KR102495473B1 - 앰피레귤린을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 앰피레귤린을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 앰피레귤린은 자가면역포도막염을 억제하는 항염증 효과와 각막상피결손 재생촉진 효과를 동시에 가짐을 확인하였는 바, 염증과 상처치유지연이 동시에 존재하는 대부분의 안질환에서 기존 치료제들보다 더 효과적인 치료효과를 보일 것으로 기대된다.

Description

앰피레귤린을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 조성물{Composition for treating eye diseases comprising Amphiregulin as an active ingredient}

본 발명은 앰피레귤린을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

포도막은 안구의 가장 바깥막인 각막, 공막 속에 있는 중간 막으로 홍채, 모양체, 맥락막으로 구성되며 이곳에 생기는 염증을 포도막염 (uveitis)으로 정의한다. 포도막은 혈관이 풍부하고 결합조직이 많아 염증이 생기기 쉬우며, 여러 가지 원인과 염증 정도에 따라 다양한 증상이 나타난다. 포도막염의 대표적인 증상으로는 시력 저하와 날파리증, 통증과 출혈, 눈물 흘림과 눈부심 등이 알려져 있다.

포도막염은 염증의 위치에 따라 앞 포도막염, 중간 포도막염, 뒤 포도막염 및 전체 포도막염으로 분류할 수 있다. 또한, 포도막염은 바이러스나 세균에 의한 감염성 포도막염 및 자가 면역체계 이상으로 생긴 비감염성 포도막염으로 나뉘며, 대부분 면역학적인 요인인 경우가 많다. 그러나, 현재까지도 포도막염의 정확한 발병기전에 대해서는 아직 명확하게 밝혀진 바가 없다.

포도막염의 대표적인 치료제로는 스테로이드나 면역억제제가 사용된다. 그러나, 스테로이드 점안제의 경우 포도막 조직으로의 약물침투를 위해 고용량을 사용하게 되어 백내장, 안압상승, 감염의 증가 등 심각한 부작용이 나타나는 경우가 많다. 또한, 장기적인 경구 스테로이드의 복용은 골다공증, 골괴사, 시상하부-뇌하수체-부신 축억제, 감염의 증가, 대사 및 전해질, 소화기계의 이상 등 다양한 부작용을 유발할 수 있다. 한편, 스테로이드 대체 요법으로 사용되고 있는 면역억제제 역시 골수 억제, 신장기능 및 간기능 손상 등의 부작용을 초래할 가능성이 있다. 때문에, 스테로이드 및 면역억제제의 충분한 치료에도 불구하고 5 내지 10%의 환자는 결국 실명에 이르게 되는 등 환자의 삶에 많은 문제점을 야기하고 있다. 때문에 타겟 조직으로 침투가 잘 되고 부작용이 적은 포도막염 치료제의 개발이 시급히 요구되고 있다.

한편, 안구건조증은 전 세계적으로 다양한 역학적 연구에 이용되는 연구 집단, 연령 및 진단 기준에 따라 유병률이 5.5-15%로 보고된 매우 일반적인 질환이다. 이 질환은 안구통증, 불규칙한 각막 표면, 흐리고 변동폭이 커진 시력(blurred and fluctuating vision) 및 증가된 각막 궤양의 위험성과 같은 특징을 가진다. 불안정한 눈물막(tear film)으로 부터 유래된 만성 안구 건조증 및 건성 각막염에서 변경된 각막 투과성은 염증을 일으키는 것으로 알려져 왔고, 이는 눈물에 염증 매개 케모카인 및 사이토카인의 증가, 결막 상피에 의한 면역활성 및 접착 분자 (HLA-DR 및 세포간 접착 분자 [ICAM-1])의 발현 증가, 그리고 결막(conjunctiva)에 T 림프구 수의 증가에 의해 입증되었다. 건성 각결막염 (keratoconjunctivitis sicca, KCS)으로부터 생긴 각막 궤양은 시력 감퇴, 시력 상실 및 심지어 눈의 소실을 야기할 수 있다. MMP-9(matrix metalloproteinase-9)의 농도 및 활성은 안구 건조증 환자의 눈물뿐만 아니라 실험용 안구 건조증 마우스의 각막 상피 및 눈물에서도 크게 증가하는 것으로 보고되어 왔다.

최근에, 안구 표면의 염증 및 세포 사멸은 안구 건조증 발달에 중요한 역할을 한다는 증거가 꾸준히 보고되고 있다. 고삼투압 스트레스 및 안구 건조증에 존재하는 증가된 염증성 사이토카인 (즉, 인터루킨 (IL)-1, 종양괴사인자 (TNF)-α 및 형질전환성장인자 (TGF)-β)은 각막 상피에 의한 matrix metalloproteinase (MMP)-9의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 만성적인 염증 환경은 편평상피성 이형성 (squamous metaplasia) 및 배상 세포 (goblet cell)의 소실과 같은 특징적인 결막 상피의 병리학적 변성에 부분적으로 책임이 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 포도막염 및 안구건조증을 포함하는 안 (eye) 질환의 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명에 따른 앰피레귤린이 안질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 10-2010-0043570호

이에 본 발명자들은 앰피레귤린(amphiregulin, AREG)이 각막 상피의 손상을 억제하고, 각막 상피의 증식을 증가시키며, 각막상피세포의 세포사를 억제할 뿐만 아니라 안구 내 염증을 억제하는 효과가 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인공 눈물 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인공 눈물 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 앰피레귤린은 중간엽 줄기세포와 공동배양된 대식세포에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 안질환은 포도막염, 안구건조증, 쇼그렌증후군, 당뇨망막병증 (Diabetic Retinopathy), 당뇨황반부종, 가령성 황반변성증 (Age-related Macular Degeneration), 미숙아망막병증 (Retinopathy of Prematurity), 결절맥락막혈관병증 (Polypoidal Choroidal Vasculopathy), 허혈성증식망막증 (Ischemic Proliferative Retinopathy), 망막색소변성증 (Retinitis Pigmentosa), 원추세포 이영양증 (Cone Dystrophy), 증식성유리체망막증 (Proliferative Vitreoretinopathy), 망막동맥폐색증 (Retinal Artery Occlusion), 망막정맥폐색증 (Retinal Vein Occlusion), 익상편 (Pterygium), 망막염 (Retinitis), 각막염 (Keratitis), 지속성 각막상피결손 (Persistent Corneal Epithelial Defect), 재발성 각막미란 (Recurrent Corneal Erosion), 노출성 각막병증 (Exposure Keratopathy), 신경영양성 각막병증 (Neurotrophic Keratopathy), 각막화상 (Corneal Burn), 결막염 (Conjunctivitis), 레버씨 시신경위축증 (Leber Hereditary Optic Neuropathy), 망막박리 (Retinal Detachment), 망막색소상피박리 (Retinal Pigment Epithelial Detachment), 신생혈관녹내장 (Neovascular Glaucoma), 각막 혈관신생 (Corneal Neovascularization), 망막 혈관신생 (Retinal Neovascularization) 및 맥락막 혈관신생 (Choroidal Neovascularization)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 앰피레귤린은 각막상피줄기세포의 증식을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 앰피레귤린은 IL-6 발현 수준을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 앰피레귤린은 각막상피줄기세포의 세포자멸사(apoptosis)를 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 안구표면 투여 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 앰피레귤린은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 앰피레귤린은 각막상피 결손을 개선할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 안질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 안질환 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 앰피레귤린은 자가면역포도막염을 억제하는 항염증 효과와 각막상피결손 재생촉진 효과를 동시에 가짐을 확인하였는 바, 염증과 상처치유지연이 동시에 존재하는 대부분의 안질환에서 기존 치료제들보다 더 효과적인 치료효과를 보일 것으로 기대된다. 또한, 기존 안질환 치료제 중 스테로이드 제제는 염증 억제효과는 있지만 오히려 상처치유를 지연하는 부작용이 있고, 상처치유를 위한 인공눈물 등은 상처치유효과 자체가 미미하고 염증 억제작용도 거의 없으므로, 본 발명의 앰피레귤린으로 기존 안질환 치료제를 대체할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 실시예 1의 프로토콜을 간략히 나타낸 도이다.
도 1b는 본 발명의 실시예 1에서 21일째에 자가면역포도막염의 발생을 망막조직 절편에 대한 헤마톡실린-에오진 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 본 발명의 실시예 1에서 21일째에 자가면역포도막염의 발생을 망막조직 절편에 대한 CD3 면역화학염색 결과를 나타낸 도이다.
도 1d는 본 발명의 실시예 1에서 망막조직의 파괴 정도를 임상점수화하여 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 본 발명의 실시예 1에서 망막 조직 내 인터페론감마의 양을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1f는 본 발명의 실시예 1에서 경부 배액림프절 (draining lymph node, DLN) 내 인터페론감마 발현 CD4 세포 (IFN-γ⁺CD4⁺cell) 의 수를 유세포 분석 (flow cytometry)으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 실시예 2의 프로토콜을 간략히 나타낸 도이다.
도 2b는 본 발명의 실시예 2에서 망막조직의 파괴 정도를 임상점수화하여 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 본 발명의 실시예 2에서 경부 배액림프절 (draining lymph node, DLN) 내 인터페론감마 발현 CD4 세포 (IFN-γ⁺CD4⁺cell) 의 수를 유세포 분석 (flow cytometry)으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 실시예 3의 프로토콜을 간략히 나타낸 도이다.
도 3b는 본 발명의 실시예 3에서 망막조직의 파괴 정도를 임상점수화하여 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 본 발명의 실시예 3에서 경부 배액림프절 (draining lymph node, DLN) 내 인터페론감마 발현 CD4 세포 (IFN-γ⁺CD4⁺cell) 의 수를 유세포 분석 (flow cytometry)으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 실시예 3에서 재조합 AREG 단백질을 투여하는 프로토콜을 간략히 나타낸 도이다.
도 4b는 도 4a의 프로토콜에서 망막조직의 파괴 정도를 임상점수화하여 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 도 4a의 프로토콜에서 경부 배액림프절 (draining lymph node, DLN) 내 인터페론감마 발현 CD4 세포 (IFN-γ⁺CD4⁺cell) 의 수를 유세포 분석 (flow cytometry)으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 실시예 4의 프로토콜을 간략히 나타낸 도이다.
도 5b는 본 발명의 실시예 4에서 MSC와 대식세포의 공동배양 3일 후 대식세포내 AREG 전사체의 양을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 본 발명의 실시예 4에서 MSC와 대식세포의 공동배양 3일 후 대식세포가 분비한 AREG 프로테인의 양을 배양액내에서 ELISA 로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 본 발명의 실시예 4에서 MSC와 대식세포의 공동배양 3일 후의 세포사 정도를 propidium iodide (PI) 와 annexin V (ANX) 염색 후 유세포분석으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5e는 본 발명의 실시예 4에서 공동배양 3일 후 각막상피줄기세포의 증식능을 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) dilution assay 로 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 5f는 본 발명의 실시예 4에서 MSC와 대식세포의 공동배양 3일 후의 세포사 정도를 propidium iodide (PI) 와 annexin V (ANX) 염색 후 유세포분석으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5g는 본 발명의 실시예 4에서 각막상피줄기세포의 염증활성화 정도를 real-time RT PCR 로 인터루킨 6 (interleukin 6, IL-6) 전사체의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5h는 AREG가 단독으로 각막상피줄기세포의 생존을 촉진하고 염증활성화를 감소시키는 기전을 나타낸 도이다.
도 6a는 본 발명의 실시예 5에서 각막상피손상 마우스 모델에서 각막상피손상 후 일주일 째 lissamine green 생체각막염색 후 임상점수화한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 본 발명의 실시예 5에서 각막조직 절편에서 BrdU (bromodeoxyuridine) 양성 세포의 수를 계수하여 각막상피줄기세포의 증식정도를 나타낸 도이다.
도 6c는 본 발명의 실시예 5에서 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)염색을 하여 TUNEL 양성 세포의 수를 세어서 각막상피줄기세포의 세포사 정도를 나타낸 도이다.
도 6d는 본 발명의 실시예 5에서 중성구 (neutrophil) elastase 면역염색을 하여 각막에 침착된 중성구의 정도를 나타낸 도이다.

따라서 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인공 눈물 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 앰피레귤린(amphiregulin), 이의 아고니스트 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서, “앰피레귤린”은 상피세포성장인자 수용체에 결합하여 상피세포 수용체 경로(EGFR pathway)를 활성화시키며, 세포증식에 관여한다는 사실이 알려져 있고, 엠피레귤린 특이적 siRNA에 의해 엠피레귤린의 발현을 저해시킬 수 있으며, 이는 특정 타입의 유방암에서 치료효과를 나타낸다고 개시되었다. 또한, 엠피레귤린에 대한 shRNA를 이용하여 염증성 유방암에서의 세포 침투를 억제할 수 있으며(Andrea Baillo, J Cell Physiol. 2011 226(10):2691-2701), 엠피레귤린 특이적 shRNA를 이용하여 엠피레귤린 발현을 억제하면 담배연기에 노출된 쥐에서의 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling)이 억제된다는 사실이 알려져 있다. 본원에서는 상기 개시된 바와 상이한 눈에 앰피레귤린을 적용함으로써, 각막 손상 개선 효과를 발현하게 한다.

본 발명에서, 상기 아고니스트는 앰피레귤린 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포, 화합물 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 아고니스트는 앰피레귤린을 활성화하거나 발현을 증가시킬 수 있는 것이라면, 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 자가면역포도막염을 유발한 마우스에 앰피레귤린 항체를 주사한 결과, MSC에 의한 망막파괴 및 CD3 세포침착 억제효과가 오히려 감소되고, 망막 내 IFN-γ 감소효과와 배액 림프절내 IFN-γ⁺CD4⁺ 세포침착 억제효과 또한 감소하며(실시예 1), MSC와 공동배양된 대식세포 투여군에 앰피레귤린 항체를 주사한 결과, 대식세포에 의해 억제된 자가면역포도막염의 발생이 앰피레귤린 항체 투여에 의해 사라짐을 확인하였으며(실시예 3), 재조합 앰피레귤린을 투여한 결과, 자가면역포도막염의 억제효과가 회복됨을 확인하였으며(실시예 3), 재조합 앰피레귤린 단독 또는 MSC와 공동배양된 대식세포와 앰피레귤린의 병용 투여에 의하여 각막상피줄기세포의 증식이 증가하고, 세포사는 감소하며, IL-6의 발현량은 감소함을 확인하였으며(실시예 4), 각막손상 마우스 동물 모델에 MSC와 앰피레귤린 항체를 투여한 결과 각막상피증식 촉진, 세포사 억제 및 염증 억제 효과 모두 감소되었는 바, 각막손상을 개선하기 위하여 앰피레귤린이 필수적임을 확인하였는 바(실시예 5),

앰피레귤린을 안질환, 특히 안구내 염증 (포도막염) 또는 각막의 손상이 동반된 안질환의 치료에 이용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서, “안질환”이란 포도막염, 안구건조증, 쇼그렌증후군, 당뇨망막병증 (Diabetic Retinopathy), 당뇨황반부종, 가령성 황반변성증 (Age-related Macular Degeneration), 미숙아망막병증 (Retinopathy of Prematurity), 결절맥락막혈관병증 (Polypoidal Choroidal Vasculopathy), 허혈성증식망막증 (Ischemic Proliferative Retinopathy), 망막색소변성증 (Retinitis Pigmentosa), 원추세포 이영양증 (Cone Dystrophy), 증식성유리체망막증 (Proliferative Vitreoretinopathy), 망막동맥폐색증 (Retinal Artery Occlusion), 망막정맥폐색증 (Retinal Vein Occlusion), 익상편 (Pterygium), 망막염 (Retinitis), 각막염 (Keratitis), 지속성 각막상피결손 (Persistent Corneal Epithelial Defect), 재발성 각막미란 (Recurrent Corneal Erosion), 노출성 각막병증 (Exposure Keratopathy), 신경영양성 각막병증 (Neurotrophic Keratopathy), 각막화상 (Corneal Burn), 결막염 (Conjunctivitis), 레버씨 시신경위축증 (Leber Hereditary Optic Neuropathy), 망막박리 (Retinal Detachment), 망막색소상피박리 (Retinal Pigment Epithelial Detachment), 신생혈관녹내장 (Neovascular Glaucoma), 각막 혈관신생 (Corneal Neovascularization), 망막 혈관신생 (Retinal Neovascularization) 및 맥락막 혈관신생 (Choroidal Neovascularization)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

아울러, 본 발명의 조성물은 중간엽 줄기세포와 공동배양된 대식세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서, 상기 앰피레귤린은 중간엽 줄기세포와 공동배양된 대식세포에 포함된 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 앰피레귤린은 중간엽 줄기세포와 공동배양된 대식세포에서 발현될 수 있다.

본 발명에서, 상기 공동배양은 LPS 및 ATP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재 하에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 공동배양은 3 내지 24시간, 6 내지 24시간, 12 내지 24시간, 14 내지 24시간, 16 내지 24시간, 16 내지 22시간, 16 내지 20시간, 14 내지 22시간, 14 내지 20시간, 또는 17 내지 19시간동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 공동배양은 대식세포 및 MSC가 약 5:1의 세포수 비로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 대식세포를 MSC와 생체 외에서 LPS 및 ATP의 존재 하에서 18시간동안 공동배양함으로써, 대식세포의 변화를 유도하였다.

본 발명은 또한, 앰피레귤린의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물 내의 앰피레귤린의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₃), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명의 조성물은 의약외품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과에 영향을 미치지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물에 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술 분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 앰피레귤린 또는 이의 아고니스트를 식품 첨가물로 사용할 경우, 앰피레귤린을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의앰피레귤린은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 인공 눈물 조성물에 유효성분으로 이용되는 앰피레귤린, 이의 아고니스트 및 그의 염은, 상술한 본 발명의 안질환의 예방 또는 치료용 조성물에 이용되는 유효성분과 동일하므로, 명세서의 과도한 번잡성을 피하기 위하여 중복 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인공 눈물 조성물에 이용되는 유효성분은 각막 손상을 개선함으로써 안질환의 예방 또는 치료 활성을 나타낸다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 전해질, 비이온성 계면활성제, 항균제, 보레이트 및 폴리올 복합체 또는 저분자량의 아미노산을 추가적으로 포함할 수 있다.

인공 눈물 조성물에 포함되는 전해질은 천연 눈물을 자극하기 위하여 이용되며, 천연 눈물에 포함된 이온을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 이용되는 전해질에는 포타슘, 칼슘, 마그네슘 및 아연이 있으며, 그 농도는 U.S. Pat. No. 5,403,598에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물에 이용되는 비이온성 계면활성제는 본 발명 조성물의 표면 장력을 감소시켜 각막 표면에 용액이 골고루 퍼지도록 한다. 비이온성 계면활성제는 당업계에 공지된 다양한 계면활성제를 포함하나, 바람직하게는 15 이상의 HLB 값을 갖는 폴리솔베이트 80(Tween 80)과 같은 폴리솔베이트류, 및 에틸렌디아민에 에틸렌옥사이드 및 프로필렌 옥사이드를 첨가하여 제조된 블록 공중합체이다. 본 발명에 이용된 계면활성제의 양은 약 38 내지 약 45 dynes/cm의 표면 장력을 갖는 조성물을 제공하기 위한 충분한 양을 의미하고, 상기 범위의 표면 장력은 천연 눈물의 표면 장력에 상응한다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 1회 투여(single-dose) 또는 분할 투여(multi-dose) 제품으로 제조될 수 있다. 제품화 이후 조성물의 무균 상태를 유지하기 위하여 1회 투여 제품은 항균 보존제가 불필요하나 분할 투여 제품은 필요할 수 도 있다.

본 발명의 조성물에 이용되는 항균 보존제로서, 바람직하게는 폴리쿼터늄-1이고, 그 함량은 0.1 내지 10 ppm이다. 본 발명의 조성물에서 항균 보존제의 항균 활성을 개선시키기 위하여 추가적으로 보레이트/폴리올 복합체 또는 저분자량의 아미노산을 포함한다.

보레이트/폴리올 복합체의 함량은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.5 내지 6.0 중량 %이고, 바람직하게는 1.0 내지 2.5 중량 %이다. 보레이트와 폴리올의 몰비는 1:0.1 내지 1:10이고, 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5이다. 본 발명에 이용되는 보레이트는 붕산(boric acid), 붕산의 염 및 다른 약제학적으로 허용되는 보레이트, 또는 이들의 조합을 의미하며, 바람직하게는 붕산, 소듐 보레이트, 포타슘 보레이트, 칼슘 보레이트, 마그네슘 보레이트 및 이들의 이다. 폴리올은 당업계에 공지된 다양한 폴리올을 포함하며, 바람직하게는 당, 당 알콜 및 당 산이고, 보다 바람직하게는 만니톨, 솔비톨, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤이며, 가장 바람직하게는 글리세롤이다.

항균 활성의 개선을 위하여 본 발명의 조성물에 이용되는 저분자량의 아미노산의 함량은 0.01 내지 2.5 w/v %, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.0 w/v %이고, 분자량은 바람직하게는 75 내지 250이며, 보다 바람직하게는 글라이신이다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 눈과 양립할 수 있는 pH 및 삼투압을 갖도록 제조된다. 바람직하게는 pH는 6.8 내지 7.8이고 삼투압은 250 내지 350 mOsm/kg이다.

본 발명의 조성물을 눈에 적용하는 경우 편안함 및 조성물의 체류 시간을 증가시키기 위해서, 개선된 점성을 가지도록 본 발명의 인공 눈물 조성물을 제조한다. 바람직하게는 점성은 1 내지 20 cps이고 보다 바람직하게는, 2 내지 20 cps이며, 가장 바람직하게는 5 내지 20 cps이다.

본 발명의 인공 눈물 조성물은 안구 건조증의 예방 또는 치료하기 위하여 각막에 국소적으로 적용될 수 있고, 눈 습윤제 또는 눈 윤활제로서 이용되며 각막에 한 두 방울 떨어뜨려 적용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[실험방법]

역전사 중합효소연쇄반응 (real-time reverse transcription polymerase chain reaction, real-time RT RCR, RT-PCR)

세포 또는 조직을 RNA 분리 시약(RNA Bee, Tel-Test Inc., Friendswood, TX)에 용해시키고 초음파 초음파기(Ultrasonic Processor, Cole Parmer Instruments, Vernon Hills, IL)로 균질화하였다. RNeasy Mini kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 total RNA를 추출하고 역전사를 통해 first-strand cDNA를 합성하였다(High Capacity RNA-to-cDNA^TM Kit, Applied Biosystems, Carlsbad, CA). 실시간 증폭은 자동화기기(ABI 7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems, Carlsbad, CA)에서 TaqMan^® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)로 수행하였다: interleukin (IL)-6, interferon (IFN)-gamma, AREG. 데이터는 GAPDH로 정규화되었고 대조군에 비해 상대적 배수 변화로 표현하였다. PCR 프로브 세트는 Applied Biosystems (TaqMan Gene Expression Assay kits, Applied Biosystems, Carlsbad, CA)에서 구입하였다.

프라이머 (TaqMan^® Gene Expression Assay, Applied Biosystems)

마우스 IFN-gamma: Mm01168134_m1

인간 IL-6: Hs00985639_m1

인간 AREG: Hs00950669_m1

효소면역분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

무세포 상청액은 1500rpm에서 5 분 동안 20 ℃에서 원심분리한 후 세포 배양 물로부터 수집하고, IL-6와 AREG을 ELISA 키트(all DuoSet ELISA kits from R&D Systems, Minneapolis MN)를 사용하여 농도를 평가하였다.

면역화학염색 (immunohistochemistry)

안구 또는 각막은 10 % 포름 알데히드에 고정되고 파라핀이 포매하였다. 4μm 두께 섹션으로 절단하고 헤마톡실린/에오신 염색, 토끼 항-마우스 CD3(Cat# ab5690, Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 CD3 면역 조직 화학 염색, 래트 항-마우스 BrdU 항체(Cat# ab6326, Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 BrdU염색, 래트 항-마우스 neutrophil elastase 항체(Cat# ab2557, Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 중성구 염색 또는 ApopTag Plus Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (S7111, EMD Millipore, Burlington, MA)를 사용하여 TUNEL 양성 세포사 염색을 하였다. 망막의 형태학적 특징을 조사하고 정의된 기준을 사용하여 0에서 4의 척도의 맹검 방식으로 조직학적 질병 점수를 평가하였다.

유세포 분석 (flow cytometry)

세포를 CD4, IFN-g 에 대한 형광-접합 항체(eBioscience, San Diego, CA)로 염색하였다. 세포 내 염색을 위해, 단백질 수송 억제제 칵테일(Cat# 50-930-9, eBioscience, San Diego, CA)의 존재 하에 24 시간 동안 50 ng/ml phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) 및 1 mg/ml 이오노마이신으로 세포를 자극하였다. DLN에서 잉글 세포 현탁액은 10% FBS (GIBCO, Waltham, MA)를 포함하는 RPMI1640 배지 (Welgene, Daejeon, Korea)에서 두 유리 슬라이드의 끝 사이에 경부 림프절을 다듬고 세포 스트레이너를 통해 여과하여 획득하였다. 생성된 현탁액은 원심 분리하고 형광 결합 항체로 염색하였다. 세포는 S1000EXi Flow Cytometer (Stratedigm, San Jose, CA)로 형광 분석하였고, 데이터는 FlowJo 프로그램 (Tree Star, Inc., Ashland, OR)을 사용하여 분석하였다.

세포증식을 평가하기 위해 세포에 5 μM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE, Invitrogen)을 10분간 처리한 후 CFSE 의 형광을 S1000EXi Flow Cytometer (Stratedigm, San Jose, CA)로 분석하였다.

세포사를 평가하기 위해 세포를 annexin 과 propidium iodide을 15분간 처리하여 염색한 후 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen™, San Diego, CA) 를 사용하여 S1000EXi Flow Cytometer (Stratedigm, San Jose, CA)로 분석하였다.

[실험결과]

실시예 1. 중간엽 줄기세포의 자가면역포도막염 억제에 있어서 앰피레귤린(amphiregulin, AREG)의 중요성 확인

도 1a의 프로토콜에 따라, B6 마우스에 망막자가항원 (interphotoreceptor retinal binding protein peptide, GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD(250 mg, Peptron, Daejeon, Korea))을 주사하여 자가면역포도막염 (experimental autoimmune uveoretinitis, EAU)을 유발한 직후 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem/stromal cell, MSC) 1백만개를 꼬리정맥을 통해 정맥주사 (intravenous injection, IV) 하고 유발후 1, 3, 5일째 각각 항 AREG 항체(Clone #206220, Cat# MAB989, R&D Systems, Minneapolis MN) 50 μg을 복강 내 주사하여 AREG 을 억제하였다. MSC의 대조군으로 MSC의 vehicle로 사용한 Hank’s balanced salt solution (HBSS)을, 항 AREG 항체의 대조군으로 IgG 항체(Clone #54447, Cat# MAB006, R&D Systems, Minneapolis MN)를 각각 사용하였다. 그 후 21일 째에 자가면역포도막염의 발생을 망막조직 절편에 대한 헤마톡실린-에오진 염색 및 CD3 면역화학염색을 통해 평가하였고, 망막조직의 파괴 정도를 임상점수화하여 평가하였다.

망막조직의 파괴 정도 score : 점수 0 (변화 없음), 점수 0.5 (매우 작은 1 ~ 2 개의 국소 병변), 점수 1 (5개까지의 국소 병변; 1 선형 병변), 점수 2 (다중 (> 5) 맥락 망막 병변 및/또는 침윤, 심한 혈관염(큰 크기, 두꺼운 벽, 침윤); 5개까지의 선형 병변), 점수 3 (선형 병변의 패턴, 큰 합류 병변, 망막 하 혈관 신생, 출혈) 및 점수 4 (대형 망막 박리, 망막 위축).

또한, 망막조직내 인터페론감마 (IFN-γ)의 양을 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (real-time reverse transcription polymerase chain reaction, real-time RT RCR)으로 분석하였다. 더불어, 경부 배액림프절 (draining lymph node, DLN) 내 인터페론감마 발현 CD4 세포 (IFN-γ⁺CD4⁺cell)의 수를 유세포 분석 (flow cytometry)으로 측정하였다.

그 결과, 도 1b (헤마톡실린-에오진 염색), 도 1c (CD3 면역화학염색) 내지 도 1d (망막조직의 파괴 정도임상점수화)에 나타난 바와 같이, MSC와 IgG 항체를 투여한 군에서는 HBSS 와 IgG 항체를 투여한 양성 대조군에 비해 자가면역포도막염에 의한 망막파괴와 CD3 세포의 망막침착이 현저히 억제되었다. 하지만, MSC와 항 AREG 항체를 투여한 군에서는 MSC와 IgG 항체를 투여한 군에 비해 MSC에 의한 망막파괴와 CD3 세포침착 억제효과가 유의하게 감소하였다.

또한, 도 1e (역전사 중합효소연쇄반응) 및 도 1f (유세포분석)에 나타난 바와 같이, MSC와 IgG 항체를 투여한 군에서는 HBSS 와 IgG 항체를 투여한 양성 대조군에 비해 망막내 IFN-γ 의 양과 배액 림프절 내 IFN-γ⁺CD4⁺ 세포의 수가 현저히 감소되었다. 하지만, MSC와 항 AREG 항체를 투여한 군에서는 MSC와 IgG 항체를 투여한 군에 비해 MSC에 의한 망막내 IFN-γ 감소효과와 배액 림프절내 IFN-γ⁺CD4⁺ 세포침착 억제효과가 유의하게 줄어들었다.

상기 결과로부터, MSC가 자가면역포도막염을 억제하기 위해서 AREG 이 필요함을 확인하였다.

실시예 2. 중간엽 줄기세포의 자가면역포도막염 억제에 있어서 대식세포의 중요성 확인

도 2a의 프로토콜에 따라, B6 마우스에 clodronate-encapsulated liposome (50 mg/kg bodyweight, Cl₂MDP-LIP, Encapsula NanoSciences, Nashville, TN)을 꼬리정맥을 통해 주사함으로써 대식세포를 제거한 후 1일 째 자가면역포도막염을 유발하고 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 (MSC) 1백만개를 꼬리정맥을 통해 정맥주사 (IV)하였다. MSC의 대조군으로 HBSS 를, Cl₂MDP-LIP의 대조군으로 PBS-encapsulated liposome (PBS-LIP, Encapsula NanoSciences, Nashville, TN)을 각각 사용하였다. 그 후 21일 째에 자가면역포도막염의 발생을 평가하기 위해 망막조직파괴정도를 망막절편 헤마톡실린-에오진 염색 후 관찰하여 임상점수화하였고, 경부 배액림프절 (DLN) 내 IFN-γ⁺CD4⁺ 세포의 수를 유세포 분석으로 측정하였다.

그 결과, 도 2b (망막조직의 파괴 정도임상점수화) 및 도 2c (유세포분석)에 나타난 바와 같이, MSC와 Cl₂MDP-LIP을 투여한 군에서는 MSC와 PBS-LIP 을 투여한 대조군에 비해 MSC의 망막파괴 억제 효과와 경부 배액림프절 내 IFN-γ⁺CD4⁺ 세포침착 억제효과가 유의하게 감소함을 확인하였다

즉, MSC가 자가면역포도막염을 억제하기 위해서는 대식세포가 필요함을 확인하였다.

실시예 3. 중간엽 줄기세포에 의해 변화된 대식세포의 자가면역포도막염 억제에 있어서 앰피레귤린의 중요성 확인

도 3a의 프로토콜에 따라, B6 마우스에 자가면역포도막염을 유발하고 MSC 와 미리 생체 외에서 lipopolysaccharide (LPS) 와 adenosine triphosphate (ATP) 자극 하에 18시간 공동배양한 마우스 대식세포 (MSC-primed macrophage, MSC-primed mac) 1백만개를 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 그 후 1, 3, 5일째 각각 항 AREG 항체 50 μg을 복강내 주사하여 AREG을 억제하였다. MSC와 공동배양한 마우스 대식세포의 대조군으로 MSC와 공동배양하지 않은 대식세포 (macrophage, Mac)를, 항 AREG 항체의 대조군으로 IgG 항체를 각각 사용하였다. 그 후 21일째에 자가면역포도막염의 발생을 평가하기 위해 망막조직파괴정도를 헤마톡실린-에오진 염색한 망막절편에서 임상점수화하였고, 경부 배액림프절내 IFN-γ⁺CD4⁺ 세포의 수를 유세포 분석으로 측정하였다.

그 결과, 도 3b (망막조직의 파괴 정도임상점수화) 및 도 3c (유세포분석)에 나타난 바와 같이, MSC-primed mac 투여군에서는 Mac 투여군에 비해 유의하게 자가면역포도막염의 발생이 억제되었는데, 이 억제효과는 항 AREG 항체로 AREG을 억제하게 되면 사라짐을 확인하였다.

즉, MSC에 의해 변화된 대식세포가 자가면역포도막염을 억제하기 위해서는 AREG이 필요함을 확인하였다.

또한, 도 4a의 프로토콜에 따라, B6 마우스에 Cl₂MDP-LIP정맥주사를 통해 대식세포를 제거한 후 1일째 자가면역포도막염을 유발하고 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 (MSC) 1백만개를 꼬리정맥을 통해 정맥주사 (IV)하였다. 그 후 1, 3, 5일째 각각 recombinant 마우스 AREG 프로테인 (rAREG, Cat# 989-AR-100, R&D Systems, Minneapolis MN)을 마우스당 5 μg씩 복강 내 주사하여 AREG을 보충하였다. MSC의 대조군으로 HBSS를, Cl₂MDP-LIP의 대조군으로 PBS-encapsulated liposome (PBS-LIP)을 각각 사용하였다. 그 후 21일 째에 자가면역포도막염의 발생을 평가하기 위해 망막조직파괴정도를 헤마톡실린-에오진 염색한 망막절편에서 임상점수화하였고, 경부 배액림프절내 IFN-γ⁺CD4⁺세포의 수를 유세포 분석으로 측정하였다.

그 결과, 도 4b (망막조직의 파괴 정도임상점수화) 및 도 4c (유세포분석)에 나타난 바와 같이, MSC 와 Cl₂MDP-LIP을 투여한 군에서는 MSC 와 PBS-LIP 을 투여한 대조군에 비해 MSC의 자가면역포도막염 억제효과가 유의하게 감소하였지만, rAREG을 같이 투여하면 자가면역포도막염 억제효과가 다시 회복됨을 확인하였다.

즉, MSC에 의해 변화된 대식세포가 자가면역포도막염을 억제하는 데 AREG이 관여함을 의미한다.

실시예 4. 중간엽 줄기세포의 각막상피줄기세포의 생존을 촉진하는 데에 대식세포가 내는 앰피레귤린의 역할 확인

도 5a의 프로토콜에 따라, 인간 각막상피줄기세포 (corneal epithelial stem cell, CESC) 에 NaCl 100 mM을 처리하여 고삼투압 스트레스를 가한 후, 미리 MSC 와 생체외에서 LPS와 ATP 자극하 18시간 공동배양한 인간 대식세포 (MSC-primed mac)와 함께 3일 공동배양하였다. 이 때 MSC와 공동배양하지 않은 대식세포 (Mac)를 대조군으로 사용하였다. 또한 공동배양 시 항 AREG 항체 5 μg/ml를 처리하여 AREG을 억제한 군과 EGF (epidermal growth factor) 수용체 길항제인 gefitinib 1 μM을 처리하여 AREG 수용체를 억제한 군을 포함하였다. 또한, 대식세포 대신 rAREG 을 직접 처리한 군도 포함하였다. 공동배양 3일 후 각막상피줄기세포의 증식능을 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) dilution assay로 평가하였고 세포사 정도를 propidium iodide (PI) 와 annexin V (ANX) 염색 후 유세포 분석으로 측정하였다. 또한, 각막상피줄기세포의 염증활성화 정도를 real-time RT PCR로 인터루킨 6 (interleukin 6, IL-6) 전사체의 양을 측정함으로써 평가하였다.

MSC에 의해 대식세포가 분비하는 AREG의 양이 늘어남을 확인하기 위해 MSC와 대식세포를 18시간 공동배양한 후 대식세포내 AREG 전사체의 양을 real-time RT PCR로 측정하였고, 배양액내 분비된 AREG 프로테인의 양을 효소면역분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 측정하였다.

그 결과, 도 5b (역전사 중합효소연쇄반응) 및 도 5c (효소면역분석법)에 나타난 바와 같이, MSC와 공동배양함으로써 대식세포내 AREG의 전사체와 대식세포가 내는 AREG 프로테인의 양이 유의하게 증가하였다.

또한, 도 5d, 도 5e, 도 5f 및 도 5g에 나타난 바와 같이, MSC와 공동배양하지 않은 대식세포 (Mac)에 의해 각막상피줄기세포의 증식은 감소하고 세포사는 증가하며 IL-6 양은 늘어남을 확인하였다. 반면, MSC와 공동배양한 대식세포 (MSC-primed mac)에 의해 각막상피줄기세포는 증식도 증가하고 세포사는 줄어들며 IL-6 양은 감소함을 확인하였다. 하지만 항 AREG 이나 gefitinib (EGF 수용체 길항제)을 같이 처리하게 되면 MSC-primed mac 에 의한 각막상피줄기세포의 증식증가, 세포사감소, IL-6 감소효과는 유의하게 줄어들었다. 또한, rAREG 으로 AREG 을 직접 보충한 경우 고삼투압 스트레스를 받은 각막상피줄기세포의 증식은 증가하고 세포사는 감소하며 IL-6 발현양은 감소함을 확인하였다.

즉, MSC에 의해 변화된 대식세포는 각막상피줄기세포의 증식을 감소하고 세포사를 억제하여 생존을 촉진하며 염증활성화를 줄이는데, 이 기전에는 AREG과 EGF 수용체 축이 중요한 역할을 함을 알 수 있었고, AREG 단독으로도 각막상피줄기세포의 생존을 촉진하고 염증활성화를 감소하는 효과가 있음을 알 수 있었다 (도 5h 참조).

실시예 5. in vivo 에서 중간엽 줄기세포의 각막상피줄기세포의 생존을 촉진하는 데에 대식세포가 내는 앰피레귤린의 역할의 확인

실시예 4에서 관찰한 사실을 생체 내에서도 확인하기 위해 BALB/c 마우스에 1 mg BrdU (5-Bromo-2´-Deoxyuridine)를 복강 내 주사하여 각막상피줄기세포를 염색한 후 각막표면에 무수에탄올을 15초간 점안하고 블레이드로 각막상피를 벗겨내었다. 그 후 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem/stromal cell, MSC) 1백만개를 꼬리정맥을 통해 정맥주사 (IV)하고 1, 3, 5일째 각각 항 AREG 항체 50 μg을 복강 내 주사하여 AREG을 억제하였다. MSC의 대조군으로 MSC의 vehicle인 Hank’s balanced salt solution (HBSS)를, 항 AREG 항체의 대조군으로 IgG 항체를 각각 사용하였다. 7일째에 각막상피결손을 lissamine green 생체각막염색을 한 후 관찰하여 임상점수화하였고, 각막조직 절편에서 BrdU 양성 세포의 수를 세어서 각막상피줄기세포의 증식정도를 평가하였으며, TUNEL 염색을 하여 TUNEL 양성 세포의 수를 세어서 각막상피줄기세포의 세포사 정도를 측정하였고, 중성구 (neutrophil) elastase 면역염색을 하여 각막에 침착된 중성구의 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, MSC와 IgG 항체를 투여한 군에서는 HBSS와 IgG 항체를 투여한 양성 대조군에 비해 각막상피결손이 현저히 억제되었지만, MSC와 항 AREG 항체를 투여한 군에서는 MSC와 IgG 항체를 투여한 군에 비해 MSC의 각막상피결손 억제효과가 유의하게 감소됨을 확인하였다.

또한, 도 6b, 도 6c 및 도 6d에 나타난 바와 같이, MSC 와 IgG 항체를 투여한 군에서는 HBSS 와 IgG 항체를 투여한 양성 대조군에 비해 각막상피의 증식이 증가하고, 세포사가 감소하며, 염증세포침착이 적었지만, MSC와 함께 항 AREG 항체를 투여하게 되면 MSC에 의한 각막상피증식 촉진효과와 세포사 억제효과, 염증억제효과 모두 감소함을 확인하였다.

즉, MSC가 각막상피줄기세포의 생존을 촉진하고 염증을 억제하기 위해서는 AREG이 필요함을 확인하였다.

상기 결과로부터 AREG은 자가면역포도막염을 억제하는 항염증 효과와 각막상피결손 재생촉진 효과를 동시에 가짐을 확인하였는 바, 염증과 상처치유지연이 동시에 존재하는 대부분의 안질환에서 기존 치료제들보다 더 효과적인 치료효과를 보일 것으로 기대된다. 또한, 기존 안질환 치료제 중 스테로이드 제제는 염증 억제효과는 있지만 오히려 상처치유를 지연하는 부작용이 있고, 상처치유를 위한 인공눈물 등은 상처치유효과 자체도 미미하고 염증 억제작용도 거의 없으므로, 기존 안질환 치료제를 대체할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Composition for treating eye diseases comprising Amphiregulin as an active ingredient <130> MP20-152 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human AREG amino acid sequence <400> 1 Ser Val Arg Val Glu Gln Val Val Lys Pro Pro Gln Asn Lys Thr Glu 1 5 10 15 Ser Glu Asn Thr Ser Asp Lys Pro Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys 20 25 30 Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro Cys Asn Ala 35 40 45 Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His 50 55 60 Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys Gln Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg 65 70 75 80 Cys Gly Glu Lys Ser Met Lys Thr His Ser Met Ile Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Lys

Claims (11)

1. 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서,
   상기 조성물은 앰피레귤린(amphiregulin), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하고,
   상기 안질환은 자가면역포도막염 또는 각막상피 결손에 의한 망막 또는 각막 손상인 것을 특징으로 하는, 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 앰피레귤린은 중간엽 줄기세포와 공동배양된 대식세포에 포함된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 앰피레귤린은 각막상피줄기세포의 증식을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 앰피레귤린은 IL-6 발현 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 앰피레귤린은 각막상피줄기세포의 세포자멸사(apoptosis)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 안구표면 투여 조성물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 앰피레귤린은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
9. 인공 눈물 조성물에 있어서,
   상기 조성물은 앰피레귤린(amphiregulin), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하고,
   상기 인공 눈물은 자가면역포도막염 또는 각막상피 결손에 의한 망막 또는 각막 손상 개선용인 것을 특징으로 하는, 인공 눈물 조성물.
   
10. 삭제
11. 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서,
    상기 조성물은 앰피레귤린(amphiregulin), 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하고,
    상기 안질환은 자가면역포도막염 또는 각막상피 결손에 의한 망막 또는 각막 손상인 것을 특징으로 하는, 안질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    
    

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