KR102631747B1 - 베타 코어 단편 hCG 분포비를 측정하여 정상 및 비정상임신을 판별하는 신규 면역 진단 장치 - Google Patents
베타 코어 단편 hCG 분포비를 측정하여 정상 및 비정상임신을 판별하는 신규 면역 진단 장치 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 임신 또는 비정상 임신 여부를 판별하는 면역 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로 Intact hCG 및 βcf hCG를 공통적으로 인식할 수 있는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 포함하는 면역 장치이며, 2개의 검출라인 및 대조라인을 포함하여 검체 중 포함된 Intact hCG 및 βcf hCG를 각각 분리 검출할 수 있고, Intact hCG 및 βcf hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율(βcf hCG의 분포비)을 수치화하여 임신 주수, 정상 임신, 자궁외 임신 및 고사난자를 포함하는 비정상 임신을 정확하고 신속하게 판별할 수 있다.
Description
본 발명은 임신시 정상 및 비정상 임신을 판별할 수 있는 면역 장치 및 이를 이용한 해석 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 임신부 뇨 중 분비되는 다양한 hCG 중에서 βcf hCG (Beta core framgment hCG)의 분포비를 측정하여 정상 및 비정상 임신을 판별하는 면역 장치 및 이를 이용한 해석 방법에 관한 것이다. 상기 면역 장치의 핵심원리는 임신부 뇨에 다양하게 존재하는 hCG 단백질 중 Intact hCG와 βcf hCG만을 공통적으로 인식하여 결합할 수 있는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 표지자에 결합된 이동상으로 하고, 고정상에서 Intact hCG 및 βcf hCG를 각각 특이적으로 분리하는 것이다.
인간융모막성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG)은 임신 중에 생성되는 당단백질 호르몬이다. hCG는 태반의 융모세포 영양막에서 생성되어 임신 초기에 프로게스테론을 계속 생산하도록 하여 태반기능이 완성되는 임신 10주까지 착상을 유지시켜 주는 기능을 한다.
체내 활성 형태인 완전형 hCG(Intact hCG; I-hCG)는 약 37 kDa의 분자량을 가지며, 244개의 아미노산으로 구성된다. Intact hCG는 크게 알파(α)와 베타(β) 2개의 서브 유닛(subunit)으로 이루어져 있으며, 알파-서브 유닛은 92개의 아미노산을 포함하고, 베타-서브 유닛은 145개의 아미노산을 포함한다. Intact hCG는 일반적으로 임신 기간 중 혈액 내 존재하며, 생물학적 활성을 띄는 주된 구조이다. 상기 활성형 외에도 hCG의 다양한 해리 및 분해 생성물은 혈액 및 소변에서 발견되며, 이들은 절편화 hCG(nicked hCG; N-hCG), 유리 베타 hCG(free β-hCG), 유리 알파 hCG(free α-hCG), 베타 코어 단편 hCG(β-core fragment hCG) 등으로 존재한다.
베타 코어 단편 hCG(βcf hCG)는 임신부 뇨에 주로 존재하는 hCG 단백질로 약 14 kDa의 분자량을 가진다. LMP(Last menstrual period; 마지막 생리일) 4주에는 Intact hCG가 우세하게 분비되며, LMP 5주부터 βcf hCG가 점차 증가하기 시작하여 5주 6일 또는 6주 이후 Intact hCG보다 우세한 농도로 분비된다(John Walter Larsen et al., 2015).
임신부 hCG 단백질 분포는 혈액에서 Intact hCG가 98%로 우세하게 존재하지만, 뇨에서는 임신주수가 경과함에 따라 βcf hCG가 최고 80%까지 증가하여 Intact hCG 대비 우세한 농도로 존재한다. Intact hCG를 마커로 이용한 종래의 임신 진단 키트는 뇨에 존재하는 Intact hCG를 정성 진단하여 임신 여부를 판단한다. 그러나, 임신으로 판정된 11,760명에 대해 기존 임신 진단 키트로 시험한 결과, 약 0.2%인 22명이 위음성(False negative)으로 확인되었고, 이들에 대한 Intact hCG 혈액 농도는 최대 268,022.5 IU/mL로 측정되어, 종래의 뇨 임신 진단 키트가 후크 현상(Hook Effect)으로 인한 위음성 문제가 발생하고 있음을 나타낸다. 이러한 근본적인 원인은 뇨에 과량으로 존재하는 βcf hCG에 의해 기인된다고 밝혀졌다(Richard T. Griffey et. al., 2013).
뇨 임신 진단에서 위음성은 응급실(emergency department, ED) 상황에서 심각한 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 여성 환자가 임신하였음에도 불구하고 소변을 이용하여 일반 임신 진단 키트로 측정 시 위음성 결과가 나오면, 여성 환자의 치료에 있어 태아를 고려하지 않고 치료를 행하게 되는 의료 사고가 발생할 수 있다.
한편, 자궁외 임신은 임신 첫 삼분기(first trimester) 동안 임신 여성의 모든 사망 중 9%를 차지하고, 임신 여성의 사망률을 증가시키며, 자궁외 임신의 유병률은 전세계적으로 점차 증가하고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 근원적인 후크 현상(hook effect)을 해결하고, 정상 임신과 비정상 임신을 판별할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구한 결과, Intact hCG 및 βcf hCG를 공통적으로 인식할 수 있는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 개발하였고, 뇨 시료 중 Intact hCG 및 βcf hCG를 각각 특이적으로 분리 검출하여 후크 현상을 해결하였으며, Intact hCG 및 βcf hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율(βcf hCG의 분포비)을 수치화하여 임신 주수, 정상 임신, 자궁외 임신 및 고사난자를 포함하는 비정상 임신을 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 임신부 뇨 중 포함되어 있는 βcf hCG 및 Intact hCG를 특이적으로 분리검출 하고 βcf hCG 분포비를 정확히 측정함으로써 정상임신유지 및 임신초기에 비정상임신을 판별할 수 있는 면역장치 및 해석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 면역장치는 i) 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 영역; ii) 상기 검체 영역과 연동되어 있고, 탐침물질에 접합된 다중결합 항 hCG 단클론항체를 포함하는 콘쥬게이트 영역; iii) 상기 콘쥬게이트 영역에 연결되어, βcf hCG에만 특이적으로 결합할 수 있는 항 βcf hCG 항체가 고정된 제1 검출라인, Intact hCG에만 특이적으로 결합할 수 있는 항 Intact hCG 항체가 고정된 제2 검출라인 및 대조라인을 포함하는 신호검출 영역; 및 iv) 신호검출 반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 영역의 다운 스트림에 위치하는 흡습 영역을 포함하는 임신 또는 비정상 임신 판별용 면역 장치이다.
본 발명의 해석방법은 하기 단계를 포함하는 임신 또는 비정상 임신 판별에 필요한 정보를 해석하는 방법이다: i) βcf hCG 및 Intact hCG를 공통으로 인식하는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 이용하여, 분석하고자 하는 피검 시료에서 βcf hCG 및 Intact hCG 분포비를 반영하여 결합하는 단계; ii) βcf hCG 및 Intact hCG발색의 세기를 측정하는 단계; 및 iii) βcf hCG 발색의 세기 분포비에 의해 임신 또는 비정상 임신을 판별하는 단계.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 제한되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다 (comprises)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 명세서 전체에 걸쳐 동일한 도면 부호는 동일한 구성 요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 구성요소들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 비록 "제1", "제2" 등이 다양한 구성요소들을 서술하기 위해서 사용되나, 이들 구성요소들은 이들 용어에 의해 제한되지 않음은 물론이다. 이들 용어들은 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소와 구별하기 위하여 사용하는 것이다. 따라서, 이하에서 언급되는 제1 구성요소는 본 발명의 기술적 사상 내에서 제2 구성요소일 수도 있음은 물론이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
본 발명은 Intact hCG 및 βcf hCG를 공통적으로 인식하는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 이용하여 임신부 뇨 중 포함되어 있는 βcf hCG 및 Intact hCG를 특이적으로 분리검출 하고 βcf hCG 분포비를 정확히 측정함으로써 정상임신유지 및 임신초기에 비정상임신을 판별할 수 있는 면역장치 및 해석방법을 제공한다.
본 발명에 이용된 Intact hCG 및 βcf hCG를 공통적으로 인식하는 다중결합 항 hCG 단클론항체는 임신 주수에 따른 Intact hCG 및 βcf hCG의 분포비를 정확히 반영하는 특징으로 이의 분포비 해석에 따라 정상 임신 및 비정상 임신을 보다 정확하고 효율적으로 판별하는데 유용하게 사용된다.
본 발명은 정상과 비정상 임신의 정확한 판별에 목적을 두고 있다. 이는 단순히 Intact hCG, βcf hCG 각 항체를 사용하여 Intact hCG, βcf hCG 농도를 측정하는 것으로 달성하기 어렵고, 시료 내 존재하는 Intact hCG와 βcf hCG과 반응하는 비율을 측정하여 달성할 수 있다. Intact hCG, βcf hCG 각 항체를 사용하는 경우, 항체가 인식할 수 있는 Intact hCG, βcf hCG 농도에 한계가 있어 오히려 Intact hCG, βcf hCG 농도 및 이의 비율을 정확히 파악하기 어렵다. 한편, 본 발명의 Intact hCG 및 βcf hCG를 공통으로 인식하는 단클론항체를 사용하는 경우 인식할 수 있는 Intact hCG, βcf hCG 값에 한계가 존재하더라도 시료 내 존재하는 Intact hCG, βcf hCG와 반응하는 비율을 측정하기 때문에 더 정확히 Intact hCG, βcf hCG 농도 및 농도비를 예측할 수 있다.
본 발명은 Intact hCG, βcf hCG에 각각 대응하는 단클론항체를 사용하지 않고, Intact hCG 및 βcf hCG를 공통으로 인식하는 단클론항체를 사용하였다. 이는 시료 내 전체 Intact hCG, βcf hCG 함량을 비율적으로 확인할 수 있기 때문이다.
본 발명의 다중결합 항 hCG 단클론항체를 사용하면, 정확한 분포비를 도출하여 정상 임신 또는 비정상 임신을 정확하게 판정할 수 있다.
본 발명의 비정상 임신은 자궁외 임신 또는 고사난자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 자궁외 임신은 수정란이 정상적으로 착상하는 장소인 자궁 내부가 아니라, 다른 장소에 착상되는 임신을 의미한다. 자궁외 임신의 착상 위치는 자궁 내의 비정상적인 위치일 수도 있고, 자궁이 아닌 다른 곳일 수도 있다. 대부분 난관에 생기는 난관 임신이며, 드물게는 난소, 복막, 자궁경관 임신도 있다. 가장 흔한 응급 질환 중 하나이며, 전체 임신의 1 내지 2% 정도에 이른다.
상기 고사난자는 초음파 상 태반 조직은 발달하지만, 태아가 보이지 않는 경우를 의미한다. 고사난자의 경우 태반은 배아없이 얼마동안 자랄 수 있으나, 결국 자연유산으로 하복부 통층과 출혈 후 자궁내에 수태된 물질이 배출되는 형태로 끝나게 된다.
또한, 본 발명은 i) 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 영역; ii) 상기 검체 영역과 연동되어 있고, 탐침물질에 접합된 항 Intact hCG/βcf hCG 다중결합 항 hCG 단클론항체를 포함하는 콘쥬게이트 영역; iii) 상기 검체 영역에 연결되어, βcf hCG에만 특이적으로 결합하는 항 βcf hCG 항체가 고정된 제1 검출라인, Intact hCG에만 특이적으로 결합하는 항 Intact hCG 항체가 고정된 제2 검출라인 및 대조라인을 포함하는, 상기 콘쥬게이트 영역과 연동된 신호검출 영역; 및 iv) 신호검출 반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 영역의 다운 스트림에 위치하는 흡습 영역을 포함하는 임신 또는 비정상 임신 판별용 면역 장치를 제공한다.
상기 i) 검체 영역은 임신부 소변과 같은 액상 시료를 수용하는 것이 바람직하나, Intact hCG 및/또는 βcf hCG를 포함하는 것으로 예상되는 시료라면 모두 사용이 가능하다.
상기 검체 영역은 분석 물질에 대한 선택성을 보다 향상시키기 위해 또는 상기 시료에 포함될 수 있는 간섭 물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 필터링의 기능을 추가로 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 검체 영역의 업스트림에 분석 물질과 콘쥬게이트 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭 물질에 의한 영향을 배제할 수 있는 물질을 포함하는 보조 영역을 추가로 구비할 수 있다.
상기 ii)의 콘쥬게이트 영역의 탐침물질은 금 나노입자, 은 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자, 자기 나노입자, 실리카 나노입자, 폴리머 비드(polymer bead), 형광물질(fluorescent substances), 발광물질(luminescent substances), 색소 비드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 탐침물질은 콜로이드성 골드 나노입자를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 iii)의 신호검출 영역은 이동상과 시료가 전개되는 매질로서, 이동상과 피검 시료는 신호검출 영역의 다공성 멤브레인의 모세관 현상에 의해 이동할 수 있다. 상기 신호검출 영역은 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 폴리스틸렌, 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 나일론, PVDF, 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 신호검출 영역은 5 내지 15 μm의 기공을 가지는 니트로셀룰로오스 멤브레인을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 신호검출 영역은 항 βcf hCG 항체가 고정된 제1 검출라인, 상기 제1 검출라인의 다운스트림에 항 Intact hCG 항체가 고정된 제2 검출라인 및 상기 제2 검출라인의 다운스트림에 대조라인을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 신호검출 영역은 항 Intact hCG 항체가 고정된 제2 검출라인, 상기 제2 검출라인의 다운스트림에 항 βcf hCG 항체가 고정된 제1 검출라인 및 상기 제1 검출라인의 다운스트림에 대조라인을 포함할 수 있다.
상기 항 Intact hCG 항체는 α와 β의 2개의 서브유닛(subunit)이 결합된 활성형 Intact hCG를 특이적으로 인식하는 항체이며, 상기 항 βcf hCG 항체는 베타 코어 단편 hCG(βcf hCG)를 특이적으로 인식하는 항체이다.
본 발명은 2개의 검출라인으로 이루어진 면역 장치이며, 검체 내 βcf hCG및 Intact hCG를 감지하는 검출라인의 발색세기를 정량 또는 정성 분석하고, 본 발명에서 도출된 하기 식을 통해 βcf hCG의 분포비를 수치화하여 비교함으로써 임신 주수, 정상 임신, 및 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신을 정확히 판별할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, LMP 5주 내지 6주에 상기 식에 따른 βcf hCG 및 Intact hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율이 50 내지 60% 이상 증가하는 경우 정상 임신으로, 5 내지 15% 이하인 경우 자궁외 임신으로, 20 내지 30% 이하로 6주 6일까지 유지되는 경우 고사난자로 판별할 수 있다.
상기 대조라인(Control line)은 피검 시료 중 Intact hCG 또는 βcf hCG의 농도와 관계없이 일정한 신호를 내는 부분을 의미한다.
상기 iv)의 흡습 영역은 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함할 수 있으며, 상기 다공성 지지체의 상부면에 다공성 필름층을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 콘쥬게이트 영역 내 존재하는 다중결합 항 hCG 단클론항체 콘쥬게이트는 임신한 여성의 뇨와 같은 검체와 반응할 시 검체 내 존재하는 Intact hCG와 βcf hCG 농도비에 따라 반응하며, 반응한 콘쥬게이트는 멤브레인 쪽으로 이동한다. 항 βcf hCG 단클론항체가 고정되어 있는 멤브레인 상 제1 검출라인에서는 콘쥬게이트에 반응한 hCG 중 βcf hCG에만 특이적으로 샌드위치 형태의 복합체를 형성하며, 항 Intact hCG 단클론항체가 고정되어 있는 제2 검출라인에서는 콘쥬게이트에 반응한 hCG 중 Intact hCG에만 특이적으로 샌드위치 복합체를 형성한다.
본 발명의 면역 장치는 하부에 고체 지지대를 포함할 수 있다. 상기 고체 지지대는 니트로셀룰로오스, 나일론, 피브이디에프(PVDF), 유리 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 재료로 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 고체 지지대 상에 패드, 멤브레인 등을 부착하여 제조하므로, 스트립의 내구성을 높일 수 있고, 취급 및 보관을 용이하게 할 수 있다. 또한, 추가적인 외부 디바이스 장착을 용이하게 할 수 있다.
상기 고체 지지대로 사용될 수 있는 플라스틱 재질로는 폴리프로필렌(polypropylene) 필름, 폴리에스테르(polyester) 필름, 폴리카보네이트(polycarbonate) 필름, 아크릴(acrylic) 필름 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역 장치는 분석 장치를 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 분석 장치는 제1 검출라인 및 제2 검출라인의 발색세기를 평가할 수 있다. 분석 장치는 제1 검출라인 및 제2 검출라인에 형성된 분석물 복합체의 강도, 색상, 발광 및/또는 형광을 평가할 수 있는 소프트웨어 프로그램과 결합된 판독기를 포함할 수 있다. 판독기는 사전 프로그래밍된 임계 값과 강도, 색상, 발광 및/또는 형광을 비교할 수 있으며, 비교를 기반으로 디지털 출력을 제공할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 장치는 CCD 카메라 또는 레이저 광원기반으로 분석 소프트웨어가 장착된 반사 리더기(reflectance reader)를 사용하였으며, 높은 정확도로 정상 임신 및 자궁 외 임신을 포함한 비정상 임신을 판별할 수 있었다. 상기 분석 장치는 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신과 관련한 정보를 제공하는 디스플레이를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 면역 장치는 태낭 및 태아를 관찰할 수 있는 임신 주수를 확인할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, LMP 5주 내지 6주에 βcf hCG 및 Intact hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율이 50 내지 60% 이상 증가하는 경우 정상 임신으로 태낭 및 태아를 관찰할 수 있는 반면에, 5 내지 15% 이하인 경우 자궁외 임신으로 태낭을 관찰할 수 없다.
본 발명의 다른 구체적인 일 구현예에서, βcf hCG 및 Intact hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율 즉, βcf hCG / (βcf hCG + Intact hCG)의 측정 값을 비교한 결과, 정상 임신에 비하여 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신의 경우 유의하게 낮음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 면역 장치가 추가적으로 디바이스 내에 고정되는 것을 특징으로 하는 키트를 제공한다.
상기 키트는 하부 디바이스에는 가이드 및 스트립 지지부가 구비되어 있고, 상부 디바이스에는 검체 투입구; 및 제1 검출라인, 제2 검출라인 및 대조라인에 상응하는 위치에 결과 확인창이 구비된 키트이다.
상기 상부 및 하부 디바이스는 통상의 플라스틱 소재를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌(acrylonitrile butadiene styrene; ABS) 등의 소재가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 임신 또는 비정상 임신 판별에 필요한 정보를 해석하는 방법을 제공한다: i) 분석하고자 하는 피검 시료에서 βcf hCG 및 Intact hCG의 양 또는 농도를 측정하는 단계; 및 ii) βcf hCG 및 Intact hCG의 양 또는 농도에 대한 βcf hCG의 양 또는 농도의 비율에 의해 임신 또는 비정상 임신을 판정하는 단계로, 상기 양 또는 농도는 βcf hCG 및 Intact hCG를 공통적으로 인식하는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 이용하여 측정되는 것인, 단계.
상기 양 또는 농도는 이에 비례한 발색세기로 측정할 수 있다.
상기 βcf hCG 및 Intact hCG의 양 또는 농도에 대한 βcf hCG의 양 또는 농도의 비율이 LMP 5주 6일에 50% 초과인 경우 정상 임신으로 판정하고, 5주 6일에 30% 이하인 경우 자궁외 임신, 고사난자와 같은 비정상 임신으로 판정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, i) 시료를 상기 면역 장치에 적용하여 시료 내 Intact hCG 및 βcf hCG가 탐침물질로 접합된 다중결합 항 hCG 단클론항체와 반응하는 단계; ii) 제1 검출라인 및 제2 검출라인에 의해 시료 내 βcf hCG 및 Intact hCG의 반응을 확인하는 단계로서, βcf hCG, Intact hCG는 각각의 검출라인에서 샌드위치 복합체의 존재에 의해 발생하는 발색세기에 의해 감지되는 단계; 및 iii) 제1 검출라인 및 제2 검출라인에 대한 제1 검출라인의 발색세기의 비율(βcf hCG 및 Intact hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색 세기의 비율)이 LMP 5 내지 6주 즉, LMP 5주 6일에 50 내지 60% 이상 증가하는 경우 정상 임신으로, 30% 이하인 경우 자궁 외 임신, 고사난자로 판정하는 단계를 포함하는 임신 또는 비정상 임신 판별에 필요한 정보를 해석하는 방법을 제공한다.
상기 발색세기는 βcf hCG 및 Intact hCG의 농도에 따른 발색 세기로, 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 농도와 발색세기는 비례하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 면역크로마토그래피 스트립을 이용하여 임신 또는 비정상 임신을 판별하는 방법을 제공한다.
상기 임신 또는 비정상 임신을 판별하는 방법은 i) 시료를 상기 면역 장치에 적용하여 시료 내 존재하는 Intact hCG 및 βcf hCG가 탐침물질로 접합된 다중결합 항 hCG 단클론항체와 반응하는 단계; ii) 제1 검출라인 및 제2 검출라인에 의해 시료 내 βcf hCG 및 Intact hCG의 반응을 확인하는 단계로서, βcf hCG, Intact hCG는 각각의 검출 라인에서 샌드위치 복합체의 존재에 의해 발생하는 발색세기에 의해 감지되는 단계; 및 iii) 제1 검출라인및 제2 검출라인에 대한 제1 검출라인의 발색세기의 비율(βcf hCG 및 Intact hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율)이 LMP 5주 6일에 50% 초과인 경우 정상 임신으로 판정하고, 5주 6일에 30% 이하인 경우 비정상 임신으로 판정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 베타 코어 단편 hCG(βcf hCG) 분포비를 측정하여 정상 및 비정상 임신을 판별하는 신규한 면역 진단 장치를 제공하고, 이에 따라 확인되는 βcf hCG 분포비의 증가는 태아가 정상적으로 착상하여 자라는 것을 의미하며, 이는 초기 임신부의 불안함을 해소하는 효과를 가져올 것이다. 또한 βcf hCG 분포비가 현저히 떨어질 경우 병원과 연계된 신속한 조치 및 치료를 기대할 수 있으며, 임신부에게 정상적인 임신 유지 정보를 제공함에 있어 도움을 줄 것이다.
도 1은 본 발명의 시료 내 Intact hCG와 βcf hCG의 농도비에 기인하는 반응 원리와 면역크로마토그래피 스트립의 구현예를 나타내는 개요도이다.
도 2는 Intact hCG 및 βcf hCG의 양 또는 농도 별 발색세기(Intensity)의 상관 관계를 나타낸 도이다.
도 3은 정상 임신 시 Intact hCG 및 βcf hCG의 분포도 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 자궁외 임신 시 Intact hCG 및 βcf hCG의 분포도 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 임신 주수 별 정상 임신군과 자궁외 임신군에서 βcf hCG/(Intact hCG + βcf hCG)의 발색세기 비를 측정하여 비교한 도이다.
도 6은 정상임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 정상임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 자궁외 임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 자궁외 임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따라 제작된 키트에서 Intact hCG 단독, βcf hCG 단독, Intact hCG 및 βcf hCG 혼합 양성검체를 농도별로 제조하여 반응시켰을 때, 각각의 농도비에 따른 발색세기 상관관계 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 Intact hCG 및 βcf hCG의 양 또는 농도 별 발색세기(Intensity)의 상관 관계를 나타낸 도이다.
도 3은 정상 임신 시 Intact hCG 및 βcf hCG의 분포도 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 자궁외 임신 시 Intact hCG 및 βcf hCG의 분포도 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 임신 주수 별 정상 임신군과 자궁외 임신군에서 βcf hCG/(Intact hCG + βcf hCG)의 발색세기 비를 측정하여 비교한 도이다.
도 6은 정상임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 정상임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 자궁외 임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 자궁외 임신 검체에 대하여 본 발명의 진단 장치를 이용하여 임상 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따라 제작된 키트에서 Intact hCG 단독, βcf hCG 단독, Intact hCG 및 βcf hCG 혼합 양성검체를 농도별로 제조하여 반응시켰을 때, 각각의 농도비에 따른 발색세기 상관관계 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기의 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1. 면역크로마토그래피 스트립의 제조
1-1. 제1 검출라인, 제2 검출라인 및 대조라인이 형성된 멤브레인 제작
각기 다른 3개의 항체를 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 분주하였다. 제1 검출라인은 βcf hCG 항체로서 항-βcf hCG 단클론항체(Anti-βcf hCG monoclonal antibody)를, 제2 검출라인은 Intact hCG 항체로서 항-Intact hCG 단클론항체(Anti-Intact hCG monoclonal antibody)를, 대조라인은 산양 항-쥐 면역글로불린(Goat anti-mouse IgG)을 분주 후 건조시켰다.
1-2. 콘쥬게이트 패드(conjugate pad) 제작
콜로이드성 골드나노입자(colloidal gold nanoparticle)와 Intact hCG 및 βcf hCG를 공통적으로 인식하는 다중결합 항 hCG 단클론항체가 접합된 제1 콘쥬게이트 용액을 준비하였다. 또한, 콜로이드성 골드나노입자와 쥐 면역글로불린(Mouse IgG)이 결합된 제2 콘쥬게이트 용액을 준비하였다. 상기 제1 콘쥬게이트 용액 및 제2 콘쥬게이트 용액을 전처리된 콘쥬게이트 패드에 분주하고, 완전히 건조시킨 후, 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.
1-3. 검체 패드(sample pad) 제작
완충제 및 보존제가 포함되어 있는 검체 패드 전처리 용액에 검체 패드를 충분히 적셔, 완전히 건조시킨 후, 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.
1-4. 흡습 패드(absorbance pad) 제작
건조되어 있는 상태의 흡습 패드를 적절한 크기로 절단하여 준비하였다.
1-5. 면역크로마토그래피 스트립의 제작
위의 각 과정을 통해 준비된 멤브레인, 콘쥬게이트 패드, 검체 패드 및 흡습 패드를 도 1에 나타난 구조대로 조립한다.
즉, 검체 패드를 콘쥬게이트 패드의 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출 패드의 일 말단을 상기 콘쥬게이트 패드의 다른 일 말단과 중첩되도록 부착하고, 검출 패드의 다른 일 말단과 흡습 패드의 일 말단을 서로 중첩되도록 부착하였다.
도 1에 있어서, 면역크로마토그래피 스트립은 하기 구조를 포함한다.
1: 검체 패드부(Sample pad)
2: 콘쥬게이트 패드부(Conjugate pad)
3: 니트로셀룰로오스 멤브레인(Membrane)
4: 흡습 패드(Absorption pad)
5: 항 βcf hCG 단클론항체가 고정된 제1 검출라인(Test line 1)
6: 항 Intact hCG 단클론항체가 고정된 제2 검출라인(Test line 2)
7: 산양 항-쥐 면역글로불린이 고정된 대조라인(Control line)
1-6. 분석장치
CCD 카메라 또는 레이저 광원 기반으로 분석 소프트웨어가 장착된 반사 리더기(reflectance reader)를 사용하여 검출라인의 발색 또는 명암 감도를 정량하고, 신호 세기로서 수치화할 수 있도록 사용하였다.
1-7. 디바이스 조립
제조된 정상 임신, 임신 주수 및 자궁외 임신 및 고사난자를 포함한 비정상 임신 판별용 면역크로마토그래피 스트립을 플라스틱 하부 디바이스의 스트립 고정위치에 넣은 후 검체투입구와 결과 확인창이 있는 상부 디바이스에 끼운 다음 조립한다.
실시예 2. 정상 임신군 및 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신군의 Intact hCG, βcf hCG의 농도에 따른 발색세기 변화량 측정
종래에는 농도 비율에 기초하여 진단하였으나, 본 발명의 임신 진단 장치는 발색세기로 확인하여 판별하였다. 발색세기는 모든 발색세기를 측정하는 기기에서 동일하게 측정하고 이를 수치화하였다.
본 발명의 임신 진단 장치의 구성인 분석장치를 이용하여 측정하는데, 농도와 발색세기가 비례함을 확인하였다(도 2).
2-1. 정상 임신군의 Intact hCG, βcf hCG의 농도에 따른 발색세기 변화량 측정
정상 임신군에서 Intact hCG와 βcf hCG의 농도에 따른 발색세기 변화량을 측정하였다. 정상 임신군에서 Intact hCG는 LMP 3주 후 4일부터 검출되기 시작하여 5주까지 증가한다. 이를 통해, 조기 임신 여부의 검사가 가능하다. βcf hCG는 LMP 4주 후반부터 검출되기 시작하여 5주부터 급격하게 증가하여 6주 이후부터는 고농도로 유지된다(도 3).
또한, LMP 5주에 βcf hCG가 검출되면, 초음파 검사 결과 태낭(아기집) 확인이 가능하였다. LMP 6주부터는 Intact hCG는 감소하고, βcf hCG는 유지되면서 역전 현상이 발생하고, 초음파 검사 결과 태아 확인이 가능하였다.
2-2. 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신군의
Intact hCG, βcf hCG의 농도에 따른 발색세기 변화량 측정
자궁외 임신군의 Intact hCG, βcf hCG 농도 변화량을 측정한 결과, 자궁외 임신 군의 경우, Intact hCG는 LMP 5주에 검출되는 양상을 보이나, βcf hCG는 LMP 5주에 검출되지 않거나, 매우 낮은 농도로 검출됨을 확인하였다(도 4).
그 결과, LMP 4 내지 7주 사이에서 정상 임신의 경우, Intact hCG의 농도는 증가하다 감소하고 βcf hCG의 농도는 점점 증가하여 유지되는 반면, 자궁외 임신의 경우, βcf hCG는 검출되지 않거나 매우 낮은 농도로 검출됨을 통해 이는 정상 임신과 자궁외 임신을 구분짓는 유의한 결과로 확인하였다.
한편, 고사난자의 경우, βcf hCG는 LMP 5주 6일부터는 30% 이하로, 증가하지 않고 낮게 유지되며, 초음파 관찰 결과 태낭은 확인이 되지만, 태아 및 심장소리가 확인되지 않았다.
실시예 3. 정상 임신군 및 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신군의 βcf hCG / (Intact hCG + βcf hCG) 발색세기 비(intensity ratio) 측정
상기 실시예 2의 결과를 임신 주수, 정상 임신군, 및 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신군의 판별에 사용하기 위하여, 정상 임신군 및 비정상 임신군의 βcf hCG / (Intact hCG + βcf hCG)의 임신 주수 별 농도에 따른 발색세기 비(intensity ratio)를 측정하여 비교하였다.
3-1. 측정 원리 검증 및 βcf hCG 분포비(%)의 계산식 도출
본 발명의 임신 진단 장치는 시료와 반응하여 고정상으로 이동하는 “이동상”과 시료 내 존재하는 Intact hCG 및 βcf hCG를 각각 분리하여 검출할 수 있는 “고정상”으로 이루어진다. 본 발명에서, 상기 이동상은 임신 진단 장치의 구성 중 콘쥬게이트 영역에 해당하며, 상기 고정상은 제1 검출라인, 제2 검출라인 및 대조라인을 포함하는 신호검출 영역에 해당한다.
이동상은 검체의 농도 세기를 표현할 수 있는 표지자(indicator) 즉, 금 입자(gold particle), 나노 비드(nano bead), 형광 또는 인광에, Intact hCG 및 βcf hCG를 공통적으로 인식할 수 있는 다중결합 항 hCG 단클론항체가 결합되어 건조된 상태이다.
즉, 표지자에 결합된 항체의 특성은 Intact hCG 및 βcf hCG를 공통적으로 인식하여 반응함을 특징으로 한다.
고정상의 제1 검출라인에는 항 βcf hCG 단클론항체가 고정되어 있어 검체 시료 중에서 βcf hCG만이 검출되며, 제2 검출라인에는 항 Intact hCG 단클론항체가 고정되어 있어 검체 시료 중에서 Intact hCG만이 검출된다.
이에, 검체 시료 중에서 포함된 Intact hCG 및 βcf hCG의 농도비에 따라 콘쥬게이트(conjugate)와 1차적으로 반응하여 고정상으로 이동하고, 고정상에 고정된 상기 항체의 특성에 따라 각각의 시료가 분리되어 검출된다.
한편, βcf hCG 분포비(%)의 계산식은 βcf hCG / (Intact hCG + βcf hCG)의 발색세기 비를 통해 도출되었으며, 이를 통해 더욱 명확하게 측정 및 분석할 수 있게 되었다.
3-2. 임신 주수 별 정상 임신군과 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신군에서 βcf hCG / (Intact hCG + βcf hCG)의 발색세기 비 측정
임신 주수 별 정상 임신군과 자궁외 임신군에서 측정된 Intact hCG, βcf hCG의 검출된 농도비에 따른 발색세기(intensity)를 바탕으로 βcf hCG / (Intact hCG + βcf hCG) 의 발색세기 비를 통한 βcf hCG의 분포비(%)를 하기 식을 통해 확인하였다.
그 결과, 하기 표 1 및 도 5 내지 9에 나타낸 바와 같이, 수정란이 자궁 내에 정상적으로 착상되어 아기가 자라는 정상 임신(Normal pregnancy)의 경우, βcf hCG의 분포비는 LMP 5주 0일에 약 10 내지 20%이고, LMP 5주 6일에 50%까지 증가하며, LMP 6주에 70%, LMP 8주 이후에는 80%의 비율로 계속 유지됨을 확인하였다. 반면에, 비정상적으로 착상되는 자궁외 임신(Ectopic pregnancy)의 경우, LMP 5주 내지 6주에 βcf hCG의 분포비는 10% 이하로 유지되고, 증가하는 현상은 관찰할 수 없으며, 초음파 상으로 태낭(아기집)도 관찰되지 않음을 확인하였다.
** 각 주수에 따른 %는 중간값(Median)을 바탕으로 표시함.
또한, 고사난자의 경우, LMP 5주 6일부터 증가하지 않으며, βcf hCG의 분포비는 30% 이하로 유지됨을 확인하였다. 초음파 관찰 결과, 태낭은 확인이 되지만, 태아 및 심장 소리는 확인되지 않았다.
이를 통해, 본 발명의 임신 진단 장치는 Intact hCG, βcf hCG의 검출된 농도에 따른 발색세기(intensity)를 바탕으로, βcf hCG / (Intact hCG + βcf hCG) 의 발색세기 비 및 βcf hCG의 분포비(%)를 통해 정상 임신군과 자궁외 임신을 포함한 비정상 임신군을 구분하고, 태낭을 확인할 수 있는 시기를 확인하는데, 한번의 측정으로 보다 더 정확하고 신속하게 판별할 수 있다.
실시예 4. 키트 성능(특이도) 검증 및 발색세기 상관관계 분석
본 발명에 따라 제작된 키트를 바탕으로 Intact hCG 단독, βcf hCG 단독, Intact hCG 및 βcf hCG 혼합 양성검체를 농도별로 제조하여 반응시킨 결과를 도 10에 나타내었다.
Intact hCG를 음성표준검체에 100, 600, 800 mIU/mL 농도로 각각 희석하여 양성검체로 제조하여 반응시킨 결과, 제1 검출 라인(βcf hCG)은 발색되지 않으면서 제2 검출 라인(Intact hCG)에 농도별 발색세기를 확인하였다.
βcf hCG를 음성표준검체에 0.03, 0.5, 5 pmol/mL 농도로 각각 희석하여 양성검체로 제조하여 반응시킨 결과, 제2 검출 라인(Intact hCG)은 발색되지 않으면서 제1 검출 라인(βcf hCG)에 농도별 발색세기를 확인하였다.
상기 Intact hCG 및 βcf hCG를 음성표준검체에 각각 100 mIU/mL (Intact hCG) + 0.03 pmol/mL (βcf hCG), 800 mIU/mL (Intact hCG) + 0.5 pmol/mL (βcf hCG), 600 mIU/mL (Intact hCG) + 5 pmol/mL (βcf hCG) 농도로 혼합희석하여 양성검체로 제조하여 반응시킨 결과 제1 및 제2 검출 라인 모두 각 농도에 대응하는 발색세기를 보였으며, Intact hCG 단독 및 βcf hCG 단독으로 처리한 결과와 농도별로 발색세기가 동등하였다.
이러한 결과는 본 발명에 사용하는 다중결합 항 hCG 단클론항체가 Intact hCG, βcf hCG에 간섭현상 없이 각각 특이적으로 반응함을 검증한 것으로, 시료 내 혼합된 Intact hCG, βcf hCG의 농도에 따라 발색세기도 양적 상관관계로 증가하여, 정확한 분포비를 측정할 수 있음을 시사한다.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (10)
- i) 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 영역;
ii) 상기 검체 영역과 연동되어 있고, 탐침물질에 접합된 Intact hCG 및 βcf hCG를 공통으로 인식하는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 포함하는 콘쥬게이트 영역;
iii) 상기 콘쥬게이트에 반응하여 결합되어 있는 Intact hCG 및 βcf hCG를 완전하게 분리 검출할 수 있는 영역으로서, βcf hCG에만 특이적으로 복합체를 형성할 수 있는 단클론항체가 고정된 제1 검출라인, Intact hCG에만 특이적으로 복합체를 형성할 수 있는 단클론항체가 고정된 제2 검출라인 및 대조라인을 포함하는 것을 특징으로 하는 신호검출 영역; 및
iv) 신호검출 반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 영역의 다운 스트림에 위치하는 흡습 영역을 포함하는,
하기 수식 1에 의해 도출되는 상기 검출라인에서 측정되는 βcf hCG 및 Intact hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율이 LMP 5주 6일에 50 % 초과인 경우 정상 임신으로 판정하고, 30 % 이하인 경우 자궁외 임신 및 고사난자를 포함하는 비정상 임신으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 임신 또는 비정상 임신 판별용 면역 장치.
[수식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 면역 장치는 분석 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역 장치. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 ii)의 탐침물질은 금 나노입자, 은 나노입자, 퀀텀닷 나노입자, 카본 나노입자, 라텍스 비드/형광 나노입자, 셀룰로오스 나노입자, 자기 나노입자, 실리카 나노입자, 폴리머 비드, 형광물질, 발광물질, 색소 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 면역 장치. - 제1항에 있어서,
상기 iii)의 신호검출 영역은 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰 및 나일론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 면역 장치. - 제1항에 있어서,
상기 iv)의 흡습 영역은 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역 장치. - 제1항에 있어서,
상기 면역 장치는 제1 검출라인의 발색으로 태낭을 관찰할 수 있는 임신 주수를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는, 면역 장치. - 하기 단계를 포함하는 임신 또는 비정상 임신 판별에 필요한 정보를 해석하는 방법:
i) 분석하고자 하는 피검 시료에서 βcf hCG 및 Intact hCG의 양 또는 농도를 측정하는 단계; 및
ii) βcf hCG 및 Intact hCG의 양 또는 농도에 대한 βcf hCG의 양 또는 농도의 비율에 의해 임신 또는 비정상 임신을 판정하는 단계로, 상기 양 또는 농도는 이에 비례한 발색세기로 측정하며,
하기 수식 1에 의해 도출되는 βcf hCG 및 Intact hCG의 발색세기에 대한 βcf hCG의 발색세기의 비율이 LMP 5주 6일에 50 % 초과인 경우 정상 임신으로 판정하고, 30 % 이하인 경우 자궁외 임신 및 고사난자를 포함하는 비정상 임신으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 상기 양 또는 농도는 βcf hCG 및 Intact hCG를 공통적으로 인식하는 다중결합 항 hCG 단클론항체를 이용하여 측정되는 단계.
[수식 1]
- 삭제
- 삭제
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