KR102462745B1 - 형광 상관 분광법을 이용한 세포외소포체에 표지된 형광 염료의 정량 분석 방법 및 이의 용도 - Google Patents
형광 상관 분광법을 이용한 세포외소포체에 표지된 형광 염료의 정량 분석 방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
형광 상관 분광법을 이용하여 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량 분석하는 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 하나의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료의 수를 정량화할 수 있으므로, 형광 염료의 표지 효율을 정확하게 측정할 수 있다. 또한, 표지 효율이 측정된 형광 염료를 이용하여 미지의 시료에 포함된 세포외소포체를 정량화할 수 있고, 보다 정확한 생체 분포 실험 결과를 얻을 수 있으므로 세포외소포체를 이용한 치료체 후보물질을 평가할 수 있으며, 생체 내 타겟 단백질의 정량화에도 이용할 수 있으므로 널리 활용될 것이다.
Description
형광 상관 분광법을 이용하여 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량 분석하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포외소포체(extracellular vesicle)는 엑소좀과 미세소포체 등을 포함하며, 이 중에서도 연구 및 개발이 많이 진행된 엑소좀이 차세대 치료제로서 크게 주목받고 있다. 엑소좀의 경우, 직경이 30 nm 내지 200 nm로서 10,000 nm 내지 20,000 nm인 세포 크기와 비교하여 훨씬 작기 때문에 세포 치료제의 잠재적 위험 요소인 색전증(embolism)의 위험 없이 다양한 경로로 투여가 가능하다. 또한, 세포와 달리 자가 복제할 수 없기 때문에 종양 형성의 위험이 매우 낮고, 상대적으로 긴 보존 기간(shelf life)이 예상되며, 다양한 품질 관리(quality control) 이후에 제품 출하가 가능한 장점을 보유하고 있다.
그러나, 정맥 주사와 같은 전신 투여의 경우 나노 크기의 세포외소포체는 목적하는 장기 뿐만 아니라 그 이외의 다양한 장기에 도달하여 조직 및 세포에 흡수 될 수 있다. 따라서 세포외소포체를 치료제로 개발하기 위해서는 투여 경로를 고려한 세포외소포체의 생체 분포 실험 평가가 필수적으로 수행되어야 한다.
광학 영상을 이용한 세포외소포체의 생체 분포 실험은 형광 물질을 쉽게 표지하고, 영상을 통하여 관찰할 수 있으므로 많은 연구자가 이용하는 기법이다. 그러나 많은 연구자가 사용하는 Cell tracker를 이용한 방법은 세포막에 형광 염료를 삽입(integration)시켜 염색하므로 조작이 단순하고 간편한 장점이 있으나, 염료의 확산 또는 이탈, 세포외소포체의 사이즈 증가 등의 문제점이 있다. 최근 사용하는 방법으로는 세포막 단백질의 아민 또는 Thiol 그룹에 형광 물질을 공유 결합하는 방법이나 Ac4ManNAz 또는 Kdo-N3를 이용한 DBCO(Dibenzocyclooctyne) 그룹 연결된 형광 물질의 copper-free click chemistry 표지법 등이 사용되고 있으며, 장시간 영상에도 형광 염료의 이탈이 발견되지 않으므로 정확한 영상 관찰이 가능하다.
한편, 이러한 광학 영상을 이용한 세포외소포체의 정확한 생체 분포 실험 평가를 위해서는, 다양한 형광 염료의 표지 효율을 측정하는 것이 중요한 요소이다. 하지만, 하나의 세포외소포체에 표지된 형광 염료의 수를 정량하는 방법이 없으므로, 형광 염료의 정확한 표지 효율을 측정하기 어려운 실정이다.
이에, 본 발명자들은 세포외소포체를 표지하는 형광 염료의 효율을 측정하기 위한 방법을 연구한 결과, 형광 상관 분광법(Fluorescence correlation spectroscopy, FCS)을 사용하는 경우 하나의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료의 수를 정량화할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량화하는 방법을 제공하는데 있다.
다른 목적은, 상기 방법을 이용하여 세포외소포체를 정량화하는 방법을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 방법을 이용하여 치료제 후보 물질을 평가하는 방법을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 방법을 이용하여 생체 내 타겟 단백질을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 방법을 이용하여 생체 내 타겟 단백질을 검출하기 위한 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 형광 염료가 표지된 세포외소포체(extracellular vesicle) 분자를 제공하는 단계; 및 상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자 및 상기 형광 염료 분자에 대하여 형광 상관 분광법(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)을 수행하여 상기 각각의 분자의 휘도(brightness)를 결정하는 단계를 포함하는 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량화하는 방법을 제공한다.
용어 "형광 상관 분광법(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)"은 형광으로 표지한 표적 분자의 매질 중에 있어서의 브라운 운동(Brownian motion) 혹은 자유 확산(free diffusion) 운동을 레이저 공초점 현미경 시스템에 의하여 측정하는 것으로, 시간에 따른 형광 강도의 요동(fluctuation)을 검출하여 형광 상관 함수(fluorescence autocorrelation function)를 계산함으로써 표적 분자의 확산계수(크기), 관찰 체적 내 평균 입자의 개수, 분자간 상호작용 등을 정량적으로 구할 수 있는 분석기법을 의미한다.
FCS는 공초점 방식의 광학계(고배율 및 고개구수의 대물렌즈), 레이저 광원, 고감도 및 고속의 검출기, 형광 상관 함수를 계산하는 계산기(correlator), 및 형광 상관 함수를 이론 모델식으로 수학적 모델 피팅(curve fit)을 해주는 소프트웨어로 구성되는 분석용 형광 기법으로, 측정을 통해 얻어진 형광 상관 함수는 복수의 수학적인 모델을 이용하여 상기에서 언급한 다양한 물리적 파라미터(분자 크기, 평균 입자 수, 분자당 형광 휘도, 해리 상수 등)를 얻을 수 있다.
현재, FCS는 고분해능의 공초점 현미경과 결합된 형태로 발전하였으며, 용액 샘플은 물론 공초점 현미경에 의한 고해상도 세포 이미징을 통해 세포내 존재하는 형광 분자에 대해서도 절대 농도, 물리적 크기(확산계수), 분자당 형광 휘도(형광 효율), 분자간 상호작용 여부를 실시간으로 검출할 수 있는 유일한 기법이다.
FCS를 생체 시료 중에 포함되는 세포외소포체 등의 검출, 측정에 사용한 경우의 특징으로서는, 용액에 포함되는 형광으로 표지한 표적 분자의 농도나 분자간 상호작용을 물리적인 분리 과정을 거치지 않고 거의 실시간으로 모니터링 할 수 있다는 것이다. 이 때문에, FCS를 사용한 검출계에서는 지금까지 생체 분자의 검출계의 주류로서 사용되어 온 ELISA 등의 분석 수단에 있어서 필요했던 번잡한 Bound/Free 분리 과정을 생략할 수가 있다. 따라서, 단시간에 다량의 샘플을 고감도로 측정하는 것이 가능하며, 자동화 측정용에도 적합하다.
용어 "세포외소포체(extracellular vesicle)"는 살아있는 세포에서 지질 이중막으로 포장되어 자연적으로 분비되는 나노 크기의 입자를 의미하며, 엑소좀과 미세소포체를 포함하는 개념이다. 기능적인 핵을 포함하고 있지 않아 복제하지 못하는 입자를 의미한다. 세포외소포체는 다세포 생물 뿐만 아니라 단세포 생물체에서도 세포간 신호 전달에 중요한 매개 물질이며, 종간 신호 전달에도 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀지고 있다. 진화적으로 다른 세포에 유전 물질이나 단백질 등 다양한 생리 활성 물질을 전달하기 위해 만들어진 세포외소포체는 기초 생물학적 연구뿐만 아니라, 치료제 개발, 치료제 전달체로서의 개발, 액체 생검 등의 적용을 위해 빠르게 산업적 적용이 진행되고 있다.
상기 분자의 휘도는 형광 휘도(fluorescent brightness)를 의미하며, 형광 상관 분광법에서는 kHz 단위로 표시되는 것이고, 특정 분자의 절대값일 수 있다.
용어 "형광 휘도(fluorescent brightness)"는 형광체가 여기(excitation)되어 발하는 형광의 밝기를 의미하며, 형광 세기 또는 형광 강도라고도 한다.
상기 방법은 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자의 휘도 대비 형광 염료 분자의 휘도 값을 결정하여 1개의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료 분자의 개수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 측정한 세포외소포체 분자의 평균 형광 강도 값을 형광 염료 분자의 평균 형광 강도 값으로 나누어 주면 1개의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료 분자의 수를 결정할 수 있다.
평균 형광 강도(averaged fluorescence intensity)는 다수의 분자가 발하는 형광 세기의 평균 값을 의미하며, 여러 개의 분자가 포함된 샘플의 형광 강도를 검출된 분자 개수로 나누어 주면 분자 한 개가 가지는 평균 형광 강도를 계산할 수 있다.
상기 1개의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료 분자의 개수 값은 정수이고, 정수가 아닌 경우 소수점 첫째 자리에서 반올림된 정수로 결정할 수 있다.
일 구현예에서, 정량화된 엑소좀을 형광 염료로 표지한 샘플에 대하여, 형광 상관 분광법을 수행하여 측정한 형광 염료로 표지된 엑소좀 분자 한 개의 평균 형광 휘도 값을 형광 염료 분자 한 개의 평균 형광 휘도 값으로 나누어, 엑소좀 분자 한 개당 결합한 형광 염료의 수를 계산할 수 있다.
상기 형광 염료로 표지된 세포외소포체는 서로 다른 휘도 값을 갖는 복수 개의 형광 염료로 표지된 세포외소포체 분자 일 수 있다.
상기 방법은 상이한 조건의 변수를 갖는 분자의 휘도를 결정하여 상관 관계 함수를 도출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 상이한 조건의 변수는 세포외소포체의 크기, 또는 개수, 세포외소포체에 처리된 형광 염료의 농도, 및 세포외소포체에 대한 형광 염료의 표지에 영향을 미칠 수 있는 인자로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다.
상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자는 형광 염료가 화학적으로 표지된 것일 수 있다.
용어, "형광 염료(fluorescence dye)"은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다.
상기 형광 염료는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 염료는 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(N-Hydroxysuccinimide ester, NHS ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids) 및 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 반응성 유도체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 형광 상관 분광법은 형광 염료로 표지된 세포외소포체 분자를 포함하는 샘플에 여기(excitation) 레이저를 조사한 후, 발생하는 형광 신호를 검출기로 측정하여 형광 상관 함수를 도출하는 단계; 상기 형광 상관 함수를 분석하는 단계; 및 상기 샘플의 형광 휘도 및 상기 샘플에 포함된 세포외소포체 분자 개수를 이용하여 상기 세포외소포체 분자 1개 당 형광 휘도를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 분자 1개 당 형광 휘도는 cpm 단위로 표시되는 것이고, 상기 cpm은 count rate per molecule의 약자이며, 분자 1개가 발하는 평균적인 형광 강도를 의미한다.
일 구현예예서, 형광 염료로 표지된 세포외소포체 분자를 포함하는 용액 샘플을 FCS 장치에 세팅한 후, 여기(excitabon) 레이저를 조사하여 발생하는 형광 신호를 검출기로 측정하여 형광 상관 함수를 도출하고, 도출된 형광 상관함 수를 수학적 이론 모델식과 맞추는(curve fit) 단계를 통하여 세포외소포체 분자 1개당 형광 세기(CPM)을 계산할 수 있다.
상기 세포외소포체 분자는 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicle), 인트라루미날 소포체 (intraluminal vesicle), 다중 소포체(multi vesicular body), 다중 소포 엔도좀(multivesicular endosome) 및 엔도좀 또는 원형질막에서 분리된 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
용어 "엑소좀(exosome)" 세포막이 1차로 함입(invasination)되어 초기 엔도좀(early endosome)을 형성하고, 엔도좀 막이 다시 2차로 함입되어 인트라루미날 소포체(intraluminal vesicle, ILV)가 함유된 다낭체(multivesicular body, MVB)를 형성한 후, MVB가 세포막과 융합되어 내부에 있는 ILV가 세포 외부 공간으로 방출되는 입자를 의미한다. 엑소좀의 크기는 대략 직경이 30 nm 내지 200 nm로 알려져 있으며, 기원 세포의 종류에 따라 다소 차이는 있으나, 엑소좀 막에 CD9, CD63, CD81 등의 표면 단백질(표면 마커)을 포함하고 있으며, 엑소좀 내부에는 엔도좀 기원임을 입증할 수 있는 TSG101, ALIX 등의 단백질이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 이외에도 다양한 기능을 갖는 성장인자(growth factor)와 싸이토카인(cytokine) 등을 포함한 단백질과 mRNA, miRNA 등의 핵산을 포함하고 있고, 기원세포의 특성을 반영하는 성분과 효능을 갖는다. 특히, 줄기세포 엑소좀은 줄기세포의 븐화를 조절하고, 재생, 성장 촉진, 특정 면역 반응 유도 등의 효능을 보유하고 있는 것으로 알려져 있어, 이를 이용한 치료제 개발이 활발하게 이루어지고 있는 상황이다.
용어 "미세소포체(microvesicle)"는 세포막이 바깥 쪽으로 돌출된 후 떨어져 나와 형성되는 입자를 의미한다. 미세소포체의 크기는 100 nm 내지 1,000 nm로 알려져 있으며, 엑소좀과 비교하여 상대적으로 알려진 바가 많지 않다.
다른 양상은, 상기 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량화하는 방법을 통해 미리 결정된 복수의 군의 특정 농도의 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자의 휘도 값에 대한 상관 관계 함수에 미지의 시료의 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자의 휘도 값을 대입하여 상기 미지의 시료의 세포외소포체 분자를 정량화하는 단계를 포함하는 세포외소포체를 정량화하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은, 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 처리된 또는 투여된 후보물질을 포함하는 세포외소포체 또는 후보물질인 세포외소포체를 상기 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량화 하는 방법을 이용하여 평가하는 단계를 포함하는 치료제 후보물질을 평가하는 방법을 제공한다.
줄기세포 유래 엑소좀이나 HEK293T 세포 유래 엑소좀은 체외 시험 및 생체 시험에서 독성을 유발하지 않는 것으로 보고되었다. 특히, 인체 줄기세포 유래 엑소좀의 경우, 면역반응을 일으킬 수 있는 MHC Class I (또는 HLA Class I), Class II (또는 HLA Class II) 또는 CD80 및 CD86 등과 같은 co-stimulatory molecules이 존재하지 않는 것으로 보고되고 있어, 치료제로 개발하는 경우 면역 거부 반응을 일으키지 않을 것으로 예상되고 있다. 아울러, 인체 줄기세포 유래 엑소좀을 장기간 반복적으로 마우스에 투여한 경우에도 특별한 면역 독성을 유발하지 않는 것으로 보고되었다. 그러나, 정맥 주사와 같은 전신 투여의 경우 나노 크기의 세포외소포체는 원하는 장기 뿐만 아니라 다양한 장기에 도달하여 조직 및 세포에 흡수될 수 있다. 따라서, 세포외소포체를 치료제로 개발하기 위해서는 투여 경로를 고려한 세포외소포체의 생체 분포 실험 평가가 필수적일 것이다.
일 양상에 의하여, 하나의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료의 수를 측정하는 경우, 생체 내 형광 분포 및 형광 세기 측정을 통하여 투여한 형광 염료로 표지된 세포외소포체가 원하는 장기에 도달한 비율 및 다양한 장기에 어느 정도의 비율로 도달하였는지 여부를 정확하게 평가할 수 있다.
또 다른 양상은, 생체 내 타겟 단백질을 검출하는 방법으로서, 상기 타겟 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질을 발현하는 세포주로부터 분리되고, 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자를 제공하는 단계; 상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자에 대하여 형광 상관 분광법을 수행하여 처리된 형광 염료의 농도에 따라 1개의 세포외소포체 분자 당 표지된 형광 염료의 개수를 정량화하는 단계; 및 타겟 단백질을 포함하는 분리된 생물학적 시료를 상기 표지된 형광 염료의 개수가 조절되고, 정량화된 세포외소포체 분자와 결합시킨 후 형광을 검출하는 단계를 포함하는 생체 내 타겟 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은, 타겟 단백질 또는 상기 타겟 단백질과 결합하는 단백질을 발현하는 세포주로부터 분리되고, 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자를 포함하고, 상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자는 상기 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량화하는 방법을 통하여 표지된 형광 염료의 개수가 조절되고, 정량화된 것인, 생체 내 타겟 단백질을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
상기 타겟 단백질은 자가 항체일 수 있다.
상기 방법 및 키트는 자가 항체 검사에 사용될 수 있다. 상기 자가 항체 검사는 자가 면역 질환을 진단, 또는 중증도를 평가하거나 자가 면역 질환의 악화, 재발 등의 예후 모니터링 또는 치료 효과의 모니터링을 위하여 사용될 수 있다.
상기 방법 및 키트를 이용하여, 개체의 생물학적 시료(예를 들어, 혈액) 내에 자가 항체의 유무 및 존재하는 자가 항체의 정량적인 평가를 통하여 보다 정확한 자가 항체 검사가 가능할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량화하는 방법을 이용하면, 하나의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료의 수를 정량화할 수 있으므로, 형광 염료의 표지 효율을 정확하게 측정할 수 있다.
또한, 표지 효율이 측정된 형광 염료를 이용하여 미지의 시료에 포함된 세포외소포체를 정량화할 수 있고, 보다 정확한 생체 분포 실험 결과를 얻을 수 있으므로 세포외소포체를 이용한 치료체 후보물질을 평가할 수 있으며, 생체 내 타겟 단백질의 정량화에도 이용할 수 있으므로 널리 활용될 것이다.
도 1은 일 양상에 의한 형광 상관 분광법을 이용하여 형광 표지된 엑소좀을 분석하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 일 양상에 의한 형광 염료로 표지한 엑소좀을 투과전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 일 양상에 의한 형광 상관 분광법을 이용하여 각 엑소좀 샘플의 시간에 따른 형광 강도 및 형광 상관 함수를 측정한 결과이다.
도 4는 일 양상에 의한 형광 상관 분광법을 이용하여 각 엑소좀 샘플에서 하나의 엑소좀에 결합한 형광 염료의 개수를 계산한 결과이다.
도 2는 일 양상에 의한 형광 염료로 표지한 엑소좀을 투과전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 일 양상에 의한 형광 상관 분광법을 이용하여 각 엑소좀 샘플의 시간에 따른 형광 강도 및 형광 상관 함수를 측정한 결과이다.
도 4는 일 양상에 의한 형광 상관 분광법을 이용하여 각 엑소좀 샘플에서 하나의 엑소좀에 결합한 형광 염료의 개수를 계산한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 엑소좀의 분리
치료용 엑소좀은 ㈜엑소코바이오에서 제공받아 수행하였다. 구체적으로, 지방 줄기세포를 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신(Thermo Fisher Scientific; Carlsbad, CA)을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 배지를 무혈정배지로 교환하고 24시간 내지 48시간 동안 배양하면서 지방 줄기세포로부터 엑소좀 분비 배양액을 분리하였다. 분리한 엑소좀 분비 배양액으로부터 세포 잔해 및 기타 큰 입자는 원심 분리 및 0.22 μm 여과를 통해 제거하였으며, 300 kDa 또는 500 kDa의 분자량 cut-off 필터를 통해 정제하였다.
실시예 2. 엑소좀의 정량
엑소좀의 정량을 위해 642 nm 레이저가 장착된 NanoSight NS300 (Malvern Instruments, Malvern, United Kingdom)을 분석에 사용하였다. 희석된 엑소좀을 분석하기 위해 카메라 레벨을 14로 유지하고 10초 간격으로 30개 비디오를 초당 30 프레임의 속도로 촬영하였다. 크기 분포에서 통계적으로 중요하지 않은 피크를 방지하기 위해 최소 2,000개의 입자를 추적하고 분석하였다. 데이터는 NTA 3.0 소프트웨어로 분석하였다.
실시예 3. 엑소좀의 형광 염료 표지 및 관찰
실시예 2에 기재된 방법으로 정량하여 2Х109개의 엑소좀을 포함하는 용액에 NHS ester(N-hydroxysuccinimide ester; BioActs사) 형광 염료를 각각 0.1 mg, 0.05 mg씩 처리하였다. 일반적으로, 엑소좀을 형광 염료 표지하는 경우 NaHCO3을 첨가하여 알칼리성(예를 들어, pH 8-9) 조건을 유지하여 형광 염료 표지 효율을 높인다. 하지만, pH 조건이 엑소좀 형광 염료 표지 효율에 미치는 영향을 확인하기 위해 NaHCO3을 처리하지 않은 샘플을 포함하여 다음과 같은 샘플을 준비하였다.
| NaHCO3 처리 여부 | 형광 염료 농도 | |
| 샘플 1 | O | 0.1 mg |
| 샘플 2 | X | 0.1 mg |
| 샘플 3 | O | 0.05 mg |
형광 염료 표지한 엑소좀의 구조 변화을 관찰하기 위하여 투과 전자 현미경(TEM)으로 촬영하여 이미지를 수득하였다(도 2).
실시예 4. 형광 염료 표지된 엑소좀의 형광 상관 분광법을 이용한 분석
형광 상관 분광(Fluorescence correlation spectroscopy, FCS) 측정이 가능한 LSM780 공초점 현미경(Carl Zeiss사)과 대물 렌즈(objective lens; C-Apo 40 X/1.2 NA Water immersion)을 선택하였다. 실시예 3에서 준비한 실험군 1 내지 4의 형광 표지된 엑소좀 용액 2 ㎕를 각각 confocal microscopy 전용 8-well chambered coverglass(LabTek사)에 넣어준 후, LSM780 스테이지에 장착하였다.
헬룸 네온 레이저(helium-neon laser) 633 nm의 출력을 0.2%로 설정하고, emission filter band(grating 가변형)는 650-700 nm로 조정하여 GaAsp 검출기로 10초 동안 10회 이상 반복 측정하였다.
3회 측정으로 얻어진 형광 상관 함수(fluorescence auto-correlation function)를 3차원 two-component 모델식을 이용하여 분석하였다. 각 실험군의 시간에 따른 형광 강도 변화 및 형광 상관 함수는 도 2에 나타낸 바와 같다. 이를 통하여, 염색이 된 형광 엑소좀과 free dye를 구분하여 절대농도 및 상대적 농도비를 산출하고, 염색된 엑소좀의 크기 및 단일 분자 당 형광 세기(brightness)를 측정하였다.
측정한 단일 엑소좀 당 형광 세기(cpm) 값을 free dye의 형광 세기(cpm) 값으로 나눈 결과, 단일 엑소좀 당 결합한 형광 염료의 개수를 계산할 수 있었다. 그 결과는 표 2에 기재된 바와 같다(도 3).
| 단일 엑소좀 당 결합한 형광 염료의 개수 | |
| 샘플 1 | 27개 |
| 샘플 2 | 14개 |
| 샘플 3 | 25개 |
이를 통하여, 알칼리성 조건에서 형광 염료의 농도가 높을수록, 엑소좀의 형광 염료 표지 효율이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
Claims (16)
- 형광 염료가 표지된 세포외소포체(extracellular vesicle) 분자를 제공하는 단계;
상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자 및 상기 형광 염료 분자에 대하여 형광 상관 분광법(Fluorescence correlation spectroscopy, FCS)을 수행하여 상기 각각의 분자의 휘도(brightness)를 결정하는 단계; 및
형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자의 휘도 대비 형광 염료 분자의 휘도 값을 결정하여 1개의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료 분자의 개수를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 형광 상관 분광법은 형광 염료로 표지된 세포외소포체 분자를 포함하는 샘플에 여기(excitation) 레이저를 조사한 후, 발생하는 형광 신호를 검출기로 측정하여 형광 상관 함수를 도출하는 단계; 상기 형광 상관 함수를 분석하는 단계; 및 상기 샘플의 형광 휘도 및 상기 샘플에 포함된 세포외소포체 분자 개수를 이용하여 상기 세포외소포체 분자 1개 당 형광 휘도를 계산하는 단계를 포함하며,
상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자는 형광 염료가 화학적으로 표지된 것인, 세포외소포체에 표지된 형광 염료를 정량화하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 분자의 휘도는 Hz 단위로 표시되는 것이고, 특정 분자의 절대값인 것인 방법. - 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 1개의 세포외소포체 당 표지된 형광 염료 분자의 개수 값은 정수이고, 정수가 아닌 경우 소수점 첫째 자리에서 반올림된 정수를 결정하는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자는 서로 다른 휘도 값을 갖는 복수 개의 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자인 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상이한 조건의 변수를 갖는 분자의 휘도를 결정하여 상관 관계 함수를 도출하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 상이한 조건의 변수는 세포외소포체의 크기, 또는 개수, 세포외소포체에 처리된 형광 염료의 농도, 및 세포외세포체에의 형광 염료의 표지에 영향을 미칠 수 있는 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 형광 염료는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 형광 염료는 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(N-Hydroxysuccinimide ester, NHS ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids) 및 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 반응 유도체인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 세포외소포체 분자는 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicle), 인트라루미날 소포체 (intraluminal vesicle), 다중 소포체(multi vesicular body), 다중 소포 엔도좀(multivesicular endosome) 및 엔도좀 또는 원형질막에서 분리된 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 삭제
- 청구항 1의 방법을 통해 미리 결정된 복수의 군의 특정 농도의 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자의 휘도 값에 대한 상관 관계 함수에 미지의 시료의 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자의 휘도 값을 대입하여 상기 미지의 시료의 세포외소포체 분자를 정량화하는 단계를 포함하는 세포외소포체를 정량화하는 방법.
- 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 처리된 또는 투여된 후보물질을 포함하는 세포외소포체 또는 후보물질인 세포외소포체를 청구항 1 또는 청구항 13의 방법을 이용하여 평가하는 단계를 포함하는 치료제 후보물질을 평가하는 방법.
- 생체 내 타겟 단백질을 검출하는 방법으로서,
상기 타겟 단백질 또는 상기 타겟 단백질과 결합하는 단백질을 발현하는 세포주로부터 분리되고, 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자를 제공하는 단계;
상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자에 대하여 형광 상관 분광법(Fluorescence correlation spectroscopy, FCS)을 수행하여 처리된 형광 염료의 농도에 따라 1개의 세포외소포체 분자당 표지된 형광 염료의 개수를 정량화하는 단계; 및
타겟 단백질을 포함하는 분리된 생물학적 시료를 상기 표지된 형광 염료의 개수가 조절되고, 정량화된 세포외소포체 분자와 결합시킨 후 형광을 검출하는 단계를 포함하고,
상기 형광 상관 분광법은 형광 염료로 표지된 세포외소포체 분자를 포함하는 샘플에 여기(excitation) 레이저를 조사한 후, 발생하는 형광 신호를 검출기로 측정하여 형광 상관 함수를 도출하는 단계; 상기 형광 상관 함수를 분석하는 단계; 및 상기 샘플의 형광 휘도 및 상기 샘플에 포함된 세포외소포체 분자 개수를 이용하여 상기 세포외소포체 분자 1개 당 형광 휘도를 계산하는 단계를 포함하며,
상기 형광 염료가 표지된 세포외소포체 분자는 형광 염료가 화학적으로 표지된 것인, 생체 내 타겟 단백질을 검출하는 방법. - 타겟 단백질 또는 상기 타겟 단백질과 결합하는 단백질을 발현하는 세포주로부터 분리되고, 형광 염료가 화학적으로 표지된 세포외소포체 분자를 포함하고, 상기 형광 염료가 화학적으로 표지된 세포외소포체 분자는 청구항 1의 방법으로 표지된 형광 염료의 개수가 조절되고, 정량화된 것인, 생체 내 타겟 단백질을 검출하기 위한 키트.
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| KR1020210055917A KR102462745B1 (ko) | 2021-04-29 | 2021-04-29 | 형광 상관 분광법을 이용한 세포외소포체에 표지된 형광 염료의 정량 분석 방법 및 이의 용도 |
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Non-Patent Citations (1)
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| Giulia CORSO 등. Systematic characterization of extracellular vesicle sorting domains and quantification at the single molecule-single vesicle level ~,Journal of extracellular vesicles, 2019, vol 8.* * |
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