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KR102565256B1 - Hla 기반 방법 및 조성물, 및 이들의 용도 - Google Patents

Hla 기반 방법 및 조성물, 및 이들의 용도 Download PDF

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KR102565256B1
KR102565256B1 KR1020197026477A KR20197026477A KR102565256B1 KR 102565256 B1 KR102565256 B1 KR 102565256B1 KR 1020197026477 A KR1020197026477 A KR 1020197026477A KR 20197026477 A KR20197026477 A KR 20197026477A KR 102565256 B1 KR102565256 B1 KR 102565256B1
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KR
South Korea
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hla
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peptide
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cells
Prior art date
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KR1020197026477A
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KR20200015454A (ko
Inventor
제니퍼 그레이스 아베린
롭 칼 오스룬드
니르 하코헨
도미닉 바셀미
마이클 루니
Original Assignee
바이오엔테크 유에스 인크.
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Publication date
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Abstract

본 개시는 세포로부터 HLA-펩타이드를 단리하는 조성물 및 방법을 개시한다. 본 개시는 임의의 가능한 클래스 I 또는 II 구축물을 발현하는 세포주로부터의 내생적으로 제시된 HLA-펩타이드의 확인을 가능하게 하는, HLA-펩티돔(peptidome)을 프로파일링하는 보편적 플랫폼 및 방법을 제공한다.

Description

HLA 기반 방법 및 조성물, 및 이들의 용도
교차참조
본원은 전체로서 본원에 참고로 각각 도입된, 2017년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/457,978호, 및 2017년 2월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/461,162호에 대한 우선권을 주장한다.
주조직적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex)는 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자를 코딩하는 유전자 복합체이다. HLA 유전자는 인간 세포의 표면에서 순환 T 세포에게 제시되는 단백질 이종이량체로서 발현된다. HLA 유전자는 그 자신이 후천성 면역 시스템을 미세하게 조정할 수 있도록 높은 다형성을 가진다. 후천성 면역 반응은 부분적으로 인간 백혈구 항원(HLA) 이종이량체에 결합된 질환 관련 펩타이드 항원을 표시하는 세포를 확인하고 제거하는 T 세포의 능력에 의존한다.
인간에서, 내생성 단백질 및 외생성 단백질은 프로테아좀(proteasome), 및 세포질 및 엔도좀/라이소좀 프로테아제(protease) 및 펩티다제(peptidase)에 의해 펩타이드로 프로세싱될 수 있고, MHC에 의해 코딩된 두 클래스의 세포 표면 단백질들에 의해 제시될 수 있다. 이 세포 표면 단백질들은 인간 백혈구 항원(HLA 클래스 I 및 클래스 II)으로서 지칭되고, 이들에 결합하여 면역 반응을 이끌어내는 펩타이드 군은 HLA 에피토프로서 지칭된다. HLA 에피토프는 면역 시스템이 위험 신호, 예컨대, 자신의 병원체 감염 및 형질전환을 검출할 수 있게 하는 핵심 성분이다. 순환 CD8+ T 세포는 내생성 프로세싱 경로로부터 유래되고 거의 모든 유핵 세포들에 표시되는 클래스 I MHC(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C) 에피토프를 인식한다. CD4+ T 세포는 항원 제시 세포(APC), 예컨대, 수지상 세포 및 대식세포에 표시된 클래스 II MHC(HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP) 에피토프를 인식한다. HLA 클래스 II-펩타이드 제시는 헬퍼 T 세포를 활성화시켜, 나중에 B 세포 분화 및 항체 생성뿐만 아니라 CTL 반응도 촉진한다. 활성화된 헬퍼 T 세포는 다른 T 세포의 분화를 활성화시키고 유도하는 사이토카인 및 케모카인도 분비한다.
HLA 이종이량체를 코딩하는 유전자는 인간 집단 전체에 걸쳐 12,000종 초과의 클래스 I 및 4,000종 초과의 클래스 II 대립유전자 변이체들이 확인될 정도로 높은 다형성을 가진다. 모 및 부 HLA 일배체형으로부터, 개체는 클래스 I HLA 좌위 및 클래스 II HLA 좌위 각각에 대한 상이한 대립유전자를 유전할 수 있다. 클래스 I HLA 분자는 클래스 I HLA 유전자에 의해 코딩된 중쇄 α쇄 및 β-2-마이크로글로불린(B2M)으로 구성된 이종이량체이다. 클래스 II HLA 분자는 둘 다 클래스 II HLA 유전자에 의해 코딩된 α쇄 및 β쇄 이종이량체이다. α쇄 및 β쇄 페어링 조합 때문에, HLA 이종이량체의 집단은 매우 복잡하다. 추가로, 각각의 HLA 이종이량체는 대립유전자 특이적 결합 선호도로 수천 개의 펩타이드들에 결합하는 것으로 추정된다. 실제로, 각각의 HLA 대립유전자는 약 1,000개 내지 10,000개의 고유 펩타이드들에 결합하여 이들을 T 세포에게 제시하는 것으로 추정되는데; 이때 약 1,000만 개의 잠재적 9머 펩타이드들의 0.1% 이하가 인간 단백질 코딩 유전자로부터 유래한다. HLA 결합에 있어서 이러한 다양성을 고려할 때, 펩타이드가 특정 HLA 대립유전자에 결합할 가능성이 있는지를 정확히 예측하는 것은 매우 어렵다. α쇄 및 β쇄 페어링의 불균질성, 코어 결합 에피토프를 신뢰할만하게 배정하는 능력을 제한하는 데이터의 복잡성, 및 고해상 생화학적 분석을 위해 요구된 면역침전 등급의 대립유전자 특이적 항체의 결여 때문에 HLA 클래스 II 분자의 대립유전자 특이적 펩타이드 결합 특성에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 더욱이, 소정의 HLA 대립유전자로부터 유래한 펩타이드 에피토프를 분석하는 것은 다수의 HLA 대립유전자들이 세포 표면에 제시될 때 모호성을 증가시킨다.
모든 HLA 이종이량체의 결합 선호도를 이해하는 것은 어느 신생항원이 종양 특이적 T 세포 반응을 이끌어낼 가능성이 있는지를 성공적으로 예측하는 데 있어서 핵심이다. 분명한 것은 특정 클래스 I HLA-회합된 펩타이드 및 클래스 II HLA-회합된 펩타이드(예를 들면, 신생항원 펩타이드)를 확인하고 단리하는 방법에 대한 필요성이 있다는 것이다. 이러한 방법 및 단리된 분자는 예를 들면, HLA-회합된 펩타이드의 연구에 유용할 뿐만 아니라, 면역 기반 치료제를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 치료제의 개발에도 유용하다.
참고에 의한 도입
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허들 및 특허출원들은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 도입되는 것으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 매우 다양한 적용분야에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 면역원성 항원 펩타이드를 확인하는 데 사용될 수 있고, 약물, 예컨대, 맞춤형 의약 약물을 개발하는 데 사용될 수 있다.
본원은 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 이 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 단계; 세포의 집단의 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 및 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 단계를 포함하는, HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 가용성 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드를 특징화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 2개 이상의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들에 대해 상기 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 2개 이상의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 분비되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 발현될 때 세포막에 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체가 아니다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 단일 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 펩타이드에 작동적으로 연결된 상이한 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 상이한 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 하나 이상의 세포를 각각 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 및 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분을 특징화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 펩타이드를 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을 하나 이상의 펩타이드와 접촉시키거나 세포의 집단에서 하나 이상의 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 RNA이고, 임의로 RNA는 mRNA이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 서열을 결정하고 임의로 펩타이드 또는 이의 부분이 변형되어 있는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석, 질량 분광측정 분석, MS 분석, MS/MS 분석, LC-MS/MS 분석 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 결합 친화성 또는 안정성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에서 펩타이드와 HLA 분자의 회합을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 폴리펩타이드 약물, 예컨대, 생물제제(예를 들면, 항체 약물)로부터 유래한 펩타이드의 라이브러리를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암, 감염성 물질에 의한 감염, 또는 자가면역 반응이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 폴리펩타이드 약물, 예컨대, 생물제제(예를 들면, 항체 약물) 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체로부터의 하나 이상의 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함하고, 임의로 이때 상기 펩타이드는 감염성 물질 또는 폴리펩타이드 약물의 하나 이상의 표적 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 폴리펩타이드 약물의 하나 이상의 표적 단백질로부터의 펩타이드의 하나 이상의 영역을 특징화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질로부터 유래한 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 일차 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 질환 또는 질병을 가진 대상체에 매칭된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드는 항원 제시 세포에 의해 제시될 때 대상체로부터의 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체를 비-암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체와 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 복수의 세포의 집단들을 포함하고, 이때 각각의 세포의 집단은 상이한 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 복수의 세포의 집단들의 각각의 세포의 집단은 동일한 또는 별개의 용기 내에 있다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 특징화하는 단계 전에 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA-펩타이드 복합체는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 HLA-펩타이드 복합체는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 세포 배양의 배지로부터 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 예를 들면, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 HLA, 예컨대, 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 함유하는 비드 또는 컬럼을 사용함으로써 단리될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 함유하는 컬럼을 사용함으로써 단리된다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드의 말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-아웃(knock-out)이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 I HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 II HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA 클래스 II α쇄, HLA 클래스 II β쇄, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩한다.
일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들 중 하나 이상은 제1 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결되고, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들 중 하나 이상은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들 각각은 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 친화성 태그를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 동일한 또는 상이한 친화성 수용체 펩타이드에 작동적으로 연결된 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 제2 다중핵산을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 외로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 위치한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 내로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 내부 서열, 예컨대, 유연한 루프 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그(bluetongue) 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase)(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(ketosteroid isomerase)(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제(luciferase) 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신(Thioredoxin)-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 소르타제(sortase) 태그, 비드에의 공유 펩타이드 결합을 형성하는 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는 태그 서열을 포함하고; 임의로, 이때 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부(repeat)들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 바이오틴에 결합하는 분자를 포함한다. 예를 들면, 친화성 분자는 다른 유기체로부터의 단백질 상동체를 포함하는, 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 고체 표면은 비드이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자로 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 N-말단 부분에 특이적인 항체 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을 다중핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 접촉시키는 단계는 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을, 다중핵산을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태들에서, 다중핵산은 세포의 집단의 게놈 내로 안정하게 삽입된다.
일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드와 상이하고 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑(skipping) 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석 또는 질량 분광측정, 예컨대, 탠덤 질량 분광측정을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 하나 이상의 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에 상응하는 펩타이드 서열을 펩타이드 데이터베이스로부터 수득하는 단계를 포함하고; 이때 수득된 하나 이상의 서열은 하나 이상의 펩타이드의 서열을 확인시켜준다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드 데이터베이스는 예컨대, 변형 데이터베이스를 갖지 않거나 변형 데이터베이스를 가진 비-효소 특이성 펩타이드 데이터베이스이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 역전된-데이터베이스 검색 기법을 이용하여 펩타이드 데이터베이스를 검색하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 인간 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 마우스 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 CHO 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO 및 THP1로부터 선택된 세포주이다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 사이토카인, 체크포인트 억제제, 후성적 활성 약물, IFN-γ, 항원 프로세싱을 변경시키는 물질(예컨대, 펩티다제 억제제, 프로테아좀 억제제 및 TAP 억제제), 또는 이들의 조합으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 대사 경로 또는 대사 상태를 조절하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 세포 프로테옴을 조절하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 세포 발현 또는 전사를 조절하거나 조정하는 하나 이상의 시약(예를 들면, AIRE 또는 CREB 결합 단백질 또는 이의 조절제)으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 전사 인자를 조절하거나 조정하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 HLA의 세포 발현 또는 전사를 조절하거나 조정하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 프로테옴의 세포 발현 또는 전사를 조절하거나 조정하는 하나 이상의 시약으로 처리된다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 105개의 세포들, 적어도 106개의 세포들 또는 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 수지상 세포, 대식세포, 암 세포 또는 B 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 종양 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 세포로부터 상기 HLA-펩타이드 복합체를 단리하기 전에 물질과 접촉된다. 일부 실시양태들에서, 상기 물질은 염증 사이토카인, 화학 물질, 보강제, 치료제 또는 방사선이다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 발현에 대해 어세이하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 어세이하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 시퀀싱하는 단계, 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 RNA를 검출하는 단계, 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질을 검출하는 단계, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 발현에 대해 어세이하는 단계는 웨스턴 블롯 어세이, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 질량 분광측정(MS), 마이크로어레이 하이브리드화 어세이, RNA-seq 어세이, 중합효소 연쇄 반응 어세이, LAMP 어세이, 리가제 연쇄 반응 어세이, 서던 블롯 어세이, 노던 블롯 어세이 또는 효소-연결된 면역흡착 어세이(ELISA)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 상이한 HLA 대립유전자들에 대해 본 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 각각의 상이한 HLA 대립유전자는 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 상이한 HLA 대립유전자를 코딩하는 각각의 다중핵산은 고유 바코드 서열을 포함한다.
본원은 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스를 제공한다. 본원은 매번 상이한 HLA 대립유전자를 사용하여 본원에 기재된 방법을 반복적으로 수행함으로써 수득된 2개 이상의 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스의 조합을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드 서열 데이터베이스 또는 본원에 기재된 조합으로 기계(machine)를 훈련(training)시키는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하기 위한 예측 알고리즘을 생성하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 기계는 하나 이상의 선형 모델(linear model), 지지 벡터 기계(support vector machine), 결정 트리(decision tree) 및 신경망(neural network)을 겸비한다. 일부 실시양태들에서, 기계를 훈련시키는 데 사용된 변수는 펩타이드 서열, 아미노산 물성, 펩타이드 물성, 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준, 단백질 안정성, 단백질 번역 속도, 유비퀴틴화 부위, 단백질 분해 속도, 리보좀 프로파일링으로부터의 번역 효율, 단백질 절단가능성, 단백질 국소화, TAP 수송을 용이하게 하는 숙주 단백질의 모티프, 자가포식되는 숙주 단백질, 리보좀 지체(stalling)에 유리한 모티프, 및 NMD에 유리한 단백질 특징으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변수를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 리보좀 지체에 유리한 모티프는 폴리프롤린 또는 폴리라이신 스트레치(stretch)를 포함한다. 일부 실시양태들에서, NMD에 유리한 단백질 특징은 긴 3' UTR, 마지막 엑손:엑손 연접부로부터 업스트림 쪽으로 50개 초과의 핵산만큼 떨어져 있는 정지 코돈, 및 펩타이드 절단가능성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원은 HLA 대립유전자에 대해 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 펩타이드 서열 데이터베이스에 의해 훈련된 기계로 펩타이드의 서열을 분석하는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 이때 상기 공급원 단백질 발현은 기계에 의해 사용된 예측 변수이다. 일부 실시양태들에서, 발현 수준은 공급원 단백질의 양 또는 상기 공급원 단백질을 코딩하는 RNA의 양을 측정함으로써 측정된다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 각각 코딩하는 2개 이상의 서열들을 포함하는 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 상이한 재조합 HLA 클래스 I α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 각각 포함하는 2개 이상의 서열들을 포함하는 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 재조합 HLA 클래스 II α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 재조합 다중핵산은 단리된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 분자를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 동일한 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 상이한 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 2개 이상의 친화성 수용체 펩타이드들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 3개 이상의 서열들을 포함하고, 이때 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 3개 이상의 서열들 중 적어도 2개의 서열들은 동일한 친화성 수용체 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 2개 이상의 친화성 수용체 펩타이드들은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들 각각에 고유하다.
일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 친화성 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 재조합 다중핵산들 중 2개 이상의 재조합 다중핵산들의 경우, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열은 세포의 게놈 내로 안정하게 삽입된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 HA 태그를 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 HLA 및 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
본원은 본원에 기재된 조성물의 다중핵산에 의해 코딩된 2개 이상의 단리된 폴리펩타이드 분자들을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 다중핵산에 의해 코딩된 2개 이상의 폴리펩타이드 분자들을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는, 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 조성물은 환자의 HLA 유형에 특이적인 펩타이드 또는 이 펩타이드를 코딩하는 다중핵산을 사용함으로써 제제화된다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 2개 이상의 다중핵산들로 2개 이상의 세포들을 형질도입하거나 형질감염시키는 단계를 포함하는 세포의 제조 방법을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드를 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 세포는 HLA-펩타이드 복합체로서 펩타이드를 제시한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 면역 반응은 T 세포 면역 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 CD8 T 세포 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 CD4 T 세포 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응이다.
본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태들에서, 질환은 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염성 물질은 병원체, 임의로 바이러스 또는 세균, 또는 기생충이다.
일부 실시양태들에서, 바이러스는 BK 바이러스(BKV), 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 림프구친화성 바이러스(HTLV-1), 인플루엔자 바이러스, RSV, HPV, 광견병, 볼거리 풍진 바이러스, 폴리오바이러스, 황열, A형 간염, B형 간염, 로타바이러스, 수두 바이러스, 인간 유두종바이러스(HPV), 천연두, 대상포진 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 세균은 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 트로페리마 휘플레이(Tropheryma whipplei), 마이코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis) 및 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 장티푸스, 폐렴구균, 수막염구균, 해모필루스 B, 탄저병, 파상풍 톡소이드, 수막염구균 군 B, bcg, 콜레라 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 기생충은 연충 또는 원생동물이다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 레이쉬마니아(Leishmania) 종, 플라스모듐(Plasmodium) 종, 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 트리쿠리스 트리키우라(Trichuris trichiura), 넥카터 아메리카누스(Necator americanus), 스키스토소마(Schistosoma) 종 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원은 재조합 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 재조합 HLA에 작동적으로 연결된 친화성 수용체 펩타이드를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계; 및 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계를 포함하는, 면역원성 펩타이드를 농축하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 면역원성 펩타이드의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 LC-MS/MS를 이용하는 단계를 포함한다.
본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본원은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터 유래한 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 코딩하는 다중핵산을 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하여 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현시켜서, 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하고 특징화하는 단계; 및 임의로, 특징화를 기반으로 치료제를 개발하는 단계를 포함하는, 질환 또는 질병을 가진 대상체를 위한 치료제를 개발하는 방법을 제공한다.
본원은 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원을 확인하고 상기 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원을 포함하는 대상체 특이적 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 대상체가 질환을 갖고 상기 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원이 대상체 및 대상체의 질환에 특이적이고, 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터 유래한 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 코딩하는 다중핵산을 상기 대상체로부터의 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하여 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현시켜서, 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 상기 하나 이상의 세포로부터 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 상기 대상체 및 상기 대상체의 질환에 특이적인 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 면역원성 펩타이드를 확인하는 단계; 및 확인된 하나 이상의 대상체 특이적 면역원성 펩타이드를 기반으로 대상체 특이적 면역원성 조성물을 제제화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 치료제 또는 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드, 또는 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 치료제 또는 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 수용체를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 또 다른 치료제, 임의로 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 보강제, 임의로 폴리-ICLC를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환이다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염은 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염성 물질은 병원체, 바이러스, 세균 또는 기생충이다.
일부 실시양태들에서, 바이러스는 BK 바이러스(BKV), 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 림프구친화성 바이러스(HTLV-1), 인플루엔자 바이러스, RSV, HPV, 광견병, 볼거리 풍진 바이러스, 폴리오바이러스, 황열, A형 간염, B형 간염, 로타바이러스, 수두 바이러스, 인간 유두종바이러스(HPV), 천연두, 대상포진 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 세균은 클렙시엘라 종, 트로페리마 휘플레이, 마이코박테리움 레프라, 마이코박테리움 레프로마토시스 및 마이코박테리움 튜버큘로시스, 장티푸스, 폐렴구균, 수막염구균, 해모필루스 B, 탄저병, 파상풍 톡소이드, 수막염구균 군 B, bcg, 콜레라, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 기생충은 연충 또는 원생동물이다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 레이쉬마니아 종, 플라스모듐 종, 트리파노소마 크루지, 아스카리스 룸브리코이데스, 트리쿠리스 트리키우라, 넥카터 아메리카누스, 스키스토소마 종, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원은 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA들을 코딩하는 상기 서열이 제1 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 재조합 서열, 및 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 재조합 서열을 포함하는 것인 단계; 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포들 중 적어도 하나의 세포에서 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 HLA들을 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계; 및 확인된 하나 이상의 펩타이드를 기반으로 면역원성 조성물을 제제화하는 단계를 포함하는, 질환 또는 질병을 가진 대상체를 위한 치료제를 개발하는 방법으로서, 상기 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자가 대상체의 HLA 일배체형에 매칭되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 대상체는 질환 또는 질병을 갖는다.
일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자와 상이하다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 동일하다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 배출되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 발현될 때 세포막에 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체가 아니다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 외생성 펩타이드를 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을 하나 이상의 외생성 펩타이드와 접촉시키거나 세포의 집단에서 하나 이상의 외생성 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을, 하나 이상의 외생성 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 RNA이고, 임의로 RNA는 mRNA이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석, 질량 분광측정 분석, MS 분석, MS/MS 분석, LC-MS/MS 분석, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 결합 친화성 또는 안정성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에서 펩타이드와 HLA 분자의 회합을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암 또는 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체로부터의 하나 이상의 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함하고, 임의로 이때 상기 펩타이드는 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터의 펩타이드의 하나 이상의 영역을 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질로부터 유래한 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 일차 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드는 항원 제시 세포에 의해 제시될 때 대상체로부터의 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 병든 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체를 병들지 않은 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체와 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 확인하는 단계 전에 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 집단에 의해 정상적으로 발현되는 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넛-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열은 클래스 I HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 클래스 I HLA 대립유전자이고, 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 클래스 I HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열은 클래스 II HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA 클래스 II α쇄, HLA 클래스 II β쇄, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 클래스 II HLA 대립유전자이고, 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자에 포함된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 코딩된 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 외로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 세포 내로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는 태그 서열을 포함하고; 임의로, 이때 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 분자를 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 친화성 분자는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 고체 표면은 비드이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자로 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 N-말단 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을 다중핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 접촉시키는 단계는 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을, 다중핵산을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태들에서, 다중핵산은 세포의 집단의 게놈 내로 안정하게 삽입된다.
일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 HLA 클래스 I α쇄이고, 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 HLA 클래스 I α쇄이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 링커에 의해 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제3 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및 제2 친화성 수용체 펩타이드와 상이하다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄 및/또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 제1 HLA 클래스 II α쇄 및 제2 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 클래스 II α쇄 및 제2 HLA 클래스 II α쇄 HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 제1 HLA 클래스 II β쇄 및 제2 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 클래스 II β쇄 및 제2 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄 또는 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열은 제3 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 상이하다.
일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드와 상이하고, 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 생화학적 분석 또는 질량 분광측정, 예컨대, 탠덤 질량 분광측정을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 하나 이상의 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에 상응하는 펩타이드 서열을 펩타이드 데이터베이스로부터 수득하는 단계를 포함하고; 이때 수득된 하나 이상의 서열은 하나 이상의 펩타이드의 서열을 확인시켜준다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO 및 THP1로부터 선택된 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포주는 하나 이상의 사이토카인, 체크포인트 억제제, 후성적 활성 약물, IFN-γ, 또는 이들의 조합으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 105개의 세포들, 적어도 106개의 세포들 또는 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 수지상 세포, 대식세포, 암 세포 또는 B 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 종양 세포를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 세포로부터 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체를 단리하기 전에 물질과 접촉된다. 일부 실시양태들에서, 상기 물질은 염증 사이토카인, 화학 물질, 보강제, 치료제 또는 방사선이다.
일부 실시양태들에서, 제1 HLA 대립유전자 및/또는 제2 HLA 대립유전자는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 대립유전자 및/또는 제2 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 발현에 대해 어세이하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 어세이하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 시퀀싱하는 단계, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 RNA를 검출하는 단계, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질을 검출하는 단계, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 고유 바코드 서열을 포함한다.
본 개시의 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 개시의 특징 및 장점은 본 개시의 원리가 이용되는 예시적 실시양태가 기재되어 있는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1a는 보편적 면역정제 및 데이터 생성 파이프라인의 대표적인 개략도이다. 특정 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자(들)가 세포에서 발현되도록 클래스 I 및/또는 클래스 II HLA 분자를, 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 발현하지 않는 세포를 포함하는 임의의 세포에 혼입한다. 유전적으로 조작된 HLA 발현 세포의 집단을 수거하고 용해시키고, 그의 HLA-펩타이드 복합체를 태그부착시키고(예를 들면, 바이오티닐화하고) (예를 들면, 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 이용하여) 면역정제한다. 단일 HLA에 특이적인 HLA-회합된 펩타이드를 그의 태깅된 (예를 들면, 바이오티닐화된) 복합체로부터 용출할 수 있고 평가할 수 있다(예를 들면, 고해상 LC-MS/MS를 이용하여 시퀀싱할 수 있다).
도 1b는 HLA 클래스 II 분자 -DP, -DQ 및 -DR의 구조의 개략도이다. HLA-DR 분자는 불변 α쇄 및 가변 β쇄를 함유하는 이종이량체이다. HLA-DQ 및 HLA-DP 분자는 가변 α쇄 및 가변 β쇄를 함유하는 이종이량체이다.
도 2는 배양된 세포주에서 HLA 클래스 I 및 II를 발현하도록 디자인된 구축물의 대표적인 개략도이다. HLA-A*02:01 구축물은 바이오티닐화 및 면역정제를 위해 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP)를 이용하는 HLA 클래스 I 디자인을 대표한다. HLA-DRB1*11:01은 바이오티닐화 및 면역정제를 위해 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP)를 이용하는 HLA 클래스 II 디자인을 대표한다.
도 3은 HLA 클래스 I 구축물 및 클래스 II 구축물을 발현하는 안정한 세포주를 생성하는 데 사용될 수 있는 예시적 렌티바이러스 벡터의 개략도이다.
도 4a는 보편적 IP 및 LC-MS/MS에 의한 HLA-회합된 펩타이드 시퀀싱을 위한 클래스 I 또는 클래스 II HLA 구축물의 형질감염 기반 도입의 대표적인 개략도이다.
도 4b는 클래스 I 또는 클래스 II HLA 구축물의 형질감염 기반 도입에 이은 선택 과정, 예를 들면, 항생제 내성 유전자의 포함의 대표적인 개략도이다. 그 다음, 선택된 세포는 보편적 IP 및 LC-MS/MS에 의한 HLA-회합된 펩타이드 시퀀싱을 위해 제출될 수 있다.
도 5는 클래스 I HLA 및 클래스 II HLA에 대한 보편적 면역정제의 개략도이다. 세포, 예컨대, HEK293T(인간 배아 신장)는 면역정제를 위한 친화성 태그를 가진 단일 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현하도록 형질감염되거나 형질도입된다. HLA 태깅된 발현 세포를 수거하고 용해시키고, 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 이용하여 그의 HLA-펩타이드 복합체를 바이오티닐화하고 면역정제한다. 단일 HLA에 특이적인 HLA-회합된 펩타이드를 그의 바이오티닐화된 복합체로부터 용출하고 분석한다(예를 들면, 고해상 LC-MS/MS를 이용하여 시퀀싱한다).
도 6a는 모의물(mock), GFP 및 빈 플라스미드 형질감염을, 바이오티닐화 기반 면역침전을 위한 HLA-A*02:01 구축물과 비교하여, HEK293T 세포에서 클래스 HLA 대립유전자의 발현을 입증하는 웨스턴 블롯(항-바이오티닐화)이다.
도 6b는 웨스턴 블롯 분석을 위한 적재 대조군으로서 사용된, 폰소(Ponceau) 염색된 겔이다.
도 6c는 도 6a 및 도 6b에서 영상화된 조작된 HEK293T 세포를 생성하는 데 사용된 클래스 I HLA 구축물의 개략적 표시이다.
도 7a는 클래스 I HLA-BAP 발현 세포 및 클래스 II HLA-BAP 발현 세포 둘 다의 경우 C-말단 및 N-말단 표지부착된 HLA-BAP 바이오티닐화가 10분 이내에 완료된다는 것을 입증하는 바이오티닐화 시간 경과 실험의 웨스턴 블롯(상부) 및 적재 대조군(하부) 영상이다. 결과는 HEK293T 세포에 의해 발현된 클래스 I HLA-BAP 대립유전자 및 클래스 II HLA-BAP 대립유전자의 형질감염 및 바이오티닐화 최적화를 보여준다.
도 7b는 N-말단 및 C-말단 BAP-표지부착된 클래스 I HLA 구축물 및 클래스 II HLA 구축물 둘 다를 발현하는 세포로부터의 항-BAP(상부) 및 적재 대조군(하부)에 대한 웨스턴 블롯이다.
도 7c는 형질감염 및 바이오티닐화 최적화를 위해 사용된 N-말단 및 C-말단 BAP-표지부착된 클래스 I(HLA-A*02:01) 구축물 및 클래스 II(HLA-DRβ*11:01) 구축물 둘 다의 개략적 표시이다.
도 8a는 HEK293T 세포에서 HLA 면역침전을 위해 사용된 바이오티닐화된 클래스 I HLA 구축물 및 클래스 II HLA 구축물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 영상(BAP 표지를 위한 항-스트렙타비딘 및 HA 표지를 위한 항-HA) 및 적재 대조군(폰소 S)이다. 바이오틴의 첨가 전(-바이오틴), 바이오틴의 첨가 후(+바이오틴 투입), 및 바이오티닐화 및 스트렙타비딘 비드를 사용한 후속 풀다운 후(+바이오틴 FT), 용해물을 분석하였다. +바이오틴 FT 레인에서의 신호의 감소는 바이오티닐화된 MHC가 용해물로부터 제거되고 스트렙타비딘 비드에 결합한다는 것을 입증한다.
도 8b는 HeLa(인간 자궁경부암) 세포에서 HLA 면역침전을 위해 사용된 바이오티닐화된 클래스 I HLA 구축물 및 클래스 II HLA 구축물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 영상(BAP 표지를 위한 항-스트렙타비딘 및 HA 표지를 위한 항-HA) 및 적재 대조군(폰소 S)이다. 바이오틴의 첨가 전(-바이오틴), 바이오틴의 첨가 후(+바이오틴 투입), 및 바이오티닐화 및 스트렙타비딘 비드를 사용한 후속 풀다운 후(+바이오틴 FT), 용해물을 분석하였다. +바이오틴 FT 레인에서의 신호의 감소는 바이오티닐화된 MHC가 용해물로부터 제거되고 스트렙타비딘 비드에 결합한다는 것을 입증한다.
도 8c는 A375(인간 악성 흑색종) 세포에서 HLA 면역침전을 위해 사용된 바이오티닐화된 클래스 I HLA 구축물 및 클래스 II HLA 구축물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 영상(BAP 표지를 위한 항-스트렙타비딘 및 HA 표지를 위한 항-HA) 및 적재 대조군(폰소 S)이다. 바이오틴의 첨가 전(-바이오틴), 바이오틴의 첨가 후(+바이오틴 투입), 및 바이오티닐화 및 스트렙타비딘 비드를 사용한 후속 풀다운 후(+바이오틴 FT), 용해물을 분석하였다. +바이오틴 FT 레인에서의 신호의 감소는 바이오티닐화된 MHC가 용해물로부터 제거되고 스트렙타비딘 비드에 결합한다는 것을 입증한다.
도 8d는 Expi293 세포(고밀도 배양 및 단백질 발현을 위해 유전적으로 조작된 인간 배아 신장)에서 HLA 면역침전을 위해 사용된 바이오티닐화된 클래스 I HLA 구축물 및 클래스 II HLA 구축물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 영상(BAP 표지를 위한 항-스트렙타비딘 및 HA 표지를 위한 항-HA) 및 적재 대조군(폰소 S)이다. 바이오틴의 첨가 전(-바이오틴), 바이오틴의 첨가 후(+바이오틴 투입), 및 바이오티닐화 및 스트렙타비딘 비드를 사용한 후속 풀다운 후(+바이오틴 FT) 용해물을 분석하였다. +바이오틴 FT 레인에서의 신호의 감소는 바이오티닐화된 MHC가 용해물로부터 제거되고 스트렙타비딘 비드에 결합한다는 것을 입증한다.
도 9a는 보편적 HLA 면역침전(보편적 IP) 파이프라인을 사용함으로써 단리된 HLA-회합된 펩타이드의 예시적 LC-MS/MS 분석의 막대그래프이다. 보편적 IP 파이프라인에서 사용된 친화성 태깅된 클래스 I HLA 구축물 및 클래스 II HLA 구축물을 발현하는 다양한 유형의 세포들(A375; 회색, HEK293T; 주황색, HeLa; 청색)로부터 확인된 총 고유 HLA-회합된 펩타이드들의 막대 도표 표시가 제시되어 있다.
도 9b는 LC-MS/MS에 의한 클래스 I HLA 단일-대립유전자 펩타이드 프로파일링으로부터의 대표적인 데이터를 보여주는 막대 도표이다. 각각의 막대는 친화성 태깅된 HLA 구축물을 사용한 클래스 I 단일-대립유전자 실험으로부터 확인된 고유 HLA-회합된 펩타이드의 총 수를 나타낸다.
도 9c는 LC-MS/MS에 의한 클래스 II HLA 단일-대립유전자 펩타이드 프로파일링으로부터의 대표적인 데이터를 보여주는 막대 도표이다. 각각의 막대는 친화성 태깅된 HLA 구축물을 사용한 클래스 II 단일-대립유전자 실험으로부터 확인된 고유 HLA-회합된 펩타이드의 총 수를 나타낸다.
도 10a는 보편적 IP 파이프라인을 사용함으로써 발견된 클래스 I HLA-회합된 펩타이드 및 클래스 II HLA-회합된 펩타이드의 특징의 예시적 개략도이다. 보편적 IP 플랫폼을 사용함으로써 단리되고 시퀀싱된 클래스 I HLA-A*02:01-회합된 펩타이드 및 클래스 II HLA-DRβ*11:01-회합된 펩타이드의 예시적 서열 로고 표시가 제시되어 있다.
도 10b는 보편적 IP 파이프라인을 사용함으로써 확인된 클래스 I HLA-회합된 펩타이드(적색; HLA-A*02:01)와 클래스 II HLA-회합된 펩타이드(청색; HLA-DRβ*11:01)를 비교하는 HLA-회합된 펩타이드 길이를 분포를 보여주는 막대그래프이다. 보편적 IP를 사용함으로써 확인된 클래스 I HLA-회합된 펩타이드 및 클래스 II HLA-회합된 펩타이드 둘 다의 길이 분포는 예상된 추세를 따른다.
도 11a는 보편적 IP 파이프라인을 위해 상이한 유형의 세포들에 의해 발현되도록 조작된 클래스 II HLA 구축물의 개략적 표시이다.
도 11b는 내생성 클래스 II HLA α쇄 및 β쇄 서브유닛을 발현하는 세포주에서 도 11a에 표시된 구축물을 발현시킬 때 형성될 수 있는 클래스 II HLA 복합체의 개략적 표시이다. 클래스 II HLA 복합체는 상이한 친화성 핸들(handle)에 의해 각각 태깅된 α쇄와 β쇄 페어링에 의해 형성된다.
도 12a는 도 11b에 묘사된 클래스 II HLA α쇄 및 β쇄 페어링의 데콘볼루션(deconvolution) 및 특정 클래스 II HLA 복합체에의 분명한 펩타이드 결합 배정을 위해 사용될 수 있는 연속 보편적 IP 기법의 개략적 표시이고, 다수의 친화성 태그들을 함유하는 클래스 II HLA 복합체의 연속 보편적 IP의 검증을 입증한다. 이중 친화성 태깅된 클래스 II HLA 구축물을 발현하는 세포를 용해시키고 바이오티닐화하고 항-HA 항체에 커플링된 비드와 함께 항온처리한다. HA 태깅된 서브유닛을 가진 클래스 II HLA 복합체를 단리하고 세척하고 HA 펩타이드(예를 들면, YPYDVPDYA)를 사용하여 용출한다. 그 다음, 용출물을 NeutrAvidin 또는 스트렙타비딘에 커플링된 비드와 함께 항온처리하여, HA 태깅된 및 바이오틴 태깅된 클래스 II HLA 복합체를 단리한다. 그 다음, 이중 태깅된 클래스 II HLA 복합체에 결합된 펩타이드를 용출하고 LC-MS/MS로 시퀀싱한다.
도 12b는 이중 태깅된 HLA-DRB*11:01 구축물을 발현하는 HEK293T에서의 연속 보편적 IP 기법의 웨스턴 블롯 검증이다. 항-HA 항체를 사용하여 연속 농축 과정을 추적한다. 적재 대조군(폰소 S 염색된 겔)이 표시되어 있다.
도 12c는 예시적 음성 대조군 실험으로부터의 결과를 나타내고, 이때 이중 친화성 태깅된 클래스 II HLA 구축물 HLA-DRB*11:01을 발현하는 세포를 용해시켰고 바이오티닐화 없이 항-HA 항체에 커플링된 비드와 함께 항온처리하였다. 웨스턴 블롯 및 적재 대조군(폰소 S 염색된 겔)은 연속 보편적 IP 파이프라인의 특이성을 입증하는 것으로 확인된다. 바이오티닐화 단계를 연속 보편적 IP 프로토콜로부터 제거하였을 때 농축은 관찰되지 않았다.
도 13은 코어 결합 에피토프의 확인을 가능하게 하는 개요 HLA 클래스 II 트리밍(trimming) 실험의 개략적 표시이다. HLA 클래스 II 분자는 동일한 공급원 단백질로부터 생성된, 길이가 통상적으로 12개 내지 18개 아미노산인 네스티드 세트의 펩타이드들에 결합한다. 더 긴 펩타이드는 HLA 클래스 II 분자의 N-말단 및 C-말단 쪽으로부터 돌출되는 반면, 코어 에피토프는 펩타이드 결합 홈(groove)과 가장 강하게 상호작용한다. N-말단 및 C-말단에 특이적인 펩티다제를 사용하여 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩타이드를 트리밍한다. 트리밍 후, LC-MS/MS를 이용하여 코어 펩타이드 에피토프를 시퀀싱한다.
도 14a는 바이오틴 친화성 태그를 사용하는 단일-대립유전자 HLA-펩티돔(peptidome) 프로파일링 방법의 개략적 표시이다. 본 개시의 예시적 실시양태는 BirA 효소에 의해 라이신(K) 잔기에서 바이오티닐화되는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP)를 사용한다. BAP 펩타이드 서열은 BirA 효소, 바이오틴 및 ATP의 첨가 시 바이오티닐화되는 라이신 잔기를 함유한다. 바이오티닐화되는 생성물은 스트렙타비딘/NeutrAvidin에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 스트렙타비딘/NeutrAvidin 비드는 바이오티닐화된 BAP 펩타이드 서열을 농축하는 데 사용될 수 있다.
도 14b는 유전적으로 조작된 HLA 분자의 바이오틴 기반 면역정제의 개략적 표시이다. HLA 단백질의 N-말단 또는 C-말단에서 BAP 서열을 가진 특정 HLA 대립유전자를, 예를 들면, 플라스미드의 형질감염 또는 형질도입으로 세포에 혼입한다. 상기 플라스미드는 PCR 기반 방법이 각각의 대립유전자에 대해 세포주를 모니터링할 수 있게 하는 DNA 바코드를 함유한다는 것을 주목한다. 바코드 길이는 적어도 5개 염기 쌍, 적어도 10개 염기 쌍, 적어도 15개 염기 쌍 또는 적어도 20개 염기 쌍일 수 있거나 더 길 수 있다. HLA-BAP 단백질을 발현하는 세포를 용해시키고 바이오티닐화한다. 펩타이드 확인을 위해 LC-MS/MS에 의해 분석될 수 있는 HLA-BAP-펩타이드 복합체를 복합체 용해물 혼합물로부터 면역정제한다.
도 15는 표적화된 에피토프 검증 및 발견을 위한 보편적 IP 플랫폼의 예시적 적용의 개략적 표시이다. 관심 있는 세포주는 대립유전자 특이적 HLA 태깅된 (예를 들면, BAP) 구축물을 발현하도록 조작된다. HLA 태깅된 (예를 들면, BAP) 분자를 발현하는 세포는 단일 에피토프 또는 다수의 에피토프들을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 에피토프 발현 세포를 용해시키고 HLA-BAP-펩타이드 복합체를 면역정제한다. 단리된 펩타이드 항원을 임의의 적합한 수단으로 조사할 수 있고, 예를 들면, LC-MS/MS로 시퀀싱할 수 있고, 도입된 에피토프로부터 생성된 펩타이드 단편을, HLA 대립유전자-매칭된 항원 프로세싱 및 제시를 위한 고효율 판독정보로서 사용할 수 있다.
도 16은 보편적 IP 파이프라인 내에서의 HLA 대립유전자 다중체화의 개략적 표시이다. 다수의 클래스 I 대립유전자들 및 클래스 II 대립유전자들을 단일 HLA 구축물로부터 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 다수의 중쇄들을 클래스 I 구축물에 포함시킬 수 있고, 다수의 β쇄들 및/또는 α쇄들을 클래스 II 구축물에 포함시킬 수 있다. 단일 구축물에서 HLA 대립유전자들을 다중체화함으로써, 다수의 HLA 분자들을 전달할 수 있고 관심 있는 세포주에서 발현시킬 수 있다. 대립유전자 다중체화는 보편적 IP 파이프라인 및 후속 복합체 및/또는 펩타이드 분석, 예를 들면, LC-MS/MS 판독정보의 적용으로 환자 HLA 유형 및 맞춤형 펩타이드 항원 판독정보에의 매칭을 가능하게 한다.
도 17은 HLA 리간드 프로파일링에서 다중-대립유전자 방법 및 단일-대립유전자 방법의 개략도이다. 다중-대립유전자 방법에서, HLA 리간드는 환자 물질 또는 세포주로부터 직접적으로 HLA 이종이량체와 함께 공-면역침전된다(상부). 이 세포는 다수의 HLA 대립유전자들을 천연적으로 발현하기 때문에, HLA 유형이 공지되어 있는 경우 이러한 다중-대립유전자 방법으로부터 확인된 펩타이드는 특정 HLA 이종이량체에의 결합을 배정하기 위해 데콘볼루션되어야 한다. 단일-대립유전자 방법에서, HLA 리간드는 단일 HLA 대립유전자만을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포주로부터의 HLA 이종이량체와 함께 공-면역침전된다(하부). 따라서, 단일-대립유전자 방법으로부터 확인된 펩타이드는 HLA 이종이량체 결합 배정을 위해 데콘볼루션을 요구하지 않는다.
도 18a는 MHC에게 제시된 돌연변이된 신생항원성 펩타이드를 보여주는 도표이다.
도 18b는 본원에 기재된 맞춤형 신생항원 표적화 요법을 개발하는 개략적 방법이다.
도 19는 상이한 HLA-리간드 프로파일링의 상이한 실험적 방법을 보여주는 개략도를 보여준다. 생화학적 펩타이드:MHC(p:MHC) 결합 어세이는 느리고 저효율적이고 프로세싱에 대한 통찰력을 갖지 않는다. 다중-대립유전자 질량 분광측정은 고효율적이고 프로세싱 규칙을 학습하는 능력을 가지나; 펩타이드를 대립유전자에 배정하기 위해 인 실리코 대치(in silico imputation)를 요구한다. 단일-대립유전자 질량 분광측정은 다양한 MHC 대립유전자들에 걸쳐 펩타이드 결합 모티프를 규정하는 신속한 비편향된 깨끗한 방법을 제공한다. 단일-대립유전자 질량 분광측정은 대립유전자 포괄범위 갭을 신속하고 체계적으로 채울 수 있고 대립유전자 특이적 펩타이드 길이 선호도에 영향을 미치는 것을 가능하게 한다.
도 20a는 단일-대립유전자 방법을 이용함으로써 커버되지 않는 A*01:01, B*51:01, A*29:02 및 B*54:01 대립유전자를 위한 예시적 HLA 결합 펩타이드의 표를 보여준다. 단일-대립유전자 방법은 NetMHCpan에 의해 잘 점수화되지 않는 HLA 결합 펩타이드를 커버하지 않으나 강한 결합제로서 생화학적으로 입증한다.
도 20b는 100회의 시뮬레이션된 데콘볼루션에서 부정확한 배정률을 보여주는 막대그래프이다. 무작위적 6개의 대립유전자 환자 HLA 유전형(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 각각의 2개 대립유전자들, 미국 대립유전자 빈도로 샘플링)을 생성하였다. 각각의 대립유전자에 대해, 관련 단일-대립유전자 실험으로부터 500개의 펩타이드들을 샘플링하고 조합하여, 3000개 펩타이드 다중-대립유전자 데이터 세트를 생성하였다. 각각의 펩타이드를, 가장 우수한 NetMHCpan% 순위 점수를 제공하는 대립 유전자에 배정하여 NetMHCpan에 의해 부정확하게 배정된 펩타이드의 퍼센트를 측정하였다. 이 과정을 100회 반복하였다.
도 21은 MS 데이터를 사용하여 다양한 개별 MHC 클래스 I 대립유전자들에 대한 MHC 제시 예측자를 개략적으로 표시한다. 비-중첩 공급원 단백질에 대한 모델 훈련 및 평가를 수행한다. MS에 의해 관찰된 펩타이드를 공급원 단백질에 따라 훈련/시험에 배정한다. 평가 방법은 5000:1 초과의 유인물(decoy) 대 진정한 결합제를 사용한다.
도 22는 프로세싱 및 대립유전자 특이적 결합의 관점에서 유의미하게 개선된 예측을 보여주는 막대그래프이다.
하기 설명 및 실시예는 본 개시의 실시양태를 상세히 예시한다. 본 개시는 본원에 기재된 특정 실시양태로 한정되지 않으므로 변경될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 당분야에서 숙련된 자는 본 개시의 범위 내에 포함되는, 본 개시의 다수의 변경 및 변형이 있다는 것을 인식할 것이다.
모든 용어들은 당분야에서 숙련된 자에 의해 이해될 바와 같이 이해되기 위한 것이다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 개시가 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용된 단락 제목은 조직화를 위한 것일 뿐이고 기재된 보호대상을 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본 개시의 다양한 특징들이 단일 실시양태의 문맥으로 기재될 수 있지만, 상기 특징들은 별개로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수도 있다. 대조적으로, 본 개시가 명료함을 위해 별개의 실시양태들의 문맥으로 본원에 기재될 수 있지만, 본 개시는 단일 실시양태로 실시될 수도 있다.
하기 정의는 당분야의 정의를 보충하고 본원에 관한 것이고, 임의의 관련된 또는 관련되지 않은 경우, 예를 들면, 임의의 공유 특허 또는 출원에 귀속되지 않아야 한다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 시험을 위해 실제로 사용될 수 있지만, 예시적 물질 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니다.
정의
본원에서, 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 단수형의 사용은 복수형을 포함한다. 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 단수형은 복수형 지시대상을 포함한다는 것을 인지해야 한다. 본원에서, 달리 언급되어 있지 않은 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 나아가, 용어 "포함하는"의 사용뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함한다", "포함하고" 및 "포함된"의 사용도 한정하기 위한 것이 아니다.
용어 "하나 이상" 또는 "적어도 하나", 예컨대, 일군의 구성원들 중 하나 이상 또는 적어도 하나의 구성원(들)은 추가 예시에 의해 그 자체로 명확하고, 상기 용어는 특히 상기 구성원들 중 어느 한 구성원, 또는 상기 구성원들 중 어느 2개 이상의 구성원들, 예를 들면, 상기 구성원들 중 임의의 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상 등의 구성원들 및 최대 모든 상기 구성원들의 언급을 포괄한다.
본 명세서에서 "일부 실시양태들", "실시양태", "한 실시양태" 또는 "다른 실시양태"의 언급은 실시양태와 관련하여 기재된 특징, 구조 또는 특성이 본 개시의 적어도 일부 실시양태들에 포함되나, 반드시 모든 실시양태들에 포함되지는 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"(및 "포함하는"의 임의의 형태, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하고"), "가진"(및 "가진"의 임의의 형태, 예컨대, "가진다" 및 "갖고"), "포괄하는"(및 "포괄하는"의 임의의 형태, 예컨대, "포괄한다" 및 "포괄하고") 또는 "함유하는"(및 "함유하는"의 임의의 형태, 예컨대, "함유한다" 및 "함유하고")은 포괄적이거나 제한되지 않고 추가 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태는 본 개시의 임의의 방법 또는 조성물에 대하여 실시될 수 있고 역의 경우도 가능하다고 생각된다. 나아가, 본 개시의 조성물은 본 개시의 방법을 달성하는 데 사용될 수 있다.
측정가능한 값, 예컨대, 파라미터, 양, 일시적 지속시간 등을 언급할 때 본원에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 특정된 값으로부터의 +/-20% 이내, +/-10% 이내, +/-5% 이내 또는 +/-1% 이내의 편차를 포괄하기 위한 것이되, 이러한 편차는 본 개시를 수행하기에 적절해야 한다. 수식어 "약" 또는 "대략"이 지칭하는 값은 그 자체도 구체적으로 개시되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "면역 반응"은 T 세포 보조자극의 조절에 의해 영향을 받는 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 예시적 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들면, 사이토카인 생성 및 세포성 세포독성을 포함한다. 추가로, 용어 면역 반응은 T 세포 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응, 예를 들면, 항체 생성(체액성 반응) 및 사이토카인 반응성 세포, 예를 들면, 대식세포의 활성화를 포함한다.
"수용체"는 리간드에 결합할 수 있는 생물학적 분자 또는 분자 기를 의미하는 것으로서 이해되어야 한다. 수용체는 세포, 세포 형성 또는 유기체에서 정보를 전달하는 데 기여할 수 있다. 수용체는 적어도 하나의 수용체 유닛을 포함하고 2개 이상의 수용체 유닛들을 함유할 수 있고, 이때 각각의 수용체 유닛은 단백질 분자, 예를 들면, 당단백질 분자로 구성될 수 있다. 수용체는 리간드의 구조를 보완하고 결합 파트너로서 리간드와 복합체를 형성할 수 있는 구조를 가진다. 신호전달 정보는 세포의 표면의 리간드와 결합한 후 수용체의 입체구조적 변화에 의해 전달될 수 있다. 본 개시에 따르면, 수용체는 리간드, 예를 들면, 적절한 길이의 펩타이드 또는 펩타이드 단편과 수용체/리간드 복합체를 형성할 수 있는 MHC 클래스 I 및 II의 단백질을 지칭할 수 있다.
"바코드" 서열은 서열에 대한 정보의 항목, 예컨대, 바코드가 부착되어 있는 서열의 정체성 또는 서열이 유래한 샘플의 정체성을 코딩할 수 있는 핵산 서열일 수 있다.
"리간드"는 수용체와 복합체를 형성할 수 있는 분자를 의미한다. 본 개시에 따르면, 리간드는 예를 들면, 펩타이드 또는 펩타이드 단편이 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 단백질과 복합체를 형성할 수 있도록 적합한 길이 및 그의 아미노산 서열 내의 적합한 결합 모티프를 가진 펩타이드 또는 펩타이드 단편을 의미하는 것으로서 이해되어야 한다.
"항원"은 면역 반응을 자극할 수 있고 암 세포 또는 감염성 물질 또는 자가면역 질환에 의해 생성될 수 있는 분자이다. 헬퍼 T 림프구(T 헬퍼(TH) 세포) 또는 세포독성 T 림프구(CTL)인 T 세포에 의해 인식되는 항원은 온전한 단백질로서 인식되는 것이 아니라, 오히려 세포 표면의 클래스 I 또는 클래스 II MHC 단백질과 회합하는 작은 펩타이드로서 인식된다. 천연 생성 면역 반응의 과정 동안, 항원 제시 세포(APC)의 클래스 II MHC 분자와 함께 인식되는 항원은 세포의 외부로부터 획득되고, 내재화되고, 클래스 II MHC 분자와 회합하는 작은 펩타이드로 프로세싱된다. APC는 외생성 항원을 프로세싱하고 프로세싱된 항원을 클래스 I MHC 분자에게 제시함으로써 펩타이드 항원을 교차제시할 수도 있다. 클래스 I MHC 분자와 함께 인식되는 단백질을 생성하는 항원은 일반적으로 세포 내에서 생성되는 단백질이고, 이 항원은 프로세싱되고 클래스 I MHC 분자와 회합한다. 현재 소정의 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 회합하는 펩타이드가 공통의 결합 모티프를 가진 것으로서 특징화되어 있고, 다수의 상이한 클래스 I 및 II MHC 분자들에 대한 결합 모티프가 확인되었다는 것을 이해한다. 소정의 항원의 아미노산 서열에 상응하고 소정의 클래스 I 또는 II MHC 분자에 대한 결합 모티프를 함유하는 합성 펩타이드도 합성될 수 있다. 그 후, 이 펩타이드는 적절한 APC에 첨가될 수 있고, APC는 시험관내에서 또는 생체내에서 T 헬퍼 세포 또는 CTL 반응을 자극하는 데 사용될 수 있다. 결합 모티프, 펩타이드를 합성하는 방법, 및 T 헬퍼 세포 또는 CTL 반응을 자극하는 방법 모두가 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있고 용이하게 이용될 수 있다.
용어 "펩타이드"는 본 명세서에서 "돌연변이체 펩타이드" 및 "신생항원성 펩타이드"와 상호교환가능하게 사용된다. 유사하게, 용어 "폴리펩타이드"는 본 명세서에서 "돌연변이체 폴리펩타이드" 및 "신생항원성 폴리펩타이드"와 상호교환가능하게 사용된다. "신생항원" 또는 "신생에피토프"는 발현된 단백질에서 종양 특이적 돌연변이로부터 비롯된 한 부류의 종양 항원 또는 종양 에피토프를 의미한다. 본 개시는 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 펩타이드, 공지된 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 펩타이드, 및 본 개시의 방법에 의해 확인된 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 이의 단편도 포함한다. 이 펩타이드들 및 폴리펩타이드들은 본원에서 "신생항원성 펩타이드" 또는 "신생항원성 폴리펩타이드"로서 지칭된다. 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 그의 중성(비하전된) 형태 또는 염 형태로 다양한 길이를 가질 수 있고, 변형, 예컨대, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화 또는 임의의 번역 후 변형을 함유하지 않을 수 있거나, 이러한 변형이 본원에 기재된 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한, 이 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 개시의 신생항원성 펩타이드는 MHC 클래스 I의 경우 길이에서 22개 이하의 잔기, 예를 들면, 약 8개 내지 약 22개의 잔기, 약 8개 내지 약 15개의 잔기, 또는 9개 또는 10개의 잔기를 포함할 수 있고, MHC 클래스 II의 경우 길이에서 40개 이하의 잔기, 예를 들면, 약 8개 내지 약 40개의 잔기, 약 8개 내지 약 24개의 잔기, 약 12개 내지 약 19개의 잔기, 또는 약 14개 내지 약 18개의 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 신생항원성 펩타이드 또는 신생항원성 폴리펩타이드는 신생에피토프를 포함한다.
용어 "에피토프"는 본원에 정의된 항체, 항체 펩타이드 및/또는 항체 유사 분자(T 세포 수용체를 포함하나 이것으로 한정되지 않음)에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프성 결정인자는 전형적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고 일반적으로 3차원 구조적 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성도 가진다.
"T 세포 에피토프"는 펩타이드 제시 MHC 분자 또는 MHC 복합체의 형태로 클래스 I 또는 II의 MHC 분자에 의해 결합된 후 이 형태에서 각각 세포독성 T 림프구 또는 T 헬퍼 세포에 의해 인식될 수 있고 결합될 수 있는 펩타이드 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 IgG(IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함함), IgA(IgA1 및 IgA2를 포함함), IgD, IgE 또는 IgM, 및 IgY를 포함하고, 단일 쇄 전체 항체를 포함하는 전체 항체, 및 이의 항원 결합(Fab) 단편을 포함하기 위한 것이다. 항원 결합 항체 단편은 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd(VH 및 CH1로 구성됨), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 단일 쇄 항체, 디설파이드-연결된 가변 단편(dsFv), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 항체는 임의의 동물로부터 유래할 수 있다. 단일 쇄 항체를 포함하는 항원 결합 항체 단편은 가변 영역(들)만을 포함할 수 있거나, 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 전체 또는 부분과 함께 가변 영역(들)을 포함할 수 있다. 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 임의의 조합도 포함된다. 항체는 예를 들면, HLA-회합된 폴리펩타이드 또는 HLA-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 단일클론 및 다중클론 항체일 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 다양한 면역친화성 기법들이 가용성 단백질, 예컨대, 가용성 HLA-펩타이드 복합체 또는, 예를 들면, 단백질분해에 의해 막으로부터 절단되는 막-결합된 HLA-회합된 폴리펩타이드를 농축하는 데 적합하다는 것을 인식할 것이다. 이들은 (1) 가용성 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 고정된 또는 이동성 기판(예를 들면, 플라스틱 웰 또는 수지, 라텍스 또는 상자성 비드)에 고정시키는 기법, 및 (2) 생물학적 샘플로부터의 가용성 단백질을 함유하는 용액을 항체로 코팅된 기판 위에 통과시켜, 상기 가용성 단백질이 항체에 결합할 수 있게 하는 기법을 포함한다. 항체 및 결합된 가용성 단백질을 가진 기판은 용액으로부터 분리되고, 임의로 항체 및 가용성 단백질은 예를 들면, 항체를 씻어내는 용액의 pH 및/또는 이온 강도 및/또는 이온 조성을 변경함으로써 해리된다. 대안적으로, 항체와 가용성 단백질을 조합하고 거대분자 응집체를 형성할 수 있게 하는 면역침전 기법이 이용될 수 있다. 거대분자 응집체는 크기 배제 기법 또는 원심분리에 의해 용액으로부터 분리될 수 있다.
용어 "면역정제(IP)"(또는 면역친화성 정제 또는 면역침전)는 당분야에서 잘 공지되어 있는 과정이고 샘플로부터 원하는 항원을 단리하는 데 널리 이용된다. 일반적으로, 상기 과정은 원하는 항원을 함유하는 샘플을, 고체 상에 공유부착된 항원에 대한 항체를 포함하는 친화성 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 샘플 중의 항원은 면역화학적 결합을 통해 친화성 매트릭스에 결합되게 된다. 그 다음, 친화성 매트릭스를 세척하여 임의의 결합되지 않은 종을 제거한다. 항원은 친화성 매트릭스와 접촉하는 용액의 화학 조성을 변경함으로써 친화성 매트릭스로부터 제거된다. 친화성 매트릭스를 함유하는 컬럼에 대한 면역정제를 수행할 수 있고, 이 경우 용액은 용출제이다. 대안적으로, 면역정제는 회분 과정으로 수행될 수 있고, 이 경우 친화성 매트릭스는 용액 중의 현탁액으로서 유지된다. 상기 과정의 중요한 단계는 매트릭스로부터 항원을 제거하는 단계이다. 이것은 예를 들면, 무기 염을 첨가하여 친화성 매트릭스와 접촉하는 용액의 이온 강도를 증가시킴으로써 통상적으로 달성된다. pH의 변경은 항원과 친화성 매트릭스 사이의 면역화학적 결합을 해리시키는 데에도 효과적일 수 있다.
"물질(agent)"은 임의의 소분자 화학적 화합물, 항체, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드, 또는 이들의 단편을 의미한다.
"변경" 또는 "변화"는 증가 또는 감소를 의미한다. 변경은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%만큼 작은 변경, 또는 40%, 50%, 60%, 또는 심지어 70%, 75%, 80%, 90% 또는 100%만큼 큰 변경일 수 있다.
"생물학적 샘플"은 유기체로부터 유래한 임의의 조직, 세포, 유체 또는 다른 물질을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "샘플"은 생물학적 샘플, 예컨대, 유기체로부터 유래한 임의의 조직, 세포, 유체 또는 다른 물질을 포함한다. "특이적으로 결합한다"는 샘플, 예를 들면, 생물학적 샘플에서 분자(예를 들면, 폴리펩타이드)를 인식하고 이에 결합하나, 다른 분자를 실질적으로 인식하지 않고 이에 결합하지 않는 화합물(예를 들면, 펩타이드)을 의미한다.
"포획 시약"은 분자(예를 들면, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드)에 특이적으로 결합하여 상기 분자(예를 들면, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드)를 선택하거나 단리하는 시약을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결정하는", "평가하는", "어세이하는", "측정하는", "검출하는" 및 이들의 문법적으로 동등한 용어는 정량적 확인 및 정성적 확인 둘 다를 지칭하므로, 용어 "확인하는"은 본원에서 "어세이하는", "측정하는" 등과 상호교환가능하게 사용된다. 정량적 확인이 의도되는 경우, 분석물의 "양을 확인하는" 등과 같은 어구가 사용된다. 정성적 및/또는 정량적 확인이 의도되는 경우, 분석물의 "수준을 확인하는" 또는 분석물을 "검출하는"과 같은 어구가 사용된다.
"단편"은 기준 단백질 또는 핵산과 실질적으로 동일한 단백질 또는 핵산의 부분을 의미한다. 일부 실시양태들에서, 상기 부분은 본원에 기재된 기준 단백질 또는 핵산의 적어도 50%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 99%의 생물학적 활성을 보유한다.
용어 "단리된", "정제된", "생물학적으로 순수한" 및 이들의 문법적으로 동등한 용어는 물질이 그의 천연 상태로 발견될 때 정상적으로 그에 동반된 다양한 성분들을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. "단리한다"는 원래의 공급원 또는 환경으로부터의 분리 정도를 의미한다. "정제한다"는 단리보다 더 높은 분리 정도를 의미한다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않거나 다른 불리한 결과를 야기하지 않도록 다른 물질을 충분히 함유하지 않는다. 즉, 본 개시의 핵산 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 때 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는 경우 정제되어 있다. 순도 및 균질도는 전형적으로 분석화학 기법, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용함으로써 측정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 1개의 밴드를 생성한다는 것을 의미할 수 있다. 변형될 수 있는, 예를 들면, 인산화될 수 있거나 글리코실화될 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 별도로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있다.
"단리된" 폴리펩타이드(예를 들면, HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드) 또는 폴리펩타이드 복합체(예를 들면, HLA-펩타이드 복합체)는 천연적으로 그에 동반된 성분들로부터 분리되어 있는 본 개시의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체는 천연적으로 그와 회합되는 적어도 60 중량%의 단백질 및 천연 생성 유기 분자를 함유하지 않을 때 단리되어 있다. 제제는 적어도 75 중량%, 적어도 90 중량% 또는 적어도 99 중량%의 본 개시의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체일 수 있다. 본 개시의 단리된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체는 예를 들면, 천연 공급원으로부터의 추출, 이러한 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체의 하나 이상의 성분을 코딩하는 재조합 핵산의 발현, 또는 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체의 하나 이상의 성분의 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
용어 "벡터"는 이종 핵산의 발현을 전달할 수 있거나 매개할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 플라스미드는 용어 "벡터"에 의해 포괄되는 속의 종이다. 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 복제 및/또는 유지를 위해 필요한 복제 기점 및 다른 독립체를 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 그 자신에 작동적으로 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 그의 벡터 형태로 염색체에 결합되지 않는 환형 이중 가닥 DNA 분자를 지칭하고 전형적으로 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 독립체 또는 코딩된 DNA를 포함하는 "플라스미드"의 형태로 종종 존재한다. 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 다른 발현 벡터는 플라스미드, 에피좀, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터를 포함하나 이들로 한정되지 않고, 이러한 벡터는 숙주의 게놈 내로 삽입될 수 있거나 세포에서 자체적으로 복제할 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 당분야에서 숙련된 자에 의해 공지되어 있는, 동등한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 자가-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있는 벡터도 사용될 수 있다. 예시적 벡터는 이에 연결된 핵산을 자체적으로 복제할 수 있고/있거나 발현시킬 수 있는 벡터이다.
"분자 프로파일"은 2개 이상의 마커들(예를 들면, 폴리펩타이드들 또는 폴리뉴클레오타이드들)의 발현 또는 발현 수준의 특징화를 의미한다.
융합 단백질의 언급 시 사용된 용어 "스페이서" 또는 "링커"는 융합 단백질을 구성하는 단백질들을 연결하는 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 스페이서는 단백질 또는 RNA 서열들 사이를 연결하거나 이들 사이의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 유지하는 것 이외의 특정 생물학적 활성을 갖지 않는다. 그러나, 일부 실시양태들에서, 스페이서의 성분 아미노산은 분자의 일부 성질, 예컨대, 분자의 폴딩, 순전하 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 본 개시의 실시양태에서 사용하기에 적합한 링커는 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있고 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로환형 탄소 링커 또는 펩타이드 링커를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 링커는 일부 실시양태들에서 각각의 항원성 펩타이드가 적절하게 폴딩하는 것을 보장하기에 충분한 거리로 2개의 항원성 펩타이드들을 분리하는 데 사용된다. 예시적 펩타이드 링커 서열은 유연한 확장된 입체구조를 채택하고 정돈된 이차 구조를 발생시키는 성향을 나타내지 않는다. 유연한 단백질 영역 내의 전형적인 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. 사실상, Gly, Asn 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 임의의 순열은 링커 서열에 대한 상기 기준을 충족시킬 것으로 예상될 것이다. 다른 거의 중성 아미노산, 예컨대, Thr 및 Ala도 링커 서열에서 사용될 수 있다. 링커로서 사용될 수 있는 다른 아미노산 서열은 문헌(Maratea et al. (1985), Gene 40: 39-46); 문헌(Murphy et al. (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83: 8258-62); 미국 특허 제4,935,233호; 및 미국 특허 제4,751,180호에 개시되어 있다.
용어 "신생물"은 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 아폽토시스 또는 이들 둘 다에 의해 야기되거나 이를 초래하는 임의의 질환을 지칭한다. 교모세포종은 신생물 또는 암의 한 비한정적 예이다. 용어 "암" 또는 "종양" 또는 "과다증식성 장애"는 암 야기 세포의 전형적인 특성, 예컨대, 조절되지 않는 증식, 불멸성, 전이 잠재력, 빠른 성장 및 증식 속도, 및 일부 특징적인 형태학적 특징을 가진 세포의 존재를 지칭한다. 암 세포는 종종 종양의 형태로 존재하나, 이러한 세포는 동물 내에 단독으로 존재할 수 있거나, 비-종양유발성 암 세포, 예컨대, 백혈병 세포일 수 있다. 암은 B 세포 암, 예를 들면, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 예를 들면, 알파쇄 질환, 감마쇄 질환 및 뮤쇄 질환, 양성 단일클론 감마글로불린병증, 및 면역구성 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 대장암, 전립선암(예를 들면, 전이성 호르몬 불응성 전립선암), 췌장암, 위암, 난소암, 요로방광암, 뇌 또는 중추신경계 암, 말초 신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 자궁암 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 정소암, 담관암, 소장암 또는 충수암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액학적 조직의 암 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 개시에 의해 포괄되는 방법에 적용될 수 있는 암의 유형의 다른 비한정적 예로는 인간 육종 및 암종, 예를 들면, 섬유육종, 점액육종, 지질육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 에윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 간암, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌종양, 정소암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 희소돌기신경교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들면, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병(골수모세포성, 전구골수성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성 적혈구증가증, 림프종(호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄 질환이 있다. 일부 실시양태들에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인과 암, 신장암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암 또는 피부암과 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는, 상피암이다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암 또는 결장암이다. 다른 실시양태에서, 상피암은 비-소세포 폐암, 비-유두 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들면, 장액성 난소 암종) 또는 유방 암종이다. 상피암은 장액성, 자궁내막성, 점액성, 투명한 세포, 브레너(brenner) 또는 미분화를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 다른 방식으로 특징화될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 개시는 맨틀 세포 림프종을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 림프종 또는 이의 서브타입의 치료, 진단 및/또는 예후에 사용된다. 림프증식성 장애도 증식성 질환으로 간주된다.
용어 "백신"은 질환(예를 들면, 신생물/종양/감염성 물질/자가면역 질환)의 예방 및/또는 치료를 위한 면역을 생성하기 위한 조성물을 의미하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 백신은 항원을 포함하고 백신접종으로 특정 방어 및 보호 물질을 생성하기 위해 인간 또는 동물에서 사용되는 약물이다. "백신 조성물"은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 개시의 양태는 항원 기반 백신의 제조에 있어서 기술의 용도에 관한 것이다. 이 실시양태들에서, 백신은 하나 이상의 질환 특이적 항원성 펩타이드(또는 이를 코딩하는 상응하는 핵산)를 지칭하기 위한 것이다. 일부 실시양태들에서, 항원 기반 백신은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개 또는 더 많은 수의 항원성 펩타이드들을 함유한다. 일부 실시양태들에서, 항원 기반 백신은 2개 내지 100개, 2개 내지 75개, 2개 내지 50개, 2개 내지 25개, 2개 내지 20개, 2개 내지 19개, 2개 내지 18개, 2개 내지 17개, 2개 내지 16개, 2개 내지 15개, 2개 내지 14개, 2개 내지 13개, 2개 내지 12개, 2개 내지 10개, 2개 내지 9개, 2개 내지 8개, 2개 내지 7개, 2개 내지 6개, 2개 내지 5개, 2개 내지 4개, 3개 내지 100개, 3개 내지 75개, 3개 내지 50개, 3개 내지 25개, 3개 내지 20개, 3개 내지 19개, 3개 내지 18개, 3개 내지 17개, 3개 내지 16개, 3개 내지 15개, 3개 내지 14개, 3개 내지 13개, 3개 내지 12개, 3개 내지 10개, 3개 내지 9개, 3개 내지 8개, 3개 내지 7개, 3개 내지 6개, 3개 내지 5개, 4개 내지 100개, 4개 내지 75개, 4개 내지 50개, 4개 내지 25개, 4개 내지 20개, 4개 내지 19개, 4개 내지 18개, 4개 내지 17개, 4개 내지 16개, 4개 내지 15개, 4개 내지 14개, 4개 내지 13개, 4개 내지 12개, 4개 내지 10개, 4개 내지 9개, 4개 내지 8개, 4개 내지 7개, 4개 내지 6개, 5개 내지 100개, 5개 내지 75개, 5개 내지 50개, 5개 내지 25개, 5개 내지 20개, 5개 내지 19개, 5개 내지 18개, 5개 내지 17개, 5개 내지 16개, 5개 내지 15개, 5개 내지 14개, 5개 내지 13개, 5개 내지 12개, 5개 내지 10개, 5개 내지 9개, 5개 내지 8개, 또는 5개 내지 7개의 항원성 펩타이드들을 함유한다. 일부 실시양태들에서, 항원 기반 백신은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 항원성 펩타이드들을 함유한다. 일부 경우, 항원성 펩타이드는 신생항원성 펩타이드이다. 일부 경우, 항원성 펩타이드는 하나 이상의 신생에피토프를 포함한다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 인간을 비롯한 동물에 사용하기 위해 연방정부 또는 주정부의 규제 관청에 의해 승인되었거나 승인될 수 있거나, 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열되어 있다는 것을 의미한다. "약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제"는 약제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않고 치료량의 약제를 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 독성을 나타내지 않는 부형제, 담체 또는 희석제를 지칭한다. 본원에서 언급된, 풀링된 질환 특이적 항원의 "약학적으로 허용되는 염"은 과도한 독성, 자극, 알레르기성 반응, 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과 접촉되어 사용되기에 적합한 것으로 당분야에서 일반적으로 간주되는 산 또는 염기 염일 수 있다. 이러한 염은 염기성 잔기, 예컨대, 아민의 무기 산 및 유기 산 염뿐만 아니라, 산성 잔기, 예컨대, 카복실산의 알칼리 또는 유기 염도 포함한다. 구체적인 약학적 염은 산, 예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 말산, 글리콜산, 푸마르산, 황산, 설팜산, 설파닐산, 포름산, 톨루엔 설폰산, 메탄 설폰산, 벤젠 설폰산, 에탄 디설폰산, 2-하이드록시에틸설폰산, 질산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 구연산, 주석산, 젖산, 스테아르산, 살리실산, 글루탐산, 아스코르브산, 파모산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 프로피온산, 하이드록시말레산, 수소화요오드산, 페닐아세트산, 알칸산, 예컨대, 아세트산, n이 0 내지 4인 HOOC-(CH2)n-COOH 등의 염들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 유사하게, 약학적으로 허용되는 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985))에 나열된 염들을 포함하는, 본원에서 제공된 풀링된 질환 특이적 항원에 대한 추가 약학적으로 허용되는 염을 본 개시 및 당분야의 지식으로부터 인식할 것이다. 일반적으로, 약학적으로 허용되는 산 또는 염기 염은 임의의 보편적 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 요약하건대, 이러한 염은 적절한 용매에서 이 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 화학양론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 개시의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 개시의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내생성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없으나, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내생성 서열과 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 이중 가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 하이브리드화할 수 있다. "하이브리드화한다"는 다양한 엄격도 조건들 하에서 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열들 또는 이들의 부분들 사이에 이중 가닥 분자를 형성하도록 페어링한다는 것을 의미한다(예를 들면, 문헌(Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507) 참조). 예를 들면, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 구연산삼나트륨 미만, 약 500 mM NaCl 및 50 mM 구연산삼나트륨 미만, 또는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 구연산삼나트륨 미만일 수 있다. 낮은 엄격도 하이브리드화는 유기 용매, 예를 들면, 포름아미드의 부재 하에서 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격도 하이브리드화는 적어도 약 35% 포름아미드 또는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재 하에서 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃, 적어도 약 37℃ 또는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 수 있다. 추가 파라미터, 예컨대, 하이브리드화 시간, 세제, 예를 들면, 황산도데실나트륨(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배재의 변경은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다. 필요할 때 이 다양한 조건들을 조합함으로써 다양한 엄격도 수준을 달성한다. 예시적 실시양태에서, 하이브리드화는 750 mM NaCl, 75 mM 구연산삼나트륨 및 1% SDS에서 30℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 하이브리드화는 500 mM NaCl, 50 mM 구연산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA(ssDNA)에서 37℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 하이브리드화는 250 mM NaCl, 25 mM 구연산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 ㎍/㎖ ssDNA에서 42℃에서 일어날 수 있다. 이 조건들의 유용한 변경은 당분야에서 숙련된 자에게 용이하게 자명할 것이다. 대부분의 적용의 경우, 하이브리드화 후 세척 단계도 엄격도의 면에서 변경될 수 있다. 세척 엄격도 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 전술된 바와 같이, 세척 엄격도는 염 농도를 감소시키거나 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 구연산삼나트륨 미만, 또는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 구연산삼나트륨 미만일 수 있다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 적어도 약 25℃, 적어도 약 42℃ 또는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 구연산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 25℃에서 일어날 수 있다. 다른 예시적 실시양태에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 구연산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 42℃에서 일어날 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 구연산삼나트륨 및 0.1% SDS에서 68℃에서 일어날 수 있다. 이 조건들의 추가 변경은 당분야에서 숙련된 자에게 용이하게 자명할 것이다. 하이브리드화 기법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있고, 예를 들면, 문헌(Benton and Davis (Science 196:180, 1977)); 문헌(Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)); 문헌(Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)); 문헌(Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)); 및 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 기재되어 있다.
"실질적으로 동일한"은 기준 아미노산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 아미노산 서열들 중 어느 한 아미노산 서열) 또는 핵산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 핵산 서열들 중 어느 한 핵산 서열)과 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 서열은 비교를 위해 사용된 서열과 아미노산 수준 또는 핵산 수준에서 적어도 60%, 80% 또는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 이상 동일할 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 위스콘신 대학 생명공학 센터)의 서열 분석 소프트웨어 팩키지, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용함으로써 측정된다. 이러한 소프트웨어는 상동성 정도를 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 배정함으로써 동일한 또는 유사한 서열을 매칭한다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 쓰레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 측정하는 예시적 방법에서, 밀접하게 관련된 서열을 시사하는, e-3과 e-mo 사이의 확률 점수와 함께 BLAST 프로그램을 이용할 수 있다. "기준"은 비교의 표준을 의미한다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 치료, 관찰 또는 실험의 객체인 동물을 지칭한다. 단지 예로써, 대상체는 인간 또는 비인간 포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 뮤린, 소과 동물, 말과 동물, 갯과 동물, 양과 동물 또는 고양잇과 동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 포유동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "치료한다", "치료된", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 이와 관련된 증상(예를 들면, 신생물 또는 종양 또는 감염성 물질 또는 자가면역 질환)을 감소시키거나, 예방하거나 완화시키는 것을 지칭하기 위한 것이다. "치료"는 질환(예를 들면, 암 또는 감염성 물질에 의한 감염 또는 자가면역 질환)의 발병 또는 의심된 발병 후 요법을 대상체에게 투여하는 것을 지칭할 수 있다. "치료"는 질환과 관련된 임의의 증상 또는 다른 좋지 않은 효과 및/또는 요법과 관련된 부작용의 발생 또는 재발의 빈도, 또는 중증도를 경감시키는 것을 지칭하는 "완화"의 개념을 포함한다. 용어 "치료"는 환자에서 질환 또는 장애의 중증도를 감소시키는 것, 예를 들면, 질환을 가진 환자의 생명을 연장하거나 생존력을 연장하거나, 질환으로부터 고통받는 환자에서 질환의 재발을 지연시키는, 예를 들면, 관해의 기간을 연장하는 것을 지칭하는 "관리"의 개념도 포괄한다. 불가능하지 않을지라도, 장애 또는 질병의 치료는 장애, 질병 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거될 것을 요구하지 않는다는 것이 인식된다.
본원에서 사용된 용어 "예방한다", "예방하는", "예방" 및 이들의 문법적으로 동등한 용어는 물질 또는 화합물의 투여가 시작될 때 질환 또는 질병과 관련된 증상을 발생시키지 않은 대상체에서 이러한 증상의 발병을 피하거나 지연시키는 것을 의미한다.
용어 "치료 효과"는 장애(예를 들면, 신생물, 종양 또는 감염성 물질에 의한 감염 또는 자가면역 질환)의 증상들 중 하나 이상의 증상 또는 이의 관련된 병상을 어느 정도 경감시키는 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 "치료 유효량"은 단회 또는 다회 용량을 세포 또는 대상체에게 투여하였을 때 이러한 치료의 부재 하에서 예상된 효과를 능가하는, 이러한 장애를 가진 환자의 생존력의 연장, 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소, 예방 또는 지연 등에 효과적인 물질의 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 치료 효과를 달성하기 위해 요구된 양을 한정하기 위한 것이다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 요구된 약학 조성물의 "치료 유효량"(예를 들면, ED50)을 용이하게 결정할 수 있고 처방할 수 있다. 예를 들면, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구된 수준보다 더 낮은 수준으로 약학 조성물에서 사용되는 본 개시의 화합물의 용량을 시작할 수 있고 원하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 질환, 질병 및 장애는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열은 HLA-단백질을 면역정제하는 데 사용될 수 있는 펩타이드 태그, 친화성 태그, 에피토프 태그 또는 친화성 수용체 태그를 추가로 포함한다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 용어 "펩타이드 태그", "친화성 태그", "에피토프 태그" 또는 "친화성 수용체 태그"가 본원에서 상호교환가능하게 사용된다는 것을 인식할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성 수용체 태그"는 태깅된 단백질이 예를 들면, 친화성 정제에 의해 용이하게 검출되게 하거나 정제되게 하는 아미노산 서열을 지칭한다. 친화성 수용체 태그는 일반적으로 HLA 대립유전자의 N-말단 또는 C-말단, 또는 이 근처에 배치된다(그러나, 반드시 그러할 필요는 없다). 다양한 펩타이드 태그들이 당분야에서 잘 공지되어 있다. 비한정적 예로는 폴리-히스티딘 태그(예를 들면, 4개 내지 15개의 연속 His 잔기들, 예컨대, 8개의 연속 His 잔기들); 폴리-히스티딘-글리신 태그; HA 태그(예를 들면, Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159, 1988); c-myc 태그(예를 들면, Evans et al., Mol. Cell. Biol., 5:3610, 1985); 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그(예를 들면, Paborsky et al., Protein Engineering, 3:547, 1990); FLAG 태그(예를 들면, Hopp et al., BioTechnology, 6:1204, 1988; 미국 특허 제4,703,004호 및 제4,851,341호); KT3 에피토프 태그(예를 들면, Martine et al., Science, 255:192, 1992); 튜불린 에피토프 태그(예를 들면, Skinner, Biol. Chem., 266:15173, 1991); T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그(예를 들면, Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393, 1990); 스트렙타비딘 태그(StrepTag.TM. 또는 StrepTagII.TM.; 예를 들면, 문헌(Schmidt et al., J. Mol. Biol., 255(5):753-766, 1996) 또는 미국 특허 제5,506,121호 참조; 시그마-제노시스(Sigma-Genosys)로부터 상업적으로 입수될 수도 있음); 또는 수포성 구내염 바이러스 당단백질로부터 유래한 VSV-G 에피토프 태그; 또는 원숭이 바이러스 5(SV5)의 파라믹소바이러스의 P 단백질 및 V 단백질에서 발견되는 작은 에피토프(Pk)로부터 유래한 V5 태그가 있다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 인식가능한 에피토프(항체 결합 부위)를 HLA-단백질에 추가하여 상응하는 항체의 결합을 제공함으로써, 태깅된 단백질의 확인 또는 친화성 정제를 가능하게 하는 펩타이드 태그의 일종인 "에피토프 태그"이다. 에피토프 태그의 비한정적 예는 IgG에 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G이다. 일부 실시양태들에서, IgG 세파로스 6 신속 유동 크로마토그래피 수지의 매트릭스는 인간 IgG에 공유커플링된다. 이 수지는 단백질 A로 태깅된 단백질의 신속하고 편리한 정제를 위한 높은 유속을 허용한다. 다수의 다른 태그 모이어티들이 통상의 기술을 가진 당업자에게 공지되어 있고 이 당업자에 의해 예상될 수 있고, 본원에서 고려된다. 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 요소로서 발현될 수 있는 한, 임의의 펩타이드 태그가 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성 분자"는 친화성 수용체 펩타이드에 화학적 특이성으로 결합하는 분자 또는 리간드를 지칭한다. 화학적 특이성은 특정 리간드에 결합하는 단백질 결합 부위의 능력이다. 단백질이 결합할 수 있는 리간드가 적을수록, 그의 특이성은 커진다. 특이성은 소정의 단백질과 리간드 사이의 결합의 강도를 기술한다. 이 관계는 단백질-리간드 시스템에 대한 결합된 상태와 비결합된 상태 사이의 균형을 특징짓는 해리 상수(KD)에 의해 기재될 수 있다.
용어 "친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체"는 친화성 수용체 펩타이드를 포함하는 단일 대립유전자 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 펩타이드에 특이적으로 결합된 HLA 클래스 I 또는 클래스 II-회합된 펩타이드 또는 이의 부분을 포함하는 복합체를 지칭한다.
친화성 분자와 친화성 수용체 태그 또는 에피토프와 HLA 펩타이드의 상호작용과 관련하여 사용될 때 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 상기 상호작용이 단백질의 특정 구조(즉, 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의해 좌우된다는 것을 의미한다; 다시 말해, 친화성 분자는 일반적으로 단백질보다는 오히려 특정 친화성 수용체 펩타이드 구조를 인식하고 이에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 결합 쌍의 두 구성원들, 예를 들면, "친화성 수용체 태그"와 "친화성 분자" 및 HLA 결합 펩타이드와 클래스 I 또는 II HLA 사이의 결합 강도의 척도를 지칭한다. KD는 해리 상수이고 몰농도의 단위를 가진다. 친화성 상수는 해리 상수의 역수이다. 친화성 상수는 종종 이 화학적 독립체를 기술하기 위한 일반 용어로서 사용된다. 이것은 결합 에너지의 직접적인 척도이다. 친화성은 예를 들면, 상업적으로 입수될 수 있는 Biacore SPR 유닛을 이용함으로써 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실험적으로 측정될 수 있다. 친화성은 50%의 펩타이드가 대체되는 농도인 억제 농도 50(IC50)으로서 표현될 수도 있다. 마찬가지로, ln(IC50)은 IC50의 자연 로그를 지칭한다. Koff는 예를 들면, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 친화성 분자의 해리에 대한 해리 속도 상수를 지칭한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP)를 포함하고 스트렙타비딘/NeutrAvidin 비드를 사용함으로써 복합체 세포 혼합물로부터 면역정제된다. 바이오틴-아비딘/스트렙타비딘 결합은 자연에서 공지되어 있는 가장 강한 비공유 상호작용이다. 이 성질은 광범위한 적용, 예컨대, 바이오틴에 공유부착된 단백질의 면역정제를 위한 생물학적 수단으로서 활용된다. 예시적 실시양태에서, HLA 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열은 면역정제를 위한 친화성 수용체 태그로서 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP)를 사용한다. BAP는 생체내에서 또는 시험관내에서 상기 태그 내의 단일 라이신 잔기에서 특이적으로 바이오티닐화될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,723,584호, 제5,874,239호 및 제5,932,433호; 및 영국 특허 제GB2370039호). BAP는 전형적으로 길이가 15개 아미노산이고 바이오틴 수용체 잔기로서 단일 라이신을 함유한다. 일부 실시양태들에서, BAP는 단일 대립유전자 HLA 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단, 또는 이 근처에 배치된다. 일부 실시양태들에서, BAP는 클래스 I HLA 펩타이드의 중쇄 도메인과 β2 마이크로글로불린 도메인 사이에 배치된다. 일부 실시양태들에서, BAP는 클래스 II HLA 펩타이드의 β쇄 도메인과 α쇄 도메인 사이에 배치된다. 일부 실시양태들에서, BAP는 클래스 I HLA의 중쇄의 α1, α2 및 α3 도메인들 사이, 또는 클래스 II HLA의 α쇄 및 β쇄의 각각 α1 및 α2 도메인들 및 β1 및 β2 도메인들 사이의 루프 영역 내에 배치된다. 바이오티닐화 및 면역정제를 위해 BAP를 사용하는, HLA 클래스 I 및 II 발현용으로 디자인된 예시적 구축물은 도 2에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이오틴"은 화합물 바이오틴 그 자체, 및 이의 유사체, 유도체 및 변이체를 지칭한다. 따라서, 용어 "바이오틴"은 바이오틴(시스-헥사하이드로-2-옥소-1H-티에노[3,4]이미다졸-4-펜탄산), 및 바이오틴 유사 화합물을 포함하는 이의 임의의 유도체 및 유사체를 포함한다. 이러한 화합물은 예를 들면, 바이오틴-e-N-라이신, 바이오사이틴 하이드라지드, 2-이미노바이오틴 및 바이오티닐-E-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스테르의 아미노 또는 설프하이드릴 유도체, 설포석신이미드이미노바이오틴, 바이오틴브로모아세틸하이드라지드, p-디아조벤조일 바이오사이틴, 3-(N-말레이미도프로피오닐)바이오사이틴, 데스티오바이오틴 등을 포함한다. 용어 "바이오틴"은 리자비딘(Rhizavidin), 아비딘, 스트렙타비딘, 타마비딘(tamavidin) 모이어티 또는 다른 아비딘 유사 펩타이드 중 하나 이상에 특이적으로 결합할 수 있는 바이오틴 변이체도 포함한다.
HLA 리간드 프로파일링 방법
HLA-에피토프 발견을 위한 생화학적 펩타이드-MHC 결합 어세이는 인공 신경망을 사용하는 대립유전자 특이적 예측자인 NetMHC를 위한 기반이었으나; 느린 생화학적 p:MHC 결합 어세이는 저효율적 방법이다(도 19). 도 17 및 도 19에 나타낸 바와 같이, 세포주 및 환자로부터 유래한 물질로부터 프로파일링된, 내생적으로 처리되고 제시된 HLA-리간드는 통상적으로 다중-대립유전자인데, 이는 이 샘플들로부터 생성된 LC-MS/MS 데이터가 다수의 동시에 발현된 HLA 대립유전자들 중 하나에 결합할 수 있는 리간드들의 혼합된 집단을 함유한다는 것을 의미한다. 다중-대립유전자 데이터 세트는 어느 펩타이드가 개체에 의해 제시된 상이한 HLA 이종이량체에 결합하는지를 확인하기 위해 데콘볼루션(deconvolution)을 요구한다. 따라서, 다중-대립유전자 데이터 세트로부터의 리간드는 (1) 기존 데이터에 의해 훈련된 결합 예측자 또는 (2) 큰 리간드 데이터 세트에 표시된 HLA 대립유전자들 사이의 중첩을 활용하는 데콘볼루션 알고리즘을 사용함으로써 그의 상응하는 HLA 이종이량체에 배정되어야 한다. 이용될 수 있는 HLA 타이핑 정보를 가진 LC-MS/MS 데이터 세트만이 확신하게 데콘볼루션될 수 있다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 사실상, 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB)에서 다중-대립유전자 연구로부터 보고된 HLA 클래스 I 복합체에 결합된, 거의 40%의 천연적으로 프로세싱된 리간드는 대립유전자 특이적 에피토프 예측을 위해 데이터의 이 서브세트를 사용하는 것을 어렵게 만드는, HLA 타이핑 정보의 결여 또는 데콘볼루션 능력의 결여로 인해 HLA 대립유전자 특이적 배정을 결여한다. 추가로, 데콘볼루션을 위한 충분한 해석된 데이터가 없기 때문에 드문 클래스 I HLA 이종이량체 및 많은 클래스 II HLA 이종이량체에 결합된 펩타이드를 확인하는 것은 어렵다. 다중-대립유전자 데이터 생성 방법은 그의 데콘볼루션이 기존 지식에 의존하기 때문에 신규 결합 모티프의 발견도 한정한다. 대립유전자 특이적 에피토프 예측을 위해 다중-대립유전자 데이터 세트를 사용하는 것에 대한 경고가 있을지라도, 이 데이터 세트는 다수의 대립유전자들의 공-발현을 요구하는 리간드 제시의 패턴을 확인하고 에피토프 예측 알고리즘을 검증하는 데 있어서 대단히 귀중하다.
다중-대립유전자 데이터 생성 및 후속 데콘볼루션에 대한 오르토고날 방법은 단일 HLA 대립유전자에 의해 제시된 펩타이드 집단이 확인된 단일-대립유전자 데이터 세트의 생성이다(도 17 및 도 19). 단일-대립유전자 데이터를 생성하는 한 방법은 HLA 발현이 결여된 세포주를 사용한다. 이 세포는 단일 HLA 대립유전자로 형질감염될 수 있거나 형질도입될 수 있으므로, 리간드를 LC-MS/MS로 프로파일링하여 대립유전자 특이적 리간드 라이브러리를 생성할 수 있다. 가용성 HLA(sHLA) 분자에 결합된 펩타이드도 세포 배지로부터 단리할 수 있고 LC-MS/MS로 프로파일링하여 단일-대립유전자 데이터를 생성할 수 있다. 단일-대립유전자 데이터 세트의 주요 장점은 이 데이터 세트가 데콘볼루션을 요구하지 않고 기존 데이터 없이 확실한 펩타이드-HLA 대립유전자 배정을 가능하게 한다는 점이다. 단일-대립유전자 방법은 이전에 특징화되지 않은 HLA 대립유전자에 대한 데이터도 신속하게 제공한다 - 큰 데이터 세트들 사이에 충분한 중첩이 존재하는 경우에만 다중-대립유전자 데이터가 할 수 있는 과제. 추가로, 확실한 HLA 결합 배정을 위해 종래 지식이 요구되지 않기 때문에 단일-대립유전자 시스템을 이용하여 신규 펩타이드 결합 모티프를 용이하게 발견할 수 있다. 데콘볼루션 방법이 그렇게 하지 못할 때, 단일-대립유전자 데이터는 심지어 다중-대립유전자 데이터 세트로부터 리간드를 배정하는 데 활용될 수 있다.
현재 이용될 수 있는 단일-대립유전자 방법의 제한 요인은 이 방법이 HLA 결핍 세포주를 요구한다는 점이다. 본 개시의 핵심 혁신적 특징은 HLA 결핍 세포주가 단일-대립유전자 데이터 생성을 위해 요구되지 않는다는 것이다. 친화성 태그를 사용하여 관심 있는 대립유전자를 단리하기 위해 본원에서 제공된 친화성 태깅된 구축물을, 내생성 HLA-펩타이드 복합체를 제시하는 임의의 세포주에 혼입할 수 있다. 본 개시의 또 다른 장점은 라이브러리 내의 임의의 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자가 동일한 친화성 태그를 가진 한, 동일한 시약이 이 대립유전자를 위해 사용됨으로써, 본 개시된 방법이 확장(자동화)될 수 있게 만든다는 점이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 특징화하는 단계 전에 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계도 포함한다. 일부 실시양태들에서, 항-HLA 항체를 사용하여 펩타이드를 단리한다. 일부 경우, 항-HLA 항체를 사용하여 친화성 태그를 가진 가용성 HLA(sHLA)를 단리한다. 일부 경우, 항-HLA 항체를 함유하는 컬럼을 사용하여 친화성 태그를 가진 가용성 HLA(sHLA)를 단리한다.
방법 및 조성물
본원은 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 단계; 세포의 집단의 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 및 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 단계를 포함하는, HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들에 대해 상기 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 초과의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 대상체(예를 들면, 질환을 가진 환자)로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 클래스 I 및/또는 클래스 II 음성 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 하나 이상의 세포를 각각 포함하는 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 제공하는 단계로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA의 서열이 친화성 수용체 펩타이드에 작동적으로 연결된 상이한 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 상이한 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 것인 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분을 특징화하는 단계; 및 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 펩타이드 또는 이의 부분이 변형(예를 들면, 번역 후 변형)되는지를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 질량 분광측정 분석을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 질량 분광측정은 MS 분석, MS/MS 분석, LC-MS/MS 분석, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태들에서, MS 분석은 온전한 펩타이드의 질량을 측정하는 데 사용된다. 예를 들면, 결정하는 단계는 온전한 펩타이드의 질량을 측정하는 단계(예를 들면, MS 분석)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, MS/MS 분석은 펩타이드 단편의 질량을 측정하는 데 사용된다. 예를 들면, 결정하는 단계는 펩타이드 또는 이의 부분의 아미노산 서열을 확인하는 데 사용될 수 있는 펩타이드 단편의 질량을 측정하는 단계(예를 들면, MS/MS 분석)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드 단편의 질량은 펩타이드 내의 아미노산들의 서열을 확인하는 데 사용된다. 일부 실시양태들에서, LC-MS/MS 분석은 복합체 펩타이드 혼합물을 분리하는 데 사용된다. 예를 들면, 결정하는 단계는 예컨대, 액체 크로마토그래피로 복합체 펩타이드 혼합물을 분리하는 단계, 및 온전한 펩타이드의 질량, 펩타이드 단편의 질량, 또는 이들의 조합을 측정하는 단계(예를 들면, LC-MS/MS 분석)를 포함할 수 있다. 이 데이터는 예를 들면, 펩타이드 시퀀싱을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 결합 친화성 또는 안정성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 펩타이드 또는 이의 부분이 변형(예를 들면, 번역 후 변형)되는지를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 펩타이드와 HLA 대립유전자의 회합을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 일차 세포의 집단이다.
일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 질환 또는 질병을 가진 대상체에 매칭된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 돌연변이체를 포함하는 항원 제시 세포는 대상체로부터의 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포에 대한 반응성을 가진다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체와 비-암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체를 비교하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자의 넉-아웃은 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자의 기능의 제거를 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자의 넉-아웃은 유전자 편집(editing)을 통해 달성된다. 일부 실시양태들에서, 유전자 편집은 넉-아웃될 HLA 클래스 I 대립유전자 또는 클래스 II 대립유전자를 표적화하는 뉴클레아제(nuclease)를, 유전자 편집을 필요로 하는 개체에게 투여함으로써 수행된다. 일부 실시양태들에서, 뉴클레아제는 CRISPR 관련 단백질(예를 들면, Cas 단백질, 예를 들면, Cas9), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 또는 메가뉴클레아제이다. 일부 실시양태들에서, 유전자 편집은 CRISPR-Cas9 시스템을, 유전자 편집을 필요로 하는 개체에게 투여함으로써 달성된다. 일부 실시양태들에서, 원하는 인식 부위에서 닉(nick) 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 임의의 적합한 뉴클레아제가 사용된다. 일부 실시양태들에서, 천연 생성 또는 천연 뉴클레아제가 사용된다. 일부 실시양태들에서, 변형되거나 조작된 뉴클레아제가 사용된다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-다운이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넉-다운이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-다운이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-다운이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-다운 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자의 넉-다운은 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자의 발현의 감소를 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 I 대립유전자 또는 클래스 II 대립유전자의 넉-다운은 치료 유효량의 작은 이중 가닥 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를, 이러한 넉-다운을 필요로 하는 개체에게 투여함으로써 달성되고, 이때 상기 siRNA, miRNA 또는 shRNA는 넉-다운될 HLA 클래스 I 대립유전자 또는 클래스 II 대립유전자를 표적화한다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자의 발현은 HLA 클래스 I 대립유전자 또는 클래스 II 대립유전자가 넉-다운되지 않았을 때에 비해 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25% 또는 약 20% 감소된다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 예컨대, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 HLA 클래스 I 대립유전자, HLA 클래스 II 대립유전자 또는 이들의 조합의 세포 표면 발현에 대해 농축되거나 분류된 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)는 세포의 집단을 분류하는 데 이용된다. 일부 실시양태들에서, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)는 HLA 클래스 I 대립유전자, HLA 클래스 II 대립유전자 또는 이들의 조합의 세포 표면 발현에 대해 세포의 집단을 분류하는 데 이용된다. 일부 실시양태들에서, FACS는 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포를 농축하거나 분류하는 데 이용된다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 상이한 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 각각 발현하는 복수의 세포의 집단들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 복수의 세포의 집단들의 각각의 세포의 집단은 별개의 용기 내에 있다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 특징화하는 단계 전에 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드의 말단을 트리밍하는 단계도 포함한다(도 13).
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 I HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 II HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 비고전적 클래스-I-b 군이다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된 비고전적 클래스-I-b 군이다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA 클래스 II α쇄, HLA 클래스 II β쇄 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 각각의 서열은 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 외로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 내로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고; 임의로, 이때 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 고체 표면은 비드이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자로 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 HLA-펩타이드 복합체의 세포외 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 HLA-펩타이드 복합체의 N-말단 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 접촉시키는 단계는 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
임의의 적합한 생화학적 어세이를 이용하여 세포(예를 들면, 조작된 세포주)에서 발현된 HLA를 확인할 수 있다. 세포(예를 들면, 조작된 세포주)에서 발현된 HLA 대립유전자의 정체성을 확인하는 예시적 방법은 예를 들면, HLA 대립유전자의 클래스(클래스 I 또는 클래스 II)를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 분석, 서열 분석, 예를 들면, (예를 들면, 유사한 서열의 상이한 대립유전자들의 확인을 위해 상이한 프라이머를 사용하는) 개별 대립유전자의 시퀀싱을 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자를 코딩하는 다중핵산은 바코드 서열을 포함한다. 바코드 서열은 세포에서 발현된 HLA 대립유전자를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 바코드 서열은 단일 HLA에 고유하다. 일부 실시양태들에서, 바코드 서열은 단일 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자에 고유하다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산은 세포의 집단의 게놈 내로 안정하게 삽입된다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 발현시키는 단계도 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드와 상이하고 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 질량 분광측정, 예컨대, 탠덤 질량 분광측정을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 하나 이상의 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에 상응하는 펩타이드 서열을 펩타이드 데이터베이스로부터 수득하는 단계를 포함하고; 이때 수득된 하나 이상의 서열은 하나 이상의 펩타이드의 서열을 확인시켜준다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO 및 THP1로부터 선택된 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포주는 하나 이상의 사이토카인, 체크포인트 억제제, 후성적 활성 약물, IFN-γ, 항원 프로세싱을 변경시키는 물질(예를 들면, 펩티다제 억제제, 프로테아좀 억제제, TAP 억제제 등), 또는 이들의 조합으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드 데이터베이스는 예컨대, 변형 데이터베이스를 갖지 않거나 변형(예를 들면, 인산화 또는 시스테이닐화) 데이터베이스를 가진 비-효소 특이성 펩타이드 데이터베이스이다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드 데이터베이스는 폴리펩타이드 데이터베이스이다. 일부 실시양태들에서, 폴리펩타이드 데이터베이스는 단백질 데이터베이스이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 역전된-데이터베이스 검색 전략을 이용하여 펩타이드 데이터베이스를 검색하는 단계도 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 역전된-데이터베이스 검색 전략을 이용하여 단백질 데이터베이스를 검색하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 예를 들면, 정상 펩타이드 또는 단백질 데이터베이스에 포함되어 있지 않은 신규 펩타이드를 발견하기 위해 드 노보(de novo) 검색을 수행한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 105개의 세포들, 적어도 106개의 세포들 또는 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 수지상 세포, 대식세포, 암 세포 또는 B 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 종양 세포, 또는 감염성 물질 또는 이의 부분에 의해 감염된 세포를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 세포로부터 상기 HLA-펩타이드 복합체를 단리하기 전에 물질과 접촉된다. 일부 실시양태들에서, 상기 물질은 염증 사이토카인, 화학 물질, 보강제, 치료제 또는 방사선이다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 상이한 HLA 대립유전자들에 대해 상기 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다.
본원은 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스를 제공한다. 본원은 매번 상이한 HLA 대립유전자를 사용하여 본원에 기재된 방법을 반복적으로 수행함으로써 수득된 2개 이상의 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스들의 조합을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드 서열 데이터베이스로 기계를 훈련시키는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하기 위한 예측 알고리즘을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 기계는 하나 이상의 선형 모델, 지지 벡터 기계, 결정 트리 및 신경망을 겸비한다.
기계를 훈련시킴으로써 예측 알고리즘을 생성하는 것은 잘 공지된 기법이다. 기계의 훈련에 있어서 가장 중요한 것은 훈련을 위해 사용된 데이터베이스의 품질이다. 전형적으로, 기계는 하나 이상의 선형 모델, 지지 벡터 기계, 결정 트리 및/또는 신경망을 겸비한다.
일부 실시양태들에서, 기계 또는 알고리즘을 훈련시키는 데 사용된 변수는 펩타이드 서열, 아미노산 물성, 펩타이드 물성, 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준, 단백질 안정성, 단백질 번역 속도, 유비퀴틴화 부위, 단백질 분해 속도, 리보좀 프로파일링으로부터의 번역 효율, 단백질 절단가능성, 단백질 국소화, TAP 수송을 용이하게 하는 숙주 단백질의 모티프, 자가포식되는 숙주 단백질, 리보좀 지체에 유리한 모티프(예를 들면, 폴리프롤린 또는 폴리라이신 스트레치), NMD에 유리한 단백질 특징(예를 들면, 긴 3' UTR, 마지막 엑손:엑손 연접부로부터 업스트림 쪽으로 50개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어져 있는 정지 코돈, 및 펩타이드 절단가능성)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변수를 포함한다.
본원은 HLA 대립유전자에 대해 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 펩타이드 서열 데이터베이스에 의해 훈련된 기계로 펩타이드의 서열을 분석하는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 이때 상기 공급원 단백질 발현은 기계에 의해 사용된 예측 변수이다. 일부 실시양태들에서, 발현 수준은 공급원 단백질의 양 또는 상기 공급원 단백질을 코딩하는 RNA의 양을 측정함으로써 확인된다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 각각 포함하는 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 (a) 상이한 재조합 HLA 클래스 I α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, (b) 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 (c) β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 각각 포함하는 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 (a) 재조합 HLA 클래스 II α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, (b) 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 (c) HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산은 단리된다.
일부 실시양태들에서, 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 비고전적 클래스-I-b 군이다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된 비고전적 클래스-I-b 군이다.
일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산 둘 다의 경우, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 상이한 재조합 HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산 둘 다의 경우, 친화성 수용체 분자를 코딩하는 서열은 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산 둘 다의 경우, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 상이한 재조합 HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산 둘 다의 경우, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산 둘 다의 경우, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산의 친화성 수용체 펩타이드는 상이하다.
일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고; 임의로, 이때 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 친화성 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산 둘 다의 경우, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열은 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 HA 태그를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고; 임의로, 이때 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제1 재조합 다중핵산 및 제2 재조합 다중핵산 둘 다의 경우, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 상이한 재조합 HLA 및 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
본원은 본원에 기재된 조성물의 제1 다중핵산 및 제2 다중핵산에 의해 코딩된 각각 제1 단리된 폴리펩타이드 분자 및 제2 단리된 폴리펩타이드 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 제1 다중핵산 및 제2 다중핵산에 의해 코딩된 각각 제1 폴리펩타이드 분자 및 제2 폴리펩타이드 분자를 포함하는 제1 세포 및 제2 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 제1 다중핵산 및 제2 다중핵산을 포함하는 각각 제1 세포 및 제2 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 제1 다중핵산 및 제2 다중핵산을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 각각 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 제1 집단 및 제2 집단은 하나 이상의 내생성 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 제1 집단 및 제2 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 제1 집단 및 제2 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 제1 집단 및 제2 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 제1 집단 및 제2 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 제1 집단 및 제2 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다.
본원은 본원에 기재된 조성물의 제1 다중핵산 및 제2 다중핵산으로 각각 제1 세포 및 제2 세포를 형질도입하거나 형질감염시키는 단계를 포함하는, 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드를 제공한다.
본원은 재조합 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 재조합 HLA에 작동적으로 연결된 친화성 수용체 펩타이드를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계; 및 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계를 포함하는, 면역원성 펩타이드를 농축하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 면역원성 펩타이드의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 LC-MS/MS를 사용하는 단계를 포함한다.
인간 백혈구 항원(HLA) 시스템
면역 시스템은 2종의 기능성 서브시스템으로 분류될 수 있다: 선천성 면역 시스템 및 후천성 면역 시스템. 선천성 면역 시스템은 감염에 대한 제1선의 방어이고, 대부분의 잠재적 병원체들은 이들이 예를 들면, 인지가능한 감염을 야기할 수 있기 전에 이 시스템에 의해 신속히 중화된다. 후천성 면역 시스템은 침입 유기체의 분자 구조물(항원으로서 지칭됨)에 반응한다. 선천성 면역 시스템과 달리, 후천성 면역 시스템은 병원체에 매우 특이적이다. 후천성 면역은 길게 지속되는 보호도 제공할 수 있고; 예를 들면, 홍역으로부터 회복한 사람은 그의 수명 동안 홍역으로부터 보호된다. 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응을 포함하는 2종의 후천성 면역 반응이 있다. 체액성 면역 반응에서, B 세포에 의해 체액 내로 분비된 항체는 병원체로부터 유래한 항원에 결합하여, 다양한 기작들, 예를 들면, 보체 매개 용해를 통한 병원체의 제거를 유발한다. 세포 매개 면역 반응에서, 다른 세포를 파괴할 수 있는 T 세포가 활성화된다. 예를 들면, 질환과 관련된 단백질이 세포에 존재하는 경우, 이 단백질은 세포 내에서 단백질분해에 의해 펩타이드로 단편화된다. 그 다음, 특정 세포 단백질은 이 방식으로 형성된 항원 또는 펩타이드에 스스로 부착하고 이들을 세포의 표면으로 수송하는데, 이 표면에서 이들은 신체의 분자 방어 기작인 T 세포에게 제시된다. 세포독성 T 세포는 이 항원을 인식하고 항원을 보유하는 세포를 사멸시킨다.
용어 "주조직적합성 복합체(MHC)", "MHC 분자" 또는 "MHC 단백질"은 단백질 항원의 단백질분해성 절단으로부터 비롯되고 잠재적 T 세포 에피토프를 표시하는 펩타이드에 결합하여, 이를 세포 표면으로 수송하고 이 표면에서 이를 특정 세포, 예를 들면, 세포독성 T 림프구 또는 T 헬퍼 세포에게 제시할 수 있는 단백질을 지칭한다. 인간 MHC는 HLA 복합체로서도 지칭된다. 따라서, 용어 "인간 백혈구 항원(HLA) 시스템", "HLA 분자" 또는 "HLA 단백질"은 인간에서 MHC 단백질을 코딩하는 유전자 복합체를 지칭한다. 용어 MHC는 뮤린 종에서 "H-2" 복합체로서 지칭된다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 용어 "주조직적합성 복합체(MHC)", "MHC 분자", "MHC 단백질" 및 "인간 백혈구 항원(HLA) 시스템", "HLA 분자", "HLA 단백질"이 본원에서 상호교환가능하게 사용된다는 것을 인식할 것이다.
HLA 단백질은 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II로서 지칭되는 2종으로 분류된다. 상기 2종의 HLA 클래스들의 단백질의 구조는 매우 유사하나; 이들은 매우 상이한 기능을 가진다. 클래스 I HLA 단백질은 대부분의 종양 세포들을 포함하는, 신체의 거의 모든 세포들의 표면에 존재한다. 클래스 I HLA 단백질은 통상적으로 내생성 단백질 또는 세포 내부에 존재하는 병원체로부터 유래하는 항원으로 적재된 후, 미감작(naive) 또는 세포독성 T 림프구(CTL)에게 제시된다. HLA 클래스 II 단백질은 수지상 세포, B 세포 및 대식세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는 항원 제시 세포(APC)에게 제시된다. 이들은 주로 외부 항원 공급원으로부터, 즉 세포의 외부에서 프로세싱된 펩타이드를 헬퍼 T 세포에게 제시한다. HLA 클래스 I 단백질에 의해 결합되는 대다수의 펩타이드들은 유기체 그 자체의 건강한 숙주 세포에서 생성된 세포질 단백질로부터 유래하고, 정상적으로 면역 반응을 자극하지 않는다.
클래스 I HLA 분자는 중쇄 및 경쇄로 구성되고 약 7개 내지 13개의 아미노산(예를 들면, 약 8개 내지 11개의 아미노산, 또는 9개 또는 10개의 아미노산)의 펩타이드에 결합할 수 있고, 이 펩타이드가 적합한 결합 모티프를 가진 경우, 이를 세포독성 T 림프구에게 제시할 수 있다. 클래스 I HLA 분자에 의해 결합되는 펩타이드는 내생성 단백질 항원으로부터 유래한다. 클래스 I의 HLA 분자의 중쇄는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 단량체일 수 있고, 경쇄는 β-2-마이크로글로불린이다. 클래스 I HLA는 3개의 도메인들, 즉 α1, α2 및 α3으로 구성된 α쇄로서 존재한다. 이 쇄는 종종 클래스 I 중쇄로서 지칭되고, 본원에서 클래스 I 알파-쇄로서 지칭된다. α1은 (인간 15번 염색체에 코딩된) 비-HLA 분자 β2 마이크로글로불린의 유닛에 의존한다. α3 도메인은 HLA 클래스 I 분자를 세포막에 고착시키는 막횡단 도메인이다. 제시되는 펩타이드는 α1/ α2 이종이량체(2개의 동일하지 않은 서브유닛들로 구성된 분자)의 중심 영역에서 펩타이드 결합 홈의 바닥에 의해 지탱된다. 클래스 I HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C는 높은 다형성을 가진다. 클래스 Ib HLA는 한정된 다형성, 발현 패턴 및 제시된 항원을 나타낸다. 이 군은 HLA 좌위 내에 코딩된 군, 예를 들면, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G뿐만 아니라, 코딩되지 않는 군, 예를 들면, 스트레스 리간드, 예컨대, ULBPs, Rae1 및 H60로도 세분된다. 이 분자들 중 대다수의 분자들에 대한 항원/리간드는 공지되어 있지 않은 상태로 남아있으나, 이들은 CD8+ T 세포, NKT 세포 및 NK 세포 각각과 상호작용할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 개시는 비고전적 클래스 I HLA-E 대립유전자를 사용한다. HLA-E는 천연 킬러(NK) 세포 및 CD8+ T 세포에 의해 인식되는 비고전적 클래스 I 분자들 중 하나이다. HLA-E는 폐, 간, 피부 및 태아 세포를 포함하는 거의 모든 조직들에서 발현된다. HLA-E 발현은 고형 종양(예를 들면, 골육종 및 흑색종)에서도 검출된다. HLA-E는 CD8+ T 세포에서 발현된 TCR에 결합하여, T 세포 활성화를 야기한다. HLA-E는 NK 세포 및 CD8+ T 세포에서 발현된 CD94/NKG2 수용체에 결합하는 것으로도 공지되어 있다. CD94는 NKG2의 여러 상이한 이소폼들과 페어링하여, 세포 활성화를 억제하거나(NKG2A, NKG2B) 촉진하는(NKG2C) 잠재력을 가진 수용체를 형성할 수 있다. HLA-E는 대다수의 HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 HLA-G 분자들의 리더 서열의 아미노산 잔기 3-11로부터 유래한 펩타이드에 결합할 수 있으나, 그 자신의 리더 펩타이드에 결합할 수 없다. HLA-E는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 대립유전자와 유사한 내생성 단백질로부터 유래한 펩타이드를 제시한다는 것도 밝혀졌다. 생리학적 조건 하에서, CD94/NKG2A와, HLA 클래스 I 리더 서열로부터의 펩타이드로 적재된 HLA-E의 맞물림은 통상적으로 억제 신호를 유도한다. 사이토메갈로바이러스(CMV)는 HLA-A 리더를 모방하는 UL40 당단백질의 발현을 통해 NK 세포 면역 감시로부터 벗어나기 위해 상기 기작을 이용한다. 그러나, CD8+ T 세포가 CMV Toledo 균주로부터 유래한 UL40 펩타이드로 적재된 HLA-E를 인식할 수 있고 CMV에 대한 방어에 있어서 역할을 할 수 있다는 것도 보고되어 있다. 다수의 연구들은 감염성 질환 및 암에서의 HLA-E의 여러 중요한 기능들을 보여주었다.
펩타이드 항원은 세포 표면 위에 제시되기 전에 소포체 내에서의 경쟁적 친화성 결합에 의해 클래스 I의 분자에 스스로 부착한다. 여기서, 개별 펩타이드 항원의 친화성은 그의 아미노산 서열, 및 이 아미노산 서열 내의 규정된 위치에서의 특정 결합 모티프의 존재와 직접적으로 연관되어 있다. 이러한 펩타이드의 서열이 공지되어 있는 경우, 예를 들면, 펩타이드 백신을 사용하여 병든 세포에 대한 면역 시스템을 조작할 수 있다.
클래스 II HLA 분자는 2개의 도메인들, 즉 α1과 α2 및 β1과 β2를 각각 가진 2개의 쇄들인 α 및 β를 갖고, 각각의 쇄는 HLA 클래스 II 분자를 세포막에 고착시키는 막횡단 도메인인 각각 α2 및 β2를 가진다. 펩타이드 결합 홈은 α1 및 β1의 이종이량체로 형성된다. 클래스 II의 HLA 분자에 의해 결합되는 펩타이드는 통상적으로 외생성 단백질 항원의 세포외 부분으로부터 유래한다. α쇄 및 β *β-쇄는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 단량체에 있다(도 1b). 클래스 II HLA 분자는 6개의 이소타입을 가진다. 고전적 분자는 펩타이드를 CD4+ 림프구에게 제시한다. 세포내 기능을 가진 비고전적 분자인 보조분자는 세포막에 노출되지 않으나, 라이소좀의 내부 막에서 통상적으로 항원성 펩타이드를 고전적 HLA 클래스 II 분자 위에 적재한다.
HLA 클래스 II에서, B 세포가 엔도좀(endosome) 내로의 보다 더 일반적인 엔도사이토시스(endocytosis)를 나타낼지라도, 식세포, 예컨대, 대식세포 및 미성숙 수지상 세포는 삼킨 단백질을 많은 상이한 펩타이드들로 절단하는 산성 효소를 가진 라이소좀과 융합하는 파고좀(phagosome) 내로의 식세포작용에 의해 독립체를 삼킨다. 자가포식은 HLA 클래스 II 펩타이드의 또 다른 공급원이다. 숙주의 게놈에 코딩된, 숙주에 의해 생긴 HLA 클래스 II 변이체와의 분자 상호작용에서 물리화학적 동력학을 통해, 특정 펩타이드는 면역우성을 나타내고 HLA 클래스 II 분자 위에 적재된다. 이들은 세포 표면으로 수송되고 외재화된다. 가장 잘 연구된 서브클래스 II HLA 유전자들은 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1이다.
HLA 클래스 II 분자에 의한 CD4+ 헬퍼 T 세포에의 펩타이드의 제시는 외부 항원에 대한 면역 반응을 위해 요구된다(Roche and Furuta, 2015). 일단 활성화되면, CD4+ T 세포는 B 세포 분화 및 항체 생성뿐만 아니라 CD8+ T 세포(CTL) 반응도 촉진한다. CD4+ T 세포는 다른 면역 세포의 분화를 활성화시키고 유도하는 사이토카인 및 케모카인도 분비한다. HLA 클래스 II 분자는 클래스 I 펩타이드 결합 홈보다 더 개방된 펩타이드 결합 홈을 형성하도록 상호작용하는 α쇄 및 β쇄의 이종이량체이다(Unanue et al., 2016). HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩타이드는 상기 홈으로부터 돌출되는 N-말단 또는 C-말단 쪽에서 플랭킹 잔기를 가진 9-아미노산 결합 코어를 가진 것으로 여겨진다(Jardetzky et al., 1996; Stern et al., 1994). 이 펩타이드는 길이가 통상적으로 12개 내지 16개 아미노산이고 종종 결합 레지스터의 위치 P1, P4, P6/7 및 P9에서 3개 또는 4개의 고착 잔기를 함유한다(Rossjohn et al., 2015).
HLA 대립유전자는 양 부모들로부터 유전된 대립유전자들(변이체들)이 동등하게 발현된다는 것을 의미하는 공동우성 방식으로 발현된다. 예를 들면, 각각의 사람은 3개의 클래스 I 유전자들(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C) 각각의 2개의 대립유전자들을 보유하므로, 6종의 상이한 클래스 II HLA를 발현할 수 있다. 클래스 II HLA 좌위에서, 각각의 사람은 한 쌍의 HLA-DP 유전자들(α쇄 및 β쇄를 코딩하는 DPA1 및 DPB1), 한 쌍의 HLA-DQ 유전자들(α쇄 및 β쇄에 대해 DQA1 및 DQB1), 하나의 HLA-DRα 유전자(DRA1) 및 하나 이상의 HLA-DRβ 유전자(DRB1 및 DRB3, DRB4 또는 DRB5)를 물려받는다. 이것은 하나의 이종접합 개체가 각각의 부모로부터 3개 이상씩 6개 또는 8개의 기능성 클래스 II HLA 대립유전자들을 물려받을 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, HLA 유전자는 높은 다형성을 갖고; 많은 상이한 대립유전자들이 집단 내부의 상이한 개체들에 존재한다. HLA 단백질을 코딩하는 유전자는 많은 가능한 변이들을 가지므로, 각각의 사람의 면역 시스템이 광범위한 외부 침입자들에 반응할 수 있게 한다. 일부 HLA 유전자들은 특정 번호를 각각 부여받은 수백개의 확인된 버전들(대립유전자들)을 가진다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA 대립유전자는 HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01(비고전적)이다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA 대립유전자는 HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 및 HLA-DRB*07:01이다.
대상체의 대상체 특이적 HLA 대립유전자 또는 HLA 유전형은 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 예시적 실시양태에서, HLA 유전형은 2015년 6월 11일에 제W02015085147호로서 공개된 국제 특허출원 제PCT/US2014/068746호에 기재된 임의의 방법에 의해 확인된다. 요약하건대, 상기 방법은 시퀀싱 데이터 세트로부터 추출된 리드와, 다형성 유전자의 대립유전자 변이체를 포함하는 유전자 기준 세트의 정렬을 생성하는 단계; 정렬에서 각각의 대립유전자 변이체에 대한 제1 사후 확률 또는 사후 확률 유래의 점수를 결정하는 단계; 최대 제1 사후 확률 또는 사후 확률 유래의 점수를 가진 대립유전자 변이체를 제1 대립유전자 변이체로서 확인하는 단계; 제1 대립유전자 변이체 및 하나 이상의 다른 대립유전자 변이체와 정렬된 하나 이상의 중첩 리드를 확인하는 단계; 가중 계수를 사용하여 하나 이상의 다른 대립유전자 변이체에 대한 제2 사후 확률 또는 사후 확률 유래의 점수를 결정하는 단계; 최대 제2 사후 확률 또는 사후 확률 유래의 점수를 가진 대립유전자 변이체를 선택함으로써 제2 대립유전자 변이체를 확인하는 단계로서, 제1 대립유전자 변이체 및 제2 대립유전자 변이체가 다형성 유전자에 대한 유전자 유형을 규정하는 것인 단계; 및 제1 대립유전자 변이체 및 제2 대립유전자 변이체의 결과물을 제공하는 단계를 포함할 수 있는, 다형성 유전자 유형을 확인하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 동물 및 인간 둘 다에서 돌연변이된 에피토프가 면역 반응을 유도하는 데 효과적이고 자연발생적 종양 퇴행 또는 장기간 생존의 사례가 돌연변이된 에피토프에 대한 CD8+ T 세포 반응과 상관관계를 갖고(Buckwalter and Srivastava PK. "It is the antigen(s), stupid" and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in immunology 20:296-300 (2008); Karanikas et al, High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood of a lung carcinoma patient with long survival. Cancer Res. 61:3718-3724 (2001); Lennerz et al. The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci U S A.102:16013 (2005)) "면역편집"이 마우스 및 인간에서 우성 돌연변이된 항원의 발현의 변경까지 추적될 수 있다(Matsushita et al, Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting Nature 482:400 (2012); DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); and Sampson et al, Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010))는 것을 보여주는 많은 증거들이 있다.
시퀀싱 기술은 각각의 종양이 유전자의 단백질 코딩 함량을 변경시키는 다수의 환자 특이적 돌연변이들을 함유한다는 것을 보여주었다. 이러한 돌연변이들은 (미스센스 돌연변이에 의해 야기된) 단일 아미노산 변화부터 프레임시프트, 종결 코돈의 통과 판독 또는 인트론 영역의 번역으로 인한 신규 아미노산 서열의 긴 영역의 추가(신규 개방 판독 프레임 돌연변이; neoORF)에 이르기까지 변경된 단백질을 생성한다. 이 돌연변이된 단백질은 천연 단백질과 달리 자가내성이라는 면역 약화 효과를 갖지 않기 때문에 종양에 대한 숙주의 면역 반응을 위한 귀중한 표적이다. 따라서, 돌연변이된 단백질은 면역원성을 가질 가능성이 더 높고 환자의 정상 세포에 비해 종양 세포에 더 특이적이기도 하다.
용어 "T 세포"는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 용어 T 세포는 T 헬퍼 1형 T 세포 및 T 헬퍼 2형 T 세포 둘 다도 포함한다. 본원에서 사용된 T 세포는 기능, 및 T 세포 수용체와 항원의 결합도 용이하게 하는 세포 표면 항원(클러스터 분화 항원 또는 CD)에 의해 일반적으로 두 주요 부류들, 즉 헬퍼 T(TH) 세포와 세포독성 T 림프구(CTL)로 분류된다.
성숙 헬퍼 T(TH) 세포는 표면 단백질 CD4를 발현하고 CD4+ T 세포로서 지칭된다. T 세포 발생 후, 성숙된 미감작 T 세포는 흉선을 떠나고 림프절을 포함하는 신체 전체로 퍼지기 시작하다. 미감작 T 세포는 그 자신이 반응하도록 프로그래밍되어 있는 항원에 노출된 적이 없는 T 세포이다. 이 T 세포는 모든 T 세포들처럼 T 세포 수용체-CD3 복합체를 발현한다. T 세포 수용체(TCR)는 불변 영역 및 가변 영역 둘 다로 구성된다. 가변 영역은 T 세포가 반응할 수 있는 항원을 결정한다. CD4+ T 세포는 클래스 II MHC에 대한 친화성을 가진 TCR을 갖고, CD4는 흉선에서 성숙 동안 MHC 친화성을 결정하는 데 관여한다. 클래스 II MHC 단백질은 일반적으로 전문화된 항원 제시 세포(APC)의 표면에서만 발견된다. 수지상 세포가 MHC 클래스 II를 항시적으로(항상) 발현하는 유일한 세포 군이지만, 전문화된 항원 제시 세포(APC)는 일차적으로 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포이다. 일부 APC들, 예컨대, 여포성 수지상 세포도 천연(또는 프로세싱되지 않은) 항원을 그의 표면에 결합시키나, 프로세싱되지 않은 항원은 T 세포와 상호작용하지 않고 그의 활성화에 관여하지 않는다. MHC 클래스 I 단백질에 결합하는 펩타이드 항원은 전형적으로 MHC 클래스 II 단백질에 결합하는 펩타이드 항원보다 더 짧다.
세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 킬러 T 세포로서도 공지되어 있는 세포독성 T 림프구(CTL)는 표적화된 세포에서 아폽토시스를 유도하는 림프구를 지칭한다. CTL은 표적 세포 표면에서의 TCR과 프로세싱된 항원(Ag)의 상호작용을 통해 표적 세포와 함께 항원 특이적 접합체를 형성하여, 표적화된 세포의 아폽토시스를 야기한다. 아폽토시스 바디는 대식세포에 의해 제거된다. 용어 "CTL 반응"은 CTL 세포에 의해 매개된 일차 면역 반응을 지칭하기 위해 사용된다. 세포독성 T 림프구는 그의 표면에서 T 세포 수용체(TCR) 및 CD8 분자 둘 다를 가진다. T 세포 수용체는 HLA 클래스 I의 분자와 복합체를 형성한 펩타이드를 인식할 수 있고 이 펩타이드에 결합할 수 있다. 각각의 세포독성 T 림프구는 특정 MHC/펩타이드 복합체에 결합할 수 있는 고유 T 세포 수용체를 발현한다. 대다수의 세포독성 T 세포들은 특정 항원을 인식할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. TCR이 클래스 I MHC 분자에 결합하기 위해, 전자는 클래스 I MHC 분자의 불변 부분에 결합하는, CD8로서 지칭되는 당단백질을 동반해야 한다. 따라서, 이 T 세포는 CD8+ T 세포로서 지칭된다. CD8과 MHC 분자 사이의 친화성은 T 세포와 표적 세포를 항원 특이적 활성화 동안 함께 가깝게 결합된 상태로 유지한다. CD8+ T 세포는 일단 활성화되면 T 세포로서 인식되고 일반적으로 면역 시스템 내에서 소정의 세포독성 역할을 가진 것으로서 분류된다. 그러나, CD8+ T 세포는 일부 사이토카인들을 만드는 능력도 가진다.
"T 세포 수용체(TCR)"는 항원의 제시에 반응한 T 세포의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체이다. TCR은 일반적으로 조립되어 이종이량체를 형성하고 CD3 형질도입 서브유닛과 회합하여 세포 표면에 존재하는 T 세포 수용체 복합체를 형성하는 2개의 쇄들인 알파 및 베타로부터 만들어진다. TCR의 각각의 알파쇄 및 베타쇄는 면역글로불린 유사 N-말단 가변(V) 및 불변(C) 영역, 소수성 막횡단 도메인 및 짧은 세포질 영역으로 구성된다. 면역글로불린 분자의 경우, 알파쇄 및 베타쇄의 가변 영역은 T 세포의 집단 내에서 매우 다양한 항원 특이성을 생성하는 V(D)J 재조합에 의해 생성된다. 그러나, 온전한 항원을 인식하는 면역글로불린과 대조적으로, T 세포는 MHC 제한으로서 공지되어 있는 가외의 특성을 T 세포에 의한 항원 인식에 도입하는, MHC 분자와 회합된 프로세싱된 펩타이드 단편에 의해 활성화된다. T 세포 수용체를 통한 기증자와 수용자 사이의 MHC 차이의 인식은 T 세포 증식 및 GVHD의 잠재적 발생으로 이어진다. TCR의 정상 표면 발현은 복합체의 모든 7개 성분들의 조화된 합성 및 조립에 의존한다는 것이 밝혀졌다(Ashwell and Klusner 1990). TCRα 또는 TCRβ의 불활성화는 T 세포의 표면으로부터의 TCR의 제거를 야기하여, 동종항원의 인식을 방해함으로써 GVHD를 예방할 수 있다. 그러나, TCR 파괴는 일반적으로 CD3 신호전달 성분의 제거를 야기하고 추가 T 세포 증폭의 수단을 변경시킨다.
용어 "HLA 펩티돔"은 특정 HLA 클래스와 특이적으로 상호작용하고 수천 개의 상이한 서열들을 포괄할 수 있는 펩타이드의 풀을 지칭한다. HLA 펩티돔은 세포에서 발현된 정상 단백질 및 비정상 단백질 둘 다로부터 유래한 다양한 펩타이드들을 포함한다. 따라서, HLA 펩티돔은 암 특이적 펩타이드의 확인을 위해, 종양 면역요법제의 개발을 위해, 그리고 암 세포 내에서의 단백질 합성 및 분해 체계에 대한 정보의 공급원으로서 연구될 수 있다. 일부 실시양태들에서, HLA 펩티돔은 가용성 HLA 분자(sHLA)의 풀이다. 일부 실시양태들에서, HLA 펩티돔은 막 HLA(mHLA)의 풀이다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 전문 항원 제시 세포(예를 들면, B 림프구, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포)뿐만 아니라, 다른 항원 제시 세포(예를 들면, 각질세포, 내피 세포, 성상세포, 섬유모세포, 희소돌기교세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 아교 세포(뇌), 췌장 베타 세포 및 혈관 내피 세포)도 포함한다. "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 주조직적합성 복합체(MHC) 분자를 발현하고 그의 표면에서 MHC와 복합체를 형성한 외부 항원을 표시할 수 있는 세포이다.
보편적 IP 파이프라인: 보편적 단일-대립유전자 HLA-펩타이드 복합체 확인 플랫폼
후천성 면역 반응은 부분적으로 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 분자에 결합된 질환 관련 항원을 표시하는 세포를 확인하고 제거하는 세포독성 CD8+ T 세포의 능력에 의존한다. HLA 클래스 I 단백질(HLA-A, B 및 C)은 인체 내의 거의 모든 유핵 세포들의 표면에서 발현되고 CD8+ T 세포 수용체에 의한 검출을 위해 짧은 펩타이드를 제시하는 데 요구된다. HLA-결합된 펩타이드는 적재 전에 프로테아좀 및 ER 펩티다제에 의해 절단되고 HLA 클래스 I 단백질에 의해 표시되는 내생성 또는 외부 단백질로부터 비롯된다. HLA 유전자는 인간 집단 전체에 걸쳐 가장 높은 다형성을 가진 유전자이고, 현재까지 10,000개 초과의 HLA 클래스 I 대립유전자 변이체들이 확인되었다(Robinson et al., 2015). 각각의 HLA 대립유전자는 약 1,000개 내지 10,000개의 고유 펩타이드들에 결합하고 이들을 T 세포에게 제시하는 것으로 추정된다; 인간 단백질 코딩 유전자로부터의 약 1,000만개의 잠재적 9머 펩타이드들의 ≤0.1%(Bassani-Sternberg et al., 2015; Hunt et al., 1992; Rammensee et al., 1995, 1999; Rock et al.; Vita et al., 2015; Walz et al., 2015).
클래스 I과 달리, HLA 클래스 II 단백질(HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP)은 염증 신호에 반응하여 항원 제시 세포(APC) 및 상피, 혈관 및 결합 조직 세포의 표면에서만 발현된다. 외부 항원에 대한 면역 반응을 위해, 가장 흔히 외생성 단백질로부터 유래한 펩타이드가 HLA 클래스 II 분자에 의해 CD4+ T 세포에게 제시될 것이 요구된다(Roche and Furuta, 2015). CD4+ T 세포는 일단 활성화되면 B 세포 분화 및 항체 생성뿐만 아니라 CD8+ T 세포 반응도 촉진한다. CD4+ T 세포는 다른 면역 세포의 분화를 활성화시키고 유도하는 사이토카인 및 케모카인도 분비한다. HLA 클래스 II 분자는 클래스 I 펩타이드 결합 홈보다 더 개방된 펩타이드 결합 홈을 형성하도록 상호작용하는 α쇄 및 β쇄의 이종이량체이다(Unanue et al., 2016). HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩타이드는 상기 홈으로부터 돌출되는 N-말단 또는 C-말단 쪽에서 플랭킹 잔기를 가진 9-아미노산 결합 코어를 가진 것으로 여겨진다(Jardetzky et al., 1996; Stern et al., 1994). 이 펩타이드는 길이가 통상적으로 12개 내지 16개 아미노산이고 종종 결합 레지스터의 위치 P1, P4, P6/7 및 P9에서 3개 또는 4개의 고착 잔기를 함유한다(Rossjohn et al., 2015). α쇄 및 β쇄 페어링의 불균질성, 코어 결합 에피토프를 신뢰할만하게 배정하는 능력을 제한하는 데이터의 복잡성, 및 고해상 생화학적 분석을 위해 요구된 면역침전 등급의 대립유전자 특이적 항체의 결여 때문에 HLA 클래스 II 분자의 대립유전자 특이적 펩타이드 결합 특성에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
펩타이드 결합 규칙은 HLA 대립유전자의 서브세트에 대해 광범위하게 연구되었고(Vita et al., 2015) 결합을 예측하는 진보된 신경망 기반 알고리즘에 코딩되어 있다(Hoof et al., 2009; Lundegaard et al., 2008). 그러나, 여러 요인들이 HLA 대립유전자에 존재하는 펩타이드를 예측하는 힘을 제한한다. 먼저, 이 알고리즘들이 훈련되는 펩타이드 데이터의 기원이 펩타이드 라이브러리 스크린부터 내생적으로 처리되고 제시된 펩타이드의 에드만 분해 및 질량 분광측정 기반 시퀀싱에 이르기까지 다양한다(Boen et al., 2000; Rammensee et al., 1995, 1999; Vita et al., 2015). 질량 분광측정 기반 펩타이드 확인은 IEDB에서의 총 확인의 약 30%를 차지한다. 질량 분광측정은 도날드 에프. 헌트(Donald F. Hunt)와 동료들에 의한 선구적 연구(Cobbold et al., 2013; Hunt et al., 1992; Meadows et al., 1997; Mohammed et al., 2008; Zarling et al., 2000, 2006), 및 지난 20년에 걸쳐 많은 연구진들에 의해 입증된 기계사용의 개선(Bassani-Sternberg et al., 2015; Caron et al., 2015; Mommen et al., 2014) 때문에 HLA-회합된 펩타이드 시퀀싱의 바람직한 방법이 되었다. 둘째, 많은 기존 예측 알고리즘들은 결합을 예측하는 데 초점을 맞추었으나 결합 전에 펩타이드를 생성하고 수송하는 내생성 과정을 전체적으로 고려할 수 없다(Larsen et al., 2007). 셋째, 많은 HLA 대립유전자들에 대한 결합 펩타이드의 수는 신뢰할만한 예측자를 개발하기에는 너무 작다. 그러나, 현재까지, 고품질 자원 데이터 세트의 생성은 대단히 큰 양의 투입 세포 물질을 필요로 하는 비효율적인 프로토콜 및 HLA-펩타이드 시퀀싱을 위한 데이터베이스 검색 수단의 결여에 의해 방해되었다(Caron et al., 2015; Hoof et al., 2009; Lundegaard et al., 2008; Vita et al., 2015).
본원은 생존 세포 및 세포 용해물로부터의 펩타이드-HLA 클래스 I 및 II 복합체에 대한 고유 생화학적 농축 전략을 개시한다. N-말단 또는 C-말단 태그 서열(예를 들면, BAP 또는 HA)을 함유하는 HLA 분자는 세포 표면 또는 세포 용해물에서 표지부착될 수 있다. 예를 들면, N-말단 또는 C-말단 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP) 서열을 함유하는 HLA 분자는 세포 표면 또는 세포 용해물에서 효소에 의해 바이오틴으로 표지부착될 수 있다. 예를 들면, N-말단 또는 C-말단 HA 서열을 함유하는 HLA 분자는 HA 특이적 항체를 사용함으로써 복합체 세포 혼합물로부터 농축될 수 있다. 예시적 실시양태에서, 바이오틴으로 표지부착된 HLA-펩타이드 복합체는 스트렙타비딘/NeutrAvidin 비드를 사용함으로써 복합체 세포 혼합물로부터 농축되고, 농축된 HLA-펩타이드 복합체는 분석되거나 특징화된다. 예시적 실시양태에서, HA로 표지부착된 HLA-펩타이드 복합체는 HA 특이적 항체를 사용함으로써 복합체 세포 혼합물로부터 농축되고, 농축된 HLA-펩타이드 복합체는 분석되거나 특징화된다. 예를 들면, 회합된 펩타이드는 용출될 수 있고 LC-MS/MS에 의해 시퀀싱될 수 있다. 중요하게는, 본 개시된 방법은 HLA-펩타이드 복합체를 분석하고 특징화하기 위한 보편적 플랫폼을 제공한다. 예를 들면, 본 개시된 방법은 모든 가능한 클래스 I 또는 II 구축물들을 발현하는 세포주로부터 내생적으로 제시된 펩타이드를 확인하기 위한 보편적 플랫폼을 제공한다.
본원은 분명한 펩타이드:대립유전자 배정을 가능하게 하는 단일 HLA 클래스 I 및 클래스 II 대립유전자 발현 세포주를 개시한다(Shimizu and DeMars, 1989; Shimizu et al., 1986). 이것은 현재의 HLA-결합된 펩타이드 검출 방법에 대한 개선인데, 이는 대다수의 MS 기반 연구들이 다수의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 분자들에 결합된 리간드들의 지저분한 혼합물을 용출하고 시퀀싱하는 단계를 포함하여, 대립유전자 배정을 위해 친화성 예측 및 종종 데콘볼루션을 요구하기 때문이다(Bassani-Sternberg and Gfeller, 2016). 가용성 HLA 형질감염된 세포주를 사용한 연구는 단일 HLA 대립유전자에 대한 펩타이드 결합 에피토프를 유도할 수 있었으나, 현재까지 대다수의 포괄적인 실험들은 200개 미만의 고유 펩타이드들만을 확인하였고 여러 자릿수 더 많은 출발 세포 물질을 요구하였다(Hawkins et al., 2008). 본 개시된 방법은 펩타이드:HLA 배정의 불확실성을 제거함으로써, 종래 노력보다 더 적은 세포 물질을 사용하여 펩타이드 항원 프로세싱 및 제시와 관련된 HLA-펩타이드 리간돔(ligandome) 및 규칙의 더 깊고 더 정확한 평가를 용이하게 한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 세포에 의해 제시된 클래스 II HLA 이종이량체들을 식별하여, 에피토프 맵핑을 개선하기 위해, 예를 들면, 화학적으로 표지부착된 가변 β쇄(바이오티닐화)를 포함한다. N-말단 또는 C-말단에서 태그, 예컨대, 바이오틴 수용체 펩타이드 서열(BAP)을 함유하는 HLA 클래스 I 및 클래스 II 구축물은 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. N-말단 및 C-말단 친화성 태그부착은 내생성 HLA를 발현하는 세포로부터의 HLA 대립유전자 선택적 면역정제를 가능하게 한다. N-말단 친화성 태그부착은 세포 표면 위에 제시된 복합체의 HLA 대립유전자 선택적 면역정제를 가능하게 한다. 예를 들면, 형질감염 또는 형질도입 후, N-말단 바이오티닐화는 세포 표면 위에 제시된 HLA 복합체와 세포 용해물 중의 모든 HLA-펩타이드 복합체들을 식별할 수 있게 한다. 예를 들면, 온전한 세포 표면(용해 없음)에서의 HLA-펩타이드 복합체의 바이오티닐화는 내생적으로 처리되고 제시된 펩타이드의 비편향된 질량 분광측정(MS) 시퀀싱 방법을 가능하게 한다. 본원에 개시된 농축 방법, 예컨대, 면역침전 농축 방법은 세포 샘플의 고효율적 분석을 가능하게 한다.
본원은 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 단계; 세포의 집단의 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 및 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 단계를 포함하는, HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 2개 이상의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들에 대해 상기 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 2개 이상의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 배출되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 발현될 때 세포막에 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체가 아니다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 단일 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 펩타이드에 작동적으로 연결된 상이한 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 상이한 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 하나 이상의 세포를 각각 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 및 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분을 특징화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 펩타이드를 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을 하나 이상의 펩타이드와 접촉시키거나 세포의 집단에서 하나 이상의 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 RNA이고, 임의로 RNA는 mRNA이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 서열을 결정하는 단계, 및 임의로 펩타이드 또는 이의 부분이 변형되는지를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석, 질량 분광측정 분석, MS 분석, MS/MS 분석, LC-MS/MS 분석, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 결합 친화성 또는 안정성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에서 펩타이드와 HLA 분자의 회합을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암, 감염성 물질에 의한 감염 또는 자가면역 반응이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체로부터의 하나 이상의 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함하고, 임의로 이때 상기 펩타이드는 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터의 펩타이드의 하나 이상의 영역을 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질로부터 유래한 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 일차 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 질환 또는 질병을 가진 대상체에 매칭된다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 약물(예를 들면, 생물제제) 과민성에 대해 스크리닝하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 투여된 생물제제(예를 들면, 단백질, 펩타이드 또는 항체 약물), 투여된 생물제제의 단편 또는 프로세싱된 생물제제 단편이 T 세포에게 제시되는지를 평가하는 단계를 포함한다. 이 에피토프들은 대상체에서 불리한 효과를 야기할 수 있으므로, 투여된 생물제제가 대상체에서 어떻게 프로세싱되는지를 모니터링해야 한다. 예를 들면, HIV 약물(예를 들면, 아바카버(Abacavir))은 HLA 분자에 결합할 수 있고 일부 HLA 대립유전자들(예를 들면, HLA-B5701)에 대한 펩타이드 결합 모티프를 변화시킬 수 있다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드는 항원 제시 세포에 의해 제시될 때 대상체로부터의 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체를 비-암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체와 비교하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 복수의 세포의 집단들을 포함하고, 각각의 세포의 집단은 상이한 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 복수의 세포의 집단들의 각각의 세포의 집단은 동일한 또는 별개의 용기 내에 있다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 특징화하는 단계 전에 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드의 말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 단계도 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-아웃이다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 I HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 II HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA 클래스 II α쇄, HLA 클래스 II β쇄, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자는 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자는 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 동일한 또는 상이한 친화성 수용체 펩타이드에 작동적으로 연결된 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 제2 다중핵산을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 외로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 내로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단게를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는 태그 서열을 포함하고; 임의로, 이때 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 고체 표면은 비드이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자로 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 N-말단 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을 다중핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 접촉시키는 단계는 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을, 다중핵산을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태들에서, 다중핵산은 세포의 집단의 게놈 내로 안정하게 삽입된다.
일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 발현시키는 단계도 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드와 상이하고 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석 또는 질량 분광측정, 예컨대, 탠덤 질량 분광측정을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 하나 이상의 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에 상응하는 펩타이드 서열을 펩타이드 데이터베이스로부터 수득하는 단계를 포함하고; 이때 수득된 하나 이상의 서열은 하나 이상의 펩타이드의 서열을 확인시켜준다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO 및 THP1로부터 선택된 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포주는 하나 이상의 사이토카인, 체크포인트 억제제, 후성적 활성 약물, IFN-γ, 항원 프로세싱을 변경시키는 물질(예컨대, 펩티다제 억제제, 프로테아좀 억제제 및 TAP 억제제), 또는 이들의 조합으로 처리된다.
일부 실시양태들에서, 펩타이드 데이터베이스는 예컨대, 변형 데이터베이스를 갖지 않거나 변형 데이터베이스를 가진 비-효소 특이성 펩타이드 데이터베이스이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 역전된-데이터베이스 검색 전략을 이용하여 펩타이드 데이터베이스를 검색하는 단계도 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 105개의 세포들, 적어도 106개의 세포들 또는 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 수지상 세포, 대식세포, 암 세포 또는 B 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 종양 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 세포로부터 상기 HLA-펩타이드 복합체를 단리하기 전에 물질과 접촉된다. 일부 실시양태들에서, 상기 물질은 염증 사이토카인, 화학 물질, 보강제, 치료제 또는 방사선이다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 발현에 대해 어세이하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 어세이하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 시퀀싱하는 단계, 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 RNA를 검출하는 단계, 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질을 검출하는 단계, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 상이한 HLA 대립유전자들에 대해 상기 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 각각의 상이한 HLA 대립유전자는 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 상이한 HLA 대립유전자를 코딩하는 각각의 다중핵산은 고유 바코드 서열을 포함한다.
본원은 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스를 제공한다. 본원은 매번 상이한 HLA 대립유전자를 사용하여 본원에 기재된 방법을 반복적으로 수행함으로써 수득된 2개 이상의 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스들의 조합을 제공한다. 본원은 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하기 위한 예측 알고리즘을 생성하는 방법으로서, 본원에 기재된 펩타이드 서열 데이터베이스 또는 본원에 기재된 조합으로 기계를 훈련시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 기계는 하나 이상의 선형 모델, 지지 벡터 기계, 결정 트리 및 신경망을 겸비한다. 일부 실시양태들에서, 기계를 훈련시키는 데 사용된 변수는 펩타이드 서열, 아미노산 물성, 펩타이드 물성, 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준, 단백질 안정성, 단백질 번역 속도, 유비퀴틴화 부위, 단백질 분해 속도, 리보좀 프로파일링으로부터의 번역 효율, 단백질 절단가능성, 단백질 국소화, TAP 수송을 용이하게 하는 숙주 단백질의 모티프, 자가포식되는 숙주 단백질, 리보좀 지체에 유리한 모티프, 및 NMD에 유리한 단백질 특징으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변수를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 지체에 유리한 모티프는 폴리프롤린 또는 폴리라이신 스트레치를 포함한다. 일부 실시양태들에서, NMD에 유리한 단백질 특징은 긴 3' UTR, 마지막 엑손:엑손 연접부로부터 업스트림 쪽으로 50개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어져 있는 정지 코돈, 및 펩타이드 절단가능성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원은 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하는 방법으로서, HLA 대립유전자에 대해 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 펩타이드 서열 데이터베이스로 훈련된 기계로 펩타이드의 서열을 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 이때 상기 공급원 단백질 발현은 기계에 의해 사용된 예측 변수이다. 일부 실시양태들에서, 발현 수준은 공급원 단백질의 양 또는 상기 공급원 단백질을 코딩하는 RNA의 양을 측정함으로써 측정된다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 각각 코딩하는 2개 이상의 서열들을 포함하는 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 (a) 상이한 재조합 HLA 클래스 I α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, (b) 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 (c) β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 각각 포함하는 2개 이상의 서열들을 포함하는 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 (a) 재조합 HLA 클래스 II α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, (b) 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 (c) HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 재조합 다중핵산은 단리된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 분자를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 동일한 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 상이한 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된다.
일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 2개 이상의 친화성 수용체 펩타이드들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 3개 이상의 서열들을 포함하고, 이때 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 3개 이상의 서열들 중 적어도 2개의 서열들은 동일한 친화성 수용체 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 2개 이상의 친화성 수용체 펩타이드들은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들 각각에 고유하다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 친화성 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다.
일부 실시양태들에서, 2개 이상의 재조합 다중핵산들의 경우, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열은 세포의 게놈 내로 안정하게 삽입된다.
일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 HA 태그를 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 HLA 및 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
본원은 본원에 기재된 조성물의 다중핵산에 의해 코딩된 2개 이상의 단리된 폴리펩타이드 분자들을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 다중핵산에 의해 코딩된 2개 이상의 폴리펩타이드 분자들을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 조성물은 환자의 HLA 유형에 특이적인 펩타이드 또는 이 펩타이드를 코딩하는 다중핵산을 사용함으로써 제제화된다.
본원은 본원에 기재된 조성물의 2개 이상의 다중핵산들로 2개 이상의 세포들을 형질도입하거나 형질감염시키는 단계를 포함하는 세포의 제조 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드를 제공한다.
본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 세포는 HLA-펩타이드 복합체로서 펩타이드를 제시한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 면역 반응은 T 세포 면역 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 CD8 T 세포 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 CD4 T 세포 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응이다.
본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태들에서, 질환은 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염성 물질은 병원체, 임의로 바이러스 또는 세균, 또는 기생충이다. 일부 실시양태들에서, 바이러스는 BK 바이러스(BKV), 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 림프구친화성 바이러스(HTLV-1), 인플루엔자 바이러스, RSV, HPV, 광견병, 볼거리 풍진 바이러스, 폴리오바이러스, 황열, A형 간염, B형 간염, 로타바이러스, 수두 바이러스, 인간 유두종바이러스(HPV), 천연두, 대상포진, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 세균은 클렙시엘라 종, 트로페리마 휘플레이, 마이코박테리움 레프라, 마이코박테리움 레프로마토시스 및 마이코박테리움 튜버큘로시스, 장티푸스, 폐렴구균, 수막염구균, 해모필루스 B, 탄저병, 파상풍 톡소이드, 수막염구균 군 B, bcg, 콜레라 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 연충 또는 원생동물이다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 레이쉬마니아 종, 플라스모듐 종, 트리파노소마 크루지, 아스카리스 룸브리코이데스, 트리쿠리스 트리키우라, 넥카터 아메리카누스, 스키스토소마 종 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원은 재조합 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 재조합 HLA에 작동적으로 연결된 친화성 수용체 펩타이드를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계; 및 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계를 포함하는, 면역원성 펩타이드를 농축하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 면역원성 펩타이드의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 LC-MS/MS를 이용하는 단계를 포함한다.
본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
HLA-펩타이드 복합체의 농축
HLA 클래스 I 및 클래스 II 당단백질을 코딩하는 유전자는 인간 게놈에서 가장 다형성이 높은 코딩 서열에 속한다. 그러나, 임의의 HLA 클래스 I 중쇄 또는 HLA 클래스 II α 또는 β쇄를 선택적으로 포획하는 항체에 의해 표적화될 수 있는 HLA 클래스 I 중쇄 및 HLA 클래스 II α쇄 및 β쇄 각각에 대한 상대적으로 불변 또는 변화 없는 영역이 있다. 그러나, α쇄와 β쇄는 정상적으로 생체내에서 서로 회합되기 때문에, 온전한 가용성 HLA의 α쇄의 면역정제는 β쇄를 공-침전시킬 수 있고 역의 경우도 마찬가지이다. HLA-회합된 폴리펩타이드를 농축하기 위한 항-HLA 클래스 II 항체는 α 또는 β쇄에 존재하는 보존된 에피토프를 인식할 수 있다.
HLA 대립유전자 특이적 항체를 사용하거나 비-HLA 특이적 시약을 사용하는 농축 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, HLA-C 폴리펩타이드는 전형적으로 HLA-A 및 HLA-B보다 더 낮은 수준으로 개체에 의해 발현된다. 따라서, 항체를 사용한 HLA-C의 검출을 향상시키기 위해, 다른 정제 방법 이외에 HLA-C 특이적 항체를 사용한 HLA-C의 특이적 면역정제를 제공하는 것이 유리할 수 있다. 개별 HLA 쇄들에 특이적으로 결합하는 단일클론 또는 다중클론 항체의 많은 예가 상업적으로 입수될 수 있다.
본원은 하나 이상의 단일 대립유전자 HLA 폴리펩타이드 복합체를 농축하기 위한 보편적 면역정제(IP) 파이프라인을 제공한다. HLA-회합된 폴리펩타이드를 농축하는 이러한 방법의 예는 면역정제 단계를 포함하는 방법이다. 보편적 IP 파이프라인은 세포 형질감염 또는 형질도입을 통해 발현 벡터로부터 발현되는 친화성 태깅된 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자를 코딩하는 DNA 구축물로 구성된 보편적 IP 구축물을 포함한다. 발현 벡터의 비한정적 예는 렌티바이러스 벡터이다.
보편적 IP로 형질감염되거나 형질도입된 세포를 증폭하거나 선택한 후, LC-MS/MS 서열 분석 전에 증폭시켰다. 형질감염 또는 형질도입에 적합한 세포의 집단은 예를 들면, 단일 HLA 클래스 I 대립유전자가 발현되는 클래스 I 결핍 세포주, 단일 쌍의 HLA 클래스 II 대립유전자들이 발현되는 클래스 II 결핍 세포주, 또는 단일 HLA 클래스 I 및/또는 단일 쌍의 클래스 II 대립유전자들이 발현되는 클래스 I 및 클래스 II 결핍 세포주를 포함한다. 한 예시적 실시양태로서, 클래스 I 결핍 B 세포주는 B721.221이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 A375, 또는 HEK293T, HeLa, 또는 expi293이다. 그러나, 클래스 I 및/또는 클래스 II가 결핍되어 있는 다른 세포의 집단이 생성될 수 있다는 것은 숙련된 자에게 명확하다. 클래스 I 및/또는 클래스 II 결핍 세포를 생성하는 방법뿐만 아니라 클래스 I 및/또는 클래스 II 결핍 세포주도 당분야에서 공지되어 있고, 내생성 클래스 I 또는 클래스 II 유전자를 결실/불활성화시키는 예시적 방법은 예를 들면, THP-1 세포에서의 CRISPR-Cas9 매개 게놈 편집을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 전문 항원 제시 세포, 예컨대, 대식세포, B 세포 및 수지상 세포이다. 세포는 B 세포 또는 수지상 세포일 수 있다. 일부 실시양태들에서, 세포는 종양 세포, 또는 종양 세포주로부터의 세포이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 환자로부터 단리된 세포이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 감염성 물질 또는 이의 부분을 함유한다.
일부 실시양태들에서, 보편적 IP 구축물은 친화성 수용체 태그 및 친화성 분자를 포함하는 클래스 I 또는 클래스 II HLA 구축물을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 보편적 IP 구축물은 적어도 하나의 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 태그 및 친화성 분자를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, 수포성 구내염 바이러스 당단백질로부터 유래한 VSV-G 에피토프 태그, 또는 원숭이 바이러스 5(SV5)의 파라믹소바이러스의 P 단백질 및 V 단백질에서 발견되는 작은 에피토프(Pk)로부터 유래한 V5 태그이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 태그 서열(예를 들면, 3x 폴리-히스티딘 태그, 3x FLAG 태그)의 다수의 반복부들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 태그 서열(예를 들면, 3x 폴리-히스티딘 태그, 3x FLAG 태그)의 다수의 반복부들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 인식가능한 에피토프(항체 결합 부위)를 HLA-단백질에 추가하여 상응하는 항체의 결합을 제공함으로써, 태깅된 단백질의 확인 또는 친화성 정제를 가능하게 하는 펩타이드 태그의 일종인 "에피토프 태그"이다. 에피토프 태그의 비한정적 예는 IgG에 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP) 또는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 펩타이드 서열을 포함한다. 다수의 다른 태그 모이어티들이 통상의 기술을 가진 당업자에게 공지되어 있고 이 당업자에 의해 예상될 수 있고 본원에서 고려된다. 임의의 펩타이드 태그가 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 요소로서 발현될 수 있는 한 사용될 수 있다.
친화성 태그는 HLA 대립유전자의 N-말단 또는 C-말단에 배치될 수 있다. 절단 서열, 예컨대 F2A, 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES)는 α쇄와 β2 마이크로글로불린(클래스 I) 사이 또는 α쇄와 β쇄(클래스 II) 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 단일 클래스 I HLA 대립유전자는 HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 및 HLA-B*14:02, 또는 HLA-E*01:01이고, 클래스 II HLA 대립유전자는 HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 및 HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01, 또는 HLA-DRB*07:01이다. 일부 실시양태들에서, 절단 서열은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 서열이다. 예를 들면, 절단 서열은 EGRGSLLTCGDVEENPGP(T2A), ATNFSLLKQAGDVEENPGP(P2A), QCTNYALLKLAGDVESNPGP(E2A), 또는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(F2A)일 수 있다.
일부 실시양태들에서, HLA-펩타이드 복합체 면역정제는 바이오틴에 기반을 둔다. 일부 실시양태들에서, HLA-펩타이드 복합체 면역정제는 스트렙타비딘 또는 NeutrAvidin에 기반을 둔다. 일부 실시양태들에서, HLA-펩타이드 복합체는 크로마토그래피 기법, 예컨대, HPLC에 의해 생물학적 샘플로부터 농축될 수도 있다. 일부 실시양태들에서, 매우 풍부한 혈청 단백질의 고갈을 이용하여 HLA-펩타이드 복합체를 농축할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 풍부한 혈청 단백질을 제거하는 방법은 안료 리간드(알부민의 경우), 단백질 A 및 G(γ-글로불린의 경우), 또는 높은 친화성으로 결합하고 샘플로부터 이 종을 선택적으로 고갈시키는 특이적 항체를 포함한다(Govorukhina, Reijmers et al. 2006). 이러한 전략은 단일 질량 분광측정 분석에서 확인된 HLA 유래의 펩타이드 서열의 수를 증가시킬 것이다.
생물학적 샘플로부터의 특정 HLA 서열의 해상도를 최적화하기에 바람직한 농축도는 생물학적 샘플 중의 HLA 서열의 초기 농도, 및 상기 샘플 중의 다른 비-HLA 단백질의 농도 및 성질에 의해 좌우될 것이다.
생물학적 샘플 내에서 HLA-펩타이드 복합체를 농축하기 위해, 고전적 단백질 정제 기법을 단독으로, 또는 본원에서 제공된 보편적 IP 파이프라인 방법과 함께 이용할 수 있다. 고전적 단백질 분리(정제) 기법은 크기 차이(한외여과, 겔 여과, 또는 크기 배제 크로마토그래피); 전하 차이(pi)(음이온/양이온 교환 크로마토그래피, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피); 및 크기 차이와 전하 차이의 조합(1D 또는 2D 전기영동)에 기반을 둔다. 면역정제 옵션은 HLA 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 또는 다중클론 항체의 사용을 포함한다. 다른 단백질 친화성 정제 옵션은 HLA에 결합하는 것으로 알려져 있는 단백질의 사용을 포함하고, 이 단백질은 모든 HLA 클래스 I 단백질들의 α3 도메인에 결합하는 CD8; 모든 HLA 클래스 II 단백질들에 결합하는 CD4; 자가 T 세포 수용체; 및 높은 친화성으로 HLA에 결합하는 항원성 펩타이드를 포함한다(컴퓨터 모델링 알고리즘을 사용하여 펩타이드/HLA 결합 특성을 예측할 수 있다). 이 높은 HLA 친화성 단백질 옵션들 중 임의의 HLA 친화성 단백질 옵션을 불용성 고체 지지체에 고정시켜, 액체 생물학적 샘플로부터 HLA를 포획하는 데 사용될 수 있는 친화성 매트릭스를 제조할 수 있다. 적절한 용출 조건은 샘플의 HLA 내용물의 농축 및 정제(단리)를 야기할 것이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다.
질환 특이적 항원
일부 실시양태들에서, 적어도 하나의 항원성 펩타이드 분자의 크기는 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개, 약 30개, 약 31개, 약 32개, 약 33개, 약 34개, 약 35개, 약 36개, 약 37개, 약 38개, 약 39개, 약 40개, 약 41개, 약 42개, 약 43개, 약 44개, 약 45개, 약 46개, 약 47개, 약 48개, 약 49개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개, 약 110개 또는 약 120개 이상의 아미노산 분자 잔기, 및 이 범위 내에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태들에서, 항원성 펩타이드 분자는 50개 이하의 아미노산을 가진다. 일부 실시양태들에서, 항원성 펩타이드 분자는 약 20개 내지 약 30개의 아미노산을 가진다. 더 긴 펩타이드는 여러 방식들로 디자인될 수 있다. 예를 들면, HLA 결합 영역이 예측되거나 공지되어 있을 때, 더 긴 펩타이드는 각각 상응하는 유전자 생성물의 N-말단 및 C-말단 쪽으로 0개 내지 10개의 아미노산의 연장을 가진 개별 결합 펩타이드로 구성될 수 있다. 더 긴 펩타이드는 각각에 대한 연장된 서열을 가진 결합 펩타이드들 중 일부 또는 전부의 콘카타머화(concatenation)로 구성될 수도 있다. 또 다른 경우, 시퀀싱이 (예를 들면, 신규 펩타이드 서열을 유발하는 프레임시프트, 통과 판독 또는 인트론 포함으로 인해) 병든 조직에 존재하는 긴(>10개의 잔기) 에피토프 서열을 보여줄 때, 더 긴 펩타이드는 신규 질환 특이적 아미노산의 전체 스트레치로 구성될 수 있다. 상기 경우들 둘 다에서, 더 긴 펩타이드의 사용은 전문 항원 제시 세포, 예컨대, 수지상 세포에 의한 내생성 프로세싱을 요구하고 더 효과적인 항원 제시 및 T 세포 반응의 유도를 유발할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 연장된 서열은 폴리펩타이드의 생화학적 성질(가용성 또는 안정성과 같은 성질)을 개선하거나 펩타이드의 효율적인 프로테아좀 프로세싱에 대한 가능성을 개선하도록 변경된다.
항원성 펩타이드 및 폴리펩타이드는 HLA 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 항원성 펩타이드는 상응하는 천연/야생형 펩타이드보다 더 큰 친화성으로 HLA 단백질에 결합할 수 있다. 항원성 펩타이드는 약 1000 nM 미만, 약 500 nM 미만, 약 250 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만의 IC50을 가질 수 있다. 일부 실시양태들에서, 항원성 펩타이드는 대상체에게 투여되었을 때 자가면역 반응을 유도하지 않고/않거나 면역학적 내성을 유발하지 않는다.
본 개시는 복수의 항원성 펩타이드들을 포함하는 조성물도 제공한다. 항원성 펩타이드의 언급은 대상체의 세포 내로의 펩타이드의 도입을 야기할 수 있는 임의의 적합한 전달 양식(예를 들면, 핵산)을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 상기 조성물은 적어도 3개 이상의 항원성 펩타이드들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 상기 조성물은 적어도 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 상이한 펩타이드들을 함유한다. 일부 실시양태들에서, 상기 조성물은 적어도 20개의 상이한 펩타이드들을 함유한다. 일부 실시양태들에서, 상기 조성물은 기껏해야 20개의 상이한 펩타이드들을 함유한다. 본 개시에 따르면, 상이한 펩타이드들 중 2개 이상의 상이한 펩타이드들은 동일한 폴리펩타이드로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 항원성 돌연변이가 폴리펩타이드를 코딩하는 경우, 항원성 펩타이드들 중 2개 이상의 항원성 펩타이드들은 상기 폴리펩타이드로부터 유래할 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드로부터 유래한 2개 이상의 항원성 펩타이드들은 상기 폴리펩타이드에 걸쳐 있는 타일형 어레이를 포함할 수 있다(예를 들면, 항원성 펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 일부 또는 전부에 걸쳐 있는 일련의 중첩되는 항원성 펩타이드들을 포함할 수 있다). 항원성 펩타이드는 임의의 단백질 코딩 유전자로부터 유래할 수 있다. 항원성 펩타이드는 인간 암의 돌연변이, 또는 감염성 물질 또는 자가면역 질환으로부터 유래할 수 있다.
항원성 펩타이드, 폴리펩타이드 및 유사체는 정상적으로 단백질의 부분이 아닌 추가 화학적 모이어티를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 유도체화된 모이어티는 가용성, 생물학적 수명, 단백질의 흡수 또는 결합 친화성을 개선할 수 있다. 상기 모이어티는 단백질의 임의의 바람직한 부작용 등을 감소시킬 수 있거나 제거할 수도 있다. 이 모이어티에 대한 개요는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000))에서 찾을 수 있다. 예를 들면, 원하는 활성을 가진 항원성 펩타이드 및 폴리펩타이드는 원하는 MHC 분자에 결합하고 적절한 T 세포를 활성화시키기 위해 변형되지 않은 펩타이드의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 증가시키거나 적어도 보유하면서 일부 원하는 특성들, 예를 들면, 개선된 약리학적 특성을 제공하도록 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들면, 항원성 펩타이드 및 폴리펩타이드는 다양하게 변화될, 예컨대, 보존적으로 또는 비보존적으로 치환될 수 있고, 이때 이러한 변화는 그의 사용에 있어서 일부 장점들, 예컨대, 개선된 MHC 결합을 제공할 것이다. 이러한 보존적 치환은 아미노산 잔기를 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것, 예를 들면, 하나의 소수성 잔기를 또 다른 소수성 잔기로 대체하거나, 하나의 극성 잔기를 또 다른 극성 잔기로 대체하는 것을 포괄할 수 있다. 단일 아미노산 치환의 효과는 D-아미노산을 사용함으로써 프로빙될 수도 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 문헌(Merrifield, Science 232:341-347 (1986)), 문헌(Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979)), 및 문헌(Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2d Ed. (1984))에 기재된 바와 같이 잘 공지되어 있는 펩타이드 합성 절차를 이용함으로써 만들어질 수 있다.
항원성 펩타이드는 예를 들면, 아미노산의 추가 또는 결실로 화합물의 아미노산 서열을 연장하거나 감소시킴으로써 변형될 수도 있다. 항원성 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 유사체는 일부 잔기들의 순서 또는 조성을 변경시킴으로써 변형될 수도 있다. 숙련된 당업자는 생물학적 활성을 위해 필수적인 일부 아미노산 잔기들, 예를 들면, 임계 접촉 부위에 있는 아미노산 잔기 또는 보존된 잔기가 일반적으로 생물학적 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 없다는 것을 인식할 것이다. 비-임계 아미노산은 단백질에 천연적으로 존재하는 아미노산, 예컨대, L-a-아미노산 또는 이의 D-이성질체로 한정될 필요는 없으나, 비천연 아미노산, 예컨대, β-γ-δ-아미노산뿐만 아니라 L-a-아미노산의 많은 유도체들도 포함할 수 있다.
항원 펩타이드는 단일 아미노산 치환을 가진 일련의 펩타이드들을 사용하여 MHC 결합에 대한 정전기 전하, 소수성 등의 효과를 확인함으로써 최적화될 수 있다. 예를 들면, 다양한 MHC 분자들 및 T 세포 수용체들에 대한 민감성의 상이한 패턴을 보여주는 펩타이드의 길이를 따라 일련의 양으로 하전된(예를 들면, Lys 또는 Arg) 또는 음으로 하전된(예를 들면, Glu) 아미노산 치환을 만들 수 있다. 추가로, 작은 상대적으로 중성 모이어티, 예컨대, Ala, Gly, Pro 또는 유사한 잔기를 사용한 다중 치환을 이용할 수 있다. 상기 치환은 동종올리고머 또는 이종올리고머일 수 있다. 치환되거나 추가되는 잔기의 수 및 유형은 필수 접촉 점들 사이에 필요한 간격 및 얻고자 하는 일부 기능적 특성(예를 들면, 소수성 대 친수성)에 의해 좌우된다. 모 펩타이드의 친화성에 비해 MHC 분자 또는 T 세포 수용체에 대한 증가된 결합 친화성도 이러한 치환에 의해 달성될 수 있다. 어떠한 경우에서도, 이러한 치환은 예를 들면, 결합을 파괴할 입체적 간섭 및 전하 간섭을 피하도록 선택된 아미노산 잔기 또는 다른 분자 단편을 사용해야 한다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합을 조합하여 최종 펩타이드에 도달할 수 있다.
항원성 펩타이드는 원하는 특성을 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, CTL 활성을 유도하는 상기 펩타이드의 능력은 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 서열에의 연결에 의해 향상될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 면역원성 펩타이드/T 헬퍼 접합체는 스페이서 분자에 의해 연결된다. 일부 실시양태들에서, 스페이서는 생리학적 조건 하에서 실질적으로 비하전된 상대적으로 작은 중성 분자, 예컨대, 아미노산 또는 아미노산 모방 물질을 포함한다. 스페이서는 예를 들면, Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택될 수 있다. 임의로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기로 구성될 필요가 없으므로 이종올리고머 또는 동종올리고머일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항원성 펩타이드는 펩타이드의 아미노 또는 카복시 말단에서 직접적으로 또는 스페이서를 통해 T 헬퍼 펩타이드에 연결될 수 있다. 항원성 펩타이드 또는 T 헬퍼 펩타이드의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. 예시적 T 헬퍼 펩타이드는 파상풍 톡소이드 830-843, 인플루엔자 307-319, 말라리아 서컴스포로조이트(malaria circumsporozoite) 382-398 및 378-389를 포함한다.
단일-대립유전자 HLA 세포주
단일 클래스 I HLA 대립유전자, 단일 쌍의 클래스 II HLA 대립유전자, 또는 단일 클래스 I HLA 대립유전자 및 단일 쌍의 클래스 II HLA 대립유전자를 발현하는 단일-대립유전자 세포주는 적합한 세포의 집단을, 단일 HLA 대립유전자를 코딩하는 다중핵산, 예를 들면, 벡터로 형질도입하거나 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 적합한 세포의 집단은 예를 들면, 단일 HLA 클래스 I 대립유전자가 발현되는 클래스 I 결핍 세포주, 단일 쌍의 HLA 클래스 II 대립유전자가 발현되는 클래스 II 결핍 세포주, 또는 단일 HLA 클래스 I 및/또는 단일 쌍의 클래스 II 대립유전자가 발현되는 클래스 I 및 클래스 II 결핍 세포주를 포함한다. 예시적 실시양태로서, 클래스 I 결핍 B 세포주는 B721.221이다. 그러나, 클래스 I 및/또는 클래스 II가 결핍되어 있는 다른 세포의 집단이 생성될 수 있다는 것은 숙련된 자에게 명확하다. 내생성 클래스 I 또는 클래스 II 유전자를 결실/불활성화시키는 예시적 방법은 예를 들면, THP-1 세포에서의 CRISPR-Cas9 매개 게놈 편집을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 전문 항원 제시 세포, 예컨대, 대식세포, B 세포 및 수지상 세포이다. 세포는 B 세포 또는 수지상 세포일 수 있다. 일부 실시양태들에서, 세포는 종양 세포, 또는 종양 세포주로부터의 세포이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 환자로부터 단리된 세포이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 감염성 물질 또는 이의 부분을 함유한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 예컨대, 적어도 하나의 유전자의 발현 및/또는 활성을 증가시키거나 감소시킴으로써 더 변형된다. 일부 실시양태들에서, 유전자는 면역프로테아좀의 구성원을 코딩한다. 면역프로테아좀은 HLA 클래스 I 결합 펩타이드의 프로세싱에 관여하는 것으로 알려져 있고 LMP2(β1i), MECL-1(β2i) 및 LMP7(β5i) 서브유닛을 포함한다. 면역프로테아좀은 인터페론-감마에 의해 유도될 수도 있다. 따라서, 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 사이토카인, 성장 인자 또는 다른 단백질과 접촉될 수 있다. 세포는 염증 사이토카인, 예컨대, 인터페론-감마, IL-10, IL-6 및/또는 TNF-α에 의해 자극될 수 있다. 세포의 집단은 다양한 환경 조건들, 예컨대, 스트레스(열 스트레스, 산소 고갈, 글루코스 기아, DNA 손상제 등)에 노출될 수도 있다. 일부 실시양태들에서, 세포는 화학요법 약물, 방사선, 표적화된 요법 및 면역요법 중 하나 이상과 접촉된다. 따라서, 본원에 개시된 방법을 이용하여, HLA 펩타이드 프로세싱 및 제시에 대한 다양한 유전자들 또는 조건들의 효과를 연구할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 사용된 조건은 HLA-펩타이드의 집단이 확인될 환자의 조건에 매칭되도록 선택된다.
본 개시의 단일 HLA 대립유전자는 바이러스 기반 시스템(예를 들면, 아데노바이러스 시스템, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 폭스바이러스(poxvirus) 또는 렌티바이러스(lentivirus))을 사용함으로써 코딩될 수 있고 발현될 수 있다. 아데노 관련 바이러스, 아데노바이러스 및 렌티바이러스 전달을 위해 사용될 수 있는 플라스미드는 이미 기재되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제6,955,808호 및 제6,943,019호, 및 미국 특허출원 제20080254008호 참조). 본 개시의 실시에 사용될 수 있는 벡터들 중에서, 레트로바이러스 유전자 전달 방법으로 세포의 숙주 게놈 내로 삽입하여, 종종 삽입된 전이유전자의 장기간 발현을 야기할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 추가로, 많은 상이한 유형의 세포들 및 표적 조직들에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다. 레트로바이러스의 향성(tropism)은 외부 외피 단백질을 도입하여 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 일부 유형의 세포들만을 렌티바이러스로 감염시키기 위해, 레트로바이러스는 삽입된 전이유전자의 조건부 발현을 허용하도록 조작될 수도 있다. 세포 유형 특이적 프로모터를 사용하여 특정 유형의 세포에서의 발현을 표적화할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다(따라서, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터 둘 다가 본 개시의 실시에 사용될 수 있다). 더욱이, 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있다. HLA 클래스 I 및 클래스 II를 발현하도록 형질도입된 안정한 세포주를 생성하는 데 사용될 수 있는 예시적 렌티바이러스 벡터는 도 3에 표시되어 있다.
레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의해 좌우될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6 내지 10 kb의 외부 서열에 대한 포장 수용량을 가진 시스-작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR은 원하는 핵산을 표적 세포 내로 삽입하여 영구적인 발현을 제공하는 데 사용되는 벡터의 복제 및 포장을 위해 충분하다. 본 개시의 실시에 사용될 수 있는, 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 이들의 조합에 기반을 둔 레트로바이러스 벡터를 포함한다(예를 들면, 문헌(Buchscher et al., (1992) J. Virol. 66:2731-2739); 문헌(Johann et al., (1992) J. Virol. 66:1635-1640); 문헌(Sommnerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59); 문헌(Wilson et al., (1998) J. Virol. 63:2374-2378); 문헌(Miller et al., (1991) J. Virol. 65:2220-2224); 및 PCT 출원 제PCT/US94/05700호 참조). 또한, 최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터, 예컨대, 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)에 기반을 둔 렌티바이러스 벡터가 본 개시의 실시에 유용하다(예를 들면, 문헌(Balagaan, (2006) J Gene Med; 8: 275 - 285, Published online 21 November 2005 in Wiley InterScience DOI: 10.1002/jgm.845) 참조). 벡터는 표적 유전자의 발현을 유도하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 가질 수 있다. 따라서, 본 개시는 본 개시의 실시에 유용한 벡터(들) 중에서 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 고려한다.
임의의 HLA 대립유전자가 세포의 집단에서 발현될 수 있다. 예시적 실시양태에서, HLA 대립유전자는 클래스 I HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA 대립유전자는 HLA-A 대립유전자 또는 HLA-B 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 클래스 II HLA 대립유전자이다. 클래스 I HLA 대립유전자 및 클래스 II HLA 대립유전자의 서열은 IPD-IMGT/HLA 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 예시적 HLA 대립유전자는 HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01, HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 및 HLA-DRB*07:01을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 관심 있는 유전형에 상응하도록 선택된다. 일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 비천연 생성 대립유전자 또는 고통받는 환자의 천연 생성 대립유전자일 수 있는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다. 본원에 개시된 방법은 다양한 장애들과 관련된 HLA 대립유전자 및 낮은 빈도로 존재하는 대립유전자에 대한 HLA 결합 펩타이드를 확인한다는 추가 장점을 가진다. 따라서, 일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 집단 내에서, 예컨대, 백인 집단 내에서 1% 미만의 빈도로 존재한다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열은 HLA-단백질을 면역정제하는 데 사용될 수 있는 친화성 수용체 태그를 추가로 포함한다. 적합한 태그는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, 수포성 구내염 바이러스 당단백질로부터 유래한 VSV-G 에피토프 태그, 또는 원숭이 바이러스 5(SV5)의 파라믹소바이러스의 P 단백질 및 V 단백질에서 발견되는 작은 에피토프(Pk)로부터 유래한 V5 태그이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 인식가능한 에피토프(항체 결합 부위)를 HLA-단백질에 추가하여 상응하는 항체의 결합을 제공함으로써, 태깅된 단백질의 확인 또는 친화성 정제를 가능하게 하는 펩타이드 태그의 일종인 "에피토프 태그"이다. 에피토프 태그의 비한정적 예는 IgG에 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP) 또는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 펩타이드 서열을 포함한다. 다수의 다른 태그 모이어티들이 통상의 기술을 가진 당업자에게 공지되어 있고 이 당업자에 의해 예상될 수 있고 본원에서 고려된다. 임의의 펩타이드 태그가 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 요소로서 발현될 수 있는 한 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 방법은 보편적 IP HLA 구축물로 형질감염되거나 형질도입된 세포로부터 HLA-펩타이드 복합체를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 상기 복합체는 상업적으로 입수될 수 있는 항체와 함께 당분야에서 공지되어 있는 표준 면역침전 기법을 이용함으로써 단리될 수 있다. 먼저, 세포를 용해시킬 수 있다. HLA 클래스 I-펩타이드 복합체는 HLA 클래스 I 특이적 항체, 예컨대, W6/32 항체를 사용함으로써 단리될 수 있는 반면, HLA 클래스 II-펩타이드 복합체는 HLA 클래스 II 특이적 항체, 예컨대, M5/114.15.2 단일클론 항체를 사용함으로써 단리될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 단일(또는 한 쌍의) HLA 대립유전자는 펩타이드 태그를 가진 융합 단백질로서 발현되고, HLA-펩타이드 복합체는 펩타이드 태그를 인식하는 결합 분자를 사용함으로써 단리된다.
상기 방법은 상기 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계 및 상기 펩타이드를 시퀀싱하는 단계도 포함한다. 펩타이드는 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 임의의 방법, 예컨대, 산 용출에 의해 복합체로부터 단리된다. 임의의 시퀀싱 방법이 이용될 수 있지만, 질량 분광측정, 예컨대, 액체 크로마토그래피-질량 분광측정(LC-MS 또는 LC-MS/MS, 또는 대안적으로 HPLC-MS 또는 HPLC-MS/MS)을 이용하는 방법이 일부 실시양태들에서 이용된다. 이 시퀀싱 방법들은 숙련된 자에게 잘 공지되어 있고 문헌(Medzihradszky KF and Chalkley RJ. Mass Spectrom Rev. 2015 Jan-Feb;34(1):43-63)에서 검토되어 있다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단, 또는 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 예컨대, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 농축되거나 분류된 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)는 세포의 집단을 분류하는 데 이용된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 클래스 I 또는 클래스 II HLA, 또는 클래스 I HLA 및 클래스 II HLA 둘 다의 세포 표면 발현에 대해 이미 FACS에 의해 분류되어 있다. 예를 들면, FACS는 HLA 클래스 I 대립유전자, HLA 클래스 II 대립유전자, 또는 이들의 조합의 세포 표면 발현에 대해 세포의 집단을 분류하는 데 이용될 수 있다.
친화성 수용체 태깅된 HLA 구축물의 라이브러리
본원에서 사용된 용어 "라이브러리"는 (환형 또는 선형) 핵산 분자의 집합체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 라이브러리는 통상의 공급원 유기체, 장기, 조직 또는 세포로부터 유래할 수 있는 복수(즉, 2개 이상)의 핵산 분자들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 유기체의 핵산 내용물의 전부 또는 부분 또는 상당한 부분을 대표하거나("게놈" 라이브러리), 세포, 조직, 장기 또는 유기체에서 발현된 핵산 분자의 전부 또는 부분 또는 상당한 부분을 대표하는 핵산 분자들의 세트이다(cDNA 라이브러리 또는 이로부터 유래한 분절). 라이브러리는 드 노보 합성, 하나 이상의 서열의 돌연변이유발 등에 의해 만들어진 무작위 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 라이브러리는 하나 이상의 벡터에 함유될 수 있다. 본원에서 제공된 친화성 수용체 태깅된 HLA 구축물의 라이브러리는 HLA 대립유전자, 친화성 수용체 펩타이드 또는 링커의 요소를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 적절한 분자 생물학적 기법은 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에서 발견될 수 있다. 핵산 분절의 클로닝을 용이하게 하는 여러 방법들이 예를 들면, 하기 참고문헌들에 기재되어 있다: 문헌(Ferguson, J., et al., Gene 16:191 (1981)) 및 문헌(Hashimoto-Gotoh, T., et al., Gene 41:125 (1986)). 본원에서 사용된 재조합 핵산 기술 및 분자 및 세포 생물학의 분야에서 사용된 다른 용어는 적용가능한 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해될 것이다.
재조합 HLA 대립유전자의 다양한 요소들 또는 도메인들은 재조합 HLA 대립유전자의 N-말단과 C-말단 사이에 임의의 순서로 정렬될 수 있다. 또 다른 요소 또는 도메인보다 재조합 HLA 대립유전자로부터 코딩된 재조합 폴리펩타이드의 N-말단에 더 가까운 요소 또는 도메인은 다른 요소 또는 도메인의 "N-말단"에 있다고 기재된다. 유사하게, 또 다른 요소 또는 도메인보다 재조합 HLA 대립유전자로부터 코딩된 재조합 폴리펩타이드의 C-말단에 더 가까운 요소 또는 도메인은 다른 요소 또는 도메인의 "C-말단"에 있다고 기재된다. 달리 명확히 언급되어 있지 않은 한, 재조합 HLA 대립유전자로부터 코딩된 재조합 폴리펩타이드의 상이한 요소 또는 도메인은 인접할 필요가 없다(즉, 하나 이상의 개재 요소 또는 도메인을 갖지 않는다). 일부 실시양태들에서, 재조합 HLA 대립유전자로부터 코딩된 재조합 폴리펩타이드의 상이한 요소 또는 도메인은 인접할 수 있다.
재조합 HLA 대립유전자로부터 코딩된 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 임의적 요소, 예컨대, 하나 이상의 링커(들), 펩타이드 태그(예컨대, 에피토프 태그) 또는 프로테아제 인식 부위(들)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드 태그는 친화성 수용체 펩타이드이다. 링커는 재조합 단백질의 다른 요소 또는 도메인을 분리하는 상대적으로 짧은 일련의 아미노산들이다. 일부 실시양태들에서, 링커는 길이가 1개 내지 100개 아미노산, 예를 들면, 5개 내지 75개, 10개 내지 60개, 15개 내지 50개, 15개 내지 40개, 또는 1개 내지 50개 아미노산이다.
이종 발현 시스템에서 단백질을 발현하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 본원에 기재된 방법과 같은 방법을 이용하여 관심 있는 단백질(예컨대, 재조합 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 친화성 수용체 태깅된 펩타이드)의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 분자를 수득한다. 표준 재조합 DNA 절차를 이용하여 단백질 코딩 핵산 서열을 관심 있는 특정 숙주 세포에 적합한 발현 벡터 내로 클로닝한다. 발현 벡터는 (다른 요소들 중에서) 원하는 단백질 코딩 핵산 분자에 작동적으로 연결되어 숙주 세포에서 이러한 핵산 분자의 발현을 야기할 수 있는 조절 서열(예를 들면, 프로모터)을 포함한다. 아울러, 조절 서열 및 단백질 코딩 핵산 서열은 "발현 카세트"이다. 발현 벡터는 복제 기점, 형질전환된 세포에서 표현형적 선택을 제공하는 마커 유전자, 하나 이상의 다른 프로모터, 및 이종 핵산 서열의 삽입을 위해 여러 제한 부위들을 함유하는 폴리링커 영역을 포함할 수도 있다.
다수의 숙주 세포들에서 이종 단백질(들)을 발현시키는 데 유용한 발현 벡터는 당분야에서 잘 공지되어 있고, 일부 구체적인 예가 본원에서 제공된다. 특정 숙주 세포에 적합한 임의의 방법을 이용하여 숙주 세포를 발현 벡터로 형질 감염시킨다(또는 발현 벡터를 함유하는 바이러스로 감염시킨다). 이러한 형질감염 방법도 당분야에서 잘 공지되어 있고, 비한정적 예시적 방법이 본원에 기재되어 있다. 형질감염되었거나 형질도입된 숙주 세포는 발현 카세트 내의 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 클래스 I 또는 클래스 II HLA 구축물은 N-말단 또는 C-말단에서 친화성 수용체 태그 및 친화성 분자를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I 또는 클래스 II HLA 구축물은 적어도 하나의 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 태그 및 친화성 분자를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, 수포성 구내염 바이러스 당단백질로부터 유래한 VSV-G 에피토프 태그, 또는 원숭이 바이러스 5(SV5)의 파라믹소바이러스의 P 단백질 및 V 단백질에서 발견되는 작은 에피토프(Pk)로부터 유래한 V5 태그이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 태그 서열(예를 들면, 3x 폴리-히스티딘 태그, 3x FLAG 태그)의 다수의 반복부들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 태그 서열(예를 들면, 3x 폴리-히스티딘 태그, 3x FLAG 태그)의 다수의 반복부들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 인식가능한 에피토프(항체 결합 부위)를 HLA-단백질에 추가하여 상응하는 항체의 결합을 제공함으로써, 태깅된 단백질의 확인 또는 친화성 정제를 가능하게 하는 펩타이드 태그의 일종인 "에피토프 태그"이다. 에피토프 태그의 비한정적 예는 IgG에 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G이다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태그는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP) 또는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 펩타이드 서열을 포함한다. 다수의 다른 태그 모이어티들이 통상의 기술을 가진 당업자에게 공지되어 있고 이 당업자에 의해 예상될 수 있고 본원에서 고려된다. 임의의 펩타이드 태그가 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 요소로서 발현될 수 있는 한 사용될 수 있다.
친화성 태그는 HLA 대립유전자의 N-말단 또는 C-말단에 배치될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 친화성 태그는 ER에 비해 세포 표면으로의 HLA-펩타이드 국소화를 가능하게 하도록 HLA 대립유전자의 C-말단에 배치된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 태그는 다수의 내생성 HLA 대립유전자들을 발현하는 세포주로부터의 단일 HLA 단리를 가능하게 하도록 HLA 대립유전자의 N-말단에 배치된다. 또 다른 실시양태에서, 친화성 태그는 특정 클래스 II HLA 이종이량체를 면역정제하도록 가변 β β-쇄에 추가된다.
*?*일부 실시양태들에서, 절단 서열, 예컨대, F2A, 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES)는 α쇄와 β2 마이크로글로불린(클래스 I) 사이, 또는 α쇄와 β쇄(클래스 II) 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 단일 클래스 I HLA 대립유전자는 HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 및 HLA-B*14:02, 또는 HLA-E*01:01이고, 클래스 II HLA 대립유전자는 HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 및 HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01, 또는 HLA-DRB*07:01이다.
비한정적 예시적 친화성 수용체 태깅된 HLA 구축물이 도 2, 도 6c 및 도 7c에 묘사되어 있다.
치료 방법
종양 특이적 펩타이드를 사용한 맞춤형 면역요법이 기재되어 있다(Ott et al., Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 28 (2014) 559-569). 면역원으로서 사용하기 위해 특정 펩타이드를 효율적으로 선택하는 것은 어느 종양 특이적 펩타이드가 환자에 존재하는 HLA 대립유전자에 효율적으로 결합할지를 예측하는 능력을 요구한다. 치유적 및 종양 특이적 면역요법을 개발하는 데 있어서 결정적인 장벽들 중 하나는 자가면역을 피하기 위해 매우 특이적이고 제한된 종양 항원을 확인하고 선택하는 것이다. 악성 세포 내에서 유전적 변화(예를 들면, 전도, 전위, 결실, 미스센스 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이 등)의 결과로서 생성된 종양 신생항원은 가장 종양 특이적인 부류의 항원들을 대표한다. 신생항원은 이를 확인하고 최적화된 항원을 선택하고 백신 또는 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 신생항원을 생성하는 데 있어서의 기술적 어려움으로 인해 암 백신 또는 면역원성 조성물에서 드물게 사용되고 있다. 이 문제점들은 DNA 수준에서 종양에 존재하나 암을 가진 높은 비율의 대상체들로부터의 매칭된 생식세포주 샘플에는 존재하지 않는 신생물/종양에서 돌연변이를 확인하고; 확인된 돌연변이를 하나 이상의 펩타이드-MHC 결합 예측 알고리즘으로 분석하여, 상기 신생물/종양 내에서 발현되고 높은 비율의 환자 HLA 대립유전자에 결합하는 복수의 신생항원 T 세포 에피토프들을 생성하고; 암을 가진 높은 비율의 대상체들을 치료하기에 적합한 암 백신 또는 면역원성 조성물에서 사용하기 위해 모든 신생항원 펩타이드들 및 예측된 결합 펩타이드들의 세트로부터 선택된 복수의 신생항원성 펩타이드들을 합성함으로써 해결될 수 있다(도 18a 및 도 18b).
예를 들면, 펩타이드 시퀀싱 정보를 치료 백신으로 번역하는 것은 높은 비율의 개체들의 HLA 분자에 결합할 수 있는 돌연변이된 펩타이드의 예측을 포함할 수 있다. 면역원으로서 사용하기 위해 특정 돌연변이를 효율적으로 선택하는 것은 어는 돌연변이된 펩타이드가 높은 비율의 환자들의 HLA 대립유전자에 효율적으로 결합할지를 예측하는 능력을 요구한다. 최근에, 검증된 결합 펩타이드 및 비-결합 펩타이드를 사용한 신경망 기반 학습 방법은 주요 HLA-A 대립유전자 및 HLA-B 대립유전자에 대한 예측 알고리즘의 정확성을 진보시켰다. 그러나, HLA-펩타이드 결합 규칙을 코딩하기 위해 진보된 신경망 기반 알고리즘을 사용한 경우조차도, 여러 요인들이 HLA 대립유전자에게 제시된 펩타이드를 예측하는 힘을 제한한다.
예를 들면, 펩타이드 시퀀싱 정보를 치료 백신으로 번역하는 것은 긴 펩타이드의 다중에피토프 백신으로서 약물을 제제화하는 것을 포함할 수 있다. 사실상 가능한 많은 돌연변이된 에피토프들을 표적화하는 것은 면역 시스템의 엄청난 수용량을 이용하고, 면역 표적화된 유전자 생성물의 하향조절에 의해 면역학적으로 탈출할 기회를 방해하고, 에피토프 예측 방법의 공지된 부정확성을 보상한다. 합성 펩타이드는 다수의 면역원들을 효율적으로 제조하고 돌연변이체 에피토프의 확인을 효과적인 백신으로 신속히 번역하기에 유용한 수단을 제공한다. 오염 세균 또는 동물 물질을 갖지 않는 시약을 사용하여 펩타이드를 화학적으로 용이하게 합성할 수 있고 용이하게 정제할 수 있다. 작은 크기는 단백질의 돌연변이된 영역에 명확히 초점을 맞출 수 있게 하고 다른 성분(돌연변이되지 않은 단백질 또는 바이러스 벡터 항원)으로부터의 관련 없는 항원성 경쟁도 감소시킨다.
예를 들면, 펩타이드 시퀀싱 정보를 치료 백신으로 번역하는 것은 강한 백신 보강제와의 조합을 포함할 수 있다. 효과적인 백신은 면역 반응을 시작하기 위해 강한 보강제를 요구할 수 있다. 예를 들면, 폴리-ICLC, TLR3의 아고니스트, 및 MDA5 및 RIG3의 RNA 헬리카제(helicase)-도메인은 백신 보강제를 위한 여러 바람직한 성질들을 보여주었다. 이 성질들은 생체내 면역 세포의 국소 및 전신 활성화의 유도, 자극성 케모카인 및 사이토카인의 생성, 및 DC에 의한 항원 제시의 자극을 포함한다. 나아가, 폴리-ICLC는 인간에서 지속가능한 CD4+ 반응 및 CD8+ 반응을 유도할 수 있다. 중요한 것은, 전사 및 신호 전달도입 경로의 상향조절에 있어서 놀라울 정도의 유사성이 폴리-ICLC로 백신접종된 대상체 및 매우 효과적인 복제 능력 황열 백신을 제공받은 자원자에서 확인되었다는 것이다. 더욱이, (몬타나이드(Montanide) 이외에) NYESO-1 펩타이드 백신과 함께 폴리-ICLC를 사용하여 면역화시킨 난소 암종 환자들 중 90% 초과의 환자들은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 유도뿐만 아니라, 최근 1 상 연구에서 상기 펩타이드에 대한 항체 반응도 보였다. 동시에, 폴리-ICLC는 현재까지 25회 초과의 임상 시험에서 광범위하게 시험되었고 상대적으로 양성 독성 프로파일을 나타내었다.
일부 실시양태들에서, 면역원성 펩타이드는 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 세포로부터 확인될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 면역원성 펩타이드는 질환 또는 질병을 가진 대상체에 특이적일 수 있다. 일부 실시양태들에서, 면역원성 펩타이드는 질환 또는 질병을 가진 대상체의 HLA 일배체형에 매칭되는 HLA에 결합할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 펩타이드의 라이브러리는 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 세포는 확인되거나 특징화될 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 확인되거나 특징화될 펩타이드는 내생성 펩타이드이다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드는 외생성 펩타이드이다. 예를 들면, 확인되거나 특징화될 펩타이드는 펩타이드의 라이브러리를 코딩하는 복수의 서열들로부터 발현될 수 있다.
본 명세서의 개시 전에, 대부분의 HLA 펩티돔의 LC-MS/MS 연구들은 다수의 HLA 분자들을 발현하는 세포를 사용하였고, 이것은 기존 생물정보학 예측자 또는 "데콘볼루션"을 이용하여 펩타이드를 최대 6개의 클래스 I 대립유전자들 중 1개의 클래스 I 대립유전자에 배정할 것을 요구한다(Bassani-Sternberg and Gfeller, 2016). 따라서, 공지된 모티프에 꼭 매칭되지 않는 펩타이드는 소정의 HLA 대립유전자에 대한 결합제로서 확실하게 보고될 수 없었다.
본원은 개체의 HLA 분자에 결합할 수 있는 펩타이드, 예컨대, 돌연변이된 펩타이드를 예측하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본원은 대상체를 위한 면역원성 조성물을 제조하기에 가장 적합한 펩타이드를 항원 포함 펩타이드들의 소정의 세트로부터 확인하는 방법으로서, 대상체의 HLA 단백질에 결합할 수 있는 복수의 펩타이드들을 상기 펩타이드들의 소정의 세트로부터 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 HLA 단백질에 결합하는 상기 능력은 상기 대상체의 HLA 대립유전자들 각각에 대한 특이적 HLA 결합 펩타이드에 상응하는 펩타이드 서열 데이터베이스에 의해 훈련된 기계로 펩타이드의 서열을 분석함으로써 확인된다. 본원은 대상체를 위한 면역원성 조성물을 제조하기에 가장 적합한 펩타이드를 항원 포함 펩타이드들의 소정의 세트로부터 확인하는 방법으로서, 대상체의 HLA 단백질에 결합할 수 있는 것으로서 확인된 복수의 펩타이드들을 상기 펩타이드들의 소정의 세트로부터 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 HLA 단백질에 결합하는 능력은 앞서 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 펩타이드 서열 데이터베이스에 의해 훈련된 기계로 펩타이드의 서열을 분석함으로써 확인된다. 따라서, 일부 실시양태들에서, 본 개시는 대상체 특이적 면역원성 조성물을 제조하기 위해 복수의 대상체 특이적 펩타이드들을 확인하는 방법으로서, 상기 대상체가 종양을 갖고 상기 대상체 특이적 펩타이드가 대상체 및 대상체의 종양에 특이적이고, 대상체의 종양 샘플 및 대상체의 비-종양 샘플을 시퀀싱하는 단계; 핵산 시퀀싱을 기반으로 대상체의 암 세포의 게놈에는 존재하나 대상체의 정상 조직에는 존재하지 않는 비-침묵 돌연변이 및 대상체의 HLA 유전형을 확인하는 단계; 및 본원에 기재된 HLA 결합을 예측하는 방법에서 비-침묵 돌연변이로부터 유래한 펩타이드의 서열을 분석함으로써 확인될 때, 대상체의 종양에 특이적인 에피토프인 상이한 종양 에피토프를 각각 갖고 대상체의 HLA 단백질에 결합할 수 있는 것으로서 각각 확인된 복수의 대상체 특이적 펩타이드들을 확인된 비-침묵 돌연변이로부터 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 본원은 개체에 특이적인 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태들에서, 개체에 특이적인 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법은 면역요법제를 필요로 하는 개체, 예컨대, 질병 또는 질환을 가진 대상체에서 면역요법제를 개발하는 데 이용된다.
본원은 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 면역을 제공하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드의 서열을 가진 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 면역을 제공하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 면역을 제공하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 면역을 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 세포는 HLA-펩타이드 복합체로서 펩타이드를 제시한다.
본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본원은 HLA-펩타이드 복합체를 특징화함으로써 면역요법제를 필요로 하는 개체를 위한 면역요법제를 개발하는 방법으로서, a) 면역요법제를 필요로 하는 개체로부터 유래한 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 i) 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된, ii) 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 단계; b) 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; c) 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 면역요법제를 필요로 하는 개체에 특이적인 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 단계; 및 d) 면역요법제를 필요로 하는 개체에 특이적인 HLA-펩타이드 복합체를 기반으로 면역요법제를 개발하는 단계를 포함하는 방법을 개시하고, 이때 상기 개체는 질환 또는 질병을 가진다.
일부 실시양태들에서, 면역요법제는 핵산 또는 펩타이드 치료제이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 펩타이드를 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단을 하나 이상의 펩타이드와 접촉시키거나 세포의 집단에서 하나 이상의 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 환자에 특이적인 하나 이상의 HLA를 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 환자에 특이적인 모든 HLA들을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 환자 특이적 HLA는 단일 대립유전자로서 도입될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 다수의 환자 특이적 HLA들이 도입될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 환자 특이적 HLA와 관련하여 확인된 펩타이드를 기반으로 면역요법제를 개발하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 면역요법제를 필요로 하는 개체로부터 유래한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암 또는 감염성 물질에 의한 감염 또는 자가면역 질환이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 이를 필요로 하는 개체에 특이적인 HLA-펩타이드 복합체로부터의 하나 이상의 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함하고, 임의로 이때 상기 펩타이드는 감염성 물질 또는 자가면역 질환의 하나 이상의 표적 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 자가면역 질환의 하나 이상의 표적 단백질로부터의 펩타이드의 하나 이상의 영역을 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 자가면역 질환으로부터 유래한 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 감염성 물질은 병원체이다. 일부 실시양태들에서, 병원체는 바이러스, 세균 또는 기생충이다.
일부 실시양태들에서, 바이러스는 BK 바이러스(BKV), 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 림프구친화성 바이러스(HTLV-1), 인플루엔자 바이러스, RSV, HPV, 광견병, 볼거리 풍진 바이러스, 폴리오바이러스, 황열, A형 간염, B형 간염, 로타바이러스, 수두 바이러스, 인간 유두종바이러스(HPV), 천연두, 대상포진 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 세균은 클렙시엘라 종, 트로페리마 휘플레이, 마이코박테리움 레프라, 마이코박테리움 레프로마토시스 및 마이코박테리움 튜버큘로시스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 세균은 장티푸스, 폐렴구균, 수막염구균, 해모필루스 B, 탄저병, 파상풍 톡소이드, 수막염구균 군 B, bcg, 콜레라 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 기생충은 연충 또는 원생동물이다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 레이쉬마니아 종(예를 들면, 엘. 메이저(L. major), 엘. 인판툼(L. infantum), 엘. 브라질리엔시스(L. braziliensis), 엘. 도노바니(L. donovani), 엘. 샤가시(L. chagasi), 엘. 멕시카나(L. mexicana)), 플라스모듐 종(예를 들면, 피. 팔시파룸(P. falciparum), 피. 비박스(P. vivax), 피. 오발레(P. ovale), 피. 말라리아(P. malariae)), 트리파노소마 크루지, 아스카리스 룸브리코이데스, 트리쿠리스 트리키우라, 넥카터 아메리카누스, 및 스키스토소마 종(에스. 만소니(S. mansoni), 에스. 해마토비움(S. haematobium), 에스. 자포니쿰(S. japonicum))으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 면역요법제는 조작된 수용체이다. 일부 실시양태들에서, 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR) 또는 B 세포 수용체(BCR), 적응 T 세포 요법(ACT) 또는 이들의 유도체이다. 다른 양태에서, 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 양태들에서, CAR은 제1세대 CAR이다. 다른 양태에서, CAR은 제2세대 CAR이다. 다른 양태에서, CAR은 제3세대 CAR이다.
일부 양태들에서, CAR은 세포외 부분, 막횡단 부분 및 세포내 부분을 포함한다. 일부 양태들에서, 세포내 부분은 적어도 하나의 T 세포 보조자극 도메인을 포함한다. 일부 양태들에서, T 세포 보조자극 도메인은 CD27, CD28, TNFRS9(4-1BB), TNFRSF4(OX40), TNFRSF8(CD30), CD40LG(CD40L), ICOS, ITGB2(LFA-1), CD2, CD7, KLRC2(NKG2C), TNFRS18(GITR), TNFRSF14(HVEM) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태들에서, 조작된 수용체는 표적에 결합한다. 일부 양태들에서, 결합은 질환 또는 질병을 앓는 개체에 특이적인 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법으로부터 확인된 펩타이드에 특이적이다.
일부 양태들에서, 면역요법제는 본원에 상세히 기재된 세포이다. 일부 양태들에서, 면역요법제는 질환 또는 질병을 앓는 개체에 특이적인 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법으로부터 확인된 펩타이드에 특이적으로 결합하는 수용체를 포함하는 세포이다. 일부 양태들에서, 면역요법제는 본 발명의 펩타이드/핵산과 함께 사용되는 세포이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 환자 세포이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태들에서, 세포는 종양 침윤 림프구이다.
일부 양태들에서, 대상체의 T 세포 수용체 레퍼토리를 기반으로 질병 또는 질환을 가진 대상체를 치료한다. 일부 실시양태들에서, 대상체의 T 세포 수용체 레퍼토리를 기반으로 항원 백신을 선택한다. 일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 항원 또는 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포로 대상체를 치료한다. 일부 실시양태들에서, TCR, 예를 들면, 대상체 특이적 TCR에 특이적인, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 항원 또는 펩타이드로 대상체를 치료한다. 일부 실시양태들에서, TCR, 예를 들면, 대상체 특이적 TCR을 발현하는 T 세포에 특이적인, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 항원 또는 펩타이드로 대상체를 치료한다. 일부 실시양태들에서, 대상체 특이적 TCR에 특이적인, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 항원 또는 펩타이드로 대상체를 치료한다.
일부 실시양태들에서, 대상체에서 확인된 TCR을 기반으로 면역원성 항원 조성물 또는 백신을 선택한다. 한 실시양태에서, T 세포 레퍼토리의 확인 및 기능 어세이에서의 시험은 질병 또는 질환을 가진 대상체에게 투여될 면역원성 조성물 또는 백신을 결정하는 데 이용된다. 일부 실시양태들에서, 면역원성 조성물은 항원 백신이다. 일부 실시양태들에서, 항원 백신은 대상체 특이적 항원 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 항원에 결합하는 대상체 특이적 TCR의 정량을 기반으로 항원 백신에 포함될 항원 펩타이드를 선택한다. 일부 실시양태들에서, TCR에 대한 펩타이드의 결합 친화성을 기반으로 항원 펩타이드를 선택한다. 일부 실시양태들에서, 선택은 양 및 결합 친화성 둘 다의 조합에 기반을 둔다. 예를 들면, TCR을 발현하는 T 세포가 유리하게는 증폭될 것이기 때문에, 기능 어세이에서 항원에 강하게 결합하나 TCR 레퍼토리에서 많이 표시되지 않는 TCR은 항원 백신을 위한 우수한 후보일 수 있다.
일부 실시양태들에서, TCR에의 결합을 기반으로 대상체에게 투여할 항원을 선택한다. 일부 실시양태들에서, T 세포, 예컨대, 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 T 세포를 증폭시킬 수 있다. 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 증폭된 T 세포를 대상체에게 다시 투여할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 특이적인 TCR의 발현을 위해 폴리뉴클레오타이드로 적합한 세포, 예를 들면, PBMC를 형질도입하거나 형질감염시키고 대상체에게 투여한다. 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 증폭시킬 수 있고 대상체에게 다시 투여할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 자가 병든 조직과 함께 항온처리될 때 세포용해 활성을 야기하는, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 증폭시킬 수 있고 대상체에게 투여할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 기능 어세이에서 사용된 T 세포는 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에의 결합을 야기하고 증폭될 수 있고 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 대상체 특이적 면역원성 항원 펩타이드에 결합하는 것으로 확인된 TCR을 T 세포에서 발현시킬 수 있고 대상체에게 투여할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 선택된 항원, 예컨대, 종양 또는 병원체 관련 항원에 특이적인 면역 시스템 세포, 예컨대, T 세포의 적응 전달을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 대한 특이성을 가진 신규 T 세포 수용체(TCR) α쇄 및 β쇄를 도입함으로써 TCR의 특이성을 변경시켜 T 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 다양한 전략들을 이용할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제8,697,854호; PCT 특허 공보 제WO2003020763호, 제WO2004033685호, 제WO2004044004호, 제WO2005114215호, 제WO2006000830호, 제WO2008038002호, 제WO2008039818호, 제WO2004074322호, 제WO2005113595호, 제WO2006125962호, 제WO2013166321호, 제WO2013039889호, 제WO2014018863호 및 제WO2014083173호; 및 미국 특허 제8,088,379호 참조).
키메라 항원 수용체(CAR)는 매우 다양한 수용체 키메라 구축물들을 사용하여 선택된 표적, 예컨대, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 특이적인 면역반응성 세포, 예컨대, T 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,843,728호, 제5,851,828호, 제5,912,170호, 제6,004,811호, 제6,284,240호, 제6,392,013호, 제6,410,014호, 제6,753,162호 및 제8,211,422호; 및 PCT 공보 제W09215322호 참조). 대안적 CAR 구축물은 연속적 세대에 속하는 것으로서 특징화될 수 있다. 제1세대 CAR은 전형적으로 예를 들면, 유연성 링커, 예를 들면, CD8a 힌지 도메인 및 CD8a 막횡단 도메인에 의해 CD3ζ 또는 FcRy 또는 scFv-FcRy의 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된, 예를 들면, 특정 항체의 VH에 연결된 VL을 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 단일 쇄 가변 단편으로 구성된다(예를 들면, 미국 특허 제7,741,465호; 미국 특허 제5,912,172호; 미국 특허 제5,906,936호 참조). 제2세대 CAR은 엔도도메인 내의 하나 이상의 보조자극 분자, 예컨대, CD28, OX40(CD134) 또는 4-1BB(CD137)의 세포내 도메인, 예를 들면, scFv-CD28/OX40/4-lBB-CD3을 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제8,911,993호; 제8,916,381호; 제8,975,071호; 제9,101,584호; 제9,102,760호; 및 제9,102,761호 참조). 제3세대 CAR은 보조자극 엔도도메인들, 예컨대, CD3C-쇄, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB 또는 CD28 신호전달 도메인들의 조합, 예를 들면, scFv-CD28-4-lBB-CD3C 또는 scFv-CD28-OX40-CD3Q를 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제8,906,682호; 미국 특허 제8,399,645호; 미국 특허 제5,686,281호; PCT 공보 제WO2014134165호; 및 PCT 공보 제WO2012079000호 참조). 일부 실시양태들에서, 예를 들면, 전문 항원 제시 세포의 항원과의 상호작용 후 보조자극에 의해 활성화되고 증폭되도록 선택된 항원 특이적 T 세포에서 CAR을 발현시켜서 보조자극을 조정할 수 있다. 예를 들면, T 세포 공격의 표적화를 개선하고/하거나 부작용을 최소화하기 위해 추가 조작된 수용체를 면역반응성 세포에게 제공할 수 있다.
대안적 기법, 예컨대, 원형질체 융합, 지질감염, 형질감염 또는 전기천공이 표적 면역반응성 세포를 형질전환시키는 데 이용될 수 있다. 매우 다양한 벡터들, 예컨대, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존(미국 특허 제6,489,458호; 제7,148,203호; 제7,160,682호; 제7,985,739호; 및 제8,227,432호 참조)이 예를 들면, CD3ζ 및 CD28 또는 CD137을 통한 제2세대 항원 특이적 CAR 신호전달을 이용하여 CAR을 도입하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들면, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기반을 둔 벡터를 포함할 수 있다.
형질전환을 위해 표적화된 세포는 예를 들면, T 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 또는 림프 세포로 분화할 수 있는 분화다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 원하는 CAR을 발현하는 T 세포는 예를 들면, 암 항원 및 보조자극 분자를 공-발현하는 γ-방사선조사된 활성화 및 증식 세포(APC)와 공-배양함으로써 선택될 수 있다. 조작된 CAR T 세포는 예를 들면, 가용성 인자, 예컨대, IL-2 및 IL-21의 존재 하에서 APC와 공-배양함으로써 증폭될 수 있다. 예를 들면, 이 증폭은 (예를 들면, 비-효소 디지털 어레이 및/또는 다중-패널 유세포분석에 의해 어세이될 수 있는) 기억 CAR T 세포를 제공하도록 수행될 수 있다. 이 방식으로, (임의로 원하는 케모카인, 예컨대, 인터페론-γ를 생성하면서) 항원 보유 종양에 대한 특이적 세포독성 활성을 가진 CAR T 세포를 제공할 수 있다. 예를 들면, 이러한 종류의 CAR T 세포는 예를 들면, 종양 이종이식편을 위협하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다.
전술된 방법들과 같은 방법은 예를 들면, 선택된 항원에 결합하는 항원 인식 수용체를 포함하는 유효량의 면역반응성 세포를 투여함으로써 질환, 예컨대, 신생물 또는 병원성 감염을 가진 대상체를 치료하고/하거나 이 대상체의 생존을 증가시키는 방법을 제공하도록 개조될 수 있고, 이때 상기 결합은 면역반응성 세포를 활성화시킴으로써, 질환(예컨대, 신생물, 병원체 감염, 자가면역 장애 또는 동종이계 이식 반응)을 치료하거나 예방한다. 예를 들면, CAR T 세포 요법에서의 투약은 예를 들면, 사이클로포스프아미드를 사용한 림프고갈의 과정과 함께 또는 이 과정 없이 106개 내지 109개 세포/kg의 투여를 포함할 수 있다.
가능한 불리한 반응으로부터 보호하기 위해, 조작된 면역반응성 세포는 세포를 특정 신호에의 노출에 취약하게 만드는 전이유전자의 형태로 형질전환 안전성 스위치를 갖출 수 있다. 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타이미딘 키나제(TK) 유전자는 예를 들면, 줄기 세포 이식 후 기증자 림프구 주입물로서 사용된 동종이계 T 림프구 내로의 도입에 의해 이 방식으로 사용될 수 있다. 이러한 세포에서, 뉴클레오사이드 프로드러그, 예컨대, 간시클로버(ganciclovir) 또는 아시클로버(acyclovir)의 투여는 세포 사멸을 야기한다. 대안적 안전성 스위치 구축물은 예를 들면, 2개의 비기능성 icasp9 분자들과 함께 활성 효소를 형성하는 소분자 이량체화제의 투여에 의해 유발되는 유도성 캐스파제(caspase) 9를 포함한다. 세포 증식 제어를 수행하기 위한 매우 다양한 대안적 방법들이 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허 공보 제20130071414호; PCT 특허 공보 제WO2011146862호; PCT 특허 공보 제WO2014011987호; PCT 특허 공보 제WO2013040371호 참조). 적응 요법의 추가 개량에서, 게놈 편집은 면역반응성 세포를 대안적 수행에 맞게 조정하여, 예를 들면, 편집된 CAR T 세포를 제공하는 데 사용될 수 있다.
세포 요법 방법은 T 세포의 생체외 활성화 및 증폭도 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, T 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되기 전에 활성화될 수 있다. 이 유형의 치료의 예로는 종양 침윤 림프구(TIL) 세포(미국 특허 제5,126,132호 참조), 세포독성 T 세포(미국 특허 제6,255,073호; 및 미국 특허 제5,846,827호 참조), 증폭된 종양 배출 림프절 세포(미국 특허 제6,251,385호 참조), 및 다양한 다른 림프구 제제들(미국 특허 제6,194,207호; 미국 특허 제5,443,983호; 미국 특허 제6,040,177호; 및 미국 특허 제5,766,920호 참조)의 사용이 있다.
생체외에서 활성화된 T 세포의 집단은 암, 감염성 질환 또는 다른 질환 상태, 예를 들면, 자가면역 질환 상태에 대한 면역 반응을 최대한 조화롭게 하는 상태로 존재할 수 있다. 활성화 후, 적어도 2종의 신호들이 T 세포에게 전달될 수 있다. 제1 신호는 정상적으로 T 세포 표면의 T 세포 수용체(TCR)를 통해 전달된다. TCR 제1 신호는 정상적으로 TCR이 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 MHC 복합체와 함께 발현된 펩타이드 항원과 상호작용할 때 유발된다. 제2 신호는 정상적으로 T 세포의 표면의 보조자극 수용체를 통해 전달된다. 보조자극 수용체는 일반적으로 APC의 표면에서 발현된 상응하는 리간드 또는 사이토카인에 의해 유발된다.
본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 특이적인 T 세포를 수득할 수 있고 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용할 수 있다고 생각된다. 이와 관련하여, 본 개시는 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 확인된 면역원성 항원 펩타이드에 특이적인 세포를 포함하는 세포의 집단을, 대상체에서 질환을 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 대상체에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법은 질환 반응성 T 세포에 대해 농축된 세포의 집단을, 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 세포는 대상체의 동종이계 또는 자가 세포일 수 있다.
본 개시는 항원성 펩타이드 또는 백신을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 질환 특이적 면역 반응을 유도하고/하거나, 질환에 대해 백신접종하고/하거나 대상체에서 질환의 증상을 치료하고/하거나 완화시키는 방법도 제공한다.
본 개시의 펩타이드 또는 조성물은 CTL 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 항원성 펩타이드 또는 백신 조성물은 단독으로, 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예시적 치료제는 화학요법제 또는 생물요법제, 방사선, 또는 면역요법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 질환을 위한 임의의 적합한 요법 치료가 투여될 수 있다. 화학요법제 및 생물요법제의 예로는 알데스류킨(aldesleukin), 알트레타민(altretamine), 아미포스틴(amifostine), 아스파라기나제(asparaginase), 블레오마이신(bleomycin), 카페시타빈(capecitabine), 카보플라틴(carboplatin), 카무스틴(carmustine), 클라드리빈(cladribine), 시사프라이드(cisapride), 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스프아미드(cyclophosphamide), 사이타라빈(cytarabine), 다카바진(dacarbazine)(DTIC), 닥티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 드로나비놀(dronabinol), 에포에틴(epoetin) 알파, 에토포사이드(etoposide), 필그라스팀(filgrastim), 플루다라빈(fludarabine), 플루오로우라실(fluorouracil), 겜시타빈(gemcitabine), 그라니세트론(granisetron), 하이드록시우레아, 이다루비신(idarubicin), 이포스프아미드(ifosfamide), 인터페론 알파, 이리노테칸(irinotecan), 란소프라졸(lansoprazole), 레바미솔(levamisole), 류코보린(leucovorin), 메게스트롤(megestrol), 메스나(mesna), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토클로프라마이드(metoclopramide), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론(mitoxantrone), 오메프라졸(omeprazole), 온단세트론(ondansetron), 파클리탁셀(paclitaxel)(Taxol®), 필로카핀(pilocarpine), 프로클로로페라진(prochloroperazine), 리툭시맙(rituximab), 타목시펜(tamoxifen), 탁솔(taxol), 토포테칸(topotecan) 하이드로클로라이드, 트라스투주맙(trastuzumab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 비노렐빈 타르트레이트(vinorelbine tartrate)가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 대상체는 항-면역억제제 또는 면역자극제도 투여받을 수 있다. 예를 들면, 대상체는 항-CTLA 항체 또는 항-PD-1 또는 항-PD-L1도 투여받을 수 있다.
백신 조성물 및 투약 섭생법에 포함될 각각의 펩타이드의 양은 당분야에서 숙련된 자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 또는 이의 변이체는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 근육내(i.m.) 주사용으로 제조될 수 있다. 예시적 펩타이드 주사 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m. 및 i.v.를 포함한다. 예시적 DNA 주사 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.를 포함한다. 백신 조성물의 다른 투여 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있다.
약학 조성물은 조성물에 존재하는 펩타이드의 선택, 수 및/또는 양이 질환 및/또는 환자 특이적이도록 편성될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드의 정확한 선택은 부작용을 피하도록 소정의 조직에서 모 단백질의 발현 패턴에 의해 안내될 수 있다. 상기 선택은 질환의 구체적인 유형, 질환의 상태, 초기 치료 섭생법, 환자의 면역 상태 및 환자의 HLA-일배체형에 의해 좌우될 수 있다. 나아가, 본 개시에 따른 백신은 특정 환자의 개인적 필요에 따라 개별화된 성분을 함유할 수 있다. 예로는 특정 환자에서의 관련된 항원의 발현, 개인적 알레르기 또는 다른 치료로 인한 원치 않는 부작용, 및 치료의 제1 라운드 또는 체계 후 이차 치료를 위한 조절에 따라 펩타이드의 양을 변경시키는 것이 있다.
질환 특이적 항원의 생성
본 개시는 적어도 부분적으로 하나 이상의 질환 특이적 항원을 환자의 면역 시스템에게 제시하는 능력에 근거를 둔다. 당분야에서 숙련된 자는 이러한 질환 특이적 항원을 생성하는 다양한 방식들이 존재한다는 것을 본 개시 및 당분야의 지식으로부터 인식할 것이다. 일반적으로, 이러한 질환 특이적 항원은 시험관내에서 또는 생체내에서 생성될 수 있다. 질환 특이적 항원은 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 시험관내에서 생성된 후, 백신 또는 면역원성 조성물로 제제화될 수 있고 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 더 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 시험관내 생성은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 다양한 방법들에 의해, 예를 들면, 다양한 세균, 진핵 또는 바이러스 재조합 발현 시스템들 중 임의의 재조합 발현 시스템에서 DNA 또는 RNA 분자로부터 펩타이드를 합성하거나 펩타이드/폴리펩타이드를 발현시킨 후, 발현된 펩타이드/폴리펩타이드를 정제함으로써 일어날 수 있다. 대안적으로, 질환 특이적 항원은 질환 특이적 항원을 코딩하는 분자(예를 들면, DNA, RNA, 바이러스 발현 시스템 등)를 대상체에 혼입하여 코딩된 질환 특이적 항원을 발현시켜서 생체내에서 생성될 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 항원을 생성하는 방법도 약학 조성물 및 요법의 전달 방법과 관련되기 때문에 본원에 기재되어 있다.
일부 실시양태들에서, 본 개시는 변형된 항원성 펩타이드를 포함한다. 변형은 항원성 펩타이드의 일차 아미노산 서열 그 자체를 변경시키지 않는 공유 화학적 변형을 포함할 수 있다. 변형은 예를 들면, 생체내 반감기를 연장하거나, 안정성을 증가시키거나, 제거를 감소시키거나, 면역원성 또는 알레르기유발성을 변경시키거나, 특정 항체의 생성, 세포 표적화, 항원 섭취, 항원 프로세싱, MHC 친화성, MHC 안정성 또는 항원 제시를 가능하게 함으로써 원하는 성질을 가진 펩타이드를 생성할 수 있다. 수행될 수 있는 항원성 펩타이드의 변화는 담체 단백질에의 접합, 리간드에의 접합, 항체에의 접합, PEG화, 폴리시알릴화, HES화, 재조합 PEG 모방 물질, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노미립자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화, 바이오티닐화, 표면 활성 물질의 추가, 아미노산 모방 물질의 추가, 또는 비천연 아미노산의 추가를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
짧은 혈장 반감기 또는 프로테아제 분해에 대한 민감성과 관련된 문제점은 (예를 들면, 전형적으로 단백질 및 비단백질성 중합체, 예를 들면, PEG 둘 다에 공유결합된 연결 모이어티를 통해) 폴리펩타이드 서열을 다양한 비단백질성 중합체들 중 임의의 비단백질성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 접합시키거나 연결하는 것을 포함하는 다양한 변형에 의해 극복될 수 있다. 이러한 PEG 접합된 생물분자는 보다 더 우수한 물리적 및 열적 안정성, 효소 분해에 대한 민감성으로부터의 보호, 증가된 가용성, 더 긴 생체내 순환 반감기 및 감소된 제거, 감소된 면역원성 및 항원성, 및 감소된 독성을 포함하는 임상적으로 유용한 성질을 가진 것으로 밝혀졌다.
폴리펩타이드 서열에의 접합에 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 물에 용해되고, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 갖고, 이때 R은 수소 또는 보호기, 예컨대, 알킬 또는 알칸올 기이고, n은 1 내지 1000의 정수이다. R이 보호기일 때, R은 일반적으로 1개 내지 8개의 탄소를 가진다. 폴리펩타이드 서열에 접합된 PEG는 선형 또는 분지된 PEG일 수 있다. 분지된 PEG 유도체인 "스타(star)-PEG" 및 다중-아암 PEG가 본 개시에 의해 고려된다.
본 개시는 접합체의 조성물도 고려하고, 이때 PEG는 상이한 n 값을 가지므로, 다양한 상이한 PEG들이 특정 비로 존재한다. 예를 들면, 일부 조성물들은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 이때 n은 1, 2, 3 및 4이다. 일부 조성물들에서, n이 1인 접합체의 퍼센트는 18% 내지 25%이고, n이 2인 접합체의 퍼센트는 50% 내지 66%이고, n이 3인 접합체의 퍼센트는 12% 내지 16%이고, n이 4인 접합체의 퍼센트는 최대 5%이다. 이러한 조성물은 당분야에서 공지되어 있는 반응 조건 및 정제 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 접합체를 분리할 수 있고, 그 후 변형되지 않은 단백질 서열 및 다른 수의 부착된 PEG를 가진 접합체로부터 정제된, 예를 들면, 원하는 수의 부착된 PEG를 가진 접합체를 함유하는 분획을 확인한다.
PEG는 말단 반응성 기("스페이서")를 통해 본 개시의 폴리펩타이드에 결합될 수 있다. 예를 들면, 스페이서는 폴리펩타이드 서열들 중 하나 이상의 폴리펩타이드 서열의 유리 아미노 또는 카복실 기와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 결합을 매개하는 말단 반응성 기이다. 유리 아미노 기에 결합될 수 있는 스페이서를 가진 PEG는 폴리에틸렌 글리콜의 석신산 에스테르를 N-하이드록시 석시닐이미드로 활성화시킴으로써 제조될 수 있는 N-하이드록시석시닐이미드 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 유리 아미노 기에 결합될 수 있는 또 다른 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르를 시아누르산 염화물과 반응시킴으로써 제조될 수 있는 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진이다. 유리 카복실 기에 결합되는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 폴리옥시에틸렌디아민을 포함한다.
본 개시의 폴리펩타이드 서열들 중 하나 이상의 폴리펩타이드 서열과, 스페이서를 가진 PEG의 접합은 다양한 통상의 방법들에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 접합 반응은 4:1 내지 30:1의 시약 대 단백질의 몰 비를 사용하여 30분 내지 20시간 동안 4℃ 내지 실온에서 5 내지 10의 pH의 용액에서 수행될 수 있다. 반응 조건은 원하는 정도의 치환을 우세하게 생성하는 쪽으로 반응을 유도하도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 낮은 온도, 낮은 pH(예를 들면, pH=5) 및 짧은 반응 시간은 부착된 PEG의 수를 감소시키는 경향을 나타내는 반면, 높은 온도, 중성 내지 높은 pH(예를 들면, pH>7) 및 더 긴 반응 시간은 부착된 PEG의 수를 증가시키는 경향을 나타낸다. 당분야에서 공지되어 있는 다양한 수단들을 이용하여 반응을 종결할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 반응은 반응 혼합물을 산성화하고, 예를 들면, -20℃에서 냉동시킴으로써 종결된다.
본 개시는 PEG 모방 물질의 사용도 고려한다. 여러 추가 유리한 성질들을 부여하면서 PEG의 특성(예를 들면, 향상된 혈청 반감기)을 가진 재조합 PEG 모방 물질이 개발되었다. 예를 들면, PEG와 유사한 연장된 입체구조를 형성할 수 있는 (예를 들면, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser 및 Thr을 포함하는) 단순한 폴리펩타이드 쇄는 관심 있는 펩타이드 또는 단백질 약물에 이미 융합된 상태로 재조합적으로 생성될 수 있다(예를 들면, Amunix's XTEN technology; 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재). 이것은 제조 과정 동안 추가 접합 단계에 대한 필요성을 없앤다. 더욱이, 확립된 분자생물학 기법은 폴리펩타이드 쇄의 측쇄 조성의 조절을 가능하게 하여, 면역원성 및 제조 성질이 최적화될 수 있게 한다.
글리코실화는 단백질의 물성에 영향을 미칠 수 있고 단백질 안정성, 분비 및 서브세포 국소화에 있어서도 중요할 수 있다. 적절한 글리코실화는 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 사실상, 단백질을 글리코실화하는 세포 과정이 결여된 세균(예를 들면, 이. 콜라이)에서 발현될 때, 진핵 유기체로부터의 일부 유전자들은 그들의 글리코실화 결여로 인해 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않는 회수된 단백질을 제공한다. 글리코실화 부위의 추가는 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 세린 또는 쓰레오닌 잔기(O-결합 글리코실화 부위의 경우) 또는 아스파라긴 잔기(N-결합 글리코실화 부위의 경우)의 추가 또는 이러한 잔기에 의한 치환으로 폴리펩타이드를 변경시킬 수 있다. 각각의 유형에서 발견된 N-결합 올리고사카라이드, O-결합 올리고사카라이드 및 당 잔기의 구조는 상이할 수 있다. 둘 다에서 통상적으로 발견되는 당의 한 유형은 N-아세틸뉴라민산(이하, 시알산으로서 지칭됨)이다. 시알산은 통상적으로 N-결합 올리고사카라이드 및 O-결합 올리고사카라이드 둘 다의 말단 잔기이고, 그의 음성 전하로 인해 산성 성질을 당단백질에 부여할 수 있다. 본 개시의 실시양태는 N-글리코실화 변이체의 생성 및 사용을 포함한다.
본 개시의 폴리펩타이드 서열은 임의로 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 변경될 수 있다. 폴리펩타이드의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 글리코사이드와 폴리펩타이드의 화학적 또는 효소 커플링이다. 탄수화물의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 달성될 수 있거나, 글리코실화되는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기법은 공지되어 있고, 폴리펩타이드의 탄수화물 모이어티의 효소 절단은 다양한 엔도글리코시다제들 및 엑소글리코시다제들의 사용에 의해 달성될 수 있다.
접합을 위한 추가 적합한 성분 및 분자는 예를 들면, 림프 시스템에 표적화하기 위한 분자, 티로글로불린; 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HAS); 파상풍 톡소이드; 디프테리아 톡소이드; 폴리아미노산, 예컨대, 폴리(D-라이신:D-글루탐산); 로타바이러스의 VP6 폴리펩타이드; 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 핵단백질; 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH); 및 B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
예를 들면, 알부민과 본 개시의 하나 이상의 폴리펩타이드의 융합은 HSA를 코딩하는 DNA 또는 이의 단편이 하나 이상의 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 DNA에 연결되도록 유전적 조작에 의해 달성될 수 있다. 그 후, 융합 폴리펩타이드를 발현하도록, 예를 들면, 적합한 플라스미드 형태의 융합된 뉴클레오타이드 서열로 적합한 숙주를 형질전환시킬 수 있거나 형질감염시킬 수 있다. 발현은 시험관내에서, 예를 들면, 원핵 또는 진핵 세포로부터 달성될 수 있거나, 생체내에서, 예를 들면, 형질전환 유기체로부터 달성될 수 있다. 본 개시의 일부 실시양태들에서, 융합 단백질의 발현은 포유동물 세포주, 예를 들면, CHO 세포주에서 수행된다. 형질전환은 그의 주변으로부터의 외생성 유전 물질(외생성 DNA)의 직접적인 섭취, 도입 및 발현 및 세포막(들)의 통과로부터 비롯된 세포의 유전적 변경을 지칭하기 위해 본원에서 넓게 사용된다. 형질전환은 세균의 일부 종들에서 천연적으로 일어나지만, 다른 세포에서 인위적 수단에 의해 달성될 수도 있다. 더욱이, 알부민 그 자체를 변형시켜 그의 순환 반감기를 연장할 수 있다. 변형된 알부민과 하나 이상의 폴리펩타이드의 융합은 전술된 유전적 조작 기법 또는 화학적 접합에 의해 달성될 수 있고; 생성된 융합 분자는 변형되지 않은 알부민을 가진 융합체의 반감기를 초과하는 반감기를 가진다(PCT 공보 제WO2011/051489호 참조). 접합된 지방산 쇄(아실화)를 통한 알부민 결합을 포함하는, 여러 알부민 결합 전략들이 직접적인 융합에 대한 대안으로서 개발되었다. 혈청 알부민은 지방산을 위한 수송 단백질이기 때문에, 알부민 결합 활성을 가진 이 천연 리간드는 작은 단백질 치료제의 반감기 연장을 위해 사용되고 있다. 예를 들면, 당뇨병을 위한 승인된 제품인 인슐린 데테미르(detemir)(LEVEMIR)는 긴 작용 인슐린 유사체를 야기하는, 유전적으로 변형된 인슐린에 접합된 미리스틸 쇄를 포함한다.
또 다른 유형의 변형은 폴리펩타이드 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 성분 또는 분자, 예컨대, 또 다른 단백질(예를 들면, 본 단백질에 대한 이종성을 가진 아미노산 서열을 가진 단백질) 또는 담체 분자를 접합(예를 들면, 연결)시키는 것이다. 따라서, 예시적 폴리펩타이드 서열은 또 다른 성분 또는 분자를 가진 접합체로서 제공될 수 있다.
접합체 변형은 제2 분자의 추가 또는 상보적 기능 또는 활성과 함께 활성을 가진 폴리펩타이드 서열을 야기할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드 서열은 예를 들면, 가용성, 저장, 생체내 또는 저장 반감기 또는 안정성, 면역원성의 감소, 생체내에서의 지연된 또는 조절된 방출 등을 용이하게 하기 위해 분자에 접합될 수 있다. 다른 기능 또는 활성은 접합되지 않은 폴리펩타이드 서열에 비해 독성을 감소시키는 접합체, 접합되지 않은 폴리펩타이드 서열보다 더 효율적으로 세포 또는 장기의 한 유형을 표적화하는 접합체, 또는 본원에 기재된 장애 또는 질환(예를 들면, 당뇨병)과 관련된 원인 또는 효과를 더 무효화하는 약물을 포함한다.
폴리펩타이드는 큰 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대, 단백질; 폴리사카라이드, 예컨대, 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 비드; 중합체성 아미노산, 예컨대, 폴리글루탐산, 폴리라이신; 아미노산 공중합체; 불활성화된 바이러스 입자; 불활성화된 세균 독소, 예컨대, 디프테리아, 파상풍, 콜레라, 류코톡신 분자로부터의 톡소이드; 불활성화된 세균; 및 수지상 세포에 접합될 수도 있다.
접합을 위한 추가 후보 성분 및 분자는 단리 또는 정제에 적합한 성분 및 분자를 포함한다. 구체적인 비한정적 예로는 예를 들면, 플라스틱 또는 폴리스티렌 비드, 플레이트 또는 비드, 자성 비드, 시험 스트립 및 막을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 결합 분자, 예컨대, 바이오틴(바이오틴-아비딘 특이적 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴 또는 분자가 있다. 정제 방법, 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피가 접합체들을 이들의 다양한 분자량으로 효과적으로 분리하는 전하 차이로 접합체들을 분리하는 데 이용될 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수득된 분획의 내용물은 통상의 방법, 예를 들면, 질량 분광법, SDS-PAGE, 또는 분자량으로 분자 독립체들을 분리하는 다른 공지된 방법을 이용함으로써 분자량에 의해 확인될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 개시의 폴리펩타이드 서열의 아미노-말단 또는 카복실-말단은 면역글로불린 Fc 영역(예를 들면, 인간 Fc)과 융합되어 융합 접합체(또는 융합 분자)를 형성할 수 있다. Fc 융합 접합체는 생물약제의 전신 반감기를 증가시키는 것으로 확인되었으므로, 생물약제 제품은 덜 빈번한 투여를 요구할 수 있다.
Fc는 혈관의 내층을 형성하는 내피 세포에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하고, 결합 시, Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되고 순환계 내로 재방출되므로, 상기 분자는 순환계에서 더 오래 유지된다. 이 Fc 결합은 내생성 IgG가 그의 긴 혈장 반감기를 갖게 하는 기작인 것으로 여겨진다. 더 최근의 Fc 융합 기술은 생물약제의 단일 카피를 항체의 Fc 영역에 연결하여, 전통적 Fc 융합 접합체에 비해 생물약제의 약동학적 및 약력학적 성질을 최적화한다.
본 개시는 현재 공지되어 있거나 장래에 개발될, 폴리펩타이드의 다른 변형을 이용하여 하나 이상의 성질을 개선하는 것을 예상한다. 본 개시의 폴리펩타이드의 순환 반감기를 연장하거나, 안정성을 증가시키거나, 제거를 감소시키거나, 면역원성 또는 알레르기유발성을 변경시키는 이러한 한 방법은 분자의 특성을 변형시키기 위해 다른 분자에 연결된 하이드록시에틸 전분 유도체를 사용하는 헤실화(hesylation)에 의한 폴리펩타이드 서열의 변형을 포함한다. 헤실화의 다양한 양태들이 예를 들면, 미국 특허출원 제2007/0134197호 및 제2006/0258607호에 기재되어 있다.
시험관내 펩타이드/폴리펩타이드 합성
단백질 또는 펩타이드는 표준 분자생물학적 기법을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 펩타이드의 단리, 시험관내 번역, 또는 단백질 또는 펩타이드의 화학적 합성을 포함하는, 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 임의의 기법에 의해 제조될 수 있다.
펩타이드는 오염 세균 또는 동물 물질을 갖지 않는 시약을 사용함으로써 화학적으로 용이하게 합성될 수 있다(Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963). 일부 실시양태들에서, 항원성 펩타이드는 (1) 균일한 합성 및 절단 조건을 이용하는 다중-채널 기구에서의 병행 고체 상 합성; (2) 컬럼 스트립핑을 이용하는 RP-HPLC 컬럼에서의 정제; 및 펩타이드들 사이의 치환이 아닌 재세척 후, (3) 가장 많은 정보를 제공하는 어세이의 제한된 세트를 사용하는 분석에 의해 제조된다. 개별 환자를 위한 펩타이드들의 세트에 대한 우수 제조 관리기준(GMP) 풋프린트(footprint)를 규정함으로써, 상이한 환자들에 대한 펩타이드의 합성 사이에만 스위트 전환 절차를 요구할 수 있다.
대안적으로, 본 개시의 항원성 펩타이드를 코딩하는 핵산(예를 들면, 폴리뉴클레오타이드)은 시험관내에서 항원성 펩타이드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, 단일 및/또는 이중 가닥, 또는 천연 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 포스포로티에이트 골격을 가진 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합일 수 있고, 상기 펩타이드를 코딩하는 한, 인트론을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 시험관내 번역이 상기 펩타이드를 생성하는 데 이용된다. 당분야에서 숙련된 자가 이용할 수 있는 많은 예시적 시스템들(예를 들면, Retic Lysate IVT Kit, Life Technologies, 매사추세츠주 왈쌈 소재)이 존재한다. 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 발현 벡터도 제조될 수 있다. 상이한 유형의 세포를 위한 발현 벡터는 당분야에서 잘 공지되어 있고 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로, DNA를 발현에 적절한 배향 및 정확한 판독 프레임으로 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드 내에 삽입한다. 필요하다면, DNA를 원하는 숙주(예를 들면, 세균)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 뉴클레오타이드 서열에 연결할 수 있지만, 이러한 조절은 일반적으로 발현 벡터에서 이용될 수 있다. 그 다음, 표준 기법을 이용하여 클로닝을 위해 상기 벡터를 숙주 세균에 혼입한다(예를 들면, 문헌(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 참조).
단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터뿐만 아니라 이 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포도 고려된다. 항원성 펩타이드는 원하는 항원성 펩타이드를 코딩하는 RNA 또는 cDNA 분자의 형태로 제공될 수 있다. 본 개시의 하나 이상의 항원성 펩타이드는 단일 발현 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 숙주 세포로부터의 폴리펩타이드의 발현 및/또는 분비를 돕는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 세포로부터의 폴리펩타이드의 수송을 조절하기 위한 분비 서열로서 작용하는 리더 서열)에 동일한 판독 프레임으로 융합된, 질환 특이적 항원성 펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열을 가진 폴리펩타이드는 전구단백질이고, 숙주 세포에 의해 절단되어 폴리펩타이드의 성숙 형태를 형성하는 리더 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태들에서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 맞춤형 질환 백신 또는 면역원성 조성물에 혼입될 수 있는 코딩된 폴리펩타이드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 동일한 판독 프레임으로 융합된, 질환 특이적 항원성 펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 마커 서열은 세균 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙 폴리펩타이드의 정제를 제공하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 마커 서열은 포유동물 숙주(예를 들면, COS-7 세포)가 사용될 때 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래한 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다. 추가 태그는 칼모듈린 태그, FLAG 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, Softag 1, Softag 3, V5 태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, 바이오틴 카복실 담체 단백질(BCCP) 태그, GST 태그, 형광 단백질 태그(예를 들면, 녹색 형광 단백질 태그), 말토스 결합 단백질 태그, Nus 태그, Strep-태그, 티오레독신 태그, TC 태그, Ty 태그 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태들에서, 폴리뉴클레오타이드는 다수의 항원성 펩타이드들을 생성할 수 있는 단일 콘카타머화된 항원성 펩타이드 구축물을 생성하기 위해 동일한 판독 프레임으로 융합된, 질환 특이적 항원성 펩타이드들 중 하나 이상의 질환 특이적 항원성 펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 개시의 질환 특이적 항원성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 60% 동일한, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가진 단리된 핵산 분자를 제공할 수 있다.
본원에 기재된 단리된 질환 특이적 항원성 펩타이드는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 시험관내에서(예를 들면, 실험실에서) 생성될 수 있다. 이러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법부터, 단리된 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 적합한 형질전환된 숙주에서 이 서열을 발현시키는 방법까지 다양하다. 일부 실시양태들에서, 관심 있는 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 합성함으로써 재조합 기술을 이용하여 DNA 서열을 구축한다. 임의로, 부위 특이적 돌연변이유발로 서열을 돌연변이시켜 이의 기능성 유사체를 제공할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)) 및 미국 특허 제4,588,585호를 참조한다.
일부 실시양태들에서, 관심 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성기를 이용한 화학적 합성에 의해 구축될 것이다. 원하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 및 관심 있는 재조합 폴리펩타이드가 생성되는 숙주 세포에 유리한 코돈의 선택을 기반으로 이러한 올리고뉴클레오타이드를 디자인할 수 있다. 표준 방법을 적용하여 관심 있는 단리된 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들면, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역-번역된 유전자를 구축할 수 있다. 추가로, 특정 단리된 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들면, 원하는 폴리펩타이드의 부분을 코딩하는 여러 작은 올리고뉴클레오타이드들을 합성한 후 라이게이션시킬 수 있다. 개별 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 상보적 조립을 위해 5' 또는 3' 돌출부(overhang)를 함유한다.
(예를 들면, 합성, 부위 지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의해) 일단 조립되면, 관심 있는 특정 단리된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고 임의로 원하는 숙주에서의 단백질의 발현에 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결한다. 적절한 조립은 뉴클레오타이드 시퀀싱, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩타이드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 수득하기 위해, 유전자를 선택된 발현 숙주에서 작용하는 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동적으로 연결할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 질환 특이적 항원성 펩타이드를 코딩하는 DNA를 증폭시키고 발현시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래한 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동적으로 연결된, 질환 특이적 항원성 펩타이드 또는 생물등가 유사체를 코딩하는 합성 또는 cDNA 유래의 DNA 단편을 가진 복제가능한 DNA 구축물이다. 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 전사 유닛은 일반적으로 (1) 유전자 발현에 있어서 조절 역할을 가진 유전적 요소 또는 요소들, 예를 들면, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 시작 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 이러한 조절 요소는 전사를 조절하기 위해 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되는, 숙주에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 도입될 수 있다. DNA 영역들은 서로 기능적으로 관련되어 있을 때 작동적으로 연결되어 있다. 예를 들면, 신호 펩타이드(분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터는 서열의 전사를 조절하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있거나; 리보좀 결합 부위는 번역을 허용하도록 위치된 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, 작동적으로 연결되어 있다는 것은 연속적이라는 것을 의미하고, 분비 리더의 경우, 연속적이고 판독 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 효모 발현 시스템에서 사용하기 위한 구조 요소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 발현된 재조합 단백질로부터 임의로 나중에 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
진핵 숙주, 특히 포유동물 또는 인간을 위한 유용한 발현 벡터는 예를 들면, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 세균 숙주를 위한 유용한 발현 벡터는 공지된 세균 플라스미드, 예컨대, pCR 1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 비롯한, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 플라스미드, 더 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예컨대, M13 및 사상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 조절 하에 있는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이 또는 바실러스를 포함한다. 고등 진핵 세포는 포유동물로부터 유래한 확립된 세포주를 포함한다. 세포 부재 번역 시스템도 사용될 수 있다. 세균, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 당분야에서 잘 공지되어 있다(문헌(Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985) 참조).
다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템들도 재조합 단백질을 발현시키는 데 유리하게 사용된다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현은 이러한 단백질이 일반적으로 정확히 폴딩되고 적절하게 변형되고 완전히 기능적이기 때문에 수행될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 문헌(Gluzman, Cell 23:175, 1981)에 기재된 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주, 및 예를 들면, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소(CHO), 293, HeLa 및 BHK 세포주를 포함하는, 적절한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주가 있다. 포유동물 발현 벡터는 발현될 유전자에 연결된 전사되지 않는 요소, 예컨대, 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 전사되지 않는 다른 5' 또는 3' 플랭킹 서열, 및 번역되지 않는 5' 또는 3' 서열, 예컨대, 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생성하기 위한 바큘로바이러스 시스템은 문헌(Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988))에 검토되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피 등), 원심분리, 상이한 가용성, 또는 임의의 다른 표준 단백질 정제 기법을 포함한다. 적절한 친화성 컬럼에 통과시킴으로써 용이하게 정제할 수 있도록 친화성 태그, 예컨대, 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 등을 단백질에 부착할 수 있다. 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정촬영과 같은 기법을 이용하여 단리된 단백질을 물리적으로 특징화할 수도 있다. 예를 들면, 상업적으로 입수될 수 있는 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터의 상청액을 먼저 농축할 수 있다. 농축 단계 후, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면, 펜던트 디에틸아미노에틸(DEAE) 기를 가진 매트릭스 또는 기판을 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 유형의 매트릭스일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계를 이용할 수 있다. 적합한 양이온 교환제는 설포프로필 또는 카복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스들을 포함한다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들면, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 기를 가진 실리카 겔을 사용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 이용하여, 암 줄기 세포 단백질-Fc 조성물을 더 정제할 수 있다. 상기 정제 단계들 중 일부 또는 모든 정제 단계들을 다양한 조합으로 이용하여 균질한 재조합 단백질을 제공할 수도 있다.
세균 배양 시 생성된 재조합 단백질은 예를 들면, 세포 펠렛으로부터의 초기 추출에 이은 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 최종 정제 단계를 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용된 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
생체내 펩타이드/폴리펩타이드 합성
본 개시는 생체내에서, 예를 들면, DNA/RNA 백신의 형태로 항원성 펩타이드/폴리펩타이드를, 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 비히클로서 핵산 분자의 사용도 고려한다(예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입된 PCT 출원 공보 제WO2012/159643호 및 제WO2012/159754호 참조).
일부 실시양태들에서, 플라스미드를 사용하여 항원을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 이들은 통상적으로 관심 있는 유전자(또는 상보적 DNA)의 생체내 전사 및 번역을 유도하기 위한 강한 바이러스 프로모터로 구성된 플라스미드이다(Mor, et al., (1995). The Journal of Immunology 155 (4): 2039-2046). 인트론 A는 mRNA 안정성을 개선함으로써 단백질 발현을 증가시키기 위해 종종 포함될 수 있다(Leitner, et al. (1997). The Journal of Immunology 159 (12): 6112-6119). 플라스미드는 강한 폴리아데닐화/전사 종결 신호, 예컨대, 소 성장 호르몬 또는 토끼 베타-글로불린 폴리아데닐화 서열도 포함한다(Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Robinson et al., (2000). Adv. Virus Res. Advances in Virus Research 55: 1-74; Bohmet al., (1996). Journal of Immunological Methods 193 (1): 29-40). 하나 초과의 면역원을 발현시키거나 면역원 및 면역자극 단백질을 발현시키기 위해 종종 멀티시스트론성 벡터를 구축한다(Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
플라스미드는 다수의 상이한 방법들에 의해 동물 조직에 혼입될 수 있다. 두 가지 가장 인기 있는 방법들은 표준 피하 바늘을 사용한 식염수 중의 DNA의 주사, 및 유전자 총 전달이다. DNA 백신 플라스미드의 구축 및 이들 두 가지 방법들에 의한 숙주 내로의 그의 후속 전달의 체계적인 개요는 문헌(Scientific American (Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34-41))에 예시되어 있다. 식염수의 주사는 통상적으로 골격근에서 근육내(IM)로 수행되거나 피내(ID)로 수행되고, 이때 DNA는 세포외 공간으로 전달된다. 이것은 미요톡신(myotoxin), 예컨대, 부피바카인(bupivacaine)으로 근육 섬유를 일시적으로 손상시키거나 식염수 또는 수크로스의 고장성 용액을 사용함으로써 전기천공에 의해 도움을 받을 수 있다(Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410). 이 전달 방법에 대한 면역 반응은 바늘 유형, 바늘 정렬, 주사 속도, 주사 부피, 근육 유형, 및 주사받는 동물의 연령, 성별 및 생리학적 상태를 포함하는 많은 요인들에 의해 영향을 받을 수 있다(Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).
다른 통상적으로 사용되는 전달 방법인 유전자 총 전달은 압축된 헬륨을 가속화제로서 사용하여 금 또는 텅스텐 마이크로입자에 흡착된 플라스미드 DNA(pDNA)를 표적 세포 내로 탄도로 가속화한다(Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
대안적 전달 방법은 점막 표면, 예컨대, 코 및 폐 점막에의 네이키드 DNA의 에어로졸 점적주입(Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88), 및 눈 및 질 점막에의 pDNA의 국소 투여(Lewis et al., (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)를 포함할 수 있다. 점막 표면 전달은 양이온성 리포좀-DNA 제제, 생체분해성 마이크로스피어, 장 점막에의 경구 투여를 위한 약독화된 시겔라(Shigella) 또는 리스테리아(Listeria) 벡터, 및 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용함으로써 달성되기도 한다. DNA 또는 RNA는 세포를 일시적으로 투과가능하게 만드는 세포막의 약한 기계적 파괴 후 세포에게 전달될 수도 있다. 상기 막의 이러한 약한 기계적 파괴는 세포를 작은 천공에 부드럽게 통과시킴으로써 달성될 수 있다(Ex vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, Sharei et al, PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0118803 April 13, 2015).
일부 실시양태들에서, 질환 특이적 백신 또는 면역원성 조성물은 예를 들면, 본 개시에 따라 확인된 하나 이상의 항원성 펩타이드/폴리펩타이드를 코딩하는 별개의 DNA 플라스미드를 포함할 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 발현 벡터의 정확한 선택은 발현될 펩타이드/폴리펩타이드에 의해 좌우될 수 있고, 통상의 당업자의 기술 내에 있다. (예를 들면, 근육 세포 내에 에피좀성 비-복제 비-삽입된 형태의) DNA 구축물의 예상된 지속성은 보호의 증가된 지속을 제공할 것으로 예상된다.
본 개시의 하나 이상의 항원성 펩타이드는 코딩될 수 있고 바이러스 기반 시스템(예를 들면, 아데노바이러스 시스템, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 폭스바이러스 또는 렌티바이러스)을 사용함으로써 생체내에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 질환 백신 또는 면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 인간 환자에서 사용하기 위한 바이러스 기반 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스를 포함할 수 있다(예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입된 문헌(Baden et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis.2013 Jan 15;207(2):240-7) 참조). 아데노 관련 바이러스, 아데노바이러스 및 렌티바이러스 전달을 위해 사용될 수 있는 플라스미드는 이미 기재되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제6,955,808호 및 제6,943,019호, 및 미국 특허출원 제20080254008호 참조).
본 개시의 펩타이드 및 폴리펩타이드는 벡터, 예를 들면, 본원에서 논의된 핵산 분자, 예를 들면, RNA 또는 DNA 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대, 폭스바이러스, 예를 들면, 오르토폭스바이러스(orthopoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 또는 아데노바이러스, AAV 또는 렌티바이러스에 의해 발현될 수도 있다. 이 방법은 본 개시의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한 벡터의 사용을 포함한다. 급성으로 또는 만성으로 감염된 숙주 또는 감염되지 않은 숙주에 혼입되었을 때, 벡터는 면역원성 펩타이드를 발현함으로써 숙주 CTL 반응을 이끌어낸다.
본 개시의 실시에 사용될 수 있는 벡터들 중에서, 종종 삽입된 전이유전자의 장기간 발현을 야기하는 레트로바이러스 유전자 전달 방법을 이용하여 세포의 숙주 게놈 내로 삽입할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 추가로, 많은 상이한 유형의 세포들 및 표적 조직들에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다. 외부 외피 단백질을 도입하여, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장함으로써 레트로바이러스의 향성을 변경시킬 수 있다. 레트로바이러스는 삽입된 전이유전자의 조건부 발현을 가능하게 하여, 특정 유형의 세포만이 렌티바이러스에 의해 감염되도록 조작될 수도 있다. 세포 유형 특이적 프로모터는 특정 유형의 세포에서의 발현을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다(따라서, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터 둘 다가 본 개시의 실시에 사용될 수 있다). 더욱이, 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입할 수 있거나 감염시킬 수 있고, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의해 좌우될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6 내지 10 kb의 외부 서열에 대한 포장 수용량을 가진 시스-작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR은 원하는 핵산을 표적 세포 내로 삽입하여 영구적인 발현을 제공하는 데 사용되는 벡터의 복제 및 포장을 위해 충분하다. 본 개시의 실시에 사용될 수 있는, 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 이들의 조합에 기반을 둔 레트로바이러스 벡터를 포함한다(예를 들면, 문헌(Buchscher et al., (1992) J. Virol. 66:2731-2739); 문헌(Johann et al., (1992) J. Virol. 66:1635-1640); 문헌(Sommnerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59); 문헌(Wilson et al., (1998) J. Virol. 63:2374-2378); 문헌(Miller et al., (1991) J. Virol. 65:2220-2224); 및 PCT 출원 제PCT/US94/05700호 참조).
최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터, 예컨대, 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)에 기반을 둔 렌티바이러스 벡터도 본 개시의 실시에 유용하다(예를 들면, 문헌(Balagaan, (2006) J Gene Med; 8: 275 - 285, Published online 21 November 2005 in Wiley InterScience DOI: 10.1002/jgm.845) 참조). 벡터는 표적 유전자의 발현을 유도하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 가질 수 있다. 따라서, 본 개시는 본 개시의 실시에 유용한 벡터(들) 중에서 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 고려한다.
렌티바이러스 벡터는 파킨슨병의 치료에 유용한 것으로서 개시되어 있다(예를 들면, 미국 특허 공보 제20120295960호, 및 미국 특허 제7303910호 및 제7351585호 참조). 뇌로 전달될 렌티바이러스 벡터도 개시되어 있다(예를 들면, 미국 특허 공보 제20110293571호, 제20040013648호, 제20070025970호 및 제20090111106호, 및 미국 특허 제7259015호 참조). 또 다른 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 질환의 치료를 위해 벡터를 뇌에게 전달하는 데 사용된다. 본 개시의 실시에 유용한 렌티바이러스 벡터 시스템에 대해서는, 미국 특허 제6428953호, 제6165782호, 제6013516호, 제5994136호, 제6312682호 및 제7,198,784호, 및 이들에서 인용된 문헌을 참조한다. 본원의 한 실시양태에서, 전달은 렌티바이러스를 통한 전달이다. 조우와 그의 동료들(Zou et al.)은 1 x 109 형질도입 유닛(TU)/㎖의 역가를 가진 약 10 ㎕의 재조합 렌티바이러스를 경막내 카테터로 투여하였다. 이 종류의 용량은 본 개시에서의 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 사용에 적용될 수 있거나 외삽될 수 있다. 뇌와 같은 조직에 형질도입하기 위해, 매우 작은 부피를 사용할 필요가 있으므로, 바이러스 제제는 한외원심분리에 의해 농축된다. 다른 농축 방법, 예컨대, 한외여과 또는 매트릭스에의 결합 및 이로부터의 용출이 이용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 투여되는 렌티바이러스의 양은 75 kg의 평균 인간에 대한 총 단일 용량으로서 1x105 또는 약 1x105 플라크 형성 유닛(PFU), 5x105 또는 약 5x105 PFU, 1x106 또는 약 1x106 PFU, 5x106 또는 약 5x106 PFU, 1x107 또는 약 1x107 PFU, 5x107 또는 약 5x107 PFU, 1x108 또는 약 1x108 PFU, 5x108 또는 약 5x108 PFU, 1x109 또는 약 1x109 PFU, 5x109 또는 약 5x109 PFU, 1x1010 또는 약 1x1010 PFU 또는 5x1010 또는 약 5x1010 PFU일 수 있거나, 대상체의 체중 및 크기 및 종에 맞게 조절될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 적합한 용량을 결정할 수 있다. 바이러스에 적합한 용량은 경험적으로 결정될 수 있다.
아데노바이러스 벡터도 본 개시의 실시에 유용하다. 한 장점은 시험관내 및 생체내에서 재조합 유전자를 다양한 포유동물 세포들 및 조직들 내로 효율적으로 전달하고 발현시켜, 전달된 핵산의 높은 발현을 야기하는 재조합 아데노바이러스의 능력이다. 추가로, 휴면 세포를 생산적으로 감염시키는 능력은 재조합 아데노바이러스 벡터의 유용성을 확장시킨다. 또한, 높은 발현 수준은 핵산의 생성물이 면역 반응을 생성하기에 충분한 수준으로 발현될 것을 보장한다(예를 들면, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제7,029,848호 참조). 본 개시의 실시에 유용한 아데노바이러스 벡터에 대해서는 미국 특허 제6,955,808호를 참조한다. 사용되는 아데노바이러스 벡터는 Ad5, Ad35, Ad11, C6 및 C7 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 아데노바이러스 5("Ad5") 게놈의 서열은 공개되어 있다(Chroboczek, J., Bieber, F., and Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285; 이들의 내용은 본원에 참고로 도입됨). Ad35 벡터는 미국 특허 제6,974,695호, 제6,913,922호 및 제6,869,794호에 기재되어 있다. Ad11 벡터는 미국 특허 제6,913,922호에 기재되어 있다. C6 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 제6,780,407호, 제6,537,594호, 제6,309,647호, 제6,265,189호, 제6,156,567호, 제6,090,393호, 제5,942,235호 및 제5,833,975호에 기재되어 있다. C7 벡터는 미국 특허 제6,277,558호에 기재되어 있다. E1이 결여되어 있거나 결실되어 있고/있거나, E3이 결여되어 있거나 결실되어 있고/있거나, E4가 결여되어 있거나 결실되어 있는 아데노바이러스 벡터도 사용될 수 있다. E1 결여 아데노바이러스 돌연변이체가 비-허용 세포에서 복제할 수 없거나 적어도 매우 약독화되어 있기 때문에, E1 영역 내에 돌연변이를 가진 일부 아데노바이러스들은 개선된 안전성 한계를 가진다. E3 영역 내에 돌연변이를 가진 아데노바이러스는 아데노바이러스가 MHC 클래스 I 분자를 하향조절하는 기작을 파괴함으로써 향상된 면역원성을 가질 수 있다. E4 돌연변이를 가진 아데노바이러스는 후기 유전자 발현의 억제 때문에 아데노바이러스 벡터의 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 벡터를 사용한 반복된 재백신접종이 요구될 때 특히 유용할 수 있다. E1, E3, E4, E1 및 E3, 및 E1 및 E4에서 결실되어 있거나 돌연변이되어 있는 아데노바이러스 벡터가 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 나아가, 모든 바이러스 유전자들이 결실되어 있는 "속빈(gutless)" 아데노바이러스 벡터도 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 그의 복제를 위해 헬퍼 바이러스를 요구하고 천연 환경에 존재하지 않는 조건인, E1a 및 Cre 둘 다를 발현하는 특별한 인간 293 세포주를 요구한다. 이러한 "속빈" 벡터는 면역원성을 갖지 않으므로, 상기 벡터는 재백신접종을 위해 다회 접종될 수 있다. "속빈" 아데노바이러스 벡터는 이종 삽입물/유전자, 예컨대, 본 개시의 전이유전자의 삽입을 위해 사용될 수 있고, 심지어 다수의 이종 삽입물들/유전자들의 공-전달을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 전달은 단일 부스터 용량으로 사용될 수 있는 아데노바이러스를 통한 전달이다. 일부 실시양태들에서, 아데노바이러스는 다회 용량을 통해 전달된다. 생체내 전달의 관점에서, AAV는 숙주 게놈 내로 삽입되지 않기 때문에 낮은 독성 및 삽입 돌연변이유발을 야기할 낮은 가능성으로 인해 다른 바이러스 벡터에 비해 유리하다. AAV는 4.5 또는 4.75 Kb의 포장 한계를 가진다. 4.5 또는 4.75 Kb보다 더 큰 구축물은 상당히 감소된 바이러스 생성을 초래한다. 핵산 분자 발현을 유도하는 데 사용될 수 있는 많은 프로모터들이 있다. AAV ITR은 프로모터로서 작용할 수 있고 추가 프로모터 요소에 대한 필요성을 제거하기 때문에 유리하다. 편재성 발현을 위해, 하기 프로모터들이 사용될 수 있다: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등. 뇌 발현을 위해, 하기 프로모터들이 사용될 수 있다: 모든 신경들을 위해 SynapsinI, 흥분성 신경을 위해 CaMKII알파, GABAergic 신경을 위해 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등. RNA 합성을 유도하는 데 사용되는 프로모터는 Pol III 프로모터, 예컨대, U6 또는 H1을 포함할 수 있다. Pol II 프로모터 및 인트론성 카세트의 사용은 가이드 RNA(gRNA)를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 본 개시의 실시에 유용한 AAV 벡터에 대해서는 미국 특허 제5658785호, 제7115391호, 제7172893호, 제6953690호, 제6936466호, 제6924128호, 제6893865호, 제6793926호, 제6537540호, 제6475769호 및 제6258595호, 및 이들에서 인용된 문헌을 참조한다. AAV의 경우, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 표적화될 세포를 고려하여 AAV를 선택할 수 있고; 예를 들면, 뇌 또는 신경 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. 일부 실시양태들에서, 전달은 AAV를 통한 전달이다. 용량은 치료 이익과 임의의 부작용의 균형을 이루도록 조절될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 질환 백신 또는 면역원성 조성물에 대한 세포 면역 반응을 효과적으로 활성화시키는 것은 비병원성 미생물에서 백신 또는 면역원성 조성물 중의 관련 항원을 발현시켜서 달성될 수 있다. 이러한 미생물의 잘 공지되어 있는 예는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG, 살모넬라(Salmonella) 및 슈도모나(Pseudomona)이다(전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제6,991,797호 참조).
일부 실시양태들에서, 폭스바이러스는 질환 백신 또는 면역원성 조성물에서 사용된다. 이들은 오르토폭스바이러스, 아비폭스, 백시니아, MVA, NYVAC, 카나리폭스(canarypox), ALVAC, 파울폭스(fowlpox), TROVAC 등을 포함한다(예를 들면, 문헌(Verardi et al., Hum Vaccin Immunother. 2012 Jul; 8(7): 961-70); 및 문헌(Moss, Vaccine. 2013; 31(39): 4220-4222) 참조). 폭스바이러스 발현 벡터는 1982년에 기재되었고 백신 개발뿐만 아니라 다수의 분야들에서의 연구를 위해 급속히 널리 사용되게 되었다. 상기 벡터들의 장점은 단순한 구축, 다량의 외부 DNA를 수용하는 능력 및 높은 발현 수준을 포함한다. 본 개시의 실시에 사용될 수 있는 폭스바이러스, 예컨대, 코르도폭스비리내(Chordopoxvirinae) 서브패밀리 폭스바이러스(척추동물의 폭스바이러스), 예를 들면, 오르토폭스바이러스 및 아비폭스바이러스, 예를 들면, 백시니아 바이러스(예를 들면, 와이어쓰(Wyeth) 균주, WR 균주(예를 들면, ATCC® VR-1354), 코펜하겐 균주, NYVAC, NYVAC.1, NYVAC.2, MVA, MVA-BN), 카나리폭스 바이러스(예를 들면, 휘틀리(Wheatley) C93 균주, ALVAC), 파울폭스 바이러스(예를 들면, FP9 균주, 웹스터(Webster) 균주, TROVAC), 도브폭스(dovepox), 피전폭스(pigeonpox), 퀘일폭스(quailpox) 및 라쿤 폭스, 특히 이들의 합성 또는 비천연 생성 재조합체들, 이들의 용도, 및 이러한 재조합체들을 제조하고 사용하는 방법에 대한 정보는 과학 및 특허 문헌에서 발견될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 백시니아 바이러스는 질환 백신 또는 면역원성 조성물에서 항원을 발현시키기 위해 사용된다(Rolph et al., Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr Opin Immunol 9:517-524, 1997). 재조합 백시니아 바이러스는 감염된 숙주 세포의 세포질 내에서 복제할 수 있으므로, 관심 있는 폴리펩타이드는 면역 반응을 유도할 수 있다. 더욱이, 폭스바이러스는 면역 세포, 특히 항원 제시 세포를 직접 감염시킴으로써 주조직적합성 복합체 클래스 I 경로에 의한 프로세싱을 위해 코딩된 항원을 표적화하는 그의 능력뿐만 아니라 자가-보강하는 그의 능력 때문에 백신 또는 면역원성 조성물로서 널리 사용되고 있다.
일부 실시양태들에서, ALVAC는 질환 백신 또는 면역원성 조성물에서 벡터로서 사용된다. ALVAC는 외부 전이유전자를 발현하도록 변형될 수 있고 원핵 항원 및 진핵 항원 둘 다에 대한 백신접종 방법으로서 사용되고 있는 카나리폭스 바이러스이다(Horig H, Lee DS, Conkright W, et al. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule. Cancer Immunol Immunother 2000; 49: 504-14; von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, et al. Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen (CEA) and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas. Clin Cancer Res 2000; 6: 2219-28; Musey L, Ding Y, Elizaga M, et al. HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals. J Immunol 2003; 171: 1094-101; Paoletti E. Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc Natl Acad Sci U.S.A 1996; 93: 11349-53; 미국 특허 제7,255,862호). I 상 임상 시험에서, 종양 항원 CEA를 발현하는 ALVAC 바이러스는 선택된 환자에서 뛰어난 안전성 프로파일을 보였고 CEA 특이적 T 세포 반응을 증가시켰으나; 객관적인 임상 반응은 관찰되지 않았다(Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J Clin Oncol 1999; 17: 332-7).
일부 실시양태들에서, 변형된 백시니아 안카라(Ankara)(MVA) 바이러스는 항원 백신 또는 면역원성 조성물을 위한 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다. MVA는 오르토폭스바이러스 패밀리의 구성원이고 백시니아 바이러스의 안카라 균주(CVA)의 닭 배아 섬유모세포에서 약 570회 연속 계대배양함으로써 생성되었다(검토를 위해서는 문헌(Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14, 1975) 참조). 이 계대배양의 결과로서, 생성된 MVA 바이러스는 CVA에 비해 31 킬로베이스 더 적은 게놈 정보를 함유하고 숙주 세포가 매우 제한된다(Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991). MVA는 그의 극도의 약독화, 즉 감소된 병독성 또는 감염 능력을 특징으로 하나, 탁월한 면역원성을 여전히 가진다. 다양한 동물 모델들에서 시험되었을 때, MVA는 심지어 면역억제된 개체에서도 병독성을 갖지 않는 것으로 입증되었다. 더욱이, MVA-BN®-HER2는 HER-2 양성 유방암의 치료용으로 디자인된 후보 면역요법이고 현재 임상 시험되고 있다(Mandl et al., Cancer Immunol Immunother. Jan 2012; 61(1): 19-29). 재조합 MVA를 제조하고 사용하는 방법은 기재되어 있다(예를 들면, 전체로서 본원에 도입된 미국 특허 제8,309,098호 및 제5,185,146호 참조).
일부 실시양태들에서, 백신 또는 면역원성 조성물의 재조합 바이러스 입자는 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
본원은 질환 또는 질병을 가진 대상체를 위한 치료제를 개발하는 방법으로서, 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터 유래한 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 코딩하는 다중핵산을 하나 이상의 세포에 혼입하여, 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현시켜서, 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하고 특징화하는 단계; 및 임의로 특징화를 기반으로 치료제를 개발하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원은 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원을 확인하고 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원을 포함하는 대상체 특이적 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 대상체가 질환을 갖고 상기 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원이 대상체 및 대상체의 질환에 특이적이고, 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터 유래한 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 코딩하는 다중핵산을 하나 이상의 세포에 혼입하여, 상기 대상체로부터의 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현시켜서, 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 상기 하나 이상의 세포로부터 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 대상체 및 대상체의 질환에 특이적인 면역원성 펩타이드를 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 확인하는 단계; 및 확인된 하나 이상의 대상체 특이적 면역원성 펩타이드를 기반으로 대상체 특이적 면역원성 조성물을 제제화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 치료제 또는 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드, 또는 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 치료제 또는 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 수용체를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 또 다른 치료제, 임의로 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 보강제, 임의로 폴리-ICLC를 대상체에게 투여하는 단계도 포함한다.
일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환이다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염은 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염성 물질은 병원체, 바이러스, 세균 또는 기생충이다. 일부 실시양태들에서, 바이러스는 BK 바이러스(BKV), 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 림프구친화성 바이러스(HTLV-1), 인플루엔자 바이러스, RSV, HPV, 광견병, 볼거리 풍진 바이러스, 폴리오바이러스, 황열, A형 간염, B형 간염, 로타바이러스, 수두 바이러스, 인간 유두종바이러스(HPV), 천연두, 대상포진, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 세균은 클렙시엘라 종, 트로페리마 휘플레이, 마이코박테리움 레프라, 마이코박테리움 레프로마토시스 및 마이코박테리움 튜버큘로시스, 장티푸스, 폐렴구균, 수막염구균, 해모필루스 B, 탄저병, 파상풍 톡소이드, 수막염구균 군 B, bcg, 콜레라 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 연충 또는 원생동물이다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 레이쉬마니아 종, 플라스모듐 종, 트리파노소마 크루지, 아스카리스 룸브리코이데스, 트리쿠리스 트리키우라, 넥카터 아메리카누스, 스키스토소마 종, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원은 질환 또는 질병을 가진 대상체를 위한 치료제를 개발하는 방법으로서, 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA들을 코딩하는 서열이 제1 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 재조합 서열; 및 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 재조합 서열을 포함하는 것인 단계; 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포들 중 적어도 하나의 세포에서 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 HLA들을 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계; 및 확인된 하나 이상의 펩타이드를 기반으로 면역원성 조성물을 제제화하는 단계를 포함하고, 상기 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자가 대상체의 HLA 일배체형에 매칭되는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 대상체는 질환 또는 질병을 가진다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자와 상이하다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 동일하다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 배출되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 발현될 때 세포막에 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체가 아니다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 외생성 펩타이드를 세포의 집단에 혼입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을 하나 이상의 외생성 펩타이드와 접촉시키거나 세포의 집단에서 하나 이상의 외생성 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을, 하나 이상의 외생성 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 RNA이고, 임의로 이때 RNA는 mRNA이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석, 질량 분광측정 분석, MS 분석, MS/MS 분석, LC-MS/MS 분석 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 결합 친화성 또는 안정성을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에서 펩타이드와 HLA 분자의 회합을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암 또는 감염성 물질에 의한 감염이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체로부터의 하나 이상의 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함하고, 임의로 이때 상기 펩타이드는 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터의 펩타이드의 하나 이상의 영역을 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질로부터 유래한 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 일차 세포의 집단이다.
일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드는 항원 제시 세포에 의해 제시될 때 대상체로부터의 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 병든 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체와 병들지 않은 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체를 비교하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 확인하는 단계 전에 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃이다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다.
일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열은 클래스 I HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 클래스 I HLA 대립유전자이고 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 클래스 I HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열은 클래스 II HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA 클래스 II α쇄, HLA 클래스 II β쇄, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 클래스 II HLA 대립유전자이고 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자에 포함된다.
일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 코딩된 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 외로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 코딩된 제2 친화성 수용체 펩타이드는 세포 내로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는 태그 서열을 포함하고; 임의로, 이때 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 분자를 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 고체 표면은 비드이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자로 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 N-말단 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을 다중핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 접촉시키는 단계는 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을, 상기 다중핵산을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태들에서, 상기 다중핵산은 세포의 집단의 게놈 내로 안정하게 삽입된다.
일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 HLA 클래스 I α쇄이고, 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 HLA 클래스 I α쇄이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 링커에 의해 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제3 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 상이하다.
일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄 및/또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 제1 HLA 클래스 II α쇄 및 제2 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 클래스 II α쇄 및 제2 HLA 클래스 II α쇄 HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 제1 HLA 클래스 II β쇄 및 제2 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 클래스 II β쇄 및 제2 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄 또는 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열은 제3 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 상이하다.
일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드와 상이하고, 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 생화학적 분석 또는 질량 분광측정, 예컨대, 탠덤 질량 분광측정을 수행하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 하나 이상의 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에 상응하는 펩타이드 서열을 펩타이드 데이터베이스로부터 수득하는 단계를 포함하고; 이때 수득된 하나 이상의 서열은 하나 이상의 펩타이드의 서열을 확인시켜준다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO 및 THP1로부터 선택된 세포주이다.
일부 실시양태들에서, 세포주는 하나 이상의 사이토카인, 체크포인트 억제제, 후성적 활성 약물, IFN-γ, 또는 이들의 조합으로 처리된다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 105개의 세포들, 적어도 106개의 세포들 또는 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 수지상 세포, 대식세포, 암 세포 또는 B 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 종양 세포를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 세포로부터 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체를 단리하기 전에 물질과 접촉된다. 일부 실시양태들에서, 상기 물질은 염증 사이토카인, 화학 물질, 보강제, 치료제 또는 방사선이다.
일부 실시양태들에서, 제1 HLA 대립유전자 및/또는 제2 HLA 대립유전자는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 대립유전자 및/또는 제2 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 발현에 대해 어세이하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 어세이하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 시퀀싱하는 단계, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 RNA를 검출하는 단계, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질을 검출하는 단계, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 고유 바코드 서열을 포함한다.
실시예
하기 제공된 실시예는 예시하기 위한 것일 뿐이고 본원에서 제공된 청구범위를 한정하지 않는다.
실시예 1. 보편적 IP 파이프라인: 보편적 단일-대립유전자 HLA-펩타이드 복합체 확인 플랫폼
본원에 개시된 보편적 면역정제(IP) 구축물은 세포 형질감염 또는 형질도입을 통해 포유동물 발현 벡터로부터 발현되는 친화성 태깅된 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자를 코딩하는 DNA 구축물로 구성된다(도 1a 및 도 1b). 비한정적 예시적 클래스 I HLA 및 클래스 II HLA 구축물은 도 2에 표시되어 있다. 비한정적 예시적 친화성 태그는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP) 또는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 펩타이드 서열을 포함한다. 친화성 태그는 HLA 대립유전자의 N-말단 또는 C-말단에 배치될 수 있다. 절단 서열, 예컨대, 도 2에 표시된 F2A, 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES)는 α쇄와 β2 마이크로글로불린(클래스 I) 사이 또는 α쇄와 β쇄(클래스 II) 사이에 배치될 수 있다. 비한정적 예시적 벡터는 도 3에 표시된 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 항체 내성 유전자, 예컨대, 퓨로마이신 내성(Puro) 유전자를 구축물에 혼입하여 형질감염 또는 형질도입 후 선택을 가능하게 한다. 보편적 IP 구축물로 형질감염되었거나 형질도입된 세포를 LC-MS/MS 분석 전에 증폭시키거나(도 4a) 선택한 후 증폭시킨다(도 4b). 클래스 I HLA 및 클래스 II HLA에 대한 보편적 면역정제 플랫폼의 개략도는 도 5에 표시되어 있다.
실시예 2. 세포 배양, 및 HLA-펩타이드 면역정제 및 시퀀싱
이전에 기재된 바와 같이(Reche et al., 2006), 단일 클래스 I HLA 대립유전자(예를 들면, HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 및 HLA-B*14:02, 또는 HLA-E*01:01) 또는 클래스 II HLA 대립유전자(예를 들면, HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 및 HLA-DRB*11:01, 또는 HLA-DRB*15:01, 또는 HLA-DRB*07:01)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 B721.221, A375, JEG-3, K562, Jurkat, 또는 HEK293T, HeLa 또는 expi293 세포를 형질도입함으로써 단일-대립유전자 HLA 세포를 생성하였다. 세포주의 클래스 I 또는 II HLA 유형을 표준 분자 타이핑으로 확인하였다. 세포를 배양하였고 HLA-펩타이드 면역정제를 수행하였다.
HEK293T 세포 내로의 클래스 I HLA 대립유전자(도 6c)의 형질도입의 개념 증명은 도 6a 내지 6c에 표시되어 있다. 바이오티닐화 기반 보편적 면역정제를 위한 HLA-A*02:01 구축물을 사용하여 모의물, GFP 및 빈 플라스미드 형질도입을 수행하였고, 바이오티닐화를 웨스턴 블롯에서 확인하였다(도 6a). 폰소에 의해 염색된 겔을, 웨스턴 블롯 분석을 위한 적재 대조군으로서 사용하였다(도 6b). HEK293T 세포에 의해 발현된 클래스 I HLA-BAP 대립유전자 및 클래스 II HLA-BAP 대립유전자(도 7c)의 형질감염 및 바이오티닐화 최적화는 도 7a 내지 7c에 표시되어 있다. 바이오티닐화 시간 경과 실험은 클래스 I HLA-BAP 발현 세포 및 클래스 II HLA-BAP 발현 세포 둘 다의 경우 C-말단 및 N-말단에서 표지부착된 HLA-BAP 바이오티닐화가 10분 이내에 완료되었다는 것을 보여주었다(도 7a 및 도 7b).
본원에 개시된 보편적 IP 파이프라인을 다수의 유형의 세포들에서 시험하였다(도 8a 내지 8d). 클래스 I HLA 및 클래스 II HLA 둘 다에 대한 보편적 IP 구축물을 HEK293T(인간 배아 신장) 세포(도 8a), HeLa(인간 자궁경부암) 세포(도 8b), A375(인간 악성 흑색종) 세포(도 8c) 및 Expi293(고밀도 배양 및 단백질 발현을 위해 유전적으로 조작된 인간 배아 신장) 세포(도 8d) 내로 형질감염시켰다. BAP 표지를 위한 항-스트렙타비딘 및 HA 표지를 위한 항-HA를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였고, 폰소에 의해 염색된 겔을, 웨스턴 블롯을 위한 적재 대조군으로서 사용하였다. 웨스턴 블롯은 시험된 모든 유형의 세포들에서 클래스 I 구축물 및 클래스 II 구축물 둘 다의 발현을 확인시켜주었다(도 8a 내지 8d).
본 실시예에서 사용된 물질 및 방법이 이하에 기재되어 있다.
클래스 I HLA 대립유전자 및 클래스 II HLA 대립유전자의 보편적 IP(바이오틴)
표준 방법에 따라 보편적 IP 구축물을 발현하도록 세포를 형질감염시켰거나 형질도입하였다. 형질도입 후, 세포를 배지에 재현탁하고 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮긴다. 상기 튜브를 5분 동안 1500 rpm으로 회전시켰고 배지를 제거하였다. 그 다음, 세포를 1.5 ㎖의 냉각된 PBS에 재현탁하고 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 그 후, 상기 튜브를 5분 동안 원심분리하였다(4℃에서 550 x g). PBS를 제거한 후, 세포를 1.2 ㎖ 용해 완충제에 재현탁하였다. 세포를 상기 완충제에 재현탁한 후, 벤조나제(benzonase)를 첨가하였다. 상기 튜브를 종종 혼합하면서 얼음 위에서 항온처리하였다. 얼음 위에서 15분 동안 항온처리한 후, 상기 튜브를 20분 동안 원심분리하였다(4℃에서 15,000 x g). 바이오티닐화를 위해 상청액(500 ㎕)을 (미리 세척된) 또 다른 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 바이오틴, ATP 및 BirA를 각각의 샘플에 첨가하여 세포 용해물의 바이오티닐화를 달성하였다. 그 후, 샘플을 10분 동안 실온에서 항온처리한 후, 면역침전 전에 얼음 위에 놓아두었다.
미리 세척된 스트렙타비딘 또는 NeutrAvidin 아가로스 수지 슬러리를 바이오티닐화된 용해물에 첨가함으로써 NeutrAvidin 또는 스트렙타비딘 비드를 사용한 면역침전을 수행하였다. 그 후, 샘플을 튜브 로티세리(rotisserie) 위에 놓아두고 4℃에서 30분 동안 항온처리한다. 30분 항온처리 후, 상기 비드를 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화하고 상청액을 제거하고 버린다. 그 후, 상기 비드를 1 ㎖의 세척 완충제에 재현탁하였다. 그 다음, 상기 비드를 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화였고, 세척 완충제를 제거하고 버렸다. 이 단계를 반복하여 세척 완충제를 사용한 총 4회의 세척을 제공하였다. 펠렛화된 비드를 1 ㎖의 트리스 완충제에 재현탁하고 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화하였고, 트리스 완충제를 제거하였다. 이 단계를 반복하여 트리스 완충제를 사용한 총 4회의 세척을 제공하였다. 비드를 1 ㎖의 질량 분광측정 등급 물에 재현탁하고 원심분리하여(1500 x g, 1분, 4℃) 비드를 펠렛화함으로써 MS 등급 물로 최종 세척을 수행하였다. 상청액을 제거하였고 비드를 -80℃에서 저장하였거나 HLA-펩타이드 용출 및 탈염을 즉시 수행하였다.
클래스 II HLA 대립유전자의 연속 보편적 IP(HA 및 바이오틴 태그부착)
표준 프로토콜에 따라 보편적 IP 구축물을 발현하도록 세포를 형질감염시켰거나 형질도입하였다. 형질도입 후, 세포를 배지에 재현탁하고 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮긴다. 상기 튜브를 5분 동안 1500 rpm으로 회전시켰고 배지를 제거하였다. 그 다음, 세포를 1.5 ㎖의 냉각된 PBS에 재현탁하고 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 그 후, 상기 튜브를 5분 동안 원심분리하였다(4℃에서 550 x g). PBS를 제거한 후, 세포를 1.2 ㎖ 용해 완충제에 재현탁하였다. 세포를 상기 완충제에 재현탁한 후, 벤조나제를 첨가하였다. 상기 튜브를 종종 혼합하면서 얼음 위에서 항온처리하였다. 얼음 위에서 15분 동안 항온처리한 후, 상기 튜브를 20분 동안 원심분리하였다(4℃에서 15,000 x g). 바이오티닐화를 위해 상청액을 (미리 세척된) 또 다른 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 바이오틴, ATP 및 BirA를 각각의 샘플에 첨가하여 세포 용해물의 바이오티닐화를 달성하였다. 그 후, 샘플을 10분 동안 실온에서 항온처리한 후, 면역침전 전에 얼음 위에 놓아두었다.
항-HA 항체와 미리 결합된, 미리 세척된 단백질 G 아가로스 수지를 첨가함으로써 HA 태깅된 클래스 II 대립유전자의 면역침전을 수행하였다. 그 다음, 샘플을 튜브 로티세리 위에서 4℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 60분 항온처리 후, 비드를 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화하였고, 상청액을 제거하고 버렸다. 상기 비드를 용해 완충제로 2회 세척하였고 유리 HA 펩타이드를 함유하는 용해 완충제에 재현탁하고 튜브 로티세리 위에서 4℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 그 후, 상기 비드를 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화하였고 상청액을, 200 ㎕의 미리 세척된 NeutrAvidin 또는 스트렙타비딘 아가로스 비드를 함유하는 1.5 ㎖ 에펜도르프로 옮겼다. 그 후, 샘플을 튜브 로티세리 위에 놓아두고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 30분 항온처리 후, 상기 비드를 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화하였고 상청액을 제거하고 버렸다. 그 다음, 상기 비드를 1 ㎖의 세척 완충제에 재현탁하였다. 그 다음, 상기 비드를 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화하였고, 세척 완충제를 제거하고 버렸다. 이 단계를 반복하여, 세척 완충제를 사용한 총 4회의 세척을 제공하였다. 펠렛화된 비드를 1 ㎖의 트리스 완충제에 재현탁하고 원심분리(1500 x g, 1분, 4℃)로 펠렛화하였고, 세척 완충제를 제거하였다. 이 단계를 반복하여, 트리스 완충제를 사용한 총 4회의 세척을 제공하였다. 비드를 1 ㎖의 질량 분광측정 등급 물에 재현탁하고 원심분리하여(1500 x g, 1분, 4℃) 비드를 펠렛화함으로써 MS 등급 물로 최종 세척을 수행하였다. 상청액을 제거하였고 비드를 -80℃에서 저장하였거나 HLA-펩타이드 용출 및 탈염을 즉시 수행하였다.
HLA-펩타이드 용출 및 탈염
HLA 복합체로부터 펩타이드를 용출하고 사내 구축된 Empore C18 StageTips (3M, 2315)(Rappsilber et al., 2007)에서 탈염하였다. 샘플 적재, 세척 및 용출을 1,500 내지 3,000 x g의 최대 속도로 테이블상면 원심분리기에서 수행하였다. StageTips를 2회의 메탄올 세척, 2회의 아세토니트릴/포름산 세척 및 2회의 포름산 세척으로 평형화시켰다. 튜브에서, HLA-회합된 펩타이드 IP로부터의 건조된 비드를 4℃에서 해동시키고 ACN/포름산 혼합물에서 재구성하고 StageTips에 적재하였다. 상기 비드를 포름산으로 세척하였고, 10% 아세트산에서의 2회 5분 항온처리를 이용하여 펩타이드를 더 용출하였다. 조합된 세척 및 용출 부피를 조합하고 StageTips에 적재하였다. IP 비드를 함유하는 튜브를 포름산으로 다시 세척하였고, 이 부피도 StageTips에 적재하였다. 펩타이드를 StageTips 또는 탈염 카트리지에서 포름산으로 2회 세척하였다. ACN과 포름산 혼합물의 단계 구배를 이용하여 펩타이드를 용출하였다. 단계 용출물을 조합하고 건조하여 완료하였다.
실시예 3. LC-MS/MS에 의한 클래스 I 및 클래스 II HLA-회합된 펩타이드 시퀀싱
모든 나노 LC-ESI-MS/MS 분석은 이하에 기재된 동일한 LC 분리 조건을 이용하였다. 10 ㎛ 방사체를 가진 PicoFrit 75 ㎛ 내부 직경 모세관을 갖추었고 압력 하에서 C18 Reprosil 비드(1.9 ㎛ 입자 크기, 200 Å 공극 크기, Dr. Maisch GmBH)로 약 20 cm까지 팩킹되었고 분리 동안 50℃에서 가열된 Proxeon Easy Nano LC 1000(Thermo Scientific, 캘리포니아주 산 호세 소재)을 이용하여 샘플을 크로마토그래피로 분리하였다.
CAN과 포름산의 혼합물 중의 샘플을 적재하였고, 82분에 걸쳐 7%부터 30%까지 완충제 B(0.1% FA 또는 0.5% AcOH 및 80% 또는 90% ACN)의 선형 구배를 이용하고 6분에 걸쳐 30%부터 90%까지 완충제 B의 선형 구배를 이용하여 펩타이드를 용출한 후, 200 nl/분의 속도로 15분 동안 90% 완충제 B(완충제 A, 0.1% FA 및 3% ACN)로 유지하여 약 13초(FA) 피크 폭을 제공하였다. 데이터 의존적 획득 동안, 용출된 펩타이드를, 2.2 kV에서 나노전기분무 공급원을 갖춘 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분광측정기(Thermo Scientific)에 혼입하였다. 300 m/z부터 1,800 m/z까지 30,000의 해상도로 전체 스캔 MS를 획득하였다. 각각의 전체 스캔 후, 0.7 m/z의 단리 폭을 이용하여 해상도 15,000에서 상위 10개의 데이터 의존적 MS2 스캔을 수행하였다.
보편적 IP 파이프라인에서 사용된 친화성 태깅된 클래스 I HLA 및 클래스 II HLA 구축물을 발현하는 다수의 유형의 세포들로부터 확인된 총 고유 HLA-회합된 펩타이드들의 수는 도 9a에 표시되어 있다. 클래스 I HLA 단일-대립유전자 펩타이드 프로파일링으로부터의 고유 펩타이드의 수는 도 9b에 표시되어 있다. 클래스 II HLA 단일-대립유전자 펩타이드 프로파일링으로부터의 고유 펩타이드의 수는 도 9c에 표시되어 있다. HLA-회합된 펩타이드의 LC-MS/MS 분석은 클래스 I HLA-회합된 펩타이드 및 클래스 II HLA-회합된 펩타이드의 특성을 보여주었다(도 10a 및 10b). 단리되고 시퀀싱된 클래스 I HLA-A*02:01-회합된 펩타이드 및 클래스 II HLA-DRβ*11:01-회합된 펩타이드의 서열 로고 표시는 도 10a에 제시되어 있다. 클래스 I HLA-A*02:01-회합된 펩타이드(적색) 및 클래스 II HLA-DRβ*11:01-회합된 펩타이드(청색) 둘 다의 길이 분포 비교는 클래스 I HLA-회합된 펩타이드 및 클래스 II HLA-회합된 펩타이드 둘 다가 예상된 추세를 따른다는 것을 보여주었다(도 10b).
본원에 기재된 단일-대립유전자 방법에 대해 70개의 HLA 클래스 I 대립유전자들 및 47개의 HLA 클래스 II 대립유전자들을 평가하였다. 친화성 태그를 가진 70개의 고유 HLA 클래스 I 대립유전자들(표 1A) 및 친화성 태그를 가진 47개의 고유 HLA 클래스 II 대립유전자들(표 2A)을 생성하였다. 표 1B는 70개의 고유 HLA 클래스 I 대립유전자들(일부 경우, 동일한 대립유전자가 다수의 세포주들 내에 배치되었음)을 사용한 96회의 고유 실험들의 세부사항을 보여준다. 표 2B는 47개의 고유 HLA 클래스 II 대립유전자들(일부 경우, 동일한 대립유전자가 다수의 세포주들 내에 배치되었음)을 사용한 54회의 고유 실험들의 세부사항을 보여준다.
[표 1A]
[표 1B]
[표 2A]
[표 2B]
실시예 4. 다수의 친화성 태그들을 사용한 클래스 II HLA 복합체의 탠덤 보편적 IP
상이한 친화성 태그로 각각 태그부착할 수 있는 클래스 II HLA 복합체를 α쇄 및 β쇄 페어링으로 형성하였다. 두 친화성 태그들을 사용한 연속 IP는 α쇄 및 β쇄 페어링의 데콘볼루션 및 클래스 II HLA 복합체로의 명확한 펩타이드 결합 배정을 가능하게 한다. 보편적 IP 파이프라인을 위해 상이한 유형의 세포들에 의해 발현되도록 조작된 클래스 II HLA 구축물의 개략적 표시는 도 11a에 제시되어 있다. 내생성 클래스 II HLA α쇄 및 β쇄 서브유닛을 발현하는 세포주에서 도 11a의 구축물을 발현할 때 형성될 수 있는 가능한 클래스 II HLA 복합체의 개략적 표시는 도 11b에 제시되어 있다.
α쇄 및 β쇄 페어링의 데콘볼루션 및 특정 클래스 II HLA 복합체로의 명확한 펩타이드 결합 배정을 위해 이용될 수 있는 연속 보편적 IP 전략의 개략도는 도 12a에 묘사되어 있다. 이중 친화성 태깅된 클래스 II HLA 구축물을 발현하는 세포를 용해시키고 바이오티닐화하고 항-HA 항체에 커플링된 비드와 함께 항온처리하였다. HA 태깅된 서브유닛을 가진 클래스 II HLA 복합체를 단리하고 세척하였고 HA 펩타이드(YPYDVPDYA)를 사용하여 용출하였다. 그 후, 용출물을 NeutrAvidin 또는 스트렙타비딘에 커플링된 비드와 함께 항온처리하여, HA 태깅된 및 바이오틴 태깅된 클래스 II HLA 복합체를 단리하였다. 그 다음, 이중 태깅된 클래스 II HLA 복합체에 결합된 펩타이드를 용출하고 LC-MS/MS로 시퀀싱한다. 웨스턴 블롯 및 적재 대조군(폰소 S에 의해 염색된 겔)은 연속 보편적 IP 파이프라인의 특이성을 입증하였다. 웨스턴 블롯은 이중 태깅된 HLA-DRB*11:01 구축물을 발현하는 HEK293T에서 연속 보편적 IP 전략을 검증하였다(도 12b). 항-HA 항체를 사용하여 연속 농축 과정을 추적하였다. 폰소 S에 의해 염색된 겔을 웨스턴 블롯 적재 대조군으로서 사용하였다. 이중 친화성 태깅된 클래스 II HLA 구축물 HLA-DRB*11:01을 발현하는 세포를 용해시키고 바이오티닐화 없이 항-HA 항체에 커플링된 비드와 함께 항온처리하는 음성 대조군 실험의 웨스턴 블롯은 도 12c에 표시되어 있다. 도 12c에 표시된 바와 같이, 바이오티닐화 단계가 연속 보편적 IP 프로토콜로부터 제거될 때 농축은 관찰되지 않았다.
실시예 5. 바이오틴 친화성 태그를 사용하는 단일-대립유전자 HLA-펩티돔 프로파일링 방법
바이오틴 친화성 태그를 사용하는 단일-대립유전자 HLA-펩티돔 프로파일링 방법의 개략적 표시는 도 14a 및 도 14b에 제시되어 있다. 본 개시의 한 예시적 실시양태는 BirA 효소에 의해 라이신(K) 잔기에서 바이오티닐화되는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP)를 사용한다. BAP 펩타이드 서열은 BirA 효소, 바이오틴 및 ATP의 첨가 시 바이오티닐화되는 라이신 잔기를 함유한다. 바이오티닐화된 생성물은 스트렙타비딘/NeutrAvidin에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 스트렙타비딘/NeutrAvidin 비드는 바이오티닐화된 BAP 펩타이드 서열을 농축하는 데 사용될 수 있다.
실시예 6. 표적화된 에피토프 발견 플랫폼
HLA 발현 세포를 농축하기 위해 선택을 이용하거나 이용하지 않으면서, 관심 있는 세포주(예를 들면, 2HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO 또는 THP1) 또는 일차 세포(예를 들면, 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 세포)를, N-말단 또는 C-말단에서 태그(예를 들면, BAP 서열)를 함유하는 클래스 I 또는 II HLA 구축물로 형질감염시킬/형질도입할 수 있다(도 15). 그 다음, 발현될 수 있고 태그 표지부착된 HLA 분자에 의해 제시될 수 있는 에피토프 단편 또는 에피토프들의 쇄를 함유하는 제2 플라스미드로 세포를 형질감염시킬 수 있거나 형질도입할 수 있다. 대안적으로, HLA 대립유전자 플라스미드 및 에피토프 플라스미드 둘 다를 세포 내로 공-전달한 후, 증폭 및/또는 선택을 수행할 수 있다. 그 후, 이 조작된 세포를 용해시키고 바이오티닐화하고, (예를 들면, 스트렙타비딘 비드를 사용하여) HLA 분자를 용해물로부터 농축한다. 펩타이드를 HLA 분자로부터 용출하고, 예를 들면, LC-MS/MS로 분석한다. 이 방법은 에피토프가 어떻게 프로세싱되고 상이한 대립유전자에 의해 제시되는지를 분석할 수 있게 한다. 이 방법은 에피토프 전달 및 디자인을 개선하는 데에도 이용될 수 있다.
실시예 7. 대립유전자 다중체화
DNA 구축물은 하나 이상의 태그를 함유하는 다수의 클래스 I 중쇄들 또는 다수의 클래스 II 중쇄들을 발현하도록 디자인될 수 있다(도 16). 리보좀 스킵핑 서열(F2A, T2A, P2A 등) 또는 IRES 요소를 포함하는 동일한 유전자 구축물로부터 각각의 HLA 구축물을 발현시킬 수 있다. 이 플라스미드로 원하는 세포주를 형질도입하거나 형질감염시켜, 태깅된 후 농축되는 다수의 HLA 대립유전자들의 발현을 유도할 수 있다. 대안적으로, 단일 HLA 대립유전자를 각각 함유하는 다수의 플라스미드들로 세포주를 형질도입할 수 있거나 형질감염시킬 수 있다. 그 후, HLA 대립유전자에 결합된 펩타이드를, 예를 들면, LC-MS/MS로 분석할 수 있다. 이 플랫폼은 다수의 대립유전자들을 가진 세포주가 생성될 수 있게 한다. 이것은 예를 들면, 환자의 HLA 유형을 매칭시키는 데 사용될 수 있다. 이것은 상이한 대립유전자 조합들에 대한 펩타이드 에피토프 패턴이 생성될 수 있게 할 것이다.
실시예 8. 프로세싱 및 대립유전자 특이적 결합의 개선된 예측
NetMHC는 각각의 대립유전자의 결합 데이터 세트에 대한 별개의 예측자를 훈련시키는 대립유전자 특이적 방법이고, NetMHCpan은 그의 입력물이 펩타이드 및 특정 MHC 분자의 서브서열 둘 다의 벡터 코딩물인 범-대립유전자 방법이다. 통상의 지식은 NetMHC가 많은 어세이된 리간드들을 사용하여 대립유전자에 대해 더 잘 수행하는 반면, NetMHCpan은 덜 특징화된 대립유전자에 대해 더 잘 수행한다는 것이다. 그러나, 관련 데이터가 훈련 세트에 포함되지 않았을 때, NetMHCpan은 정확하지 않다는 것이 확인되었다.
본원에 기재된 단일-대립유전자 방법(도 21)은 NetMHCpan에 의해 잘 점수화되지 않았으나 강력한 결합제로서 생화학적으로 검증된 HLA 결합 펩타이드를 커버하지 않았다. 도 20a는 본원에 기재된 단일-대립유전자 방법의 이용에 의해 커버되지 않는 A*01:01, B*51:01, A*29:02 및 B*54:01 대립유전자에 대한 예시적 HLA 결합 펩타이드를 보여준다. 도 20b는 100회의 시뮬레이션된 데콘볼루션에서의 부정확한 배정률을 보여준다. 무작위적 6개의 대립유전자 환자 HLA 유전형(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 각각 2개의 대립유전자들, 미국 대립유전자 빈도로 샘플링)이 생성되었다. 각각의 대립유전자에 대해, 관련 단일-대립유전자 실험으로부터 500개의 펩타이드들을 샘플링하고 조합하여 모의물 3000개 펩타이드 다중-대립유전자 데이터 세트를 생성하였다. 가장 우수한 NetMHCpan% 순위 점수를 제공하는 대립유전자에 각각의 펩타이드를 배정하여, NetMHCpan에 의해 부정확하게 배정된 펩타이드의 퍼센트를 측정하였다. 이 과정을 100회 반복하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 프로세싱 및 대립유전자 특이적 결합 예측 둘 다가 상당히 개선되었다.
본 개시의 단락
본원은 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 단계; 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 및 HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 단계를 포함하는, HLA-펩타이드 복합체를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 가용성 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 2개 이상의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들에 대해 상기 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 2개 이상의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 분비되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 발현될 때 세포막에 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체가 아니다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 단일 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 펩타이드에 작동적으로 연결된 상이한 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 상이한 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 하나 이상의 세포를 각각 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 및 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분을 특징화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 펩타이드를 세포의 집단에 혼입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을 하나 이상의 펩타이드와 접촉시키거나 세포의 집단에서 하나 이상의 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 RNA이고, 임의로 이때 RNA는 mRNA이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 서열을 결정하는 단계, 및 임의로 펩타이드 또는 이의 부분이 변형되어 있는지를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석, 질량 분광측정 분석, MS 분석, MS/MS 분석, LC-MS/MS 분석 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 결합 친화성 또는 안정성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 농축하는 단계로부터의 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에서 펩타이드와 HLA 분자의 회합을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 폴리펩타이드 약물, 예컨대, 생물제제(예를 들면, 항체 약물)로부터 유래한 펩타이드의 라이브러리를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암, 감염성 물질에 의한 감염, 또는 자가면역 반응이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 폴리펩타이드 약물, 예컨대, 생물제제(예를 들면, 항체 약물) 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체로부터의 하나 이상의 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함하고, 임의로 이때 상기 펩타이드는 감염성 물질 또는 폴리펩타이드 약물의 하나 이상의 표적 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 폴리펩타이드 약물의 하나 이상의 표적 단백질로부터의 펩타이드의 하나 이상의 영역을 특징화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질로부터 유래한 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 일차 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 질환 또는 질병을 가진 대상체에 매칭된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드는 항원 제시 세포에 의해 제시될 때 대상체로부터의 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, 특징화하는 단계는 암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체와 비-암 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체를 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 복수의 세포의 집단들을 포함하고, 이때 각각의 세포의 집단은 상이한 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 복수의 세포의 집단들의 각각의 세포의 집단은 동일한 또는 별개의 용기에 있다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 특징화하는 단계 전에 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA-펩타이드 복합체는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 HLA-펩타이드 복합체는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 세포 배양의 배지로부터 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 예를 들면, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 HLA, 예컨대, 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 함유하는 비드 또는 컬럼을 사용함으로써 단리될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 사용함으로써 단리된다. 일부 경우, 친화성 태그를 갖거나 갖지 않는 가용성 HLA(sHLA)는 항-HLA 항체를 함유하는 컬럼을 사용함으로써 단리된다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드의 말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 I HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 클래스 II HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA 클래스 II α쇄, HLA 클래스 II β쇄, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩한다.
일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들 중 하나 이상은 제1 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결되고, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들 중 하나 이상은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들 각각은 상이한 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 상이한 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 친화성 태그를 코딩하는 서열에 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 동일한 또는 상이한 친화성 수용체 펩타이드에 작동적으로 연결된 상이한 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 제2 다중핵산을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 외로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 위치한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 내로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자, 예컨대, 유연성 루프 서열을 코딩하는 서열의 내부 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 소르타제 태그, 비드와의 공유 펩타이드 결합을 형성하는 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는 태그 서열을 포함하고; 임의로, 이때 상기 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 분자를 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 바이오틴에 결합하는 분자를 포함한다. 예를 들면, 친화성 분자는 다른 유기체로부터의 단백질 상동체를 포함하는, 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 고체 표면은 비드이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자로 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 N-말단 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을 다중핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 접촉시키는 단계는 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을, 다중핵산을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태들에서, 다중핵산은 세포의 집단의 게놈 내로 안정하게 삽입된다.
일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드와 상이하고, 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석 또는 질량 분광측정, 예컨대, 탠덤 질량 분광측정을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 하나 이상의 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에 상응하는 펩타이드 서열을 펩타이드 데이터베이스로부터 수득하는 단계를 포함하고; 이때 수득된 하나 이상의 서열은 하나 이상의 펩타이드의 서열을 확인시켜준다. 일부 실시양태들에서, 펩타이드 데이터베이스는 예컨대, 변형 데이터베이스를 갖지 않거나 변형 데이터베이스를 가진 비-효소 특이성 펩타이드 데이터베이스이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 역전된-데이터베이스 검색 전략을 이용하여 펩타이드 데이터베이스를 검색하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 인간 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 마우스 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 CHO 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat 및 THP1로부터 선택된 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 사이토카인, 체크포인트 억제제, 후성적 활성 약물, IFN-γ, 항원 프로세싱을 변경시키는 물질(예컨대, 펩티다제 억제제, 프로테아좀 억제제 및 TAP 억제제), 또는 이들의 조합으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 대사 경로 또는 대사 상태를 조절하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 세포 프로테옴을 조절하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 세포 발현 또는 전사를 조정하거나 조절하는 하나 이상의 시약(예를 들면, AIRE 또는 CREB 결합 단백질 또는 이의 조절제)으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 전사 인자를 조정하거나 조절하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 HLA의 세포 발현 또는 전사를 조정하거나 조절하는 하나 이상의 시약으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 프로테옴의 세포 발현 또는 전사를 조정하거나 조절하는 하나 이상의 시약으로 처리된다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 105개의 세포들, 적어도 106개의 세포들 또는 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 수지상 세포, 대식세포, 암 세포 또는 B 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 종양 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 세포로부터 상기 HLA-펩타이드 복합체를 단리하기 전에 물질과 접촉된다. 일부 실시양태들에서, 상기 물질은 염증 사이토카인, 화학 물질, 보강제, 치료제 또는 방사선이다.
일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 발현에 대해 어세이하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 어세이하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 시퀀싱하는 단계, 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 RNA를 검출하는 단계, 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질을 검출하는 단계, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 발현에 대해 어세이하는 단계는 웨스턴 블롯 어세이, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 질량 분광측정(MS), 마이크로어레이 하이브리드화 어세이, RNA-seq 어세이, 중합효소 연쇄 반응 어세이, LAMP 어세이, 리가제 연쇄 반응 어세이, 서던 블롯 어세이, 노던 블롯 어세이 또는 효소-연결된 면역흡착 어세이(ELISA)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 상이한 HLA 대립유전자들에 대해 상기 방법의 단계들을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 각각의 상이한 HLA 대립유전자는 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 상이한 HLA 대립유전자를 코딩하는 각각의 다중핵산은 고유 바코드 서열을 포함한다.
본원은 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스를 제공한다. 본원은 매번 상이한 HLA 대립유전자를 사용하여 본원에 기재된 방법을 반복적으로 수행함으로써 수득된 2개 이상의 HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드 서열 데이터베이스들의 조합을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드 서열 데이터베이스 또는 본원에 기재된 조합으로 기계를 훈련시키는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하기 위한 예측 알고리즘을 생성하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 상기 기계는 하나 이상의 선형 모델, 지지 벡터 기계, 결정 트리 및 신경망을 겸비한다. 일부 실시양태들에서, 상기 기계를 훈련시키는 데 사용된 변수는 펩타이드 서열, 아미노산 물성, 펩타이드 물성, 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준, 단백질 안정성, 단백질 번역 속도, 유비퀴틴화 부위, 단백질 분해 속도, 리보좀 프로파일링으로부터의 번역 효율, 단백질 절단가능성, 단백질 국소화, TAP 수송을 용이하게 하는 숙주 단백질의 모티프, 자가포식되는 숙주 단백질, 리보좀 지체에 유리한 모티프, 및 NMD에 유리한 단백질 특징으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변수를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 리보좀 지체에 유리한 모티프는 폴리프롤린 또는 폴리라이신 스트레치를 포함한다. 일부 실시양태들에서, NMD에 유리한 단백질 특징은 긴 3' UTR, 마지막 엑손:엑손 연접부로부터 업스트림 쪽으로 50개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어져 있는 정지 코돈, 및 펩타이드 절단가능성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원은 HLA 대립유전자에 대해 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 수득된 펩타이드 서열 데이터베이스에 의해 훈련된 기계로 펩타이드의 서열을 분석하는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자 특이적 결합 펩타이드를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 이때 상기 공급원 단백질 발현은 기계에 의해 사용된 예측 변수이다. 일부 실시양태들에서, 발현 수준은 공급원 단백질의 양 또는 상기 공급원 단백질을 코딩하는 RNA의 양을 측정함으로써 측정된다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 각각 코딩하는 2개 이상의 서열들을 포함하는 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 상이한 재조합 HLA 클래스 I α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다.
본원은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열을 각각 포함하는 2개 이상의 서열들을 포함하는 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열이 재조합 HLA 클래스 II α쇄 대립유전자를 코딩하는 서열, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열, 및 임의로 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함하고, (a)의 서열, (b)의 서열 및 임의로 (c)의 서열이 작동적으로 연결된 조성물을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 재조합 다중핵산은 단리된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 분자를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 동일한 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 상이한 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 2개 이상의 친화성 수용체 펩타이드들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 3개 이상의 서열들을 포함하고, 이때 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 3개 이상의 서열들 중 적어도 2개의 서열들은 동일한 친화성 수용체 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 2개 이상의 친화성 수용체 펩타이드들은 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 2개 이상의 서열들 각각에 고유하다.
일부 실시양태들에서, 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 친화성 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 재조합 다중핵산들 중 2개 이상의 재조합 다중핵산들의 경우, 친화성 수용체 태깅된 HLA를 코딩하는 서열은 세포의 게놈 내로 안정하게 삽입된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제2 친화성 수용체 펩타이드는 HA 태그를 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열 또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 재조합 HLA 및 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
본원은 본원에 기재된 조성물의 다중핵산에 의해 코딩된 2개 이상의 단리된 폴리펩타이드 분자들을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 다중핵산에 의해 코딩된 2개 이상의 폴리펩타이드 분자들을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 조성물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여되도록 조작된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 조성물은 환자의 HLA 유형에 특이적인 펩타이드 또는 이 펩타이드를 코딩하는 다중핵산을 사용함으로써 제제화된다. 본원은 본원에 기재된 조성물의 2개 이상의 다중핵산들로 2개 이상의 세포들을 형질도입하거나 형질감염시키는 단계를 포함하는 세포의 제조 방법을 제공한다.
본원은 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 펩타이드를 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포함하는 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 항-종양 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 세포는 HLA-펩타이드 복합체로서 펩타이드를 제시한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 면역 반응은 T 세포 면역 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 CD8 T 세포 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 CD4 T 세포 반응이다. 일부 실시양태들에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응이다.
본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하는 유효량의 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태들에서, 질환은 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염성 물질은 병원체, 임의로 바이러스 또는 세균, 또는 기생충이다.
일부 실시양태들에서, 바이러스는 BK 바이러스(BKV), 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 림프구친화성 바이러스(HTLV-1), 인플루엔자 바이러스, RSV, HPV, 광견병, 볼거리 풍진 바이러스, 폴리오바이러스, 황열, A형 간염, B형 간염, 로타바이러스, 수두 바이러스, 인간 유두종바이러스(HPV), 천연두, 대상포진 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 세균은 클렙시엘라 종, 트로페리마 휘플레이, 마이코박테리움 레프라, 마이코박테리움 레프로마토시스 및 마이코박테리움 튜버큘로시스, 장티푸스, 폐렴구균, 수막염구균, 해모필루스 B, 탄저병, 파상풍 톡소이드, 수막염구균 군 B, bcg, 콜레라 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 기생충은 연충 또는 원생동물이다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 레이쉬마니아 종, 플라스모듐 종, 트리파노소마 크루지, 아스카리스 룸브리코이데스, 트리쿠리스 트리키우라, 넥카터 아메리카누스, 스키스토소마 종 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다..
본원은 재조합 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 재조합 HLA에 작동적으로 연결된 친화성 수용체 펩타이드를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계; 및 친화성 수용체 태깅된 HLA를 포함하는 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계를 포함하는, 면역원성 펩타이드를 농축하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 면역원성 펩타이드의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 LC-MS/MS를 이용하는 단계를 포함한다.
본원은 본원에 기재된 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 유효량의 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 유효량의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 본원에 기재된 펩타이드의 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 유효량의 다중핵산을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본원은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터 유래한 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 코딩하는 다중핵산을 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하여 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현시켜서, 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하고 특징화하는 단계; 및 임의로, 특징화를 기반으로 치료제를 개발하는 단계를 포함하는, 질환 또는 질병을 가진 대상체를 위한 치료제를 개발하는 방법을 제공한다.
본원은 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원을 확인하고 상기 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원을 포함하는 대상체 특이적 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 대상체가 질환을 갖고 상기 적어도 하나의 대상체 특이적 면역원성 항원이 대상체 및 대상체의 질환에 특이적이고, 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터 유래한 세포의 집단을 제공하는 단계; 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 코딩하는 다중핵산을 상기 대상체로부터의 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하여 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 발현시켜서, 상기 하나 이상의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 상기 하나 이상의 세포로부터 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 상기 대상체 및 상기 대상체의 질환에 특이적인 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 면역원성 펩타이드를 확인하는 단계; 및 확인된 하나 이상의 대상체 특이적 면역원성 펩타이드를 기반으로 대상체 특이적 면역원성 조성물을 제제화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 치료제 또는 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드, 또는 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 치료제 또는 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 대상체 특이적 면역원성 조성물은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 수용체를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 또 다른 치료제, 임의로 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 보강제, 임의로 폴리-ICLC를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환이다. 일부 실시양태들에서, 질환 또는 장애는 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염은 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 감염성 물질은 병원체, 바이러스, 세균 또는 기생충이다.
일부 실시양태들에서, 바이러스는 BK 바이러스(BKV), 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T 세포 림프구친화성 바이러스(HTLV-1), 인플루엔자 바이러스, RSV, HPV, 광견병, 볼거리 풍진 바이러스, 폴리오바이러스, 황열, A형 간염, B형 간염, 로타바이러스, 수두 바이러스, 인간 유두종바이러스(HPV), 천연두, 대상포진 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 세균은 클렙시엘라 종, 트로페리마 휘플레이, 마이코박테리움 레프라, 마이코박테리움 레프로마토시스 및 마이코박테리움 튜버큘로시스, 장티푸스, 폐렴구균, 수막염구균, 해모필루스 B, 탄저병, 파상풍 톡소이드, 수막염구균 군 B, bcg, 콜레라 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 기생충은 연충 또는 원생동물이다. 일부 실시양태들에서, 기생충은 레이쉬마니아 종, 플라스모듐 종, 트리파노소마 크루지, 아스카리스 룸브리코이데스, 트리쿠리스 트리키우라, 넥카터 아메리카누스, 스키스토소마 종 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원은 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 세포의 집단의 하나 이상의 세포가 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열을 포함하는 다중핵산을 포함하고, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA들을 코딩하는 서열이 제1 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 재조합 서열, 및 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 재조합 서열을 포함하는 것인 단계; 상기 세포의 집단의 하나 이상의 세포들 중 적어도 하나의 세포에서 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 HLA들을 발현시켜서, 상기 적어도 하나의 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 형성하는 단계; 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 농축하는 단계; 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계; 및 확인된 하나 이상의 펩타이드를 기반으로 면역원성 조성물을 제제화하는 단계를 포함하는, 질환 또는 질병을 가진 대상체를 위한 치료제를 개발하는 방법으로서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자가 대상체의 HLA 일배체형에 매칭되는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자와 상이하다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 동일하다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 클래스 I HLA 대립유전자들 및/또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 배출되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 발현될 때 세포막에 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체는 가용성 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체가 아니다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 외생성 펩타이드를 세포의 집단에 혼입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을 하나 이상의 외생성 펩타이드와 접촉시키거나 세포의 집단에서 하나 이상의 외생성 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 도입하는 단계는 세포의 집단을, 하나 이상의 외생성 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 RNA이고, 임의로 RNA는 mRNA이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 사량체 시약의 사용을 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 결정하는 단계는 생화학적 분석, 질량 분광측정 분석, MS 분석, MS/MS 분석, LC-MS/MS 분석, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분의 결합 친화성 또는 안정성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계로부터의 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에 결합된 펩타이드 또는 이의 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체에서 펩타이드와 HLA 분자의 회합을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 세포의 집단에서 펩타이드의 라이브러리를 발현시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 펩타이드의 라이브러리 또는 펩타이드를 코딩하는 서열의 라이브러리를 세포의 집단과 접촉시켜서, 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체의 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 라이브러리는 질환 또는 질병과 관련된 펩타이드의 라이브러리를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 질환 또는 질병은 암 또는 감염성 물질에 의한 감염이다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질 또는 이의 부분을 세포의 집단의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체로부터의 하나 이상의 펩타이드를 특징화하는 단계를 포함하고, 임의로 이때 상기 펩타이드는 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질의 하나 이상의 표적 단백질로부터의 펩타이드의 하나 이상의 영역을 특징화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 감염성 물질로부터 유래한 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 질환 또는 질병을 가진 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 일차 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드는 항원 제시 세포에 의해 제시될 때 대상체로부터의 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 병든 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체를 병들지 않은 세포로부터의 HLA-펩타이드 복합체와 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 확인하는 단계 전에 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 낮은 세포 표면 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 발현 세포의 집단이다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 세포의 집단에 의해 정상적으로 발현되는 내생성 HLA 대립유전자를 발현한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 내생성 HLA 클래스 I 대립유전자 및 내생성 HLA 클래스 II 대립유전자가 결여된 세포의 조작된 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자의 넛-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 모든 HLA 클래스 I 대립유전자들의 넉-아웃 및 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들의 넉-아웃이다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열은 클래스 I HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 클래스 I HLA 대립유전자이고, 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 클래스 I HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, 적어도 2개의 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자들을 코딩하는 서열은 클래스 II HLA를 코딩한다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 클래스 II HLA는 HLA 클래스 II α쇄, HLA 클래스 II β쇄, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 클래스 II HLA 대립유전자이고, 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 클래스 II HLA 대립유전자이다.
일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 각각 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자에 포함된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 코딩된 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 코딩된 친화성 수용체 펩타이드는 세포 외로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 코딩된 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 세포 내로 발현된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 링커에 의해 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 발현하는 온전한 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축하는 단계 전에 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자를 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는 태그 서열을 포함하고; 임의로, 이때 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 바이오틴, 또는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자에 특이적으로 결합하는 친화성 분자를 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 친화성 분자는 고체 표면에 부착된다. 일부 실시양태들에서, 고체 표면은 비드이다.
일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자로 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 친화성 수용체 펩타이드 결합 분자는 코딩된 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA의 아미노산 서열과 특이적으로 상호작용하지 않는다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 세포외 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 농축하는 단계는 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 N-말단 부분에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을 다중핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 접촉시키는 단계는 형질감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제공하는 단계는 세포의 집단을 다중핵산을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태들에서, 다중핵산은 세포의 집단의 게놈 내로 안정하게 삽입된다.
일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 I α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제1 HLA 클래스 I α쇄이고, 제2 재조합 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 제2 HLA 클래스 I α쇄이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 링커에 의해 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, β2 마이크로글로불린을 코딩하는 서열은 제3 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 상이하다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II α쇄 및/또는 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 제1 HLA 클래스 II α쇄 및 제2 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 클래스 II α쇄 및 제2 HLA 클래스 II α쇄 HLA를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제1 클래스 I 또는 클래스 II HLA 및/또는 제2 클래스 I 또는 클래스 II HLA를 코딩하는 서열은 제1 HLA 클래스 II β쇄 및 제2 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 하나 이상의 세포에서 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 클래스 II β쇄 및 제2 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 서열은 링커에 의해 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, HLA 클래스 II β쇄 또는 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 서열은 제3 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드 및/또는 제2 친화성 수용체 펩타이드와 상이하다.
일부 실시양태들에서, 제3 친화성 수용체 펩타이드는 제1 친화성 수용체 펩타이드와 상이하고, 바이오틴 수용체 펩타이드(BAP), 폴리-히스티딘 태그, 폴리-히스티딘-글리신 태그, 폴리-아르기닌 태그, 폴리-아스파르테이트 태그, 폴리-시스테인 태그, 폴리-페닐알라닌, c-myc 태그, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그, FLAG 태그, KT3 에피토프 태그, 튜불린 에피토프 태그, T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그, 스트렙타비딘 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SPB) 태그, Strep-태그, Strep-태그 II, 알부민 결합 단백질(ABP) 태그, 알칼리성 포스파타제(AP) 태그, 블루통그 바이러스 태그(B-태그), 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP) 태그, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 태그, 콜린 결합 도메인(CBD) 태그, 키틴 결합 도메인(CBD) 태그, 셀룰로스 결합 도메인(CBP) 태그, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 태그, 갈락토스 결합 단백질(GBP) 태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), Glu-Glu(EE) 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP) 태그, NE-태그, HSV 태그, 케토스테로이드 이소머라제(KSI) 태그, KT3 태그, LacZ 태그, 루시퍼라제 태그, NusA 태그, PDZ 도메인 태그, AviTag, 칼모듈린-태그, E-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, Profinity eXact 태그, 단백질 C 태그, S1-태그, S-태그, 바이오틴-카복시 담체 단백질(BCCP) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 태그, 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, HaloTag, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, CYD 태그, HPC 태그, TrpE 태그, 유비퀴틴 태그, VSV-G 에피토프 태그, V5 태그, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 임의로, 이때 제1 또는 제2 친화성 수용체 펩타이드는 태그 서열의 2개 이상의 반복부들을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 링커는 절단가능한 링커를 코딩하는 다중핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 절단가능한 링커는 리보좀 스킵핑 부위 또는 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 요소이다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위 또는 IRES는 세포에서 발현될 때 절단된다. 일부 실시양태들에서, 리보좀 스킵핑 부위는 F2A, T2A, P2A 및 E2A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, IRES 요소는 통상의 세포 또는 바이러스 IRES 서열들로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 본 방법은 생화학적 분석 또는 질량 분광측정, 예컨대, 탠덤 질량 분광측정을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 농축된 친화성 수용체 태깅된 HLA-펩타이드 복합체로부터 단리된 하나 이상의 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에 상응하는 펩타이드 서열을 펩타이드 데이터베이스로부터 수득하는 단계를 포함하고; 이때 수득된 하나 이상의 서열은 하나 이상의 펩타이드의 서열을 확인시켜준다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat 및 THP1로부터 선택된 세포주이다. 일부 실시양태들에서, 세포주는 하나 이상의 사이토카인, 체크포인트 억제제, 후성적 활성 약물, IFN-γ, 또는 이들의 조합으로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 적어도 105개의 세포들, 적어도 106개의 세포들 또는 적어도 107개의 세포들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 수지상 세포, 대식세포, 암 세포 또는 B 세포의 집단이다. 일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 종양 세포를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 세포의 집단은 하나 이상의 세포로부터 제1 HLA-펩타이드 복합체 및/또는 제2 HLA-펩타이드 복합체를 단리하기 전에 물질과 접촉된다. 일부 실시양태들에서, 상기 물질은 염증 사이토카인, 화학 물질, 보강제, 치료제 또는 방사선이다.
일부 실시양태들에서, 제1 HLA 대립유전자 및/또는 제2 HLA 대립유전자는 돌연변이된 HLA 대립유전자이다. 일부 실시양태들에서, 제1 HLA 대립유전자 및/또는 제2 HLA 대립유전자를 코딩하는 서열은 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 방법은 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자의 발현에 대해 어세이하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태들에서, 어세이하는 단계는 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 시퀀싱하는 단계, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자를 코딩하는 RNA를 검출하는 단계, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질 및/또는 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 단백질을 검출하는 단계, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자 및 제2 친화성 수용체 태깅된 클래스 I 또는 클래스 II HLA 대립유전자는 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 제1 서열 및 제2 서열은 고유 바코드 서열을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> NEON THERAPEUTICS, INC. <120> HLA-BASED METHODS AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> 50401-704.601 <140> PCT/US2018/017849 <141> 2018-02-12 <150> 62/461,162 <151> 2017-02-20 <150> 62/457,978 <151> 2017-02-12 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> /note="This sequence may encompass 4-15 residues" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 2 His His His His His His His His His His His His His His His 1 5 10 15 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Thosea asigna virus <400> 3 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine teschovirus <400> 4 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Equine rhinitis A virus <400> 5 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 6 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 7 His His His His His His 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Leu Trp Pro Glu Ala Phe Leu Tyr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Tyr Val Pro Glu His Trp Glu Tyr Tyr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Lys Leu Asp Leu Leu Glu Gln Glu Tyr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Thr Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Thr Glu Phe Pro Asn Phe Lys Tyr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Thr Asp Gly Lys Val Leu Leu Trp 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Gly Leu Leu Arg Val Leu Thr Val 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Ala Pro Leu Asn Ile Arg Ser Ile 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asp Gly Leu Arg Asp Leu Pro Ser Ile 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Gly Tyr Val Val Lys Glu Thr Ile 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Gly Arg Leu Val Ile Asn Arg Val 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Ala Tyr Pro Gln Arg Ile Lys Phe 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ile Ile Tyr Pro Thr Pro Lys Val Val 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Val Pro Pro Leu Val Pro Lys Val Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Pro Glu Ser Lys Ile Arg Phe Val 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Ala Leu Leu Val Gly Glu Lys Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Tyr Ile Ile Glu Arg Glu Pro Leu Ile 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Phe Tyr Pro Glu Leu Lys Leu Ala Tyr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 His Phe Leu Asp Arg His Leu Val Phe 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Tyr Leu Pro Ala Leu Lys Val Glu Tyr 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Leu Pro Leu Asp Ile Gln Ile Phe Tyr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Leu Ser Asp Leu Ala Leu His Phe 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Leu Asp Asp Lys Leu Leu His Tyr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Leu Pro Asp Leu Val Ala Lys Tyr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Tyr Pro Val Tyr Gln Pro Val Gly Pro 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Tyr Gly Phe Val Asn Tyr Val Thr Ala 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Phe Val Glu Ile Leu Ile Pro Val Ala 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Phe Pro Lys Glu Thr Phe Glu Gly Pro 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ser Ala Pro Val Asn Phe Ile Ser Ala 1 5

Claims (76)

  1. (a) 인간 세포에서 친화성 수용체 태깅된 HLA 단백질을 발현시켜 인간 세포에 의해 발현된 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체를 형성하는 단계로서, 친화성 수용체 태깅된 HLA 단백질은 인간 대상체에 의해 발현된 HLA 클래스 II 대립유전자에 의해 코딩된 서열을 포함하는 HLA 클래스 II 단백질이고, 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질이 (i) 인간 대상체에 의해 발현된 HLA 클래스 II 대립유전자를 코딩하는 서열, 여기에 연결된 (ii) 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 다중핵산에 의해 코딩되며, 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체는 발현될 때 세포막에 혼입(incorporation)되는 단계;
    (b) 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체의 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자 특이적 펩타이드 또는 복합체를 확인하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 확인된 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자 특이적 펩타이드의 서열을 사용하여 제형을 제조하는 것을 포함하는 치료제를 개발하는 단계로서,
    치료제는
    (i) 서열을 포함하는 상기 (b) 단계에서 확인된 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자 특이적 펩타이드, (ii) 서열을 포함하는 하나 이상의 HLA 클래스 II 대립유전자 특이적 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, (iii) 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항원 제시 세포(APC), (iv) 하나 이상의 펩타이드와 복합체를 형성한 HLA 클래스 II 대립유전자에 특이적인 T 세포 수용체(TCR) 또는 (v) 하나 이상의 펩타이드와 복합체를 형성한 HLA 클래스 II 대립유전자에 특이적인 TCR 또는 키메라 T 세포 수용체(CAR)를 포함하는 세포를 포함하는 단계;
    를 포함하는 HLA 클래스 II 대립유전자 특이적 펩타이드 또는 복합체를 확인하고 치료제를 개발하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질은 HLA 클래스 II α쇄 및 HLA 클래스 II β쇄를 포함하는 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 재조합 다중핵산은 (i) 제1 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된 HLA 클래스 II α쇄를 코딩하는 제1 서열, 및 (ii) 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된 HLA 클래스 II β쇄를 코딩하는 제2 서열을 포함하고, 제1 친화성 수용체 펩타이드와 제2 친화성 수용체 펩타이드는 상이한 방법.
  4. 제1항에 있어서, 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열은 HLA 클래스 II 대립유전자를 코딩하는 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된 방법.
  5. 제1항에 있어서, 세포는 내생성 HLA를 발현하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 용해된 세포로부터 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II-펩타이드 복합체를 단리 또는 농축(enriching)하는 단계, 또는 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체를 발현하는 세포를 단리 또는 농축하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체를 농축하는 단계는 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체를 면역침전시키는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체를 발현하는 세포를 농축하는 단계는, 친화성 수용체 펩타이드 특이적 결합 분자를, 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질-펩타이드 복합체를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 친화성 수용체 펩타이드는 BAP(바이오틴 수용체 단백질)인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 친화성 수용체 펩타이드 특이적 결합 분자는 바이오틴, 또는 친화성 수용체 펩타이드에 특이적인 항체인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 농축하는 단계는 친화성 수용체 펩타이드 특이적 결합 분자에 특이적인 친화성 분자를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 친화성 분자는 스트렙타비딘, NeutrAvidin 또는 이들의 유도체인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 인간 세포는 항원 제시 세포(APC)인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 인간 세포는 일차 세포 또는 세포주인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 기계를 확인된 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 또는 복합체의 하나 이상의 서열을 포함하는 HLA 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스로 훈련(training)시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 기계를 훈련시키는 데 사용된 변수는, 펩타이드 서열, 아미노산 물성, 펩타이드 물성, 세포 내에서의 펩타이드의 공급원 단백질의 발현 수준, 단백질 안정성, 단백질 번역 속도, 유비퀴틴화 부위, 단백질 분해 속도, 리보좀 프로파일링으로부터의 번역 효율, 단백질 절단가능성, 단백질 국소화, TAP 수송을 용이하게 하는 숙주 단백질의 모티프, 자가포식되는 숙주 단백질, 리보좀 지체(stalling)에 유리한 모티프, 및 넌센스(non-sense) 매개 분해(NMD)에 유리한 단백질 특징으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변수를 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 재조합 다중핵산은 제1 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질을 코딩하는 제1 서열, 및 제2 친화성 수용체 태깅된 HLA 클래스 II 단백질을 코딩하는 제2 서열을 포함하고,
    제1 서열은 제1 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된 제1 HLA 클래스 II 단백질을 코딩하는 제1 HLA 클래스 II 대립유전자의 서열을 포함하고;
    제2 서열은 제2 친화성 수용체 펩타이드를 코딩하는 서열에 연결된 제2 HLA 클래스 II 단백질을 코딩하는 제2 HLA 클래스 II 대립유전자의 서열을 포함하며;
    제1 HLA 클래스 II 대립유전자와 제2 HLA 클래스 II 대립유전자는 상이한 HLA 클래스 II 대립유전자인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 확인된 HLA 클래스 II 대립유전자 특이적 펩타이드 또는 복합체의 다양한 서열을 포함하는 HLA 클래스 II 대립유전자 특이적 펩타이드 데이터베이스를 생성하는 것을 더 포함하는 방법.
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