KR102379752B1

KR102379752B1 - X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 및 조성물

Info

Publication number: KR102379752B1
Application number: KR1020200103976A
Authority: KR
Inventors: 임상규; 류일환; 류지연
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2022-03-28
Also published as: US20220054660A1; KR20220022705A; WO2022039312A1; CN114073778A

Abstract

본 발명은 X-선 감쇠 기반 생체 이미징 기술에 관한 것으로, X-선 감쇠물질을 포함한 코어 구조체; 및 상기 코어 구조체 상에 형성되며, 생체적합성, 생체 내 비반응성을 갖는 물질로 이루어진 쉘 층을 포함하는 것을 특징으로 하여 비침습적으로 흉부 X-선에 사용되는 것과 같은 일반 X-선 촬영에 의해 간단하고, 신속하게 암 진단이 가능한 효과가 있다.

Description

X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 및 조성물{Nanoparticles and compositions for biological imaging based on X-ray attenuation}

본 발명은 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 기술에 관한 것이다.

암의 발병률과 사망률은 꾸준히 증가하고 있으며, 암은 전세계적으로 기대 수명을 늘리는 데 있어 주요 장벽 중 하나이다. 암의 조기 진단은 치료 가능성을 높이고 대부분의 암, 특히 공격적이거나 초기 증상이 없는 암에 대한 생존율을 향상시킨다. 자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 초음파 이미징과 같은 비침습적 영상 기술이 암 진단에 없어서는 안되나, 이들은 긴 시간, 높은 방사선 노출과 낮은 해상도 등과 같은 문제점이 있다. 또한, 이러한 단층 촬영 기술은 종양의 형태가 건강한 조직의 형태와 유사하면 명암(contrast) 문제 때문에 사용이 상당히 제한된다. 따라서 이러한 기술로 췌장암과 결장암과 같은 암에서 발생하는 초기 또는 미묘한 변화를 감지할 수 없다는 문제점이 있어왔다.

이에, 암에 특이적으로 결합하도록 설계된 형광 분자 또는 나노입자(Nano Particle; NP)와 함께 비침습적 광학 이미징을 사용하는 기술이 꾸준히 발전하고 있다. 근적외선 (NIR), 특히 2 차 근적외선 (NIR-II, 900 - 1700nm)을 사용한 형광 이미징에는 가시적 또는 자외선(UV)에 비해 조직 흡수, 산란 및 자가 형광이 감소되었기 때문에 조직 침투가 길고, 시간적 및 공간적 분해능이 향상되었다. 그러나, 흡수 및 방출광의 제한된 침투 깊이 및 깊이와 해상도 사이의 타협과 같은 형광 기반 접근법의 본질적인 문제는 피할 수 없다는 문제점이 있다. 또한, 생체독성, 낮은 양자 수율 및 불충분한 검출 시스템에 대한 문제로 임상 채택을 제한하고 있다.

그러나, X-선 기반 이미징은 빠르고, 사용하기 쉬우며 침투 깊이에 거의 제한이 없다. 특히 CT와 같은 다른 X-선 기술과 비교하여 흉부 X-선에 사용되는 것과 같은 일반 X-선 이미징은 비용이 적게 들고, 방사선에 대한 노출이 적으며 접근성이 더 쉽다는 추가 이점이 있다.

따라서, 비침습적으로 일반 X-선 검사로 종양의 조기 진단을 포함한 실시간 생체 내 이미징을 할 수 있는 나노입자 개발 및 이를 이용한 생체 내 이미징 기술에 대한 연구가 필요한 실정이다.

1. Nat. Biomed. Eng. 1, 697-713 (2017)(2017.09.12. 공개)

본 발명의 목적은 일반 X-선 촬영을 통해 비침습적으로 생체 내 이미징 할 수 있는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자를 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자를 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 X-선 감쇠물질을 포함한 코어 구조체; 및 상기 코어 구조체 상에 형성되며, 생체적합성, 생체 내 비반응성을 갖는 물질로 이루어진 쉘 층을 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자를 생체시료와 반응 시키는 단계; 및 X-선 촬영에 의해 이미지를 관측하는 단계를 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 X-선 감쇠물질 전구체 용액을 제조하는 단계(제 1단계); 상기 제 1단계의 용액을 코어 전구체 용액에 첨가하여 코어 구조체를 제조하는 단계(제 2단계); 상기 제 2단계의 코어 구조체를 어닐링하는 단계(제 3단계); 및 상기 제 3단계의 어닐링된 코어 구조체를 쉘 전구체 용액에 첨가하여 코어 전구체-쉘 층을 갖는 나노입자를 제조하는 단계(제 4단계); 를 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 X-선 감쇠 기반 실시간 생체 이미징용 나노입자는 공-합성에 의해 빠르게 제조될 수 있으며, 생체 내 안전성 및 안정성이 우수하다.

또한, 비침습적으로 흉부 X-선에 사용되는 것과 같은 일반 X-선 촬영에 의해 간단하고, 신속하게 암 조기 진단 등과 같이 실시간 생체 이미징이 가능한 효과가 있다.

도 1은 브롬화세슘납(CPB) 양자점(QD) 신틸레이터를 사용하여 암의 일반 X-선 이미징을 나타낸 도면으로, (A) 일반 X-선 검사에 의한 암 검출의 개략도, (B) CPB-SiO₂@SiO₂-Ab 나노입자(NP)의 구조, (C 및 D) 상이한 배율에서 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(SiO₂ NP에 포함된 CPB QD는 (C)에서 녹색 화살표로 표시), (E) UV 조사 및 일광(삽입 도면) 하에서의 CPB-SiO₂@SiO₂ NP 분말 사진을 나타냈다.
도 2는 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 분광학적 조사 결과를 나타낸 도면으로, (A 내지 C) 150 ℃에서 2 시간 동안 어닐링 전, 후 CPB-SiO₂ NP의 FT-IR 스펙트럼(A), O 1s 전자에 대한 X-선 광전자 스펙트럼 (B 및 C), (D) 어닐링 전, 후의 Si-OH 관련 분광 강도의 비교, (E 및 F) 수성 CPB-SiO₂@SiO₂ NP 용액 (1 mg / ml)에 대한 시간에 따른 유도 결합 플라즈마(ICP) 측정(E) 및 광발광(PL) 강도(F)에 의해 분석된 Pb 농도의 변화를 나타냈다.
도 3은 CPB-SiO₂ NP의 분광학적 조사 결과로, 150 ℃에서 2 시간 동안 어닐링되거나 되지 않은 CPB-SiO₂ NP를 포함하는 수용액 (1 mg / ml)에 대한 시간에 따른 상대적인 광발광(PL) 강도를 나타낸 도면이다.
도 4는 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 형태 및 형광 특성을 나타낸 도면으로, (A, B) 상이한 배율에서 촬영한 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지, (C) CPB-SiO₂ NP 및 CPB-SiO₂@SiO₂ NP 용액의 광발광(PL) 스펙트럼을 나타냈다.
도 5는 X-선 광전자 분광법(XPS) 측정 결과를 나타낸 도면으로, CPB-SiO₂@SiO₂ NP 증착막에 대한 O 1s, Si 2p 및 Pb 4f 코어 전자의 원자 함량 변화를 에칭 시간(막 깊이)의 함수로 플롯(plot)하였다.
도 6은 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 X-선 감쇠 특성을 나타낸 도면으로, (A) 다양한 튜브 전위에서 촬영한 CPB-SiO₂@SiO₂NP의 X-선 이미지(NP를 포함하는 실린더의 두께는 왼쪽에서 오른쪽으로 0.5, 1.0 및 2.0 cm임.), (B) 50kVp의 튜브 전위에서 촬영한 근육과 뼈 아래에 위치한 NP의 X-선 이미지(두께는 왼쪽에서 오른쪽으로 0.5, 1.0 및 2.0cm임.), (C) 근육과 뼈 아래에 배치된 소량 NP의 X-선 이미지(튜브 전위는 50kVp이며, NP의 양은 왼쪽에서 오른쪽으로 1, 3, 5, 10 및 20mg임.), 명암 해상도 및 SNR 값도 제공되었다.
도 7은 CPB-SiO₂@SiO₂NP의 생체 외 세포 흡수 및 생체 내 X-선 암 영상화를 나타낸 도면으로, (A) 24 시간 동안 0.5 mg / mL CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP (CPB-S@SiO₂로 표시)로 처리된 Panc-1 세포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 이미지(세포의 핵을 DAPI(청색)로 염색하고, NP를 녹색으로 식별함.) (B) 24 시간 동안 다양한 농도의 CPB-S@SiO₂-Ab NP로 처리된 Panc-1 세포의 광발광(PL)으로 분석된 세포 흡수 효율, (C) 1.0 mg / ml CPB-S@SiO₂-Ab NP 용액의 PL 스펙트럼 및 이 용액으로 처리된 Panc-1 세포, (D) WST-1 분석에 의해 분석된 세포 생존율(세포를 다양한 농도의 CPB-S@SiO₂-Ab NP로 처리함, 오차 막대는 평균 ± S.D를 나타냄. (n = 3)). (E) CPB-S@SiO₂-Ab NP (2 mg / kg)의 정맥 내 주사 2 시간 후, 췌장 종양을 가진 마우스의 생체 내 사진, X-선 및 X-선 및 형광 오버레이 이미지(노란색 원은 췌장 종양이 자란 부위를 나타냄), (F) NP (10 mg / kg) 주사 후, 다양한 시점에서의 실시간 생체 내 X-선 및 X-선 및 형광 오버레이 이미지(흰색 화살표는 종양 부위를 나타냄.)를 나타냈다.
도 8은 주입된 CPB-S@SiO₂-Ab NP의 생체분포를 나타낸 도면으로, (A, C) CPB-S@SiO₂-Ab NP 주입 후 2 시간 (A) 및 10 일 (C)에 해부된 다양한 장기의 생체 외 형광 영상, (B) NP 주사 2 시간 후에 마우스로부터 해부된 장기와 NP 주사 없이 마우스로부터 해부된 장기의 상대적인 형광 강도를 나타냈다(오차 막대는 평균 ± S.D를 나타냄, n = 그룹 당 마우스 3 마리).
도 9는 CPB-S@SiO₂-Ab NP의 독성 평가를 나타낸 도면으로, CPB-S@SiO₂-Ab NP로 처리 및 처리되지 않은 생쥐의 장기(간, 비장, 위, 장, 신장 및 고환)의 헤마톡 실린 및 에오신(H & E) 염색의 현미경 이미지를 나타냈다(스케일 바 = 200 um).
도 10은 체중 변화에 따른 CPB-S@SiO₂-Ab NP의 독성 평가를 나타낸 도면으로, CPB-S@SiO₂-Ab NP (10 mg / kg)를 주사한 마우스와 대조군 마우스에 대해 14 일에 걸쳐 체중을 측정한 결과를 나타냈다(오차 막대는 평균 ± S.D를 나타냄, n = 그룹 당 마우스 3 마리).
도 11은 할로겐 조성에 따른 여러 종류의 CsPbX₃-SiO₂@SiO₂ NP 분말 합성 결과를 나타낸 도면으로, (A) UV 조사 하에서의 각 분말 사진과 (B) 각 분말의 광발광 측정 결과를 나타낸 도면이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 생체 안전성 및 안정성이 우수한 브롬화세슘납(CsPbBr₃, CPB) 페로브스카이트 양자점(QD)과 같은 X-선 감쇠물질을 포함하는 나노입자를 제조하였으며, 이는 일반 X-선 촬영만으로 양자점의 X-선 감쇠 반응에 의해 암을 이미징할 수 있어 암 조기 진단에 유용하게 이용될 수 있을 뿐 아니라, 생체 내 이미징을 가능하게 함을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 X-선 감쇠물질을 포함한 코어 구조체; 및 상기 코어 구조체 상에 형성되며, 생체적합성, 생체 내 비반응성을 갖는 물질로 이루어진 쉘 층을 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자를 제공한다.

이때, 상기 X-선 감쇠물질은 평균 직경 5 내지 15 nm 크기의 양자점(quantum dot) 물질인 ABX₃ 페로브스카이트 구조 물질을 포함하고, 상기 쉘 층은 SiO₂, TiO₂, ZnO, ZrO₂ 및 Al₂O₃로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되어 포함할 수 있다.

(상기 A는 Ti, Sr, Ca, Cs, Ba, Y, Gd, La, Fe 및 Mn으로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 B는 Pb, Sn, Cu, Ni, Bi, Co, Fe, Mn, Cr, Cd, Ge 및 Yb로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 X는 I_yBr_(1-y), I_yCl_(1-y) 및 Br_yCl_(1-y) (0≤y≤1)로 이루어진 군에서 선택됨.)

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 X-선 감쇠 양자점(quantum dot) 물질을 SiO₂로 캡슐화하여 분해 또는 방출되는 것을 완전히 방지할 수 있다.

또한, 상기 쉘 층은 표면상에 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 헥산, 지질, 코펙터, 탄수화물 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 표적화제를 더 구비한 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 표적화제는 나노입자의 흡수율을 높일 수 있으며, 생체 내 세포 또는 조직 등의 생체 시료에 특이적으로 타겟하여 결합할 수 있다. 또한, 상기 항체는 암세포만을 특이적으로 표적하여 암세포에 결합되는 것이라면 어떠한 항체라도 모두 가능하다.

또한, 상기 암세포는 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양 및 뇌종양으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 본 발명에 따라 일반 X-선 촬영에 의한 X-선 감쇠에 의해 나타나는 변화로 암을 진단할 수 있으므로 통상의 기술자에게 알려진 모든 암세포를 진단할 수 있다.

또한, 상기 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자를 생체시료와 반응 시키는 단계; 및 X-선 촬영에 의해 이미지를 관측하는 단계를 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 나노입자에 결합된 암-특이적 표적화제인 항체는 나노입자를 암세포에 부착시키고, 여기에 X-선을 조사하면 브롬화세슘납 양자점 신틸레이터에 의해 암세포를 투과하는 X-선 광자의 양을 상당히 감소시켜 X-선 감쇠 또는 브롬화세슘납 양자점 신틸레이터의 형광 발광 특성으로 인해 종양 위치에는 밝게 또는 형광이 발하여 암을 진단할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 나노입자 제조방법은 SiO₂ NP 내부에 CPB QD, 즉 QD와 NP의 빠른 공-합성을 위해 새롭고 효과적인 합성방법으로, 이러한 빠른 공-합성으로 인해 CPB QD가 분해되기 전에 SiO₂ NP 내부에 갇히게 될 수 있다.

이때, 상기 X-선 감쇠물질 전구체는 브롬화납(PbBr₂), 브롬화세슘(CsBr), 요오드화세슘(CsI), 염화세슘(CsCl) 및 염화납(PbCl₂)으로 이루어진 군에서 선택되어 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 X-선 감쇠물질 전구체 용액은 염기성 촉매, 구체적으로 암모니아 촉매를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 코어 전구체 또는 쉘 전구체는 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate) 및 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 어닐링은 100 내지 200 ℃에서 1 내지 3시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하며, 이러한 어닐링 공정에 의해 나노입자 표면의 하이드록실기를 감소시킴으로써 안정성이 증진되었다.

또한, 상기 코어 전구체-쉘 층을 갖는 나노입자의 쉘 층에 표적화제를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 코어 전구체-쉘 층을 갖는 나노입자의 쉘 층에 표적화제를 결합시키는 단계는 상기 나노입자를 3-아미노프로필 트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane) 및 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산 3-설포-N-하이드록시석신이미드 에스터 나트륨 염(4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt)과 반응시켜 쉘 층을 개질시키는 단계; 및 상기 개질된 나노입자와 표적화제를 콘쥬게이션(conjugation) 시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이러한 표적화제를 나노입자의 쉘 층에 결합시키는 공정에 의해 나노입자의 흡수율을 높일 수 있으며, 생체 내 세포 또는 조직 등 생체시료에 특이적으로 타겟하여 결합할 수 있다.

또한, 본 발명은 브롬화세슘납(CsPbBr₃, CPB) 페로브스카이트 양자점(QD) 신틸레이터를 사용하여 생체 내 세포 또는 조직 등 어디에나 감지할 수 있는 새롭고 효과적인 X-선 감쇠 기반 생체 이미징 방법을 제공한다. CPB 페로브스카이트 QD는 입사 X-선 광자를 우수한 공간 분해능으로 가시적인 발광으로 변환할 수 있는 뛰어난 능력을 가지고 있다. 그러나 수분에 대한 안정성이 떨어지고, 독성 Pb 화합물을 방출할 가능성 때문에 사용이 제한되었다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, CPB QD이 박혀진 이산화규소(SiO₂) 코어 / 쉘 나노입자(Nano Particle;NP)를 도입하여 안정성 문제를 해결하였다. 코어 부분은 CPB QD 및 SiO₂ NP의 신속한 공-합성에 의해 형성되었다; 쉘 부분은 QD가 방출되거나 분해되는 것을 완전히 방지하기 위해 합성된 코어 NP 외부에 추가 SiO₂ 층을 성장시킴으로써 형성되었다. 이어서, 암세포 표면 부착 수용체를 표적으로 하는 항-CD44 항체(Ab)를 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 표면에 접합시켰다. CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 소량(QD 기준으로 2.8 ㎍)을 대략 5 mm 크기의 췌장 종양을 갖는 마우스에 정맥 내 주사하였다; 그런 다음 일반 X-선 이미지를 촬영하였다. 종양 부위에서 CPB QD의 강한 X-선 감쇠(attenuation)로부터의 밝은 백색 반점(spot)은 점차 강렬해져 주사 2 시간 후에 가장 높은 명암에 도달했다. 또한, CPB QD의 안정성, X-선 감쇠 특성 및 임상 적용을 위한 QD-함유 SiO₂ NP의 생체 분포 및 독성을 평가하였다.

일반 X-선 검사에 의한 암의 생체 내 영상화를 위한 기본 전략은 도 1A 및 1B에 도시되었다. X-선 섬광 CPB QD를 함유하는 SiO₂ NP는 정맥 내(IV) 주사를 통해 이종 이식 마우스에 도입되었다. NP 상에 접합된 암-특이적 항체는 NP를 암 세포에 부착시키고, 내부의 X-선 섬광 QD는 X-선 조사 동안 암세포를 투과하는 X-선 광자의 양을 상당히 감소시켜 이미징 동안 암 영역이 밝게 보였다. 이로써 본 발명은 일반 X-선 검사에 의해 암의 생체 내 이미징을 가능하게 하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<참고예> 재료

브롬화납(PbBr₂, 99.999 %), 브롬화세슘(CsBr, 99.999 %), 올레산(oleic acid; OA, 90 %, technical grade), 올레일 아민(oleyl amine; OLA, 70 %, technical grade), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate; TMOS, 98 %) , 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate; TEOS, 98 %, 시약 등급), 3-아미노프로필 트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane; APTES, 99 %) 및 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide; NH₄OH, 28 %), 항-CD44 (토끼에서 생산된 항체), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산 3-설포-N-하이드록시석신이미드 에스터 나트륨 염(4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt; sulfo-SMCC) 및 2-머캅토-에틸-아민 하이드로클로라이드(2-mercaptoethylamine hydrochloride; 2-MEA, ≥98 %)를 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)로부터 구입하여 수령한대로 사용했다. N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide; DMF, 99.5 %), 톨루엔(toluene, 99.7 %) 및 무수 에탄올(anhydrous ethanol, 99.8 %)을 DAEJUNG에서 구입하여 추가 정제 없이 사용했다.

< 실시예 1> CsPbBr ₃ -SiO ₂ @SiO ₂ NP의 합성

먼저, CPB 전구체 용액은 0.3 g PbBr₂, 0.17 g CsBr, 1.2 ml OLA 및 3.6 ml OA를 20 ml DMF에 첨가하고 혼합물이 투명해질 때까지 90 ℃에서 교반함으로써 제조하였다. 이후, 28 % NH₄OH 수용액 촉매를 CPB 전구체 용액에 천천히 첨가하였다. 이러한 암모니아를 포함하는 CPB 전구체 용액 2 ㎖를 400 ㎕ / 100 ㎖ TMOS / 톨루엔 용액에 빠르게 주입한 후, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 합성된 CPB-SiO₂ NP를 원심분리를 사용하여 수집하고, 에탄올로 3 회 세척하였다. 얻어진 분말을 150 ℃에서 2 시간 동안 어닐링하여 표면 하이드록실기를 제거하였다. 1.2 ㎖ / 40 ㎖ TEOS / 에탄올 용액에 NP를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음, 4 ㎖ 28 % NH₄OH 용액을 주입함으로써, 어닐링된 CPB-SiO₂ NP 상에 추가의 SiO₂ 층을 형성하였다. 실온에서 20 시간 동안 교반한 후, 합성된 CPB-SiO₂@SiO₂ NP를 원심분리로 수집하고, 에탄올로 3 회 세척 하였다.

< 실시예 2> CsPbI ₂ Br ₁ -SiO ₂ @SiO ₂ NP의 합성

전구체 용액은 0.2212g PbI₂, 0.08376g PbBr₂, CsI 0.1248g, CsBr 0.068g, 1.2ml OLA 및 3.6ml OA를 20ml DMF에 첨가하고, 혼합물이 투명해질 때까지 90 ℃에서 교반함으로써 제조하였다. 이후, 28 % NH₄OH 수용액 촉매를 CsPbI₂Br₁ 전구체 용액에 천천히 첨가하였다. 이러한 암모니아를 포함하는 CsPbI₂Br₁ 전구체 용액 2 ㎖를 1600 ㎕ / 100 ㎖ TMOS / 톨루엔 용액에 빠르게 주입한 후, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 합성된 CsPbI₂Br₁-SiO₂ NP를 원심분리를 사용하여 수집하고, 에탄올로 3 회 세척하였다. 얻어진 분말을 150 ℃에서 2 시간 동안 어닐링하여 표면 하이드록실기를 제거하였다. 1.2 ㎖ / 40 ㎖ TEOS / 에탄올 용액에 NP를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음, 4 ㎖ 28 % NH₄OH 용액을 주입함으로써, 어닐링된 CsPbI₂Br₁-SiO₂ NP 상에 추가의 SiO₂ 층을 형성하였다. 실온에서 20 시간 동안 교반한 후, 합성된 CsPbI₂Br₁-SiO₂@SiO₂ NP를 원심분리로 수집하고, 에탄올로 3 회 세척 하였다.

< 실시예 3> CsPbBr ₂ Cl ₁ -SiO ₂ @SiO ₂ NP의 합성

전구체 용액은 0.0134g CsCl, 0.2936g PbBr₂, 1.2ml OLA 및 3.6ml OA를 20ml DMF에 첨가하고, 혼합물이 투명해질 때까지 90 ℃에서 교반함으로써 제조하였다. 이후, 28 % NH₄OH 수용액 촉매를 CsPbBr₂Cl₁ 전구체 용액에 천천히 첨가하였다. 이러한 암모니아를 포함하는 CsPbBr₂Cl₁ 전구체 용액 2 ㎖를 400 ㎕ / 100 ㎖ TMOS / 톨루엔 용액에 빠르게 주입한 후, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 합성된 CPB-SiO₂ NP를 원심분리를 사용하여 수집하고, 에탄올로 3 회 세척하였다. 얻어진 분말을 150 ℃에서 2 시간 동안 어닐링하여 표면 하이드록실기를 제거하였다. 1.2 ㎖ / 40 ㎖ TEOS / 에탄올 용액에 NP를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음, 4 ㎖ 28 % NH₄OH 용액을 주입함으로써, 어닐링된 CsPbBr₂Cl₁-SiO₂ NP 상에 추가의 SiO₂ 층을 형성하였다. 실온에서 20 시간 동안 교반한 후, 합성된 CsPbBr₂Cl₁-SiO₂@SiO₂ NP를 원심분리로 수집하고, 에탄올로 3 회 세척 하였다.

< 실시예 4> CsPbBr ₁ Cl ₂ -SiO ₂ @SiO ₂ NP의 합성

전구체 용액은 0.0117g CsBr, 0.2225g PbCl₂, 1.2ml OLA 및 3.6ml OA를 20ml DMF에 첨가하고, 혼합물이 투명해질 때까지 90 ℃에서 교반함으로써 제조하였다. 이후, 28 % NH₄OH 수용액 촉매를 CsPbBr₁Cl₂ 전구체 용액에 천천히 첨가하였다. 이러한 암모니아를 포함하는 CsPbBr₁Cl₂ 전구체 용액 2 ㎖를 400 ㎕ / 100 ㎖ TMOS / 톨루엔 용액에 빠르게 주입한 후, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 합성된 CsPbBr₁Cl₂-SiO₂ NP를 원심분리를 사용하여 수집하고, 에탄올로 3 회 세척하였다. 얻어진 분말을 150 ℃에서 2 시간 동안 어닐링하여 표면 하이드록실기를 제거하였다. 1.2 ㎖ / 40 ㎖ TEOS / 에탄올 용액에 NP를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음, 4 ㎖ 28 % NH₄OH 용액을 주입함으로써, 어닐링된 CsPbBr₁Cl₂-SiO₂ NP 상에 추가의 SiO₂ 층을 형성하였다. 실온에서 20 시간 동안 교반한 후, 합성된 CsPbBr₁Cl₂-SiO₂@SiO₂ NP를 원심분리로 수집하고, 에탄올로 3 회 세척 하였다.

< 실시예 5> 표면 변형 및 항체 콘쥬게이션 (conjugation)

합성된 CPB-SiO₂@SiO₂ NP를 무수 에탄올에 5 mg / ㎖의 농도로 용해시켰다. 과량의 APTES를 용액에 첨가한 다음 60 ℃에서 밤새 유지하였다. CPB-SiO₂@SiO₂ NP 표면이 아민으로 기능화된 NP를 원심분리에 의해 수집하고, 2 시간 동안 실온에서 sulfo-SMCC와 반응시켰다. 별도로, 항-CD44 항체를 37 ℃에서 50mM 2-MEA와 함께 1.5 시간 동안 반응시킨 다음, 탈염 컬럼을 통해 혼합물을 통과시킴으로써 과량의 2-MEA를 분리하였다. 마지막으로, CPB-SiO₂@SiO₂ NP에 대한 항체 콘쥬게이션(conjugation)은 4 ℃에서 2 시간 동안 말레이미드-활성화된 NP 및 설프하이드릴(sulfhydryl)기를 포함하는 항체를 혼합하여 수행하였다.

< 실시예 6> 생체 외(in vitro) CPB-SiO ₂ @SiO ₂ -Ab NP의 흡수 효율

Panc-1 세포를 10 % 소태아 혈청(FBS) 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신 (Pen-Strep)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM, Gibco)에서 37 ℃, 5 % CO₂하에 밤새 배양하였다. NP의 흡수 효율을 측정하기 위해, 세포를 60-mm 접시 (1 × 10⁶ 세포)에 씨딩(seeding)하고, 다양한 NP 농도(0.1, 0.2, 0.5 및 1.0 mg / ml)의 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP를 포함하는 인산염 완충 식염수(PBS)에서 37 ℃, 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 포름알데하이드로 고정시키고, 형광 발광을 PL 분광법으로 측정하였다.

< 실시예 7> 세포 생존율 분석

세포 생존율 분석을 위해, Panc-1 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 다양한 시간 동안(24, 48 및 72 h) 다양한 농도(PBS 중 0.1, 0.2, 0.5 및 1.0 mg / ml)의 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP 용액으로 처리하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 수용성 테트라졸륨 염(WST-1) 분석(Dogen)을 사용하여 세포 생존율을 분석하였다. WST-1 용액을 각 웰에 첨가하고 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 이후, 마이크로 플레이트 리더기(BioTek)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 8> 면역 형광 분석

Panc-1 세포를 4-웰 챔버 슬라이드(웰 당 1.5 x 10⁴ cells)에 씨딩하고, 다양한 시간동안 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP 용액 (0.5 mg / mL)으로 처리하였다. 세포를 15 분 동안 4 % 파라포름알데하이드에 고정시키고, 실온에서 15 분 동안 PBS 중 0.1 % 트리톤 X-100으로 투과시킨 후, 실온에서 1 시간 동안 2 % BSA로 블로킹시켰다. 이후, 세포를 DAPI(Abcam)로 염색하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 분석하였다.

< 실시예 9> 마우스 이종 이식 실험 및 이미징

모든 동물 실험은 서울 성모병원 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었다. BALB/c 누드 마우스(Orient Bio)의 Matrigel에 Panc-1(3 x 10⁶ 세포)을 피하 이식했다. 종양 크기가 약 150 ± 30 mm³에 도달할 때까지 성장을 모니터링 하였다. 200 ㎕의 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP 용액 (1 mg / ml)을 꼬리 정맥에 주사하였다. 실시간 X-선 이미지를 얻기 전에, 모든 마우스를 이소플루란 및 의료용 산소로 마취시켰다. CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 생체 분포를 조사하기 위해, 마우스를 NP 주사 후, 2 시간 또는 10 일에 희생시키고 해부하였다.

< 실시예 10> 특성 분석

합성된 CPB-SiO₂ 및 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 크기 및 모양은 고해상도 투과전자 현미경(HRTEM, JEM-2100F, JEOL Ltd.) 및 전계방출 주사전자 현미경(FE-SEM, JSM- 7610F, JEOL Ltd.)으로 분석되었다. CPB-SiO₂ NP 표면의 하이드록실기의 변화는 푸리에-변환 적외선(FT-IR) 분광법(Nicolet™ iS™ 50 FTIR 분광계, Thermo Fisher) 및 X-선 광전자 분광법(XPS, PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI)으로 분석되었다. CPB-SiO₂ 및 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 PL 스펙트럼은 405 nm의 여기를 갖는 형광 분광 광도계(SM245, 코리아스펙트랄프로덕츠(주) 및 Darsa Pro-5200, PSI Co. Ltd.)를 사용하여 분석되었다. CPB-SiO₂@SiO₂ NP로부터의 원소 납의 방출은 유도성 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS, NexION 350D, Perkin-Elmer SCIEX)에 의해 검출되었다. 생체 내(in vivo) 형광 및 X-선 이미지는 광학 생체 내 이미징 시스템-IVIS Lumina XRMS (PerkinElmer Inc.)로 얻었다. 종양 및 주요 장기를 해부하고, 즉시 10 % 포르말린에 24 시간 동안 고정시킨 후, 이들의 이미지를 동일한 IVIS Lumina XRMS로 촬영 하였다. 현미경 평가를 위해, 조직을 파라핀에 넣고, 절편화 하였으며(두께 : 5-15 μm), 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하였다.

< 실험예 1> CsPbX ₃ -SiO ₂ @SiO ₂ NP의 합성

SiO₂ NP 내부에 CsPbX₃ QD, 즉 QD와 NP의 빠른 공-합성을 위해 새롭고 효과적인 합성방법을 개발했다. SiO₂ 합성을 위한 염기 촉매를 함유하는 QD 전구체 용액을 Si 전구체 용액에 신속하게 주입한 후, 염기 촉매에 의한 SiO₂ NP 합성 및 CsPbX₃ QD 의 리간드 보조 재침전(ligand-assisted re-precipitation; LARP)이 매우 짧은 시간에 동시에 발생했다. 이러한 빠른 공-합성으로 인해 CsPbX₃ QD가 분해되기 전에 SiO₂ NP 내부에 갇히게 되었다. 도 11은 할로겐 조성에 따른 여러 종류의 CsPbX₃-SiO₂@SiO₂ NP 분말 합성 결과를 나타낸 도면으로, (A) UV 조사 하에서의 각 분말 사진과 (B) 각 분말의 광발광 측정 결과를 나타냈다. 각 CsPbX₃ 양자점의 할로겐(X) 조성에 따른 분자식은 CsPbI₂Br₁ (RED), CsPbBr₃ (GREEN), CsPbBr₂Cl₁ (CYAN), CsPbBr₁Cl₂ (BLUE)와 같으며 X의 변화에 따라 고유의 광발광을 나타냈다. 또한, 150 ℃ 에서의 후-어닐링은 표면 하이드록실기를 상당히 감소시켰으며, 이는 FT-IR 스펙트럼에 나타난 바와 같이, 950 cm^-1에서 Si-OH 신장(stretching) 피크의 감소로 확인할 수 있다(도 2A). 또한, O 1s 전자의 결합 에너지 영역에서의 XPS 측정에서도 표면 하이드록실기의 감소를 보여 주었다(도 2B 및 2C). 이는, FT-IR 결과와 일치하며, 어닐링 후 533.2 eV에서 Si-OH 관련 O 1s 피크 면적이 76.4 %로 감소되었다(도 2D). 이렇게 어닐링 공정을 통해 감소된 하이드록실기의 수는 시간에 따른 광 발광(PL) 강도의 변화에 의해 나타낸 바와 같이, 내부의 CPB QD의 안정성에 기여하였다(도 3). 어닐링되지 않은 CPB-SiO₂ NP는 350 시간 후에 초기 PL 강도의 1/5에 도달하여 PL 특성을 빠르게 잃었다. 이후, 어닐링된 CPB-SiO₂ NP는 CPB QD의 방출 또는 분해를 차단하기 위해 추가 SiO₂ 층의 성장에 의해 다시 한번 캡슐화되었다. TEM 이미지는 결과는 CPB-SiO₂@SiO₂ 코어-쉘 구조를 명확하게 보여주었다(도 1C 및 1D). CPB-SiO₂ 코어의 평균 직경은 100 nm이고 SiO₂ 쉘 층의 두께는 약 26 nm였다. 8 - 11 nm 크기의 CPB QD는 도 1C에 화살표로 표시된 것처럼 확대된 TEM 이미지에서 명확하게 관찰되었다. 합성된 NP의 UV 조사에서 관찰되는 512nm 파장의 녹색 방출은 4 - 15nm 크기 CPB QD의 특성으로, 이 파장의 방출은 QD가 SiO₂ NP 내에서도 PL 특성을 잘 나타냄을 나타낸다(도 1E 및 도 4).

<실험예 2> CPB-SiO ₂ @SiO ₂ NP의 안전성 및 안정성

스핀코팅된 NP 박막의 깊이 프로파일 XPS 측정에 의해 CPB-SiO₂@SiO₂ NP에 포함된 CPB QD의 양을 측정하였다(도 5). 에칭 직후, Si, O 및 Pb 원자의 원자 함량은 각각 31.1 %, 68.8 % 및 0.046 %로 거의 일정해졌으며, 이는 Pb 원자의 총량이 NP 1g 당 약 0.5mg임을 나타낸다. 이는 본 발명에서 IV 주입된 NP의 양 (200 μg) 중 Pb의 질량은 단지 1μg 에 불과함을 의미한다. 더구나, NP 내의 CPB QD에 의해 야기되는 혈중 납 함량은 QD가 NP 내부에서 매우 안정적이기 때문에 이보다 훨씬 적을 것이다. 도 2E는 CPB-SiO₂@SiO₂ NP 수용액 (1 mg / ml)에 대한 유도 결합 플라즈마(ICP) 측정으로부터 측정된 시간에 따른 Pb 농도의 변화를 보여준다. 용액에서 검출된 Pb 농도는 14일 후에도 단지 0.2 ppb (0.02 ㎍ / dl)였으며, 이는 Pb 또는 Pb 관련 화합물이 NP에서 극소량만 방출됨을 나타낸다. 관찰된 Pb 함량은 세계 보건기구 (WHO)와 질병 통제 예방 센터(CDC)가 권장하는 최대 혈중 납 농도인 성인의 경우 10 ㎍ / dl, 어린이의 경우 5 ㎍ / dl 보다 훨씬 낮게 나타났다. NP에서 CPB QD의 안정성은 PL 측정에 의해서도 확인되었다(도 2F). 1.0 mg / ml CPB-SiO₂@SiO₂ NP 용액의 PL 강도는 5 일 동안 거의 변하지 않았고, 14 일 후에 초기값의 92 %로 약간 감소했다.

<실험예 3> CPB-SiO ₂ @SiO ₂ NP의 X-선 감쇠 특성

CPB-SiO₂@SiO₂ NP에 의한 X-선 감쇠는 임상 X-선 장비(EVA-HF520, COMED)를 사용하여 평가되었다. 40, 50, 60 kVp (피크 kV)의 다양한 X-선 튜브 전위에서 NP가 0.5, 1.0 및 2.0 cm 두께로 들어 있는 플라스틱 용기의 방사선 사진을 얻었다(도 6A). X-선 빔 강도 및 소스 이미지 거리(source-image distance; SID)는 각각 2 mAs 및 100 cm로 고정하였다. 샘플 두께가 증가함에 따라 더 높은 X-선 감쇠를 나타내는 더 밝은 이미지가 각 튜브 전위에 대해 관찰되었다. 이러한 X-선 감쇠의 관찰이 인체 내부에서도 유효하다는 것을 검증하기 위해, 무게 300g, 두께 1.5cm의 돼지 갈비를 사용한 대체 실험을 수행했다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 튜브 전압을 50kVp의 X-선 검사에서 근육 또는 뼈 아래에 위치한 CPB-SiO₂@SiO₂ NP가 명백히 확인되었다. 근육 아래에 놓인 2.0 cm 두께 NP의 명암 해상도는 0.34로, 뼈의 0.32보다 약간 더 컸다. 명암 해상도는 (S_ROI - S_muscle) / (S_ROI + S_muscle)로 정의되며, 여기서 S_ROI 및 S_muscle은 관심 영역(Region Of Interest; ROI) 및 근육의 신호 강도이다. 근육 아래 0.5 및 1.0 cm 두께 NP의 명암 해상도는 각각 0.08 및 0.18로, 2.0 cm 두께 NP의 것보다 작았지만, 육안으로 감지 가능한 최소 명암이 약 0.005 ~ 0.05 수준이므로 쉽게 구분할 수 있었다. 뼈 아래 NP를 두었을 때의 명암 해상도(0.37, 0.39 및 0.45)는 뼈만 있을 때(0.32) 보다 더 높았으며, 이는 NP와 뼈에 의한 X-선 감쇠가 더해졌기 때문이다. 신호의 표준 강도 대 표준 편차의 비로 정의된 신호 대 잡음비(signal to noise ratio; SNR)도 평가하였다. 근육 아래 0.5cm 두께의 NP를 제외한 모든 NP 시료의 SNR은 뼈의 SNR 보다 컸으며, 이는 NP가 뼈에 비해 더 균일하게 빛을 발한다는 것을 나타낸다. 이러한 모든 결과는 합성된 CPB-SiO₂@SiO₂ NP가 근육과 뼈와 같은 조직에 숨겨져 있어도 일반 X-선 영상으로 명확하게 식별될 수 있음을 나타낸다. 또한, X-선 방사선 촬영에서 인식될 수 있는 최소량을 결정하기 위해 상당히 적은 양의 NP도 테스트하였다(도 6C). 1mg NP와 근육 사이의 명암을 구별하기는 어려웠지만, 3mg (이는 10mg / kg 조직 무게에 해당함) 이상의 NP는 명확하게 구별할 수 있었다. 또한, NP의 SNR은 모두 뼈의 SNR 보다 크게 나타났다.

<실험예 4> 생체 외(in vitro) CPB-SiO ₂ @SiO ₂ NP 흡수율 및 세포 생존율 분석

췌장 세포의 CD44 표면 부착 수용체를 표적으로 하기 위해, 합성된 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 표면에 항-CD44 항체를 결합시켰다. CD44의 발현은 일반적으로 나쁜 예후와 관련이 있기 때문에, CD44는 췌장암의 중요한 예후 마커 및 치료 표적이다. 항-CD44 항체는 말레이미드-활성화된 NP 표면을 항체상의 설피하이드릴기와 반응시킴으로써 CPB-SiO₂@SiO₂ NP의 표면에서 결합되었다. Panc-1 세포에서 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 흡수는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의해 평가되었다(도 7A). 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색된 세포의 핵은 청색 범위인 최대 461 nm에서 발광하였다. CPB QD로부터의 밝은 녹색 형광이 주로 청색 영역이 없는 곳에서 관찰되었는데, 이는 QD가 세포에서 안정하고 주로 세포질(cytosol)에 국한되어 있음을 나타낸다.

CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 흡수 효율을 검증하기 위해, Panc-1 세포를 60-mm 세포 배양 플레이트 상에 1 × 10⁶의 밀도로 씨딩하고, 24 시간 동안 유지시켰다; 이어서 추가 24 시간 동안 다양한 농도의 NP(0, 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg / ml)로 처리 한 후, 세포를 포름알데하이드로 고정시켰다. CPB QD 흡수를 나타내는 Panc-1 세포의 PL 강도는 NP의 농도가 0.5 mg / ml로 증가할 때까지 꾸준히 증가 하였지만, 그 이후에는 뚜렷한 증가는 보이지 않았다(도 7B). 1 mg / ml 용액의 경우, 76.8 %의 최대 흡수율을 나타냈다(도 7C). CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 세포 독성에 대한 연구는 암 이미징에 적용하기 위해 매우 중요하다. 도 7D는 WST-1 분석을 통해 관찰된 Panc-1 세포의 생존율에 대한 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 효과를 보여준다. NP의 모든 농도에 대해, 세포 배양 조건 하에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 세포 증식 또는 분화에 대한 다른 영향은 관찰되지 않았다. Pb 농도가 3 μM 이상일 때 세포 사멸이 알려져 있기 때문에, 이러한 비독성은 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP로부터 Pb가 거의 방출되지 않았음을 확인해 준다.

<실험예 5> 생체 내(in vivo) X-선 암 이미징

이식된 Panc-1 세포가 이종 이식 마우스에서 충분한 크기로 성장했을 때, 200 ㎕의 1 mg / ml CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP 용액을 정맥으로 주사하였다. 도 7E는 X-선 조사 하에서 이종 이식 마우스 종양 위치에서의 백색 및 녹색 표시를 명확하게 보여준다. 이는 항체-접합된 NP가 CD44 예후 마커를 성공적으로 인식하였고, 보다 중요한 것은 단순한 일반 X-선 이미징에 의해 생체 내의 암세포를 쉽게 검출할 수 있음을 나타낸다. 또한, 종양을 피부 바로 아래에서 키웠기 때문에, CPB QD의 512 nm 파장 녹색 형광도 관찰된다.

주입된 CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 실시간 생체 분포는 X-선 및 형광 이미징을 통해 모니터링되었으며, 결과는 도 7F에 나타냈다. 신호 강도는 시간이 지남에 따라 점차 증가하여 주사 2 시간 후에 최대에 도달했으며, 5 일 후, 검출 가능한 신호가 관찰되지 않았다. 생체 분포를 상세하게 조사하기 위해, NP 주사 2 시간 및 10 일 후에 해부된 다양한 장기의 형광 이미지를 촬영 하였다(도 8). 예상한 바와 같이, 주사 2 시간 후(도 8A 및 8B), 대략 5 mm 직경의 종양에서 강한 녹색 발광이 검출되었다. 형광 강도는 미처리 대조군 세포보다 4.4 배 높았다. 간과 신장에서도 약간의 형광이 관찰되었지만, 비장 및 장에서는 관찰되지 않았다. NP 주사 10 일 후에는, 어떤 장기에도 형광이 관찰되지 않았다(도 8C). 또한, CPB-SiO₂@SiO₂-Ab NP의 급성 독성을 평가하기 위해, NP-처리된 마우스로부터 다양한 장기의 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색을 수행 하였다(도 9). NP가 처리되지 않은 대조군 마우스로부터의 장기과 비교하여 조직의 형태에서 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 NP의 생체 적합성을 나타낸다. 또한 독성 평가의 기본 척도로 체중 변화를 모니터링했지만, 처리 그룹간에 유의한 체중 차이는 관찰되지 않았다(도 10).

따라서, SiO₂ NP 안에 안정적으로 가두어진 CPB QD를 이용하여 세포 독성 없이, 비침습적 일반 X-선 검사에 의해 암을 효율적으로 실시간 검출할 수 있음을 확인하였다.

Claims

나노입자 내에 X-선 감쇠물질인 복수개의 CsPbX₃양자점이 개별적으로 각각 박혀있는 형태로 이루어진 코어 구조체; 및
상기 코어 구조체 상에 형성되며, 생체적합성, 생체 내 비반응성을 갖는 물질인 SiO₂, TiO₂, ZnO, ZrO₂ 및 Al₂O₃로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 이루어진 쉘 층을 포함하며,
상기 CsPbX₃ 양자점의 평균 직경은 5 내지 15 nm 이고,
상기 X는 I_yBr_(1-y), I_yCl_(1-y) 및 Br_yCl_(1-y) (0≤y≤1)로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 CsPbX₃는 X-선 조사 동안 생체를 투과하는 X-선 광자의 양을 감소시켜 이미징 동안 암 영역이 밝게 보이도록 하는 것을 특징으로 하는, X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자.
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제 1항에 있어서,
상기 쉘 층은 표면상에 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 헥산, 지질, 코펙터, 탄수화물 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 표적화제를 더 구비한 것을 특징으로 하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자.
제 1항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 따른 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자를 유효성분으로 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 조성물.
제 1항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 따른 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자를 생체로부터 분리된 생체시료와 반응 시키는 단계; 및
X-선 촬영에 의해 이미지를 관측하는 단계를 포함하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징 방법.
X-선 감쇠물질 전구체 용액을 제조하는 단계(제 1단계);
상기 제 1단계의 용액을 코어 전구체 용액에 첨가하여 코어 구조체를 제조하는 단계(제 2단계);
상기 제 2단계의 코어 구조체를 어닐링하는 단계(제 3단계); 및
상기 제 3단계의 어닐링된 코어 구조체를 쉘 전구체 용액에 첨가하여 코어 전구체-쉘 층을 갖는 나노입자를 제조하는 단계(제 4단계); 를 포함하며,
상기 X-선 감쇠물질 전구체는 브롬화납(PbBr₂), 브롬화세슘(CsBr), 요오드화세슘(CsI), 염화세슘(CsCl) 및 염화납(PbCl₂)으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 코어 전구체 또는 쉘 전구체는 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate) 및 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제 1항에 따른 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 제조방법.
삭제
제 8항에 있어서,
상기 X-선 감쇠물질 전구체 용액은 염기성 촉매를 포함하는 것을 특징으로 하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 제조방법.
삭제
제 8항에 있어서,
상기 어닐링은 100 내지 200 ℃에서 1 내지 3시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 제조방법.
제 8항에 있어서,
상기 코어 전구체-쉘 층을 갖는 나노입자의 쉘 층에 표적화제를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 제조방법.
제 13항에 있어서,
상기 코어 전구체-쉘 층을 갖는 나노입자의 쉘 층에 표적화제를 결합시키는 단계는,
상기 코어 전구체-쉘 층을 갖는 나노입자를 3-아미노프로필 트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane) 및 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산 3-설포-N-하이드록시석신이미드 에스터 나트륨 염(4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt)과 반응시켜 쉘 층을 개질시키는 단계; 및
상기 개질된 나노입자와 표적화제를 콘쥬게이션(conjugation) 시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 X-선 감쇠 기반 생체 이미징용 나노입자 제조방법.