KR102637436B1 - Crm197의 높은 수준의 생산을 위한 개선된 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 고수율로 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 아미노산을 갖는 동물 유래 성분이 없는 배지에서 균주를 배양하는 것을 포함한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 균주를 사용하여 고수율로 CRM197을 생산하는 개선된 방법에 관한 것이다.
CRM197은 유전적으로 해독된 형태의 디프테리아 독소이다. 글리신을 글루탐산으로 치환한 52번 위치의 단일 돌연변이는 천연 독소의 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 상실시킨다. 독성 결여에 대한 CRM197의 구조적 기초가 밝혀졌으며 접합 백신을 위한 담체 단백질로서 널리 사용된다. 디프테리아 독소와 같은 CRM197은 2개의 서브 유닛(이황화 가교에 의해 연결됨)으로 구성된 535개의 아미노산(58.4 KD)의 단일 폴리펩티드 쇄이다.
CRM197은 상표명 Hibtiter TM 하에 시판되는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) b형 접합체, 상표명 PREVNAR 13® 하에 시판되는 13가 폐렴구균 다당류 접합체 등과 같은 다수의 승인된 접합 백신에서 담체 단백질로서 사용된다.
문헌[Ruth M. Drew et al., Bacteriol. 1951 Nov; 62(5):549-59]에는 고역가 디프테리아 독소의 생산에 적합한 화학적으로 규정된 배지를 개시하고, 파크-윌리엄스 넘버 8의 토론토 균주 코리네박테리움 디프테리아의 아미노산 요건을 요약하였다. 배지는 동물 유래 성분, 즉 카세인 가수분해물을 효과적으로 대체하는 아미노산을 함유한다. 아미노산은 글루탐산, 시스틴, 프롤린, 트립토판, 류신, 발린, 메티오닌 및 글리신을 포함한다.
문헌[Rappuoli et al; Applied and Environmental Microbiology 1983Vol. 46(3):560-564]에는 비-탠덤 이중 리소겐(lysogen)이 안정적이고 모노리소겐보다 최대 3배 더 높은 CRM197의 높은 수율을 제공할 수 있다고 개시하였다.
문헌[R Fass. et al., Applied Microbiology and Biotechnology; April 1995, Volume 43(1): 83-88]에는 코리네박테리움 디프테리아의 두 균주: C7(β)(tox-201, tox-9) 및 C7(β)(tox-107)로부터 돌연변이된 디프테리아 독소를 생산하는 고밀도 성장 접근법을 개시하였다. 이 절차에는 박테리아의 빠른 고밀도 성장을 제공하고, 포도당과 철의 동시 고갈과 관련하여 독소 생산을 향상시키는 변형된 비-탈철(non-defferated) 성장 배지의 사용이 포함된다. 600 nm에서 70의 흡광도를 제공하는 세포 밀도(15-20 g/L 건조 중량)로 박테리아가 성장할 수 있도록 산소가 충분한 공기를 공급하였다. 배양 상청액에서 최대 독소 농도는 150 mg/l였다.
문헌[Parag P.Nagarkar et al., Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 215-220]에는 코리네박테리움 디프테리아의 성장 동안 아미노산 활용 패턴을 개시하고 시험된 9개의 아미노산 중 단 4개, 즉 시스틴, 히스티딘, 아스파테이트 및 메티오닌이 코리네박테리움 디프테리아 의한 성장 및 독소 생산에 중요하다는 것을 보여주었다.
유럽 특허 번호 1 849 860 B1은 병원성 박테리아의 배양을 위한 배지 구성성분으로서 대두, 면실, 감자 등으로부터의 단백질과 같은 비동물 기원의 단백질성 물질의 용도를 개시하였다.
미국 특허 번호 6,962,803 B2에는 디프테리아 독소를 생산할 수 있는 미생물 균주를 발효시켜 디프테리아 독소를 정제하는 방법을 개시하였으며, 상기 방법은 포도당의 첨가가 디프테리아 독소 생산을 지원하는데 효과적인 미생물 성장을 유지하는 성장 배양물에 포도당을 첨가하는 것을 포함한다. 또한, 탄소원 이외에, 미량 금속, 인산염, 질소원, 일반적으로 카사미노산 및 효모 추출물을 포함하는 성장을 위한 다른 최소 영양 요건이 존재한다고 개시하였다.
미국 특허 출원 공개 번호 2011/0097359 A1은 일정 수준의 디프테리아 독소 또는 이의 유사체를 생산하는 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양하기 위한 배지를 개시하고, 여기서 배지는 동물 유래 생성물이 실질적으로 없고, 물; 탄수화물원; 질소원; 및 초기 농도의 다수의 유리 아미노산을 포함하고, 각각의 유리 아미노산의 초기 농도는 디프테리아 독소 또는 이의 유사체의 생산 수준을 제한하지 않는다. 탄수화물원은 포도당을 포함하지 않음을 추가로 개시한다.
WO 2006/100108 A1은 발효 단계의 대부분 동안 배양물 내의 pO2가 4% 미만으로 떨어지도록 제한된 통기 및 균질 배양을 유지하기에 충분한 교반 조건 하에 발효기 내의 배지에서 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하는 발효 공정을 개시하였다. 발효기 내의 pH는 산 또는 염기의 첨가를 요구하지 않고 통기 정도에 의해 7.0 내지 7.8 사이로 유지되는 것이 추가로 개시되었다.
CRM197 공정은 일반적으로 공정 매개변수뿐만 아니라 공정 구성요소의 작은 변화에 민감하다. 코리네박테리움 디프테리아로부터의 CRM197 생산은 상업적 실현에 대한 제한적인 성공에도 불구하고 전세계에서 행해지고 있다. 상기 참고 문헌 중 어느 것도 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 > 150 mg/l와 같은 고수율로 CRM197을 생산하는 방법을 개시하지 않았다. 본 발명의 발명자들은 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용한 CRM197의 고수율 생산을 위한 대사 흐름 모델을 개발하였다.
본 발명의 목적
본 발명의 주요 목적은 CRM197의 고수준 생산을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비용 효율적이고 접합 백신 제조에 사용될 수 있는 CRM197의 고수준 생산을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 고수율로 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 아미노산을 포함하고 동물 유래 성분이 없는 발효 배지에서 균주를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명은 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것 및 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것 및 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공한다.
도 1 - pBE33으로 지정된 플라스미드의 구성물
도 2 - 대사 흐름 밸런스 모델 흐름도.
도 2 - 대사 흐름 밸런스 모델 흐름도.
본 발명은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 고수율로 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 10종 초과의 아미노산을 포함하고 동물 유래 성분이 없는 발효 배지에서 균주를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주(C7Ep)는 숙주 CRM197 유전자와 동일한 메커니즘에 의해 조절된 CRM197 유전자의 다중 카피를 에피솜으로(episomally) 배치한 코리네박테리움 디프테리아를 지칭하고 상기 균주의 유전적 배경은 단일 리소겐이다.
본 발명에 사용된 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 이의 염으로부터 선택되고 각각의 아미노산은 약 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용된다.
아미노산, 비타민의 효과 및 CRM197의 생산을 위한 공정 조건이 연구되었다. 특정 아미노산은 박테리아의 성장에 부정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 10종 초과의 아미노산이 최적의 농도로 사용되면 CRM197의 생산이 증가하는 것으로 밝혀졌다. 플라켓 버만(Plackett Burman) 실험 디자인을 사용하여 아미노산 농도를 최적화한다.
플라켓 버만 디자인은 제한된 수의 실험을 사용하여 이러한 의존성에 대한 추정치의 변동을 최소화하는 방식으로 여러 독립 변수(요인)에 대한 일부 측정 수량의 의존성을 조사하기 위한 실험 디자인이다. 결과는 아스파르트산, 글루타민, 글리신, 이소류신, 류신, 발린과 같은 아미노산이 35 내지 36℃의 온도에서 CRM197 합성에 긍정적인 영향을 미치고, 알라닌, 이소류신, 발린과 같은 아미노산이 35 내지 35℃의 온도에서 CRM197의 합성에 부정적인 효과를 갖는 것으로 나타났다. CRM197의 높은 수준의 생산을 달성하기 위해 여러 수준의 실험 디자인을 상이한 농도로 수행하였다. 티로신 및 아스파라긴의 사용은 CRM197의 전체 수율을 감소시켰고, 따라서 이들 아미노산은 본 발명의 일부가 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 발효 배지는 페닐알라닌, 아르기닌 및 하나 이상의 다른 아미노산의 조합을 함유하며, 여기서 사용되는 페닐알라닌 및 아르기닌의 양은 약 1 g/L 미만이다.
본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서, 발효 배지는 페닐알라닌, 아르기닌 및 하나 이상의 다른 아미노산의 조합을 포함하며, 여기서 페닐알라닌의 양은 약 0.25 내지 0.75 g/l이고 아르기닌은 약 0.1 내지 0.5 g/l이다.
본 발명은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 균주를 배양하는 것, 배지에 리터당 약 0.05 내지 20 mg의 범위로 비타민을 보충하는 것을 포함하고, 배지에는 동물 유래 성분이 없다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 아미노산, 비타민, 미량 원소 등은 배양 동안 발효 배지에 영양소로서 첨가된다.
보충제로서 본 발명에서 사용되는 다양한 영양소는 니코틴산, 티아민, 판토텐산, 비오틴, 리보플라빈, 엽산으로부터 선택된 비타민; 피멜산; 인산염, 질소원 및 미량 금속 등을 포함하고 각 비타민은 리터당 약 0.05 내지 20 mg 범위의 양으로 사용된다.
본 발명에 사용된 발효 배지는 비-탈철이며 동물 유래 성분이 전혀 없다. 또한, 배지에는 전형적인 육류 기반 로플러(Loeffler) 배지 및 카사미노산 기반의 탈철 저 철분 YC 배지가 결여된다. 본 발명의 발효 배지 성분은 효모 추출물, 식물성 펩톤, 인산이수소칼륨(KH2PO4), 트립토판, 포도당, YC 미량 염 용액을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주의 배양을 위한 배지 조성물은 효모 추출물, 식물성 펩톤, 인산이수소칼륨(KH2PO4), 트립토판, 포도당, YC 미량 염 용액을 포함하는 기본 발효 배지; 하나 이상의 아미노산, 비타민, 미량 원소 등을 포함한다.
적합한 미량 금속은 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 염화물, 콜린, 구리, 망간, 황산염, 아연 등을 포함한다.
본 발명은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 대사 흐름 모델을 기초로 발효 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함한다.
대사 흐름 모델은 열 전달, 물질 전달, 산소 전달률(OTR), 산소 흡수율(OUR) 및 이온 전달 동역학의 완전한 네트워크를 지칭하며, 여기서 OTR은 순수 산소에서 교반, 배압 및 펌프를 통해 유지된다. 이 모델은 도 2에 도시된다.
대사 흐름 모델 개발
이 모델은 공정에서 방출된 열과 함께 용존 산소, 산소에서 CO2로의 전환이 뒤따르는 주요 변수로서 공정에서 수소 이온 축적에 대한 온라인 데이터 해석에 기초하여 생성된다. 예를 들어, 모델은 탄소원 제한 조건에서 작동한다. 탄소원이 펄싱되고 공정에서 반응이 평가된다. 반응에 기초하여 수소 이온 발생에 대해 보정 조치를 취했다. 이어서, 공급물은 안정한 pH 및 용존 산소(DO) 및 열 전달률(예를 들어, pH 7.4, 잔류 DO > 2 내지 20; 열 전달률 HTR)을 얻도록 최적화되었다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 방법은 전체 발효 공정 동안 배지에 포도당을 보충하는 것을 포함한다.
본 발명은 탄소원으로서 말토스의 사용 및 탈철 단계를 포함하지 않는다.
본 발명에 따라 생산된 CRM197은 폐렴구균 접합체, 장티푸스 접합체, Hib 접합체 등과 같은 접합 백신의 제조에 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것 및 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 영양소를 공급하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 여기서 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 이의 염으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 아미노산은 약 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것 및 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 아미노산은 약 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동물 유래 성분이 없고 기본 배지, 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것 및 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 각각의 아미노산은 약 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것 및 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 여기서 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 이의 염으로부터 선택되고, 각각의 아미노산은 약 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 여기서 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 이의 염으로부터 선택되고, 각각의 아미노산은 약 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 CRM197을 생산하는 개선된 방법으로서,
i) 동물 유래 성분이 없고, 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 이의 염으로부터 선택된 10종 초과의 아미노산과 기본 배지를 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것, 및
ii) 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 포도당 및 영양소를 보충하는 것
을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 발효 공정 동안 온도는 30 내지 40℃의 범위로 유지되고 pH는 20% 오르토인산, 12.5% 수산화암모늄을 사용하여 7.0 내지 8.0, 바람직하게는 7.4 내지 7.6으로 유지된다. 발효 공정은 15 내지 24시간, 바람직하게는 16 내지 20시간 동안 수행된다.
실시양태에서, 본 발명은 티로신 및 아스파라긴이 없는 발효 조성물 및 방법을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명의 방법은 카사미노산 기반의 탈철 저 철분 YC 배지, 탄소원으로서의 말토스 및 탈철 단계가 없다.
본 발명은 동물 유래 성분이 없고 약 1 g/L 미만의 양의 아르기닌, 페닐알라닌 및 하나 이상의 다른 아미노산의 조합을 함유하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공한다.
실시양태에서, 본 발명은 동물 유래 성분이 없고 10종 초과의 아미노산을 포함하는 발효 배지에서 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것 및 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함하는 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 여기서 수득된 CRM197의 수율은 150 mg/L 초과이다.
실시양태에서, 본 발명은 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 수막구균(meningococcus), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 다당류를 본 발명에 따라 생산된 CRM197과 접합시키는 것을 포함하는 접합 백신을 제조할 수 있다.
본 발명은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 고수율로 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 10종 초과의 아미노산을 포함하고 동물 유래 성분이 없는 배지에서 균주를 배양하는 것 및 대사 흐름 모델을 기초로 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 150 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 500 mg/L, 1 g/L, 1.5 g/L, 2 g/L, 2.5 g/L, 3 g/L, 3.5 g/L, 4 g/l, 4.5 g/L, 및 5 g/L와 같은 수율로 CRM197을 생산하는 개선된 방법을 제공한다.
실시양태에서, 본 발명은 pBE33 플라스미드가 전기천공에 의해 전달된 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7(β 197)을 제공한다.
본 발명에 따라 생산된 CRM197은 면역-포획 효소 연결 면역-흡착 분석(IC-ELISA)으로 정량화되었다.
발현 벡터 플라스미드 상에서의 증가된 카피 수의 CRM
197
유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주의 개발
코리네박테리움 디프테리아 C7(β-197) ATCC 53821, 즉 CRM197을 코딩하는 유전자는 단일 카피로서 존재하며 돌연변이 CRM197 단백질은 철 조절 하에 배양 배지로 분비된다. CRM197의 수율은 두 개의 카피의 코리네파지-베타를 갖는 코리네박테리움 디프테리아 C7 균주(ATCC 39255)에서 3배 증가한다. 이는 유전자 카피 수가 생산성 증가와 관련이 있음을 시사한다. 코리네박테리움 디프테리아로부터 CRM197 생산을 상업적으로 실행 가능하게 하기 위해, 발현 수준을 증가시키는 것이 바람직하다. 박테리아 게놈에 더 많은 카피 수를 통합하는 것은 기술적으로 어려운 일이다. 다중 카피 파지 인테그란트(integrant)는 유전적으로 불안정하고 CRM 유전자의 추가 카피를 잃는다. 본 발명자들은 항생제 선택 마커를 갖는 플라스미드 상에 전달된 CRM197의 유전자 카피를 CRM197의 천연 조절 요소와 함께 증가시킴으로써 CRM197의 발현 수준을 개선하고자 하였다. 따라서, 본 발명자들은 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 코리네박테리움 디프테리아 균주를 개발하여 균주의 안정성을 평가하였다. 변형된 균주는 변형되지 않은 코리네박테리움 균주와 비교하여 더 높은 수준의 CRM197 발현을 가졌다.
본 발명은 하기 주어진 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명된다. 그러나, 본 발명은 임의의 방식으로 예시에 의해 제한되지 않고, 본 기술 분야에서 잘 알려진 사람들에게 공지된 바와 같이, 본원에 설명된 매개변수 내에서의 변형을 포함한다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1
CRM197의 에피솜 카피에 의한 CRM
197
발현의 개선:
코리네박테리움 디프테리아 C7(β 197)에서 안정적으로 복제될 수 있는 벡터를 제조하였다. 코리네박테리움 C7 디프테리아로부터의 천연 플라스미드의 단리는 문헌[T.C Currier et al., Anal Biochem. 1976; 76(2): 431441]에 기술된 바와 같이 큰 플라스미드 단리 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 천연 플라스미드 DNA 제제를 사용하여, 1.87 Kb 복제 기점(oriR)을 증폭시켰다. 동시에, pUC4-KIXX 템플릿 DNA를 사용하여 1.033 Kb kanR 서열을 증폭시키고 무딘 말단을 oriR에 결찰하여 pBE30을 생성하였다. 또한, pTox 프로모터 영역을 포함하는 CRM197의 2.13 Kb 유전자 서열(Boyd et al., 1988), cru 및 예측된 종결자 서열은 코리네박테리움 디프테리아 C7(β 197) 게놈 DNA로부터 증폭되고 pBE30에서 디자인된 독특한 SpeI 제한 부위 내로 클로닝되었다. 이 앰플리콘에서의 GAG 돌연변이는 대립유전자 특이적 PCR 분석(Pushnova et al., Analytical Biochemistry. 1998; 260: 24 to 29) 및 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 이렇게 얻은 플라스미드를 pBE33으로 지정하였다(도 1).
pBE33 플라스미드를 코리네박테리움 디프테리아 C7(β 197)에 최적화된 절차에 따라 전기천공법으로 옮겼다. 형질전환된 코리네박테리움 디프테리아 C7(β 197)(pBE33) 콜로니는 특이적 콜로니 PCR 및 플라스미드 단리 및 제한부위 분해에 의해 확인되었다. 콜로니에서 CRM197의 발현을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 배지 중의 CRM197을 ELISA 및 HPLC로 정량하고, 배양 배지 1 리터당 발현된 CRM197의 농도로서 제시하였다.
실시예 2
동물 유래 성분이 없는 기본 배지에서의 조작된 코리네박테리움 디프테리아 C7Ep 균주에 의한 CRM
197
생산.
코리네박테리움 디프테리아 C7Ep 균주가 이 공정에 사용되었다. 진탕 플라스크에서 접종물 제조를 위해 2 단계 배양을 수행하였다. 진탕 플라스크 배양용 배지는 효모 추출물(YE) 10 g/L, 식물성 펩톤 15 g/L, KH2PO4 4.3 g/L, 트립토판 50 mg/L, 포도당 4.0 g/L, 니코틴산 0.8 mg/L, 피멜산 0.08 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4. 5H2O 12.5 mg/L, MnCl2. 4H2O 6.25 mg/L, 시스틴 0.5 g/L, 카나마이신 25 mg/L, 포도당 4.0 g/L를 포함한다.
20 L 발효기 배지에, 5% 접종물을 첨가하여 공정을 시작하였다. 발효기 배양용 배지는 YE 15 g/L, 식물성 펩톤 30 g/L, KH2PO4 4.3 g/L, 트립토판 50 mg/L, 니코틴산 0.8 mg/L, 피멜산 0.08 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4. 5H2O 12.5 mg/L, MnCl2. 4H2O 6.25 mg/L, 시스틴 0.5 g/L, 카나마이신 25 mg/L, 포도당 4.0 g/L를 포함한다.
배양물을 뱃치 전체에 걸쳐 300 RPM에서 교반하였다. 온도를 35℃로 유지하고 20% 오르토인산 및 5 N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 유지하였다. 1.0 vvm 공기를 사용하여 배양물을 폭기시켰다. 용존 산소(DO) 수준을 20%로 유지하기 위해 배양물에 산소를 농축시켰다. 처음 몇 시간이 지난 후, O2 농축 한계에 도달하면 DO 수준이 20% 아래로 계속 떨어진다. 나머지 뱃치에 대한 DO 수준은 종료 시간을 향해 상승함에 따라 0에 가깝게 유지된다. 배양액 중 잔류 포도당이 0.5 g/L 미만으로 떨어질 때, 40% 포도당 공급물을 2 g/L/hr로 제공하였다. 세포 밀도가 OD 600 nm의 약 90 유닛에 도달했을 때 14시간 배양 후 뱃치를 수확하였다. 반응기 내의 발포체는 30% 유기 소포제에 의해 제어되었다. CRM197 생산은 60 내지 65 mg/L의 발효 배양액의 역가에 도달하였다.
미조작된 코리네박테리움 디프테리아 C7 CRM197 균주를 사용하여 유사한 조건 하에서 발효를 실시하여 조작된 균주보다 적은 약 35 내지 40 mg/L의 CRM197을 생산하였다. 이는 추가 유전자 카피가 CRM197의 생산 증가에 미치는 영향을 보여준다.
실시예 3:
하기 대사 흐름 밸런스 모델에 의한 동물 유래 성분이 없는 기본 배지에서의 조작된 코리네박테리움 디프테리아 C7Ep 균주에 의한 CRM
197
의 생산.
코리네박테리움 디프테리아 C7Ep 균주가 이 공정에 사용되었다. 진탕 플라스크에서 접종물 제조를 위해 2 단계 배양을 수행하였다. 진탕 플라스크 배양용 배지는 YE 10 g/L, 식물성 펩톤 15 g/L, KH2PO4 4.3 g/L, 트립토판 50 mg/L, 포도당 4.0 g/L, 니코틴산 0.8 mg/L, 피멜산 0.08 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4. 5H2O 12.5 mg/L, MnCl2. 4H2O 6.25 mg/L, 시스틴 0.5 g/L, 카나마이신 25 mg/L, 포도당 4.0 g/L를 포함한다.
20 L 발효기 배지에, 5% 접종물을 첨가하여 공정을 시작하였다. 발효기 배양용 배지는 YE 15 g/L, 식물성 펩톤 30 g/L, KH2PO4 4.3 g/L, 트립토판 50 mg/L, 니코틴산 0.8 mg/L, 피멜산 0.08 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4. 5H2O 12.5 mg/L, MnCl2. 4H2O 6.25 mg/L, 시스틴 0.5 g/L, 카나마이신 25 mg/L, 포도당 4.0 g/L를 포함한다.
배양물을 뱃치 전체에 걸쳐 300 RPM에서 교반하였다. 온도를 35℃로 유지하고 20% 오르토인산 및 12.5% 수산화암모늄을 사용하여 pH를 7.4로 유지하였다. 1.0 vvm 공기를 사용하여 배양물을 폭기시켰다. DO 수준을 20%로 유지하기 위해 배양물에 산소를 농축시켰다. 주어진 시점에 대사 전환율을 따르는 모델을 도입하였으며, 이 모델은 pH, CO2, 열 발생에 대한 변화에 대응하여 잔류 DO의 온라인 매개변수로부터 입력을 받는다. 로그 단계에서 O2 농축 한계에 도달했음에도 불구하고 DO 수준은 계속 20% 아래로 떨어진다. 나머지 뱃치에 대한 DO 수준은 종료 시간을 향해 상승함에 따라 0에 가깝게 유지된다. 배양액의 잔류 포도당이 0.5 g/L 미만으로 떨어질 때, 대사 흐름 모델을 정당화하기 위해 40% 포도당 공급물이 공급되었다. 세포 밀도가 OD 600 nm의 약 90 유닛에 도달했을 때 14시간 배양 후 뱃치를 수확하였다. 반응기 내의 발포체는 30% 유기 소포제에 의해 제어되었다. CRM197 생산은 150 mg/L의 발효 배양액의 역가에 도달하였다.
실시예 4:
본 발명에 따른 CRM
197
의 생산
접종물 제조를 위해 3 단계 배양을 수행하였다. 처음 두 단계를 진탕 플라스크에서 수행하였다. 진탕 플라스크 배양용 배지는 YE 10 g/L, 식물성 펩톤 15 g/L, KH2PO4 4.3 g/L, 트립토판 50 mg/L, 포도당 4.0 g/L, YC 미량 염 용액 2 ml/L, 시스틴 보충제 1 ml/L, 카나마이신 25 mg/L, 포도당 4.0 g/L를 포함한다.
시드 발효기의 기본 배지 조성은 YE 15 g/L, 식물성 펩톤 30 g/L, KH2PO4 4.3 g/L, 트립토판 50 mg/L, 니코틴산 0.8 mg/L, 피멜산 0.08 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4. 5H2O 12.5 mg/L, MnCl2. 4H2O 6.25 mg/L, 시스틴 0.5 g/L, 카나마이신 25 mg/L, 포도당 4.0 g/L였다.
하기는 플라켓 버만 디자인에 따라 디자인된 발효기 배지 조성(표 I) 및 성분이다.
[표 I]
기본 배지(YE 15 g/L, 식물성 펩톤 30 g/L, KH2PO4 4.3 g/L, 트립토판 50 mg/L, 니코틴산 0.8 mg/L, 피멜산 0.08 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4. 5H2O 12.5 mg/L, MnCl2. 4H2O 6.25 mg/L, 시스틴 0.5 g/L, 카나마이신 25 mg/L, 포도당 4.0 g/L.)와 함께 상기 성분을 갖는 20 L 발효기에, 시드 발효기로부터의 5% 접종물을 첨가하여 공정을 시작하였다. 온도를 35℃로 유지하고 20% 오르토인산, 12.5% 수산화암모늄, 및 포도당 공급 및 OTR의 대사 흐름(도 2) 조절에 기초한 모델을 사용하여 pH를 7.4 내지 7.6으로 유지하였다. 1.0 vvm 공기를 사용하여 배양물을 폭기시켰다. DO 수준을 20%로 유지하기 위해 배양물에 산소를 농축시켰다. 로그 단계에서, O2 농축 한계에 도달했음에도 불구하고 DO 수준은 계속 20% 아래로 떨어진다. 나머지 뱃치에 대한 DO 수준은 종료 시간을 향해 상승함에 따라 0에 가깝게 유지된다. 배양액 중 잔류 포도당이 0.5 g/L 미만으로 떨어질 때, 40% 포도당 용액을 4.5 g/L/hr로 공급하였다. 간헐적으로 비타민과 미량 원소는 하기 수준으로 보충되었다: 니코틴산 6.425 mg/L, 피멜산 0.465 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4. 5H2O 12.5 mg/L, MnCl2. 4H2O 6.25 mg/L, 티아민 0.08 mg/L, 판토텐산 0.25 mg/L, 비오틴 0.006 mg/L, 리보플라빈 0.3 mg/L, 엽산 0.06 mg/L. 세포 밀도가 OD 600 nm의 약 132 유닛에 도달했을 때 18시간 배양 후 뱃치를 수확하였다. 반응기 내의 발포체는 30% 유기 소포제에 의해 제어되었다. CRM197 생산은 450 내지 500 mg/L의 발효 배양액의 역가에 도달하였다.
실시예 5
천연 코리네박테리움 디프테리아 C7 및 조작된 코리네박테리움 디프테리아 C7Ep 균주를 사용한 CRM
197
의 수율 비교.
천연 C7 코리네박테리움 디프테리아 및 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 기본 동물성분 불포함 배지, 사전 모델 공정 개선 및 본 발명에 따른 배지 및 공정을 사용하여 발효를 수행하였다.
단일 리소겐 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7 및 에피솜으로 배치된 여분의 CRM197 유전자 카피를 갖는 조작된 균주(C7Ep)를 공정 최적화에 사용하였다. 동물 성분을 갖는 전형적인 비-탈철 YC 배지에서, C7은 22 내지 25 mg/L의 CRM197을 제공한 반면, C7Ep는 40 내지 45 mg/L를 제공하였다. 동물성 성분을 식물성 펩톤으로 대체하여 배지를 변형한 경우, C7 균주는 40 내지 45 mg/L의 CRM197을 생산하였고 C7Ep는 65 mg/L의 CRM197을 제공하였다. 매개변수를 변경하여 공정 조건을 수정 한 경우, C7Ep는 120 내지 150 mg/L의 CRM197을 생산하였다. 기본 공정의 입력을 사용하여 모델이 개발되었다. 최적화된 방법의 최종 결과는 C7로부터의 CRM197이 120 mg/l이고 C7Ep로부터의 CRM197은 > 500 mg/L였다. 수율은 하기 제시된 표 II에서 비교된다:
Claims (15)
- 변형되지 않은 코리네박테리움 디프테리아 균주와 비교하여 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 균주를 사용하여 CRM197을 생산하는 개선된 방법으로서, 티로신 및 아스파라긴을 제외한 10종 초과의 아미노산을 포함하고 동물 유래 성분이 없는 비-탈철 발효 배지에서 균주를 배양하는 것을 포함하고, 말토스가 탄소원으로 사용되지 않는 것인, CRM197을 생산하는 개선된 방법.
- 제1항에 있어서, 배지에 비타민, 피멜산, 인산염, 질소원 및 미량 금속으로부터 선택된 영양소를 보충하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 아미노산이 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 이의 염으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 각각의 아미노산이 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 발효 배지가 페닐알라닌, 아르기닌 및 다른 아미노산의 조합을 함유하고, 페닐알라닌 및 아르기닌의 양은 1 g/L 미만인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지가 효모 추출물, 식물성 펩톤, 인산이수소칼륨(KH2PO4), 트립토판, 포도당, YC 미량 염 용액을 포함하는 기본 발효 배지를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 발효 공정 동안 배지에 포도당을 보충하는 것을 포함하는 방법.
- CRM197을 생산하는 개선된 방법으로서,
i) 동물 유래 성분이 없고, 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 이의 염으로부터 선택된 10종 초과의 아미노산과 기본 배지를 포함하는 비-탈철 발효 배지에서, 변형되지 않은 코리네박테리움 디프테리아 균주와 비교하여 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것, 및
ii) 배지에 포도당 및 영양소를 보충하는 것
을 포함하고, 말토스가 탄소원으로 사용되지 않는 것이며, 상기 영양소는 비타민, 피멜산, 인산염, 질소원 및 미량 금속으로부터 선택된 것인, CRM197을 생산하는 개선된 방법. - CRM197을 생산하는 개선된 방법으로서, 동물 유래 성분이 없고 티로신 및 아스파라긴을 제외한 10종 초과의 아미노산을 포함하는 비-탈철 발효 배지에서, 변형되지 않은 코리네박테리움 균주와 비교하여 증가된 카피 수의 CRM197 유전자를 갖는 조작된 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 것, 및 배지에 영양소를 보충하는 것을 포함하고, 각각의 아미노산은 0.05 내지 2 g/l의 양으로 사용되고, 말토스가 탄소원으로 사용되지 않는 것이며, 상기 영양소는 비타민, 피멜산, 인산염, 질소원 및 미량 금속으로부터 선택된 것인, CRM197을 생산하는 개선된 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 발효가 30 내지 40℃의 온도 및 7.0 내지 8.0 범위의 pH에서 수행되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 CRM197의 수율이 150 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 또는 500 mg/L 초과인 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 따라 제조된 CRM197과 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 다당류를 접합시키는 것을 포함하는 접합 백신을 제조하는 방법.
- 제2항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민은 니코틴산, 티아민, 판토텐산, 비오틴, 리보플라빈 및 엽산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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