KR102558956B1 - 양친매성 펩타이드 및 이를 포함하는 항균용 또는 항염증용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생산 단가를 줄이고 약학적 물성을 향상시키며 약제학적 수식을 용이하게 하는 장점을 가지기 위하여 단순한 조성 및 10 잔기만으로 구성된 짧은 길이의 항균 또는 항염증 펩타이드를 제조하였다. 상기 펩타이드는 모두 천연 AMP들이나 기존에 보고된 다른 펩타이드인 omiganan에 비해 항균 및 항염증성이 강력하고, 단순한 조성을 가지기 때문에, 항균이나 항염증 관련 약학, 식품, 화장료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

양친매성 펩타이드 및 이를 포함하는 항균용 또는 항염증용 조성물{Amphiphilic peptide and antimicrobial or anti-inflammatory composition comprising the same}

본 발명은 신규 펩타이드 및 이의 항균, 항염증 용도에 관한 것이다.

모든 생명체로부터 유래한 막-용해성(lytic), 항생 펩타이드(이하, "AMP"라 함)들은 강력한 치료제 개발을 위한 후보물질로 주목받고 있다(Zaiou M., J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003;Zasloff M. Nature 415:389,2002; Hancock REW, et al., Proc. Nat. Acad. Soc. USA 97:8856, 2000; Yeaman MR, et al., Pharmacol. Rev. 55:27, 2003).

새로운 약물 소재 개발의 목적으로 AMP들의 구조-활성 관계에 대한 광범위한 연구들로부터 많은 유도체들이 생성되었다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Zasloff M. Nature 415:389, 2002; Won HS, et al., J. Biol. Chem. 279:14784, 2004).

박테리아의 감염은 LPS 방출로 인해 염증성 사이토카인이 생성이 과도하게 유도되고, 폐혈증 및 폐혈성 쇼크 등 여러 기관의 손상으로 이어진다(Rietschel ET, et al., Springer, 39:81, 1996; Dinarello CA, Chest, 321:329, 1997).

박테리아에 의한 염증을 치료하기 위해 항균 및 항염증 효과와 같은 이중 기능을 갖는 항균제를 발견할 가치가 있다(Rosenfeld Y, et al., J. Biol. Chem., 1636:1643, 2006; Pulido D, et al., J. innate immunity, 327:336, 2012)

AMP는 박테리아 LPS에 결합하여 막 투과를 통해 항균 작용을 발휘할 수 있는 구조적 측면에서 항균에 국한되어 있지 않고 면역 조절 특성을 가진다(Lee E, et al., Biomembranes, 271:283, 2013; Wei L, et al., J Med Chem, 3546:3556, 2103).

AMP의 면역 조절 특성은 새로운 항염증제 개발을 목표로 하는 연구에서도 많은 관심을 가지고 있다(Hilchie AL, et al., Nat. Chem. 761:768, 2013).

그렇기 때문에, 이들을 이용하여 임상적 치료제를 개발하기 위한 산업적인 시도들도 널리 이루어지고 있다(Zaiou M.J. Mol.Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Zasloff M. Nature 415:389, 2002; Jenssen H, et al., Clin. Microbiol. Rev. 19:491,2006).

특히, 본 발명에서 대조군으로 사용된 펩타이드인 omiganan(MBI-226)은 항생 펩타이드 최초로 새로운 항생제 의약품으로 개발 완료 시점에 근접한 물질로서, 현재 임상 3상 시험이 진행 중이다(Gordon J, et al., Curr. Eye Res. 30:505, 2005).

그러나 이들의 상당하게 큰 분자 크기와 높은 제조원가 및 일부 물질에 나타난 그리 좋지 않은 약제학적 및 약동학적 특성 등은 그들의 산업적 및 임상적인 적용에 있어서의 장애가 되고 있다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Won HS, et al., J. Biol. Chem. 279:14784, 2004).

따라서 약학적 최적화 및 제조원가를 낮추는 측면에서 더욱 바람직한 선도물질이 되기 위하여, 될 수 있는 한 단순한 아미노산 조성을 가지는 더 짧은 활성 펩타이드들을 발명하는 것이 필요할 것이다. 이러한 측면에서, 항생 활성을 가지는 모델 양친매성 나선 펩타이드를 고안하기 위한 최소 드 노보(De novo) 시도들은 주목할 가치가 있다.

양이온성 양친매성 α-나선 펩타이드들은 특히 풍부하고 광범위하며 자연계에 존재하는 AMP들 중에서 가장 잘 규명된 군이다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Jenssen H,et al., Hancock REW. Clin. Microbiol. Rev. 19:491, 2006).

따라서, 강력한 α-나선 형성력을 가지는 류신과 라이신과 같은 아미노산들의 단순한 조성을 가지는 새로운 양친매성 나선 모델 AMP들을 제조하기 위하여 많은 연구가 노력하고 있다(Chou PY, et al., Biochemistry 13:211, 1974).

이에 본 발명자들은 저분자량 펩타이드 항생물질을 개발하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 특허 공개공보 제10-2018-0000531호

본 발명의 목적은 항균 및 항염증 활성을 갖는, 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 항균 및 항염증 활성을 갖는, 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 펩타이드는 양친매성 나선(amphipathic helix) 구조를 가질 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 시겔라 디센테리(Shigella dysenteriae)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 세균에 대해 항균활성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 산화질소(Nitric oxide, NO) 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 염증질환은 건선, 알레르기 비염, 아토피피부염, 접촉성피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 맥관부종, 안검염, 알러지성 결막염, 퇴행성 또는 염증성 안구염, 관절염, 류마티스관절염, 척추염, 전신성 경화증, 피부근염, 다발성근염 및 염증성 근병증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 생산 단가를 줄이고 약학적 물성을 향상시키며 약제학적 수식을 용이하게 하는 장점을 가지기 위하여 단순한 조성 및 10 잔기만으로 구성된 짧은 길이의 항균 또는 항염증 펩타이드를 제조하였다. 상기 펩타이드는 모두 천연 AMP들이나 기존에 보고된 다른 펩타이드인 omiganan에 비해 항균 및 항염증성이 강력하고, 단순한 조성을 가지기 때문에, 항균이나 항염증 관련 약학, 식품, 화장료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 L₄K₄W₂ 모델 펩타이드에 대한 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 각 펩타이드의 서열은 왼쪽에 일련의 이름으로 표시하였다. 트립토판(W) 잔기들은 굵은 글씨, 기울임꼴로 나타내었다.
도 2는 L₄K₄W₂ 모델 펩타이드에 대한 나선형 휠 다이어그램(helical wheel diagrams)으로, 각 다이어그램의 중앙에 해당하는 펩타이드의 모델 번호와 이름(화학식)을 나타내었다. 트립토판(W) 잔기들은 굵은 글씨, 기울임꼴로 나타내었다.
도 3a 및 b는 원편광 이색법(circular dichroism, CD) 스펙트럼을 이용하여 2차 구조를 나타낸 것이다. 도 3a에서는 phosphate buffer에서의 2차 구조 형성을 도시하고, 도 3b에서는 trifluoroethanol에서의 2차 구조 형성을 나타내었다.
도 4는 Hemolysis를 이용하여 사람 적혈구 세포에서의 용혈독성활성을 도시한 것이다.
도 5a 및 b는 염증 반응 매개 물질인 LPS로 인한 염증 반응에 관하여 L₄K₄W₂ 모델 펩타이드에 대한 항염증 효과와 세포 독성을 나타낸 것이다. 도 5a에서는 염증 유발 물질인 LPS가 처리된 세포에서 염증 매개인자 NO의 발생을 억제하는 활성을 도시하고, 도 5b에서는 도 5a에서의 세포 생존력을 나타내었다.

본 발명자들은 천연 AMP를 이용하지 않더라도 임계 양친매성 경계면에 트립토판을 가지도록 새롭게 설계된 양친매성 나선 펩타이드가 짧은 길이로도 항균 활성을 가질 것임을 예측하고, 이러한 발상을 증명하기 위하여 3종의 아미노산의 단순 조성을 가지는 10 종의 L₄K₄W₂ 펩타이드들(두 개의 트립토판을 가지는 LK 펩타이드들)을 고안하고 그들의 항균 활성 및 항염증 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 항균 및 항염증 활성을 갖는, 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열은 아래와 같다.

본 발명에서 상기 펩타이드는 양친매성 나선(amphipathic helix) 구조를 가질 수 있다.

구체적으로, 상기 펩타이드는 α-나선 구조로 형성될 때, 나선 축의 한쪽으로 소수성 류신 잔기가 다른 한쪽으로는 양이온성 라이신 잔기가 모여서 완전하게 양친매성이 된다. 또한, 2개의 트립토판 잔기는 나선 휠 사영에서 친수성(lysyl) 말단부와 소수성(leucyl) 시작부 사이의 임계 양친매성 경계면에 위치한다.

다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항균용 조성물은 의약외품 조성물 일 수 있다. 즉, 본 발명은 병원성 미생물 또는 내성균에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약외품 조성물은 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항균용 조성물은 식품 첨가물, 또는 사료 첨가물 일 수 있다. 즉, 본 발명은 병원성 미생물 또는 내성균에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 첨거물 조성물 또는 사료 첨가물 조성물을 제공한다. 본 발명의 식품 첨가물 또는 사료 첨가물은 다른 의약외품 또는 약물과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 식품 또는 사료에 첨가할 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 약학적 조성물 일 수 있다. 즉, 본 발명은 병원성 미생물 또는 내성균에 의한 감염 질환의 예방 또는 치료을 목적으로 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 다른 의약외품 또는 약물과 함께 사용할 수 있으며, 약학적 조성물에 대한 더 상세한 내용은 후술한다.

상기 조성물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 시겔라 디센테리(Shigella dysenteriae)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 세균에 대해 항균활성을 가질 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 4 종의 그램 양성균(Bacillus subtilis KCTC 3135, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus TK784) 및 3 종의 그램 음성균(Escherichia coli KCTC 2441, Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysenteriae ATCC 9752)을 이용하여 본 발명 펩타이드의 항균 활성을 실험한 결과 본 발명은 공지된 Omiganan 보다 더 우수한 항균 활성을 가짐을 확인하였다(실시예 4 참조).

다른 양태로서 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 LPS를 세포에 처리하기 전에 다양한 농도의 본 발명 펩타이드를 처리한 결과 LPS 단독 처리군에 비해 모두 NO의 생성량을 감소시킴을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명에서 예방이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 안과용 점안액, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 점안제, 주사제 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 점막, 정맥 내, 피하에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.

본 발명에서 상기 조성물은, 산화질소(Nitric oxide, NO) 생성을 억제할 수 있다.

본 발명에서 상기 염증질환은 건선, 알레르기 비염, 아토피피부염, 접촉성피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 맥관부종, 안검염, 알러지성 결막염, 퇴행성 또는 염증성 안구염, 관절염, 류마티스관절염, 척추염, 전신성 경화증, 피부근염, 다발성근염 및 염증성 근병증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 양태로서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물에 대한 설명은 상충되지 않는 한 상기 식품 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강기능성 식품을 포함하는 개념이다.

본 발명에서 사용되는 용어, “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 식품 조성물에서 본 발명의 펩타이드를 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 펩타이드의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

다른 양태로서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 화장료 조성물은 상기 펩타이드 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 펩타이드 이외에, 상기 펩타이드와 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에틸헥실부타미도트리아존, 디에틸아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메틸렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메틸벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에틸디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에틸헥실디메틸파바, 에틸헥실메톡시신나메이트, 에틸헥실살리실레이트, 에틸헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에틸벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조산(파바)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 펩타이드 준비

1-1 : 펩타이드 디자인 및 구조

본 발명의 L₄K₄W₂ 모델 펩타이드의 아미노산 서열들을 도 1에 요약하였다. 도 1의 각각의 서열은 서열번호 1에서 10로 지정하였다: 모델 244.01(서열번호 1) ~ 모델 244.10(서열번호 10).

각 서열을 고안하기 위하여 본 발명자들은 도 2에서 나타난 나선 휠 도식을 이용하였다. 모든 펩타이드들은 α-나선 구조로 형성될 때, 나선 축의 한쪽으로 소수성 류신 잔기가 다른 한쪽으로는 양이온성 라이신 잔기가 모여서 완전하게 양친매성이 되도록 고안하였으며, 2개의 트립토판 잔기는 나선 휠 사영에서 친수성(lysyl) 말단부와 소수성(leucyl) 시작부 사이의 임계 양친매성 경계면에 위치시켰다(도 2 참조).

결국, 상기 모델 펩타이드의 L:K 비율은 1:1로 분포하였다. AMP(Bessalle, R., et al., J. Med. Chem. 36:1203, 1993; Dathe, M., et al., FEBS Lett. 403:208, 1997; Deslouches, B., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 49:316, 2005)의 드 노보 설계(de novo)에서 트립토판 잔기가 종종 나타나며, LKW 서열 역시 나타난다: K₆L₆W(KWKKLLKKLLKLL-NH₂), K₄L₇W(KLLLKWLLKLLK-NH₂) 및 이들의 유사체는 항생제로 평가되고 있다(Avrahami, D., Z. et al., Biochemistry 40:12591, 2001; . Shin, S. Y., et al., Biotechnol. Lett. 26:735, 2004; Oren, Z., J. et al., Eur. J. Biochem. 269:3869, 2002). 그러나 이들은 본 발명에서 제시하는 펩타이드들에 비해 길고, 트립토판 배치법이 다르며, 서열을 고안할 수 있는 아무런 규칙도 제시되지 않았다.

1-2 : 펩타이드 준비

상기 모델 펩타이드 및 Omiganan(서열번호 11 : ILRWPWWPWRRK-NH₂)은 화학적으로 합성된 건조 분말 형태로 구입했다(ANYZEN, 광주). 모든 펩타이드 중성 pH에서 추가 양전하를 부여하기 하고, C-terminal의 음전하를 제거하기 위하여 C-terminal amidation하여 화학적으로 합성하였다. 합성된 펩타이드의 순도 및 정확한 질량은 HPLC 및 질량분석기(mass spectrometry)를 이용하여 확인하였다.

또한, 본 발명의 펩타이드 분말을 각각의 용매에 녹인 후, 용액에서의 상기 펩타이드 농도는 분광광도계를 이용하여 280 ㎚에서의 흡광량으로부터 결정하였다. 모델 펩타이드들은 모두 2개의 트립토판 잔기를 가지고 있기 때문에 280 ㎚에서의 몰흡광계수(molar extinction coefficient)를 11,000 M^-1㎝^-1로 사용하였고, omiganan은 4개의 트립토판을 가지고 있기 때문에 22,000 M^-1㎝^-1의 몰흡광계수를 사용하여 농도를 계산하였다.

참조를 위한 상기 펩타이드 합성방법은 아래와 같다.

펩타이드들은 표준 Fomc 화학법을 사용한 고체상 방법에 의하여 펩타이드 합성기(Advanced Chemtach, Inc.에서 제조된 Model 90)상에서 자동으로 합성하였다. Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl)-보호된 아미노산들과 Rink 레진들은 Advanced Chemtech, Inc.로부터 구입하였고, HPLC 용매들은 Fisher Scientific으로부터 구입하였다. 다른 모든 화학물질은 여러 제조원으로부터 구입한 분석 또는 생명공학등급이었다. 펩타이드 아미드를 얻기 위하여, 4-(2',4'-dimethyoxyphenyl-Fmoc-amiso-methyl)페녹시 레진을 사용하였다. 사이드-체인 보호기들은 Fmoc-O-t-butyl-L-세린과 N-Fmoc-N-Boc-L-라이신을 포함하였다.

이중(double) 커플링 과정들은 diisopropylcarbodiimide/ 1-hydroxybenzotriazole 활성화로 수행되었다. 펩타이드 체인으로부터 Fmoc 기의 제거는 다이메틸포름아마이드 내의 25% 피페리딘으로 수행되었다. 레진과 보호기의 절단은 다이클로로메탄 내의 10% 불화초산으로 수행되었다. 결과 산물들의 정제 및 분석은 Merck-Hitachi사의 분석 역상 HPLC C-18컬럼에 의하여 수행되었다. 0.1% trifluoroacetic acid가 혼합된 아세토나이트릴/물을 이동상(eluent)으로 사용하고, 20-80% 아세토나이트릴 구배를 1 ml/min의 유속으로 적용하였다. 그 산물 펩타이드의 정제 및 정확도는 질량분광기로 확인하였다. 그 동일한 펩타이드들은 또한 그 활성 테스트의 재현성을 체크하기 위하여 펩타이드 제조회사인 ANYZEN (Kwangju, Korea; URL, http://www.anygen,com)으로부터 구입하였다.

실시예 2 : 2차 구조 분석

2-1 : 펩타이드 구조-활성 분석

상기 실시예 1-2의 펩타이드들의 2차 구조를 측정하기 위해 원편광 이색성 분광 측정(Circular dichroism spectroscopy, CD)법을 이용하였다. CD 측정은 10mM Phosphate 10mM NaCl buffer(10mM PBS), pH 6.5에 녹아있는 50μM 펩타이드와 50% TFE(Trifluoroethanol)을 함유하는 10mM PBS, pH 6.5, 50μM 펩타이드에 대하여 20℃에서 Jasco J-1500 분광편광계에서 수행하였고, 260~190 nm 범위에서 스캔속도 50 nm/분 및 0.2 nm 단계 해상도로 스캔하였다.

3번의 스캔을 하고, 용매의 CD 신호를 빼어 평균 내었다. 최종적으로 상기 CD 강도는 평균 잔기의 몰 타원률(molar ellipticity)로 변환하였다(Won, H. S., et al., Eur. J. Biochem. 269:4367, 2002).

2-2 : 펩타이드 구조-활성 분석 결과

상기 실시예 1-2의 펩타이드들이 실제로 나선 구조로 접힐 수 있는지 확인하였다. 일반적으로, 양친매성 나선 AMP는 세포막과 상호작용을 통해 나선 구조를 형성하는 것이 알려져 있다(Oren, Z., et al., Biopolymers 47:451, 1998; Shai, Y. Biochim. Biophys. Acta 1462:55, 1999; Zelezetsky, I., et al., Biochim. Biophys. Acta 1758:1436, 2006). 10mM PBS 수용액 상태(도 3a)에서의 펩타이드의 구조는 random coil의 형태로 아무런 구조를 취하지 않고 있는 것을 확인하였고, Hydrophobic한 환경인 50% TFE 용매(도 3b)에서의 펩타이드 구조는 나선형의 구조 성질을 확인하였다. 즉, 208 및 222 nm 쪽으로 신호가 이동하여 200 nm가 넘는 곳에서 넓은 범위의 음성 밴드 스펙트럼을 나타내었다.

222 nm에서의 상기 신호 증감은 나선성의 정도를 반영하는데, 이를 바탕으로 볼 때, 이것은 생체 내에서는 아무런 구조를 취하지 않고 존재하던 펩타이드가 박테리아의 세포막과 만나면 설계했던 대로 양친매성 나선 구조를 취한다는 것을 유추 할 수 있다.

실시예 3 : 용혈활성 분석

3-1 : 펩타이드 용혈 활성 분석

상기 실시예 1-2의 펩타이드들에 대한 독성 평가의 일환으로, 용혈 활성을 측정하기 위하여, 다양한 농도의 펩타이드들(0.5~64 μg/ml, 2-배씩 순차적으로 희석)이 있는 조건에서, 인간 적혈구 세포 현탁액(10% V/V)을 37℃ 조건에서, 30분간 배양했다. 상기 배양액을 원심분리한 다음, 상층액의 흡광도를 550 nm에서 측정하여 용혈 정도를 평가하였다. 펩타이드 대신 0.2% Triton X-100을 처리한 결과를 100% 용혈활성의 대조군으로 하여, 각 펩타이드의 용혈 능력을 %로 나타내었다.

상기 실험은 3개의 샘플로 수행되어졌으며, 3회의 독립적인 측정의 평균값을 기록하였다. 최소 용혈 농도(Minimal hemolytic concentration, MHC)는 오차범위에 해당하는 5% 이상의 용혈 활성을 나타내는 최소 농도 값으로 결정하였다.

3-2 : 펩타이드 용혈 활성 분석 결과

용혈 독성 측정한 결과(도 4) 본 발명의 모든 펩타이드에서 항생활성 농도인 MIC 농도에서는 10% 이상의 독성이 보이지 않았고, 용혈 독성 5% 이하인 농도를 MHC로 나타내었을 때(표 1) 모델 244.01, 244.08, 244.09를 제외한 모델에서는 대조군인 Omiganan의 MHC값보다 높은 용혈 독성을 나타내는 농도 값을 가졌다.

따라서, 새로운 항생제 개발에 있어 길고 조성이 복잡한 Omiganan보다 더 적은 용혈 활성을 보이며, 길이가 짧고 조성이 간단한 본 발명의 펩타이드가 더 훌륭한 후보 물질이 될 수 있을 것이다.

표 1은 L₄K₄W₂ 모델 펩타이드의 5% 이하의 용혈 활성 농도를 나타낸 것이다.

실시예 4 : 항균성 분석

4-1 : 펩타이드 항균 활성 분석

상기 실시예 1-2의 펩타이드들의 항균 활성을 4 종의 그램 양성균(Bacillus subtilis KCTC 3135, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus TK784) 및 3 종의 그램 음성균(Escherichia coli KCTC 2441, Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysenteriae ATCC 9752)으로 측정하였다.

상기 균주들을 이용하여, 본 발명의 모델 펩타이드에 대한 항생 감수성 평가는 액상(broth)배지에서의 미량희석법(microdilution method)으로 최소저해 농도(Minimum inhibitory concentration, MIC) 값들을 측정하여 수행하였다.

즉, 다양한 농도(2 ~ 64 μg/ml, 2배 연속 희석)로 각각의 펩타이드가 첨가된 세포 배양액(10⁶ ~ 10⁸ cells/ml, LB 액상 배지)으로부터, 세포 성장을 완전하게 저해하는 가장 낮은 펩타이드 농도를 그 MIC로 결정하였다. 독자적인 3회 실험을 통해 두 번 또는 세 번 모두 재현된 MIC 값들을 기록하였다.

4-2 : 펩타이드 항균 활성 분석 결과

항균 활성 측정 결과(표 2) 본 발명의 모든 펩타이드 및 대조 펩타이드(Omiganan)의 MIC 값을 정리한 것이다. Omiganan의 MIC값은 그램 양성 박테리아에서 4 ~ 5μg/ml, 그램 음성 박테리아에서는 64μg/ml 값을 가진 것에 비해 보다 서열 1 ~ 10까지 모든 모델에서 Omiganan보다 낮은 MIC 값을 가짐을 확인 할 수 있다. 그 중 강한 항균활성은 모델 244.01, 244.05, 244.09 에서 관찰되었고 상기 펩타이드(244.01, 244.05, 244.09)는 그램 양성 박테리아 ATCC 균주에서 2μg/ml 보다 낮았으며, 그램 음성 박테리아 ATCC 균주에서는 4μg/ml 값을 가졌다.

따라서, 새로운 항생제 개발에 있어 Omiganan보다 더 강력한 항균 활성을 보이는 펩타이드는 더 훌륭한 후보 물질이 될 수 있을 것이다.

상기 표 2는 L₄K₄W₂ 모델 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 것이다.

실시예 5: 항염증 분석

5-1: 펩타이드의 항염증 활성 및 세포 독성 분석

상기 실시예 1-2의 펩타이드들의 항염증 활성을 마우스 유래 대식 세포의 일종인 J774A.1으로 측정하였다.

상기 세포는 DMEM(10% FBS , 1% P/S)배지를 사용하여 계대배양 하였고, 3 X 10⁴ cell/well로 96-well plate에 seeding 한 다음, 16시간 동안 37℃, CO₂ 5%에서 배양 한 후 실험에 사용되었다. 실험은 염증 유발 요소인 LPS 처리하기 30분 전 다양한 농도의 펩타이드들(1 ~ 8 μM, 2배씩 순차적으로 희석) 전처리하여 염증 반응을 억제 하였고, NO 생성량을 확인하여 염증 반응 산물을 확인하였다.

그와 동시에 MTT 분석법으로 세포 생존율을 확인하였으나 세포 생존율이 아무것도 처리하지 않은 대조군 Non보다 더 높게 나타났기에, MTT 시약 처리시간을 반으로(1시간) 줄여 세포 생존율을 확인 하였다.

5-2 : 펩타이드 항염증 활성 및 세포 독성 분석결과

항염증 활성 측정 결과(도 5a) 본 발명 발명된 10개의 펩타이드들은 LPS 단독 처리 군에 비해 모두 NO의 생성량을 감소 시켰고, 대조군인 Omiganan에 비해 유의성 있는 값을 가졌다. 그 중 강력한 NO 억제 효과를 가진 것은 모델 244.01, 244.04, 244.05, 244.08, 244.09로, 특히 모델 244.08과 244.09 최저농도 2μM에서도 거의 100% NO 발생 억제능을 보여 특히 강력한 항염증 활성을 지님이 확인되었다. 강력한 항균 활성을 보인 모델 244.01과 244.09은 항염증 활성에서도 탁월한 것으로 보아 항균활성과 항염증 활성이 간접적으로 연관이 있을 것이라고 유추 할 수 있다.

세포 독성에 따른 세포 생존율(도 5b)에 대해서는 독성을 나타내는 것처럼 보이나 MTT 시약처리 시간을 줄여 독성을 나타내는 것처럼 보이는 것이다. 현미경을 통해 세포 모양을 확인 하였을 때, 세포 생장 속도에 영향을 줄 뿐 독성을 나타내는 모델은 없는 것으로 확인 되었다.

이것을 통해 10개 펩타이드들은 진핵세포인 마우스 유래 J774A.1에서 세포 독성을 나타내지 않지만 원핵세포인 박테리아에서는 세포 독성을 나타냈었다. 그와 동시에 염증 매개 산물인 NO의 생성량을 줄이는 것을 통해 원핵세포의 선택적 항균 활성과 더불어 항염증 활성을 가지는 치료제 개발의 소재로 활용될 수 있다.

실시예 6: 고찰

본 발명에서는 단순한 아미노산 조성을 가지고 길이가 짧은 항균과 항염증 활성을 가지는 펩타이드 이성질체를 개발하는 방법을 고안하였다. 즉, 본 발명에서 사용된 L₄K₄W₂ 모델 펩타이드들은 3종의 아미노산만을 이용하여 설계, 합성 되었고, 나선 휠 사영 상에서 친수성 말단부와 소수성 시작부 사이 임계 양친매성 경계면에 두개의 트립토판이 위치하였다. 이러한 Trp의 규칙에 따라 제조된, 10 잔기의 짧은 펩타이드들은 강하고 넓은 범위의 항균성과 항염증성을 보였다.

본 발명에서 대조군으로 사용된 펩타이드인 omiganan(MBI-226)은 항생 펩타이드 최초로 새로운 항생제 의약품으로 개발 완료 시점에 근접한 물질로서, 현재 임상 3상 시험이 진행 중이다(Gordon J, et al., Curr. Eye Res. 30:505-515, 2005).

본 발명의 LKW 모델 펩타이드들은 상용 발전 중인 omiganan 보다 짧으며, 더 단순한 아미노산 조성을 지니고 있다. 이 모델들은 강력한 항균성을 및 항염증성을 가지므로 omiganan 보다 더 훌륭한 치료 및 상용 발전용 후보물질이 될 수 있으며 가장 좋은 신약 후보물질로 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation EYESEL Co.,Ltd. <120> Amphiphilic peptide and antimicrobial or anti-inflammatory composition comprising the same <130> P201147P <150> KR 10-2019-0178377 <151> 2019-12-30 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.01 <400> 1 Trp Leu Lys Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.02 <400> 2 Lys Trp Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.03 <400> 3 Leu Lys Trp Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.04 <400> 4 Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Trp Leu Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.05 <400> 5 Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Trp Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.06 <400> 6 Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Leu Lys Trp 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.07 <400> 7 Leu Lys Lys Trp Leu Lys Trp Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.08 <400> 8 Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.09 <400> 9 Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 244.10 <400> 10 Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Omiganan <400> 11 Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys 1 5 10

Claims (9)

1. 항균 및 항염증 활성을 갖는, 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는, 펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 양친매성 나선(amphipathic helix) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 시겔라 디센테리(Shigella dysenteriae)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 세균에 대해 항균활성을 가지는 것인, 펩타이드.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성을 억제하여, 항염증 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제