KR102584685B1

KR102584685B1 - 포도의 형질전환 방법

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Publication number: KR102584685B1
Application number: KR1020200176206A
Authority: KR
Inventors: 김세희; 이한찬; 조강희; 조상윤; 신일섭; 박정관
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2023-10-06
Also published as: KR20220086083A

Abstract

본 발명은 포도 육종을 위한 포도의 형질전환 방법에 관한 것으로, 상기 포도의 형질전환 방법은 아그로박테리움 접종액에 포도 화수를 침지하고 갑압함으로써 형질전환 효율을 효과적으로 향상시킬 수 있어, 포도 육종에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

포도의 형질전환 방법{Method for transformation of grape}

본 발명은 포도 육종을 위한 포도의 형질전환 방법에 관한 것이다.

포도는 식물 분류학상 포도과(Vitaceae) 포도속(Vitis)에 속하는 덩굴성 식물로 북반구의 온대 및 아열대 지역에 분포되어 있으며 발상지에 따라 아시아 서부 원생, 아시아 동부 원생, 북미대륙 원생으로 분류된다. 우리나라에는 아시아 동부 원생에 속하는 왕머루(Vitis amurensis)가 분포하고 있으나, 우리나라에서 재배되는 포도의 대부분은 북미대륙 원생에 속하는 미국 종으로 미국과 일본에서 육성된 품종들이며 특히 캠벨얼리가 재배면적의 70% 이상을 차지하고 있다. 따라서 소비자의 다양한 기호에 부합하는 고품질 포도 품종 육성이 필요한 실정이다.

포도 육종은 야생종 포도를 이용하여 교배 육종으로 창출되는 변이의 폭을 넓히고 있으나 배수성이 다양하고 자식열세 현상이 나타나며, 무핵 품종에서와 같이 종자가 형성되지 않는 경우도 있어서 교배 육종이 쉽지 않다는 문제점이 있다 (Gray DJ and Merdith CP. CAB International Wallingford. 1992). 또한 기존의 포도 신품종 육성에는 10년 이상의 시간과 노동력이 요구되며 목표로 하는 형질의 도입에 어려움이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해서 제시되고 있는 방법으로는 식물생명공학 기술을 이용하여 외래의 유용 유전자를 직접 도입하는 형질전환 방법이 있다. 식물 형질전환 방법으로는 아그로박테리움(Agrobacterium)속의 균을 이용하는 아그로박테리움법, 원형질 상태의 식물세포를 이용하는 프로토플라스트(protoplast)법, 강한 외력을 투사하여 세포에 직접 DNA 등을 주입하는 유전자총(gene gun)법 등이 있다. 아그로박테리움법은 형질전환의 대상이 되는 포도 세포 또는 조직과 아그로박테리움을 공동배양하는 방법으로서 국내에서 형질전환 성공 사례가 보고된 바 없었고, 국외에서 보고된 바에 의하면 품종에 따라 차이가 있지만 5% 내외로 알려져 있다 (한지학 외. 식물형질전환. 정문각. 2007). 유전자총법은 다양한 식물 조직에 적용 가능하며, 실험 수행 기간이 짧다는 이점이 있으나, 그 형질전환 효율이 약 1 ~ 3% 정도로 매우 저조하여 새로운 포도 품종을 개발하는데 적용하기 어렵다는 문제가 있었다 (R. Scorza, et al. Plant Cell Reports. 1995).

이에 따라 포도를 대상으로 한 효과적인 형질전환 방법을 개발하기 위해서는 여전히 많은 연구가 요구되고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0066872호

본 발명은 화수 감압침지법을 이용한 새로운 포도의 형질전환 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 a) 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움을 배양하여 접종액을 준비하는 단계; 및 b) 상기 접종액에 포도 화수를 침지하고 감압하여 형질전환하는 단계를 포함하는 포도의 형질전환 방법에 관한 것이다.

상기 단계들을 자세히 설명하면, 다음과 같다.

상기 a) 단계는 포도에 도입하고자 하는 유전자를 포함하는 아그로박테리움을 제조하기 위한 과정이다.

먼저, 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입할 수 있다.

본 발명에서 사용된 "목적 유전자"는 식물체에 도입될 수 있는 다양한 유전자를 의미한다. 이러한 목적 유전자는 특별히 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 유전자를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 그 일례로는 포도를 포함한 식물, 곤충, 세균, 곰팡이, 바이러스 등에서 유래된 유전자일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "발현 벡터"는 목적 유전자를 전달하여 발현시키는데 최적화된 벡터로서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미하며, 재조합 벡터라고도 한다. 이러한 발현 벡터는 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 요소(element)를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 암호화하는 유전자, 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신 및 하이그로마이신) 또는 이의 내성 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 발현 벡터의 종류는 특별히 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 식물의 형질전환 벡터를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 그 일례로는 pBI계, pPZP계, pSMA계, pUC계, pBR계 등의 플라스미드(plasmid) 벡터이거나 pBI계 등의 바이너리(binary) 벡터 등일 수 있다.

상기 아그로박테리움(Agrobacterium)은 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포도에 전달하는 전달체 역할을 하는 것으로, 당업계에 알려진 아그로박테리움을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens), 아그로박테리움 라이조제네스(A. rhizogenes), 아그로박테리움 비티스(A. vitis), 아그로박테리움 네포튬(A. nepotum), 아그로박테리움 푸센스(A. pusense), 아그로박테리움 살리니톨란스(A. salinitolerans) 및 아그로박테리움 스키에니에비센스(A. skierniewicense)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 본 발명에서는 형질전환 효율을 고려하여 아그로박테리움 투메파시엔스인 것이 바람직하다.

이러한 아그로박테리움에 발현 벡터를 도입하는 과정은 특별히 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 발현 벡터로서 pBI121 벡터에 GUS 유전자 및 NPTⅡ 유전자를 도입한 후 Freeze-thaw 방법에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주에 형질전환하여 접종 균주를 제조하였다.

이후, 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움을 적정 조건에서 배양하여 접종액을 준비할 수 있다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 아그로박테리움에 대한 배양 배지로서 YEP(Yeast Extract Peptone) 배지를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 더 포함할 수 있다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 온도는 아그로박테리움이 충분히 생장할 수 있는 온도 범위일 수 있으며, 예를 들면 20 내지 35℃, 20 내지 30℃, 또는 25 내지 35℃일 수 있다. 배양 기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 12 내지 48시간, 12 내지 36시간, 또는 12 내지 24시간일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "접종액"은 포도의 형질전환을 위해 상기 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 또는 이의 배양액을 포함하는 용액을 의미하며, 본 발명에서는 접종액 또는 아그로박테리움 접종액으로 혼용될 수 있다. 상기 접종액은 아그로박테리움을 안정화할 수 있는 완충액을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 접종 균주를 항생제가 첨가된 액체 YEP 배지에서 28℃, 200 rpm으로 약 18시간 배양하여 OD₆₀₀ 값이 0.8 ~ 1.0인 배양액을 접종액으로 준비하였다.

상기 b) 단계는 아그로박테리움 접종액을 이용하여 포도 화수에 대한 형질전환을 수행하는 과정이다.

본 발명에서 사용된 "형질전환"은 유전자를 숙주(host) 또는 숙주세포 내에 도입하여 숙주 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주 내에서 발현될 수 있으면 숙주의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다. 본 발명에서는 숙주로서 포도 화수를 이용할 수 있다.

상기 포도 화수는 포도 송이를 이루는 꽃 무리로, 개화시기에 포도 화수의 꽃이 1 ~ 3일간 순차적으로 핀다. 포도 꽃은 주로 암술과 수술이 동일한 꽃에 같이 있는 양성화로서 매개 곤충이 필요하지 않으며 자가수정이 가능하다. 이러한 포도 화수 또는 포도 꽃을 대상으로 하는 형질전환은 목적 유전자가 암술 및 수술을 통해 포도의 생식세포로 도입되어 다음 세대로 전달되는 형질전환체를 나타낼 수 있다. 형질전환 효율을 높이기 위해서는 암술과 수술이 노출되는 만개기의 화수를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 포도 화수는 전체 꽃 중 70% 이상 개화한 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 포도 화수의 개화율은 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 85 내지 100%, 90 내지 100%, 또는 95 내지 100%인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 형질전환의 방법은 특별히 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 아그로박테리움 매개 형질전환 방법에 따라 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환의 방법은 아그로박테리움 접종액에 포도 화수를 침지하고 감압하는 화수 감압침지법인 것일 수 있다.

상기 감압침지법은 아그로박테리움 접종액에 포도 화수가 완전히 잠기도록 침지한 후 일정 압력의 진공을 일정 시간 가한 후 순간적으로 압력을 제거하여 압력 차이로 인해 아그로박테리움이 화수의 꽃술 내로 효과적으로 침투할 수 있도록 하는 방법이다.

본 발명에서 사용된 감압 장치는 특별히 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 감압 장치를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 감압은 10 내지 25 기압의 진공을 3 내지 15분간 가한 후 압력을 제거하는 것일 수 있다. 이때 감압 및 시간 조건이 상기 범위에 미치지 못할 경우에는 형질전환이 제대로 일어나지 않으며, 상기 범위를 초과할 경우에는 오히려 형질전환 효율이 감소하며 식물체가 손상되어 정상적인 생장이 어려울 수 있다. 형질전환 효율을 향상시키기 위하여, 15 내지 20 기압의 진공을 5 내지 10분간 가한 후 압력을 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 아그로박테리움 접종액이 담긴 가지 삼각 플라스크에 화수를 완전히 침지한 후 밀봉하여 다양한 압력 및 시간 조건 (1 ~ 20분 및 0 ~ 25 기압)으로 진공을 걸어준 후 압력을 제거하여 아그로박테리움의 침투를 유도한 결과, 화수에 10 ~ 25기압의 진공을 5 ~ 15분간 가한 후 제거한 경우에는 약 3% 이상의 형질전환율을 나타냈으며, 특히 화수에 15 ~ 20 기압의 진공을 5 ~ 10분간 가한 후 제거한 경우에는 형질전환율이 최소 17%, 최대 31%인 것으로 나타나, 종래 포도의 형질전환 방법에 비해 형질전환율이 향상된 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 포도의 형질전환 방법은 아그로박테리움 접종액에 포도 화수를 침지하고 갑압함으로써 형질전환 효율을 효과적으로 향상시킬 수 있어, 포도 육종에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 포도 형질전환에 사용된 pBI121 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 포도 화수에 대한 감압침지법을 이용한 형질전환의 순서를 나타낸 사진이다. (a)는 아그로박테리움 접종액에 닿지 않는 화수 윗부분을 제거한 사진이며, (b)는 가운데 홈이 있는 플라스크 마개 사이에 줄기를 넣고 화수를 아그로박테리움 접종액에 침지한 사진이며, (c)는 아그로박테리움 접종액이 담긴 플라스크를 마개로 밀봉한 후 감압 처리하는 사진이며, (d) ~ (f)는 감압 처리한 지 11, 31, 97일 후 과실이 맺힌 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 캠벨얼리 화수의 형질전환 여부를 GUS 발현 분석으로 확인한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환된 포도의 종자를 재배한 순서를 나타낸 사진이다. (a)는 포도 증식배지가 담긴 시험관에 종자를 파종하여 신초로 생장될 때까지 육묘한 사진이며, (b)는 뿌리가 발달된 식물체를 상토에 이식한 사진이며, (c)는 묘종을 화분에서 6개월간 재배한 식물체의 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 캠벨얼리 화수의 형질전환 여부를 gDNA PCR 분석으로 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 캠벨얼리의 형질전환

1-1. 아그로박테리움 접종액의 제조

캠벨얼리의 형질전환을 위하여, 발현 벡터 및 이를 포함하는 아그로박테리움을 제조하였다.

발현 벡터로는 식물 형질전환 벡터인 pBI121 벡터를 사용하여 원하는 유전자를 도입하였다. 도 1을 참조하면, pBI121 벡터의 식물체로 삽입되는 T-DNA에 선발표지 마커로서 NPTII 유전자 (Vancanneyt et al. Mol Gen Genet. 1990)를 넣은 발현 카세트(expression cassette), CaMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터(promoter) (Jach et al. Plnat J. 1995) 및 β-글루쿠로니다아제(glucuronidase, GUS) 리포터 유전자를 도입하였다.

아그로박테리움으로서 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 균주를 사용하였다 (Hoekema et al. Nature. 1983).

Freeze-thaw 방법 (Burrow et al. Plant Mol Biol Rep. 1990)에 따라 LBA4404 균주에 pBI121 발현 벡터를 도입하였다. 자세히 설명하면, LBA4404 균주 100 ㎕에 pBI121 발현 벡터 10 ㎕를 첨가하여 얼음 위에서 30분간 반응시켰다. 이후, 액체질소에서 1분간 급속하게 얼리고서 바로 37℃의 heat-block에서 5분 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 1 ㎖의 액체 YEB 배지 (Nutrient broth 13.3 g/L, Yeast extract 1.0 g/L, Sucrose 5 g/L 및 MgSO₄ 0.24 g/L (pH 7.5) 함유)를 첨가하여 아그로박테리움을 28℃, 200 rpm에서 4시간 배양하였다. 배양 후 3,000 rpm, 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 회수된 아그로박테리움을 100 ㎕의 액체 YEP 배지에 재현탁하였다. 재현탁된 아그로박테리움을 항생제 (Rifampicin 100 mg/L, Streptomycin 300 mg/L 및 Kanamycin 50 mg/L 함유)가 첨가된 고체 YEP 배지 (Nutrient broth 13.3 g/L, Yeast extract 1.0 g/L, Sucrose 5 g/L, MgSO₄ 0.24 g/L (pH 7.5) 및 agar 10 g/L 함유)에 도포하여 28℃ 배양기에서 2일간 배양하여 군락을 이루며 자란 아그로박테리움 콜로니(colony)를 선발하였다.

선발된 아그로박테리움을 항생제 (Rifampicin 100 mg/L, Streptomycin 300 mg/L 및 Kanamycin 50 mg/L 함유)가 첨가된 액체 YEP 배지 50 mL에 첨가하여 28℃, 200 rpm에서 약 18시간 정도 배양하여 OD₆₀₀ 값이 0.8 ~ 1.0인 배양액을 접종액으로 준비하였다.

1-2. 형질전환

비닐하우스 (기온 25 ~ 28℃, 습도 40 ~ 60%)에서 재배하여 전체 개화율이 70% 이상인 캠벨얼리 화수에 대해 감압침지법으로 형질전환을 수행하였다.

도 2를 참조하면, 가지 삼각 플라스크에 준비된 접종액 200 mL을 넣고, 플라스크의 코르크 마개 가운데를 잘라 홈을 내어 꽃송이 줄기를 끼운 후 꽃송이가 접종액에 완전히 잠기도록 하고 마개를 끼워 플라스크를 밀봉하였다. 이때 용액에 닿지 않는 꽃송이 윗부분을 제거하였다. 이후, 플라스크의 가지에 호스를 연결하여 1, 5, 10, 15 또는 20분간 0, 5, 10, 15, 20 또는 25기압으로 진공을 걸어준 후 압력을 순간적으로 제거하여 아그로박테리움이 꽃술 내로 효과적으로 침투하도록 하였다.

이후, 플라스크에서 꽃송이를 꺼내어 종이 타올로 과도한 접종액을 제거하였고, 과실을 수확할 때까지 일반적인 캠벨얼리 관리 방법으로 재배하였다. 과실은 접종 후 11일째 확인되었다.

실험예 1. 캠벨얼리의 유전자 도입 확인

형질전환이 유도된 포도 화수에서 과실을 수확한 후 과실 1 ~ 5 개는 GUS 발현을 확인하는데 이용하였고, 나머지 과실은 종자를 분리하여 멸균수로 3회 이상 세척한 후 냉장실 (4℃에서 층적저장법으로 2개월 이상 보관하여 식물체를 양성하는데 이용하였다.

1-1. GUS 발현 분석

과실을 37℃에서 5-bromo-4-chloro-3-indole-glucuronidase 용액에 침지시켰다 (Jefferson et al. EMBO J. 1987). 침지 24시간 후 destaining 용액 (70% EtOH 및 1% glacial acetic acid 함유)으로 탈색시켜 GUS 양성반응을 나타낸 과실을 조사하였다. 대조구로는 감압침지법에 사용하지 않은 식물체의 과실을 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 경우에는 조직과 종자 전체가 GUS 염색되어 청록색을 띄는 반면, 형질전환되지 않은 경우에는 조직 전체가 백색으로 탈색되었다.

이러한 GUS 발현 분석 결과를 바탕으로 압력 및 시간 조건에 따른 형질전환 효율을 계산하였다.

	0기압	5기압	10기압	15기압	20기압	25기압
1분	0%	0%	0%	0%	0%	0%
5분	0%	3.6±3.17%	9.3±3.28%	17.8±7.96%	31.7±9.43%	11.1±4.71%
10분	0%	3.7±3.23%	9.8±4.13%	18.9±1.18%	21.3±8.71%	5.9±0.35%
15분	3.5±3.03%	5.4±5.27%	7.6±2.61%	8.2±3.07%	6.2±0.56%	3.4±2.96%
20분	5.3±0.28%	7.0±2.58%	5.5±0.45%	5.4±0.45%	5.5±0.45%	1.7±2.89%

그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 화수에 10 ~ 25기압의 진공을 5 내지 15분간 가한 후 압력을 제거할 때 종래 포도의 형질전환율 (1 ~ 3%)과 유사하거나 그보다 높은 형질전환율을 보였으며, 특히 15 ~ 20 기압 및 5 ~ 10분의 조건에서는 압력에 의한 식물체 손상 없이 우수한 형질전환율이 나타났다.

1-2. gDNA PCR 분석

GUS 발현 분석에 사용하지 않은 남은 과실의 종자 10개를 선택하여 재배한 후 gDNA PCR을 수행하였다.

먼저, 시험관에 포도 증식배지 (MS 4.4 g/L, Sucrose 30 g/L, BA 0.1 mg/L, IBA 0.1 mg/L 및 plant agar 10 g/L 함유, pH 5.8)를 넣고 형질전환된 종자를 각각 파종하여 25℃에서 배양하면서 발아 후 신초 생장까지 관찰하였다. 뿌리가 발달된 식물체는 시험관에서 꺼내어 뿌리에 증식배지가 남지 않도록 멸균수로 세척한 후 각각 상토에 이식하여 실온에서 한달간 재배하고 분갈이하여 6개월간 재배하였다. 대조구로는 감압침지법에 사용하지 않은 식물체의 종자를 사용하였다 (도 4 참조).

재배된 식물체에서 잎 200 g을 채취하여 액체 질소로 급격하게 얼린 후 Tissue LyserⅡ (QIAGEN)를 사용하여 분쇄하고, DNeasy Plant Minikit (QIAGEN)의 제조사 매뉴얼에 따라 각 식물체의 genomic DNA를 추출하였다. genomic DNA를 주형으로 하기 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다 (Dyad Thermal cycler, BIO-RAD). PCR 수행 조건은 95℃에서 5분 반응 (pre-denaturation)한 후 95℃에서 30초, 55℃에서 20초 및 72℃에서 30초로 30회 반복하고, 72℃에서 5분 반응 (post-extension)하였다. PCR 증폭 산물은 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용한 전기영동으로 확인하였다.

프라이머 명칭	프라이머 서열 (5' > 3')	PCR 증폭 산물 크기
NPTII-F	GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG	600 bp
NPTII-R	ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA	600 bp

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 종자에서 발아한 식물체는 모두 NPTⅡ 유전자를 포함하는 것으로 나타났다.

실시예 2. 흑보석의 형질전환

포도 품종으로 캠벨얼리 대신 흑보석을 사용한 경우를 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 형질전환을 수행하였다.

형질전환이 유도된 포도 과실을 수확하여 실험예 1과 동일한 방법으로 GUS 발현 분석과 gDNA PCR 분석을 실시하였다.

그 결과, 흑보석의 형질전환율은 켐벨얼리와 유사한 패턴으로 나타났으며, 20기압 및 5분 조건에서 가장 우수한 형질전환율 (30.0±2.93%)을 나타냈다.

실시예 3. 거봉의 형질전환

포도 품종으로 캠벨얼리 대신 거봉을 사용한 경우를 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 형질전환을 수행하였다.

그 결과, 거봉의 형질전환율은 켐벨얼리와 유사한 패턴으로 나타났으며, 20기압 및 5분 조건에서 가장 우수한 형질전환율 (23.3±5.11%)을 나타냈다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

a) 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움을 배양하여 접종액을 준비하는 단계; 및
b) 상기 접종액에 포도 화수를 완전히 잠기도록 침지하고 감압하여 형질전환하는 단계;를 포함하는 포도의 형질전환 방법으로서,
상기 b) 단계의 감압은 15 내지 20 기압의 진공을 5 내지 10분간 가한 후 압력을 순간적으로 제거하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 a) 단계의 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens), 아그로박테리움 라이조제네스(A. rhizogenes), 아그로박테리움 비티스(A. vitis), 아그로박테리움 네포튬(A. nepotum), 아그로박테리움 푸센스(A. pusense), 아그로박테리움 살리니톨란스(A. salinitolerans) 및 아그로박테리움 스키에니에비센스(A. skierniewicense)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 b) 단계의 포도 화수는 전체 꽃 중 70% 이상 개화한 것인, 방법.
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