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KR102646046B1 - Erbb2 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Erbb2 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR102646046B1
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Abstract

본 발명은 수용체 티로신-단백질 키나제 ErbB-2(ErbB2)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다. 결합 단백질은, 선택적으로 트라스투주맙과 같은 다른 ErbB2 항체와 함께 상승적으로, ErbB2 활성이 유해한 질병 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하거나, ErbB2-양성 세포 또는 종양의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 결합 단백질은 또한 ErbB2-양성 세포 내로 제제 또는 다른 ErbB2 항체, 예를 들어, 트라스투주맙의 내재화를 향상시키는데 사용될 수 있다.

Description

ERBB2 항체 및 이의 용도
관련 출원의 전후 참조
본 출원은 2017년 1월 6일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/443,078호를 우선권으로 주장하며, 이의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 예를 들어, 인간 암 요법에서 단독으로 또는 다른 ErbB2 항체(예를 들어, 트라스투주맙)와 함께, ErbB2 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
수용체 티로신-단백질 키나제 ErbB-2(ErbB2)는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 패밀리의 구성원이며, EGFR, ErbB3 및 ErbB4도 포함한다(Akiyama et al., Arch Biochem Biophys 245, 531-6 (1986); Rubin and Yarden, Ann Oncol. 12 Suppl 1: S3-82001 (2001)). ErbB2는 또한 종종 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)라고 불리며, 과학 문헌에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 4개의 수용체 각각은 세포외 리간드 결합 도메인, 막통과 도메인, 및 티로신 키나제 도메인을 포함하고 이의 C-말단이 다수의 신호전달 분자와 상호작용하는 세포내 도메인을 함유하며, 리간드-의존성 및 리간드-독립적 생물활성 둘 모두를 나타낸다(Marmor et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys 58, 903-13 (2004)). HER2는 임의의 EGFR 구성원, 즉, EGFR, ErbB3 및 ErbB4와 이종-이량체화되며, 다른 ErbB 수용체의 바람직한 이량체화 파트너로 고려된다. ErbB2가 트랜스-활성화되면, Ras-미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 및 PI3K-mTOR 캐스케이드를 포함하는 여러 하류 신호전달 캐스케이드를 활성화하여, 세포 증식을 촉진하고 아폽토시스를 회피한다(문헌[Citri et al., Nat Rev Mol Cell Biol 7: 505-16 (2006)]에서 검토됨). ErbB2는 정상적인 성인 조직에서 적당히 발현되며, 세포 성장 및 분화를 조절한다. ErbB2 단백질의 유전자 증폭 및 과발현은 유방암, 위암 및 난소암의 20-30%에서 보고되었다(King et al, Cancer Res 49: 4185-91 (1989); Slamon et al., Science 235: 177-82 (1987); Koeppen et al, Histopathology 38, 96-104 (2001)). 일반적으로, erbB2 유전자 증폭은 더 큰 전이 가능성 및 불량한 예후와 관련이 있다. ErbB2의 발현은 정상적인 조직에서 비교적 낮은 수준이기 때문에, 이는 표적화 요법을 위한 매력적인 표적이다(Drebin et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9129-33 (1986)).
트라스투주맙(CAS 180288-69-1, HERCEPTIN® Genentech)은 세포-기반 검정에서 높은 친화도로 인간 ErbB2 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 뮤린 HER2 항체의 재조합 인간화된 모노클로날 항체 버전이다(Kd = 5 nM)(Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-9 (1992)). 트라스투주맙은 시험관내 검정 및 마우스 이종이식 종양 모델 둘 모두에서 ErbB2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다(Hudziak et al., Mol Cell Biol 9, 1165-1172 (1989); Lewis et al., Immunol Immunother 37, 255-263 (1993)). 종양 세포에 대한 직접적인 효과 외에도, 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)과 같은 면역 메커니즘을 포함하는 몇몇 작용 메커니즘이 제안되었다(문헌[Ben-Kasus et al., Mol Cell Biol 9, 1165-1172 (2007)]에서 검토됨). 트라스투주맙은 1998년에 광범위 사전 항암 요법 후 진행된 HER2-양성 또는 HER2-양성 전이성 유방암(MBC)으로도 알려진 ErbB2-과발현을 지닌 환자의 치료를 위해 승인되었다(Baselga et al., J Clin Oncol 14, 737-744(1996); Slamon et al., N Engl J Med 344, 783-792 (2001)). 그러나, 트라스투주맙 단독요법에 대한 환자의 반응은 상대적으로 낮고(약 15%) 오래가지 못한다(9개월의 중간 지속기간)(Cobleigh et al., Clin Oncol 17: 2639- 48 (1999)). 다른 한편으로, 트라스투주맙은 화학요법과 조합될 때, 아마도 ErbB2-구동 생존 경로의 중단으로 인해, 상승적 효과를 나타내는 것으로 보인다(Arteaga et al., Cancer Res 54: 3758-65 (1994)). 트라스투주맙이 단독 화학요법보다 HER2-양성 종양을 지닌 환자에게 현저히 더 나은 결과를 제공하지만, 사실상 모든 치료된 환자는 결국 이용 가능한 요법으로 진행될 것이다. HER2를 과발현하는 암을 지닌 환자의 결과를 개선할 기회가 남아있다.
항체-표적화된 요법에 대한 하나의 접근법은 항원-발현 암 세포에 특이적으로 세포독성 약물을 전달하기 위해 항체를 이용하는 것이다. 트라스투주맙에 연결된 메이탄시노이드 DM1로 구성된 "면역독소"라고 불릴 수 있는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)는 HER2-과발현 및 트라스투주맙-민감성 또는 트라스투주맙-내성 종양 세포주, 및 인간 유방암의 이종이식 모델에서 강력한 항종양 활성을 나타낸다. 트라스투주맙-MCC-DM1(T-DM1)은 HER2-지시 요법에 불응성인 질환을 갖는 환자에 대해 승인되었다(Beeram et al., Cancer 118, 5733-5740 (2007)). 그러나, T-DM1은 HER2+ 전이성 유방암(MBC)을 지닌 환자에서 1차 요법으로 사용될 때 트라스투주맙에 비해 이점이 없다.
대안적인 접근법은 조합 요법이며, 이는 (i) 내성 발달의 빈도를 감소시키고, (ii) 비-중첩 독성 및 유사한 치료 프로파일을 갖는 약물의 용량 감소, 및 결과적으로 치료 지수를 증가시키고, (iii) 다른 약물의 사용을 통해 세포를 한 약물에 감작시키고, (iv) 생물학적 활성에 대한 2개 약물에 의한 부가적 또는 상승적 효과를 이용함으로써 향상된 효능을 달성하는 이점을 갖는다(Pegram et al., Oncogene 18:2241-2251 (1999); Konecny et al., Breast Cancer Res. and 처리 67:223-233 (2001); Pegram et al., J. of the Nat. Cancer Inst. 96(10):739-749 (2004)).
HER2 이량체화 억제제 항체 및 EGFR 억제제는 암에 대한 조합 요법을 위해 보고되었다(US 2007/0020261). 페르투주맙(PERJETA®) 단독은 MBC 환자에서 치료 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 또한, 페르투주맙은 전이성 질환에 대해 사전 항-ErbB2 요법 또는 화학요법을 받지 않은 HER2-양성 전이성 유방암(MBC)을 지닌 환자의 치료를 위해 트라스투주맙 및 도세탁셀과 함께 사용되도록 지시된다(Baselga et al., J Clin Oncol 28, 1138-1144, (2010)).
단독으로 또는 다른 치료제, 예를 들어, 트라스투주맙과 함께 사용될 때, HER2-양성 종양 세포에 대해, 바람직하게는 상승적으로, 치료 효과를 갖는 신규한 ErbB2 항체에 대한 요구가 남아있다.
발명의 개요
본 발명은 5개의 항-HER2 항체 4C9, 4H2, 4G6, 5H12, 및 5G9 및 관련 결합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 약학적 조성물 뿐만 아니라 이들의 용도에 관한 것이다. 용어 "ErbB2 항체", "HER2 항체", "항-ErbB2 항체" 및 "항-HER2 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 ErbB2 또는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
결합 단백질이 제공된다. 결합 단백질은 수용체 티로신-단백질 키나제 ErbB-2(ErbB2)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 17-51 및 56-160으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 17-51로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다.
항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 17 및 18; SEQ ID NO: 19 및 20; SEQ ID NO: 21 및 22; SEQ ID NO: 23 및 24; SEQ ID NO: 25 및 26; SEQ ID NO: 27 및 32; SEQ ID NO: 27 및 33; SEQ ID NO: 27 및 34; SEQ ID NO: 27 및 35; SEQ ID NO: 27 및 36; SEQ ID NO: 27 및 37; SEQ ID NO: 27 및 38; SEQ ID NO: 28 및 32; SEQ ID NO: 28 및 33; SEQ ID NO: 28 및 34; SEQ ID NO: 28 및 35; SEQ ID NO: 28 및 36; SEQ ID NO: 28 및 37; SEQ ID NO: 28 및 38; SEQ ID NO: 29 및 32; SEQ ID NO: 29 및 33; SEQ ID NO: 29 및 34; SEQ ID NO: 29 및 35; SEQ ID NO: 29 및 36; SEQ ID NO: 29 및 37; SEQ ID NO: 29 및 38; SEQ ID NO: 30 및 32; SEQ ID NO: 30 및 33; SEQ ID NO: 30 및 34; SEQ ID NO: 30 및 35; SEQ ID NO: 30 및 36; SEQ ID NO: 30 및 37; SEQ ID NO: 30 및 38; SEQ ID NO: 31 및 32; SEQ ID NO: 31 및 33; SEQ ID NO: 31 및 34; SEQ ID NO: 31 및 35; SEQ ID NO: 31 및 36; SEQ ID NO: 31 및 37; SEQ ID NO: 31 및 38; SEQ ID NO: 39 및 45; SEQ ID NO: 39 및 46; SEQ ID NO: 39 및 47; SEQ ID NO: 39 및 48; SEQ ID NO: 39 및 49; SEQ ID NO: 39 및 50; SEQ ID NO: 39 및 51; SEQ ID NO: 40 및 45; SEQ ID NO: 40 및 46; SEQ ID NO: 40 및 47; SEQ ID NO: 40 및 48; SEQ ID NO: 40 및 49; SEQ ID NO: 40 및 50; SEQ ID NO: 40 및 51; SEQ ID NO: 41 및 45; SEQ ID NO: 41 및 46; SEQ ID NO: 41 및 47; SEQ ID NO: 41 및 48; SEQ ID NO: 41 및 49; SEQ ID NO: 41 및 50; SEQ ID NO: 41 및 51; SEQ ID NO: 42 및 45; SEQ ID NO: 42 및 46; SEQ ID NO: 42 및 47; SEQ ID NO: 42 및 48; SEQ ID NO: 42 및 49; SEQ ID NO: 42 및 50; SEQ ID NO: 42 및 51; SEQ ID NO: 43 및 45; SEQ ID NO: 43 및 46; SEQ ID NO: 43 및 47; SEQ ID NO: 43 및 48; SEQ ID NO: 43 및 49; SEQ ID NO: 43 및 50; SEQ ID NO: 43 및 51; SEQ ID NO: 44 및 45; SEQ ID NO: 44 및 46; SEQ ID NO: 44 및 47; SEQ ID NO: 44 및 48; SEQ ID NO: 44 및 49; SEQ ID NO: 44 및 50; 및 SEQ ID NO: 44 및 51로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 가변 도메인을 포함할 수 있다.
항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 56-160으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다.
항원 결합 단편은 3개 CDR의 적어도 한 세트를 포함할 수 있고, 적어도 한 CDR 세트는 4C9 VH Set, 4C9 VL Set, 4H2 VH Set, 4H2 VL Set, 4G6 VH Set, 4G6 VL Set, 5F12 VH Set, 5F12 VL Set, 5G9 VH Set, 5G9 VL Set, 5F12.VH.V1 Set, 5F12.VH.1 Set, 5F12.VH.2 Set, 5F12.VH.3 Set, 5F12.VH.4 Set, 5F12.VL.V1 Set, 5F12.VL.1 Set, 5F12.VL.2 Set, 5F12.VL.3 Set, 5F12.VL.4 Set, 5F12.VL.5 Set, 5F12.VL.6 Set, 5G9.VH.V1 Set, 5G9.VH.1 Set, 5G9.VH.2 Set, 5G9.VH.3 Set, 5G9.VH.4 Set, 5G9.VH.5 Set, 5G9.VL.V1 Set, 5G9.VL.1 Set, 5G9.VL.2 Set, 5G9.VL.3 Set, 5G9.VL.4 Set, 5G9.VL.5 Set 및 5G9.VL.6 Set로 구성된 군으로부터 선택된다.
항원 결합 단편은 3개 CDR의 2개 CDR 세트를 포함할 수 있고, 2개 CDR 세트는 4C9 VH Set 및 4C9 VL Set; 4H2 VH Set 및 4H2 VL Set; 4G6 VH Set 및 4G6 VL Set; 5F12 VH Set 및 5F12 VL Set; 5G9 VH Set 및 5G9 VL Set; 5F12.VH.V1 Set 및 5F12.VL.V1 Set; 5F12.VH.1 Set 및 5F12.VL.V1 Set; 5F12.VH.2 Set 및 5F12.VL.V1 Set; 5F12.VH.3 Set 및 5F12.VL.V1 Set; 5F12.VH.4 Set 및 5F12.VL.V1 Set; 5F12.VH.V1 Set 및 5F12.VL.1 Set; 5F12.VH.1 Set 및 5F12.VL.1 Set; 5F12.VH.2 Set 및 5F12.VL.1 Set; 5F12.VH.3 Set 및 5F12.VL.1 Set; 5F12.VH.4 Set 및 5F12.VL.1 Set; 5F12.VH.V1 Set 및 5F12.VL.2 Set; 5F12.VH.1 Set 및 5F12.VL.2 Set; 5F12.VH.2 Set 및 5F12.VL.2 Set; 5F12.VH.3 Set 및 5F12.VL.2 Set; 5F12.VH.4 Set 및 5F12.VL.2 Set; 5F12.VH.V1 Set 및 5F12.VL.3 Set; 5F12.VH.1 Set 및 5F12.VL.3 Set; 5F12.VH.2 Set 및 5F12.VL.3 Set; 5F12.VH.3 Set 및 5F12.VL.3 Set; 5F12.VH.4 Set 및 5F12.VL.3 Set; 5F12.VH.V1 Set 및 5F12.VL.4 Set; 5F12.VH.1 Set 및 5F12.VL.4 Set; 5F12.VH.2 Set 및 5F12.VL.4 Set; 5F12.VH.3 Set 및 5F12.VL.4 Set; 5F12.VH.4 Set 및 5F12.VL.4 Set; 5F12.VH.V1 Set 및 5F12.VL.5 Set; 5F12.VH.1 Set 및 5F12.VL.5 Set; 5F12.VH.2 Set 및 5F12.VL.5 Set; 5F12.VH.3 Set 및 5F12.VL.5 Set; 5F12.VH.4 Set 및 5F12.VL.5 Set; 5F12.VH.V1 Set 및 5F12.VL.6 Set; 5F12.VH.1 Set 및 5F12.VL.6 Set; 5F12.VH.2 Set 및 5F12.VL.6 Set; 5F12.VH.3 Set 및 5F12.VL.6 Set; 5F12.VH.4 Set 및 5F12.VL.6 Set; 5G9.VH.V1 Set 및 5G9.VL.V1 Set; 5G9.VH.1 Set 및 5G9.VL.V1 Set; 5G9.VH.2 Set 및 5G9.VL.V1 Set; 5G9.VH.3 Set 및 5G9.VL.V1 Set; 5G9.VH.4 Set 및 5G9.VL.V1 Set; 5G9.VH.5 Set 및 5G9.VL.V1 Set; 5G9.VH.V1 Set 및 5G9.VL.1 Set; 5G9.VH.1 Set 및 5G9.VL.1 Set; 5G9.VH.2 Set 및 5G9.VL.1 Set; 5G9.VH.3 Set 및 5G9.VL.1 Set; 5G9.VH.4 Set 및 5G9.VL.1 Set; 5G9.VH.5 Set 및 5G9.VL.1 Set; 5G9.VH.V1 Set 및 5G9.VL.2 Set; 5G9.VH.1 Set 및 5G9.VL.2 Set; 5G9.VH.2 Set 및 5G9.VL.2 Set; 5G9.VH.3 Set 및 5G9.VL.2 Set; 5G9.VH.4 Set 및 5G9.VL.2 Set; 5G9.VH.5 Set 및 5G9.VL.2 Set; 5G9.VH.V1 Set 및 5G9.VL.3 Set; 5G9.VH.1 Set 및 5G9.VL.3 Set; 5G9.VH.2 Set 및 5G9.VL.3 Set; 5G9.VH.3 Set 및 5G9.VL.3 Set; 5G9.VH.4 Set 및 5G9.VL.3 Set; 5G9.VH.5 Set 및 5G9.VL.3 Set; 5G9.VH.V1 Set 및 5G9.VL.4 Set; 5G9.VH.1 Set 및 5G9.VL.4 Set; 5G9.VH.2 Set 및 5G9.VL.4 Set; 5G9.VH.3 Set 및 5G9.VL.4 Set; 5G9.VH.4 Set 및 5G9.VL.4 Set; 5G9.VH.5 Set 및 5G9.VL.4 Set; 5G9.VH.V1 Set 및 5G9.VL.5 Set; 5G9.VH.1 Set 및 5G9.VL.5 Set; 5G9.VH.2 Set 및 5G9.VL.5 Set; 5G9.VH.3 Set 및 5G9.VL.5 Set; 5G9.VH.4 Set 및 5G9.VL.5 Set; 5G9.VH.5 Set 및 5G9.VL.5 Set; 5G9.VH.V1 Set 및 5G9.VL.6 Set; 5G9.VH.1 Set 및 5G9.VL.6 Set; 5G9.VH.2 Set 및 5G9.VL.6 Set; 5G9.VH.3 Set 및 5G9.VL.6 Set; 5G9.VH.4 Set 및 5G9.VL.6 Set; 및 5G9.VH.5 Set 및 5G9.VL.6 Set로 구성된 군으로부터 선택된다.
항원 결합 단편은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함할 수 있고, CDR-H1은 SEQ ID NO: 56, 62, 68, 74, 80, 86, 89, 92, 95, 98, 122, 125, 128, 131, 134 및 137로 구성된 군으로부터 선택되고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 57, 63, 69, 75, 81, 87, 90, 93, 96, 99, 123, 126, 129, 132, 135 및 138로 구성된 군으로부터 선택되고; CDR-H3는 SEQ ID NO: 58, 64, 70, 76, 82, 88, 91, 94, 97, 100, 124, 127, 130, 133, 136 및 139로 구성된 군으로부터 선택되고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 59, 65, 71, 77, 83, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 140, 143, 146, 149, 152, 155 및 158로 구성된 군으로부터 선택되고; CDR-L2는 SEQ ID NO: 60, 66, 72, 78, 84, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 141, 144, 147, 150, 153, 156 및 159로 구성된 군으로부터 선택되고; CDR-L3은 SEQ ID NO: 61, 67, 73, 79, 85, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 142, 145, 148, 151, 154, 157 및 160으로 구성된 군으로부터 선택된다.
결합 단백질은 인간 억셉터 프레임워크 서열을 추가로 포함할 수 있다. 인간 억셉터 프레임워크 서열은 SEQ ID NO: 3-10으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 억셉터 프레임워크 서열은 SEQ ID NO: 3-10 및 161-166으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 억셉터 프레임워크 서열은 핵심 잔기에서 적어도 하나의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 핵심 잔기는 CDR에 인접한 잔기; 당화 부위 잔기; 희귀 잔기; 인간 ErbB2와 상호작용할 수 있는 잔기; CDR과 상호작용할 수 있는 잔기; 정규 잔기; 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기; Vernier 구역 내의 잔기; 및 Chothia-정의된 가변 중쇄 CDR1과 Kabat-정의된 제1 중쇄 프레임워크 사이에서 중첩되는 영역의 잔기로 구성된 군으로부터 선택된다.
결합 단백질이 핵심 잔기에 적어도 하나의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하는 인간 억셉터 프레임워크 서열을 포함하는 경우, 결합 단백질은 컨센서스 인간 가변 도메인 서열을 추가로 포함할 수 있다.
인간 억셉터 프레임워크가 적어도 하나의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하는 경우, 인간 억셉터 프레임워크는 인간 생식계열 억셉터 프레임워크의 서열과 적어도 약 65% 동일한 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 인간 생식계열 억셉터 프레임워크와 동일한 적어도 70개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 결합 단백질은 면역글로불린 분자, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR-그래프팅된 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 디아보디, 다중특이적 항체, 이중 특이적 항체, 및 이특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
결합 단백질은 항체일 수 있다. 항체는 모노클로날 항체, 전장 사량체 면역글로불린, IgG 분자, IgG1 분자, 키메라 항체, CDR-그래프팅된 항체, 인간화된 항체, 및 친화도 성숙 항체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 결합 단백질은 인간화된 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
용어 "ErbB2-매개된 생물활성" 및 "ErbB2 활성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 세포, 조직, 기관 또는 대상체와 같은 생물학적 시스템, 또는 샘플에서 ErbB2에 의해 유발되거나 방해되는 생물학적 활성을 지칭한다. ErbB2-매개된 생물활성 또는 ErbB2 활성은 ErbB2를 과발현하는 세포에서 상향조절될 수 있다. ErbB2-매개된 생물활성의 예는 자체의 동종이량체화, EGFR, 또는 ErbB3 또는 ErbB4와의 이종이량체화, ErbB2에 의해 조절되는 신호전달 경로 및 ErbB2-의존성 세포 성장을 포함한다. 샘플은 대상체로부터 얻을 수 있다. 세포는 대상체에 있을 수 있다.
대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간일 수 있다. 대상체는 ErbB2 활성이 유해한 질병 또는 장애로 고통받을 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "유해한"은 질병 또는 장애가 없는 대조군 대상체와 비교하여 질병 또는 장애를 갖는 대상체에서의 ErbB2 활성의 변경을 지칭한다. ErbB2 활성이 질병 또는 장애를 갖는 대상체에서 유해한 경우, ErbB2 활성은 질병 또는 장애를 갖지 않는 대조군 대상체에서보다, 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 더 높을 수 있다.
결합 단백질은 ErbB2-매개된 생물활성을 조절할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "조절하다"는 ErbB2-매개된 생물활성을 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다. ErbB2-매개된 생물활성이 변경된 경우, 결합 단백질은 변경된 ErbB2-매개된 생물활성을 중화시킬 수 있다. ErbB2-매개된 생물활성이 상향조절되는 경우, 결합 단백질은 상향조절된 ErbB2-매개된 생물활성을 감소, 억제, 차단, 또는 길항시킬 수 있다. 결합 단백질은, 예를 들어, 샘플 또는 세포에서 ErbB2-매개된 생물활성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 조절할 수 있다. 그러한 결합 단백질에 대해, 샘플 또는 세포에서 ErbB2-매개된 생물활성을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 유효량의 결합 단백질을 ErbB2-매개된 생물 활성을 갖는 샘플 또는 세포에 투여하여, ErbB2-매개된 생물활성이, 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 조절되는 것을 포함한다. 예를 들어, 샘플, 세포 또는 대상체에서 ErbB2-매개된 생물활성을 조절하기 위한 약제가 제공된다. 상기 약제는 유효량의 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 제조 방법은 결합 단백질을 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
결합 단백질은 ErbB2-양성 세포와 접촉시 상기 세포 내로 내재화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "ErbB2-양성 세포"는 ErbB2를 발현하는 세포를 지칭한다. 한 구체예에서, ErbB2-양성 세포는 ErbB2를 과발현한다. 그러한 결합 단백질은 항체-약물 컨쥬게이트(ADC) 적용에 사용될 수 있다. 결합 단백질은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 50%의 내재화율을 가질 수 있다. 결합 단백질은 세포내이입에 의해 내재화될 수 있다. 결합 단백질은 ErbB2와의 복합체로 내재화될 수 있다. 그러한 결합 단백질의 경우, 결합 단백질을 ErbB2-양성 세포 내로 내재화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포를 유효량의 결합 단백질과 접촉시켜, 결합 단백질이 세포 내로 내재화되는 단계를 포함한다. 세포는 대상체에 있을 수 있다. 결합 단백질을 ErbB2-양성 세포 내로 내재화하기 위한 약제가 제공된다. 상기 약제는 유효량의 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 제조 방법은 결합 단백질을 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
결합 단백질은 세포와 함께 접촉할 때, 동시에 또는 순차적으로, 추가 제제의 ErbB2-양성 세포 내로의 내재화를 향상시킬 수 있다. 향상은 소정의 기간 내에, 예를 들어, 접촉 후 약 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 또는 24시간 내에 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%일 수 있다. 추가 제제는 ErbB2에 결합할 수 있지만 결합 단백질과는 상이한 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. ErbB2는 인간 ErbB2일 수 있다. 추가 제제는 트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 접촉 후 2시간 내에 ErbB2 세포 내로 트라스투주맙의 내재화를 적어도 약 20%만큼 향상시킬 수 있다.
결합 단백질은 ErbB2-양성 세포의 성장을 억제할 수 있다. ErbB2 세포의 성장은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 억제될 수 있다. ErbB2-양성 세포는 BT474 세포일 수 있다. 결합 단백질은 BT474 세포의 성장을 적어도 약 70%만큼 억제할 수 있다.
결합 단백질은, 선택적으로 추가 ErbB2 항체와 상승적으로, ErbB2-양성 종양의 성장을 억제할 수 있다. ErbB2-양성 종양의 성장은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 억제될 수 있다. 종양은 추가 ErbB2 항체에 내성일 수 있다. 결합 단백질 및 동시에 또는 순차적으로 함께 사용되는 추가 ErbB2 항체에 의한 종양 성장의 상승적 억제는 결합 단백질 및 단독으로 사용된 추가 ErbB2 항체에 의한 부가적 억제보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 클 수 있다. 추가 ErbB2 항체는 트라스투주맙일 수 있다. 결합 단백질은 트라스투주맙과 함께 사용될 때 ErbB2-양성이고 트라스투주맙-내성인 종양의 성장을 적어도 약 70%만큼 억제할 수 있다.
결합 단백질 작제물이 또한 제공된다. 결합 단백질 작제물은 본 발명의 결합 단백질 및 링커 폴리펩티드 또는 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 면역글로불린 불변 도메인은 인간 IgM 불변 도메인, 인간 IgG1 불변 도메인, 인간 IgG2 불변 도메인, 인간 IgG3 불변 도메인, 인간 IgG4 불변 도메인, 인간 IgE 불변 도메인, 및 인간 IgA 불변 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인일 수 있다. 면역글로불린 불변 도메인은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질 작제물에서, 결합 단백질은 인간 당화 패턴을 가질 수 있다.
결합 단백질 컨쥬게이트가 추가로 제공된다. 결합 단백질 컨쥬게이트는 본 발명의 결합 단백질 작제물 및 영상화제, 치료제, 세포독성제, 및 면역부착 분자로 구성된 군으로부터 선택된 제제를 포함한다. 영상화제는 방사성표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자기 표지, 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 제제는 대사길항제, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항-혈관신생제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 및 아폽토틱제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 결합 단백질 컨쥬게이트에서, 결합 단백질은 인간 당화 패턴을 가질 수 있다. 결합 단백질 컨쥬게이트는 항체 컨쥬게이트일 수 있다.
결합 단백질 컨쥬게이트는 ErbB2-양성 세포와 접촉시 상기 세포 내로 내재화될 수 있다. 결합 단백질 컨쥬게이트는 세포내이입에 의해 내재화될 수 있다. 결합 단백질 컨쥬게이트는 ErbB2와의 복합체로 내재화될 수 있다. 그러한 결합 단백질 컨쥬게이트의 경우, 결합 단백질 컨쥬게이트를 ErbB2-양성 세포 내로 내재화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포를 유효량의 결합 단백질 컨쥬게이트와 접촉시켜, 결합 단백질 컨쥬게이트가 세포 내로 내재화되는 단계를 포함한다. 세포는 대상체에 있을 수 있다. 결합 단백질 컨쥬게이트를 ErbB2-양성 세포 내로 내재화하기 위한 약제가 제공된다. 상기 약제는 유효량의 결합 단백질 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 제조 방법은 결합 단백질 컨쥬게이트를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
결합 단백질은 결정으로서 존재할 수 있다. 결정은 담체-비함유 약학적 제어된 방출 결정이다. 결합 단백질 결정은 결합 단백질의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 가질 수 있다. 결합 단백질 결정은 비-결정 형태의 결합 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
결합 단백질 작제물은 결정으로서 존재할 수 있다. 결정은 담체-비함유 약학적 제어된 방출 결정이다. 결합 단백질 작제물 결정은 결합 단백질 작제물의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 가질 수 있다. 결합 단백질 작제물 결정은 비-결정 형태의 결합 단백질 작제물의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
결합 단백질 컨쥬게이트는 결정으로서 존재할 수 있다. 결정은 담체-비함유 약학적 제어된 방출 결정이다. 결합 단백질 컨쥬게이트 결정은 결합 단백질 컨쥬게이트의 가용성 대응물보다 더 큰 생체내 반감기를 가질 수 있다. 결합 단백질 컨쥬게이트 결정은 비-결정 형태의 결합 단백질 컨쥬게이트의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
본 발명의 각각의 결합 단백질에 대해, 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터도 제공된다. 벡터는 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, NV, 및 pBJ로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 원핵생물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 에스체리치아 콜리(Escherichia coli)일 수 있다. 숙주 세포는 진핵생물 세포일 수 있다. 진핵생물 세포는 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포, 및 진균 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 동물 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 및 곤충 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 COS 세포일 수 있다. 진균 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 곤충 세포는 Sf9 세포일 수 있다.
본 발명의 결합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 숙주 세포를 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 숙주 세포는 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 이 방법에 따라 생산된 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 결합 단백질을 방출하기 위한 방출 조성물이 제공된다. 조성물은 제형 및 적어도 하나의 중합성 담체를 포함한다. 제형은 결정화된 결합 단백질 및 성분을 포함한다. 중합성 담체는 폴리 (아크릴산), 폴리 (시아노아크릴레이트), 폴리 (아미노산), 폴리 (안하이드라이드), 폴리 (뎁시펩티드), 폴리 (에스테르), 폴리 (락트산), 폴리 (락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리 (b-하이드록시부티레이트), 폴리 (카프로락톤), 폴리 (디옥사논), 폴리 (에틸렌 글리콜), 폴리 ((하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리 [(오가노)포스파젠], 폴리 (오르토 에스테르), 폴리 (비닐 알콜), 폴리 (비닐피롤리돈), 말레산 안하이드라이드-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루론산 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고당류, 글리카미노글리칸, 설페이트화 다당류, 이의 블렌드 및 공중합체로 구성된 군으로부터 선택된 중합체일 수 있다. 성분은 알부민, 수크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 포유동물에서 방출 조성물로부터 결합 단백질을 방출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 포유동물에 유효량의 방출 조성물을 투여하여, 결합 단백질이 포유동물에서 방출되는 단계를 포함한다. 방출 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 제조 방법은 제형을 적어도 하나의 중합성 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
약학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 ErbB2 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가 제제를 더 포함할 수 있다. 추가 제제는 치료제; 영상화제; 항신생물제; 화학치료제; 혈관신생 억제제; 항-VEGF 항체; 항-EGFR 항체; 항-cMet 항체; 항-ErbB3 항체; 항-ErbB2 항체; 항-CD20 항체; 아플리버셉트(aflibercept); 키나제 억제제; 공동-자극 분자 차단제; 항-B7.2 항체; CTLA4-Ig; 부착 분자 차단제; 항-E 셀렉틴 항체; 항-L 셀렉틴 항체; 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편; 항-IL-18 항체; 항-TNF 항체; 항-IL-6 항체; 메토트렉세이트; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; DNA 알킬화제; 시스플라틴; 카르보플라틴; 항-튜불린제; 파클리탁셀; 도세탁셀; 독소루비신; 젬시타빈; 젬자(gemzar); 안트라사이클린; 아드리아마이신; 토포아이소머라제 I 억제제; 토포아이소머라제 II 억제제; 5-플루오로우라실(5-FU); 류코보린; 이리노테칸; 수용체 티로신 키나제 억제제, 아폽토시스 억제제; Bcl2/Bclx 억제제; 에를로티닙, 게피티닙, COX-2 억제제, 셀레콕시브, 사이클로스포린; 라파마이신; 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제; 마약; 진통제; 마취제; 진정제; 국소 마취제; 신경근 차단제; 항균제; 항건선제; 코르티코스테로이드; 단백동화 스테로이드; 에리트로포이에틴; 면역화; 면역글로불린; 면역억제제; 성장 호르몬; 호르몬 대체 약물; 방사성 의약품; 항우울제; 항정신병 약물; 자극제; 천식 약물; 베타 효능제; 흡입 스테로이드; 에피네프린; 이의 에피네프린 유사체; 사이토카인; 및 사이토카인 길항제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. ErbB2 활성은 질병 또는 장애에서 유해하다. 치료 방법은 대상체에 유효량의 본 발명의 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트를 투여하여, ErbB2 활성이 대상체에서 조절되는 단계를 포함한다. 질병 또는 장애는 유방암, 위암, 결장암, 직장암, 폐암, 입인두암, 후두인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담관암, 소장암, 요로암, 여성 생식관 암, 남성 생식관 암, 내분비샘 암, 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종, 뇌종양, 신경암, 눈 종양, 수막암, 조혈성 악성종양으로부터의 고형 종양, 종양 전이, 안구 혈관신생, 부종, 류마티스 관절염, 죽상경화성 플라크, 크론병, 염증성 장 질환, 난치성 복수, 건선, 사르코이드증, 동맥 동맥경화증, 패혈증, 소화성 궤양, 화상(bums), 췌장염, 다낭 난소병(POD), 자궁내막증, 자궁 섬유증, 양성 전립선 비대, T-세포 급성 림프모구 백혈병(T-ALL), 피질하 경색 및 백색질뇌증을 갖는 뇌 상염색체 우성 동맥병(CADA- SIL), 다발성 경화증(MS), 팔로네징후(TOF), 알라질 증후군(AS), 황반 변성 및 연령-관련 황반 변성 질환, 및 이상 ErbB2 활성을 특징으로 하는 다른 혈관신생 독립적 및 의존성 질병으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 질병 또는 장애는 원발성 및 전이성 암일 수 있다. 질병 또는 장애는 유방암일 수 있다. 여성 생식관 암은 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 융모막암종, 및 임신성 영양막병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 여성 생식관 암은 난소암일 수 있다. 질병 또는 장애는 위암일 수 있다. 질병 또는 장애는 폐암일 수 있다. 수막암은 별아교세포종, 신경아교종, 아교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 신경집종, 및 수막종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 조혈성 악성종양으로부터의 고형 종양은 백혈병, 호지킨 백혈병, 비호지킨 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 및 비호지킨 림프종일 수 있다. 안구 혈관신생은 당뇨병성 실명, 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 및 피부홍조로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 질환 또는 장애가 종양인 경우, 치료 방법은 대상체에서 종양의 성장을, 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 억제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 종양은 ErbB2-양성일 수 있다.
치료 방법에 따르면, 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트는 비경구, 피하, 근내, 정맥내, 동맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 관절낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장가로막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비내, 및 경피로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 모드에 의해 대상체에 투여될 수 있다.
치료 방법은 하나 이상의 추가 제제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 제제는 ErbB2에 결합할 수 있지만 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트와는 상이한 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. ErbB2는 인간 ErbB2일 수 있다. 하나 이상의 추가 제제는 트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 상기 방법은 대상체에서 하나 이상의 추가 제제와 상승적으로 ErbB2 활성을 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 동시에 또는 순차적으로 함께 사용되는 하나 이상의 추가 제제에 의한 상승적 효과는 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 단독으로 사용된 하나 이상의 추가 제제에 의한 부가적 효과보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 클 수 있다.
치료 방법은 치료적 유효량의 제2 제제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제2 제제는 메토트렉세이트; 인간 TNF에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린; 라파마이신, FK506; 비스테로이드 항염증제(NSAID); 방사선-치료제; 항신생물제; 화학치료제; DNA 알킬화제; 시스플라틴; 카르보플라틴; 항-튜불린제; 파클리탁셀; 도세탁셀; 탁솔; 독소루비신; 젬시타빈; 젬자; 안트라사이클린; 아드리아마이신; 토포아이소머라제 I 억제제; 토포아이소머라제 II 억제제; 5-플루오로우라실(5-FU); 류코보린; 이리노테칸; 수용체 티로신 키나제 억제제; 에를로티닙; 게피티닙; COX-2 억제제; 셀레콕시브; 키나제 억제제; 혈관신생 억제제; 항-VEGF 항체; 아플리버셉트(aflibercept); 공동-자극 분자 차단제; 항-B7.1 항체; 항-B7.2 항체; CTLA4-Ig; 항-CD20 항체; 부착 분자 차단제; 항-LFA-1 항체; 항-E 셀릭틴 항체; 및 항-L 셀렉틴 항체; 소분자 억제제; 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편; 항-IL-18 항체; 항-TNF 항체; 항-IL-6 항체; 항-사이토카인 수용체 항체; 검출 가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제; 마약; 진통제; 마취제; 진정제; 국소 마취제; 신경근 차단제; 항균제; 항건선제; 코르티코스테로이드; 단백동화 스테로이드; 에리트로포이에틴; 면역화; 면역글로불린; 면역억제제; 성장 호르몬; 호르몬 대체 약물; 방사성 의약품; 항우울제; 항정신병 약물; 자극제; 천식 약물; 베타 효능제; 흡입 스테로이드; 에피네프린; 에피네프린 유사체; 사이토카인; 및 사이토카인 길항제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
각각의 치료 방법에 대해, 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제가 제공된다. ErbB2 활성은 질환 또는 장애에서 유해하다. 약제는 유효량의 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제는 하나 이상의 추가 제제 및/또는 제2 제제를 추가로 포함할 수 있다. 약제를 제조하는 방법이 제공된다. 제조 방법은 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트를 약학적으로 허용되는 담체, 및 선택적으로 하나 이상의 추가 제제 및/또는 제2 제제와 혼합하는 단계를 포함한다.
ErbB2-양성 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 억제 방법은 세포를 유효량의 본 발명의 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 포함한다. ErbB2 세포의 성장은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 억제될 수 있다. ErbB2-양성 세포는 BT474 세포일 수 있다. 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트는 BT474 세포의 성장을 적어도 70%만큼 억제할 수 있다. 억제 방법은 세포를 하나 이상의 추가 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 제제는 ErbB2에 결합할 수 있지만 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트와는 상이한 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 하나 이상의 추가 제제는 세포의 성장을 상승적으로 억제할 수 있다. 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 동시에 또는 순차적으로 함께 사용되는 추가 ErbB2 항체에 의한 ErbB2-양성 세포의 성장의 상승적 억제는 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 단독으로 사용된 추가 ErbB2 항체에 의한 부가적 억제보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 클 수 있다. 하나 이상의 추가 제제는 트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 세포는 대상체에 있을 수 있다. 대상체는 ErbB2 활성이 유해한 질병 또는 장애로 고통받을 수 있다. 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간일 수 있다. 각각의 억제 방법에 대해, 대상체에서 ErbB2-양성 세포의 성장을 억제하기 위한 약제가 제공된다. 약제는 유효량의 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제는 하나 이상의 추가 제제를 추가로 포함할 수 있다. 약제를 제조하는 방법이 제공된다. 제조 방법은 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트를 약학적으로 허용되는 담체, 및 선택적으로 하나 이상의 추가 제제와 혼합하는 단계를 포함한다.
ErbB2-양성 종양의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 억제 방법은 종양을 유효량의 본 발명의 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 포함한다. 종양의 성장은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 억제될 수 있다. 억제 방법은 종양을 하나 이상의 추가 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 제제는 ErbB2에 결합할 수 있지만 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트와는 상이한 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 하나 이상의 추가 제제는 종양의 성장을 상승적으로 억제할 수 있다. 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 동시에 또는 순차적으로 함께 사용되는 추가 ErbB2 항체에 의한 종양 성장의 상승적 억제는 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 단독으로 사용된 추가 ErbB2 항체에 의한 부가적 억제보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 클 수 있다. 하나 이상의 추가 제제는 트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 종양은 트라스투주맙-내성일 수 있다. 추가의 ErbB2 항체가 트라스투주맙이고 종양이 트라스투주맙-내성인 경우, 종양의 성장은 트라스투주맙과 함께 사용된 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트에 의해 적어도 약 70%만큼 억제될 수 있다. 종양은 대상체에 있을 수 있다. 대상체는 ErbB2 활성이 유해한 질병 또는 장애로 고통받을 수 있다. 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간일 수 있다. 각각의 억제 방법에 대해, 대상체에서 ErbB2-양성 세포의 성장을 억제하기 위한 약제가 제공된다. 약제는 유효량의 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제는 하나 이상의 추가 제제를 추가로 포함할 수 있다. 약제를 제조하는 방법이 제공된다. 제조 방법은 결합 단백질, 결합 단백질 작제물 또는 결합 단백질 컨쥬게이트를 약학적으로 허용되는 담체, 및 선택적으로 하나 이상의 추가 제제와 혼합하는 단계를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 의해 분리된 환원된 IgG 분자의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 주: 레인 1 - 분자량 마커; 레인 2 - IgG 4C9; 레인 3 - IgG 4H2; 레인 4 - IgG 4G6; 레인 5 - IgG 5F12; 레인 6 - IgG 5G9.
도 2A-2E는 BT474 유방암 세포주의 세포 증식 억제에 대한 본 발명의 5개 항체 및 조합물의 용량-반응 곡선을 보여준다. BT474 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고 밤새 부착시켰다. 10% 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 실험을 수행하였다. 항-ErbB2 항체, 항체 혼합물, 또는 대조군 IgG를 첨가하고 세포를 37℃에서 144시간 동안 인큐베이션하였다. 50 μl의 CellTiter-Glo(PROMEGA, G7573)를 10분 동안 첨가한 후, 제조업체의 지시에 따라 발광 신호를 측정한다. 샘플 세트는 hIgG + mIgG(), hIgG + 트라스투주맙(), hIgG + 페르투주맙(), 트라스투주맙 + 페르투주맙(), 트라스투주맙 + 본 발명의 mAb(▲), 및 hIgG + 본 발명의 mAb(▼)를 포함한다. "본 발명의 mAb"는 4C9, 4H2, 4G6, 5F12, 또는 5G9를 나타낸다. 주: T-mAb는 트라스투주맙을 나타내고, P-mAb는 페르투주맙을 나타낸다.
도 3A-3B는 BT474 유방암 이종이식 모델에서 PBS(◆), 트라스투주맙 단독(■), 트라스투주맙/4C9(▲), 트라스투주맙/4H2(), 트라스투주맙/4G6(), 트라스투주맙/5F12(●), 및 트라스투주맙/5G9() 및 트라스투주맙/페르투주맙() 처리의 치료 반응을 도시한다. 주: T-mAb는 트라스투주맙을 나타내고, P-mAb는 페르투주맙을 나타낸다.
도 4A-4B는 PDX 트라스투주맙-내성 위 모델에서 PBS(◆), 트라스투주맙 단독(■), 트라스투주맙+페르투주맙(▲), 트라스투주맙+5F12(●), 및 트라스투주맙+5G9() 및 트라스투주맙/페르투주맙() 처리의 치료 반응을 도시한다. 주: T-mAb는 트라스투주맙을 나타내고, P-mAb는 페르투주맙을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 인간 ErbB2에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 트라스트주맙의 항종양 효능을 상승적으로 향상시키는(예를 들어, ErbB2 발현, 활성 및/또는 신호전달을 억제, 길항, 조절함) 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 트라스투주맙과 함께 사용될 때 페르투주맙보다 더 강력한 상승적 효능을 갖는 것으로 세포-기반 기능성 검정을 사용하여 대규모 트라스투주맙-기반 상승적 효능 스크리닝으로부터 확인된 5개의 신규한 항체의 발견에 기반한다. 구체적으로 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합 치료와 비교하여, 트라스투주맙과 이들 항체 중 어느 하나의 항체의 조합은 ErbB2-양성 세포 또는 종양, 예를 들어, ErbB2-양성 및 트라스투주맙-내성 종양의 성장을 억제하는데 있어 상당히 높은 효능 결과를 제공한다.
항-ErbB2 항체 4C9, 4H2, 4G6, 5H12, 및 5G9를 포함하는 ErbB2에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 뿐만 아니라 이의 키메라 및 인간화된 변이체가 제공된다. 한 구체예에서, 결합 단백질은 이들 항체 중 어느 하나의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 이들 항체 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 결합 단백질이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 이들 항체 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열 및 이들 항체 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 결합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자가 제공된다. 또한 그러한 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 결합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
트라스투주맙 및 본 발명의 결합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 결합 단백질은 트라스투주맙 또는 페르투주맙에 의해 결합된 에피토프와 다른 별개의 에피토프에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 트라스투주맙과 같은 다른 ErbB2 항체의 내재화를 현저히 개선하고/하거나 트라스투주맙과 같은 다른 ErbB2 항체와 함께 상승적으로, ErbB2-매개된 생물활성, 예를 들어, 하류 신호 전달 경로의 인산화 및 세포 증식을 조절할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질 및 항암제를 포함하는 결합 단백질 컨쥬게이트가 제공된다. 결합 단백질 컨쥬게이트는 면역독성일 수 있다. 또한, 결합 단백질 컨쥬게이트 및 트라스투주맙과 같은 다른 ErbB2 항체 및 면역독성일 수 있는 결합 단백질 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다.
대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법은 유효량의 본 발명의 결합 단백질 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간일 수 있다. 상기 방법은 트라스투주맙과 같은 다른 ErbB2 항체를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 결합 단백질 및 선택적으로 대상체(예를 들어, 인간)에서 질병 또는 장애(예를 들어, 암)를 치료하기 위한 트라스투주맙과 같은 다른 ErbB2 항체를 포함하는 약제가 제공된다.
트라스투주맙과 같은 다른 ErbB2 항체의 ErbB2-양성 세포 내로의 내재화를 향상시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포를 본 발명의 결합 단백질 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
A. 정의
용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함하는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이특이적 항체)를 구체적으로 포함한다. 항체(Ab) 및 면역글로불린(Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 한편, 면역글로불린은 표적 특이성이 없는 항체 및 다른 항체-유사 분자 둘 모두를 포함한다. 천연 항체 및 면역글로불린은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)를 포함하는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 또한, 용어 "항체"(Ab) 또는 "모노클로날 항체"(mAb)는 무손상 분자 뿐만 아니라 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, 이를 테면, Fab 및 F(ab')2 단편)을 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 무손상 항체의 Fc 단편이 없고, 동물 또는 식물의 순환으로부터 보다 신속하게 제거되며, 무손상 항체보다 덜 비특이적 조직 결합능을 가질 수 있다(Wahl, et al., J Nucl Med 24:316 (1983)).
"키메라 항체"는 이의 가장 넓은 의미에서 한 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 항체를 의미한다. 본원에서 사용되는 "키메라 항체"는 일반적으로 부분적으로 인간 기원이고 부분적으로 비-인간 기원인 항체, 즉, 마우스 또는 래트와 같은 비-인간 동물로부터 부분적으로 유래되는 항체이다. 키메라 항체를 생산하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi, et al, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies, et al, J Immunol Methods 125:191 (1989)] 참조.
용어 "Kabat 넘버링"은 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 다른 아미노산 잔기보다 더욱 가변적인(즉, 과가변성) 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다(Kabat et al, Ann. NY Acad. Sci, 190: 382-391 (1971) and Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). 중쇄 가변 영역(VH)의 경우, 과가변 영역은 CDR1의 경우 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 66, 및 CDR3의 경우 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역(VL)의 경우, 과가변 영역은 CDR1의 경우 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 56, 및 CDR3의 경우 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다.
용어 "CDR-그래프팅된 항체"는 뮤린 CDR 중 하나 이상(예를 들어, CDR3)이 인간 CDR 서열로 대체된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 같이, 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체를 지칭한다.
용어 "인간화된 항체"는 비-인간 종(예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더욱 "인간-유사해진", 즉, 인간 생식계열 가변 서열과 더욱 유사하게 변경된 항체를 지칭한다. "인간화된 항체"는 관심 항원에 특이적으로 결합하고 실질적으로 인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 실질적으로 비-인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체, 또는 단편이다. CDR의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 비-인간 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "억셉터" 및 "억셉터 항체"는 프레임워크 영역(FR) 중 하나 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%를 제공하거나 인코딩하는 항체 또는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 용어 "억셉터"는 불변 영역(들)을 제공하거나 인코딩하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 또 다른 구체예에서, 용어 "억셉터"는 프레임워크 영역 및 불변 영역(들) 중 하나 이상을 제공하거나 인코딩하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 특정 구체예에서, 용어 "억셉터"는 프레임워크 영역 중 하나 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 바람직하게는, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%를 제공하거나 인코딩하는 인간 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 이 구체예에 따르면, 억셉터는 인간 항체의 하나 이상의 특정 위치에서 발생하지 않는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 억셉터 프레임워크 영역 및/또는 억셉터 불변 영역(들)은, 예를 들어, 생식계열 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들어, 당 분야에 잘 알려진 항체, 개발 중인 항체, 또는 시판되는 항체)로부터 유래되거나 수득될 수 있다.
용어 "가변성"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에 있어 광범위하게 상이하고 이것이 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합능 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 고르게 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 과가변 영역이라 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하고, 3개의 과가변 영역에 의해 연결된 β-시트 구성을 주로 채택하는데, 이는 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하여, 일부 경우에, β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 과가변 영역은 FR에 의해 함께 근접하게 유지되고, 다른 사슬로부터의 과가변 영역과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에서 사용될 때 용어 "과가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 과가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "과가변성 루프"로부터의 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편들, 및 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭을 갖는 잔류 "Fc" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인지 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이는 각각의 가변 도메인의 3개의 과가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원-결합 부위를 정의하는 구성이다. 총괄적으로, 6개의 과가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 과가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)도, 전체 결합 부위보다 친화도가 낮더라도, 항원을 인지하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기를 첨가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv로 하여금 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. ErbB2 항체 scFv 단편은 WO93/16185호; U.S. 특허 번호 5,571,894호; 및 U.S. 특허 번호 5,587,458호에 개시되어 있다.
용어 "면역글로불린"은 일반적으로 혈액 또는 혈청에서 발견되는 항체의 혼합물의 총괄적 명칭으로서 사용되지만, 다른 공급원으로부터 유래된 항체의 혼합물을 지정하는데 사용될 수도 있다.
용어 "동족체 VH 및 VL 코딩 쌍"은 동일한 항체-생산 세포 내에 함유되거나 이로부터 유래된 VH 및 VL 코딩 서열의 본래 쌍을 기술한다. 따라서, 동족체 VH 및 VL 쌍은 그러한 세포가 유래된 공여체에 원래 존재하는 VH 및 VL 페어링을 나타낸다. 용어 "VH 및 VL 코딩 쌍으로부터 발현된 항체"는 항체 또는 항체 단편이 VH 및 VL 코딩 서열을 함유하는 벡터, 플라스미드 또는 다른 폴리뉴클레오티드로부터 생성됨을 나타낸다. 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍이 완전한 항체 또는 이의 안정한 단편으로서 발현될 때, 이들은 이들이 유래된 세포로부터 원래 발현되는 항체의 결합 친화도 및 특이성을 보존한다. 동족체 쌍의 라이브러리는 또한 레퍼토리 또는 동족체 쌍의 집합물로서 지칭되며, 개별적으로 유지되거나 풀링될 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터(또는 가능하게는 하나 초과의 발현 벡터, 통상적으로 2개의 발현 벡터)로 트랜스펙션된 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체를 지칭하고, 여기서 상기 코딩 서열은 상기 세포와 자연적으로 관련이 없다.
본원에서 사용되는 용어 "정규" 잔기는 Chothia 등이 정의한 대로 특정 정규 CDR 구조를 정의하는 CDR 또는 프레임워크의 잔기를 지칭한다.(J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227: 799-817 (1992)). Chothia 등에 따르면, 많은 항체의 CDR의 중요한 부분은 아미노산 서열 수준에서의 큰 다양성에도 불구하고 거의 동일한 펩티드 백본 형태(confirmation)를 갖는다. 각각의 정규 구조는 주로 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연속 세그먼트에 대한 펩티드 백본 비틀림 각도의 세트를 특정한다.
본원에서 사용되는 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 뺀 가변 영역의 나머지 서열을 지칭한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에(예를 들어, 상기 참조), 프레임워크 서열의 의미는 그에 따라 다른 해석이 적용된다. 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)도 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각 사슬에 대해 4개의 하위-영역으로 나누며(FR1, FR2, FR3, 및 FR4), 여기서 CDR1은 FR1 및 FR2 사이에 위치하고, CDR2는 FR2 및 FR3 사이에 위치하며, CDR3은 FR3 및 FR4 사이에 위치한다. 특정 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로 명시하지 않는 경우, 프레임워크 영역은, 다르게 언급되는 바와 같이, 단일의 자연 발생 면역글로불린 사슬의 가변 영역 내의 조합된 FR을 나타낸다. 본원에서 사용되는 FR은 4개의 하위-영역 중 하나를 나타내고, FR은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위-영역 중 2개 이상을 나타낸다.
당 분야에 공지된 기술을 사용하여 비-인간 항체를 인간화하기 위해 중쇄 및 경쇄 "억셉터" 프레임워크 서열(또는 간단히 "억셉터" 서열)로서 사용될 수 있는 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크(FR) 서열은 당 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 인간 중쇄 및 경쇄 억셉터 서열은 V-base와 같은 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스(hypertext transfer protocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 또는 국제 IMMUNOGENETICS®(IMGT®) 정보 시스템(hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)에 열거된 프레임워크 서열로부터 선택된다. 하기 표 2는 당 분야에 공지된 인간 중쇄 억셉터 서열의 예의 비제한적인 목록을 제공한다. 하기 표 3는 당 분야에 공지된 인간 경쇄 억셉터 서열의 예의 비제한적인 목록을 제공한다. 본 발명의 한 구체예에서, 인간 중쇄 및 경쇄 억셉터 서열은 하기 표 2 및 표 3에 기재된 아미노산 서열로부터 선택되지만, 표 2 및 표 3에 열거되지 않은 다른 인간 중쇄 및 경쇄 억셉터 서열도 본 발명에 따른 항체를 인간화하는데 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 ErbB2에 결합하는 인간화된 항체를 생성하는데 사용하기 위한 표 2의 중쇄 인간 억셉터 프레임워크 서열은 hIGHV1-69 FR1, hIGHV1-69 FR2, hIGHV1-69 FR3 및 hIGHJ4 FR4 억셉터 서열로 구성된 세트; hIGHV1-46 FR1, hIGHV1-46 FR2, hIGHV1-46 FR3, 및 hIGHJ4 FR4 억셉터 서열로 구성된 세트를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 ErbB2에 결합하는 인간화된 항체를 생성하는데 사용하기 위한 표 3의 경쇄 인간 억셉터 프레임워크 서열은 hIGKV1-33 FR1, hIGKV1-33 FR2, hIGKV1-33 FR3, 및 hIGKJ1 FR4 억셉터 서열로 구성된 세트 및 hIGKV1-27 FR1, hIGKV1-27 FR2, hIGKV1-27 FR3, 및 hIGKJ1 FR4 억셉터 서열로 구성된 세트를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 ErbB2에 결합하는 인간화된 항체를 생성하는데 사용하기 위한 인간 억셉터 프레임워크 서열의 세트는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 억셉터 프레임워크 서열 중 하나 이상(예를 들어, 결합 도메인 당 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개)을 포함한다:
중쇄 프레임워크-1(H-FR1): Q-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-K-K-P-G-S-S-V-K-V-S-C-K-X24-S-G-G-T-F-X30 (SEQ ID NO: 52), 여기서 X24는 A 또는 T이고, X30은 S 또는 T이다;
중쇄 프레임워크-2(H-FR2): W-V-R-Q-A-P-G-Q-G-L-E-W-M-G (SEQ ID NO: 4);
중쇄 프레임워크-3(H-FR3):
R-X67-T-I-T-A-D-X73-S-T-X76-T-A-Y-M-E-L-S-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-R (SEQ ID NO: 53), 여기서 X67은 A 또는 V이고, X73은 K 또는 Q이고, X76은 S 또는 N이다
중쇄 프레임워크-4(H-FR4): W-G-Q-G-T-L-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 6)
경쇄 프레임워크-1(L-FR1):
D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C (SEQ ID NO: 7);
경쇄 프레임워크-2(L-FR2): W-Y-Q-X38-K-P-G-K-G-P-K-L-L-I-X49 (SEQ ID NO: 54), 여기서 X38은 Q 또는 H이고, X49는 Y 또는 H이다,
경쇄 프레임워크-3(L-FR3): G-X58-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-X69-D-X71-T-X73-T-I-S-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO: 55), 여기서 X58은 I 또는 V이고, X69는 K, T 또는 R이고, X71은 Y 또는 F이고，X73은 L 또는 F이다;
경쇄 프레임워크-4(L-FR4): F-G-Q-G-T-K-V-E-I-K (SEQ ID NO: 10).
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 ErbB2에 결합하는 항체는 상기 기재된 H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR-4, L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4 억셉터 서열로 구성된 인간 억셉터 서열의 세트를 사용하여 인간화된다.
용어 "항체의 조합물" 또는 "항체 조합물" 또는 "항체 혼합물"은 상이한 CDR 서열을 갖는 적어도 2개의 별개의 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "상승적"은 2개 이상의 모노클로날 항체의 부가적 효과보다 더욱 효과적인 항체 조합물을 지칭한다. 약물 조합물의 상승작용에 대한 실험 설계는 문헌[Chou (Pharmacol Rev 58:621-681, 2006)]에서 설명되었다. 본 발명에 의해 제공된 조합물은 여러 검정 시스템에서 평가되었고, 데이터는 항암제 사이의 상승작용, 부가성, 및 길항작용을 정량하기 위한 표준 프로그램을 사용하여 분석될 수 있다. 조합 요법은 "상승작용"을 제공하고 "상승효과", 즉, 활성 성분을 동시에 또는 순차적으로 함께 사용할 때 달성되는 효과가 화합물들을 단독으로 사용함으로써 초래되는 효과의 합보다 크다는 것을 입증한다. 상승적 효과는 2개 이상의 항체가 (1) 조합된 제형으로 공동-제형화되고 동시에 투여 또는 전달되거나; (2) 별개의 제형으로서 교대로 전달되거나; (3) 이특이적 IgG 포맷과 같은 일부 다른 요법에 의해 달성될 수 있다.
용어 "중화"는 항체가 항원에 특이적으로 결합할 때 항원의 생물학적 활성을 방해하는 것을 지칭한다. 한 구체예에서, 중화 항체는 항원에 결합하여 이의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과만큼 중화시킨다.
용어 "별개의 에피토프"는 본 발명의 2개의 상이한 항체가 바람직하게는 항원 결합에 대해 80% 미만의 경쟁, 보다 바람직하게는 항원 결합에 대해 50% 미만의 경쟁, 및 가장 바람직하게는 가능한 한 적게 경쟁하며, 예를 들어, 항원 결합에 대해 약 25% 미만의 경쟁으로 별개의 에피토프에 결합한다는 사실을 지칭한다. 동일한 항원에 결합하기 위해 서로 경쟁할 수 있는 항체는 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합할 수 있거나 서로의 가까이에 결합 부위를 가질 수 있어, 경쟁은 주로 입체 장애에 의해 야기되므로, 용어 "동일한 에피토프"는 본 발명의 2개의 상이한 항체가 바람직하게는 항원 결합에 대해 80% 초과의 경쟁, 더욱 바람직하게는 항원 결합에 대해 85% 초과의 경쟁, 더욱 바람직하게는 항원 결합에 대해 90% 초과의 경쟁, 및 가장 바람직하게는 항원 결합에 대해 95% 초과의 경쟁으로 동일한 에피토프에 결합한다는 사실을 지칭한다. 항체 쌍의 "별개의 에피토프" 또는 "동일한 에피토프"에 대한 분석은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, ErbB2 및 개별 형광 표지된 항체를 발현하는 세포에 대한 FACS(형광 활성화 세포 분류) 또는 다른 유세포분석법을 사용하여 포화 항체 조건 하에 결합 실험에 의해 수행되거나, 유동 세포 표면에 포집되거나 컨쥬게이션된 ErbB2 항원을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 수행될 수 있다. SPR을 사용하여 항체 사이의 경쟁을 결정하는 방법은 실시예에 기재되어 있다.
용어 "항체 컨쥬게이트"는 치료제 또는 세포독성제와 같은 제2 화학 모이어티에 화학적으로 연결된 항체를 지칭한다. 용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 바람직하게는, 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그래미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 비제한적으로 포함한다.
B. 트라스투주맙-상승적 항-ErbB2 항체의 생성
본 발명의 한 양태는 트라스투주맙-상승적 중화 용량으로 ErbB2에 결합하는 분리된 마우스 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 다른 양태는 ErbB2에 결합하는 키메라 항체를 제공한다. 본 발명의 다른 양태는 ErbB2에 결합하는 CDR 그래프팅된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 본 발명의 다른 양태는 ErbB2에 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 한 구체예에서, 항체 또는 이의 부분은 분리된 항체 또는 이의 분리된 부분이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 중화성 항-ErbB2 항체이다. 유리하게는, ErbB2에 결합하는 그러한 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 개별로서 투여될 수 있는(인간 또는 다른 포유동물) 트라스투주맙 기능성 상승적 파트너로서 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 트라스투주맙과 조합될 때 ErbB2-양성 암 세포의 성장을 상승적으로 억제하는 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 항체의 생성을 위한 예시적인 기술에 대한 설명이 이어진다. 항체의 생성에 사용되는 ErbB2 항원은 ErbB2의 세포외 도메인의 가용성 형태일 수 있다. 대안적으로, 세포 표면에서 ErbB2를 발현하는 세포(예를 들어, SKBR3 세포와 같은 암종 세포주, 문헌[Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)] 참조)를 항체를 생성하는데 사용할 수 있다.
(i) 하이브리도마 기술을 이용한 항-ErbB2 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술의 사용, 또는 이들의 조합을 포함하는 당 분야에 공지된 광범위하게 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, second edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988)]에 교시된 것들을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
ErbB2 항원 또는 ErbB2-과발현 암 세포로 마우스를 면역시킨 후, 항체 및/또는 항체-생산 세포를 동물로부터 얻을 수 있다. 동물을 출혈 또는 희생시킴으로써 항-ErbB2 항체-함유 혈청을 동물로부터 수득한다. 혈청은 동물로부터 수득된 그대로 사용될 수 있거나, 항-ErbB2 항체는 혈청으로부터 정제될 수 있다.
마우스 혈청에서 면역 반응이 검출되면(예를 들어, 항원 ErbB2에 특이적인 항체), 마우스 비장을 수확하고 비장세포를 분리한다. 이후 비장세포를 널리 공지된 기술에 의해 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Manassas, VA, US)으로부터 입수 가능한 세포주 SP2/0으로부터의 세포에 융합시킨다. 이후 하이브리도마 클론을 ErbB2에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당 분야에 공지된 방법에 의해 검정한다. 제한된 희석에 의해 양성 하이브리도마를 선택하고 클로닝한다. 마우스에 양성 하이브리도마 클론을 접종함으로써 일반적으로 높은 수준의 항체를 함유하는 복수를 생성할 수 있다.
(ii) 트라스투주맙-상승적 항종양 생물활성을 갖는 항체의 스크리닝
항체를 생성하는 기술은 상기에 기술되어 있다. 본 발명은 상승적 생물활성(예를 들어, 세포-증식 억제 활성)을 함유하는 항체 조합물을 분리하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 항체 조합물은 하기 요망되는 특성을 갖는 적어도 2개 이상의 모노클로날 항체를 함유한다: <1> 이들은 ErbB2 상에 존재하는 별개의 비-중첩 에피토프에 결합하고; <2> 이들은 신규 항체이거나 조합물의 일부가 신규 항체이고; <3> 항체 조합물(본 발명의 임의의 항체 + 트라스투주맙)의 효능은 각 개별 성분의 효능 또는 각 개별 효능의 합보다 더욱 강력하다. 바람직하게는, 본 발명은 2개의 모노클로날 항체, 즉, 본 발명의 5개 모노클로날 항체 중 하나 및 다른 트라스투주맙의 상승적 조합물을 제공하였다. 그러한 2개-항체 조합물의 항종양 활성은 어느 한 성분의 효능 또는 각 개별 효능의 합보다 더욱 강력하다.
바람직하게는, ErbB2-양성 세포의 세포 성장을 억제함에 있어 트라스투주맙과 상승작용할 수 있는 항체를 확인하기 위해, 다음 절차를 따를 수 있다: (a) ELISA 또는 세포-기반 결합을 수행하여 관심 항체의 특정 ErbB2 결합 활성을 확인한다. 재조합 인간 ErbB2 및 인간 ErbB2를 발현하는 세포에 결합하는 항체의 능력을 결정할 수 있다. (b) 세포 증식의 트라스투주맙-기반 상승적 억제의 스크리닝을 수행한다. 예를 들어, 개별 항-ErbB2 항체 및/또는 항체 조합물에 의한 BT474 세포 성장의 억제는 하기 실시예 4에 기재된 바와 같은 BT474-기반 세포 증식 억제 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 항-ErbB2 모노클로날 항체 또는 항체 조합물을 각각의 웰에 첨가하고 약 144시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 용량 반응 곡선을 작성하고 관심 항체 또는 관심 항체 조합물에 대한 IC50 값을 계산할 수 있다. 한 구체예에서, 성장 억제성 항체 조합물은 약 0.5 내지 20 μg/ml의 농도에서 BT474 세포의 성장을 각 개별 항체보다 약 20-80%만큼 더 높게 억제할 수 있다.
그러한 우수한 상승적 항종양 활성에 대한 가정된 메커니즘은 비제한적으로 다음 가능성 중 하나일 수 있었다: (a) 표적의 2개 이상의 기능성 에피토프(예를 들어, ErbB2)를 차단함으로써 상승적 교차 향상, 및/또는 (b) 2개 이상의 모노클로날 항체의 표적(예를 들어, ErbB2)에 대한 결합력 또는 상승적 결합 친화도는 단일 모노클로날 항체의 친화도보다 훨씬 높고/거나, (c) 단일 모노클로날 항체의 항체-항원 삼량체 형성과 달리, 별개의 에피토프를 갖는 2개 이상의 모노클로날 항체에 의해 매개되는 항체-항원 응집물의 형성은 면역 시스템이 제거 및/또는 세포내이입을 검출하기에 훨씬 더 크고 더 용이할 수 있다. 상기 메커니즘 중 하나 또는 상기 모두의 조합, 또는 다른 가능한 메커니즘에 기반하여, 항-ErbB2 상승적 항체 조합물을 ErbB2-양성 암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 ErbB2-양성 암 또는 트라스투주맙-내성 ErbB2-양성 암을 치료하기 위해 트라스투주맙과의 조합물로서 사용될 수 있다.
(iii) 재조합 ErbB2 항체의 생산
본 발명의 항체는 당 분야에 공지된 임의의 많은 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포로 트랜스펙션된 숙주 세포로부터의 발현. 용어 "트랜스펙션"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 진핵생물 숙주 세포에 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 광범위한 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 포함하도록 의도된다. 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(dhfr-CHO 세포 포함, 문헌[Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)]에 기술됨, 예를 들어, 문헌[Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 1-621(1982)]에 기술된 바와 같이, DHFR 선택 가능한 마커와 사용됨, NSO 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2 세포를 포함한다. 항체를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 가능하게 하거나 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양시킴으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
숙주 세포는 또한 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같은 기능성 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 절차의 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 기능성 단편을 인코딩하는 DNA로 트랜스펙션하는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 관심 항원에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 둘 모두를 인코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 트렁케이션된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체를 표준 화학 가교 방법에 의해 제2 항체에 가교시킴으로써 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체(즉, 인간 ErbB2에 결합함)이고 다른 중쇄 및 경쇄가 인간 ErbB2 이외의 항원에 특이적인 이작용성 항체가 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 재조합 발현 벡터는 칼슘-포스페이트-매개된 트랜스펙션에 의해 dhfr-CHO 세포로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 유전자의 높은 수준의 전사를 유도하기 위해 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절성 요소에 각각 작동 가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포의 선택을 허용하는 DHFR 유전자를 보유한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄가 발현되게 하고 무손상 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 트랜스펙션시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 또한 추가로 본 발명은 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 본 발명의 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
1. 항-ErbB2 항체.
인간 ErbB2에 결합하는 분리된 마우스 모노클로날 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 표 12의 클론 4C9, 4H2, 4G6, 5F12, 및 5G9에 대해 제시되어 있다(하기 실시예 참조). 본원에 기재된 분리된 항-ErbB2 항체 CDR 서열은 본 발명에 따라 분리되고 이로부터 유래된 CDR 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 ErbB2 항체의 패밀리를 확립한다. 모노클로날 항체 및 이의 인간화된 항체 유도체의 가변 영역 및 CDR의 서열은 표 12, 16 및 19에 열거되어 있다. 인간 ErbB2에 대해 바람직한 ErbB2 결합 및/또는 중화 활성을 갖는 본 발명에 따른 항체에 대한 CDR을 생성 및 선택하기 위해, 본원에 구체적으로 기재된 것들을 비제한적으로 포함하는, 본 발명의 항체를 생성하고 그러한 항체의 ErbB2 결합 및/또는 중화 특성을 평가하기 위한 당 분야에 공지된 표준 방법을 사용할 수 있다.
본원에 기재된 항-ErbB2 항체 클론의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR의 아미노산 서열의 정렬에 기반하여, 본 발명은 인간 ErbB2에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하는 ErbB2 항체를 제공하고, 상기 항원 결합 도메인은 6개 CDR, 즉, 하기 정의된 CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDRL-3 중 적어도 하나 이상을 포함한다:
CDR-H1은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
X1-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 11),
(여기서, X1은 S이고
X2는 Y이고
X3은 T 또는 Y이고
X4는 M 또는 I이고
X5는 H이다)
4C9 CDR-H1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 17)
4H2 CDR-H1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 19)
4G6 CDR-H1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 21)
5F12 CDR-H1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 23)
4G9 CDR-H1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 25)
5F12 CDR-H2VH.V1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 27)
5F12 CDR-H1 VH.1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 28)
5F12 CDR-H1 VH.2의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 29)
5F12 CDR-H1 VH.3의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 30)
5F12 CDR-H1 VH.4의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 31)
5G9 CDR-H1 VH.V1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 39)
5G9 CDR-H1 VH.1의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 40)
5G9 CDR-H1 VH.2의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 41)
5G9 CDR-H1 VH.3의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 42)
5G9 CDR-H1 VH.4의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 43)
5G9 CDR-H1 VH.5의 잔기 31-35(SEQ ID NO: 44)
CDR-H2는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO: 12),
(여기서, X1은 Y이고
X2는 I이고
X3은 N이고
X4는 P이고
X5는 S이고
X6은 S이고
X7은 S 또는 D이고
X8은 Y이고
X9는 T이고
X10은 A 또는 N이고
X11은 Y이고
X12는 N이고
X13은 Q이고
X14는 K 또는 N이고
X15는 F이고
X16은 K 또는 R이고
X17은 D이다)
4C9 CDR-H2의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 17)
4H2 CDR-H2의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 19)
4G6 CDR-H2의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 21)
5F12 CDR-H2의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 23)
4G9 CDR-H2의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 25)
5F12 CDR-H2VH.V1의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 27)
5F12 CDR-H2VH.1의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 28)
5F12 CDR-H2VH.2의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 29)
5F12 CDR-H2VH.3의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 30)
5F12 CDR-H2VH.4의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 31)
5G9 CDR-H1 VH.V1의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 39)
5G9 CDR-H2VH.1의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 40)
5G9 CDR-H2VH.2의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 41)
5G9 CDR-H2VH.3의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 42)
5G9 CDR-H2VH.4의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 43)
5G9 CDR-H2VH.5의 잔기 50-66(SEQ ID NO: 44)
및
CDR-H3은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 13),
(여기서, X1은 A이고
X2는 S이고
X3은 A 또는 S이고
X4는 F이고
X5는 S이고
X6은 L이고
X7은 D이고
X8은 F이고
X9는 W이다)
4C9 CDR-H3의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 17)
4H2 CDR-H3의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 19)
4G6 CDR-H3의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 21)
5F12 CDR-H3의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 23)
4G9 CDR-H3의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 25)
5F12 CDR-H3VH.V1의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 27)
5F12 CDR-H3VH.1의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 28)
5F12 CDR-H3VH.2의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 29)
5F12 CDR-H3VH.3의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 30)
5F12 CDR-H3VH.4의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 31)
5G9 CDR-H1 VH.V1의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 39)
5G9 CDR-H3VH.1의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 40)
5G9 CDR-H3VH.2의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 41)
5G9 CDR-H3VH.3의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 42)
5G9 CDR-H3VH.4의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 43)
5G9 CDR-H3VH.5의 잔기 95-103(SEQ ID NO: 44)
CDR-L1은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO: 14),
(여기서, X1은 K이고
X2는 A이고
X3은 S이고
X4는 H 또는 Q이고
X5는 D이고
X6은 I이고
X7은 N이고
X8은 K이고
X9는 Y이고
X10은 I이고
X11은 A이다)
4C9 CDR-L1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 18)
4H2 CDR-L1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 20)
4G6 CDR-L1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 22)
5F12 CDR-L1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 24)
4G9 CDR-L1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 26)
5F12 CDR-L1VL.V1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 32)
5F12 CDR-L1VL.1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 33)
5F12 CDR-L1VL.2의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 34)
5F12 CDR-L1VL.3의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 35)
5F12 CDR-L1VL.4의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 36)
5F12 CDR-L1VL.5의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 37)
5F12 CDR-L1VL.6의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 38)
5G9 CDR-L1VL.V1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 45)
5G9 CDR-L1VL.1의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 46)
5G9 CDR-L1VL.2의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 47)
5G9 CDR-L1VL.3의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 48)
5G9 CDR-L1VL.4의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 49)
5G9 CDR-L1VL.5의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 50)
5G9 CDR-L1VL.6의 잔기 24-34(SEQ ID NO: 51)
CDR-L2는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID NO:15).
(여기서, X1은 Y 또는 S이고
X2는 T이고
X3은 S이고
X4는 T이고
X5는 L이고
X6은 Q 또는 Y이고
X7은 P이다)
4C9 CDR-L2의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 18)
4H2 CDR-L2의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 20)
4G6 CDR-L2의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 22)
5F12 CDR-L2의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 24)
4G9 CDR-L2의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 26)
5F12 CDR-L2VL.V1의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 32)
5F12 CDR-L2VL.1의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 33)
5F12 CDR-L2VL.2의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 34)
5F12 CDR-L2VL.3의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 35)
5F12 CDR-L2VL.4의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 36)
5F12 CDR-L2VL.5의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 37)
5F12 CDR-L2VL.6의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 38)
5G9 CDR-L2VL.V1의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 45)
5G9 CDR-L2VL.1의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 46)
5G9 CDR-L2VL.2의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 47)
5G9 CDR-L2VL.3의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 48)
5G9 CDR-L2VL.4의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 49)
5G9 CDR-L2VL.5의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 50)
5G9 CDR-L2VL.6의 잔기 50-56(SEQ ID NO: 51)
및
CDR-L3은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:16),
(여기서, X1은 L이고
X2는 Q 또는 N이고
X3은 Y이고
X4는 D이고
X5는 N이고
X6은 L이고
X7은 L이고
X8은 W이고
X9는 T이다)
4C9 CDR-L3의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 18)
4H2 CDR-L3의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 20)
4G6 CDR-L3의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 22)
5F12 CDR-L3의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 24)
4G9 CDR-L3의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 26)
5F12 CDR-L3VL.V1의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 32)
5F12 CDR-L3VL.1의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 33)
5F12 CDR-L3VL.2의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 34)
5F12 CDR-L3VL.3의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 35)
5F12 CDR-L3VL.4의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 36)
5F12 CDR-L3VL.5의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 37)
5F12 CDR-L3VL.6의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 38)
5G9 CDR-L3VL.V1의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 45)
5G9 CDR-L3VL.1의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 46)
5G9 CDR-L3VL.2의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 47)
5G9 CDR-L3VL.3의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 48)
5G9 CDR-L3VL.4의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 49)
5G9 CDR-L3VL.5의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 50)
5G9 CDR-L3VL.6의 잔기 89-97(SEQ ID NO: 51)
바람직하게는, ErbB2 항체는 상기 기재된 적어도 하나의 CDR, 더욱 바람직하게는 상기 기재된 임의의 2개의 CDR, 더욱 바람직하게는 상기 기재된 임의의 3개의 CDR, 심지어 더욱 바람직하게는 상기 기재된 임의의 4개의 CDR, 더욱 더 바람직하게는 상기 기재된 임의의 5개의 CDR, 및 가장 바람직하게는 상기 기재된 임의의 6개의 CDR(즉, 상기 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3)을 포함한다. 3개의 CDR을 포함하는 특히 바람직한 ErbB2 항체는 상기 기재된 바와 같이 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
2. 항-ErbB2 키메라 항체.
키메라 항체는 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체와 같이, 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다. 예를 들어, 문헌[Morrison, Science, 229 1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques, 4: 214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989) U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397] 참조. 또한, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985)] 참조.
3. 항-ErbB2 CDR 그래프팅된 항체.
본 발명의 분리된 항-ErbB2 항체 CDR 서열은 원래 항체의 특성을 조절하기 위해 CDR-그래프팅된 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 그러한 특성은 결합 동역학, 친화도, 생물학적 활성, 종 교차-반응성, 분자 교차 반응성, 에피토프, 물리화학적 특성, 약동학적 특성, 약역학적 특성, 또는 약리학적 특성을 비제한적으로 포함한다. CDR-그래프팅된 항체는 인간 항체 또는 비-인간 영장류 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 여기서 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상은 원래 항-ErbB2 항체의 CDR 서열로 대체된다. 임의의 인간 또는 비-인간 영장류 항체로부터의 프레임워크 서열은 CDR 그래프팅을 위한 주형으로서 작용할 수 있다. 그러나, 그러한 프레임워크 상의 직접 사슬 대체는 종종 항원에 대한 결합 친화도의 일부 손실을 초래한다. 인간 또는 다른 종의 항체가 원래의 인간 항체와 더 상동일수록, CDR과 새로운 인간 프레임워크 또는 비-인간 영장류 프레임워크의 조합이 친화도 또는 다른 특성을 감소시킬 수 있는 왜곡을 CDR에 도입할 가능성이 더 적어진다. 따라서, CDR 이외의 인간 가변 영역 프레임워크를 대체하기 위해 선택된 가변 프레임워크는 인간 항체 가변 영역 프레임워크와 적어도 30% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, CDR 이외의 인간 가변 영역 프레임워크를 대체하기 위해 선택된 가변 영역 프레임워크는 인간 항체 가변 영역 프레임워크와 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 따라서, CDR 이외의 인간 가변 영역 프레임워크를 대체하기 위해 선택된 가변 영역 프레임워크는 인간 항체 가변 영역 프레임워크와 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 따라서, CDR 이외의 인간 가변 영역 프레임워크를 대체하기 위해 선택된 가변 영역 프레임워크는 인간 항체 가변 영역 프레임워크와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 새로운 인간 또는 비-인간 영장류 및 CDR 이외의 원래 인간 가변 영역 프레임워크는 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 새로운 인간 또는 비-인간 영장류 및 CDR 이외의 원래 인간 가변 영역 프레임워크는 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것이 심지어 더욱 바람직하다. 새로운 인간 또는 비-인간 영장류 및 CDR 이외의 원래 인간 가변 영역 프레임워크는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것이 가장 바람직하다. 원래 인간 항-ErbB2 항체의 CDR을 그래프팅하기 위해 고도로 상동인 인간 또는 비-인간 영장류 프레임워크를 사용하더라도, 생성된 그래프팅된 항체는 항원에 대한 결합 친화도를 여전히 어느 정도 잃을 수 있다. 이 경우에, 친화도를 회복하기 위해, 새로 그래프팅된 항체의 상응하는 위치로 원래 항체의 적어도 하나 이상의 핵심 프레임워크 잔기(들) 치환을 포함시키는 것이 필요하다. 그러한 핵심 잔기는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:
CDR에 인접한 잔기;
당화 부위 잔기;
희귀 잔기;
인간 ErbB2와 상호작용할 수 있는 잔기
정규 잔기;
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기;
Vernier 구역 내의 잔기; 및
Chothia-정의된 가변 중쇄 CDR1과 Kabat-정의된 제1 중쇄 프레임워크 사이에서 중첩되는 영역의 잔기.
4. 항-ErbB2 인간화된 항체.
본 발명의 조성물은 인간화된 항체를 제조하기 위한 필요조건을 제거하지만, 인간화된 ErbB2 항체는 본 발명의 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 인간화된 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 요망되는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터의 항체 분자이다. 공지된 인간 Ig 서열은 월드 와이드 웹(www.)을 통해 이용 가능한 웹 사이트, 예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;
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jerini.de/frroducts.htm; patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept. Health (1983)에 공개되어 있다. 그러한 유입된 서열은 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화도, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 결합력, 특이성, 반감기, 또는 당 분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 특징을 감소시키거나, 향상시키거나, 변형시키기 위해 이용될 수 있다.
인간 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경시키기 위해, 바람직하게는, 개선시키기 위해 CDR 공여 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 프레임워크 치환은 당 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어, CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하여 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 프레임워크 잔기를 식별하여 특정 위치에서 특이한 프레임워크 잔기를 식별함으로써 확인된다. (예를 들어, U.S. Pat. No. 5,585,089 (Queen et al.); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988) 참조). 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 제시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서의 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 식으로, FR 잔기를 선택하고 컨센서스 및 유입 서열로부터 조합할 수 있어, 요망되는 항체 특징, 예를 들어, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 있어 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여한다. 항체는 비제한적으로 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); Sims et al., J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol.Biol., 196: 901-917 (1987); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992); Presta et al, J. Immunol,151: 2623-2632 (1993); Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al. Protein Engineering, 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973 (1994); PCT Publication Nos: WO 91/09967, WO 99/06834 (PCT/US98/16280), WO97/20032 (PCT/US96/18978), WO 92/11272 (PCT/US91/09630), WO 92/03461 (PCT/US91/05939), WO 94/18219 (PCT/US94/01234), WO 92/01047 (PCT/GB91/01134), WO93/06213 (PCT/GB92/01755), WO90/14443, WO90/14424 and WO90/14430; European Publication Nos. EP 0 592 106 EP 0 519 596, and EP 0 239 400; U.S. Pat. Nos. 5,565,332: 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476: 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023: 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 및 4,816,567]에 기재된 것들과 같이, 당 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 인간화될 수 있다.
C. 항체 및 항체-생산 세포주의 생산
바람직하게는, 본 발명의 항-ErbB2 항체는, 예를 들어, 당 분야에 공지된 여러 시험관내 및 생체내 검정 중 어느 하나에 의해 평가된 바와 같이 트라스투주맙과 조합될 때 ErbB2-양성 종양 성장 활성을 억제하는 높은 능력을 나타낸다. 예를 들어, 트라스투주맙과 본 발명의 이러한 항체 중 어느 하나의 조합물의 IC50은 시험관내 세포 증식 억제 검정(표 11) 및/또는 생체내 종양 모델(표 23)에서 각각의 개별 항체의 약 50%이고, 동일한 시험관내 세포-기반 생물검정에서, 트라스투주맙과 본 발명의 이러한 항체 중 어느 하나의 조합물의 최대 억제 능력은 81% 내지 95%의 범위에 있는 반면, 각각의 개별 항체의 최대 억제 능력은 13% 내지 70%의 범위이다.
특정 구체예에서, 항체는 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, 또는 IgD 불변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 또한, 항체는 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역 중 어느 하나인 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항체 부분은, 예를 들어, Fab 단편 또는 단일 사슬 Fv 단편일 수 있다.
한 구체예는 본 발명의 항체 또는 항체 부분이 유도체화되거나 또 다른 기능성 분자(예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결된 표지된 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 표지된 항체는 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 하나 이상의 다른 분자 존재물, 예를 들어, 다른 항체(예를 들어, 이특이적 항체 또는 디아보디), 검출제, 세포독성제, 약학적 제제, 및/또는 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 항체 또는 항체 부분의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 다른 방법에 의해) 기능적으로 연결시킴에 의해 유래될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분이 유도체화될 수 있는 유용한 검출제는 형광 화합물을 포함한다. 예시적인 형광 검출제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오 시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함한다. 항체는 또한 알칼리성 포스파타제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등과 같은 검출 가능한 효소로 유도체화될 수 있다. 항체가 검출 가능한 효소로 유도체화될 때, 이것은 효소가 검출 가능한 반응 생성물을 생산하기 위해 사용하는 추가 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어, 검출 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출 가능한 착색된 반응 생성물을 발생시킨다. 항체는 또한 비오틴으로 유도체화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출될 수 있다.
D. ErbB2 항체의 용도
(i) 모노클로날 항체
인간 ErbB2에 결합하는 능력을 고려해 볼 때, 항체 및 이의 부분을 포함하는 본원에 기재된 ErbB2 항체는 샘플 내의 (예를 들어, 혼합물, 용액, 또는 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 또는 혈장 내의) ErbB2를 당 분야에 공지된 임의의 통상적인 면역검정, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 또는 조직 면역조직화학을 사용하여 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 샘플을 ErbB2 항체와 접촉시키고 인간 ErbB2에 결합된 ErbB2 항체 또는 결합되지 않은 항체를 검출하여 샘플 내의 인간 ErbB2를 검출하는 것을 포함하는 샘플 내의 인간 ErbB2를 검출하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 ErbB2 항체는 결합된 또는 결합되지 않은 ErbB2 항체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 적합한 검출 가능한 물질은 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, P-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보철 그룹 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm을 포함한다.
ErbB2에 대해 검정될 수 있는 생물학적 샘플은 소변, 대변, 혈액, 혈청, 혈장, 땀, 타액, 구강 면봉(뺨, 혀, 목구멍), 질 면봉, 직장 면봉, 피부 면봉, 피부 스크레이프, 조직 생검 뿐만 아니라 당 분야에서 이용 가능한 방법에 의해 수득될 수 있는 임의의 다른 조직 샘플을 포함한다.
항체 표지화에 대한 대안으로, 인간 ErbB2는 검출 가능한 물질로 표지된 재조합 인간(rh) ErbB2(rhErbB2) 표준 및 본원에 기재된 표지되지 않은 ErbB2 항체를 활용하는 경쟁 면역검정에 의해 생물학적 유체에서 검정될 수 있다. 이 검정에서, 생물학적 샘플, 표지된 (rhErbB2) 표준 및 ErbB2 항체를 조합하고 표지되지 않은 항체에 결합된 표지된 rhErbB2 표준의 양을 결정한다. 생물학적 샘플에서 인간 ErbB2의 양은 ErbB2 항체에 결합된 표지된 rhERBB2 표준의 양에 반비례한다. 유사하게, 인간 ErbB2는 또한 검출 가능한 물질로 표지된 rhErbB2 표준 및 본원에 기재된 표지되지 않은 ErbB2 항체를 활용하는 경쟁 면역검정에 의해 생물학적 유체에서 검정될 수 있다.
본 발명의 ErbB2 항체는 바람직하게는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서, ErbB2 활성, 특히 인간 ErbB2 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 그러한 항체는 ErbB2 활성을, 예를 들어, ErbB2를 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상체에서, 또는 본 발명의 항체와 교차 반응하는 ErbB2를 발현하는 다른 포유동물 대상체에서 억제하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 ErbB2 활성이 억제되도록 ErbB2를 본 발명의 ErbB2 항체 또는 항체 부분과 접촉시키는 단계를 포함하는 ErbB2 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, ErbB2를 함유하거나 함유할 것으로 의심되는 세포 배양물에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부분을 배양 배지에 첨가하여 배양물에서 ErbB2 활성을 억제할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 대상체에서, 유리하게는 ErbB2 또는 ErbB2 활성이 유해한 질병 또는 장애로 고통받는 대상체로부터, ErbB2 활성을 중화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 그러한 질병 또는 장애로 고통받는 대상체에서 ErbB2 또는 ErbB2 활성을 중화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 ErbB2 항체를 대상체에 투여하여 대상체에서 ErbB2 또는 ErbB2 활성이 중화되도록 하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, ErbB2는 인간 ErbB2이고, 대상체는 인간 대상체이다. 대안적으로, 대상체는 본 발명의 ErbB2 항체가 결합할 수 있는 ErbB2를 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한 추가로, 대상체는 ErbB2가 도입된 포유동물일 수 있다(예를 들어, ErbB2의 투여 또는 ErbB2 트랜스진의 발현에 의해). 본 발명의 항체 또는 다른 ErbB2 항체는 치료 목적으로 인간 대상체에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 ErbB2 항체는 항체가 결합할 수 있는 ErbB2를 발현하는 비-인간 포유동물에 수의학적 목적을 위해 또는 인간 질병의 동물 모델로서 투여될 수 있다. 후자와 관련하여, 그러한 동물 모델은 본 발명의 항체 및 다른 ErbB2 항체의 치료 효능을 평가하는데 유용할 수 있다(예를 들어, 투여량 및 투여 시간 경과의 시험).
(ii) 이특이적 항체
이특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이특이적 항체는 ErbB2 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 그러한 다른 항체는 EGFR, ErbB3 및/또는 ErbB4에 대한 ErbB2 결합 부위(들)를 조합할 수 있다. 대안적으로, 항-ErbB2 아암은 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3)와 같은 백혈구 상의 촉발 분자, 또는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR)에 결합하는 아암과 조합되어 ErbB2-발현 세포에 세포의 방어 메커니즘을 집중시킬 수 있다. 이특이적 항체는 또한 ErbB2를 발현하는 세포독성제를 세포에 국소화시키기 위해 이용될 수 있다. 이들 항체는 ErbB2-결합 아암 및 세포독성제(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 이특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이특이적 항체)로서 제조될 수 있다. WO 96/16673호는 이특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체를 기재하고, U.S. 특허 번호 5,837,234호는 이특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체를 기재한다. 이특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 98/02463호에 제시되어 있다. U.S. 특허 번호 5,821,337호는 이특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시한다.
이특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 전장 이특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 사슬이 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기반한다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이 중 하나만이 올바른 이특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829호, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 요망되는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 융합체 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 요망되는 경우, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에서 공동-트랜스펙션한다. 이는 작제에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 비균일한 비율이 최적의 수율을 제공하는 구체예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율을 발생시키거나 비율이 특별히 중요하지 않은 경우 한 발현 벡터에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이 접근법의 바람직한 구체예에서, 이특이적 항체는 한 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)을 포함한다. 이특이적 분자의 단지 절반에 있는 면역글로불린 경쇄의 존재가 손쉬운 분리 방법을 제공하기 때문에, 이 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 요망되는 이특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690호에 개시되어 있다. 이특이적 항체 생성을 위한 추가 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다. US 특허 US 5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 공학처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavities)"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이특이적 항체는 가교된 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는, 예를 들어, 면역 시스템 세포를 원치 않는 세포(U.S. 특허 번호 4,676,980호)에 표적화하고, HIV 감염의 치료(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안되었다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께, U.S. 특허 번호 4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이특이적 항체를 생성하는 기술이 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이특이적 항체는 화학적 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌[Brennan et al., Science, 229:81(1985)]은 무손상 항체가 단백질분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 디티올 착화제 소듐 아르세나이트의 존재 하에 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 이후 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 이후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환시키고, 동 몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이특이적 항체를 형성한다. 생성된 이특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
최근의 진전은 이특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있는 E. 콜리(E. coli)에 대한 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 촉진시켰다. 문헌[Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜리로부터 별도로 분비되고 시험관내에서 지시된 화학적 커플링되어 이특이적 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 이특이적 항체는 ErbB2 수용체 및 정상 인간 T 세포를 과발현하는 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 이특이적 항체 단편을 직접 제조 및 분리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이특이적 항체를 생산하였다. 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아보디" 기술은 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 메커니즘을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 2개 도메인 사이의 페어링을 허용하기에 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루도록 강제되어 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략도 보고되었다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조.
결합가가 2 초과인 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)].
(iii) 면역컨쥬게이트
본 발명의 항체 및 조성물의 치료적 사용을 위한 다른 옵션은 면역컨쥬게이트, 즉, 하나 이상의 항암제에 컨쥬게이션된 항체의 형태이다. 특히, 별개의 ErbB2 에피토프에 결합하는 본 발명의 2개 이상의 개별 항체를 포함하는 조성물의 경우에, 이는 세포 표면 상에 가교된 항체-수용체 격자를 생성하여 단일 모노클로날 항체의 사용와 비교하여 잠재적으로 증가된 수준의 수용체 내재화를 발생시킬 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 하나 이상의 항암제에 그러한 조성물의 개별 항체 중 하나 이상의 컨쥬게이션은 컨쥬게이션된 항암제를 종양 세포의 내부로 특이적이고 효과적으로 전달하는 잠재력을 가져, 본 발명의 항-ErbB2 항체의 효과를 증대시킴으로써 개선된 종양 세포-사멸 활성을 제공한다.
세포독성제(기존 화학치료제 및 다른 소분자 항암제 포함), 사이토카인(이 경우에 컨쥬게이트는 "면역사이토카인"으로 명명될 수 있음), 독소(이 경우에 컨쥬게이트는 "면역독소"로 명명될 수 있음) 및 방사성핵종을 포함하는 다양한 유형의 항암제가 본 발명의 항체에 컨쥬게이션될 수 있고, 몇몇 면역컨쥬게이트는 이미 임상적 사용을 위해 승인되었다. 이들은 ZEVALIN®(90Y에 컨쥬게이션된 뮤린 항-CD20 항체), BEXXAR®(131I에 컨쥬게이션된 뮤린 항-CD20 항체) 및 MYLOTARG®(칼리키아미신에 컨쥬게이션된 인간화된 항-CD33 항체)를 포함한다. 임상 시험에서 시험된 다른 면역컨쥬게이트는, 예를 들어, 독소루비신 또는 메이탄시노이드 화합물에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다. 임상 시험에서 시험된 면역독소는 트렁케이션된 절단된 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A에 컨쥬게이션된 몇몇 항체를 포함한다. IL-2에 컨쥬게이션된 인간화된 EpCAM 항체를 포함하는 면역사이토카인도 시험되었다.
세포독성제에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체의 경우에, 이들은, 예를 들어, 알킬화제(예를 들어, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴), 대사길항제(예를 들어, 메토트렉세이트, 카페시타빈, 젬시타빈), 안트라사이클린(예를 들어, 블레오마이신, 독소루비신, 미토마이신-C) 및 식물 알칼로이드(예를 들어, 도세탁셀 및 파클리탁셀과 같은 탁산, 및 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드)를 포함하는 화학요법 약물의 주요 부류 중 어느 하나에 속할 수 있다. 면역컨쥬게이트의 사용은 구체적으로 항암제를 종양, 및 특히 내재화 후 종양 세포의 내부로 유도하므로, 본 발명의 항-ErbB2 항체에 기반한 면역컨쥬게이트는 유리하게는 칼리키아미신 또는 메이탄신 유도체와 같은 고도의 세포독성제, 또는 박테리아 독소(예를 들어, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소) 및 식물 독소(예를 들어, 리신)와 같은 독소에 기반할 수 있다.
면역컨쥬게이트 내의 컨쥬게이션된 항암제는 일반적으로 혈청에서는 비교적 안정하지만 면역컨쥬게이트가 표적 세포로 내재화될 때 제제의 방출을 허용하는 불안정한 링커에 의해 항체에 연결된다. 적합한 링커는, 예를 들어, 혈청의 중성 pH에서는 안정하지만 내재화 후 리소솜 내의 약산성 조건에서 산 가수분해되는 화학적 링커, 세포내 티올에 의해 절단되는 디설파이드 링커, 및 혈청에서는 안정하지만 세포내 구획에서 효소적 절단되는 펩티드 링커를 포함한다.
본 발명의 2개 이상의 항체를 함유하는 조성물에서 다양한 컨쥬게이션 배열이 예상될 수 있다. 예를 들어, 2개의 항체를 갖는 경우, 2개 이상의 상이한 항암 약물에 항체를 컨쥬게이션하거나, 한 항체를 다른 항체에 컨쥬게이션된 효소와 같은 제제에 의해 활성화되는 프로드럭에 컨쥬게이션하는 것이 가능할 것이다. 항체-유도 효소 프로드럭 요법(ADEPT)의 일반적인 개념은 모노클로날 항체에 대해 기술되었고, 여기서 프로드럭은 mAB-효소 컨쥬게이트에 의해 종양으로 표적화되는 효소에 의해 활성화되지만, 본 발명은 이러한 접근을 특정 조건으로 조정할 기회를 제공할 수 있다. 따라서, 정상 조직에 대한 손상을 피하거나 줄이면서 종양 세포 사멸을 명확하게 증가시키는 것이 가능할 수 있다.
항암 면역컨쥬게이트에 대한 추가 정보에 대해서는, 문헌[Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Schrama et al. (2006) Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159; and Rohrer (2009) chimica oggi/Chemistry Today 27(5):56-60]을 참조한다.
(ivi) 용량 및 투여 경로
본 발명의 항체 및 조성물은 고려되는 질환의 치료를 위한 유효량으로, 즉, 요망되는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그러한 시간 동안 투여될 것이다. 치료적 유효량은 치료되는 특정 질환, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 항-ErbB2 항체가 단독 치료로서 또는 하나 이상의 추가적인 항암 치료제와 함께 투여되는 지의 여부와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.
종양 요법을 위한 유효량은 환자에서 질병 진행을 안정화시키고/거나 증상을 개선시키는 능력, 및 바람직하게는, 예를 들어, 종양 크기를 감소시킴으로써, 질병 진행을 역전시키는 능력에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하기 위한 본 발명의 항체 또는 조성물의 능력은, 예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같은 시험관내 검정 뿐만 아니라, 인간 종양에서의 효능을 예측하는 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 적합한 투여 요법은 각각의 특정 상황에서 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 선택될 것이고, 예를 들어, 단일 볼루스로서 또는 연속 주입으로서, 각 경우의 위급상황에 의해 지시되는 바와 같이 투여량을 가능하게 조절하며 투여된다.
본 발명에 따른 항체에 대한 구체적인 용량은 아직 결정되지 않았지만, 치료용으로 승인된 유사한 생성물(항-ErbB2 모노클로날 항체)과의 비교를 통해 특정 용량 고려사항이 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 조성물의 적절한 투여량은 항-ErbB2 모노클로날 항체 트라스투주맙(HERCEPTIN®)에 대한 권장 투여량과 유사할 것으로 생각된다. 특정 조건에 따라, 트라스투주맙은 4 mg/kg의 초기 용량 및 2 mg/kg의 후속 매주 용량, 또는 8 mg/kg의 초기 용량 및 3주마다 6 mg/kg의 후속 용량으로 유방암의 치료를 위해 (주입 방식으로) 투여된다.
본 발명의 항체 조성물의 적합한 용량은 약 0.1-100 mg/kg, 0.5-50 mg/kg 또는 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 고려된다. 항체 조성물은 적어도 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4 또는 5 mg/kg; 및/또는 최대 약 50, 30, 20 또는 15 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여는 보통 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 또는 4주에 1회와 같이 적합한 간격으로 반복될 것이고, 주치의에 의해 적절하다고 여겨지는 한, 필요한 경우에 투여량을 선택적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
본 발명의 항체의 전달을 위한 세 가지 별개의 전달 접근법이 고려된다. 통상적인 정맥내 전달은 아마도 대부분의 종양에 대한 표준 전달 기술일 것이다. 그러나, 난소, 담관, 다른 관 등의 종양과 같은 복막강의 종양과 관련하여, 복강내 투여는 종양에서 고 용량의 항체를 수득하고 항체 제거율을 최소화하는데 유리한 것으로 입증될 수 있다. 유사하게, 특정 고형 종양은 국소 관류에 적합한 맥관구조를 갖는다. 국소 관류는 종양 부위에서 고 용량의 항체의 획득을 허용하고 항체의 단기 제거율을 최소화할 수 있다.
임의의 단백질 또는 항체 주입-기반 치료 제품과 마찬가지로, 안전성 문제는 주로 (i) 사이토카인 방출 증후군, 즉, 저혈압, 발열, 진전, 오한, (ii) 단백질에 대한 면역원성 반응의 발달(즉, 재조합 항체 생성물에 대한 환자에 의한 인간 항체의 발달), 및 (iii) ErbB2 수용체를 발현하는 정상 세포, 예를 들어, 많은 상피 세포에 대한 독성과 관련된다. 임의의 그러한 안전성 문제를 모니터링하기 위해 표준 시험 및 후속 절차가 사용된다.
양, 백분율 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 심지어 더욱 바람직하게는 ±1%, 및 또한 더욱 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미하고, 그러한 변동은 적절하다.
실시예
실시예 1. 하이브리도마 기술을 이용한 마우스 항-ErbB2 모노클로날 항체의 생성
마우스를 당 분야에 공지된 방법에 따라 면역화시켰다(예를 들어, 문헌[E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998]).
인간 HER2-양성 세포주 BT474 뿐만 아니라 재조합 인간 ErbB2 세포외 도메인(ErbB2-ECD) 단백질을 면역원으로서 사용하였다. 고-수준 인간 ErbB2(SK-BR3 세포) 또는 저-수준 인간 ErbB2(MCF7)를 발현하는 인간 세포주를 사용하여 항-혈청 역가를 결정하고 항원-특이적 항체를 분비하는 하이브리도마를 스크리닝하였다.
면역화 투여량은 1차 및 부스트 면역화 둘 모두에 대해 1 x106개 BT474 세포/마우스/주입을 함유하였다. 마우스 ErbB2에 대한 면역 반응을 증가시키기 위해, 마우스를 불완전 프로이트 애쥬번트(Sigma, St. Louis, MO., US)와 함께 에멀젼 형태의 재조합 마우스 ErbB2-ECD로 추가로 부스팅하였다. 간단히 말해, 애쥬번트를 바이알에서 볼텍스를 사용하여 부드럽게 혼합함으로써 애쥬번트-항원 혼합물을 제조하였다. 요망되는 양의 애쥬번트를 바이알로부터 제거하고 오토클레이브된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 항원을 PBS 또는 염수에서 0.5-1.0 mg/ml 범위의 농도로 제조하였다. 이후 계산된 양의 항원을 애쥬번트와 함께 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 용액을 2분 동안 부드럽게 볼텍싱함으로써 혼합하여 유중수 에멀젼을 생성하였다. 이후 애쥬번트-항원 용액을 동물 주입을 위해 적당한 주사기로 빨아 들였다. 총 50 μg의 항원을 50-100 ul의 부피로 주입하였다. 각 동물을 면역화시킨 후, 이들의 역가에 따라 2 내지 3회 부스팅하였다.
적정 역가(30,000배가 넘는 희석)를 갖는 동물에게 인간 ErbB2를 발현하는 BT474 또는 25ug의 재조합 인간 ErbB2-ECD로 융합 전 최종 피하 부스트를 제공하였다.
하이브리도마 융합체 및 ELISA 스크리닝
SP2/0 세포(ATCC CRL-1581)를 융합 직전 로그 단계에 도달하도록 배양하였다. 면역화된 마우스 비장 세포를 멸균적으로 제조하고 당 분야에 공지된 방법에 따라 SP2/0 세포와 융합시켰다(예를 들어, Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497 (1975)). 융합된 "하이브리드 세포"를 이어서 DMEM/20% FCS/HAT 배지에서 96-웰 플레이트로 분배하였다. 생존 하이브리도마 콜로니를 융합 후 7 내지 10일에 현미경 아래에서 관찰하였고, 이어서 각 웰로부터의 상청액을 다음 절차에 따라 ELISA 포맷을 사용하여 하이브리도마 스크리닝하였다: <1> ELISA 플레이트를 50 ul의 인간 ErbB2(PBS 중 2.0 μg/ml)로 4℃에서 밤새 코팅하였다; <2> 플레이트를 250 ul의 PBS/0.5% Tween20으로 3회 세척하고 200 ul의 차단 완충제(0.5% Tween20과 함께 PBS 중 2% BSA)로 차단하였다; <3> 희석된 혈청 또는 하이브리도마 상청액(100 ul)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다; <4> 이후, 플레이트를 PBS/0.5% Tween20으로 3회 세척하고, 염소 항-마우스-IgG-HRP를 검출에 사용하여, 결합 OD를 450 nm에서 관찰하였다. 이후 재조합 인간 ErbB2-ECD에 결합하는 양성 하이브리도마 분비 항체를 선택하고, 후속 세포-기반 결합 스크리닝을 위해 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 본 발명의 융합체는 약 30000~40000 HAT-내성 생존 하이브리도마를 생성하여, 재조합 인간 ErbB2-ECD 단백질에 특이적으로 결합하는 1415개의 양성 하이브리도마를 발생시켰다. 그러한 하이브리도마 스크리닝의 하나의 플레이트가 하기 표 4와 같이 예시되며, 양성 하이브리도마는 밑줄과 이탤릭체로 표시된다.
실시예 2. 세포막 ErbB2에 대해 높은-비율의 차별적 결합 활성을 갖는 항체에 대한 세포-기반 스크리닝
실시예 1에서 ELISA 스크리닝이 완료되면, ErbB-양성 하이브리도마를 새로운 69-웰 플레이트로 옮기고 HAT 선택없이 신선한 DMEM 배지를 공급하였고, 3 내지 5일 후에, 하이브리도마 배지를 세포-결합 스크리닝하였다. 간단히 말해, SK-BR3 세포(ATCC＃HTB-30, 고-수준 ErbB2) 또는 MCF7세포(ATCC＃HTB-30, 저-수준 ErbB2)를 1-5x105개 세포/웰로 96-웰(둥근 바닥) 플레이트에 분배하고, 하이브리도마 상청액(50 ul)과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 FACS 완충제(2% FBS와 함께 PBS pH 7.2)로 3회 세척하고 100ul의 염소 항-마우스 IgG-F(ab)2-알렉사(JIR #：115-545-006)에 재현탁시켰다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 이어서 세포를 FACS 완충제(2% FBS와 함께 PBS pH 7.2)으로 3회 세척한 다음, FACS 완충제에 재현탁시키고 FACS 기구(FACSCalibur™ Flow Cytometer, BD Biosciences)에 의해 결합 신호 수집 및 분석하였다. SK-BR3 세포 및 MCF7 세포에 대한 동일한 하이브리도마 상청액의 결합 신호를 계산하고 SK-BR3-결합/MCF7-결합의 비율을 추가로 계산하였다. 상기 ELISA 스크리닝으로부터의 1415개의 양성 하이브리도마 중에서, SK-BR3-결합/MCF7-결합 클론(예를 들어, 클론 A2, 클론 A7, 클론 A11, 클론 B2, 클론 B5, 클론 B7, 클론 B9 등)의 높은 비율을 갖는 상위 672개 하이브리도마를 세포 뱅킹 및 후속 기능성 스크리닝을 위한 양성 클론으로서 분리하였다. 그러한 세포-결합 스크리닝의 하나의 플레이트가 하기 표 5와 같이 예시되어 있다.
세포-기반 스크리닝이 완료되면, SK-BR3/MCF7의 높은-순위 비율을 갖는 상위 672개 하이브리도마를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 3-5일 동안 배양한 후, 각 웰의 하이브리도마 배지를 후속 에피토프 그룹화 및 세포-기반 기능성 스크리닝을 위해 수집하였고, 상응하는 세포를 장기간 보관을 위해 액체 질소에서 동결시켰다.
실시예 3. 트라스투주맙과의 경쟁에 기반한 하이브리도마 상청액의 에피토프 그룹화
실시예 2의 세포-결합 스크리닝으로부터의 양성 하이브리도마 세포에 기반하여, 각 세포주의 하이브리도마 상청액을 벤치마크 항체(예를 들어, 트라스투주맙 및/또는 페르투주맙) 기반 에피토프 그룹화에 의해 추가로 평가하여 본 발명의 항체를 2개의 범주로 나누었다: 벤치마크 경쟁 그룹 및 벤치마크 비경쟁 그룹. 간단히 말해, 96-웰 ELISA 플레이트를 재조합 인간 ErbB2-ECD(0.1ug/ml)로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 폐기하고 여과지에 가볍게 두드려 코팅 용액을 제거하고 200ul/웰의 차단 완충제를 첨가하고, 37℃에서 2h 동안 인큐베이션한다. 50ul의 관심 항체를 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 50ul의 0.03ug/ml 비오틴-표지된 벤치마크 항체(예를 들어, 비오틴-트라스투주맙 또는 비오틴-페르투주맙)를 첨가하고 추가 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 플레이트를 PBST로 3회 세척한다. 100ul/웰의 스트렙타비딘-HRP(1:5000)를 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. PBST로 3회 세척한다. 100ul/웰의 TMB 기질을 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 50ul/웰의 1N HCl을 첨가하여 반응을 종결시킨다. 450nm 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 플레이트를 판독한다. 하기 표 6은 트라스투주맙 경쟁적 ELISA 결과를 예시한다. 표 6에서, F7 웰은 정상 인간 IgG(대조군)이고, G7 웰은 정상 마우스 IgG(대조군)이고, H7 웰은 벤치마크 대조군(즉, 트라스투주맙, 5ug/ml)이다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙은 비오틴-트라스투주맙의 ErbB2-ECD 결합 능력을 차단하지만 인간 IgG 또는 마우스 IgG는 그렇지 않다. 유사하게, 샘플 C6, C7, D2, D3, D4, 및 H1-H6(볼드체, 이탤릭체 및 밑줄침)은 특정 억제 활성을 나타내며, 이는 이들이 트라스투주맙-에피토프와 동일하거나 중첩 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 이 플레이트의 나머지 샘플(예를 들어 A1-A7)은 재조합 인간 ErbB2-ECD에 대한 트라스투주맙 결합 활성을 억제하지 않으며, 이는 이들 항체가 트라스투주맙-에피토프와 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 트라스투주맙-에피토프 경쟁적 그룹화에 기반하여, 본 발명은 트라스투주맙-결합 에피토프와 별개의 에피토프에 결합하는 ErbB2 항체를 성공적으로 확인하였다.
실시예 4. 상승적 생물활성을 갖는 항체의 트라스투주맙-기반 스크리닝
표준 접근법과 달리, 본 발명은 초기 단계에서 대규모 트라스투주맙-기반 상승적 생물활성 스크리닝을 수행하였다. 실시예 2로부터 분리된 항원 양성 하이브리도마의 경우, 각 하이브리도마의 세포 배양 상청액은 BT474 유방암 세포 및/또는 MDA-MB-VII175 세포의 세포 증식을 억제하는 이의 트라스투주맙-상승적 효능에 대해 추가로 스크리닝되었다. 간단히 말해, 세포를 100ul 배지를 갖는 플레이트에 2000개 세포/웰로 시딩한다. 세포를 시딩한 다음 날에, 40ul의 세포 배양 배지를 흡입하고, 벤치마크 항체(트라스투주맙, 페르투주맙, 및 트라스투주맙+페르투주맙의 조합물), 실시예 2로부터의 개별 하이브리도마 상청액, 및 트라스투주맙과 실시예 2로부터의 각 개별 하이브리도마 상청액의 조합물을 포함하는 60ul의 항체 샘플을 첨가한다. 세포를 120-144시간 동안 계속하여 배양한다. CellTiter Glo를 10분 동안 첨가한다. 시험 세포 배양 플레이트를 SpectraMax M5 플레이트-판독기로 분석하였다. 바람직하게는, 트라스투주맙의 세포 증식 억제를 상승적으로 촉진하는 하이브리도마 상청액을 스크리닝하기 위해, 관심 샘플 세트는 (a) 트라스투주맙-단독 활성 그룹(HOA); (b) 페르투주맙-단독 활성 그룹(POA); (c) 트라스투주맙/페르투주맙(50% 트라스투주맙/50% 페르투주맙) 조합물 그룹(HPC); (d) Mab 독립적 활성 그룹(MIA): 시험 중인 하이브리도마 상청액 샘플; (e) 트라스투주맙-상승적 활성 그룹(HSA): 트라스투주맙 + 시험 중인 하이브리도마 상청액 샘플; (f) 음성 대조군(NC): 인간 IgG + 마우스 IgG를 포함한다. 트라스투주맙-상승적 후보를 선택하기 위한 기준은 다음에 기반한다: 동일한 조건 하에, HSA의 세포 증식 억제 활성이 HOA 또는 MIA의 것보다 높고 HOA + MIA의 합의 50%를 초과하는 경우, 시험 중인 샘플은 세포 증식 억제 검정에서 트라스투주맙-상승적 생물활성을 함유한다. 바람직하게는, 동일한 세포 배양 조건 하에, HSA의 세포 증식 억제 활성이 HPC(트라스투주맙/페르투주맙 그룹)의 것보다 높으면, 시험 중인 샘플은 페르투주맙의 것보다 높은 트라스투주맙-상승적 생물활성을 나타내는 것으로 간주된다. 상기 스크리닝 후, 실시예 2로부터의 상위 672개 하이브리도마 상청액을 평가하고, 세포 증식 억제의 트라스투주맙-상승적 생물활성에 대해 순위를 매기고, 각 세포주의 클론성을 보장하기 위해 희석을 제한함으로써 상위 15개 후보를 서브클로닝하였다. 그 중에서, 예로서 5개의 하이브리도마 세포주(4C9, 4H2, 4G6, 5F12, 및 5G9)가 항체 생산에 사용되었고, 상응하는 정제된 IgG가 상기 프로토콜에 따라 트라스투주맙-상승적 생물활성에 대해 추가로 확인되었다. 결과는 실시예 5 표 11에 요약되어 있다.
실시예 5. 본 발명의 항체의 생화학적 특성
본 발명의 정제된 IgG의 ErbB2-결합 활성 확인
본 발명의 5개 항체의 상응하는 정제된 IgG를 SDS-PAGE 분석하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 5개 모두의 항체는 재조합 ErbB2-ECD 및 ErbB2-양성 세포에 결합할 수 있는 IgG1/κ인 것으로 아이소형이 확인된다(하기 표 7 참조).
본 발명의 항체의 ErbB2-결합 EC50
본 발명의 5개 항체의 상응하는 정제된 IgG를 또한 재조합 인간 ErbB2에 대한 결합 활성에 대해 포집 ELISA에 의해 평가하였다. 절차는 다음과 같이 간단히 설명된다: 96-웰 플레이트를 0.5 μg/ml 항-ErbB2 항체로 밤새 코팅하고, PBST 중 1% BSA에 의해 1시간 동안 37℃에서 차단하였다. 2 μg/ml에서 출발하여 1:5 연속 희석된 비오틴-인간 ErbB2-ECD의 연속 희석된 샘플을 첨가한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 100 ul의 HRP-스트렙타비딘(1:5000)을 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 추가로 40분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 100 ul/웰의 TMB를 첨가하여 실온에서 15분 동안 발색시킨 후 50 ul의 1N HCl로 켄칭하였다. OD 값에 대해 450nm에서 플레이트를 판독한다. Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 EC50을 계산하고 그 결과는 하기 표 8에 제시된다.
상이한 종으로부터 유래된 ErbB2에 대한 본 발명의 항체의 결합 능력
실시예 1에 기재된 간접 ELISA를 사용하여, 마우스, 래트, 히말라야 원숭이, 필리핀 원숭이 및 인간과 같은 상이한 종으로부터 유래된 재조합 ErbB2-ECD에 대한 본 발명의 항체의 결합 활성을 조사하였다. 간단히 말해, 96-웰 ELISA 플레이트를 상이한 종의 1ug/ml 재조합 ErbB2-ECD로 100ul/웰로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 폐기하고 여과지를 가볍게 두드려 코팅 용액을 제거한다. 200ul/웰의 차단 완충제를 첨가하고, 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다. 본 발명의 정제된 항체를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 염소 항-마우스 IgG-HRP 100ul/웰을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 15분 후에 100ul/웰의 TMB를 첨가하고, 50ul/웰의 1N HCl을 첨가한다. 450nm 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 플레이트를 판독한다. 결과는 하기 표 9에 요약되어 있으며, 이는 본 발명의 5개 항체가 히말라야 원숭이, 필리핀 원숭이로부터 유래된 재조합 ErbB2에 대해 교차-반응성이고, 래트 및 마우스 대응물에 대해서는 그렇지 않음을 나타낸다.
본 발명의 정제된 항체의 에피토프 그룹화
실시예 3에 기재된 방법과 달리, 정제된 항체의 에피토프 그룹화는 경쟁적 ELISA 후 포집 ELISA에 의해 평가되었다. <1> 비오틴-표지된 재조합 ErbB2-ECD의 결합 EC80의 농도를 결정하기 위해 포집 ELISA를 수행하였다. 간단히 말해, 96-웰 플레이트를 0.5 μg/ml의 항-ErbB2 항체로 밤새 코팅하고, PBST 중 1% BSA에 의해 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 100 ul의 HRP-스트렙타비딘(1:5000)을 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 추가로 40분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 100 ul/웰의 TMB를 첨가하여 실온에서 15분 동안 발색시킨 후 50 ul의 1N HCl로 켄칭한다. 각 시험 항체에 대한 비오틴-표지된 재조합 ErbB2-ECD의 EC80 농도를 수득하기 위해 OD 값에 대해 450nm에서 플레이트를 판독한다; <2> 2개의 항체가 별개의 에피토프 또는 동일한 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위해 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 항원에 결합하는 2개 항체의 교차-경쟁 능력이 높을수록, 2개 항체의 에피토프는 더욱 동일하다(또는 2개의 시험 항체의 에피토프가 별개일 가능성이 낮아짐). 간단히 말해, 96-웰 플레이트를 상기와 동일한 절차에 따라 코팅하였다. EC80의 농도 및 10 μg/ml의 시험 항체와 ErbB2-ECD-비오틴의 사전-인큐베이션된 혼합물을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 100 ul의 HRP-스트렙타비딘(1:5000)을 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 추가로 40분 동안 인큐베이션한다. 상기 포집 ELISA에서와 동일한 절차에 따라 OD450 값을 얻고 교차-경쟁 능력을 계산한다. 교차-경쟁 능력이 80% 이상인 경우, 2개 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 4C9, 4H2, 4G6, 5F12, 및 5G9는 서로 강력한 교차-경쟁 능력을 나타내지만, ErbB2-ECD에 결합함에 있어 트라스투주맙 또는 페르투주맙과 경쟁하지 않는데, 이는 본 발명의 항체들이 동일한 에피토프 또는 고도-중첩 에피토프에 결합하지만, 트라스투주맙-에피토프 또는 페르투주맙 에피토프와는 별개인 것을 나타낸다.
본 발명의 항체의 트라스투주맙-상승적 생물활성
실시예 4에 기재된 방법을 사용하여, 본 발명에 의해 분리된 정제된 항체(4C9, 4H2, 4G6, 5F12, 및 5G9)의 트라스투주맙-상승적 생물활성을 BT-474 세포 증식 억제 검정에 의해 평가하였다. 결과(도 2A-2E 및 표 11 참조)는 본 발명의 항체가 세포 증식의 특정 억제 활성을 나타내지만, 트라스투주맙과 조합시 강한 상승적 억제 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 트라스투주맙과 본 발명의 항체의 세포 증식 억제 활성은 임상에 사용된 공지된 조합물인 트라스투주맙 및 페르투주맙의 것보다 높다.
실시예 6. DNA 클로닝 및 시퀀싱에 의한 항-ErbB2 모노클로날 항체의 가변 영역 단백질 서열의 추론
다음 프로토콜을 사용하여, 총 RNA를 하이브리도마 세포 펠렛으로부터 트리졸 시약(Invitrogen, 15596)을 사용하여 추출하였다. 1ml의 트리졸 시약을 첨가하여 세포(DPBS에서 제조된 약 1x107개 세포)를 파괴하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 200 ul의 클로로포름을 첨가한다. 15초 동안 격렬하게 진탕시킨다. 실온에서 3분 동안 인큐베이션한다. 12,000 x g으로 4℃에서 15분 동안 원심분리한다. 수성상을 새로운 1.5 ml 원심분리 튜브로 옮긴다. 500 ul의 이소프로필 알콜을 첨가한다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 12,000 x g으로 4℃에서 10분 동안 원심분리한다. 1 ml의 75% 에탄올로 세척한다. 7500 rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리한다. 10분 동안 공기 건조한다. 40 ul의 DEPC-처리된 물에 재현탁한다. 55℃에서 10분 동안 인큐베이션한다. Nanodrop 상에서 A260을 측정한다.
이어서, 2ug의 총 RNA를 사용하여 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen, 18080-400)를 사용하여 제1-가닥 cDNA를 다음 프로토콜에 따라 합성하였다:
열 순환기에서 65℃로 5분 동안 인큐베이션한 다음, 즉시 얼음 위에 2분 동안 둔다. 얼음 위의 튜브에 다음을 첨가한다: 10 μl의 2x 제1-가닥 Remix Mix 및 2 μl의 SuperScriptR III/RNase OUT™ Enzyme Mix. 볼텍싱에 의해 샘플을 혼합한 후 잠시 원심분리한다. 50℃에서 50분 동안 인큐베이션한다. 85℃에서 5분 동안 반응을 종결시킨다. 얼음 위에서 식힌다. 이후 생성된 cDNA를 항체의 가변 영역의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. PCR은 제1-가닥 cDNA, 마우스 Ig-Primer Set(Novagen, catalog #69831-3)로부터의 프라이머 및 PLATINUM® Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen, 11304)를 사용하여 수행되었다. 중쇄 가변 영역을 증폭시키기 위해, PCR 샘플을 다음과 같이 어셈블링하였다: 27 μl PCR Super Mix + 1 μl 역방향 프라이머 MuIgG VH3'-2 + 1 μl cDNA + 1 μl MuIg-5' 선도 프라이머. 경쇄 가변 영역을 증폭시키기 위해, PCR 샘플을 다음과 같이 어셈블링하였다: 27 μl PCR Super Mix + 0.25 μl 역방향 프라이머 MuIgK VL3'-1 + 1 μl cDNA + 1 μl MuIg-5' 선도 프라이머.
선도 프라이머와의 반응을 위해 VH-A, VH-B, VL-A 및 VL-B는 다음 PCR 사이클을 사용한다: 단계 1-변성 94℃ 2 min; 단계 2-변성 94℃ 30 sec; 단계 3-어닐링 50℃ 30 sec.; 단계 4-연장 72℃ 1 min.; 35회 사이클, 단계 2 내지 4; 단계 5-최종 연장 72℃ 5 min.; 단계 6-냉각 4℃ 영구적.
선도 프라이머와의 반응을 위해 VH-C 내지 VH-F, 및 VL-C 내지 VL-G는 다음 PCR 사이클을 사용한다: 단계 1-변성 94℃ 2 min; 단계 2-변성 94℃ 30 sec; 단계 3-어닐링 60℃ 30 sec.; 단계 4-연장 72℃ 1 min.; 35회 사이클, 단계 2 내지 4; 단계 5-최종 연장 72℃ 5 min.; 단계 6-냉각 4℃ 영구적.
PCR 생성물을 1.2% 아가로스 겔에서 진행시키고, DNA 추출을 위해 예상된 크기(400-500 bp)로 이동하는 밴드를 절제하였다. DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, catalog #28704)를 사용하여 다음 프로토콜에 따라 정제하였다: 겔 슬라이스를 칭량하였다. 1 부피의 겔에 대해 3 부피의 완충제 QG를 각 겔 슬라이스에 첨가하였다. 샘플을 겔 슬라이스가 완전히 용해될 때까지, 2-3분마다 혼합하면서, 50℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후 1 겔 부피의 이소프로판올을 각 샘플에 첨가하고 혼합하였다. 이후 샘플을 QIAquick 컬럼에 적용하고 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 세척하기 위해, 750 ul의 완충제 PE를 샘플에 첨가하고 13000 rpm에서 1분 동안 회전시켰다. 이후 잔류 에탄올을 완전히 제거하기 위해 컬럼을 13,000 rpm에서 추가로 1분 동안 원심분리하였다. 각 컬럼에 30 μl의 H20를 첨가하고 13,000 rpm에서 1분 동안 회전시켜 DNA를 용리시켰다. 이후 정제된 PCR 생성물을 시퀀싱하여 가변 영역 서열을 확인하였다(하기 표 12).
실시예 7. 키메라 항체의 생성 및 특성화
항-ErbB2 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(상기 표 12)을 각각 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역에 대해 인-프레임으로(in-frame)으로 클로닝하였다. 생성된 키메라 항체의 활성을 포집 ELISA 검정으로 확인하였고(하기 표 13), 이는 부모 마우스 모노클로날 항체와 유사하였다.
실시예 5에 기재된 동일한 방법에 따라, 본 발명의 키메라 항체의 결합 활성을 마우스, 래트, 히말라야 원숭이, 필리핀 원숭이 및 인간과 같은 상이한 종으로부터 유래된 재조합 ErbB2-ECD 결합에 대해 조사하였다. 결과를 하기 표 14에 나타내었다.
키메라 항체의 트라스투주맙-상승적 생물활성의 확인
실시예 5에 기재된 것과 동일한 절차에 따라, 상응하는 키메라 항체를 BT474 유방암 세포의 세포 증식을 억제하는 이들의 트라스투주맙-상승적 효능에 대해 평가하였다. 결과는 표 15에 요약되어 있다.
실시예 8. 항-ErbB2 마우스 모노클로날 항체 5F12의 인간화
5F12 마우스 항-ErbB2 항체(상기 표 12)는 인간화되었다. 인간화된 변이체 아미노산 서열 VH.v1, VH.1, VH.2, VH.3, VH.4, VL.v1, VL.1, VL.2, VL.3, VL.4, VL.5, VL.6(하기 표 16)은 가장 상동인 인간 생식계열에 기반한 DNA 서열로 전환되고 합성되었다. 중쇄 변이체의 경우, 인간 생식계열 중쇄 억셉터 서열 hIGHV1-46 FR1, hIGHV1-46 FR2, hIGHV1-46 FR3, 및 hIGHJ4 FR4가 사용되었다(상기 표 2 참조). 경쇄 변이체 VL.l, VL.la, 및 VL.lb의 경우, 인간 생식계열 경쇄 억셉터 서열 hIGKV1-33 FR1, hIGKV1-33 FR2, hIGKV1-33 FR3, 및 hIGKJ1 FR4가 사용되었다(상기 표 3 참조). 정확성을 확인하기 위해 개별 작제물을 서열 검증하였다. 이후 양성 변이체를 250 ml Luria 브로스 + 암피실린에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. Qiagen maxi prep 키트를 사용하여 변이체 배양물로부터 DNA를 추출하였다.
총 35개 변이체에 대해 VH.v1, VH.1, VH.2, VH.3 또는 VH.4의 각각의 중쇄 변이체를 VL.v1, VL.1, VL.2, VL.3, VL.4, VL.5, 및 VL.6의 각각의 경쇄 변이체와 조합하여 인간화된 항체를 생성하였다(하기 표 17).
그 중에서, 최소 역 돌연변이를 갖는 11개의 변이체를 항체 생산 및 정제를 위해 선택하고, 포집 ELISA에 의해 ErbB2 결합 EC50에 대해 평가하였다. 결과(하기 표 18 참조)는 하나를 제외한 11개의 변이체가 5F12 키메라 항체와 비교하여 동등한 ErbB2 결합 EC50을 보인다는 것을 나타낸다.
실시예 9. 항-ErbB2 마우스 모노클로날 항체 5G9의 인간화
5G9 마우스 항-ErbB2 항체(상기 표 12)는 인간화되었다. 인간화된 변이체 아미노산 서열 VH.v1, VH.1, VH.2, VH.3, VH.4, VL.v1, VL.1, VL.2, VL.3, VL.4, VL.5, VL.6(하기 표 19)은 가장 상동인 인간 생식계열에 기반한 DNA 서열로 전환되고 합성되었다. 중쇄 변이체의 경우, 인간 생식계열 중쇄 억셉터 서열 hIGHV1-69 FR1, hIGHV1-69 FR2, hIGHV1-69 FR3, 및 hIGHJ1 FR4가 사용되었다(상기 표 2 참조). 경쇄 변이체 VL.v1, VL.1, VL.2, VL.3, VL.4, VL.5, VL.6의 경우, 인간 생식계열 경쇄 억셉터 서열 hIGKV1-27 FR1, hIGKV1-27 FR2, hIGKV1-27 FR3, 및 hIGHJ1 FR4가 사용되었다(상기 표 3 참조). 정확성을 확인하기 위해 개별 작제물을 서열 검증하였다. 이후 양성 변이체를 250 ml Luria 브로스 + 암피실린에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. Qiagen maxi prep 키트를 사용하여 변이체 배양물로부터 DNA를 추출하였다.
총 42개 변이체에 대해 VH.v1, VH.1, VH.2, VH.3, VH.4 및 VH5의 각각의 중쇄 변이체를 VL.v1, VL.1, VL.2, VL.3, VL.4, VL.5, 및 VL.6의 각각의 경쇄 변이체와 조합하여 인간화된 항체를 생성하였다(하기 표 20).
그 중에서, 최소 역 돌연변이를 갖는 12개의 변이체를 항체 생산 및 정제를 위해 선택하고, 포집 ELISA에 의해 ErbB2 결합 EC50에 대해 평가하였다. 결과(하기 표 21 참조)는 6/12 변이체가 5G9 키메라 항체와 비교하여 더 낮은 ErbB2 결합 EC50을 보인다는 것을 나타낸다.
실시예 10. BT474 이종이식 모델에서 항-ErbB2 항체 혼합물의 생체내 효능
BT474 유방암 이종이식 종양 모델의 생체내 연구가 Crown Bioscience에 의해 계약 번호 E0627-T1401 하에 상업적으로 수행되었다. 본 연구는 (a) 트라스투주맙 단독; (b) 트라스투주맙과 본 발명에 의해 분리된 항체 중 어느 하나의 조합물; (c) 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합물에 의한 치료의 항종양 활성을 조사하였다.
6-8주령의 암컷 NOD/SCID 마우스; 체중 17.7-26.0 g(Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. China)을 12시간 광/12시간 암의 매일 주기, 실온 21.9-23.8℃, 습도 40-45%를 갖는 특정-병원체가 없는 조건 하에 유지하였다. 도착 후, 새로운 환경에 적응하게 하고 관찰을 위해 동물들은 1주일 동안 동물 시설의 검역 공간에 수용된다. 지속적인 건강 모니터링을 정기적으로 수행한다. 다이어트 식품(방사성동위원소 60Co로 조사됨)과 물은 임의로 제공된다.
인간 유방암 세포주 BT474를 10% FBS를 갖는 DMEM에서 배양하였다. 세포 성장이 로그 단계에 도달하면, 세포를 수집하고 PBS로 세척한 다음 적절한 농도로 희석하였다. 재구성된 기저막(Matrigel; Collaborative Research, Bedford, Mass.)을 1:1 부피 비로 혼합한 후, 세포(1 x 107개 세포/마우스)를 마우스 유방 패드 아래에 접종하였다. 이식된 종양의 부피가 약 151mm3에 도달하면, 마우스를 다음을 포함하는 8개 그룹(6마리 마우스/그룹)으로 무작위로 나누었다: (a) 그룹-1: PBS(비히클 대조군); (b) 그룹-2: PC(트라스투주맙 단독, 3mg/kg); (c) 그룹-3: 트라스투주맙 + 4C9의 조합물(1.5mg/kg+1.5mg/kg); (d) 그룹-4: 트라스투주맙 + 4H2의 조합물(1.5mg/kg+1.5mg/kg); (e) 그룹-5: 트라스투주맙 + 4G6의 조합물(1.5mg/kg+1.5mg/kg); (f) 그룹-6: 트라스투주맙 + 5F12의 조합물(1.5mg/kg+1.5mg/kg); (g) 그룹-7: 트라스투주맙 + 5G9의 조합물(1.5mg/kg+1.5mg/kg); (h) 그룹-8: 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합물(1.5mg/kg+1.5mg/kg). 마우스를 처음 2주 동안 매주 처리한 후, 다음 2주 동안 총 7회 투여량으로 매주 2회 처리하였다. 시험 항체는 꼬리 정맥 주입에 의해 투여되었다.
이 연구에서, 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 치료 개시 후 32일에 1064 mm3에 도달하였다. PC 그룹 처리(트라스투주맙 단독, 3 mg/kg)는 잔류 항종양 활성을 나타내었고, 32일에 95%의 T/C 값으로 965 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였으며, 비히클 대조군과 비교하여(P = 0.24) 종양 부피의 측면에서 더 작긴 하지만 유의하지 않은 차이가 관찰되었는데, 이는 트라스투주맙이 3mg/kg의 낮은 투여량에서 항종양 활성이 거의 없음을 나타낸다. 반대로, 동일한 투여량 스케줄 하에, 트라스투주맙과 본 발명에 의해 분리된 항체 중 어느 하나 또는 페르투주맙의 조합물은 비히클 대조군과 비교하여 중간 내지 상당히 강한 항종양 활성을 보여준다. 바람직하게는, 동일한 투여량 처리 하에, 트라스투주맙 + 5F12 또는 트라스투주맙 + 5G9의 조합물은 47% 또는 53%의 T/C 값(각각 p<0.03 또는 p<0.001)으로 종양 성장을 크게 억제하였는데, 이는 5F12 또는 5G9가 트라스투주맙 치료의 항종양 효능을 유의하게 향상시킬 수 있다는 것을 입증한다. 보다 바람직하게는, 5F12 및 5G9는 현재 임상에 사용되는 공지된 약물인 페르투주맙보다 트라스투주맙-매개된 항종양 효능에 대해 상당히 높은 상승적 활성을 나타내었다(각각 p<0.07 및 p<0.006). 트라스투주맙과 본 발명에 의해 분리된 항체의 조합물의 항종양 효능의 결과는 도 3A-3B 및 표 22에 제시되어 있다.
실시예 11. NCI-N87 위 모델에서 항-ErbB2 항체 혼합물(5G9, 5F12)의 생체내 효능
NCI-N87 이종이식 모델을 사용하여 트라스투주맙과 조합된 본 발명의 항체의 상승적 효능을 추가로 평가하였다. 이 연구의 절차는 다음과 같이 간단히 요약된다: <1> NCI-N87 세포를 로그 단계로 배양하고 수집하였다; <2> NCI-N87 세포를 PBS에 재현탁시키고, 세포 밀도를 8x107개 세포/ml로 조정하고, 100 μl 또는 8x107개 세포를 무흉선 누드 암컷 마우스의 좌측 옆구리 부위에 피하 주입하였다; <3> 종양이 약 100 내지 200 mm3 크기로 성장하게 한 다음 마우스를 그룹에 무작위화하였다; <4> 동물에게 지시된 용량의 항체를 매주 2회 복강내 투여하고, 종양 크기 및 체중을 주 2회 측정하였다. 종양 부피(TV)를 공식 TV = 1/2×a×b2를 사용하여 계산하였다 (여기서 "a"는 더 큰 종양 직경을 나타내고 "b2"는 가장 작은 종양 직경을 나타낸다).
NCI-N87 종양 성장에 대한 트라스투주맙과 5G9, 5F12 또는 페르투주맙의 조합물의 생체내 효능의 연구 설계는 표 23에 제시되어 있다. 이 연구의 1-단계는 5G9, 5E12, 및 상이한 투여량의 트라스투주맙(5mg/kg, 10mg/kg, 및 15mg/kg)과 이들의 조합물의 효능을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 연구의 2-단계는 구체적으로 두 가지 양태에 중점을 두고 있다: <1> 26일부터 시작하여, 저 투여량(5mg/kg)의 5G9 및 5F12의 단일 치료에 트라스투주맙(5mg/kg)의 첨가가 트라스투주맙 고 투여량 그룹(15mg/kg)과 비교하여 상승적 효능을 재구성할 수 있는지 여부. <2> 26일부터 시작하여, 추가 처리 없이 동일한 투여량(5mg/kg+5mg/kg) 하에, 트라스투주맙과 5G9 또는 5E12의 조합물이 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합물과 비교하여 항종양 효능을 유지할 수 있는지 여부.
이 연구의 1-단계 결과는 표 24에 요약되어 있다. 연구 결론은 다음과 같이 요약된다: <1> 5mg/kg 투여량의 트라스투주맙 처리는 강력한 항종양 활성을 나타내었고, 22일에 43.59%의 TGI 값(즉, TGI = (1 - 처리된 종양의 평균 부피/대조군 종양의 평균 부피) x 100%)으로 227 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였으며, 비히클 대조군과 비교하여 종양 부피의 측면에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(그룹 2 대 그룹 1, P<0.01). 그러나, 트라스투주맙 처리의 3배 증가(15 mg/kg)는 이의 효능을 현저하게 향상시킬 수 없었고(그룹 3 대 그룹 2, P>0.05), 이는 트라스투주맙의 항종양 효능이 5mg/kg과 같은 특정 투여량에 도달한 후 개선되지 않을 것임을 나타낸다; <2> 그러나 낮은 투여량의 5G9 또는 5F12와 트라스투주맙의 조합물(5 mg/kg +5 mg/kg)은 높은 투여량(15mg/kg)의 5G9, 5F12 또는 트라스투주맙의 단일 치료보다 훨씬 높은 항종양 효능을 나타낸다. 22일에 종양 부피의 측면에서 조합 치료(그룹 8, 10)와 단일 치료(그룹 5, 7 및 3) 사이에 매우 현저가 차이가 관찰되었고(그룹 8 또는 10 대 그룹 5, 7 또는 3, P<0.01), 이는 트라스투주맙과 5G9 또는 5F12의 조합물이 강력한 상승적 항종양 효능을 나타낸다는 증거를 제공한다; <3> 동일한 투여량 처리 하에(5 mg/kg +5 mg/kg 또는 15 mg/kg +15 mg/kg), 트라스투주맙과 5G9의 조합물은 트라스투주맙 및 페르주투맙의 조합물보다 훨씬 높은 항종양 활성을 보여주며, 22일에 98.31% 또는 98.61%의 TGI 값으로 8.75 mm3 또는 7.23 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였다. 트라스투주맙과 페르투주맙 조합물의 대조군과 비교할 때 매우 현저한 차이가 관찰되었다(22일에 90.97% 또는 95.87%의 TGI 값으로 46.83 mm3 또는 21.41 mm3, P<0.05 또는 P<0.01). 이 결과는, 페르투주맙과 달리, 5G9가 트라스투주맙과 조합시 독특한 상승적 활성을 지님을 보여준다; <3> 동일한 투여량 처리 하에(15 mg/kg +15 mg/kg), 트라스투주맙과 5F12의 조합물은 트라스투주맙 및 페르주투맙의 조합물보다 훨씬 높은 항종양 활성을 보여주며, 22일에 99.72%의 TGI 값으로 1.45 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였다. 트라스투주맙과 페르투주맙 조합물의 대조군과 비교할 때 매우 현저한 차이가 관찰되었다(22일에 95.87%의 TGI 값으로 21.41 mm3, P<0.01). 이 결과는, 페르투주맙과 달리, 5F12가 트라스투주맙과 조합시 독특한 상승적 활성을 지님을 보여준다.
5G9 또는 5F12의 기존 단일 치료에 트라스투주맙의 첨가가 상승적 효능을 재구성할 것인지를 조사하기 위해, 1-단계 연구 내지 2-단계의 끝 이후에 5G9(5mg/kg) 또는 5F12(5mg/kg)의 단일 치료를 5mg/kg의 트라스투주맙 투여랑과 추가로 조합시켰다. 표 25에 제시된 대로, 5mg/kg 투여량의 5G9 또는 5F12의 단일 치료는, 26일에 190.75 mm3의 평균 종양 크기 및 63.23%의 TGI 값을 갖는 15mg/kg 투여량의 트라스투주맙 처리에 반해, 26일에 각각 424.57mm3 또는 386.92mm3의 평균 종양 크기 및 54.23% 또는 25.41%의 TGI 값으로 15mg/kg 투여량의 트라스투주맙의 처리보다 현저하게 낮은 항종양 활성을 나타내었다(그룹 4 또는 6 대 그룹 3, P=0.003<0.01 또는 P=0.012<0.05). 그러나, 26일에 시작되는 균등한 5 mg/kg + 5 mg/kg 투여량의 5G9 또는 5F12의 단일 치료에 트라스투주맙의 첨가시, 조합 치료는 트라스투주맙 고-용량 단독 처리의 효능을 따라 잡는 상승적 항종양 효능을 재구성할 수 있어, 57일에 39.11% 또는 58.95%의 TGI 값으로 1305.11 mm3 또는 879.9 mm3의 최종 평균 종양 크기를 초래하였고, 이는 57일에 58.55%의 TGI 값으로 888.57 mm3의 평균 종양 크기를 갖는 15mg/kg 투여량의 트라스투주맙 처리와 통계적으로 유의한 차이가 없었다(그룹 4 또는 6 대 그룹 3, 각각 P= 0.165>0.05 또는 P=0.491>0.05). 유사하게, 5 mg/kg + 5 mg/kg 투여량의 5G9 + 트라스투주맙 또는 5F12 + 트라스투주맙의 조합물 처리의 종양 부피 진행율은 15 mg/kg의 높은 투여량의 트라스투주맙-처리의 진행율보다 훨씬 낮고, 트라스투주맙 단독 처리에 대한 292.92%에 비해 5G9/트라스투주맙 조합물 또는 5F12/트라스투주맙 조합물에 대해 192.60% 또는 130.97%를 초래하며, 한편 5 mg/kg + 5 mg/kg 투여량의 5G9 + 트라스투주맙 또는 5F12 + 트라스투주맙의 조합물 처리의 TGI 진행율은 15mg/kg의 높은 투여량의 트라스투주맙-처리의 진행율보다 훨씬 높고, 트라스투주맙 단독 처리에 대한 -7.71에 비해 5G9/트라스투주맙 조합물 또는 5F12/트라스투주맙 조합물에 대해 39.93% 또는 53.52%를 초래한다. 종합하면, 상기 결과는 트라스투주맙과 5G9 또는 5F12의 조합물이 강한 상승적 항종양 효능을 보인다는 것을 나타낸다.
트라스투주맙과 5G9 또는 5E12의 조합물이 트라스투주맙/페르투주맙 조합물보다 양호한 항종양 효능을 유지할 수 있는지를 조사하기 위해, 낮은 투여량(5mg/kg + 5mg/kg) 처리를 이 평가에 사용하였는데, 그 이유는 3개 모두의 조합물(트라스투주맙/5G9, 트라스투주맙/5F12, 및 트라스투주맙/페르투주맙)의 높은 투여량 처리가 22일까지 종양을 거의 완전히 제거하였기 때문이다. 표 26에 나타낸 바와 같이, 치료 중단 후, 트라스투주맙/5G9 그룹 또는 트라스투주맙/5F12 그룹에서의 종양 진행은 상당히 느리고, 종양 진행율은 트라스투주맙/5G9 그룹 또는 트라스투주맙/5F12 그룹에서 각각 93.55% 또는 125.81%이나, 트라스투주맙/페르투주맙 그룹에서는 351.85%이다. 26일 대 57일 종양 부피에 관해, 트라스투주맙/5G9 그룹(P=0.278>0.05) 또는 트라스투주맙/5F12 그룹(P=0.064>0.05)에 대해 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 반면, 26일 대 57일 종양 부피에 관해 트라스투주맙/페르투주맙 처리 그룹(P=0.03<0.05)에서는 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. 또한, 트라스투주맙/5G9 그룹 또는 트라스투주맙/5F12 그룹의 TGI는 26일과 57일 사이에 높게 유지되었지만, 트라스투주맙/페르투주맙 그룹에서는 약간 감소하였다. 종합하면, 이들 결과는 트라스투주맙/5G9 또는 트라스투주맙/5F12의 조합 치료가 트라스투주맙/페르투주맙 그룹보다 현저히 더 우수한 효능을 가짐을 나타낸다.
실시예 12. 본 발명의 항체 및 이들의 조합물의 세포-기반 내재화율
2-항체 조합물의 이들의 내재화율에 대한 상승적 효과를 조사하기 위해, 세포-기반 세포내이입 검정을 수행하였다. 간단한 절차는 다음과 같다: <1> SKBR3 세포를 PBS로 세척한 다음, 37℃에서 약 2분 동안 트립신으로 분해시켰다. 세포를 차가운 FACS 완충제에 재현탁시키고, 3x106개 세포/ml로 조정하였다; <2> 1ml 세포 현탁액을 FACS 튜브에 첨가하였고, 이 때 최종 농도 2ug/ml의 FITC-컨쥬게이션된 또는 APC-컨쥬게이션된 항체(트라스투주맙, 또는 페르투주맙, 또는 본 발명의 항체) 또는 이들의 조합물을 첨가하였다. 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 1000rpm, 5분, 4℃에서 원심분리하고; 상청액을 따라서 버렸다. 이후 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고, 1ml FACS 완충제에 재현탁시켰다. 2x200ul의 세포 현탁액을 0분에 각각 대조군 및 샘플로서 취하였다. 나머지 세포를 1000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다; <3> 세포를 배지(DMEM+10%FBS+PS)에서 재현탁하고, 내재화를 위해 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 200ul의 샘플을 각각 30분 및 2시간에 취하였다. 샘플을 얼음 위에서 5분 동안 냉각시키고, 1000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거한 다음, FACS 완충제로 1회 세척하였다; <4> 250ul 스트립 완충제를 세포에 첨가하고, RT에서 7분 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 1000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하고, FACS 완충제로 2회 세척하였다; <5> 200ul의 고정 완충제를 세포에 첨가하고, 4℃에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 유세포분석기로 분석하였다; <6> 단계 2에서 취한 0분에서의 대조군 및 샘플에 대해, 하나는 고정 완충제로 직접 고정하고(단계 5), 다른 하나는 단계 4 및 단계 5로 처리하였다(스트립 완충제 및 고정 완충제 사용); <7> 항체 또는 항체 조합물의 내재화율은 평균 백분율 변화 = [내재화 그룹 (MFI-MFI 블랭크)]/[결합 친화성 그룹 (MFI-MFI 블랭크)]로서 계산되었다.
표 27에 나타낸 바와 같이, 모든 시험 항체(트라스투주맙, 페르투주맙, 4C9, 4H2, 4G6, 5F12, 및 4G9)는 SKBR3 세포에서 항원-항체 내재화 현상을 나타낸다. 트라스투주맙 및 페르투주맙과 달리, 본 발명의 각각의 개별 항체(4C9, 4H2, 4G6, 5F12, 및 4G9)는 트라스투주맙 또는 페르투주맙보다 훨씬 높은 내재화율을 나타낸다. 그 중에서, 4C9 및 5F12는 트라스투주맙보다 현저히 높은 내재화율을 나타내며(P<0.05), 이는 본 발명의 항체(특히 4C9, 5F12 및 4G9)가 항체-약물 컨쥬게이트 적용을 위한 더 나은 후보일 수 있음을 뒷받침한다.
표 28에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체와 조합될 때, 트라스투주맙의 내재화율은 트라스투주맙 단독보다 매우 현저히 높으며(P<0.01), 이는 본 발명의 항체가 트라스투주맙의 내재화율을 유의하게 향상시킬 수 있고 결과적으로 트라스투주맙-약물 컨쥬게이트(즉, T-DM1)의 치료 효능을 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 13. PDX HERCEPTIN 내성 위 모델 - HUPRIME® 위암 이종이식 모델에서 항-ErbB2 항체 조합물의 생체내 효능
Crown Bioscience(Beijing) Inc.에서 확립되고 검증된 PDX 모델로서, 69세 아시아 여성 환자로부터 유래된 HUPRIME® 위암 이종 이식 모델 GA0060을 이 효능 연구를 위해 선택한다. Balb/c 누드 마우스에서 HUPRIME® 위암 이종이식 모델 GA0060의 치료에서 항-ErbB2 항체 조합물의 생체내 효능 연구를 Crown Bioscience Inc.(Beijing)에 의해 계약 번호 E0627-T1501/T1502 하에 수행하였다. 간단히 말해, 선택된 원발성 인간 위암 조직으로 접종된 스톡 마우스로부터의 종양 단편을 수확하고 BALB/c 누드 마우스에 접종하는데 사용하였다. 종양 발달을 위해 원발성 인간 위암 모델 GA0060 단편(P7, 직경 2-4 mm)을 각 마우스의 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 약 200 mm3에 도달했을 때 치료를 시작하였다. 마우스를 종양 크기에 따라 그룹 당 6마리 마우스의 12개 실험 그룹에 무작위로 할당하였다. 당일은 0일로 표시되었다. 시험 물품을 하기 표 29에 제시된 예정된 요법에 따라 0일 내지 28일에 종양-보유 마우스에 투여하였다.
이 연구의 결과는 표 30 및 도 4A-4B에 요약되어 있다. 비히클 처리된 마우스의 평균 종양 크기는 치료 개시 후 35일에 1201.1 mm3에 도달하였다. 동일한 시험 하에: <1> 트라스투주맙 단독 처리는 경미한 항종양 활성을 나타내었고, 35일에 77.7%의 T/C 값으로 932.7 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였고, 비히클 대조군과 비교하여(P=0.161>0.05) 종양 부피에 관해 유의한 차이는 관찰되지 않았다; <2> 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합물 처리는 트라스투주맙-단독 처리와 비교하여 심지어 더 낮은 항종양 효능을 나타내었고, 35일에 82.8%의 T/C 값으로 994.6 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였고, 비히클 대조군과 비교하여(P=0.217>0.05) 유의한 차이는 관찰되지 않았다; <3> 트라스투주맙 및 5F12의 조합물 처리는 트라스투주맙-단독 처리와 비교하여 더 강력한 효능을 나타내었고, 35일에 57.6%의 T/C 값으로 691.6 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였고, 비히클 대조군과 비교하여(P=0.004<0.01) 종양 부피에 관해 매우 유의한 차이가 관찰되었다; <4> 트라스투주맙 및 5G9의 조합물 처리는 트라스투주맙-단독 처리와 비교하여 더 강력한 효능을 나타내었고, 35일에 50.7%의 T/C 값으로 608.8 mm3의 평균 종양 크기를 초래하였고, 비히클 대조군과 비교하여(P=0.004<0.01) 종양 부피에 관해 매우 유의한 차이가 관찰되었다.
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표 1. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 서열
표 2. 중쇄 억셉터 서열
표 3. 경쇄 억셉터 서열
표 4. 항-ErbB2 하이브리도마 스크리닝(간접 ELISA) - 예(실시예 1)
주: H11: 음성 대조군-PBS, H12: 양성 대조군(폴리클로날 혈청)
표 5. 하이브리도마 상청액에 대한 세포-기반 결합 스크리닝 - 예
주: H11: 정상 마우스 혈청, H12: 양성 대조군(융합 혈청), 나머지 웰: 하이브리도마 상청액. 비율 값이 2보다 큰 샘플은 양성 클론으로 간주되며, 비율이 높을수록, 추가 평가를 위해 선택될 우선 순위가 높아진다.
표 6. 하이브리도마 상청액의 에피토프 그룹화(트라스투주맙-경쟁적 ELISA)
주: F7: hIgG 5ug/ml, G7: mIgG 5ug/ml, H11: 트라스투주맙 5ug/ml, 다른 웰: 하이브리도마 상청액
표 7. 본 발명에 의해 분리된 모노클로날 항체
표 8. 본 발명의 항체의 ErbB2-ECD 결합
표 9. 본 발명에 의해 분리된 항체의 교차-종 결합
주: "+"는 결합 활성을 나타낸다; "-"는 결합 활성이 없음을 나타낸다
표 10. 본 발명의 정제된 항체의 에피토프 그룹화
주: "-"는 "동일한" 에피토프에 결합함으로 인한 경쟁 관계를 나타낸다; "+"는 다른 에피토프에 결합함으로 인한 비경쟁 관계를 나타낸다.
표 11. 본 발명의 항체의 세포 증식 억제의 효능
주: *는 적어도 2회 실험의 범위를 나타낸다
표 12. 본 발명의 마우스 항-ErbB2 모노클로날 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열
표 12. (계속)
표 13. 키메라 항체의 재조합 ErbB2-ECD 결합 EC50
표 14. 본 발명에 의해 분리된 키메라 항체의 교차-종 결합
주: "+"는 결합 활성을 나타낸다; "-"는 결합 활성이 없음을 나타낸다
표 15. 키메라 항체의 BT474 세포 증식 억제의 효능
주: * "c": 키메라 항체를 나타낸다
표 16. 마우스 항-ERBB2 모노클로날 항체 5F12의 인간화된 버전의 VH 및 VL 아미노산 서열
표 16. (계속)
표 17. 생성된 인간화된 5F12 항체 및 역 돌연변이의 요약
표 18. 인간화된 5F12 변이체의 재조합 ErbB2-ECD 결합 활성
* "-": 결합 활성이 없음을 나타낸다.
표 19. 마우스 항-ERBB2 항체 5G9의 인간화된 버전의 VH 및 VL 아미노산 서열
표 19. (계속)
표 20. 생성된 인간화된 5G9 항체 및 역 돌연변이의 요약
표 21. 인간화된 5G9 변이체의 재조합 ErbB2-ECD 결합 활성
표 22. BT474 유방암 이종이식 모델에서 조합물의 항종양 활성
주: a. T/C % = T/C x 100%, 이 때 T 및 C는 35일에 각각 처리 및 대조군 그룹의 평균 종양 부피이다; b. 일원 ANOVA에 의해 비히클 대조군의 종양 부피와 비교한 후 Games-Howell 방법에 의한 다중 비교 절차; 비히클 대조군과 비교하여 *P<0.05 및 ** P<0.01.
표 23. NCI-N87 위 이종이식 모델에서 항종양 효능의 연구 설계
주: T-mAb는 트라스투주맙을 나타내고, P-mAb는 페르투주맙을 나타낸다.
표 24. NCI-N87 위 이종이식 모델의 결과 요약(1-단계)
주: 종양 성장 억제(TGI) 지수 = (1 - 처리된 종양의 평균 부피/대조군 종양의 평균 부피) X 100%
표 25. NCI-N87 위 이종이식 모델의 결과 요약(2-단계)
주: T-mAb: 트라스투주맙; 진행율= (57일-26일)/26일 x 100.
표 26. NCI-N87 위 이종이식 모델의 암 진행율(2-단계)
주: 회복율= (57일-26일)/26일 x 100; TV: 종양 부피
표 27. 본 발명의 ErbB2 항체의 내재화율
표 28. 본 발명의 항체 ErbB2 조합물의 내재화율
표 29. HuPrime® 위암 이종이식 모델의 연구 설계
주: N: 그룹 당 동물 수; 모든 시험 화합물의 투여 빈도는 14일까지 매주 BIW에서 QW로 조정되었고(0, 3, 7, 14일), 이들의 투여량은 21일 이후 반으로 감소되었다(21, 28일); T-mAb은 트라스투주맙을 나타내고; P-mAb은 페르투주맙을 나타낸다.
표 30. 트라스투주맙-내성 위 모델 - HuPrime® 위암 이종이식 모델에서 본 발명의 항체 조합물의 항종양 효능
주: a. 평균 ± SEM; b. T/C % = T/C x 100%, 이 때 T 및 C는 35일에 각각 처리 및 대조군 그룹의 평균 종양 부피이다; c. T-테스트에 의해 비히클 대조군의 종양 부피와 비교(*P<0.05 및 **P<0.01) T-mAb은 트라스투주맙을 나타내고; P-mAb은 페르투주맙을 나타낸다.
표 31. 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> Biosion, Inc. Chen, Mingjiu <120> ERBB2 ANTIBODIES AND USES THEREFORE <130> HBI-100WO <150> 62/443,078 <151> 2017-01-06 <160> 166 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is S <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is Y <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is T or Y <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is M or I <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is H <400> 11 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is Y <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is I <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is N <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is P <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is S <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is S <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is S or D <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is Y <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is T <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> X is A or N <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> X is Y <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> X is N <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> X is Q <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> X is K or N <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> X is F <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> X is K or R <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> X is D <400> 12 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is A <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is S <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is A or S <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is F <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is S <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is L <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is D <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is F <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is W <400> 13 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is K <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is A <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is S <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is H or Q <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is D <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is I <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is N <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is K <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is Y <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> X is I <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> X is A <400> 14 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is Y or S <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is T <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is S <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is T <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is L <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is Q or Y <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is P <400> 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is L <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is Q or N <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is Y <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is D <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is N <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is L <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X is L <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is W <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is T <400> 16 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Asn Leu Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 100 105 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asn Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Asn Leu Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Arg Ile Thr Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Gly Ile Arg 100 105 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ser Phe Arg Ile Thr Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Ile Arg 100 105 <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 100 105 <210> 27 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr 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musculus <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 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Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is Q or H <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> X is T or H <400> 54 Trp Tyr Gln Xaa Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile Xaa 1 5 10 15 <210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is I or V <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> X is K, T or R <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> X is Y or F <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> X is L or F <400> 55 Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Xaa Asp Xaa Thr 1 5 10 15 Xaa Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Lys 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Thr 1 5 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 82 Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 84 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 86 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 87 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 88 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 93 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 94 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 96 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 98 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 98 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 99 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 102 Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 104 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 106 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 107 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 108 Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 109 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 110 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111 Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 112 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 114 Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 116 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 118 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 122 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 123 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 123 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 124 Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 125 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 126 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 126 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 127 Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 128 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 129 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 129 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 130 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 130 Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 131 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 132 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 132 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 133 Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 134 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 135 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 135 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 136 Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 137 Ser Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 138 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 138 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 139 Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 140 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 141 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 141 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 142 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 143 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 143 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 144 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 145 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 146 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 146 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 147 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 148 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 149 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 150 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 150 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 151 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 152 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 152 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 153 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 154 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 155 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 156 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 156 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 157 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 158 Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 159 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 160 Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr 1 5 <210> 161 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 162 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 163 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 164 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 165 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 166 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30

Claims (49)

  1. 수용체 티로신-단백질 키나제 ErbB-2(ErbB2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고,
    a) 상기 CDR-H1은 SEQ ID NO: 80의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 CDR-H2는 SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열로 이루어지며,
    상기 CDR-H3은 SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 CDR-L1은 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열로 이루어지며,
    상기 CDR-L2는 SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 CDR-L3은 SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
    b) 상기 CDR-H1은 SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 CDR-H2는 SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열로 이루어지며,
    상기 CDR-H3은 SEQ ID NO: 76의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 CDR-L1은 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열로 이루어지며,
    상기 CDR-L2는 SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열로 이루어지고,
    상기 CDR-L3은 SEQ ID NO: 79의 아미노산 서열로 이루어지는,
    결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편이 SEQ ID NO: 23-51로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편이 SEQ ID NO: 23 및 24; SEQ ID NO: 25 및 26; SEQ ID NO: 27 및 32; SEQ ID NO: 27 및 33; SEQ ID NO: 27 및 34; SEQ ID NO: 27 및 35; SEQ ID NO: 27 및 36; SEQ ID NO: 27 및 37; SEQ ID NO: 27 및 38; SEQ ID NO: 28 및 32; SEQ ID NO: 28 및 33; SEQ ID NO: 28 및 34; SEQ ID NO: 28 및 35; SEQ ID NO: 28 및 36; SEQ ID NO: 28 및 37; SEQ ID NO: 28 및 38; SEQ ID NO: 29 및 32; SEQ ID NO: 29 및 33; SEQ ID NO: 29 및 34; SEQ ID NO: 29 및 35; SEQ ID NO: 29 및 36; SEQ ID NO: 29 및 37; SEQ ID NO: 29 및 38; SEQ ID NO: 30 및 32; SEQ ID NO: 30 및 33; SEQ ID NO: 30 및 34; SEQ ID NO: 30 및 35; SEQ ID NO: 30 및 36; SEQ ID NO: 30 및 37; SEQ ID NO: 30 및 38; SEQ ID NO: 31 및 32; SEQ ID NO: 31 및 33; SEQ ID NO: 31 및 34; SEQ ID NO: 31 및 35; SEQ ID NO: 31 및 36; SEQ ID NO: 31 및 37; SEQ ID NO: 31 및 38; SEQ ID NO: 39 및 45; SEQ ID NO: 39 및 46; SEQ ID NO: 39 및 47; SEQ ID NO: 39 및 48; SEQ ID NO: 39 및 49; SEQ ID NO: 39 및 50; SEQ ID NO: 39 및 51; SEQ ID NO: 40 및 45; SEQ ID NO: 40 및 46; SEQ ID NO: 40 및 47; SEQ ID NO: 40 및 48; SEQ ID NO: 40 및 49; SEQ ID NO: 40 및 50; SEQ ID NO: 40 및 51; SEQ ID NO: 41 및 45; SEQ ID NO: 41 및 46; SEQ ID NO: 41 및 47; SEQ ID NO: 41 및 48; SEQ ID NO: 41 및 49; SEQ ID NO: 41 및 50; SEQ ID NO: 41 및 51; SEQ ID NO: 42 및 45; SEQ ID NO: 42 및 46; SEQ ID NO: 42 및 47; SEQ ID NO: 42 및 48; SEQ ID NO: 42 및 49; SEQ ID NO: 42 및 50; SEQ ID NO: 42 및 51; SEQ ID NO: 43 및 45; SEQ ID NO: 43 및 46; SEQ ID NO: 43 및 47; SEQ ID NO: 43 및 48; SEQ ID NO: 43 및 49; SEQ ID NO: 43 및 50; SEQ ID NO: 43 및 51; SEQ ID NO: 44 및 45; SEQ ID NO: 44 및 46; SEQ ID NO: 44 및 47; SEQ ID NO: 44 및 48; SEQ ID NO: 44 및 49; SEQ ID NO: 44 및 50; 및 SEQ ID NO: 44 및 51의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 2개의 가변 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편이 마우스 단일 클론 항체, 마우스 항체로부터 유래된 항원 결합 단편, 키메라 항체, 키메라 항원 결합 단편, 인간화 항체 및 인간화 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결합 단백질이
    i) ErbB2-매개된 생물활성을 조절함,
    ii) ErbB2-양성 세포와 접촉시 상기 세포 내로 내재화됨,
    iii) ErbB2-양성 세포의 성장을 억제함, 및
    iv) 트라스투주맙과 상승적으로 ErbB2 양성 및 트라스투주맙 내성 종양의 성장을 억제함
    중 하나 이상의 특성을 갖는,
    결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 결합 단백질이 단독으로 또는 트라스투주맙과 병용하여 ErbB2-양성 및 트라스투주맙 내성 종양의 성장을 70% 이상 억제하는, 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, 링커 폴리펩티드 또는 면역글로불린 불변 도메인, 및 제제를 포함하는 결합 단백질 컨쥬게이트로서,
    상기 제제가 영상화제, 치료제, 세포독성제, 및 면역부착 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 결합 단백질 컨쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  10. i) 치료적 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, 또는
    상기 결합 단백질, 링커 폴리펩티드 또는 면역글로불린 불변 도메인, 및 제제를 포함하는 결합 단백질 컨쥬게이트로서, 상기 제제가 영상화제, 치료제, 세포독성제, 및 면역부착 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 결합 단백질 컨쥬게이트, 또는
    상기 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는
    상기 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및
    ii) 약학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는, 개체에서 질병 또는 장애 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 질병 또는 장애가 유방암, 위암, 결장암, 직장암, 폐암, 입인두암, 후두인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담관암, 소장암, 요로암, 여성 생식관 암, 남성 생식관 암, 내분비샘 암, 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종, 뇌종양, 신경암, 눈 종양, 수막암, 조혈성 악성종양으로부터의 고형 종양, 종양 전이, 안구 혈관신생, 부종, 류마티스 관절염, 죽상경화성 플라크, 크론병, 염증성 장 질환, 난치성 복수, 건선, 사르코이드증, 동맥 동맥경화증, 패혈증, 소화성 궤양, 화상(bums), 췌장염, 다낭 난소병(POD), 자궁내막증, 자궁 섬유증, 양성 전립선 비대, T-세포 급성 림프모구 백혈병(T-ALL), 피질하 경색 및 백색질뇌증을 갖는 뇌 상염색체 우성 동맥병(CADA-SIL), 다발성 경화증(MS), 팔로네징후(TOF), 알라질 증후군(AS), 황반 변성 및 연령-관련 황반 변성 질환, 및 이상 ErbB2 활성을 특징으로 하는 다른 혈관신생 독립적 및 의존성 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는,
    약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    ErbB2 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가 제제를 더 포함하는, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 제제가 치료제; 영상화제; 항신생물제; 화학치료제; 혈관신생 억제제; 항-VEGF 항체; 항-EGFR 항체; 항-cMet 항체; 항-ErbB3 항체; 항-ErbB2 항체; 항-CD20 항체; 아플리버셉트(aflibercept); 키나제 억제제; 공동-자극 분자 차단제; 항-B7.2 항체; CTLA4-Ig; 부착 분자 차단제; 항-E 셀렉틴 항체; 항-L 셀렉틴 항체; 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편; 항-IL-18 항체; 항-TNF 항체; 항-IL-6 항체; 메토트렉세이트; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; DNA 알킬화제; 시스플라틴; 카르보플라틴; 항-튜불린제; 파클리탁셀; 도세탁셀; 독소루비신; 젬시타빈; 젬자(gemzar); 안트라사이클린; 아드리아마이신; 토포아이소머라제 I 억제제; 토포아이소머라제 II 억제제; 5-플루오로우라실(5-FU); 류코보린; 이리노테칸; 수용체 티로신 키나제 억제제, 아폽토시스 억제제; Bcl2/Bclx 억제제; 에를로티닙, 게피티닙, COX-2 억제제, 셀레콕시브, 사이클로스포린; 라파마이신; 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제; 마약; 진통제; 마취제; 진정제; 국소 마취제; 신경근 차단제; 항균제; 항건선제; 코르티코스테로이드; 단백동화 스테로이드; 에리트로포이에틴; 면역화; 면역글로불린; 면역억제제; 성장 호르몬; 호르몬 대체 약물; 방사성 의약품; 항우울제; 항정신병 약물; 자극제; 천식 약물; 베타 효능제; 흡입 스테로이드; 에피네프린; 이의 에피네프린 유사체; 사이토카인; 및 사이토카인 길항제로 구성된 군으로부터 선택되는,
    약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 제제가 ErbB2에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 제제가 트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이들의 조합물을 포함하는, 약학적 조성물.
  15. 제10항에 있어서,
    개체에서의 질병 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이고, 상기 질병 또는 장애에서 ErbB2 활성이 유해한 것인, 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 질병 또는 장애가 유방암, 위암 및 폐암으로 구성된 그룹에서 선택되는, 약학적 조성물.
  17. 제10항에 있어서,
    ErbB2-양성 종양의 성장을 억제하는데 사용되는, 약학적 조성물.
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