KR102641020B1 - 부패곰팡이에 항균 활성을 갖는 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주 및 이의 용도 - Google Patents
부패곰팡이에 항균 활성을 갖는 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 부패곰팡이에 항균 활성을 가지는 균주, 이를 유효성분으로 포함하는 생균제, 항균용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 균주는 치즈 부패 곰팡이의 생장 및 활성을 현저하게 억제할 수 있으므로, 치즈를 비롯한 식품의 부패 방지에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 부패곰팡이에 항균 활성을 가지는 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주, 이를 유효성분으로 포함하는 생균제, 항균용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
2011년 이후 EU, 미국, 호주, 뉴질랜드 등 낙농선진국과의 FTA 체결로 수입치즈의 양이 큰 폭으로 증가하고 있으며, 국내 1인당 치즈 소비량은 2005년 1.5 kg에서 2015년 2.6 kg으로 약 73% 증가하였다. 이에 발맞추어 국내 자연치즈의 소비량 및 국내 치즈 자급율도 증가하고 있는데, '자연치즈'란 우유에 효소를 넣어 응고 및 숙성시킨 발효식품이며, 그 중에서도 자연숙성치즈는 제조된 후에도 제품의 숙성과 풍미를 확보하기 위해 저온에서 계속 발효시키는 살아있는 식품으로서, 짧게는 24시간부터 길게는 수년간의 숙성기간을 거치게 된다. 미생물은 유제품의 제조와 숙성기간 동안에 맛, 향기, 질감 및 외형에 중요한 역할을 하는데, 유제품의 미생물학적 다양성과 개체량은 우유의 품질, 취급 및 열처리, 제조, 응결 처리 조건, 숙성기간의 온도 및 습도, 염분의 양, 제조 중 또는 제조 후 외인성 미생물에 노출된 정도에 따라 변화한다. 곰팡이는 일반적으로 산성조건 및 30 ℃에서 잘 증식하나 온도가 적당하면 건조식품에서도 증식한다. 효모 또한 증식할 수 있는 pH 범위가 넓고(pH 2.0~8.2) 곰팡이와 마찬가지로 약산성에서 잘자란다. 이들은 치즈 변질의 주요 원인이며, 여러 유형의 치즈에서 천이 과정에 중대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다
곰팡이는 종종 특정 품종의 치즈에 첨가되어 특이적 외형, 품질의 일관성 및 풍미를 제공하고, 유통 기한을 연장시키는 것으로 알려져 있으나, 이중 몇몇 곰팡이는 자연치즈 등과 같이 장기간의 숙성을 필요로 하는 유제품 등에서 부패를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 부패 유발 곰팡이의 독소는 간과 신장의 손상, 중추신경계의 이상구토 및 설사 등이 있으며, 장기적으로 노출되었을 경우에는 만성질환, 발암, 돌연변이, 태아 기형등을 유발할 수 있다고 보고되어 있다(Food Control 22(3-4):360-368). 따라서 이러한 치즈의 부패를 방지하기 위한 조성물의 연구 개발이 시급한 실정이다.
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 치즈에서 주로 분리되는 유해 곰팡이에 항균효과가 있는 균주를 발굴해내기 위하여 연구 노력한 결과, 본 발명의 미생물을 처리하는 경우 치즈 유해 곰팡이 균에 대한 현저한 항균효과를 가지면서, 우수한 염분내성, 저온내성, 건조내성 및 바이오필름 형성 효과를 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 이에, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는, 생균제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 처리하는 단계를 포함하는, 유해균 제거 또는 활성 억제 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 균주는 염분내성, 건조내성 및 저온내성으로 이루어진 군에서 선택되는 특성 하나 이상을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 균주는 바이오필름(biofilm) 형성능을 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는, 생균제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생균제는 치즈 부패곰팡이에 대해서 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 치즈 부패곰팡이는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항균용 조성물은 치즈 부패곰팡이에 항균 효과를 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 치즈 부패곰팡이는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 처리하는 단계를 포함하는, 유해균 제거 또는 활성 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계는 상기 균주를 3일에 한번씩 15일 동안 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 유해균은 치즈 부패곰팡이일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 치즈 부패곰팡이는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 부패곰팡이에 항균 활성을 가지는 균주, 이를 유효성분으로 포함하는 생균제, 항균용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 특정 균주를 이용하여 치즈 부패곰팡이의 생장 및 활성을 억제할 수 있으므로, 치즈를 비롯한 식품의 부패 방지를 위해 유용하게 활용될 수 있다.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명 미생물의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 미생물의 항균활성을 확인한 것으로서, 도 2의 A는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 도 2의 B는 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides), 도 2의 C는 페니실린 코뮨(Penicillium commune)에 대한 항균활성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명 미생물을 처리한 치즈에서 부패를 확인한 것으로서, 도 3의 A는 제조한지 1일된 치즈에서 부패를 관찰한 결과이고, 도 3의 B는 제조한지 3개월된 치즈에서 부패를 관찰한 결과이다.
도 4는 본 발명 미생물의 내염도를 NaCl 농도를 달리하면서 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명 미생물의 건조내성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명 미생물의 저온내성을 온도를 달리하면서 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명 미생물의 바이오필름 형성능을 확인한 것으로서, 도 7a는 본 발명 미생물의 바이오필름 형성능을 확인한 것이고, 도 7b는 바이오필름이 형성된 본 발명 미생물의 생존능을 확인한 것이다.
도 2는 본 발명 미생물의 항균활성을 확인한 것으로서, 도 2의 A는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 도 2의 B는 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides), 도 2의 C는 페니실린 코뮨(Penicillium commune)에 대한 항균활성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명 미생물을 처리한 치즈에서 부패를 확인한 것으로서, 도 3의 A는 제조한지 1일된 치즈에서 부패를 관찰한 결과이고, 도 3의 B는 제조한지 3개월된 치즈에서 부패를 관찰한 결과이다.
도 4는 본 발명 미생물의 내염도를 NaCl 농도를 달리하면서 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명 미생물의 건조내성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명 미생물의 저온내성을 온도를 달리하면서 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명 미생물의 바이오필름 형성능을 확인한 것으로서, 도 7a는 본 발명 미생물의 바이오필름 형성능을 확인한 것이고, 도 7b는 바이오필름이 형성된 본 발명 미생물의 생존능을 확인한 것이다.
본 발명자들은 치즈에서 주로 분리되는 유해 곰팡이에 항균효과가 있는 균주를 발굴해내기 위하여 연구 노력한 결과, 본 발명의 미생물을 처리하는 경우 치즈 유해 곰팡이 균에 대한 현저한 항균효과를 가지면서, 우수한 염분내성, 저온내성, 건조내성 및 바이오필름 형성 효과를 가지고 있음을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 제공한다.
상기 페디오코쿠스 펜토사세우스 M132-2 균주는 서열번호 1로 나타나는 염기서열의 16S rDNA를 가질 수 있으며, 미생물 기탁번호 KACC 92316P(미생물 명칭: Pediococcus pentosaceus M132-2)로 기탁된 균주일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는, 생균제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "항균"의 의미는 특정 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다. 항균용 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람양성균, 그람음성균, 진균(효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질 즉, 항세균 및 항진균 효력이 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 생균제 및 항균용 조성물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 치즈 부패곰팡이에 대하여 항균 활성을 가지는 것일 수 있으며, 상기 치즈 부패곰팡이는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 또는 페니실린 코뮨(Penicillium commune)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 생균제 또는 항균용 조성물은 상술한 균주 그 자체 또는 그의 배양물을 함유할 수 있고, 나아가 적합한 부형체 또는 담체를 추가로 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "생균제"는 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 살아있는 미생물 제제이고, 이는 독자적으로 섭취 또는 투여되거나 의약품, 식품 및 사료 또는 식이 첨가제 등에 포함되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "배양물"은 균주를 배지에 접종하고 일정시간 배양하여 얻은 결과물로서, 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체(조 배양물), 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액, 상기 배양액, 여액, 파쇄액을 추출한 추출액, 상기 배양액, 여액, 파쇄액, 추출액 등을 농축한 농축액 및 이들의 건조물 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "농축액"은 상기 배양액을 농축한 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "추출액"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 본 발명의 항균 효과를 나타낼 수 있는 추출물인 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 유해 미생물에 감염된 부분에 직접 투여하거나 적절한 형태의 조성물로 제조하여 투여할 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물의 투여량은 투여 대상에서 유해 미생물을 사멸시키는 효과를 발휘하기 위해 요구되는 정도의 양을 의미하는데, 제형의 종류 및 투여 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 가축 또는 어류에 사용하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서 제제화하고 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 분사제 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명에 따른 항균용 조성물은 농약, 의약, 화장품, 생활용품, 식품 등에서 항균, 살균, 소독, 방부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균목적으로 사용되어 질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 상술한 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 본 발명이 적용될 수 있는 상기 식품의 예로는 특별한 제한은 없으며, 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드 링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 바람직하게는 치즈일 수 있고, 통상적인 의미에서의 식품, 특히 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명에 따른 조성물을 함유하는 건강식품으로는 상기 균주, 이의 배양물, 또는 이로부터 분리된 항균물질을 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 유해균 생장 억제를 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 첨가제 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 상술한 유효 성분 각각을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품은 통상의 식품와 같이 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 외의 본 발명의 식품에는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 미생물이 치즈 부패곰팡이에 대해 우수한 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 미생물인 페디오코쿠스 펜토사세우스 M132-2가 치즈 부패곰팡이균으로 알려진 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune)의 생육을 억제하는 것을 확인하였고, 이는 실제 치즈에서 실험을 수행하였을 때에도 마찬가지로 확인되었다(실시예 2 참조).
상기와 같은 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 미생물이 치즈 부패 곰팡이균에 대하여 현저한 항균효과를 가지고 있으며, 실제 치즈에 실험을 수행하였을 때도, 갓 만든 치즈 및 숙성 치즈 모두에서도 우수한 항균효과를 보여줌을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 미생물은 치즈를 비롯한 낙농업 관련 제품의 부패 방지를 위해 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 처리하는 단계를 포함하는, 유해균 제거 또는 활성 억제 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 단계는 상기 균주를 3일에 한번씩 15일 동안 처리하는 것일 수 있다.
상기 유해균은 치즈 부패곰팡이 일 수 있으며, 상기 치즈 부패곰팡이는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명 미생물의 분리 및 계통 확인
청국장 1g을 취하여 멸균생리식염수 (0.85% NaCl) 9mL과 혼합하여 균질화 한 후 연속 희석법에 의해 10-4~ 10-7배 희석하였다. 희석액은 BCP 고체배지(Yeast extract 2.5g, peptone 5g, glucose 1g, tween 80 1g, L-cystein 0.1g, Bromocresol purple 0.1%(w/v), agar 15g, distilled water 1L)에 도말하여 37도의 온도로, 72시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지의 색이 노랗게 변화 되어 형성된 집락(colony)을 대항으로 선택한 후 순수배양하였다. 순수 분리시에는 Lactobacillus MRS 고형배지에 계대 배양 후 미생물을 순수 분리하였다.
본 발명 미생물의 염기서열을 구체적으로 확인하였을 때, 본 발명 미생물은 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것으로 확인되었으며, GenBenk의 BLAST 데이터와 비교하여 분자 생물학적 연관성을 나타내는 계통도(도 1)를 얻었다. 이 결과에 따라 본 발명의 미생물은 선발 미생물인 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)와 99%의 상동성으로 가장 가까운 유연관계를 나타내었다. 따라서 선발미생물을 페디오코쿠스 펜토사세우스로 동정하였고, 본 발명의 미생물을 페디오코쿠스 펜토사세우스(P. pentosaceus) M132-2로 명명하였다.
실시예 2. 본 발명 미생물의 항균 효과 확인
본 발명의 곰팡이인 페디오코쿠스 펜토사세우스(P. pentosaseus) M132-2가 치즈에서 주로 분리되는 유해 곰팡이를 저해할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 치즈에서 주로 분리되는 것으로 알려진 곰팡이인 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune) 각각에 대한 생육억제 저해 효과를 확인하였다.
① 상기 유해 곰팡이들은 PDA 배지에서 25℃, 3일 배양한 각 곰팡이 균은 포자를 긁어 0.75% PDA soft agar에 넣어 잘 섞고 PDA agar plate에 부어주었다. 유해 곰팡이에 항균 효과를 가지는 상등액은 배양된 페디오코쿠스 펜토사세우스 M132-2를 원심분리(9,950Хg, 4℃ 15 min)하여 회수한 상등액을 막 필터(0.45 ㎛ pore size, Millipore, Beverly, USA)로 제균하여 준비하였고, 항균활성은 agar well diffusion assay 방법을 이용하였다. 항균활성은 저해환의 반직경 크기에 따라 하기와 같이 구분하였다. 그 결과 본 발명의 미생물은 도 2에 나타낸 바와 같이 아스퍼질러스 나이거(도 2의 A) 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(도 2의 B) 및 페니실린 코뮨(도 2의 C)에 대해 우수한 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다.
② 또한, 상기와 같은 항균효과가 실제 치즈에서도 적용되는지 여부를 확인하기 위하여, 실제로 제조된 고다 치즈(Gouda cheese)를 사용하여 부패균 저해활성을 확인하였다. 갓 제조된 치즈는 숙성 온도인 15℃에서 보관되었고 코팅하지 않은 상태로 실험을 진행하였다. 실험은 치즈 표면에 페디오코쿠스 펜토사세우스 M132-2 상등액을 3일에 한번씩 분무하였고, 총 15일에 걸쳐서 진행되었다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 갓 제조된 치즈(도 3의 A) 및 제조 후 3개월 동안 숙성된 치즈(도 3의 B) 모두에서 본원발명의 미생물이 포함된 항균물질을 처리한 경우, 대조군(무처리 대조군)에 비해 곰팡이의 성장이 현저하게 저해된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 본 발명 미생물의 특성 확인
3-1. 염분내성 확인
본 발명 미생물의 내염성 실험을 위해 미생물을 24시간 37℃에서 전배양한 다음, 9 log CFU/mL로 조정하여 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%의 NaCl을 첨가한 MRS 액체 배지에 전배양한 균주 배양액을 1% 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. NaCl을 첨가하지 않은 대조군의 생균수와 비교하여 생존율을 계산한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 NaCl 1~7%까지는 90% 이상의 높은 생존율을 유지하였고, 10%의 NaCl 첨가한 배지에서는 약간 감소하여 75.1%의 생존율을 보였으며 구체적인 수치는 하기 표 1에 나타내었다.
| NaCl | survival rate (%) |
| 0% | 100.0 |
| 1% | 99.6 |
| 2% | 99.0 |
| 3% | 98.0 |
| 5% | 96.5 |
| 7% | 91.7 |
| 10% | 75.1 |
기존에 내염성 유산균으로 알려진 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mensenteroides) DSR1310은 2~4%에서 내염성 특성을 보인 반면 본 연구에서 분리한 유산균은 10%에서도 높은 생존율을 보여 넓은 범위의 염분에도 매우 높은 저항성을 가지고 있다고 판단된다. 또한 실제 자연숙성치즈는 염도가 2% 내외이기에 본 연구에서 분리한 균주의 생존율(99.0% 이상)을 고려할 때, 치즈 부패곰팡이에 대한 우수한 항균효과를 보여줄 것으로 예상된다.
3-2. 건조내성 확인
본 발명 미생물의 장기적 건조노출 분석을 위해 24시간 37℃에서 전배양시킨 후 9 log CFU/mL로 조정하여 12-well culture plate의 각 well에 200ul씩 접종하여 상온에서 10일간 방치하면서 건조시켰다. 각 시간별로 각각의 well에서 회수된 균체액을 MRS 고체 배지에 도말한 다음, 37℃에서 24시간 배양하고 계수하였다. 12-Well plate의 플라스틱 표면상에서 10일의 장기간 상온 방치 시에 따른 생균수의 변화를 측정한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 3일 건조 후 생균수는 유지되는 경향을 보였으며, 8일 건조 후에는 약 log 2 CFU/mL(생존율, 45%)의 균주가 생존해있었다. 일반적으로 세균은 2일 건조 후 생균수가 반 이하로 떨어지는데에 반해, 본 발명의 균주는 4일 건조까지는 매우 높은 수준의 생존율을 유지하고 있기에, 일반적인 균에 비해 우수한 건조 내성을 가지고 있는 것으로 판단된다.
3-3. 저온내성 확인
본 발명 미생물의 저온내성 실험을 위해 24시간 37℃에서 전배양시킨 후 9log CFU/mL로 조정하여 5℃, 15℃에서 24시간 배양한 후 35℃, 25℃에서 배양한 생균수와 비교하여 생존율을 계산하였다. 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 15℃ 내지 35℃의 온도에서 생존율의 변화가 확인되지 않았으며, 5℃까지 온도를 낮춘 경우에 생존율이 조금 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 구체적인 수치는 하기 표 2에 나타내었다.
| Temperature | survival rate (%) |
| Initial | 100.0 |
| 35℃ | 99.7 |
| 25℃ | 101.5 |
| 15℃ | 100.0 |
| 5℃ | 88.8 |
3-4. 바이오필름 형성능 확인
본 발명 미생물의 바이오필름 형성능력을 확인하기 위하여, crystal violet의 OD를 측정하는 microplate plate assay법을 이용하였고, 각 그룹간 평균과 표준편차를 계산하여 표기하였다. 37℃하루 밤 전배양된 페디오코쿠스 펜토사세우스 M132-2 배양액을 12-well tissue culture test plate의 각 well에 2mL씩 접종하여 3일 배양하였다. 배양 후 부유세균과 배양액을 제거한 후 2.5mL의 생리식염수로 3번 세척하였다. 잔여 식염수를 제거한 후 2mL의 99% methanol을 각 well에 분주하고 15분 동안 방치하여 biofilm을 표면에 부착시켰다. Methanol을 완전히 건조시키고 각 well마다 2mL의 0.2% crystal violet (Hucker, sigma) solution 분주 후 5분동안 방치하여 biofilm을 염색하였다. crystal violet solution을 제거하고 건조한 후 2.5mL 증류수로 1회 세척하고 33%(v/v) glacial acetic acid를 1.6mL씩 분주하여 착색된 crystal violet를 용출시켜 570nm에서 microtiter plate reader(Tecan, Sunrise)로 흡광도를 측정하였다. 본 발명의 미생물은 높은 OD값을 보여 주었고, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 우수한 바이오필름 형성능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 본원에 바이오필름 우수 균주로고 알려진 Bifidobacteria spp. 의 경우, porcine 1%로 바이오 필름을 유도했을 때, 2 내지 3 수준의 OD 값을 보여주는데, 본원발명의 박테리아 또한, 약 2.2 수준의 OD 값을 보여주어 높은 수준으로 바이오 필름을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 바이오 필름 생존율을 확인했을 때에도, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 접종 후 6일 가량의 시간이 경과해도 높은 수준의 바이오 필름 생존율을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본원발명의 미생물이 우수한 수준의 치즈 부패곰팡이에 대한 항균효과를 가지고 있으며, 우수한 수준의 염분내성, 건조내성, 저온내성 및 바이오필름 형성능을 가지고 있어 지속적으로 우수한 항균효과를 유지할 수 있음을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Microorganisms having antibacterial activity against spoilage
moulds and uses thereof
<130> PD20-333
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> 16S rDNA of Pediococcus pentosaceus M132-2
<400> 1
gaagkkgcgg gcggctaata catgcagtcg aacgaacttc cgttaattga ttatgacgta 60
cttgtactga ttgagatttt aacacgaagt gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt 120
aacctgccca gaagtagggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgt ataacagaga 180
aaaccgcatg gttttctttt aaaagatggc tctgctatca cttctggatg gacccgcggc 240
gtattagcta gttggtgagg taaaggctca ccaaggcagt gatacgtagc cgacctgaga 300
gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360
ggaatcttcc acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaagggtt 420
tcggctcgta aagctctgtt gttaaagaag aacgtgggta agagtaactg tttacccagt 480
gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540
gtggcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtc ttttaagtct 600
aatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa gtgcattgga aactgggaga cttgagtgca 660
gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc 720
agtggcgaag gcggctgtct ggtctgcaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg 780
aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gattactaag tgttggaggg 840
tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagtaatc cgcctgggga gtacgaccgc 900
aaggttgaaa ctcaaaagaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tctgacagtc taagagatta 1020
gaggttccct tcggggacag atgacagtgt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080
tgttgggtta agtccccgca cgagcgcacc cttattacta gttgccagca ttaagttggg 1140
cacttctagt gaagactgcc gggtgaacaa 1170
Claims (14)
- 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) M132-2 균주(기탁번호: KACC 92316P)를 유효성분으로 포함하는 항곰팡이 조성물로서,
상기 조성물은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치즈부패 곰팡이에 대해서 항곰팡이 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 항곰팡이 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 항곰팡이 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 염분내성, 건조내성 및 저온내성으로 이루어진 군에서 선택되는 특성 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는, 항곰팡이 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 바이오필름(biofilm) 형성능을 가지는 것을 특징으로 하는, 항곰팡이 조성물.
- 제1항에 따른 항곰팡이 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항곰팡이 생균제.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 항곰팡이 조성물을, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides) 및 페니실린 코뮨(Penicillium commune)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치즈부패 곰팡이에 처리하는 단계를 포함하는, 치즈부패 곰팡이 제거 또는 활성 억제 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 단계는 상기 항곰팡이 조성물을 상기 치즈부패 곰팡이에 3일에 한번씩 15일 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 삭제
- 삭제
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| Shiman Jiang 등, Microbial cell factories, 20(1), 페이지1-14, 2021(2021.02.16.)* |
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