD137에 결합하는 인간 리포칼린 뮤테인과 이를 위한 유용한 적용을 제공한다. 본 개시물은 또한 여기에 기술된 CD137 결합 단백질의 제조방법과 그러한 단백질들을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시물의 CD137 결합 단백질 및 이의 조성물은 시료에서 CD137을 검출하는 방법 또는 대상체에서 CD137의 결합 방법에 사용될 수 있다. 본 개시물에 의해 제공된 용도에 수반되는 이들 특징을 갖는 그러한 인간 리포칼린 뮤테인은 이전에 기술된 바 없었다.
본 개시물의 다른 구현예는 CD137에 결합하여 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 리포칼린 뮤테인을 제공한다.
일 구현예에서, 본 개시물은 CD137-결합 인간 눈물 리포칼린 뮤테인을 제공한다.
이와 관련하여, 본 개시물은 약 300 nM 이하 및 심지어 약 100 nM 이하의 KD로 측정된 친화도로 CD137에 결합할 수 있는 하나 이상의 Tlc 뮤테인을 제공한다.
일부 구현예들에서, 그러한 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153의 위치들에 대응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 특정 구현예들에서, 그러한 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 및 108의 위치들에 대응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
추가 특정 구현예들에서, 그러한 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 101, 111, 114 및 153의 위치들에 대응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
다른 특정 구현예들에서, Tlc는 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153의 위치들에 대응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 추가 구현예들에서, Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153의 서열 위치들에 대응하는 하나 이상의 서열 위치에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 그 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 상기 폴리펩타이드는 CD137, 특히 인간 CD137에 결합한다.
일부 또 다른 구현예들에서, 본 개시물은 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 Tlc 뮤테인이며, 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열과 비교하여, 526-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 및 108의 서열 위치들에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 CD137, 특히 인간 CD137에 결합한다.
일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 천연 시스테인 잔기 즉 세린 잔기에 의한 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 Tlc 뮤테인은 세린 잔기와 같은 다른 아미노산에 의해 61 및/또는 153의 위치에서 천연 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 이와 관련하여, 시스테인 잔기 61 및 153에 의해 형성된 야생형 눈물 리포칼린의 구조적 이황화 결합(각 나이브 핵산 라이브러리의 수준에서)의 제거(참조. Breustedt, et al., 2005, supra)는 안정적으로 접힐 뿐만 아니라 높은 친화도로 주어진 비-천연 리간드와 결합할 수 있는 눈물 리포칼린 뮤테인을 제공할 수 있음이 발견되었다는 것을 특히 덧붙인다. 일부 특정 구현예들에서, 본 개시물에 따른 Tlc 뮤테인은 아미노산 치환 Cys 61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro 또는 Trp 및 Cys 153 → Ser 또는 Ala을 포함한다. 그러한 치환은 Cys 61 및 Cys 153을 연결하는 자연적으로 발생하는 이황화 브릿지의 형성을 방지하여 뮤테인의 취급을 용이하게 하는데 유용하다는 것을 입증하였다. 그러나 CD137에 결합하고, Cys 61 및 Cys 153 사이에 형성된 이황화 브릿지를 갖는 눈물 리포칼린 뮤테인 역시 본 개시물의 일부이다.
일부 구현예들에서, 구조적 이황화 결합의 제거는 본 개시물의 뮤테인에 비-천연 인공 이황화 결합의 (자발적인) 생성 또는 고의적인 도입을 허용하여 뮤테인의 안정성을 증가시키는 추가의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 61, 101 및 153의 위치에서 시스테인 코돈 중 2개 또는 3개 모두 다른 아미노산의 코돈에 의해 대체된다. 또한, 일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 Tlc 뮤테인은 101의 위치에서 세린 잔기 또는 히스티딘 잔기에 의한 천연 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열에 대하여 28 또는 105의 위치에서 시스테인 잔기에 의한 천연 아미노산의 아미노산 치환을 포함한다.
또한, 일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 뮤테인은 111의 위치에서 프롤린 잔기에 의한 천연 아르기닌 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 또한, 일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 뮤테인은 114의 위치에서 트립토판 잔기 또는 글루탐산에 의한 천연 라이신 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 CD137-결합 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153의 위치들에 대응하는 하나 이상의 위치에서, 하나 이상의 하기 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함한다: Ala 5 → Val 또는 Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg 또는 Asn; Thr 71 → Ala; Val 85 → Asp; Lys 94 → Arg 또는 Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile 및 Cys 153 → Ser. 일부 구현예들에서, 본 개시물에 따른 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 이들 서열 위치에서 둘 이상, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 심지어 그 이상, 예컨대, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 모든 돌연변이 된 아미노산 잔기들을 포함한다.
일부 추가 구현예들에서, CD137과 결합하는 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열과 비교하여 다음의 아미노산 치환 세트 중 하나를 포함한다:
1. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
2. Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser; 157 → Pro;
3. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Asn; Lys 94 → Arg; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser;
4. Ala 5 → Val; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Lys 94 → Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser; 157 → Pro;
5. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; 157 → Pro;
6. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; 157 → Pro; 또는
7. Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; 157 → Pro.
나머지 영역, 즉 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153의 서열 위치들과는 다른 영역에서, 본 개시물의 Tlc 뮤테인은 돌연변이 된 아미노산 서열 위치들 외에 야생형(천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시물에 따른 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열(SEQ ID NO: 1)과 적어도 70% 서열 동일성 또는 적어도 70%의 서열 상동성을 갖는다.
본 개시물에 따른 Tlc 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린의 자연적으로 발생하는 형태의 돌연변이 유발의 수단에 의해 얻을 수 있다. 돌연변이 유발의 일부 구현예들에서, 치환(또는 대체)은 보존적 치환이다. 그럼에도, 리포칼린 뮤테인이 CD137에 결합하는 능력을 보유하고/하거나 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 예컨대, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 이상 서열 동일성이 있는 치환된 서열에 대해 서열 동일성을 갖는 한 비-보존적 치환 또는 아래의 예시적인 치환들로부터 하나 이상을 포함하여 임의의 치환이 예상된다(SWISS-PROT Data Bank Accession Number P31025).
다른 양태에서, 본 개시물은 CD137을 겨냥하거나 특이적인 신규한 특이적-결합을 하는 hNGAL 뮤테인에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 개시물은 200 nM 이하, 약 140 nM 이하, 약 50 nM 이하 및 심지어 약 10 nM 이하의 KD로 측정된 친화도로 CD137에 결합할 수 있는 하나 이상의 hNGAL 뮤테인을 제공한다. 보다 바람직하게는, hNGAL 뮤테인은 약 5 nM 이하의 KD로 측정된 친화도를 가질 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134의 위치들에 대응하는 하나 이상의 위치에서의 치환을 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188; SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134의 서열 위치에 대응하는 서열 위치에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 그 이상의 치환(들)을 포함한다. 바람직하게는, 본 개시물은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 28, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 94, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134의 위치들에 대응하는 하나 이상의 위치에서의 치환, 더불어 성숙한 인간 NGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 87 및/또는 96의 위치들에 대응하는 위치들에서 하나 이상의 치환을 포함하는 리포칼린 뮤테인에 관한 것이 예상된다.
일부 또 다른 구현예들에서, 본 개시물은 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 hNGAL 뮤테인이고, 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188; SEQ ID NO: 2)과 비교하여 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134의 서열 위치들에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 그 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 CD137, 특히 인간 CD137과 결합한다.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134의 서열 위치들 중 임의의 하나 이상에서, 다음의 돌연변이 된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함한다: Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg 또는 Lys; Gln 49 → Val, Ile, His, Ser 또는 Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met, Ala 또는 Gly; Leu 70 → Ala, Lys, Ser 또는 Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met, Arg, Thr 또는 Asn; Trp 79 → Ala 또는 Asp; Arg 81 → Met, Trp 또는 Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu 및 Lys 134 → Tyr.
일부 구현예들에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 이들 서열 위치에서 둘 이상, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 심지어 그 이상, 예컨대, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 모든 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 추가 구현예들에서, CD137에 결합하는 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열과 비교하여 다음의 아미노산 대체물들을 포함한다:
(a) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;
(b) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;
(c) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;
(d) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;
(e) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Met; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;
(f) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Val; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;
(g) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → His; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;
(h) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; 또는
(i) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr.
나머지 영역, 즉, 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134의 서열 위치들과는 상이한 영역에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 돌연변이 된 아미노산 서열 위치들 외에 야생형(천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, hNGAL 뮤테인은 성숙한 인간 리포칼린 2의 아미노산 서열(SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188)에 적어도 70% 또는 그보다 더 높은 서열 동일성을 가진다.
추가의 특정 구현예들에서, 본 개시물에 따른 CD137-결합 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 18-33으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
본 개시물의 CD137-결합 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:　18-33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 높은 서열 동일성, 예컨대, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 95% 동일성을 포함하여 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다.
본 개시물은 또한 SEQ ID NOs:　18-33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 리포칼린 뮤테인의 구조 동족체들을 포함하고, 구조 동족체들은 상기 뮤테인과 관련하여 약 60% 초과, 바람직하게는 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 92% 초과 및 가장 바람직하게는 95% 초과의 아미노산 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가진다.
D. 융합 폴리펩타이드의 예시적인 용도, 적용 및 생산
일부 구현예들에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 CD137 및 GPC3의 이중-표적화를 통해 시너지 효과를 생산할 수 있다.
따라서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드에 대한 수많은 가능한 적용들이 의약에 존재한다.
일 양태에서, 본 개시물은 시료에서 CD137과 GPC3을 검출하기 위해 여기에 기술된 융합 폴리펩타이드의 용도 및 각각의 진단 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 개시물은 여기에 기술된 하나 이상의 융합 폴리펩타이드 또는 CD137 및 GPC3에 동시에 결합하기 위해 그러한 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 조성물의 용도를 특징으로 한다.
본 개시물은 또한 CD137 및 GPC3와의 복합체 형성에 대해 기술된 바와 같은 하나 이상의 융합 폴리펩타이드의 용도를 포함한다.
따라서, 본 개시물의 또 다른 양태에서, 개시된 하나 이상의 융합 폴리펩타이드는 CD137 및 GPC3의 검출에 사용된다. 그러한 용도는 하나 이상의 상기 융합 폴리펩타이드를 적당한 조건하에서 CD137 및 GPC3를 포함하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시켜 융합 폴리펩타이드와 CD137 및 GPC3 사이에 복합체를 형성하고, 적당한 시그널로 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출 가능한 시그널은 상술한 바와 같이 표지에 의해 또는 결합 즉 복합체 형성 자체에 의한 물리적 특성들의 변화에 의해 야기될 수 있다. 일 예시는 표면 플라즈몬 공명이며, 그 값은 금박과 같은 표면에 고정된 결합 파트너의 결합 중에 변화된다.
여기에 개시된 융합 폴리펩타이드는 또한 CD137 및 GPC3의 분리를 위해 사용될 수 있다. 그러한 용도는 하나 이상의 상기 융합 폴리펩타이드를 적당한 조건하에서 CD137 및 GPC3를 포함하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시켜 융합 폴리펩타이드와 CD137 및 GPC3 사이에 복합체를 형성시키고, 시료로부터 복합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시물은 본 개시물에 따른 융합 폴리펩타이드를 포함하는 진단 또는 분석 키트를 특징으로 한다.
진단에서의 그들의 용도에 더하여, 또 다른 양태에서, 본 개시물은 본 개시물의 융합 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 고려한다.
또한, 본 개시물은 항암제 및 면역조절제로서 사용하기 위한 CD137 및 GPC3에 동시에 결합하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 따라서, 본 개시물의 그러한 융합 폴리펩타이드는 간세포 암종("HCC"), 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종을 포함하는 다양한 종양과 같이 인간 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용되는 것으로 예상된다. 따라서, 본 개시물의 하나 이상의 융합 폴리펩타이드의 약학적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 간세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종을 포함하는 다양한 종양과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방 방법이 또한 제공된다.
간세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종과 같이 GPC3가 발현되는 종양 세포를 동시에 표적화하여, 그러한 종양 세포 또는 적응 면역계의 T-세포에 인접한 숙주의 선천 면역계에서 자연살해(NK) 세포를 활성화시킴으로써, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 표적화 된 항-종양 림프구 세포 활성을 증가시키고, 항-종양 면역계를 향상시키며, 동시에 종양 성장에 대한 직접적인 억제 효과를 가져 상승적 항-종양 결과를 생산할 수 있다. 또한, 종양유전자 활성을 국소적으로 억제하고 NK 세포 및/또는 T-세포에 의한 세포-매개 세포독성을 유도함으로써 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 건강한 세포에 대한 효과기 림프구의 부작용, 즉 표적 이외의 독성을 감소시킬 수 있다.
T 세포에서, CD137-매개 신호전달은 TRAF 패밀리 구성원의 동원 및 ASK-1, MKK, MAPK3/MAPK4, p38 및 JNK/SAPK를 포함하여 몇몇 키나아제의 활성화를 유도한다. 키나아제 활성화 후 ATF-2, Jun, 및 NF-κB를 포함하여 몇몇 전사 인자들의 활성화 및 핵 이동이 이어진다. 차선의 TCR-유도성 증식을 증가시키는 것 외에도, CD137-매개 신호전달은 T 세포, 특히 활성화-유도성 세포 죽음(AICD)으로부터 CD8+T 세포를 보호한다.
본 개시물은 본 개시물의 융합 폴리펩타이드 또는 간세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종과 같이 GPC3가 발현되는 종양 세포에 결합할 때 T-세포를 보조자극하고, 및/또는 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 용도를 포함한다.
본 개시물은 또한 본 개시물의 하나 이상의 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 간세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종과 같이 GPC3가 발현되는 종양 세포에 결합할 때 T-세포를 보조자극하고 및/또는 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하는 방법을 특징으로 한다.
또한, 본 개시물은 본 개시물의 하나 이상의 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 간세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종과 같이 GPC3가 발현되는 종양 세포에 결합할 때 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하는 방법에 관한 것이다.
본 개시물은 또한 본 개시물의 하나 이상의 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 간세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종과 같이 GPC3가 발현되는 종양 세포에 결합할 때 T 림프구 증식을 유도하는 방법을 고려한다.
본 개시물은 간세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 윌름스 종양 및 간모세포종과 같이 GPC3가 발현되는 종양 세포에 대해 CD137 클러스터링 및 T-세포상의 활성화를 유도하는 본 개시물의 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 용도를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 개시물은 또한 여기에 개시된 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자(DNA 및 RNA)에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시물은 상기 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 유전자 암호의 축퇴성은 동일한 아미노산을 특정하는 다른 코돈에 의한 특정 코돈의 치환을 허용하기 때문에, 본 개시물은 여기에 기술된 바와 같은 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 특이 핵산 분자에 제한하지 않고 기능적 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 모든 핵산 분자를 포함한다. 이와 관련하여, 본 개시물은 또한 본 개시물의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
일부 구현예들에서, 본 출원에 개시된 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자, 예컨대, DNA는 여기에 개시된 융합 폴리펩타이드가 발현되도록 본 개시물의 면역글로불린을 인코딩하는 다른 핵산 분자에 "작동 가능하게 연결"될 수 있다. 이와 관련하여, 작동 가능한 결합은 하나의 핵산 분자의 서열 요소들과 다른 핵산의 서열 요소들이 단일 폴리펩타이드로서 융합 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 결합이다.
본 개시물은 또한 유전 공학적 방법들에 의해 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 서브유닛을 코딩하는 핵산으로부터 출발하여 생산되는 본 개시물의 융합 폴리펩타이드의 생산방법에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 방법은 인 비보에서 수행될 수 있고, 폴리펩타이드는 예를 들어, 세균 또는 진핵 숙주 유기체에서 생산된 다음 이 숙주 유기체 또는 그것의 배양물로부터 분리될 수 있다. 예를 들어 인 비트로 번역 시스템을 사용하여 인 비트로에서 본 개시물의 융합 폴리펩타이드를 생산하는 것도 가능하다.
인 비보에서 융합 폴리펩타이드를 생산할 때, 그러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이 재조합 DNA 기술(상기에서 이미 설명한 바와 같이)에 의해 적당한 세균 또는 진핵 숙주 유기체로 도입된다. 이 목적을 위해, 숙주 세포는 우선 확립된 표준 방법들을 사용하여 여기에 기술된 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝 벡터에 형질전환된다. 이어서, 숙주 세포를 이종 DNA의 발현 및 대응하는 폴리펩타이드의 합성을 가능하게 하는 조건하에서 배양한다. 이후에, 폴리펩타이드는 세포 또는 배양 배지로부터 회수된다.
본 개시물의 일 구현예에서, 이 방법은 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 40-52, 60, 68, 65, 70, 71-81, 87, 89, 96, 98, 100-106, 114, 118, 120, 125-137 및 145의 서열 위치들에 대응하는 서열 위치들의 적어도 하나, 때로는 그 이상을 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중항에서 hNGAL을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자에 돌연변이 유발을 받게 하는 것을 포함한다.
또한, 일부 구현예들에서, Cys 76 및 Cys 175 사이의 자연적으로 발생하는 이황화 결합이 본 개시물의 hNGAL 뮤테인에서 제거될 수 있다. 따라서, 그러한 뮤테인은 예를 들어, 그람-음성 세균의 세포질에서 환원 레독스 환경을 갖는 세포 구획에서 생산될 수 있다.
본 개시물은 또한 본 개시물의 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 실험적 돌연변이 유발의 지시된 서열 위치들 외에 추가적인 돌연변이를 포함한다. 그러한 돌연변이는 예를 들어, 리포칼린 뮤테인의 개선된 폴딩 효율, 혈청 안정성, 열 안정성 또는 리간드 결합 친화도에 기여하는 경우 종종 용인되거나 심지어 유리한 것으로 입증될 수 있다.
본 출원에 개시된 핵산 분자는 조절 서열(또는 조절 서열들)에 "작동 가능하게 연결"되어 이 핵산 분자의 발현을 가능하게 할 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는 그것이 전사 및/또는 번역 조절에 관한 정보를 포함하는 서열 요소들을 포함하고, 그러한 서열들이 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 "작동 가능하게 연결되어" 있다면, "핵산 분자를 발현할 수 있는" 또는 "뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는" 것으로 지칭된다. 작동 가능한 결합은 조절 서열 요소들과 발현될 서열이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되어 있는 결합이다. 유전자 발현에 필수적인 조절 영역의 정확한 성질은 종마다 다를 수 있지만 일반적으로 이들 영역은 원핵생물에서 프로모터 자체, 즉, 전사의 개시를 지시하는 DNA 요소들은 물론 RNA로 전사될 때 번역의 개시를 알리는 DNA 요소들 둘 다를 포함하는 프로모터를 포함한다. 그러한 프로모터 영역은 일반적으로 전사 및 번역의 개시에 결합하는 5' 비-코딩 서열, 예컨대 원핵생물에서 -35/-10 박스 및 샤인-달가노 요소 또는 진핵생물에서 TATA 박스, CAAT 서열 및 5'-캡핑 요소들을 포함한다. 이들 영역은 천연 폴리펩타이드를 숙주 세포의 특정 구획으로 표적화하기 위한 번역된 시그널 및 리더 서열뿐만 아니라 인핸서 또는 리프레서 요소들 역시 포함할 수 있다.
또한, 3' 비-코딩 서열은 전사 종결, 폴리아데닐화 등에 관련된 조절 요소들을 포함할 수 있다. 그러나 이들 종결 서열은 특정 숙주 세포에서 만족스러운 기능이 없다면 그 세포에서 기능성 시그널로 치환될 수 있다.
따라서, 본 개시물의 핵산 분자는 조절 서열, 예컨대, 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시물의 핵산 분자는 프로모터 서열과 전사 종결 서열을 포함한다. 적당한 원핵생물 프로모터는 예를 들어, tet 프로모터, lacUV5 프로모터 또는 T7 프로모터이다. 진핵세포에서 발현에 유용한 프로모터의 예는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.
본 개시물의 핵산 분자는 또한 벡터 또는 임의의 다른 종류의 클로닝 비히클의 일부, 예를 들어, 플라스미드, 파지미드, 파지, 배큘로바이러스, 코스미드 또는 인공 염색체일 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 파지미드에 포함된다. 파지미드 벡터는 M13 또는 f1과 같은 템퍼런트(temperent) 파지의 유전자 간 영역 또는 관심 있는 cDNA에 융합된 이의 기능적 일부를 인코딩하는 벡터를 뜻한다. 그러한 파지미드 벡터 및 적당한 헬퍼 파지(예를 들어, M13K07, VCS-M13 또는 R408)로 세균 숙주 세포를 중복감염시킨 후 온전한 파지 입자가 생산되어, 파지 표면상에 표시된 그것의 대응하는 폴리펩타이드와 암호화된 이종 cDNA의 물리적 커플링을 가능하게 한다(예를 들어, Lowman, H.B. (1997) Annu . Rev. Biophys . Biomol . Struct . 26, 401-424, 또는 Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-9 참조).
그러한 클로닝 비히클은 상기 기술된 조절 서열들 및 여기에 기술된 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 제외하고, 발현에 사용되는 숙주 세포와 양립 가능한 종류로부터 유래된 복제 및 조절 서열들뿐만 아니라 형질전환 또는 형질감염된 세포에서 선별 가능한 표현형을 부여하는 선별 마커를 포함할 수 있다. 다수의 적당한 클로닝 벡터들이 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다.
여기에 기술된 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 분자(예를 들어, SEQ ID NOs: 20 및 31), 및 특히 그러한 폴리펩타이드의 코딩 서열을 포함하는 클로닝 벡터는 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포에 형질전환될 수 있다. 형질전환은 표준 기술들을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시물은 또한 여기에 개시된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
형질전환된 숙주 세포는 본 개시물의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적당한 조건하에서 배양된다. 적당한 숙주 세포는 원핵생물, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 또는 진핵생물, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), SF9 또는 High5 곤충세포, 불멸화 포유동물 세포주(예를 들어, HeLa 세포 또는 CHO 세포) 또는 프라이머리 포유동물 세포일 수 있다.
여기에 개시된 융합 폴리펩타이드에 포함되는 것을 포함하여 분자 내 이황화 결합을 포함하는 본 개시물의 리포칼린 뮤테인이 있는 일부 구현예들에서, 적당한 시그널 서열을 사용하여 산화 레독스 환경을 갖는 세포 구획으로 신생 폴리펩타이드를 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 산화 환경은 대장균과 같은 그람-음성 세균의 주변세포질 또는 그람-양성 세균의 세포외 환경 또는 진핵세포의 소포체의 내강에 의해 제공될 수 있고, 보통 구조적 이황화 결합의 형성을 선호한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포, 바람직하게는 대장균의 세포질에서 본 개시물의 융합 폴리펩타이드를 생산하는 것도 가능하다. 이 경우, 폴리펩타이드는 가용성 및 접힘 상태로 직접 수득되거나 봉입체 형태로 회수되고 이어서 인 비트로에서 복원된다. 추가적인 선택은 산화 세포 내 환경을 갖는 특정 숙주 균주의 사용이며, 이로 인해 세포질에서 이황화 결합의 형성을 가능하게 할 수 있다(Venturi et al. (2002) J. Mol . Biol . 315, 1-8.).
일부 구현예들에서, 여기에 기술된 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 유전 공학의 사용에 의해서만 생성되거나 생산될 필요는 없다. 오히려, 그러한 폴리펩타이드는 메리필드 고체상 폴리펩타이드 합성과 같은 화학적 합성 또는 인 비트로 전사 및 번역에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 가능성이 큰 돌연변이가 분자 모델링을 사용하여 확인된 후 인 비트로에서 원하는(디자인된) 뮤테인 또는 폴리펩타이드를 합성하고 관심 표적에 대한 결합 활성을 조사하는 것이 가능하다. 단백질의 고체상 및/또는 용액상 합성법은 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43 참조).
다른 구현예에서, 본 개시물의 융합 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 잘-확립된 방법들을 사용하여 인 비트로 전사/번역에 의해 생산될 수 있다.
숙련된 기술자는 본 개시물에 의해 고려되는 융합 폴리펩타이드를 제조하는데 유용한 방법을 이해할 것이나 그의 단백질 또는 핵산 서열은 여기에 명시적으로 개시되어 있지는 않는다. 개요로서, 아미노산 서열의 그러한 변형들은 특정 제한 효소들에 대한 절단 부위를 포함함으로써 폴리펩타이드 유전자 또는 그의 부분들의 서브클로닝을 단순화하기 위해 예를 들어 단일 아미노산 위치들의 지정 돌연변이 유발을 포함한다. 또한, 이들 돌연변이는 그것의 표적(예를 들어, CD137 및 GPC3)에 대한 융합 폴리펩타이드의 친화도를 더욱 개선하기 위해 포함될 수 있다. 또한, 필요하다면, 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 내성 또는 물 용해성을 개선하거나 응집 경향을 감소시키는 것과 같이 폴리펩타이드의 특정 특징들을 조절하기 위해 돌연변이가 도입될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기들은 이황화 브릿지 형성을 방지하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다.
이 개시물의 추가적인 목적, 이점 및 특징들은 하기 실시예들 및 이의 첨부된 도면들을 검토함으로써 당업자에게 명백해질 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 개시물은 예시적인 구현예들 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었으나, 여기에 구체화된 본 개시물의 변형 및 변이는 당업자에 의해 의존될 수 있고, 그러한 변형 및 변이는 이 개시물의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.
V. 실시예
실시예 1: 항체- 리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드의 발현 및 분석
우리는 표적인 GPC3 및 CD137에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 구조물을 생성하기 위해 세 가지 접근법을 사용하였다.
첫 번째 접근법에서, 우리는 예를 들어, SEQ ID NOs: 34 및 35에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 CD137-특이 항체 및 예를 들어, SEQ ID NO: 10의 GPC3 리포칼린 뮤테인에 기초한 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. 모든 경우에서 단백질을 서로 융합시키기 위해 비구조식 프로테아제에 둔감한 (G4S)3 링커(SEQ ID NO: 49)를 사용하였다. 디자인된 다양한 형태들은 도 1A에 도시되어 있다. 생성된 변이체들은 절반-항체 교환을 최소화하기 위해 돌연변이 된 IgG4 백본을 포함하는 항체의 4개의 말단 중 어느 하나에 리포칼린 뮤테인이 융합되어 있다(S228P 돌연변이, SEQ ID NO: 34 참조): SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41, SEQ ID NOs: 42 및 43.
두 번째 접근법에서, 우리는 Fc-감마 수용체 상호작용을 감소시키기 위한 F234A 및 L235A 돌연변이(Alegre 1992) 뿐만 아니라 인 비트로 및 인 비보에서 IgG4 절반-항체 교환을 최소화하기 위해 S228P 돌연변이를 포함하는 조작된 IgG4-Fc 단편(SEQ ID NO: 73)(Silva 2015 참조)에 두 개의 리포칼린 뮤테인(GPC3에 결합하는 SEQ ID NO: 10 및 CD137에 결합하는 SEQ ID NO: 26)의 융합을 생성하였다. 생성된 융합 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45)는 도 1B에 구조적으로 도시되어 있다.
첫 번째 및 두 번째 접근법의 구조물은 유전자 합성에 의해 생성되었고, 포유동물 발현 벡터에 클로닝되었다. 이어서, CHO 세포에서 일시적으로 발현되었다. 세포 배양 배지에서 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드 및 IgG4Fc-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드의 농도는 ForteBio ProteinA sensor(Pall Corp.)를 사용하여 측정되었고, 인간 IgG1 표준물질을 사용하여 정량하였다(미도시 됨).
세 번째 접근법에서, 우리는 하나 이상의 (G4S)2 링커(SEQ ID NO: 48)에 의해 연결되고 도 1C에 도시된 두 개의 상이한 디자인을 사용하여 두 개의 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 26)의 융합을 생성하였다. 첫 번째 디자인에서, SEQ ID NO: 26은 SEQ ID NO: 10의 C-말단에 융합되어 SEQ ID NO: 46의 융합 폴리펩타이드를 생성하고, 두 번째 디자인에서, SEQ ID NO: 26의 2개의 카피는 SEQ ID NO: 10의 C-말단에 융합되어 SEQ ID NO: 47의 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. 구조물은 친화도 크로마토그래피 정제를 위한 스트렙-태그(SEQ ID NO: 50)를 포함하였다. 구조물은 표준 방법들을 사용하여 클로닝되었고, 원형질막 분비를 이용하는 대장균(E. coli)에서 발현되었다.
항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드 및 IgG4Fc 단편-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드는 10 mM 히스티딘 pH 5.5, 150 mM NaCl 또는 PBS, pH7.4에서 Protein A 크로마토그래피에 이어서 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제되었다. SEC 정제 후 단량체 단백질을 포함하는 분획을 모으고 분석 SEC를 사용하여 다시 분석하였다. 이 분석에 따르면, 융합 폴리펩타이드는 검출 가능한 다량체 종 또는 응집체 없이 전적으로 단량체였다(미도시 됨).
실시예 2: GPC3에 대한 융합 폴리펩타이드의 특이도
우리는 재조합 인간 GPC3(R&D Systems #2119-GP-050/CF)에 대한 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41 및 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드의 특이도를 측정하기 위해 ELISA 분석을 사용하였다. 표적을 PBS(1㎍/mL)에 녹이고, 4℃에서 밤새 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅시켰다. 플레이트를 0.1%(v/v) Tween 20가 보충된 100㎕ PBS(PBS-T)로 각 배양 단계 후 5회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS-T에 녹인 2% BSA(w/v)로 차단한 후 세척하였다. 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 10) 또는 융합 폴리펩타이드를 농도별로 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 이어서 세척 단계를 수행하였다. 결합된 융합 단백질 또는 리포칼린 뮤테인은 1:1000으로 희석된 2%(w/v) BSA가 보충된 PBS-T(PBS-TB)에 녹인 HPR에 컨쥬게이트 된 항-인간 NGAL 항체와 인큐베이션한 후 검출하였다. 추가 세척 단계 후, 형광 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 2에 도시하였다.
생성된 EC50 값은 표 1에 제공되며, 데이터의 S자형 조정의 오류를 포함하여 여기에 표에 요약된 모든 데이터의 경우이다. 관찰된 EC50 값은 모든 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드(0.25 - 0.28　nM)에 대해 유사한 범위에 있으며, 모두 0.55　nM에 있는 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 10)보다 약간 양호하였다. 실험은 상기 기술된 융합 폴리펩타이드에 포함될 때, 리포칼린 뮤테인이 GPC3에 대한 활성의 손실 없이 항체의 4개의 말단 중 하나에 융합될 수 있음을 보여준다.
GPC3 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 GPC3 [nM]
SEQ ID NOs: 42 및 43 0.27 ± 0.03
SEQ ID NOs: 40 및 41 0.25 ± 0.02
SEQ ID NOs: 38 및 39 0.26 ± 0.02
SEQ ID NOs: 36 및 37 0.28 ± 0.02
SEQ ID NO: 10 0.55 ± 0.03
실시예 3: 인간 CD137에 대한 융합 폴리펩타이드의 특이도
우리는 재조합 CD137-Fc 융합 단백질(#838-4B-100, R&D Systems)에 대한 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드의 특이도를 측정하기 위해 ELISA 분석을 사용하였다. SEQ ID NOs: 34 및 35의 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. 표적을 PBS(1㎍/mL)에 녹이고, 4℃에서 밤새 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 각 배양 단계 후 100㎕/L의 PBS-T로 플레이트를 5회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS-T에 녹인 2% BSA(w/v)로 차단한 후 세척하였다. CD137-특이 항체 또는 융합 폴리펩타이드를 농도별로 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 세척 단계를 수행하였다. 결합된 융합 단백질은 PBS-TB에서 1:5000으로 희석된 HRP에 컨쥬게이트 된 마우스 항-인간 IgG Fab 항체(Jackson Laboratories)로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후 검출되었다. 추가의 세척 단계 후, 형광성 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고, 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 검출하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 3에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 2에 제공된다. 시험된 모든 분자에 대해 관찰된 EC50 값은 매우 유사하고, 1.5 nM 내지 2.3 nM 범위였다. 실험은 기술된 융합 폴리펩타이드에 포함될 때, 항체는 CD137에 대한 활성의 손실 없이 항체의 4개의 말단 중 어느 하나에서 리포칼린 뮤테인과 융합될 수 있음을 보여준다.
CD137 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 CD137 [nM]
SEQ ID NOs: 42 및 43 2.1 ± 0.03
SEQ ID NOs: 40 및 41 2.0 ± 0.02
SEQ ID NOs: 38 및 39 2.3 ± 0.02
SEQ ID NOs: 36 및 37 1.6 ± 0.02
SEQ ID NOs: 34 및 35 1.5 ± 0.03
실시예 4: ELISA-기반 세팅에서 융합 폴리펩타이드의 동시 표적 결합의 입증
GPC3 및 CD137과의 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드의 동시 결합을 입증하기 위해, 이중-결합 ELISA 포맷이 사용되었다. PBS(1　㎍/mL)에 녹인 재조합 인간 CD137-Fc 융합 단백질(R&D Systems)을 4℃에서 밤새 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 각 배양 단계 후 100㎕ PBS-T로 플레이트를 5회 세척하였다. PBS-T에 녹인 2% BSA(w/v)로 실온에서 1시간 동안 플레이트를 차단하고 나서 다시 세척하였다. 융합 폴리펩타이드를 농도별로 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하고 나서 세척 단계를 수행하였다. 이후에, 비오틴화 된 인간 GPC3를 PBS-TB에 1㎍/mL의 일정 농도로 첨가하였다. 세척 후 엑스트라비딘-HRP(Sigma-Adrich, PBS-TB로 1:5000 희석)를 웰에 1시간 동안 첨가하였다. 추가 세척 단계 후, 형광성 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 4에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 3에 제공된다. 모든 융합 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드가 GPC3 및 CD137을 동시에 결합시킬 수 있음을 입증하는, 1.7-2.1 nM 범위의 EC50 값을 갖는 명확한 결합 시그널을 나타냈다.
동시 표적 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 이중 결합 [nM]
SEQ ID NOs: 42 및 43 1.92 ± 0.27
SEQ ID NOs: 40 및 41 1.97 ± 0.32
SEQ ID NOs: 38 및 39 2.06 ± 0.36
SEQ ID NOs: 36 및 37 1.74 ± 0.25
실시예 5: 인간 GPC3에 대한 항체 및 융합 폴리펩타이드의 친화도
재조합 인간 GPC3(R&D Systems #2119-GP-050/CF)에 대한 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인과 SEQ ID NOs: 42 및 43뿐만 아니라 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41의 융합 폴리펩타이드의 결합 친화도는 Biacore T200 instrument(GE Healthcare)를 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정되었다. SPR 친화도 분석에서, 비오틴화 된 GPC3는 Biotin CAPture Kit(GE Healthcare)를 사용하여 센서 칩("CAP chip") 상에서 포획되었다: 센서 칩 캡은 ssDNA 올리고가 미리 고정되어 있다. 희석하지 않은 비오틴 캡쳐 시약(상보적 ss-DNA 올리고가 결합된 스트렙타비딘)을 300초 동안 2㎕/min의 유속으로 처리하였다. 리포칼린 뮤테인의 분석을 위해, 1㎍/mL의 농도의 비오틴화 된 GPC3를 사용하였고, 융합 단백질을 위해서는 0.25㎍/mL의 비오틴화 된 GPC3가 사용되었다. 비오틴화 된 GPC3를 5㎕/min의 유속으로 300초 동안 처리하였다. GPC3는 실온에서 2시간 동안 EZ-Link® NHS-PEG4-Biotin(5-배 몰 초과, Thermo Scientific)와 인큐베이션 하여 비오틴화되었다. 과량의 미반응 비오틴 시약은 반응 혼합물을 ZebaTM Spin Desalting Plate(Thermo Scientific)에 로딩하여 제거하였다. 레퍼런스 채널에는 비오틴 캡쳐 시약만을 로딩하였다.
친화도를 측정하기 위해, GPC3를 칩 표면상에 고정하고, 각 시험된 시약(융합 폴리펩타이드 또는 리포칼린 뮤테인)의 4개의 다른 농도(11.1, 3.7, 1.2 및 0.4 nM)은 러닝 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Surfactant P20, 3 mM EDTA, pH 7.4(GE Healthcare))에서 제조하고, 칩 표면에 처리하였다. 30㎕/min의 유속으로 처리하면서, 시료 접촉 시간은 180초로 하고, 분리 시간은 1200초로 하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행되었다. 센서 칩 캡 표면의 재생은 6 M guanidinium-HCl 및 0.25 M NaOH를 주입한 후 러닝 버퍼로 추가 세척하고 120초의 안정화 기간을 통해 달성되었다. 단백질 측정에 앞서, 컨디셔닝 목적을 위해 3회의 재생 사이클을 수행하였다. 데이터는 Biacore T200 평가 소프트웨어(V 2.0)로 평가되었다. 이중 참조가 사용되었고, 원시 데이터를 조정하기 위해 1:1 결합 모델을 사용하였다.
데이터는 도 5에 도시되며, 조정 결과는 표 4에 요약하였다. 데이터로부터 융합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인과 매우 유사한 친화도로 GPC3에 결합한다는 결론을 얻을 수 있다. 융합 폴리펩타이드의 경우 겉보기 결합 친화도는 17-30 pM의 범위이고, SEQ ID NO: 10의 리포칼린 뮤테인의 경우 겉보기 결합 친화도는 12 pM이었다.
GPC3에 대한 결합 친화도
명칭 KD [pM]
SEQ ID NO: 10 12
SEQ ID NOs: 36 및 37 24
SEQ ID NOs: 42 및 43 30
SEQ ID NOs: 40 및 41 17
SEQ ID NOs: 38 및 39 20
실시예 6: 인간 CD137에 대한 항체 및 융합 폴리펩타이드의 친화도
재조합 인간 CD137-Fc 융합 단백질(#838-4B-100, R&D Systems)에 대한 SEQ ID NOs: 34 및 35의 항체와 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드의 결합 친화도는 실시예 5와 유사하게 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다. 간략하게, 비오틴화 된 CD137-Fc는 센서 칩 캡 상에 포획되고, 각 시험된 시약(융합 단백질 또는 SEQ ID NOs: 34 및 35)의 4개의 희석액(20, 5, 1.3 및 0.3 nM)을 러닝 버퍼에서 제조하고, 칩 표면에 처리하였다. 30㎕/min의 유속을 적용하면서, 시료 접촉 시간은 180초로 하고, 분리 시간은 600초로 하였다. 이외의 모든 실험은 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하고 분석하였다.
결과는 표 5에 요약되었다. 데이터는 융합 폴리펩타이드가 항체와 매우 유사한 친화도로 CD137에 결합한다는 것을 보여준다. 겉보기 결합 친화도는 융합 단백질에 대해서는 71 - 179　pM, 항체 20H4.9(SEQ ID NOs: 34 및 35)에 대해서는 92　pM이었다.
CD137에 대한 결합 친화도
명칭 KD [pM]
SEQ ID NOs: 34 및 35 92
SEQ ID NOs: 36 및 37 71
SEQ ID NOs: 42 및 43 62
SEQ ID NOs: 40 및 41 101
SEQ ID NOs: 38 및 39 179
실시예 7: GPC3에 대한 리포칼린 뮤테인 Fc -융합 폴리펩타이드의 특이도
우리는 재조합 인간 GPC3에 대한 융합 폴리펩타이드, SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 특이도를 측정하기 위해 실시예 2에 기술된 ELISA 분석을 사용하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 7에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 6에 제공된다. 리포칼린 뮤테인 Fc-융합 폴리펩타이드에 대한 관찰된 EC50 값은 GPC3-결합 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 10)보다 더 양호하였다.
GPC3 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 GPC3 [nM]
SEQ ID NO: 44 0.07 ± 0.04
SEQ ID NO: 45 0.12 ± 0.02
SEQ ID NO: 10 0.32 ± 0.04
실시예 8: 인간 CD137에 대한 리포칼린 뮤테인 Fc -융합 폴리펩타이드의 특이도
우리는 실시예 3에 기술된 바와 같이 재조합 CD137-Fc 융합 폴리펩타이드에 대한 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 리포칼린 뮤테인 Fc-융합 폴리펩타이드의 특이도를 측정하기 위해 ELISA 분석을 사용하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 8에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 7에 제공된다. 리포칼린 뮤테인 Fc-융합 폴리펩타이드에 대한 관찰된 EC50 값은 CD137-결합 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 26)의 관찰된 EC50 값보다 양호하였다.
CD137 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 CD137 [nM]
SEQ ID NO: 44 0.13 ± 0.01
SEQ ID NO: 45 0.21 ± 0.01
SEQ ID NO: 26 0.43 ± 0.03
실시예 9: ELISA-기반 세팅서 리포칼린 뮤테인 Fc -융합 폴리펩타이드의 동시 표적 결합의 입증
GPC3 및 CD137에 대한 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 동시 결합을 입증하기 위해, 실시예 4와 유사하게 이중-결합 ELISA 포맷이 사용되었다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 9에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 8에 제공된다. 두 융합 폴리펩타이드 모두 1.7 nM에 가까운 EC50 값을 갖는 명확한 결합 시그널을 보여, 융합 폴리펩타이드는 GPC3 및 CD137을 동시에 결합시킬 수 있음을 입증하였다.
동시 표적 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 이중 결합[nM]
SEQ ID NO: 44 1.72 ± 0.26
SEQ ID NO: 45 1.70 ± 0.30
실시예 10: 인간 GPC3에 대한 항체 및 융합 폴리펩타이드의 친화도
재조합 인간 GPC3에 대한 SEQ ID NO: 10의 GPC-결합 리포칼린 뮤테인 및 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 결합 친화도는 실시예 5에 기술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다.
데이터는 도 10에 도시되었고, 조정된 KD 값은 표 9에 요약되어 있다. 데이터는 융합 폴리펩타이드가 리포칼린 뮤테인과 매우 유사한 친화도로 GPC3에 결합함을 보여준다. 리포칼린 뮤테인에 대한 33 pM의 겉보기 결합 친화도와 비교하여 융합 폴리펩타이드들에 대한 겉보기 결합 친화도는 각각 23 pM 및 29　pM이었다.
GPC3에 대한 결합 친화도
명칭 KD [pM]
SEQ ID NO: 10 33
SEQ ID NO: 44 29
SEQ ID NO: 45 23
실시예 11: 인간 CD137에 대한 항체 및 융합 폴리펩타이드의 친화도
재조합 인간 CD137-Fc 융합 단백질에 대한 SEQ ID NO: 26의 CD137-결합 리포칼린 뮤테인 및 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 결합 친화도는 실시예 6과 유사하게 측정되었다.
SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드에 대한 데이터는 도 11에 도시되었고, 모든 시험된 분자들에 대해 조정된 KD 값은 표 10에 요약되어 있다. 데이터는 융합 폴리펩타이드들이 2.3 nM의 값을 가진 리포칼린 뮤테인의 KD 값보다 우수한 각각 1 nM 또는 1.1 nM의 친화도로 CD137에 결합함을 보여준다.
CD137에 대한 결합 친화도
명칭 KD [nM]
SEQ ID NO: 26 2.3
SEQ ID NO: 44 1.1
SEQ ID NO: 45 1.0
실시예 12: GPC3에 대한 융합 폴리펩타이드의 특이도
우리는 SEQ ID NOs: 51 및 52의 CD137-결합 항체 및 SEQ ID NO: 10의 GPC3-결합 리포칼린 뮤테인에 기초한 추가의 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. 리포칼린 뮤테인은 (G4S)3 링커를 사용하여 중쇄의 C-말단에 융합되어 SEQ ID NOs: 53 및 54의 융합 폴리펩타이드를 생성하였다.
우리는 재조합 인간 GPC3에 대한 SEQ ID NOs: 53 및 54의 융합 폴리펩타이드의 특이도를 측정하기 위해 실시예 2에 기술된 ELISA 분석을 수행하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 12에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 11에 제공된다. GPC3에 대한 EC50은 융합 폴리펩타이드 및 리포칼린 뮤테인과 유사하다. 데이터는 융합 폴리펩타이드에 포함될 때 리포칼린 뮤테인이 GPC3에 대한 활성의 손실 없이 항체에 융합될 수 있음을 보여준다.
GPC3 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 GPC3 [nM]
SEQ ID NOs: 53 및 54 0.62 ± 0.05
SEQ ID NO: 10 0.55 ± 0.03
실시예 13: ELISA-기반 세팅에서 융합 폴리펩타이드의 동시 표적 결합의 입증
GPC3 및 CD137 둘 다에 대한 SEQ ID NOs: 53 및 54의 융합 폴리펩타이드의 동시 결합을 입증하기 위해 실시예 4와 유사하게 이중-결합 ELISA 포맷을 사용하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 13에 도시되었다. 융합 폴리펩타이드는 4.66±0.65　nM의 EC50 값으로 명확한 결합 시그널을 보여주어 폴리펩타이드가 GPC3 및 CD137에 동시에 결합할 수 있음을 입증하였다.
실시예 14: GPC3에 대한 융합 폴리펩타이드의 특이도
우리는 재조합 인간 GPC3에 대한 SEQ ID NO: 8의 리포칼린 뮤테인뿐만 아니라 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 이중특이적 융합 폴리펩타이드의 특이도를 측정하기 위해 실시예 2에 기술된 ELISA 분석을 사용하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 14에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 12에 제공된다. 융합 폴리펩타이드들에 대한 EC50 값은 리포칼린 뮤테인의 EC50 값과 적어도 동일하거나 더 우수하다. 데이터는 2개의 융합 폴리펩타이드에 포함될 때 리포칼린 뮤테인이 GPC3에 대한 활성의 손실 없이 항체에 융합될 수 있음을 입증한다.
GPC3 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 GPC3 [nM]
SEQ ID NO: 46 0.14 ± 0.02
SEQ ID NO: 47 0.16 ± 0.03
SEQ ID NO: 8 0.24 ± 0.02
실시예 15: 인간 CD137에 대한 융합 폴리펩타이드의 특이도
우리는 재조합 CD137-Fc 융합 단백질에 대한 SEQ ID NO: 26의 리포칼린 뮤테인뿐만 아니라 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 이중특이적 폴리펩타이드의 특이도를 측정하기 위해 실시예 3에 기술된 ELISA 분석을 사용하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 15에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 13에 제공된다. 융합 폴리펩타이드들에 대한 EC50 값은 리포칼린 뮤테인의 EC50 값과 적어도 동일하거나 더 우수하다. 데이터는 2개의 융합 폴리펩타이드에 포함될 때 항체가 CD137에 대한 활성의 손실 없이 리포칼린 뮤테인에 융합될 수 있음을 입증한다.
CD137 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 CD137 [nM]
SEQ ID NO: 46 0.20 ± 0.02
SEQ ID NO: 47 0.26 ± 0.01
SEQ ID NO: 26 0.28 ± 0.02
실시예 16: ELISA-기반 세팅에서 융합 폴리펩타이드의 동시 표적 결합의 입증
GPC3 및 CD137에 대한 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 이중특이적 폴리펩타이드의 동시 결합을 입증하기 위해 실시예 4와 유사하게 이중-결합 ELISA 포맷을 사용하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 16에 도시되었다. 융합 폴리펩타이드 둘 다 7.3-7.5　nM의 EC50 값으로 명확한 결합 시그널을 나타내어 두 융합 폴리펩타이드가 GPC3 및 CD137에 동시에 결합할 수 있음을 입증하였다.
동시 표적 결합에 대한 ELISA 데이터
명칭 EC50 이중 결합[nM]
SEQ ID NO: 46 7.30 ± 0.94
SEQ ID NO: 47 7.47± 0.79
실시예 17: 인간 GPC3에 대한 융합 폴리펩타이드의 친화도
재조합 인간 GPC3 및 재조합 인간 CD137에 대한 GPC3-결합 리포칼린 뮤테인 및 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 이중특이적 폴리펩타이드의 결합 친화도는 실시예 5에 기술된 과정과 유사하게 러닝 버퍼로 HBS-EP+(1x; BR-1006-69; GE Healthcare)를 사용하여 Biacore T200 instrument(GE Healthcare) 상에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다.
Biotin CAPture Kit(GE Healthcare)를 칩 표면상에 비오틴화 된 이중특이적 폴리펩타이드를 고정하는데 사용하였다. 이중특이적 폴리펩타이드는 표준 NHS 화학을 사용하여 비오틴화되었다. 희석하지 않은 비오틴 캡쳐 시약(ss-DNA 올리고와 결합된 스트렙타비딘)은 미리-고정된 상보적 ss-DNA 올리고로 센서 칩 캡 상에 포획되었다. 그 후, 1㎍/mL의 비오틴화 된 뮤테인을 5㎕/min의 유속으로 300초 동안 처리하였다.
GPC3는 30㎕/min의 유속에서 4개의 농도(300　nM, 100 nM, 33　nM 및 11　nM)로 처리되었다. GPC3는 180초 동안 주입되었고, 이후 분리 시간은 1200초로 설정되었다. 칩 표면의 재생은 10㎕/min의 유속으로 6　M Guanidinium-HCl + 0.25　M NaOH (120초)를 주입하여 달성되었다. 재생 용액의 주입 후 HBS-EP+(1x; BR-1006-69; GE Healthcare) 러닝 버퍼로 추가 세척 단계 및 120초의 안정화 기간을 거쳤다.
데이터는 대조 채널(비오틴 캡쳐 시약만 로딩함)에 대해 측정된 해당 시그널의 감산 및 결합 반응으로부터 버퍼 주입의 감산에 의해 이중-참조되었다. 결합 반응에 대한 결합 속도 상수 ka 및 해리 속도 상수 kd는 Biacore T200 평가 소프트웨어 V2.0를 사용하여 데이터 처리 및 동역학적 조정을 위해 측정되었다.
각각의 센서그램은 도 17에 도시되었다. 결과는 표 15에 요약되어 있다. 데이터는 이중특이적 폴리펩타이드가 각각 4.3 nM(SEQ ID NO: 46) 및 3.5 nM(SEQ ID NO: 47)의 친화도로 GPC3에 결합함을 보여준다.
GPC3에 대한 결합 친화도
명칭 KD [nM]
SEQ ID NO: 46 4.3
SEQ ID NO: 47 3.5
실시예 18: 인간 CD137에 대한 융합 폴리펩타이드의 친화도
재조합 인간 CD137-Fc 융합 단백질(#838-4B-100, R&D Systems)에 대한 CD137-결합 리포칼린 뮤테인 및 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47의 이중특이적 폴리펩타이드의 결합 친화도는 실시예 6과 유사하게 Biacore T200 장비(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다. SPR 친화도 분석에 앞서, CM5 센서 칩을 Human Antibody Capture Kit(GE Healthcare # BR-1008-39)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 항-인간 Fc 항체로 유도체화하였다.
친화도를 측정하기 위해, 인간 CD137-Fc 융합 단백질은 10㎕/min의 유속 및 180초의 접촉 시간에서 0.25mg/mL의 농도로 칩 상에서 고정되었다. 4종의 농도(1000 nM, 200 nM, 40 nM 및 8 nM)의 이중특이적 폴리펩타이드를 러닝 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Surfactant P20, 3 mM EDTA, pH 7.4(GE Healthcare))에서 제조하고 칩 표면에 처리하였다. 30㎕/min의 유속을 가하면서, 시료 접촉 시간은 180초, 분리 시간은 600초로 하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. 센서 칩 표면의 재생은 10 mM glycine pH 1.7의 주입 후 러닝 버퍼로 추가 세척 및 120초의 안정화 기간에 의해 달성되었다. 단백질 측정에 앞서, 3회의 재생 사이클이 컨디셔닝 목적으로 수행되었다. 데이터는 Biacore T200 평가 소프트웨어(V 2.0)로 평가되었다. 이중 참조가 사용되었고, 원시 데이터를 조정하기 위해 1:1 결합 모델을 사용하였다.
결과는 도 18에 도시하였고, 표 16에 요약되어 있다. 데이터는 이중특이적 폴리펩타이드가 적어도 CD137에 대한 리포칼린 뮤테인의 친화도만큼 우수한 친화도로 CD137에 결합함을 보여준다.
CD137에 대한 결합 친화도
명칭 KD [nM]
SEQ ID NO: 26 2.3
SEQ ID NO: 46 1.6
SEQ ID NO: 47 0.6
실시예 19: 코팅된 융합 폴리펩타이드를 이용한 기능적 T-세포 활성화 분석
우리는 T-세포 반응을 보조-자극하기 위한 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41, 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드의 능력을 평가하기 위해 T-세포 활성화 분석을 사용하였다. 이 목적을 위해, 농도별로 융합 폴리펩타이드를 항-인간 CD3 항체(OKT3, eBioscience)와 함께 플라스틱 접시 위에 코팅하고, 이후 가용성 항-인간 CD28 항체(Clone 28.2; eBioscience)의 존재하에서 코팅된 표면에서 정제된 T-세포를 인큐베이션 하였다. 판독값으로서, 우리는 상등액의 인터루킨 2(IL-2) 수준을 측정하였다. 음성 대조군으로서, 인간 IgG4 이소타입을 사용하였다. 이후에 우리는 실험의 구체적인 설명을 제공한다.
Biochrom의 프로토콜에 따라 폴리수크로스 밀도 구배(Biocoll 1.077g/mL from Biochrom)를 통한 원심분리에 의해 버피 코트에서 건강한 기증자의 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. Pan T-cell purification Kit(Miltenyi Biotec GmbH) 및 제조사의 프로토콜에 따라 생성된 PBMC로부터 T 림프구를 분리하였다. 정제된 T-세포는 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 버퍼에서 재현탁되고, 액체 질소를 사용하여 즉시 냉동하고, 추가로 사용할 때까지 액체 질소에서 저장하였다. 분석을 위해, T 세포를 16시간 동안 해동하고, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 배양하였다.
다음 과정은 각 실험 조건에 대해 3반복을 사용하여 수행되었다. 바닥이 평평한 조직 배양 플레이트를 0.5㎍/mL의 항-CD3 항체 및 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41, 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43의 융합 폴리펩타이드의 희석 계열(25㎍/mL, 2.5㎍/mL, 및 0.25㎍/mL) 또는 IgG4 이소타입 음성 대조군(25 ㎍/mL)의 혼합물 200㎕를 사용하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 동일한 실험 조건을 갖는 다른 세팅에서, 융합 폴리펩타이드를 항-CD3 항체 대신에 IgG1 이소타입(추가 음성 대조군으로서)과 함께 코팅하였다. 다음날, PBS로 웰을 2회 세척하고, 2㎍/mL의 항-hCD28 항체가 보충된 배양 배지에서 100㎕의 T-세포 현탁액(5×104 T 세포에 해당)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 가스 투과성 씰(4titude)로 덮고 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 이후에, 세포 증식뿐만 아니라 상등액 중의 IL-2 농도를 평가하였다.
풀드(pooled) 세포 배양 상등액에서 인간 IL-2 수준은 R&D Systems의 IL-2 DuoSet DuoSet kit를 이용하여 정량화되었다. 과정은 아래에 설명된 대로 수행되었다. 제1단계에서, PBS로 희석된 1㎍/mL의 "인간 IL-2 캡쳐 항체"(R&D System)로 384-웰 플레이트를 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 이후에, 웰을 Biotek EL405 select CW washer(Biotek)를 사용하여 80㎕의 PBS-T(0.05% Tween20를 포함하는 PBS)로 5회 세척하였다. 1% 카제인(w/w)을 추가로 포함하는 PBS-T에서 1시간 동안 차단한 후, 풀드 상등액 및 배양 배지로 희석된 IL-2 표준물질의 농도 계열을 384-웰 플레이트에서 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 포획된 IL-2의 검출 및 정량화를 가능케 하기 위해, 100ng/mL 비오틴화 된 염소 항-hIL-2-Bio 검출 항체(R&D System) 및 1㎍/mL의 설포태그-표지된 스트렙타비딘(Mesoscale Discovery)의 혼합물을 0.5% 카제인을 포함하는 PBS-T에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 25㎕의 리딩 버퍼를 각 웰에 첨가하고, 각 웰의 전기화학발광(ECL) 시그널을 메조스케일 디스커버리 리더를 이용하여 판독하였다. 분석 및 정량화는 메조스케일 디스커버리 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.
실험 결과는 도 19에 도시되어 있다. 4종의 융합 폴리펩타이드(SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NOs: 38 및 39, SEQ ID NOs: 40 및 41 그리고 SEQ ID NOs: 42 및 43) 모두, 음성 대조군인 이소타입 IgG4과 비교하여 사용된 T-세포에 의한 IL-2 생산의 명백한 유도가 있었다. 데이터는 폴리펩타이드 융합들의 더 높은 코팅 농도들에서 더 강한 IL-2 유도 경향을 보여준다. T-세포의 항-CD3 자극이 없는 경우, 융합 폴리펩타이드는 T-세포에 의한 IL-2 생산을 유도하지 않았다. 이는 융합 폴리펩타이드가 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극된 T-세포의 활성화를 차선의 농도로 보조-자극할 수 있음을 입증한다.
실시예 20: 종양 세포에 결합된 융합 폴리펩타이드를 이용한 기능적 T-세포 활성화 분석
우리는 GPC3-양성 세포주 상에 고정될 때 T-세포 반응을 보조자극하는 CD137 및 GPC3와 동시에 결합할 수 있는 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 능력을 평가하기 위해 표적-세포 의존적 T-세포 활성화 분석을 사용하였다. 음성 대조군으로, SEQ ID NOs: 34 및 35의 단일특이적 CD137-결합 항체를 사용하였다. 실험에서, 항-인간 CD3 항체(OKT3, eBioscience)를 플라스틱 배양 접시에 코팅하고, 이후에 GPC3-양성 HepG2 세포를 접시에서 밤새 배양하였다. 다음날, 정제된 T-세포를 SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NO: 44, 그리고 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드 또는 SEQ ID NOs: 34 및 35의 대조군 항체 1㎍/mL의 존재에서 코팅된 표면상에서 인큐베이션 하였다. 판독값으로, 상등액의 IL-2 수준을 측정하였다. 아래에 실험이 구체적으로 기술된다.
Biochrom의 프로토콜에 따라 폴리수크로스 밀도 구배(Biocoll 1.077g/mL from Biochrom)를 통한 원심분리에 의해 버피 코트에서 건강한 기증자의 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. Pan T-cell purification Kit(Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 생성된 PBMC로부터 T 림프구를 분리하였다. 정제된 T-세포는 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 버퍼에서 재현탁하고, 액체 질소를 이용하여 즉시 동결하고, 이후 사용할 때까지 액체 질소에서 저장하였다. 분석을 위해, T 세포를 16시간 동안 해동하고, FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 배양하였다.
다음 과정은 각 실험 조건에 대해 3반복으로 수행되었다. 바닥이 평평한 조직 배양 플레이트를 0.25㎍/mL 항-CD3 항체의 200㎕를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 미리-코팅하거나 그렇지 않았다. 이후에 PBS로 웰을 2회 세척하였다. 웰당 1.25×104 HepG2 종양 세포를 플레이팅하고, 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 밤새 부착되도록 하였다. HepG2 세포는 이전에 표준 조건하에서 배양하여 성장되었고, Accutase를 사용하여 탈착되었으며, 배양 배지로 재현탁되었다.
다음날, 종양 세포에 그들의 증식을 차단하기 위해 10㎍/mL의 농도의 마이토마이신 C(Sigma Aldrich)으로 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 100㎕의 T-세포 현탁액(5×104 T 세포에 해당) 및 1㎍/mL의 융합 폴리펩타이드 또는 음성 대조군을 각 웰에 첨가하였다. 가스 투과성 씰(4titude)로 플레이트를 덮고 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 이후에, 상등액 내 IL-2 농도를 아래에 기술된 바와 같이 평가하였다.
세포 배양 상등액 내 인간 IL-2 수준은 R&D Systems사의 IL-2 DuoSet 키트를 사용하여 정량화되었다. 과정은 아래에 기술된 대로 수행되었다. 제1단계에서, PBS로 희석된 1㎍/mL의 "인간 IL-2 캡쳐 항체"(R&D System)로 384-웰 플레이트를 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 이후에, Biotek EL405 select CW washer(Biotek)를 사용하여 80㎕의 PBS-T(0.05% Tween20를 포함하는 PBS)로 웰을 5회 세척하였다. 1% 카제인(w/w)을 추가로 포함하는 PBS-T에서 1시간 동안 차단한 후, 풀드 상등액 및 배양 배지로 희석된 IL-2 표준물질의 농도 계열을 384-웰 플레이트에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 포획된 IL-2의 검출 및 정량화를 가능케 하기 위해, 100ng/mL의 비오틴화 된 염소 항-hIL-2-Bio 검출 항체(R&D System) 및 1㎍/mL의 설포태그-표지된 스트렙타비딘(Mesoscale Discovery)의 혼합물을 0.5% 카제인을 포함하는 PBS-T에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 25㎕의 리딩 버퍼를 각 웰에 첨가하고, 각 웰의 전기화학발광(ECL) 시그널을 메조스케일 디스커버리 리더를 이용하여 판독하였다. 분석 및 정량화는 메조스케일 디스커버리 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.
실험 결과는 도 20에 도시되었다. SEQ ID NOs: 36 및 37, SEQ ID NO: 44, 그리고 SEQ ID NO: 45의 3종의 융합 폴리펩타이드의 경우, SEQ ID NOs: 34 및 35의 대조군 항체와 비교하여 사용된 T-세포에 의한 IL-2 생산의 명백한 유도가 있었다. 이는 GPC3-결합 융합 폴라펩타이드가 대조군 항체보다 IL-2 생산 수준이 더 높다는 것을 입증함으로써 본 개시물의 융합 폴리펩타이드가 표적-의존적 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극할 수 있음을 보여준다.
실시예 21: 이중특이적 결합의 차단의 유무에 따른 종양 세포에 결합된 융합 폴리펩타이드를 이용한 기능적 T 세포 활성화 분석
우리는 GPC3-양성 세포주에 결합될 때 T-세포 반응을 보조-자극하는 CD137 및 GPC3와 동시에 결합할 수 있는 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 능력을 평가하기 위해 실시예 20에 기술된 실험과 유사한 표적-세포 의존적 T-세포 활성화 분석을 사용하였다. 대조군으로, GPC3-양성 세포에 대한 결합으로부터 이중특이적 구조물 SEQ ID NO: 44 또는 SEQ ID NO: 45를 대체하기 위해 과량의 SEQ ID NO: 10의 단일특이적, GPC3-결합 안티칼린의 존재에서 실험을 수행하였다. 실험에서, 항-인간 CD3 항체(OKT3, eBioscience)를 플라스틱 배양 접시에 코팅하고, 이후에, GPC3-양성 Hep3B 세포를 접시에서 밤새 배양하였다. 다음날, SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45(1㎍/mL, 0.1㎍/mL, 0.01㎍/mL, 0.001㎍/mL)의 융합 폴리펩타이드의 4종의 농도의 존재에서 코팅된 표면상에서 정제된 T-세포를 인큐베이션 하였다. 병행하여, 과량의 SEQ ID NO: 10(1mg/mL)를 첨가하여 실험을 수행하였다. 판독값으로서, 상등액의 IL-2 수준을 측정하였다. 아래에 실험이 구체적으로 기술된다.
Biochrom의 프로토콜에 따라 폴리수크로스 밀도 구배(Biocoll 1.077 g/mL from Biochrom)를 통한 원심분리에 의해 버피 코트에서 건강한 기증자의 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. Pan T-cell purification Kit(Miltenyi Biotec GmbH) 및 제조사의 프로토콜에 따라 생성된 PBMC로부터 T 림프구를 분리하였다. 정제된 T 세포는 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 배양하였다.
다음 과정은 각 실험 조건에 대해 3반복을 사용하여 수행하였다. 평평한-바닥의 조직 배양 플레이트를 0.25㎍/mL의 항-CD3 항체 200㎕을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 미리 코팅하였다. 이후에 웰을 PBS로 2회 세척하였다. 웰당 1.25×104 Hep3B 종양 세포를 플레이팅하고 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 밤새도록 접착되도록 하였다. Hep3B 세포는 표준 조건하에서 배양하여 성장시킨 후 Accutase를 사용하여 탈착시키고 배양 배지에서 재현탁하였다.
다음날, 종양 세포의 증식을 차단하기 위해 10㎍/mL의 농도로 마이토마이신 C(Sigma Aldrich)를 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. PBS로 플레이트를 2회 세척하고, 100㎕의 T-세포 현탁액(5×104 T 세포에 해당)과 1㎍/mL, 0.1㎍/mL, 0.01㎍/mL, 0.001㎍/mL 농도의 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드를 과량의 SEQ ID NO: 10(1　mg/mL)의 존재 또는 부재에서 첨가하였다. 가스 투과성 씰 (4titude)로 플레이트를 덮고, 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션 하였다. 이후에, 제조사의 설명에 따라 BD Bioscience에 의한 인간 IL-2 ELISA 세트를 사용하여 ELISA에 의해 상등액 내 IL-2의 농도를 측정하였다.
실험 결과는 도 21에 도시하였다. 2개의 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NOs: 44(도 21A) 및 SEQ ID NO: 45(도 21C)의 경우 농도가 증가함에 따라 증가하는 사용된 T 세포에 의한 IL-2 생산의 명백한 유도가 있었다. 대조적으로, IL-2 생산 유도는 Hep3B 세포에 대한 이중 특이적 SEQ ID NOs: 44 및 SEQ ID NOs: 45의 결합을 억제하는 과량의 SEQ ID NO: 10의 존재에서 폐지된다. 이는 본 개시물의 융합 폴리펩타이드가 표적-의존적 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극할 수 있음을 나타낸다.
특히, 유도된 IL-2의 함량은 SEQ ID NO: 45와 비교하여 SEQ ID NOs: 44에서 더 높으며, 이는 이중특이적 GPC3/CD137 융합의 기하학이 T 세포 활성화의 강도를 결정하는데 중요한 역할을 한다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 22: 높고 낮은 GPC3 수준을 갖는 종양 세포를 이용한 기능적 T-세포 활성화 분석
우리는 사용된 세포주의 GPC3 수준에 의존적인 T-세포 반응을 보조자극하는 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 융합 폴리펩타이드의 능력을 평가하기 위해 실시예 20에 기술된 실험과 유사하게 표적-세포 의존적 T-세포 활성화 분석을 사용하였다. 음성 대조군으로서, HER2-결합 항체 트라스투주맙을 사용하였다. 비교를 위해, 우리는 SEQ ID NOs: 74 및 75의 표준 항-CD137 단클론 항체의 거동을 조사하였다. 실험에서, 항-인간 CD3 항체(OKT3, eBioscience)로 플라스틱 배양 접시를 코팅하고, 이후에, HepG2, SKBR3 또는 MCF7 세포를 접시에서 밤새도록 개별적으로 배양하였다. 다음날, 다양한 농도의 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, 표준 항체 SEQ ID NOs: 74 및 75, 그리고 음성 대조군 트라스투주맙과 비히클(즉, 시험물질의 첨가가 없는)의 존재에서 코팅된 표면에서 정제된 T-세포를 인큐베이션 하였다. 판독값으로서, 상등액의 IL-2 수준을 측정하였다. 아래에 실험이 구체적으로 기술된다.
Biochrom의 프로토콜에 따라 폴리수크로스 밀도 구배(Biocoll 1.077 g/mL from Biochrom)를 통한 원심분리에 의해 버피 코트에서 건강한 기증자의 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. Pan T-cell purification Kit(Miltenyi Biotec GmbH) 및 제조사의 프로토콜에 따라 생성된 PBMC로부터 T 림프구를 분리하였다. 정제된 T 세포는 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 버퍼에서 재현탁하고, 액체 질소를 사용하여 즉시 동결하고, 추가 사용 때까지 액체 질소에서 저장하였다. T 세포는 16시간 동안 해동하고 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 배양하였다.
다음 과정은 각 실험 조건에 대해 3반복을 사용하여 수행하였다. 평평한-바닥의 조직 배양 플레이트를 0.25㎍/mL의 항-CD3 항체 200㎕을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 미리 코팅하였다. 이후에 웰을 PBS로 2회 세척하였다. 웰당 5×104 표적 종양 세포를 플레이팅하고 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 밤새도록 접착되도록 하였다. 표적 세포는 표준 조건하에서 배양하여 성장시킨 후 Accutase를 사용하여 탈착시키고 배양 배지에서 재현탁하였다.
다음날, 종양 세포의 증식을 차단하기 위해 30㎍/mL의 농도로 마이토마이신 C(Sigma Aldrich)를 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. PBS로 플레이트를 2회 세척하고, 100㎕의 T-세포 현탁액(5×104 T 세포에 해당)을 0.05　nM 내지 5　nM 범위 농도의 시험물질 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, 표준 항체 SEQ ID NOs: 74 및 75, 및 음성 대조군 트라스투주맙과 함께 각 웰에 첨가하였다. 가스 투과성 씰 (4titude)로 플레이트를 덮고, 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션 하였다. 이후에, 아래 기술된 대로 상등액에서 IL-2의 농도를 평가하였다.
세포 배양 상등액 중 인간 IL-2 수준은 IL-2 DuoSet kit from R&D Systems를 사용하여 정량화되었다. 과정을 수행하고, 아래에 기술하였다. 제1단계에서, PBS로 희석된 1㎍/mL의 "인간 IL-2 포획 항체"(R&D System)로 실온에서 2시간 동안 384 웰 플레이트를 코팅하였다. 이후에, Biotek EL405 select CW washer(Biotek)를 사용하여 80㎕의 PBS-T(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)로 웰을 5회 세척하였다. 추가로 1% 카제인(w/w)를 포함하는 PBS-T에서 1시간 동안 차단한 후 풀드 상등액과 배양 배지로 희석된 IL-2 표준물질의 농도 계열을 384-웰 플레이트에서 4℃에서 밤새도록 인큐베이션 하였다. 포획된 IL-2의 검출 및 정량화를 위해, 100ng/mL의 비오틴화 된 염소 항-hIL-2-Bio 검출 항체(R&D System) 및 1㎍/mL의 설포태그-표지된 스트렙타비딘(Mesoscale Discovery)의 혼합물을 0.5% 카제인을 포함하는 PBS-T에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 25㎕의 리딩 버퍼를 각 웰에 첨가하고, 모든 웰의 전기화학발광(ECL) 시그널을 메조스케일 디스커버리 리더를 사용하여 판독하였다. 분석 및 정량화는 메조스케일 디스커버리 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
대표 실험 결과를 도 22에 도시하였다. 이 도면에서, 값은 시험물질의 부재하에서 백그라운드 IL-2 생산에 대해 상대적으로 표시되어 백그라운드와 비교된 배수(fold) 변화를 나타낸다. 음성 대조군인 트라스투주맙(도 22A, 삼각형)은 3개의 세포주 중 임의의 것과 T-세포에서 IL-2 유도를 일으키지 않지만, 이중특이적 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NO: 44(도 22A, 원형) 및 SEQ ID NO: 45(도 22A, 사각형)의 농도가 증가함에 따라 T-세포를 유도하여 GPC3-발현 HepG2 세포의 존재에서 IL-2를 생산하도록 한다. 그러나 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45로 인한 IL-2 증가는 GPC3 음성 SKBR3 및 MCF7 세포에 대해서는 명백하지 않다(도 22). 이 거동은 3개의 세포주 모두의 존재에서 T-세포상에 IL-2를 유도하는 항-CD137 항체 SEQ ID NOs: 74 및 75와는 현저하게 다르다(도 22B).
실험은 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45가 표적 세포 상의 GPC3의 존재에 의존하는 방식으로 T-세포를 활성화한다는 것을 명백하게 입증한다. GPC3-양성 HepG2 세포주는 IL-2 생산에 의해 측정된 바와 같이 명백한 T-세포 활성화를 나타내지만, GPC3의 검출 가능한 수준을 발현하지 않는 SKBR3 및 MCF7 세포에서는 이러한 효과가 일어나지 않는다. 이 효과는 GPC3의 존재에서 기인하고, 연구중인 GPC3 음성 세포주에서는 기인하지 않으며 잠재적으로 CD137 신호전달을 비효율적인 것으로 만드는 것은 항-CD137 항체 SEQ ID NOs: 74 및 75가 세 가지 세포 유형 모두와 CD137 신호전달을 통해 T-세포를 활성화할 수 있다는 사실에 의해 명백해진다.
실시예 23: 융합 폴리펩타이드의 엑스 비보 T 세포 면역원성 평가
인간에서 항-약물 항체의 형성의 위험을 조사하기 위해, 이중특이적 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45, 대조군 항체 트라스투주맙 및 양성 대조군 케이홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanine(KLH))의 인 비트로 T 세포 면역원성 평가를 수행하였다. 실험을 수행하기 위해, 전 세계 인구 분포를 반영한 인간 백혈구 항원(HLA) 동종형을 포함하기 위해 선택된 32명의 기증자 유래의 PBMC를 해동하고, 세척하고 96-웰 플레이트에 웰당 3×105 세포의 밀도로 씨딩하였다. 분석 배지로 희석된 시험물질을 30㎍/mL의 농도로 세포에 첨가하였다. 분석 배지만 블랭크로 사용하고, 케이홀 림펫 헤모시아닌은 나이브 양성 대조군으로 사용하였다. PBMC는 가습된 대기에서 37℃ 및 5% CO2에서 7일 동안 인큐베이션 하였다. 7일째에, PBMC는 표면 표현형 CD3+ 및 CD4+ 마커, 및 세포 증식 마커로 사용되는 DNA-결합된 EdU(5-ethynyl-2'deoxyuridine)에 대해 표지되었다. CD3+CD4+EdU+ 증식 세포의 비율은 Guava easyCyte 8HT 플로우 사이토미터를 사용하여 측정하였고, GuavaSoft InCyte 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 23은 32명 기증자 모두와 연구중인 모든 시험물질에 대해 이 분석의 결과를 제공한다. 도 23A에서, 시험물질의 유무에 따라 증식율에 의해 얻어진 자극 지수가 도시되었다. 응답 기증자(자극 지수 >2)를 정의하는 임계값은 점선으로 표시된다. 도 23B에서, 이 임계치에 의해 정의된 대로 응답하는 기증자의 수를 표시하였다. 분명히, 표준 트라스투주맙에 반응하는 기증자의 수는 1명에 불과하여 작으나, 32명의 기증자 모두 양성 대조군 KLH에 대해 임계치를 넘는 강한 증식으로 반응한다. 이중특이적 융합 폴리펩타이드 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45의 경우, 응답 기증자의 수는 두 경우 모두 1이다.
따라서, 이 실험은 이중특이적 융합 폴리펩타이드가 인 비트로 T 세포 면역원성 평가에서 거의 반응을 유도하지 않음을 나타내며, 이는 면역원성 반응을 유발할 위험이 낮음을 나타낸다.
실시예 24: Fc -감마 수용체 hFcγ RI/CD64 및 hFcγ RIIIA / CD16a의 친화도
Fc-감마 수용체 hFcγ RI/CD64(R&D Systems) 및 hFcγ RIIIA/CD16a(R&D Systems)에 대한 조작된 IgG4-기반 백본을 가진 폴리펩타이드 융합(SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45)의 결합 친화도를 평가하기 위해, 표면 플라즈몬 공명 기반 분석을 사용하였다. IgG1 백본을 가진 단일특이적 항체의 대조군으로 트라스투주맙을 제공하였다. SPR 친화도 분석에서, 폴리펩타이드 융합은 비오틴화되고, Biotin CAPture Kit(GE Healthcare)를 사용하여 센서 칩 캡 상에 포획되었다. 센서 칩 캡에는 ssDNA 올리고뉴클레오타이드가 미리 고정되어 있다. 희석하지 않은 비오틴 캡쳐 시약(상보적 ss-DNA 올리고뉴클레오타이드가 결합된 스트렙타비딘)은 2㎕/min의 유속으로 300초 동안 처리되었다. 이후에, 10㎍/mL의 비오틴화 된 폴리펩타이드 융합을 5㎕/min의 유속으로 300초 동안 처리하였다. 트라스투주맙 및 폴리펩타이드 융합은 EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴(Thermo Scientific)과 실온에서 2시간 동안 인큐베이션 하여 비오틴화되었다. 과량의 미반응 비오틴 시약은 반응 혼합물을 ZebaTM Spin Desalting Plate(Thermo Scientific)에 로딩하여 제거하였다. 레퍼런스 채널에는 비오틴 캡쳐 시약만 넣었다.
친화도를 측정하기 위해, 러닝 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Surfactant P20, 3 mM EDTA, pH 7.4(GE Healthcare))에서 hFcγ RI/CD64(100, 25 및 6.25 및 1.6 nM)의 4종의 희석 또는 hFcγ RIIIA/CD16a(1000, 333, 111, 37 및 12 nM)의 4종 내지 5종 희석을 제조하고 칩 표면에 처리하였다. 30㎕/min의 유속을 적용하면서, 시료 접촉 시간은 180초, 분리 시간은 hFcγ RI/CD64에 대해서는 1800/2700초로 hFcγ RIIIA/CD16a에 대해서는 300초로 하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. 센서 칩 캡 표면의 재생은 6 M Gua-HCl 및 0.25 M NaOH의 주입에 이어서 러닝 버퍼로 초과 세척하고, 120초의 안정화 시기를 거쳐 달성되었다. 단백질 측정 전에서 컨디셔닝 목적으로 3회의 재생 사이클을 수행하였다. 데이터는 Biacore T200 평가 소프트웨어(V 2.0)로 평가하였다. 이중 참조가 사용되었다. hFcγ RI/CD64의 경우, 원시 데이터를 조정하기 위해 1:1 결합 모델을 사용하였다. hFcγ RIIIA/CD16a의 경우 스테디 스테이트 친화도 모델을 사용하여 원시 데이터를 조정하였다.
표 17은 hFcγ RI/CD64에 대한 데이터의 조정 결과를 보여준다. IgG1-기반 시험물질인 트라스투주맙은 0.3 nM의 친화도를 나타냈다. 폴리펩타이드 융합 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45는 hFcγ RI/CD64에 대해 유의적인 결합을 보여주지 않았다. 이들 데이터는 hFcγ RI/CD64에 대한 결합이 이소타입을 IgG1에서 조작된 IgG4로 바꾸면 유의하지 않은 수준으로 감소될 수 있음을 입증한다.
클론 명칭 KD [nM]
트라스투주맙 0,3
SEQ ID NO: 44 검출되지 않음
SEQ ID NO: 45 검출되지 않음
표 18은 hFcγ RIIIA/CD16a에 대한 데이터의 조정 결과를 보여준다. IgG1-기반 시험물질 트라스투주맙의 hFcγ RIIIA/CD16a에 대한 생성된 결합 친화도는 350 nM 근처이나 폴리펩타이드 융합 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45는 hFcγ RIIIA/CD16에 대해 유의적인 결합을 보여주지 않았다. 이들 데이터는 hFcγ RI/CD64에 대한 결합이 이소타입을 IgG1에서 조작된 IgG4로 바꾸면 유의하지 않은 수준으로 감소될 수 있음을 입증한다.
명칭 KD [nM]
트라스투주맙 335 ± 64
SEQ ID NO: 44 검출되지 않음
SEQ ID NO: 45 검출되지 않음
실시예 25: 신생아 Fc 수용체에 대한 친화도
조작된 IgG4-기반 백본을 가진 폴리펩타이드 융합(SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45)의 신생아 Fc 수용체(FcRn, Sino Biologicals, #CT009-H08H)에 대한 결합 친화도를 측정하기 위해, 표면 플라즈몬 공명 기반 분석을 사용하였다. 트라스투주맙을 IgG1 백본을 가진 단일특이적 항체의 대조군으로 제공하였다. SPR 친화도 분석에서, FcRn은 제조사의 설명서에 따라 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에서 공유적으로 고정되었다. 간단히 말해, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC) 및 N-hydroxysuccinimide(NHS)로 덱스트란 매트릭스의 카르복실기를 활성화한 후, ~200 RU의 시그널이 도달할 때까지 표면상에서 FcRn 단백질의 1차 아민이 NHS 에스테르와 반응하도록 하였다. 마지막으로, 미반응 NHS-에스테르는 1M 에탄올아민의 용액을 표면을 통과시킴으로써 차단되었다. 고정화 과정 전반에 걸친 유속은 10㎕/min이었다.
그들의 친화도를 측정하기 위해, 러닝 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Surfactant P20, 3 mM EDTA, pH 6.0)에서 모든 구조물의 6종의 희석액(1000 nM, 333 nM, 111 nM, 37　nM, 12 nM 및 4 nM)을 제조하고 칩 표면에 처리하였다. 30㎕/min의 유속을 적용하면서, 시료 접촉 시간은 180초로, 분리 시간은 30초로 하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. 센서 칩 캡 표면의 재생은 10 mM glycine pH 3.0의 주입으로 달성되었다. 단백질 측정 전에, 컨디셔닝 목적을 위해 3회 재생 사이클을 수행하였다. 데이터는 이중 참조를 사용하여 Biacore T200 평가 소프트웨어(V 2.0)로 평가되었다. 원시 데이터를 조정하기 위해 스테디 스테이트 친화도 모델을 사용하였다.
표 19에 반영된 바와 같이, 모든 폴리펩타이드 융합의 FcRn에 대한 결합 친화도는 2 μM 근처이었고, 이는 이소타입을 IgG1에서 조작된 IgG4로 바꾸는 것은 FcRn 결합에 검출 가능한 영향을 미치지 않음을 입증한다.
명칭 KD [μM]
트라스투주맙 2.0
SEQ ID NO: 44 2.1
SEQ ID NO: 45 1.9
실시예 26: 마우스에서 융합 폴리펩타이드의 약물동력학
SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45로 정의된 융합 폴리펩타이드의 약물동력학의 분석을 마우스에서 수행하였다. 약 5주령의 수컷 CD-1 마우스(시간대별로 3마리 마우스; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH)의 꼬리 정맥 내로 10mg/kg의 투여량으로 융합 폴리펩타이드를 주사하였다. 시험물질은 5mL/kg의 부피를 볼루스로 사용하여 투여하였다. 마우스의 혈장 시료는 5분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 8일 및 14일의 시간대에 얻었다. 이소플루란 마취하에서 얻은 충분한 전혈을 수집하여 동물과 시간당 적어도 100㎕의 Li-Heparin 혈장을 얻었다. 약물 수준은 표적 GPC3 및 CD137에 의해 전체 이중특이적 구조물을 검출하는 샌드위치 ELISA를 사용하여 검출되었다. 데이터는 Prism GraphPad 5 소프트웨어를 이용한 2-구획 모델을 사용하여 조정하였다.
도 25는 구조물 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45에 대한 시간별 혈장 농도의 도표를 보여주며, 내부에 대수 도표에서의 동일한 데이터를 보여준다. 약물동력학은 두 경우 모두 비슷하게 보였다. 약 150㎍/mL의 혈장 농도에서 시작하여, 약 100시간 이내에 혈장 농도는 백그라운드 수준으로 떨어졌다. 2-구획 모델의 이중 지수 감쇠는 데이터를 정확하게 기재하기 위해 성공적으로 적용되었고, 이 모델을 이용한 데이터의 조정 시(도 25) SEQ ID NO: 44에 대해 13.7시간 그리고 SEQ ID NO: 45에 대해 10.0시간의 최종 반감기가 초래되었다.
데이터는 이중특이적 융합이 Fc 융합 단백질에 대해 예상될 수 있는 중간 범위의 반감기를 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 27: 필리핀 원숭이에서 융합 폴리펩타이드의 약물동력학
SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45로 정의된 융합 폴리펩타이드의 약물동력학의 분석을 필리핀 원숭이에서 수행하였다. 수컷 필리핀 원숭이는 60분에 걸쳐 3mg/kg 시험물질의 투여량으로 정맥내 주사를 받았다. 15 min, 2　h, 4　h, 8　h, 24　h, 48　h, 3　d, 4　d, 5　d, 6　d, 7　d, 9　d, 11　d, 14　d, 18　d 및 24　d의 시간대별로 필리핀 원숭이에서 혈장 시료를 얻었다. 약물 수준은 표적 HER2 및 CD137에 의해 전체 이중특이적 구조물을 검출하는 샌드위치 ELISA를 사용하여 검출되었다. 트라스투주맙 혈장 수준은 표적 HER2 및 인간 Fc와 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정되었다. 데이터는 Prism GraphPad 5 소프트웨어를 이용한 2-구획 모델을 사용하여 조정하였다. 도 26은 구조물 SEQ ID NO: 44 및 SEQ ID NO: 45에 대한 시간별 혈장 농도의 도표를 보여주며, 내부는 대수 도표에서의 동일한 데이터를 보여준다. 약물동력학은 두 경우 모두 비슷하게 보였다. SEQ ID NO: 44는 외관상 좀 더 긴 반감기를 나타낸다. 약 70㎍/mL의 혈장 농도에서 시작하여, 혈장 수준은 200시간에 걸쳐 0에 가까운 수준으로 떨어졌다. 2-구획 모델의 이중 지수 감쇠는 데이터를 정확하게 기재하기 위해 성공적으로 적용되었고, 이 모델을 이용한 데이터의 조정 시(도 26) 각각 SEQ ID NO: 44에 대해 39시간 그리고 SEQ ID NO: 45에 대해 24.1시간의 최종 반감기가 초래되었다.
그러므로 데이터는 이중특이적 융합이 마우스에서의 반감기와 비교하여 증가한 필리핀 원숭이에서의 최종 반감기를 가지며, 생물학적 치료제의 합리적인 범위를 가짐을 입증한다.
여기에 예시적으로 기재된 구현예들은 여기에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들이 없이 적당히 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는", "함유하는", "내포하는" 등은 광범위하고 제한없이 읽혀져야 한다. 또한, 여기에 사용된 용어들 및 표현들은 설명의 용어들로서 사용되었을 뿐 제한은 아니며, 도시되고 기술된 특징들 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하는 그러한 용어들 및 표현들의 사용에 대한 의도는 없으나, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형들이 가능한 것으로 간주된다. 따라서, 본 구현예들이 바람직한 구현예들과 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었다고는 하나, 이의 변형 및 변이들이 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 그러한 변형 및 변이들은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것으로 이해되어야 한다. 여기에 기재된 모든 특허, 특허출원, 교과서 및 동료 검토 논문들은 그들의 전체가 참조로 여기에 포함된다. 또한, 여기에 참조로 포함된 참고문헌에서 정의 또는 용어의 사용이 여기에 제공된 용어의 정의와 모순되거나 반대되는 경우, 여기에 제공된 해당 용어의 정의와 참조에서 해당 용어의 정의가 적용되지 않는다. 일반 개시물에 속하는 더 좋은 종 및 아속(sub-generic) 그룹화 각각 역시 본 발명의 일부를 형성한다. 삭제된 물질이 구체적으로 여기에 인용되는 지의 여부와 무관하게 속(genus)으로부터 임의의 대상을 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 가진 발명의 일반적인 설명이 포함된다. 또한, 특징이 마쿠쉬 그룹으로 기재되는 경우, 당업자는 개시물이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 서브그룹의 관점에서 기재됨을 인식할 것이다. 추가의 구현예들은 다음의 청구범위로부터 명백해질 것이다.
등가물: 당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 여기에 기재된 발명의 특정 구현예들에 대한 많은 등가물을 인식할 수 있거나 확인할 수 있다. 그러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 여기에 참조로 포함되는 것처럼 동등한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Pieris AG <120> Anti-Cancer fusion polypeptide <130> PIE15362PCT <150> EP15167927.1 <151> 2015-05-18 <150> EP16150508.6 <151> 2016-01-08 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 156 <212> PRT <213> artificial <220> <223> wildtype Tlc <400> 1 His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr 1 5 10 15 Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn 20 25 30 Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn 35 40 45 Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val 50 55 60 Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp 65 70 75 80 Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His 85 90 95 Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly 100 105 110 Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu 115 120 125 Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile 130 135 140 Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly 145 150 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ctgggctgcc tcgtgaagga ctacttcccc gagcctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480 gctctgacct ctggcgtgca caccttccct gctgtgctgc agtctagcgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctct aacttcggca cccagaccta cacctgtaac 600 gtggaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaccg tggaacggaa gtgctgcgtg 660 gaatgccccc cttgtcctgc ccctcctgtg gctggcccta gcgtgttcct gttcccccca 720 aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 780 gtgtcccacg aggaccccga ggtgcagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 840 aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag ttcaactcca ccttccgggt ggtgtccgtg 900 ctgaccgtgg tgcatcagga ctggctgaac ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac 960 aagggcctgc ctgcccccat cgaaaagacc atctctaaga ccaagggaca gccccgcgag 1020 ccccaggtgt acacactgcc tccatcacgg gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1080 acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc 1140 cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccatgctgg actccgacgg ctcattcttc 1200 ctgtactcca agctgacagt ggacaagtcc cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc 1260 tccgtgatgc 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<400> 71 gaggtccagc tggtgcagag cggtgccgaa gtcaagaagc ctggcgagag cctgcggatt 60 tcctgcaaag gaagcggata ctcattcagc acatactgga tctcttgggt caggcagatg 120 ccaggcaagg gactggagtg gatggggaaa atctaccccg gagacagtta cactaactat 180 tctccgagtt tccaaggcca ggtcactatc agcgctgata agtcaatttc caccgcctac 240 ctgcaatggt ccagcctgaa agcctccgac accgctatgt actattgcgc tcgggggtac 300 ggtatctttg attattgggg ccagggaacc ctggtgacag tctcgagcgc tagcaccaag 360 ggcccctccg tgtttcctct ggccccttgc tccagatcca cctccgagtc taccgccgct 420 ctgggctgcc tcgtgaagga ctacttcccc gagcctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480 gctctgacct ctggcgtgca caccttccct gctgtgctgc agtctagcgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctct aacttcggca cccagaccta cacctgtaac 600 gtggaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaccg tggaacggaa gtgctgcgtg 660 gaatgccccc cttgtcctgc ccctcctgtg gctggcccta gcgtgttcct gttcccccca 720 aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 780 gtgtcccacg aggaccccga ggtgcagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 840 aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag ttcaactcca ccttccgggt ggtgtccgtg 900 ctgaccgtgg tgcatcagga ctggctgaac ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac 960 aagggcctgc ctgcccccat cgaaaagacc atctctaaga ccaagggaca gccccgcgag 1020 ccccaggtgt acacactgcc tccatcacgg gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1080 acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc 1140 cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccatgctgg actccgacgg ctcattcttc 1200 ctgtactcca agctgacagt ggacaagtcc cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc 1260 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc 1320 gggaaaggcg gcggaggatc cgggggtggg ggaagcggcg gaggaggtag ccaggactcc 1380 actagcgatc tgatcccggc tccccctctg agtaaggtgc ccctgcaaca aaacttccaa 1440 gacaatcagt ttcagggcaa atggtacgtg gtcgggagag ctggtaacgt gggactgcga 1500 gaggacaagg acccccccaa aatgtgggcc accatctacg agctgaagga agacaaaagc 1560 tatgatgtga caaatgtcag gttcgcacgg aagaaatgca cttactcaat cggcaccttc 1620 gtgcccggct cccagcctgg ggagtttaca ctgggccaga ttaagagcga acctggcgga 1680 acagccaacc tggtgcgggt ggtctctact aactataatc agcacgctat ggtgttcttt 1740 aaagaggtct accagaaccg agaaatcttc tttatcatcc tgtacggccg taccaaggag 1800 ctgacatccg agctgaaaga aaacttcatc cgcttttcta agagtctggg actgccagaa 1860 aatcatattg tgtttcctgt cccaatcgac cagtgtattg atggg 1905 <210> 72 <211> 642 <212> DNA <213> artificial <220> <223> fusion polypeptide light chain <400> 72 tcctatgaac tgacacagcc tccttccgtg agcgtgagcc ctggacagac tgcttctatt 60 acttgtagcg gggataacat cggggatcag tacgcccact ggtatcagca gaagcccgga 120 cagagtcctg tgctggtcat ctaccaggac aaaaacaggc catcaggcat tcccgagcgg 180 ttctccggaa gcaactctgg gaataccgct acactgacta tctccggaac acaggcaatg 240 gacgaagccg attactattg cgctacctat acaggtttcg gctctctggc agtgtttggc 300 ggagggacta agctgaccgt cctgggccag cctaaagcgg cgccatccgt caccctgttc 360 cctccctcat ccgaggaact gcaggccaat aaggctacac tggtctgtct gattagcgac 420 ttctaccctg gggccgtgac tgtggcttgg aaagccgatt cttctcccgt gaaagctgga 480 gtggaaacaa ccaccccctc taaacagagc aacaacaaat acgctgcctc ttcatacctg 540 tccctgaccc ctgaacagtg gaaatctcac cggtcttact catgccaggt gacacacgag 600 ggatcaactg tggagaaaac cgtggctcct accgaatgtt ca 642 <210> 73 <211> 229 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG4-Fc with mutations <400> 73 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 74 <211> 448 <212> PRT <213> artificial <220> <223> reference antibody <400> 74 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 75 <211> 216 <212> PRT <213> reference antibody <400> 75 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (62)

  1. 적어도 두 개의 서브유닛을 포함하고, 제1 서브유닛은 CD137에 특이적이고, 제2 서브유닛은 GPC3에 특이적이되,
    제1 서브유닛은 SEQ ID NOs: 18-33로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CD137에 대해 결합 특이도를 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하고, 제2 서브유닛은 SEQ ID NOs: 4-17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 GPC3에 대해 결합 특이도를 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하는 CD137 및 글리피칸-3(GPC3) 둘 다와 결합할 수 있는 융합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    융합 폴리펩타이드는 5 nM 이하의 KD의 친화도로 CD137에 결합할 수 있고, 및/또는 융합 폴리펩타이드는 5 nM 이하의 KD의 친화도로 GPC3에 결합할 수 있는 융합 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    융합 폴리펩타이드는 CD137 및 GPC3에 동시에 결합할 수 있는 융합 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    융합 폴리펩타이드는 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있고, T-세포의 자극의 존재에서 IL-2 생산을 유도할 수 있으며, 및/또는 표적 세포 상의 GPC3 존재에 의존하는 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극할 수 있는 융합 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    하나의 서브유닛은 (Gly4Ser)3, SEQ ID NO: 48 또는 SEQ ID NO: 49로부터 선택된 펩타이드 링커를 통해 다른 서브유닛에 연결되는 융합 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    융합 폴리펩타이드는 SEQ ID NOs: 36 및 37에서 나타낸 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 38 및 39에서 나타낸 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 40 및 41에서 나타낸 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 42 및 43에서 나타낸 아미노산 서열, SEQ ID NO: 44에서 나타낸 아미노산 서열, SEQ ID NO: 45에서 나타낸 아미노산 서열, SEQ ID NO: 46에서 나타낸 아미노산 서열, SEQ ID NO: 47에서 나타낸 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 53 및 54에서 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  8. 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산으로부터 출발하여 생산되는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드의 인 비트로 생산방법.
  9. CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하고 동시에 GPC3-양성 종양 세포에 결합하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 제제.
  10. T 세포를 보조-자극하고 동시에 GPC3-양성 종양 세포에 결합하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 제제.
  11. T 림프구 증식을 유도하고 동시에 GPC3-양성 종양 세포에 결합하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 제제.
  12. CD137 클러스터링-유도된 활성화 된 T 세포를 GPC3-양성 종양 세포로 유도하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 제제.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
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