KR102590758B1 - 안토시아니딘 성분인 시아니딘, 델피니딘, 페튜니딘등을 함유한 빌베리 추출물의 항산화 또는 항염증용 조성물 - Google Patents
안토시아니딘 성분인 시아니딘, 델피니딘, 페튜니딘등을 함유한 빌베리 추출물의 항산화 또는 항염증용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물은 강력한 라디칼 소거 활성을 보이고, 리놀레산 산화를 억제하고, 자유 라디칼에 의한 DNA 손상을 용량 의존적으로 예방할 수 있고, 산화질소(NO) 생성을 억제하고, LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 iNOX, COX-2, TNF-α, IL-6와 같은 전 염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있는 효과가 있는 바, 강력한 천연의 항산화 및 항염증 반응을 조절하는 면역기능 조절 조성물로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 빌베리 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1 종 이상의 안토시아닌을 함유하는 빌베리 추출물의 항산화 또는 항염증용 천연 조성물과 상기 천연 조성물을 포함하는 건강기능식품 조성물, 건강식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
인간을 포함한 생물은, 호흡을 통하여 에너지를 얻고 신진대사를 하는 과정에서 흡입된 산소의 약 2 %를 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)로 변환시켜 지니고 있게 된다.
상기 ROS는 프리 라디칼(free radical)을 가진 산소를 의미하며, 세포 내에서 대사하는 과정에서 생성되는 산소로 세포막을 파괴하기도 하고, 유전정보를 가진 DNA를 변형시켜 돌연변이를 일으켜 단백질을 변성시키고 신호전달 체계를 무너뜨리는 각종 질환의 원인이 될 수도 있다.
생체내에는 superoxide dismutase(SOD), catalase, peroxidase 등의 항산화효소와 함께 비타민 E, 비타민 C, 글루타치온 등의 항산화물질을 포함하는 항산화 방어 시스템이 존재하여, 정상 산소성 개체(aerobic organism)는 ROS의 발생과 항산화 방어계가 항상 균형을 이루고 있게 되는데, 산화적 스트레스(oxidative stress)란, 상기 ROS의 발생과 항산화 방어계간의 불균형이 초래되는 상황을 의미한다.
상기 산화적 스트레스로 인해, ROS가 과도하게 발생하게 되면 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체물질과 쉽게 반응하여, 생체막의 지질을 산화시키고, 단백질을 변성시키고, 강력한 산화력으로 DNA를 손상시켜 세포와 조직을 손상시키며, 이화증, 동맥 경화증, 당뇨병, 뇌졸중, 암과 같은 질병을 유발하게 된다.
한편, 염증과 관련된 면역기능을 정상적으로 유지하는데 있어서는 항상 건강한 상태를 보존하는 것이 매우 중요하다. 면역반응에는 여러 가지 면역관련 세포, 면역조절인자가 관련되어 있지만, 면역계를 정상적으로 기능시키기 위해서는 충분한 영양소의 섭취가 필요하며, 일부 면역조절 인자는 환경적인 요소가 면역기능의 발현에 크게 영향을 미치지는 것으로 알려져 있다. 이러한 염증반응은 초기 세포손상의 억제와 함께 상처 부분의 괴사된 세포 및 상처를 입은 조직을 제거함과 동시에 조직재생을 하는데 목적이 있다.
인체 내에서 대식세포는 병원체에 반응하여 종양 괴사 인자-α(tumor necrotic factor-α, TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1ββ등과 같은 염증유발인자를 생성하고, 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)를 합성하여 일산화질소(NO) 및 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)을 생성하여, 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.
생리학적으로 상기 NO는 세균과 종양을 제거하고 혈압을 조절하거나 신경 전달을 매개하는 등 다양한 역할을 한다. 그러나 염증 반응이 일어나게 되면 관련 세포들에서 iNOS의 발현이 증가하여 많은 양의 NO가 생성되고, 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자변이, 신경 손상 등을 유발하며, 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진시킨다.
상술한 인체의 염증 반응에서, 최근 여러 연구에서 입증된 많은 염증과 관련된 만성 질환은 산화적 스트레스, 즉, 과도한 ROS 생산을 특징으로 한다.
상기 과도한 ROS 생산은 필수 세포 지질, 단백질 및 DNA를 손상시켜 많은 강력한 병리학적 변화를 표시하여 이끌어 내고, 상기 ROS 가 신호인자로 작용하여 전염증성 사이토카인의 생산이 악화되는 것으로 나타나고 있다.
인체 내에서, 산화적 스트레스(oxidative stress)를 줄이기 위한 새로운 항산화 물질에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있으며, 최근에는 합성 항산화제의 독성, 합병증 등의 위험성으로 인해 천연 물질로서 독성이 없는 안전한 천연 항산화제의 개발이 요구되고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항산화 및 항염증 효과를 나타내면서 부작용이 적은 천연 물질을 찾고자 예의 연구노력한 결과, 빌베리 추출물에서 높은 항산화 및 항염증 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
삭제
본 발명의 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 빌베리 추출물을 포함하는 조성물은 강력한 라디칼 소거 활성을 보이고, 리놀레산 산화를 억제하고, 자유 라디칼에 의한 DNA 손상을 용량 의존적으로 예방할 수 있다.
나아가, 산화질소(NO) 생성을 억제하고, LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 iNOX, COX-2, TNF-α, IL-6와 같은 전 염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있는 효과가 있는 바, 강력한 천연의 항산화 및 항염증 반응을 조절하는 면역기능 조절 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예의 빌베리 추출물의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 아질산염 소거 활성 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 DNA 산화적 손상에 대한 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 산화 질소(NO) 발생 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예의 빌베리 추출물의 웨스턴 블롯 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 아질산염 소거 활성 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 DNA 산화적 손상에 대한 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예 및 비교예의 추출물의 산화 질소(NO) 발생 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예의 빌베리 추출물의 웨스턴 블롯 실험 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 빌베리는(Vaccinium myrtillus L., Bilberry)는 진달래과(Ericaceae)의 월귤나무속(Vaccinium)에 속하는 관목성 식물로, 일반적으로, 15 ℃ 내지 21 ℃의 온도와 pH 4.5 내지 5.5의 산성토양에서 잘 자라는 다년생 온대 과수로 주로 동남아시아에 분포하는 것으로 알려져 있다.
상기 빌베리는 발열, 흥분, 초조, 기침, 신장 결석과 요로 감염, 장과 간 질환, 치질 및 야맹증, 백내장, 근시, 눈의 피로 등의 안구 질환의 예방 및 치료를 위해 한의학에서 오랫동안 사용되어 왔다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 빌베리 추출물은 폴리페놀, 플라보노이드, 아스코르브 산 및 안토시아닌 중 1 종 이상을 포함할 수 있고, 이때, 상기 안토시아닌은 Delphinidin-3-galactoside chloride, delphinidin 3-glucoside chloride, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-glucoside, petunidin-3-glucoside 및 cyanidin-3-arabinoside 중 1 종 이상을 포함할 수 있다.
상기 안토시아닌은 화학적으로 방향족 고리로 이루어진 안토시아니딘을 기본 구조로 하는 과일 등에 많이 함유된 수용성 천연 색소로, 항산화 활성, 신경계 질환, 심장질환, 당뇨 등에 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.
상기 안토시아닌은 암 발생 억제, 항바이러스 작용, 지질대사 조절, 시력 및 난소기능 증강효과 등의 생리활성을 가지고, 특히, 퇴행성 질병 및 질환의 많은 발달 조건에 관련된 자유라디칼을 억제하는 항산화 활동과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있는 바, 과도한 ROS 생성 및 염증을 억제하는 메커니즘에 의해 작용할 수 있다.
본 발명의 빌베리 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물은 상기 빌베리 추출물에 포함되는 안토시아닌을 유효성분으로 포함하여 항산화 및 항염증 활성의 주요성분이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 항산화 또는 항염증용 조성물은 고추씨(Capsicum spp. seeds) 추출물을 더 포함하는 복합 추출물을 포함할 수 있다.
고추는 남아메리카 원산으로 아메리카 대륙에서 오래전부터 재배되어온 식물이다. 열대에서 온대에 걸쳐 널리 재배되고, 한국에는 담배와 거의 같은 시기에 들어와 한국인의 식생활에 커다란 영향을 주었다. 고추씨는 고춧가루를 만드는 과정에서 고추에서 제거되어 버려지는 식품 부산물이나, 최근 연구에서 상기 고추씨의 항암활성 억제 효과가 밝혀지고, 고추 껍질보다 캡사이신(capsaicin) 함량이 더 많이 함유되어 있다고 보고된 바 있다.
본 발명의 조성물은 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 빌베리 추출물의 각종 항산화 활성 및 대식세포에서의 항염증 효과가 확인되며, 상기 고추씨 추출물을 더 포함하는 혼합 추출물의 경우, 상기 항산화 활성 및 항염증 효과에 있어서, 상승 효과가 나타날 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물이 모두 포함된 복합 추출물인 경우, 상기 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물은 각각 분말형태의 빌베리 열매 및 고추로부터 추출되어 준비될 수 있고, 상기 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물은 1: 300 내지 1: 500, 예를 들면, 1: 380 내지 1: 420, 예를 들면, 1: 400의 중량비로 혼합되어, 상기 복합 추출물이 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물(extract)"은 추출 대상을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 빌베리 추출물 또는 고추씨 추출물은 통상의 기술분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물에 있어서, 상기 빌베리 추출물 또는 고추씨 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매 중 어느 하나를 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 70 % 에탄올로 추출할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 빌베리 추출물 또는 고추씨 추출물은 (1) 빌베리 열매 또는 고추씨로부터 추출물을 수득하는 단계; (2) 상기 추출물을 감압 농축하는 단계; 및 (3) 상기 (2) 단계에서 감압 농축된 추출물을 동결 건조하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.
이때, 혼합 추출물은 상기 방법으로 각각 추출되어 준비되는 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물을 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 양태는 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 건강기능식품 조성물 및 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 상기 빌베리 추출물에 고추씨(Capsicum spp. seeds) 추출물을 더 포함하는 혼합 추출물(이하, 혼합 추출물) 조성물일 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출할 수 있으며, 바람직하게는 70% 에탄올로 추출할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물을 건강기능식품 및 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.
빌베리 추출물 또는 혼합 추출물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태일 수 있으며, 건강식품의 예로는 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품 및 건강식품 조성물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
빌베리 추출물 또는 혼합 추출물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 및 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 일 양태는 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 상기 빌베리 추출물에 고추씨(Capsicum spp. seeds) 추출물을 더 포함하는 혼합 추출물(이하, 혼합 추출물) 조성물일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상술한 본 발명의 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 제형에서 선택된 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 본 발명에 따른 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함할 수 있다. 상기 함량을 만족하는 경우 부작용없이 우수한 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 빌베리 추출물 또는 혼합 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예>
실시예 1. 빌베리 추출물의 제조
분말 형태의 동결 건조 빌베리 열매(안국 건강(주), 서울, 한국)의 30 배(wt/v%)에 해당하는 부피의 70 % 에탄올에 침지하여 실온에서 24 시간 추출하였다. 상기 과정을 3 회 반복하여 빌베리 추출액을 수득하였다.
상기 빌베리 추출액을 Whatman No.1 여과지(GE Healthcare, Buckinghamshire, 영국)를 사용하여 3 회 여과하고, 진공 회전 증발기(EYELA, 도쿄, 일본)를 사용하여 40 ℃에서 감압 하에 증발시켜 빌베리 농축 추출물을 수득하고, 상기 빌베리 농축 추출물을 -80 ℃에서 동결 건조하고, 사용하기 전까지 -20 ℃에서 보관하였다.
이때, 상기 빌베리 추출물의 최종 수율은 70.32 %였다.
실시예 2. 빌베리 및 고추씨 혼합 추출물의 제조
충북 음성군의 국내 고추 품종인 'PR케이스타(피알케이스타, 한국다끼이(주))'의 고추씨를 분리하여, 분리한 고추씨의 30 배(wt/v%)에 해당하는 부피의 70 % 에탄올에 침지하여 실온에서 24 시간 추출하였다. 상기 과정을 3 회 반복하여 고추씨 추출액을 수득하였다.
상기 고추씨 추출액을 Whatman No.1 여과지(GE Healthcare, Buckinghamshire, 영국)를 사용하여 3회 여과하고, 진공 회전 증발기(EYELA, 도쿄, 일본)를 사용하여 40 ℃에서 감압 하에 증발시켜 고추씨 농축 추출물을 수득하고, 상기 고추씨 농축 추출물을 -80 ℃에서 동결 건조하여 건조된 고추씨 추출물을 수득하였다.
상기 실시예 1에서 제조된 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물을 1 : 400 중량비로 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였다.
비교예 1. 고추씨 추출물의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 고추씨 혼합 추출물을 비교예로 이용하였다.
<실험예>
참고. 통계 처리
모든 데이터는 세 번의 실험에서 평균 ± 표준 편차로 표시하였다.
모든 통계 분석은 GraphPad Prism5.0 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 계산되었고, 각 그룹의 유의성은 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트 또는 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 결정되었다. p < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주되었다.
실험예 1. 빌베리 추출물의 성분 분석
- 총 페놀 함량 측정
총 페놀 함량은 표준으로 사용되는 갈산과 함께 Folin-Ciocalteu 방법(Elzaawely, et al. 2005; Hu, et al. 2009)에 의해 정량화 되었다.
처음에는 물과 에탄올에 담겨있는 저장 용액(10 mg/ml)으로 실시예 1의 빌베리 추출물 시료를 준비하고, 증류수에 희석된 5 μg/ml 내지 100 μg/ml 농도의 갈산(gallic acid)을 준비하였다.
다음으로, 상기 시료 용액 40 μl, 1 N 농도의 FC 시약(Folin-ciocalteu reagent, Sigma Chemical Co, 미국) 20 μl 및 탄산나트륨(Na2CO3, 20 %, w/v) 60 μl를 혼합하여 혼합액을 제조한 후, 상기 혼합액을 실온(RT)에서 30 분 동안 어두운 곳에서 저장하여 반응을 완료하였다.
마지막으로, UV 분광광도계(Sunrise Basic Tecan, Grodig, Austria)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하고, 표준곡선을 이용하여 총 페놀 함량값을 실시예 1의 빌베리 추출물 건조 질량 100 g 당 갈산 당량(GAE) mg으로 표시하여, 하기의 표 1에 도시하였다.
- 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 알루미늄 비색법(Sakanaka, et al. 2005)을 수정하여 측정하였다.
실시예 1의 빌베리 추출물은 70 % 에탄올에 10 mg/ml의 농도로 용해되었고, 카테킨은 10 μg/ml 내지 100 μg/ml의 농도의 증류수(DW)에서 표준 물질로 사용되었다.
처음에는 각 시료 및 표준 용액 25 μl, 증류수 125 μl 및 5 % 아질산 나트륨 용액 8 μl를 혼합하여 5 분간 배양하였다.
다음으로, 10 % w/v 염화 알루미늄 용액 15 μl를 각 혼합물에 첨가하고 실온에서 6 분 동안 배양한 후, 1 M 수산화 나트륨 50 μl와 증류수 27 μl를 각각 첨가하였다.
마지막으로 UV 분광 광도계를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하고, 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해 다양한 농도의 흡광도에 의해 카테킨의 표준 검량선을 구성하였다. 표준곡선을 이용하여 총 플라보노이드 함량값을 실시예 1의 빌베리 추출물 건조 질량 100 g 당 카테킨 당량(GAE) mg으로 표시하여, 하기의 표 1에 도시하였다.
- 아스코르브 산 함량 측정
아스코르브 산(Ascorbic acid)은 2,6-dichlorophenolindophenol(DCPIP) (Klein and Perry 1982)의 약간 변형된 방법에 따라 정량적으로 측정하였다.
실시예 1에서 제조된 빌베리 추출물 0.5 g을 3 %(w/v) 메타 인산 20 ml로 추출하고 30 분 동안 300 rpm에서 교반하고, 10 분 동안 4,000 rpm에서 원심 분리하였다. 상층액을 수집하여 추가 분석에 사용하고(Butcher, et al. 2013), 표준으로 사용된 아스코르브 산은 3 %(w/v) 메타 인산으로 준비하였다.
실시예 1에서 제조된 빌베리 추출물 또는 표준 물질 1 ml를 0.2 mM DCPIP 3 ml에 첨가하고 15 초 동안 혼합한 후, 즉시 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아스코르브 산 함량은 표준의 검량선을 구성하고, 실시예 1의 빌베리 추출물 건조 질량 100 g 당 아스코르브 산 mg (mg/100 g DW)으로 표시하여, 하기의 표 1에 도시하였다. 실험은 독립적으로 세번 반복되었다.
| 총 페놀 함량 (mg GAE*/100 g dry mass) |
총 플라보노이드 함량 (mg CE**/100 g dry mass) |
아스코르브산 함량 (mg/100 g dry mass) |
수율 (%) |
| 644.43 ± 9.72 | 542.39 ± 4.25 | 182.38 ± 2.84 | 70.32 |
상기 표 1에서, 모든 데이터는 평균 ± 표준편차(n=3)로 표현되고, 상기 GAE*는 갈산 당량(gallic acid equivalent)이고, 상기 CE**는 카테킨 당량(catechin equivalent)이다.
상기 표 1을 참조하면, 본 발명의 빌베리 추출물은 항산화제 역할을 하는 건조 질량 100 g 당 644.25 mg GAE의 페놀산, 건조 질량 100 g 당 542.39 mg CE의 플라보노이드 및 풍부한 아스코르브산을 포함하는 것을 확인할 수 있었다.
- 안토시아닌 측정
상기 실시예 1에서 제조된 빌베리 추출물의 성분을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 이용하여 측정하였다.
syncronis C18, 5 μm, 250 mm ⅹ4.6 mm 컬럼(Thermo Fisher Scientific, Walthan, MA, USA)이 장착된 Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000시리즈를 사용하여 하기의 표 2에 도시된 조건에서 측정하고, 이를 분석하였다:
| condition | ||||
| Column | Thermo scientific syncronis C 18 | |||
| Column temp. | 30 ℃ | |||
| Wavelength | 530 nm | |||
| Mobile phase | A; 0.1 % TFA in WaterB: 0.1 % TFA in Acetonitrile | |||
| Gradient | Time | A (%) | B (%) | Flow rate: 0.6 ml/min |
| 0 5 20 25 30 40 |
100 87 85 85 89 0 |
0 13 15 15 11 100 |
||
| injection Volume | 10 μl | |||
안토시아닌을 확인하기 위해 10 % 포름산/수용액을 용매 A로 사용하고 HPLC 등급 아세토 니트릴/메탄올/물/포름산 (22.5 / 22.5 / 40 / 10)을 용매 B로 사용하였다. 데이터는 CHROMELEON Chromatography Management System(버전: 6.80)으로 수집되었고, 각 피크는 UV-VIS 분광 광도계(파장 535 nm)의 표준과 비교하여 확인하고, 결과를 도 1에 도시하였다.
도 1을 참조하면, 상기 HPLC 분석에 의해 Delphinidin-3-galactoside chloride, delphinidin 3-glucoside chloride, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-glucoside, petunidin-3-glucoside 및 cyanidin-3-arabinoside의 6 종류의 안토시아닌이 실시예 1의 빌베리 추출물에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 항산화 활성 평가
- DPPH 라디칼 소거활성 측정
실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 추출물과 양성대조군인 아스코르브산(AA)을 각각 50 μg/ml 내지 400 μg/ml의 농도로 준비하였다.
각 시료 및 표준 용액 100 μl를 DPPH 용액을 100 μl와 혼합하고, 어둠속에서 30 분 동안 실온에서 배양하였다. 각 용액의 흡광도는 517 nm에서 측정하였다(ELISA reader(16039400, TECAN). 대조군은 상술한 방법에 따라 동일하게 준비되었다.
하기의 식 1에 표시된 방정식을 사용하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 계산하고, 그 결과를 표 3 및 도 2에 도시하였다:
[식 1]
DPPH 라디칼 소거 활성 (%) = [(대조군의 흡광도-샘플의 흡광도)/대조군의 흡광도] × 100
| DPPH radical scavenging activity (%) | |||||
| Ascorbic acid | 비교예 1 | 실시예 1 | 실시예 2 | ||
| Concentration (μg/ml) |
50 | 99.9 | 9.2 | 17.7 | 31.2 |
| 100 | 99.9 | 13 | 45.8 | 56 | |
| 200 | 100 | 21.1 | 63.7 | 82.1 | |
| 300 | 100 | 24 | 88.5 | 94 | |
| 400 | 100 | 25.3 | 95.2 | 98.9 | |
상기 표 3 및 도 2를 참조하면, 50 μg/ml 내지 400 μg/ml의 농도에서, 비교예 1의 DPPH 라디칼 소거활성은 17.7 % 내지 95.2 % 이고, 실시예 1의 소거활성은 17.7 % 내지 95.2 %이고, 실시예 2의 소거활성은 31.2 % 내지 98.9 %로 농도 의존적인 것을 확인할 수 있었고, 비교예 1, 실시예 1의 단일 추출물과 비교하여, 실시예 2의 혼합 추출물의 DPPH 소거활성이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.
- ABTS
+
라디칼 소거활성 측정
ABTS는 7 mM의 최종 농도로 DW에 용해되었고 최종 농도 2.45 mM (V/V의 50 %)에서 과 황산칼륨 용액과 혼합되어, 어두운 곳에서 12 시간 내지 16 시간 동안 실온에서 배양하였다(Jeong, et al. 2009). 각 실험에서 새로 준비된 ABTS 용액을 0.01 M 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 희석하여 734 nm 파장에서 흡광도가 0.70 ± 0.02 이내로 조정하였다.
상기 비교예 1, 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 추출물과 대조군인 아스코르브산(AA)을 이용하여, 각각 50 μg/ml 내지 400 μg/ml 농도의 샘플 용액 및 대조군을 준비하고, 상기 각각의 샘플 용액 및 대조군 100 μl를 0.9 ml의 ABTS 용액과 혼합하고 상온에서 5 분 동안 배양한 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 자유 라디칼의 소거 활성은 다음 방정식을 사용하여 계산하고, 그 결과를 표 4 및 도 3에 도시하였다:
[식 2]
ABTS 소거 활성 (%) = [(대조군의 흡광도-샘플의 흡광도)/대조군의 흡광도] × 100
| ATBS radical scavenging activity (%) | |||||
| Ascorbic acid | 비교예 1 | 실시예 1 | 실시예 2 | ||
| Concentration (μg/ml) |
50 | 99.9 | 23.7 | 45.1 | 51.3 |
| 100 | 99.9 | 29 | 78 | 85 | |
| 200 | 100 | 33.6 | 99.17 | 99.56 | |
| 300 | 100 | 49 | 99.6 | 99.7 | |
| 400 | 100 | 58.9 | 99.3 | 99.8 | |
상기 표 4 및 도 3을 참조하면, 50 μg/ml 내지 400 μg/ml의 농도에서, 비교예 1의 ABTS 라디칼 소거활성은 23.7 % 내지 58.9 % 이고, 실시예 1의 소거활성은 45.1 % 내지 99.3 %이고, 실시예 2의 소거활성은 51.3 % 내지 99.8 %로 농도 의존적인 것을 확인할 수 있었고, 비교예 1, 실시예 1의 단일 추출물과 비교하여, 실시예 2의 혼합 추출물의 ABTS 소거활성이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.ABTS 라디칼 소거 활성은 DPPH 라디칼 소거활성보다 우수한 것을 확인할 수 있었고, 200 내지 400 농도에서 아스코르브 산의 ABTS 소거능과 거의 동일한 효과를 보였으며, 이는, 페놀 및 플라보노이드 화합물의 함량이 높기 때문인 것으로 예상되었다.
- 아질산염 소거활성 측정
아질산염 소거 활성은 Griess 시약을 사용하여 결정하였다(Choi, et al. 2008a).
상기 비교예 1, 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 추출물을 이용하여, 각각 50 μg/ml 내지 400 μg/ml 농도의 샘플 용액 또는 표준시약을 준비하고, 상기 각각의 샘플 용액 또는 표준시약 1 ml를 1 mM NaNO2 1 ml와 혼합한 후, 8 ml의 0.2 M 시트레이트 완충액(pH 3)을 첨가하고, 37 ℃ 수조에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 1 ml의 샘플에 2 ml(2%(v/v)) 아세트산 및 0.4 M의 Griess 시약을 분주하고, 볼텍스 믹서로 격렬하게 혼합한 후, 15 분 간 상온반응 시키고, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 아스코르브 산은 양성 대조군으로 사용되었고, 상기 대조군에서는 항산화 용액 대신 물이 포함되었다.
아질산염 소거 활성은 하기의 식 3에 도시된 방정식을 사용하여 계산하고, 그 결과를 표 5 및 도 4에 도시하였다:
[식 3]
소거 활성 (%) = [1 - (처리된 샘플의 흡광도-샘플 또는 표준 물질의 흡광도)/대조군의 흡광도] × 100
| Nitrite scavenging activity (%) | |||||
| Ascorbic acid | 비교예 1 | 실시예 1 | 실시예 2 | ||
| Concentration (μg/ml) |
50 | 10 | 3.2 | 19.9 | 21 |
| 100 | 12.5 | 4.1 | 20.2 | 25.5 | |
| 200 | 21 | 6.3 | 22.3 | 29.1 | |
| 300 | 29.1 | 8.1 | 29.1 | 29.9 | |
| 400 | 29.7 | 11.2 | 30 | 30.5 | |
상기 표 5 및 도 4를 참조하면, 50 μg/ml 내지 400 μg/ml의 농도에서, 비교예 1의 아질산염 소거활성은 3.2 % 내지 11.2 %이고, 실시예 1의 소거활성은 19.9 % 내지 30.0 %이고, 실시예 2의 소거활성은 21 % 내지 30.5 %로 농도 의존적인 것을 확인할 수 있었고, DPPH 및 ABTS 소거 활성과 함께 높은 소거 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비교예 1, 실시예 1의 단일 추출물과 비교하여, 실시예 2의 혼합 추출물의 아질산염 소거활성이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.
- DNA 손상에 대한 보호 활성 분석
H2O2에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 예방은 Tian &Hua (2005)의 실험방법을 약간 수정하여 실시하였다.
플라스미드 PBR 322 DNA(0.5 μg/μl) 1 μl를 FeSO4 3 μl (0.08 mM) 및 30%(v/v) H2O2 3 μl를 포함하는 3 μl의 증류수와 서로 다른 농도(50 μg/ml, 100μg/μl 및 150 μg/μl)의 비교예 1, 실시예 1 및 실시예 2의 추출물 2 μl의 혼합물을 1 시간 동안 37 ℃에서 반응시킨 후, 6 X DNA 로딩 염료 2 μl가 첨가한 후, 실온에서 70 V의 0.8% agarose gel 전기영동을 실시하였다.
DNA 밴드(supercoiled, linear and open circular)는 ethidium bromide로 염색시켰고, DNA 산화를 억제하는 효과는 control 값을 기준으로 한 supercoiled monomer의 증가와 감소로 평가하고, 그 결과를 표 6 및 도 5에 도시하였다.
| DNA protection activity (% of control) | ||||
| Con | Dam | 비교예 1 | 실시예 1 | 실시예 2 |
| 100 | 19.9 | 37.8 | 76 | 87.1 |
도 5을 참조하면, DNA 손상에 대한 플라스미드 DNA 컨트롤(Con)에 비해 산화적 손상을 일으킨 군(Damage group, Dam)에서는 초나선(supercoiled) DNA가 완전히 DNA 손상에 의한 선형 형태로 변환되었으며(데이터 미도시), 비교예 1, 실시예 1 및 실시에 2를 처리한 경우 모두 DNA 손상에 대한 보호 효과(DNA protection activity)를 나타내었으나, 비교예 1, 실시예 1의 단일 추출물과 비교하여, 실시예 2의 혼합 추출물의 경우, DNA 손상에 대한 보호 효과가 현저히 우수한 것을 확인하였다.
실험예 3. 항염증 활성 평가
- 세포 배양
생쥐의 대식 세포인 RAW 264.7은 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 분양 받았으며, 10 % 불활성화된 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 10 μ/ml가 보충된 DEME(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양되었다.
- 세포 독성 평가
세포독성은 MTT법으로 측정하였다.
100 μl DMED를 포함하는 96 well plate에 5 X 104 세포/웰의 밀도로 접종하고 밤새 배양하였다. 다양한 농도(10 μg/ml 내지 1,000 μg/ml)의 추출물을 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시키고 세포 배양물에 1 μg/ml의 LPS와 함께 하루동안 적용하였다. 그 후, 세포를 1 회 세척한 다음 5 mg/ml의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5 디페닐 테트라 졸륨 브로마이드(MTT)를 함유하는 50 μl의 FBS 유리 배지와 혼합하였다. 37 ℃에서 4 시간동안 배양한 후, 배지를 폐기하고 세포에 포르마잔 블루를 형성하고 100 μl의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켰다. 광학 밀도는 540 nm에서 측정하고, 결과를 도 6에 도시하였다.
도 6을 참조하면, 비교예 1, 실시예 1 및 실시예 2의 추출물의 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 세포생존률(cell viability, %)을 측정한 결과, 세포독성을 보이지 않는 것을 확인하였다.
- 산화 질소(NO) 측정
NO 생성량 측정 실험은 Griess 반응을 이용하여 세포 배양 상측액의 NO 생성량을 측정하여 간접적으로 평가하였다.
배양된 RAW 264.7 세포를 5×104 cells/well의 농도로 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂조건에서 24 시간 배양하고, 배지를 제거한 후, 농도별 실시예 1 및 실시예 2의 샘플에 1 μg/ml LPS를 적용하여 24 시간 더 배양하였다.
24 시간 배양 후, 상층액 80 μl와 샘플 80 μl를 혼합하여 10 분간 반응시키고, 540 nm에서 NO의 양을 측정하였다. 아질산 농도는 아질산 나트륨 표준 곡선에서 외삽하여 결정하고, 결과를 하기의 표 7 및 도 7에 도시하였다.
| Nitrite oxide (mM) | ||||
| 비교예 1 | 실시예1 | 실시예2 | ||
| Concentration (μg/ml) |
10 | 67 | 66 | 55 |
| 50 | 66 | 64 | 48 | |
| 100 | 64 | 61 | 38 | |
| 400 | 61 | 60 | 32 | |
| 1000 | 59 | 56 | 28 | |
상기 표 7 및 도 7을 참조하면, LPS로 처리된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성이 감소(b)하는 것을 확인할 수 있었고, NO 방출의 용량 의존적 억제에 의해 입증된 강력한 항염증 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 웨스턴 블롯 분석
RAW 264.7 세포를 6웰 배양 플레이트에 5 X 105 세포/웰의 밀도로 접종하고 24 시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, 농도별 실시예 1의 샘플에 1 μg/ml LPS를 적용하여 24 시간 더 배양하였다. 배양된 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2 회 세척하고 1 ml PBS를 사용하여 플레이트에서 긁어 낸 다음 원심 분리 후, PBS를 제거하였다. 세포에서 단백질을 추출하기 위하여 PRO 200 균질기를 사용하여 1 % 프로테아제 억제제 칵테일을 사용하는 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 용해 완충액에서 세포를 균질화 한 다음 디스 멤브레이터로 초음파 처리한 후, 균질물을 4 ℃에서 12,000 rpm에서 15 분 간 원심 분리하고, 세포 파편 제거 후, 상청액을 수집하였다.
총 단백질 농도는 제조업체의 지침에 따라 Bio-Rad 단백질 분석 시약을 사용하여 결정되었고, 단백질 (레인당 20 μg)을 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 사용하여 분리하고, 겔에서 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 니트로 셀룰로오스 막을 5 % BSA에서 차단하고 각각 4 ℃에서 iNOS, TNF-α, IL-6 및 β-액틴을 포함한 1 차 항체와 함께 밤새 배양한 후, 다음 막을 해당 2 차 항체와 함께 배양하고 막의 표적 단백질을 강화된 화학 발광(ECL) 시약을 사용하여 시각화 하였다.
밴드의 상대적인 강도는 Imae Lab 소프트웨어와 함께 BIO-RAD ChemiDoc XRD+(BIO-RAD, Philadelphia, PA, 미국) 이미지 시스템을 사용하여 시각화 및 분석하여 도 8에 도시하였다.
도 8을 참조하면, 실시예 1의 빌베리 추출물이 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었고, IL-6 및 TNF-α 단백질 발현도 실질적으로 하향 조정된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1의 빌베리 추출물은 LPS 유도 RAW 264.7 세포에 대한 항염 효과를 나타내고, iNOS, COX-2, IL-6 및 TNF-α의 방출을 감소시키는 바, 염증선 질환의 치료, 예를 들면, 아토피 등의 염증성 피부 질환 환자에게 유익할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
<제조예>
- 약제의 제조예
본 발명에 따른 추출물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 추출물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
약제 제조예 1. 산제의 제조
추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
약제 제조예 2. 정제의 제조
추출물 100 mg
옥수수전분 100 mg
유 당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
약제 제조예 3. 캡슐제의 제조
추출물 100 mg
옥수수전분 100 mg
유 당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
약제 제조예 4. 주사제의 제조
추출물 10 μg/ml
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ml
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 추출물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ml 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
약제 제조예 5. 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조
추출물 1.0 g
아세트산나트륨 0.3 g
메틸파라벤 0.1 g
프로필파라벤 0.02 g
염화나트륨 적량
HCl 또는 NaOH pH 조정 적량
정제수 적량
통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 ml당 추출물 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.
약제 제조예 6. 액제의 제조
추출물 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
- 건강식품의 제조예
본 발명에 따른 추출물은 목적에 따라 여러 형태의 건강식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 추출물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
건강식품 제조예 1. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 추출물 0.01-1 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
건강식품 제조예 2. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 34 중량부, 율무 19 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
추출물 (2 중량부),
영지(1.5 중량부), 및
지황(1.5 중량부).
- 건강기능식품의 제조예
본 발명에 따른 추출물은 목적에 따라 여러 형태의 건강기능식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 추출물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강기능식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
건강기능식품 제조예 1. 건강기능식품의 제조
추출물 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
건강기능식품 제조예 2. 건강 기능 음료의 제조
추출물 100 mg
구연산 100 mg
올리고당 100 mg
매실농축액 2 mg
타우린 100 mg
정제수를 가하여 전체 500 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
- 화장료의 제조예
본 발명에 따른 추출물은 목적에 따라 여러 형태의 화장료로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 추출물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 화장료의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
화장료 제조예 1. 유연 화장수의 제조
추출물 10.0 중량부
1,3-부틸렌글리콜 1.00 중량부
디소듐이디티에이 0.05 중량부
알란토인 0.10 중량부
디포타슘글리시리제이트 0.05 중량부
시트르산 0.01 중량부
소듐시트레이트 0.02 중량부
글리세레스-26 1.00 중량부
알부틴 2.00 중량부
하이드로제네이티드캐스터오일 1.00 중량부
에탄올 30.0 중량부
보존제 미량
착색제 미량
착향제 미량
정제수 잔량
화장료 제조예 2. 영양 크림의 제조
추출물 10.0 중량부
1,3-부틸렌글리콜 7.00 중량부
글리세린 1.00 중량부
D-판테놀 0.10 중량부
식물 추출물 3.20 중량부
마그네슘알루미늄실리케이트 0.30 중량부
PEG-40 스테아레이트 1.20 중량부
스테아르산 2.00 중량부
폴리소르베이트 60 1.50 중량부
친유형글리세릴스테아레이트 2.00 중량부
소르비탄세스퀴올리에이트 1.50 중량부
세테아릴알코올 3.00 중량부
미네랄오일 4.00 중량부
스쿠알란 3.80 중량부
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.80 중량부
식물성오일 1.80 중량부
디메치콘 0.40 중량부
디포슘글리시리제이트 미량
알란토인 미량
소듐 히아루로네이트 미량
토코페릴아세테이트 적량
트리에탄올아민 적량
보존제 적량
착향제 적량
정제수 잔량
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (14)
- 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물 및 고추씨(Capsicum spp. seeds) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물에서,
상기 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물은 1:300 내지 1:500 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 항산화 또는 항염증용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 빌베리 추출물은,
폴리페놀, 플라보노이드, 아스코르브 산 및 안토시아닌 중 1 종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염증용 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 안토시아닌은,
Delphinidin-3-galactoside chloride, delphinidin 3-glucoside chloride, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-glucoside, petunidin-3-glucoside 및 cyanidin-3-arabinoside 중 1 종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염증용 조성물. - 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물 및 고추씨(Capsicum spp. seeds) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 건강기능식품 조성물에서,
상기 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물은 1:300 내지 1:500 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 항산화 또는 항염증용 건강기능식품 조성물. - 삭제
- 제 6 항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염증용 건강기능식품 조성물. - 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물 및 고추씨(Capsicum spp. seeds) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 건강식품 조성물에서,
상기 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물은 1:300 내지 1:500 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 항산화 또는 항염증용 건강식품 조성물. - 삭제
- 제 9 항에 있어서,
상기 건강식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염증용 건강식품 조성물. - 빌베리(Vaccinium myrtillus L.) 추출물 및 고추씨(Capsicum spp. seeds) 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물에서,
상기 빌베리 추출물 및 고추씨 추출물은 1:300 내지 1:500 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물. - 삭제
- 제 12 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 제형에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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2021
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 전은미. 빌베리 (Vaccinium myrtillus L) 추출물의 항산화 및 항염증 효능 평가. 중앙대학교 대학원 석사학위논문. 2019년 1부.* |
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