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KR102369898B1 - 다량체 코딩 핵산 및 그 용도 - Google Patents

다량체 코딩 핵산 및 그 용도 Download PDF

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KR102369898B1
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encoding nucleic
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프랑크 데로사
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다니엘 크로포드
스리랑 카르베
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트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 무엇보다도 생체내 및 생체외 사용에서 우수한 안정성을 보이는 다량체 코딩 핵산(multimeric coding nucleic acid)을 제공한다. 일부 구현예에서, 다량체 코딩 핵산(MCNA)은 다량체 코딩 핵산 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 3' 말단을 통해 연결된 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

Description

다량체 코딩 핵산 및 그 용도
관련 출원
본 출원은 2016년 4월 8일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/320,073호의 우선권을 주장하고, 그 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록
본 명세서는 2017년 4월 7일에 "SL_SHR-1237WO" 이름의 .txt 파일로 전자 제출된 서열 목록을 참조한다. 상기 .txt 파일은 2017년 4월 7일에 생성되었고, 49,249 바이트 크기이다. 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
핵산 기반 기술은 제한되지는 않지만, 몇 가지 예를 들면, 전령 RNA 요법, 유전자 요법 및 유전자 편집을 포함하는 다양한 치료적 적용에 있어서 점점 더 중요해진다. 이러한 치료적 적용은 일반적으로 외인성 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA 또는 RNA)의 투여를 필요로 하는데, 종종 이러한 폴리뉴클레오티드의 제한된 안정성으로 인해 제한된다. 예를 들어, 대상에 폴리뉴클레오티드를 투여한 후에, 많은 폴리뉴클레오티드가 뉴클레아제(예컨대, 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제)에 의해 분해될 수 있다. 뉴클레아제 분해는 폴리뉴클레오티드가 표적 세포에 도달하거나 전사되고/되거나 번역되는 능력에 부정적인 영향을 주고, 그 결과 외인성 폴리뉴클레오티드가 의도된 치료 효과를 발휘하지 못하게 한다.
본 발명은 무엇보다도 생체내 및 생체외 사용에서 우수한 안정성을 보이는 다량체 코딩 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 핵산 기반 요법에 있어서 복잡성 및 효율을 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 발명은 다량체 코딩 핵산(multimeric coding nucleic acid, MCNA) 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(코딩 또는 비코딩) 사이에 3' 말단 결합을 통해 하나 이상의 비코딩 폴리뉴클레오티드에 연결된 하나 이상의 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MCNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 5' 말단은 5' 말단 캡 구조를 포함하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 5' 말단을 갖는 하나 이상의 코딩 폴리뉴클레오티드는 코딩 폴리뉴클레오티드의 번역을 촉진하도록 5' 말단 캡 구조를 포함한다. 특정 구현예에서, 5' 말단 구조를 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 MCNA의 안정성을 도모하도록 5' 말단 캡 구조를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 다량체 코딩 핵산 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 3' 말단을 통해 연결된 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다량체 코딩 핵산(MCNA)을 제공한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리디옥시리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리디옥시리보뉴클레오티드 또는 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 목적 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 동일한 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 별개의 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, MCNA 화합물은 3개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 4개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 5개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상은 5' 비번역 영역(5' UTR) 및/또는 3' 비번역 영역(3' UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 5~2,000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 사이에 스페이서(spacer)가 있는 복수의 다중-A 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-A 단편 각각은 8~50개의 연속 아데노신을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 다중-A 단편은 1~100개의 범위이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 5~100의 다양한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 DNA, RNA 및/또는 변형 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 염기는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 유사매듭구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 폴리아데닐화(poly-A) 꼬리가 뒤따르지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 25~5,000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 폴리-A 결합 단백질(PABP)에 결합한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 "키싱 루프(kissing loop)" 서열 모티프를 포함한다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 3'-3' 반전 인산디에스테르 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 브릿지를 통해 결합된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 브릿지를 포함하는 뉴클레오티드는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 브릿지는 활성 부분(active moiety)에 대한 적어도 하나의 공유결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성 부분은 표적 그룹, 펩타이드, 대조 작용제, 소분자, 단백질, DNA 및/또는 RNA이다. 일부 구현예에서, 3'-3' 반전 결합에 근접한 뉴클레오티드는 하나 이상의 트리안테너리(tri-antennary) GalNac 표적 제제로 기능화된다.
일부 구현예에서, 인코딩 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 상응하는 본래(native) 염기의 1~100%를 치환한다. 일부 구현예에서, 우리딘의 적어도 25%가 2-티오우리딘으로 대체된다. 일부 구현예에서, 시티딘의 100%가 5-메틸시티딘으로 대체된다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 리보스 고리 상의 4'-티오 치환으로 더 변형된다. 일부 구현예에서, 본래의 뉴클레오티드는 리보스 고리 상의 4'-티오 치환으로 변형된다.
일부 구현예에서, MCNA의 하나 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 치료 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA의 하나 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 효소, 수용체, 리간드, 항체의 경사슬 또는 중사슬, 뉴클레아제, 및/또는 DNA-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, MCNA의 하나 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, MCNA의 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 각각 치료 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA의 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 효소, 수용체, 리간드, 항체의 경사슬 또는 중사슬, 뉴클레아제, 및/또는 DNA-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA의 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 각각 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, MCNA의 제1 인코딩 폴리뉴클레오티드는 제1 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하고 MCNA의 제2 인코딩 폴리뉴클레오티드는 제1 단백질과 동일한 단백질인 제2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA의 제1 인코딩 폴리뉴클레오티드는 제1 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하고 MCNA의 제2 인코딩 폴리뉴클레오티드는 제1 단백질과 별개인 제2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, MCNA의 제1 인코딩 폴리뉴클레오티드는 효소, 수용체, 리간드, 항체의 경사슬 또는 중사슬, 뉴클레아제, 또는 DNA 결합 단백질 종류의 제1 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하고, MCNA의 제2 인코딩 폴리뉴클레오티드는 제1 단백질과 별개이지만 제1 단백질과 같은 종류인 제2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, MCNA의 제1 인코딩 폴리뉴클레오티드는 효소, 수용체, 리간드, 항체의 경사슬 또는 중사슬, 뉴클레아제, 또는 DNA 결합 단백질 종류의 제1 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하고, MCNA의 제2 인코딩 폴리뉴클레오티드는 제1 단백질과 별개이면서 제1 단백질과 다른 종류인 제2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, MCNA의 제1 인코딩 폴리뉴클레오티드는 항체의 경사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하고 MCNA의 제2 인코딩 폴리뉴클레오티드는 항체의 중사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 다량체 핵산(multimeric nucleic acid, MNA) 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 3' 말단 결합을 통해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 5' 말단은 MNA의 안정성을 도모하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 3' 말단 결합을 통해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 각각 비코딩 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 본 발명은 전달 운반체로 캡슐화되거나 복합체화된 상기에 기술된 MCNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 전달 운반체는 리포솜, 지질 나노입자, 고형-지질 나노입자, 폴리머, 바이러스, 졸-겔, 및 나노겔로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 발명은 전달의 필요가 있는 대상에게 상기에 기술된 MCNA를 투여하는 것을 포함하는 생체내 단백질 생산을 위한 MCNA 전달 방법을 제공한다. 일부 양태에서, MCNA는 정맥내 전달, 피하(subcutaneous) 전달, 경구 전달, 진피하(subdermal) 전달, 안구 전달, 기관내 주사 폐 전달(예컨대, 분무), 근육내 전달, 경막내(intrathecal) 전달 또는 관절내 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 경로를 통해 투여된다.
상기에 기술된 모든 구현예들은 본 발명의 모든 양태에 적용되는 것으로 이해되어야 한다.
도면은 단지 예시적인 목적이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1은 3'-3' 반전 RNA 뉴클레오티드 이량체(dimer)를 통해 연결된 2개의 RNA 종을 포함하는 예시적인 MCNA를 나타낸다.
도 2는 3'-3' 반전 RNA 뉴클레오티드 이량체를 통해 연결된 2개의 RNA 종을 포함하는 예시적인 MCNA를 나타내되, 여기서 상기 MCNA는 하나의 트리안테너리 GalNac 표적 제제로 기능화된다.
도 3은 3'-3' 반전 RNA 뉴클레오티드 이량체를 통해 연결된 2개의 RNA 종을 포함하는 예시적인 MCNA를 나타내되, 여기서 상기 MCNA는 2개의 트리안테너리 GalNac 표적 제제로 기능화된다.
도 4는 MCNA의 합성에 대한 일반적인 개략도를 나타낸다.
도 5는 겔 전기영동을 통해 검출된 합성 EPO MCNA의 예시적인 결과를 나타낸다. 구조체는 다음 조건 하에서 합성되었다: RNA 리가아제 1(A); RNA 리가아제 1 + 10% PEG(B); 및 RNA 리가아제 2(C)
도 6은 겔 전기영동을 통해 검출된 합성 EPO MCNA의 예시적인 결과를 나타낸다. 레인 1은 꼬리가 없는 캐핑된(capped) EPO RNA를 나타낸다. 레인 2는 DNA분해효소(DNAse) 처리하지 않은 EPO MCNA 혼합물을 나타낸다. 레인 3은 DNA분해효소 처리한 EPO MCNA 혼합물을 나타낸다.
도 7은 hEPO mRNA(구조체 당 1 마이크로그램)를 포함하는 꼬리없는 EPO mRNA 또는 MCNA를 포함하는 합성 구조체를 가지는 HEK293T 세포의형질 주입 후 분비된 hEPO 단백질 수준에 대한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 8은 겔 전기영동을 통해 검출된 합성 EPO MCNA의 예시적인 결과를 나타낸다. 레인 1은 RNA 사다리를 함유하고, 레인 2는 정제되지 않은 EPO MCNA의 라이게이션(ligation) 산물을 함유하고, 레인 3은 정제된 미반응/부분적 반응 산물을 함유하며 레인 4는 정제된 EPO MCNA 라이게이션 산물을 함유한다.
도 9는 hEPO mRNA(구조체 당 250 나노그램)를 포함하는 꼬리없는 EPO mRNA 또는 정제된 MCNA를 포함하는 합성 구조체를 가지는 HEK293T 세포의형질 주입 후 분비된 hEPO 단백질 수준에 대한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 10은 hOTC mRNA를 포함하는 꼬리없는 hOTC mRNA(hOTC 단량체) 또는 MCNA를 포함하는 합성 구조체를 가지는 HEK293T 세포의형질 주입 후 세포 용해물에서 측정된 hOTC 단백질 활성 수준에 대한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 11은 hPAH mRNA를 포함하는 꼬리없는 hPAH mRNA(hPAH 단량체) 또는 MCNA를 포함하는 합성 구조체를 가지는 HEK293T 세포의형질 주입 후 생산된 hPAH 단백질 수준에 대한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 12는 hCFTR mRNA를 포함하는 꼬리없는 hCFTR mRNA(hCFTR 단량체) 또는 MCNA를 포함하는 합성 구조체를 가지는 HEK293T 세포의형질 주입 후 hCFTR 단백질 생산을 입증하는 예시적 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 13은 지질 나노입자에 캡슐화된 hOTC MCNA로 처리한 후 마우스의 간에서 측정된 시트룰린 생산에 대한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 14는 지질 나노입자에 캡슐화된 hOTC MCNA 또는 hOTC 단량체로 처리한 후 마우스의 간에서 검출된 hOTC 생산을 입증하는 예시적 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 15는 지질 나노입자에 캡슐화된 hOTC mRNA로 처리한 후 마우스의 간에서 측정된 시트룰린 생산에 대한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 16은 지질 나노입자에 캡슐화된 hOTC mRNA 또는 hOTC MCNA로 처리한 마우스에 투여 후 24시간에 시트룰린 생산의 백분율로서 투여 후 1주차에 시트룰린 생산과 비교한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 17은 지질 나노입자에 캡슐화된 hPAH MCNA 또는 hPAH 단량체 중 하나를 투여한 후 24시간에 PAH 넉아웃(KO) 마우스의 간에서 검출된 hPAH 단백질의 예시적 그래프를 나타낸다.
도 18은 지질 나노입자에 캡슐화된 hPAH MCNA 또는 hPAH 단량체 중 하나를 투여한 후 24시간에 PAH 넉아웃(KO) 마우스에서의 혈청 페닐알라닌 수준에 대한 예시적 그래프를 나타낸다.
도 19는 지질 나노입자에 캡슐화된 hEPO MCNA 또는 hEPO 단량체 중 하나를 투여한 후 24시간에 야생형 마우스의 혈청에서 검출된 hEPO 단백질의 예시적 그래프를 나타낸다.
도 20은 에어로졸화를 통해 지질 나노입자에 캡슐화된 hCFTR MCNA로 처리 후 24시간 및 7일차에 CFTR KO 마우스 폐에서 인간 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절인자(human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, hCFTR) 단백질의 예시적인 면역조직화학적 검출을 나타낸다.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체를 통하여 설명된다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가적인 자세한 사항을 제공하도록 본원에서 참조된 출판물 및 기타 다른 참고물은 참조로서 본원에 의해 포함된다.
아미노산: 본원에서 사용되는 바, 용어 "아미노산"은 그의 가장 넓은 의미로, 폴리펩타이드 사슬에 포함될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조인 H2N-C(H)(R)-COOH를 가진다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산은 합성 아미노산이고, 일부 구현예에서 아미노산은 D-아미노산이며; 일부 구현예에서 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 주로 자연발생 펩타이드에서 발견되는 임의의 20종의 L-아미노산을 말한다. "비표준 아미노산"은 합성하여 제조되었는지 또는 천연 원료에서 얻은 것인지에 관계없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 말한다. 본원에서 사용되는 바, "합성 아미노산"은 이에 제한되지는 않지만, 염, 아미노산 유도체(예컨대 아미드), 및/또는 치환물을 포함하는 화학적으로 변형된 아미노산을 망라한다. 펩타이드에서 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기 및/또는 활성에 부정적인 영향 없이 펩타이드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학적 작용기로 치환하는 것을 통해 변형될 수 있다. 아미노산은 이황화(disulfide) 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 예를 들어 하나 이상의 화학적 엔티티(entities)(예컨대, 메틸기, 아세테이트기, 아세틸기, 포스페이트기, 포밀 모이어티(formyl moieties), 이소프레노이드기, 설페이트기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 바이오틴(biotin) 모이어티 등)와 같은 하나 이상의 번역후 변형을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호교환적으로 사용되고, 자유 아미노산 및/또는 펩타이드의 아미노산 잔기를 말할 수 있다. 자유 아미노산을 언급하는지 펩타이드의 잔기를 언급하는지는 이 용어가 사용되는 문맥으로부터 분명해질 것이다.
동물: 본원에서 사용되는 바, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 말한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 말한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비인간 동물을 말한다. 특정 구현예에서, 비인간 동물은 포유류(예컨대, 설치류, 마우스, 랫, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은 이에 제한되지는 않지만, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 유전자 도입 동물, 유전 공학으로 생성된 동물(genetically-engineered animal) 및/또는 복제 동물일 수 있다.
대략 또는 약: 본원에서 사용되는 바, 용어 "대략" 또는 "약"은 관심있는 하나 이상의 수치들에 적용되는 경우, 진술된 기준 수치와 유사한 수치를 말한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 진술되거나 달리 내용으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 말한다.
생물학적으로 활성이 있는: 본원에서 사용되는 바, 용어 "생물학적으로 활성이 있는"은 생물학적 체계(biological system)에서, 특히 유기체에서 활성을 가지는 임의의 제제의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때 본 유기체에 미치는 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성이 있는 것으로 여겨진다.
전달: 본원에서 사용되는 바, 용어 "전달"은 국소적인 전달과 전신 전달 둘 다를 망라한다. 예를 들어, MCNA의 전달은 MCNA가 표적 조직에 전달되고 인코딩된 단백질이 발현되고 표적 조직 내에 유지되는 상황("국소 분포" 또는 "국소 전달"이라고도 함) 및 MCNA가 표적 조직에 전달되고 인코딩된 단백질이 발현되고 환자의 순환계(예컨대, 혈청)에 분비되며 전신에 분포되어 다른 조직에 의해 흡수된 상황("전신 분포" 또는 "전신 전달"이라고도 함)을 망라한다.
발현: 본원에서 사용되는 바, 아미노산 서열의 "발현"은 MCNA의 폴리펩타이드로의 번역, 다수의 폴리펩타이드를 무손상(intact) 단백질(예컨대, 효소)로 조립 및/또는 폴리펩타이드 또는 완전히 조립된 단백질(예컨대, 효소)의 번역 후 변형을 말한다. 본 출원에서, 용어 "발현" 및 "생산" 및 문법적으로 동등한 용어는 상호교환적으로 사용된다.
기능적인(Functional): 본원에서 사용되는 바, "기능적인" 생물학적 분자는 그에 의해 특징지어지는 성질 및/또는 활성을 나타내는형태의 생물학적 분자이다.
반감기: 본원에서 사용되는 바, 용어 "반감기"는 핵산 또는 단백질 농도나 활성과 같은 양이 시작 시점에 측정된 수치의 절반으로 떨어지는 데 필요한 시간이다.
개선하다, 증가하다 또는 감소하다: 본원에서 사용되는 바, 용어 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적으로 동등한 용어는 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 대상(또는 다수의 대조군 대상들)에서의 측정과 같은 기준선 측정(baseline measurement)과 관련된 수치들을 나타낸다. "대조군 대상"은 치료 받는 개인과 동일한형태의 질환에 걸린, 치료 받는 개인과 거의 동일한 연령인 대상이다.
생체외(In Vitro): 본원에서 사용되는 바, 용어 "생체외"는 다세포 유기체 내 보다는 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 말한다.
생체내(In Vivo): 본원에서 사용되는 바, 용어 "생체내"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 말한다. 세포-기반 시스템의 상황에서, 상기 용어는 (예를 들어, 생체외 시스템에 반대되는) 살아있는 세포 내에서 발생하는 사건을 말하는 데 사용될 수 있다.
분리된(isolated): 본원에서 사용되는 바, 용어 "분리된"은 (1) 최초에 생산되었을 때(자연적이고/이거나 실험 환경이거나) 결합된 적어도 일부의 구성 성분으로부터 분리된 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 엔티티(entity)를 말한다. 분리된 물질 및/또는 엔티티는 최초에 결합된 다른 구성 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 보다 높은 순도이다. 본원에서 사용되는 바, 실질적으로 다른 구성성분이 없는 경우, 물질이 "순수하다"라고 한다. 본원에서 사용되는 바, 분리된 물질 및/또는 엔티티의 퍼센트 순도의 계산은 부형제(예컨대, 완충액, 용매, 물 등)는 포함하지 않아야 한다.
전령 RNA(mRNA): 본원에서 사용되는 바, 용어 "전령 RNA(mRNA)" 또는 "mRNA"는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 본원에서 사용되는 mRNA는 변형 및 비변형 RNA 둘 다를 망라한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비코딩 영역을 함유할 수 있다. mRNA는 천연 원료로부터 정제, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산 및 선택적 정제, 그리고 화학적 합성 등이 될 수 있다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 뼈대 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. mRNA 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5' 에서 3' 방향으로 제시된다. 일반적인 mRNA 분자는 5' 말단 및 3' 말단을 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신(adenosine), 구아노신(guanosine), 시티딘(cytidine), 우리딘(uridine)); 뉴클레오시드 유사체(예컨대, 2-아미노아데노신(2-aminoadenosine), 2-티오티미딘(2-thiothymidine), 이노신(inosine), 피롤로-피리미딘(pyrrolo-pyrimidine), 3-메틸 아데노신(3-methyl adenosine), 5-메틸시티딘(5-methylcytidine), C-5 프로피닐-시티딘(C-5 propynyl-cytidine), C-5 프로피닐-우리딘(C-5 propynyl-uridine), 2-아미노아데노신(2-aminoadenosine), C5-브로모우리딘(C5-bromouridine), C5-플루오로우리딘(C5-fluorouridine), C5-아이오도우리딘(C5-iodouridine), C5-프로피닐-우리딘(C5-propynyl-uridine), C5-프로피닐-시티딘(C5-propynyl-cytidine), C5-메틸시티딘(C5-methylcytidine), 2-아미노아데노신(2-aminoadenosine), 7-데아자아데노신(7-deazaadenosine), 7-데아자구아노신(7-deazaguanosine), 8-옥소아데노신(8-oxoadenosine), 8-옥소구아노신(8-oxoguanosine), O(6)-메틸구아닌(O(6)-methylguanine), 및 2-티오시티딘(2-thiocytidine); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예컨대, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예컨대, 2'-플루오로리보스(fluororibose), 리보스(ribose), 2'-디옥시리보스(deoxyribose), 아라비노오스(arabinose) 및 헥소오스(hexose)); 및/또는 변형된 포스페이트기(예컨대, 포스포로티오에이트(phosphorothioates) 및 5'-N-포스포아미다이트(5'-N-phosphoramidite) 결합)이거나 또는 상기의 것들을 포함한다.
핵산: 본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미로 폴리뉴클레오티드 사슬내에 포함되어 있거나 포함될 수 있는 임의의 화합물(compound) 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산디에스테르 결합(phosphodiester linkage)을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬내에 포함되거나 포함될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예컨대, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 말한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 말한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다.
환자: 본원에서 사용되는 바, 용어 "환자" 또는 "대상"은 예컨대, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적을 위해 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 말한다. 전형적인 환자는 동물(예컨대, 마우스, 랫, 토끼, 비인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유류)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생-전 및 출생-후형태를 포함한다.
약학적으로 허용가능한(Pharmaceutically acceptable): 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"은 철저한 의학적 판단의 범주내에서 과도한 독성, 자극 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증, 비례하는 합리적인 유익/위험 비율(benefit/risk ratio) 없이 인간과 동물의 조직과의 접촉에 있어 사용에 적합한 물질을 말한다.
약학적으로 허용가능한 염: 약학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에 잘 알려진 것이다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용가능한 염에 대해 J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19에 상세하게 기술한다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산과 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 비독성 산 첨가염의 예는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산, 또는 말론산과 같은 유기산으로형성된 아미노기의 염 또는 이온교환과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여형성된 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용 가능한 염은 아디핀산염(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코르브산염(ascorbate), 아스파르트산염(aspartate), 벤젠술폰산염(benzenesulfonate), 벤조산염(benzoate), 중황산염(bisulfate), 붕산염(borate), 낙산염(butyrate), 장뇌산염(camphorate), 장뇌술폰산염(camphorsulfonate), 구연산염(citrate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 디글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄술폰산염(ethanesulfonate), 포름산염(formate), 푸마르산염(fumarate), 글루코헵토네이트(glucoheptonate), 글리세로인산염(glycerophosphate), 글루코네이트(gluconate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 요오드화수소산염(hydroiodide), 2-히드록시-에탄술폰산염(2-hydroxy-ethanesulfonate), 락토바이온산염(lactobionate), 젖산염(lactate), 라우린산염(laurate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 말론산염(malonate), 메탄술폰산염(methanesulfonate), 2-나프탈렌술폰산염(2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 질산염(nitrate), 올레산염(oleate), 옥살산염(oxalate), 팔미트산염(palmitate), 파모산염(pamoate), 펙티닝산염(pectinate), 과황산염(persulfate), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionate), 인산염(phosphate), 피크르산염(picrate), 피발산염(pivalate), 프로피온산염(propionate), 스테아르산염(stearate), 숙신산염(succinate), 황산염(sulfate), 주석산염(tartrate), 티오시안산염(thiocyanate), p-톨루엔술폰산염(p-toluenesulfonate), 운데카노에이트(undecanoate), 발레르산염(valerate salts) 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 할로겐화물, 수산화물, 카르복시산염(carboxylate), 황산염, 인산염, 질산염, 설폰산염 및 아릴 설폰산염과 같은 반대 이온(counterion)을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 예컨대 알킬 할로겐화물과 같은 적절한 친전자물질을 사용하여 4급 알킬 아미노염(quarternized alkylated amino salt)을 형성하는 아민의 4급화로 형성된 염을 포함한다.
전신 분포 또는 전달(Systemic distribution or delivery): 본원에서 사용되는 바, 용어 "전신 분포" 또는 "전신 전달" 또는 문법적으로 동등한 용어는 전신 또는 전체 유기체에 영향을 주는 전달 또는 분포 메커니즘 또는 접근법을 말한다. 일반적으로 전신 분포 또는 전달은 예컨대 혈류와 같은 신체의 순환계를 통해 달성된다. "국소 분포 또는 전달"의 정의와 비교.
대상: 본원에서 사용되는 바, 용어 "대상"은 인간 또는 임의의 비인간 동물(예컨대, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 말한다. 인간은 출생-전 및 출생-후형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상은 인간이다. 대상은 환자일 수 있고, 이는 의료 제공자에게 질환의 진단 또는 치료를 위해 가는 사람을 말한다. 용어 "대상"은 본원에서 "개인" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상은 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 취약하지만 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.
실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바, 용어 "실질적으로"는 관심있는 특성 또는 성질의 보이는 전체 또는 거의 전체 규모 또는 정도의 정성적인 상태를 말한다. 생물학 기술분야의 당업자라면 생물학 및 화학적 현상은 완성되고/되거나 완전하게 진행되거나 절대적인 결과를 달성하거나 피하는 일이 설사 있다하더라도 극히 드물다는 것을 이해할 것이다. 그러므로 본원에서 용어 "실질적으로"는 많은 생물학 및 화학적 현상에 고유한 완전함의 잠재적 결핍을 담아내는 데 사용된다.
표적 조직: 본원에서 사용되는 바, 용어 "표적 조직"은 치료 받을 질환이 발생된 임의의 조직을 말한다. 일부 구현예에서, 표적 조직은 질환 관련 병리학, 증상 또는 특징을 나타내는 이들 조직을 포함한다.
치료 유효량: 본원에서 사용되는 바, 용어 치료제의 "치료 유효량"은 질환, 장애 및/또는 질병을 앓고 있거나 이에 취약한 대상에게 투여했을 때, 질환, 장애 및/또는 질병의 증상(들)의 발현을 치료, 진단, 예방 및/또는 지연하는 데 충분한 양을 의미한다. 당업자라면 치료 유효량이 일반적으로 적어도 하나의 단위 투여량을 포함하는 투여 요법을 통해 투여되는 것을 인정할 것이다.
치료하는(treating): 본원에서 사용되는 바, 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)" 또는 "치료하는"은 부분적으로 또는 완벽하게 특정한 질환, 장애 및/또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제하고, 예방하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고 및/또는 이의 빈도를 감소시키는 임의의 방법을 말한다. 질환의 징후를 보이지 않고/않거나 질환의 초기 징후만을 보이는 대상에게 질환과 관련된 병상이 생길 위험을 감소시킬 목적으로 치료가 시행될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 무엇보다도 다량체 코딩 핵산(MCNA)을 포함하는 조성물 및 이를 합성하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 이의 3' 말단과 결합된 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MCNA 화합물과 이를 합성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리디옥시리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 합성 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드는 폴리펩타이드, 단백질, 효소, 항체 또는 수용체를 코딩한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 다량체 핵산(MNA) 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 3' 말단 결합을 통해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 5' 말단은 MNA의 안정성을 도모하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 3' 말단 결합을 통해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 각각 비코딩 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, MNA는 폴리펩타이드, 단백질, 효소, 항체 또는 수용체를 인코딩하지 않는 합성 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 MNA는 유전자 발현을 억제한다. 일부 구현예에서, 유전자 발현을 억제하는 본 발명의 합성 폴리리보뉴클레오티드는 소간섭 리보핵산(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)이다.
외인성 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA 또는 RNA)의 투여가 질환의 치료에 대한 의미있는 개선을 나타내지만, 이러한 외인성 폴리뉴클레오티드의 투여는, 특히 이의 생체내 투여 후에 이러한 폴리뉴클레오티드의 제한된 안정성으로 인해 종종 제한된다. 예를 들어, 대상에 폴리뉴클레오티드를 투여한 후에, 많은 폴리뉴클레오티드가 뉴클레아제(예컨대, 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제)에 의해 분해될 수 있다. 뉴클레아제 분해는 폴리뉴클레오티드가 표적 세포에 도달하거나 전사되고/되거나 번역되는 능력에 부정적인 영향을 주고, 그 결과 외인성 폴리뉴클레오티드가 의도된 치료 효과를 발휘하지 못하게 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MCNA는 3' 말단에서 또 다른 폴리뉴클레오티드와 결합되지 않은 단일 폴레뉴클레오티드(이후, "단량체 폴리뉴클레오티드(monomeric polynucleotide)")와 비교하여 증가된 생체내 안정성을 보인다. 일부 구현예에서, 본 발명의 MCNA는 생체내로 전달될 때, 단량체 폴리뉴클레오티드가 동일한 단백질을 인코딩하는 것과 비교하여 증대된 단백질 생산을 가져온다. 일부 구현예에서, 본 발명의 MCNA는 대상에 전달 될 때, 상응하는 단량체 폴리뉴클레오티드와 비교하여 대상에 의해 더 잘 내성화된다.
다량체 코딩 핵산(MCNA)
일부 구현예에서, 본 발명은 다량체 코딩 핵산(MCNA)을 포함하는 조성물 및 이를 합성하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 이의 3' 말단과 결합된 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MCNA 화합물과 이를 합성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리디옥시리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 합성 폴리디옥시리보뉴클레오티드 또는 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 목적 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 동일한 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 별개의 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 별개의 단백질을 인코딩하는 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 동일한 수로 존재한다. 일부 구현예에서, 별개의 단백질을 인코딩하는 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 동일하지 않은 수로 존재한다(예컨대, #1 관심 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 2 카피(copy), #2 관심 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 1 카피). 일부 구현예에서, MCNA 화합물은 3개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물은 4개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물은 5개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다량체 핵산(MNA) 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 3' 말단 결합을 통해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 5' 말단은 MNA의 안정성을 도모하도록 변형된다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 3' 말단 결합을 통해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 인코딩 폴리뉴클레오티드이고, 적어도 하나의 3' 말단 결합을 통해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 비코딩 폴리뉴클레오티드이며, 이로써 다량체 코딩 핵산(MCNA)을 구성한다. 특정 구현예에서, 인코딩 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 인코딩하고 비코딩 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현을 억제한다(예컨대, 소간섭 리보핵산(siRNA), 마이크로 RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)).
일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MCNA 화합물은 항체 또는 항원 조각의 하나 이상의 사슬을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 항체의 중사슬과 경사슬을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항체는 무손상 면역글로불린, (Fab)2, (Fab′)2, Fab, Fab′' 또는 scFv이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG이다. 일부 구현예에서, 항체는 항-CCL2, 항-리실 산화효소-유사-2(anti-lysyl oxidase-like-2, LOXL2), 항-Flt-1, 항-TNF-α, 항-인터루킨-2Rα 수용체(CD25), 항-TGFβ, 항-B-세포 활성화 인자, 항-알파-4 인테그린(integrin), 항-BAGE, 항-β-카테닌/m, 항-Bcr-abl, 항-CS, 항-CA125, 항-CAMEL, 항-CAP-1, 항-CASP-8, 항-CD4, 항-CD19, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD25, 항-CDC27/m, 항-CD 30, 항-CD33, 항-CD52, 항-CD56, 항-CD80, 항-CDK4/m, 항-CEA, 항-CT, 항-CTL4, 항-Cyp-B, 항-DAM, 항-EGFR, 항-ErbB3, 항-ELF2M, 항-EMMPRIN, 항-EpCam, 항-ETV6-AML1, 항-HER2, 항-G250, 항-GAGE, 항-GnT-V, 항-Gp100, 항-HAGE, 항-HER-2/neu, 항-HLA-A*0201-R170I, 항-IGF-1R, 항-IL-2R, 항-IL-S, 항-MC1R, 항-미오신(myosin)/m, 항-MUC1, 항-MUM-1, -2, -3, 항-단백분해효소(proteinase)-3, 항-p190 마이너(minor) bcr-abl, 항-Pml/RARα, 항-PRAMS, 항-PSA, 항-PSM, 항-PSMA, 항-RAGE, 항-RANKL, 항-RU1 or RU2, 항-SAGE, 항-SART-1 또는 항-SART-3, 항-서비빈(survivin), 항-TEL/AML1, 항-TPI/m, 항-TRP-1, 항-TRP-2, 항-TRP-2/INT2, 및 항-VEGF 또는 항-VEGF 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MCNA 화합물은 하나 이상의 뉴클레아제를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레아제 각각은 Cas9, 징크핑거 뉴클레아제(zinc-finger nucleases, ZFN), TALEN, 유도(homing) 엔도뉴클레아제, 유도 메가뉴클레아제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대표적인 뉴클레아제는 Afu 우라실-DNA 글리코실화효소(UDG), Tma 엔도뉴클레아제 III, Tth 엔도뉴클레아제 IV, 남극 열불안정성(Antarctic Thermolabile) UDG, APE 1, Cas9 뉴클레아제 NLS(S. 피오게네스(pyogenes)), Cas9 뉴클레아제(S. 피오게네스), DNA분해효소 I, 엔도뉴클레아제 IV, 엔도뉴클레아제 V, 엔도뉴클레아제 VIII, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III(E. coli), 엑소뉴클레아제 T, 엑소뉴클레아제 V(RecBCD), 엑소뉴클레아제 VII, 엑소뉴클레아제 VIII(절단형), Fpg, hAAG, hOGG1, hSMUG1, 람다 엑소뉴클레아제, 미구균(Micrococcal) 뉴클레아제, 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제, 뉴클레아제 BAL-31, RecAf, RecJf, T4 PDG (T4 엔도뉴클레아제 V), T5 엑소뉴클레아제, T7 엔도뉴클레아제 I, T7 엑소뉴클레아제, 내열성(Thermostable) FEN1, 우라실 글리코실화효소 억제제(UGI)를 포함한다. 대표적인 유도 뉴클레아제는 I-AabMI, I-AniI, I-CeuI, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CreI, I-DmoI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeI, I-GzeII, I-HjeMI, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MsoI, I-OnuI, I-PanMI, I-SceI, I-SmaMI, I-Vdi141I, PI-SceI, I-CreI(m), I-MsoI(m), I-OnuI(E2), I-AniI / I-OnuI, I-DmoI / I-CreI, I-GpiI / I-OnuI, I-GzeI / I-PanMI, I-LtrI / I-PanMI, I-OnuI / I-LtrI, I-AaeMIP, I-ApaMIP, I-GzeMIIIP, I-NcrMIP, I-OsoMIIP, I-OsoMIP, I-PanMIIIP, I-PanMIIP, I-ScuMIIIP, I-ScuMIIP, I-ScuMIP, 및 I-ScuMIVP를 포함한다.
일부 구현예에서, MCNA 화합물은 1개, 2개, 또는 그 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 각 인코딩 폴리뉴클레오티드는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5 또는 표 6에서 선택된 유전자 및/또는 단백질에 대한 mRNA 전사체인 폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다.
[표 1]
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[표 2]
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[표 3]
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[표 4]
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[표 5]
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[표 6] - 분비 단백질
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구현예 중 한 세트에서, MCNA 화합물은 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들면, MCNA 화합물은 동일한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 각각 갖는 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 갖는 회문 코딩 핵산(palindromic coding nucleic acid, PCNA)일 수 있다.
일부 구현예에서, MCNA 화합물은 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절인자(hCFTR) mRNA를 인코딩하고, 폴리뉴클레오티드들 사이의 3' 말단 결합을 통해 비코딩 폴리뉴클레오티드에 연결되는 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 여기서 인코딩 폴리뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 hCFTR을 인코딩한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 회문 코딩 핵산(PCNA)이되, 여기서 각각의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 hCFTR을 코딩한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 여기서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 hCFTR을 인코딩하는 인코딩 폴리뉴클레오티드이고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 보호기로서 작용한다.
일부 구현예에서, MCNA 화합물은 인간 페닐알라닌 수산화효소(hPAH) mRNA를 인코딩하고, 폴리뉴클레오티드들 사이의 3' 말단 결합을 통해 비코딩 폴리뉴클레오티드에 연결되는 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 여기서 인코딩 폴리뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 hPAH를 인코딩한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 회문 코딩 핵산(PCNA)이되, 여기서 각각의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 hPAH를 코딩한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 여기서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 hPAH를 인코딩하는 인코딩 폴리뉴클레오티드이고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 보호기로서 작용한다.
일부 구현예에서, MCNA 화합물은 인간 오르니틴 트랜스카바밀라제(hOTC) mRNA를 인코딩하고, 폴리뉴클레오티드들 사이의 3' 말단 결합을 통해 비코딩 폴리뉴클레오티드에 연결되는 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 여기서 인코딩 폴리뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 hOTC를 인코딩한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 회문 코딩 핵산(PCNA)이되, 여기서 각각의 폴리뉴클레오티드는 hOTC를 코딩한다. 일부 구현예에서, MCNA 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 MCNA 화합물은 폴리뉴클레오티드들 사이에 3' 말단 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 여기서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 hOTC를 인코딩하는 인코딩 폴리뉴클레오티드이고 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 보호기로서 작용한다.
브릿지(w/ 3'-3' 결합)
일부 구현예에서, MCNA 화합물은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 각각의 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 3'-3' 반전 인산디에스테르 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 브릿지(또한 "브릿징 올리고뉴클레오티드" 또는 "브릿징 올리고")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 브릿지는 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 브릿지는 2'-O-메틸 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 브릿지는 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 브릿지는 2개 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 브릿지는 공유 결합에 의해 브릿지에 결합되어 있는 하나 이상의 활성 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성 부분은 표적 그룹, 펩타이드, 대조 작용제, 소분자, 단백질, DNA 및/또는 RNA이다. 일부 구현예에서, 활성 부분은 수용체 리간드를 세포 표면 수용체에 결합시킨다. 일부 구현예에서, 활성 부분은 하나 이상의 트리안테너리 GalNac 표적 제제이다.
MCNA 합성
일부 구현예에서, 본 발명은 MCNA를 합성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, MCNA의 합성은 각각의 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 올리고뉴클레오티드 브릿지의 5' 말단에 라이게이션되도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 라이게이션하는 단계를 포함하되, 여기서 올리고뉴클레오티드 브릿지는 2개의 5' 말단과 하나의 내부 3'-3' 반전 인산디에스테르 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA를 합성하는 방법은 리가아제가 각각의 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 브릿지의 5' 말단에 연결할 수 있도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드 스플린트(splints)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 스플린트는 리가아제가 각각의 폴리뉴클레오티드의 완전한 말단을 올리고뉴클레오티드 브릿지의 5' 말단에 연결하도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 스플린트는 리가아제가 각각의 폴리뉴클레오티드의 3' 말단을 올리고뉴클레오티드 브릿지의 5' 말단에 연결하도록 2개 이상의 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 스플린트는 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 리가아제는 RNA 리가아제이다. 일부 구현예에서, 리가아제는 T4 RNA 리가아제 1이다. 일부 구현예에서, 리가아제는 T4 RNA 리가아제 2이다.
일부 구현예에서, MCNA를 합성할 때 폴리뉴클레오티드 대 올리고뉴클레오티드 브릿지 대 올리고뉴클레오티드 스플린트의 몰비는 2:1:2이다. 일부 구현예에서, MCNA를 합성할 때 폴리뉴클레오티드 대 올리고뉴클레오티드의 몰비는 2:1이다. 일부 구현예에서, MCNA를 합성할 때 폴리뉴클레오티드 대 올리고뉴클레오티드 스플린트의 몰비는 2:2이다. 일부 구현예에서, MCNA의 합성은 PEG를 더 포함한다.
일부 구현예에서, MCNA는 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조될 수 있다. 요약하면, RNA 코딩 서열 측부에 배열되는 5' 비번역 영역(UTR)과 3' UTR을 함유하는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되고, 효소적으로 캐핑되어(capped) 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제된다. 그런 다음, 이 전사체는 단일 단계에서 (A) T4 RNA 리가아제 1 또는 (B) T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K 또는 (C) T4 RNA 리가아제 2 중 하나를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 "브릿지" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 브릿징 올리고에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션된다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고는 50 μM 올리고, ATP, 1x PNK 완충액 및 T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소를 포함하여 37 °C에서 1시간 동안 반응하여 5' 말단이 인산화된다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고는 세파덱스(Sephadex) G-25 탈염 컬럼을 사용하여 탈염되고 캐핑된 RNA 전사체, 1x 브릿징 올리고 및 2x 스플린트 올리고를 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화된다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 (A) 1X RNA 리가아제 완충액, ATP 및 T4 RNA 리가아제 1(NEB) 또는 (B) 1x RNA 리가아제 완충액, ATP, 10% PEG 및 T4 RNA 리가아제 1(NEB) 또는 (C) 1X T4RNA 리가아제 2 완충액 및 T4 RNA 리가아제 2(NEB)를 포함하여 제조된다. 각각은 37 °C에서 90분간 반응한다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제한다. 정제된 MCNA 산물은 이어서 DNA 분해효소 I로 처리하여 잔여 브릿지 올리고뉴클레오티드를 제거한다.
일부 구현예에서, MCNA는 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트-비의존성 라이게이션에 의해 제조될 수 있다.
비번역 영역
일반적으로, mRNA 합성은 5' 말단에 "캡"을 3' 말단에 "꼬리"를 첨가하는 것을 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
일부 구현예에서, MCNA의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역(5' UTR)은 예를 들어, 철분 반응 요소와 같이 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 주는 하나 이상의 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 비번역 영역(3' UTR)은 폴리아데닐화 신호, 세포 내 MCNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위 중 하나 이상, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 50 내지 500개의 뉴클레오티드 길이이거나 더 길 수 있다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 5 내지 2,000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
예시적인 3' 및/또는 5' UTR 서열은 센스(sense) MCNA 분자의 안정성을 높이기 위하여 안정한 핵산 분자(예컨대, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린(tubulin), 히스톤, 또는 시트르산 회로 효소)로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 5' UTR 서열은 CMV 즉각-조기(immediate-early) 1(IE1) 유전자, 또는 그의 조각을 포함하여 뉴클레아제 내성을 개선시키고/시키거나 폴리뉴클레오티드의 반감기를 개선시킬 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드의 추가적인 안정을 위하여 폴리뉴클레오티드(예컨대, MCNA)의 3' 말단 또는 비번역 영역에 인간 성장 호르몬(hGH)을 인코딩하는 서열 또는 그의 조각을 포함하는 것이 고려된다. 일반적으로, 이러한 변형은 폴리뉴클레오티드의 안정성 및/또는 약동학적 성질(예컨대, 반감기)을 변형되지 않은 대응물에 비해 개선시키고, 예를 들어 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 이러한 폴리뉴클레오티드의 내성을 개선시키도록 이루어진 변형을 포함한다.
3' UTR
일부 구현예에서, 3' UTR은 사이에 스페이서가 있는 복수의 다중-A 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 DNA, RNA 및/또는 변형 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-A 단편 각각은 8~50개의 연속 아데노신을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 다중-A 단편은 1~100개의 범위이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 5~100의 다양한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 유사매듭구조를 포함한다. 유사매듭은 단일 가닥 영역 또는 루프(loop)에 의해 연결되는 2개의 나선형 단편으로 최소로 이루어진 RNA 구조로 정의될 수 있다(Staple, D.W. et al., PLoS Biology, 2005, 3, e213). 이는 대개 헤어핀 또는 스템(stem) 루프와 같은 이차 구조 및 원위 단일 가닥 영역을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 "키싱 루프" 서열 모티프를 포함한다. 넓은 의미에서, 키싱 루프는 한 RNA 분자의 스템/헤어핀 루프에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 별개의 RNA 분자의 제2 스템/헤어핀 루프의 쌍을 일루지 않은 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 때 형성되는 구조로 기술될 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 폴리아데닐화(폴리-A) 꼬리가 뒤따르지 않는다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 폴리-A 결합 단백질(PABP)에 결합한다.
일부 구현예에서, MCNA는 3' 폴리(A) 꼬리 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 25~5,000개의 뉴클레오티드 길이이다. MCNA의 3' 말단 상에 있는 폴리-A 꼬리는 전형적으로 약 10 내지 300개의 아데노신 뉴클레오티드(예컨대, 약 10 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 150개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 60개의 아데노신 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 3' poly(C) 꼬리 구조를 포함한다. MCNA의 3' 말단 상에 있는 적합한 폴리-C 꼬리는 전형적으로 약 10 내지 200개의 시토신 뉴클레오티드(예컨대, 약 10 내지 150개의 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 60개의 시토신 뉴클레오티드 또는 약 10 내지 40개의 시토신 뉴클레오티드)를 포함한다. 폴리-C 꼬리는 폴리-A 꼬리에 첨가될 수 있거나 폴리-A 꼬리를 치환할 수 있다.
전형적으로, "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 MCNA를 보호하는 역할을 한다. 폴리 A 꼬리는 자연 전령 및 합성 센스 MCNA를 안정화시키는 것으로 여겨진다. 그러므로, 특정 구현예에서 긴 폴리 A 꼬리는 MCNA 분자에 첨가되어 MCNA를 보다 안정화시킬 수 있다. 폴리 A 꼬리는 다양한 기술 인식(art-recognized) 기법을 사용하여 첨가될 수 있다. 예를 들어, 긴 폴리 A 꼬리는 폴리 A 중합효소를 사용하여 합성된 또는 시험관내 전사된 RNA에 첨가될 수 있다(Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). 전사 벡터는 또한 긴 폴리 A 꼬리를 인코딩할 수 있다. 게다가, 폴리 A 꼬리는 PCR 산물로부터의 직접 전사에 의해 첨가될 수 있다. 폴리 A는 또한 RNA 리가아제로 센스 RNA의 3' 말단에 라이게이션될 수 있다(예컨대, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch 및 Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1991 edition)을 참조).
일부 구현예에서, MCNA 중 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 3' 폴리(A) 꼬리 구조를 포함한다. 전형적으로, 폴리-A 꼬리의 길이는 적어도 약 10개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 적어도 500개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, MCNA의 3' 말단 상에 있는 폴리-A 꼬리는 전형적으로 약 10 내지 300개의 아데노신 뉴클레오티드(예컨대, 약 10 내지 200개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 150개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 60개의 아데노신 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA는 3' 폴리-C 꼬리 구조를 포함한다. MCNA의 3' 말단 상에 있는 적합한 폴리-C 꼬리는 전형적으로 약 10 내지 200개의 시토신 뉴클레오티드(예컨대, 약 10 내지 150개의 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 60개의 시토신 뉴클레오티드 또는 약 10 내지 40개의 시토신 뉴클레오티드)를 포함한다. 폴리-C 꼬리는 폴리-A 꼬리에 첨가될 수 있거나 폴리-A 꼬리를 치환할 수 있다.
그러므로, 일부 구현예에서, 폴리-A 또는 폴리-C 꼬리의 길이가 조정되어 본 발명의 변형 센스 MCNA 분자의 안정성 및 MCNA의 인코딩 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 코딩되는 단백질의 전사를 조절한다. 예를 들어, 폴리-A 꼬리의 길이가 센스 MCNA 분자의 반감기에 영향을 줄 수 있으므로, 폴리-A 꼬리의 길이가 조정되어 뉴클레아제에 대한 MCNA의 내성 수준을 변형시킬 수 있고 이로인해 표적 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현 및/또는 폴리펩타이드 생산의 시간 경과를 조절할 수 있게 된다.
5' UTR
일부 구현예에서, MCNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 우선, RNA 말단 인산가수분해효소가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 인산기 중 하나를 제거하고, 2개의 말단 인산기를 남긴다; 그런 다음, 구아노신 삼인산(guanosine triphosphate, GTP)이 구아닐릴(guanylyl) 전이효소를 통해 말단 인산에 첨가되고 5'5'5 삼인산 결합을 생성한다; 그런 다음 구아닌의 7-질소가 메틸기 전이효소에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는 이에 제한되지 않지만, m7G(5')ppp(5')A, G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함한다.
자연적으로 발생한 캡 구조는 삼인산 브릿지를 통해 제1 전사 뉴클레오티드의 5' 말단에 연결되는 7-메틸 구아노신을 포함하고, 결과적으로 m7G(5')ppp(5')N의 디뉴클레오티드 캡이 되며 여기서 N은 임의의 뉴클레오시드이다. 생체내에서, 캡은 효소적으로 첨가된다. 캡은 핵에서 첨가되고 구아닐릴 전이효소에 의해 촉매된다. RNA의 5' 말단에 캡의 첨가는 전사 개시 후 즉시 일어난다. 말단 뉴클레오시드는 전형적으로 구아노신이고, 다른 모든 뉴클레오티드, 즉 G(5')ppp(5')GpNpNp에 반대 방향이다.
시험관내 전사에 의해 생성된 MCNA의 하나의 캡은 m7G(5')ppp(5')G이고, 이는 T7 또는 SP6 RNA 중합효소와 함께 전사 시에 디뉴클레오티드 캡으로서 사용되어 시험관내에서 그의 5' 말단이 캡 구조를 갖는 MCNA를 수득하게 된다. 캐핑된 MCNA의 시험관내 합성을 위한 방법은 m7G(5')ppp(5')G("m7GpppG") 형태의 미리 형성된 디뉴클레오티드를 전사 억제제로서 사용한다.
지금까지, 시험관내 전사 실험에서 사용된 합성 디뉴클레오티드 캡의 보통 형태는 항-역전 캡 유사체(Anti-Reverse Cap Analog, "ARCA") 또는 변형 ARCA이고, 이는 일반적으로 2' 또는 3' OH기가 -OCH3로 대체되어 있는 변형된 캡 유사체이다.
추가적인 캡 유사체는 이에 제한되지는 않지만, m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC로 이루어진 군으로부터 선택된 화학적 구조; 메틸화되지 않은 캡 유사체(예컨대, GpppG); 디메틸화된 캡 유사체(예컨대, m2,7GpppG), 삼메틸화된 캡 유사체(예컨대, m2,2,7GpppG), 디메틸화된 대칭성 캡 유사체(예컨대, m7Gpppm7G), 또는 항 역전 캡 유사체(예컨대, ARCA; m7,2'OmeGpppG, m72'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG 및 이들의 사인산 유도체)를 포함한다(예컨대, Jemielity, J. et al., "Novel 'anti-reverse' cap analogs with superior translational properties", RNA, 9: 1108-1122 (2003)을 참조).
일부 구현예에서, 적합한 캡은 삼인산 브릿지를 통해 제1 전사 뉴클레오티드의 5' 말단에 연결되는 7-메틸 구아닐산("m7G")이고, 결과적으로 m7G(5')ppp(5')N이 되며 여기서 N은 임의의 뉴클레오시드이다. 본 발명의 구현예들에서 사용된 m7G cap의 바람직한 구현예는 m7G(5')ppp(5')G이다.
일부 구현예에서, 캡은 캡0 구조이다. 캡0 구조는 염기 1과 2에 부착된 리보스의 2'-O-메틸 잔기가 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, 캡은 캡1 구조이다. 캡1 구조는 염기 2에서 2'-O-메틸 잔기를 갖는다. 일부 구현예에서, 캡은 캡2 구조이다. 캡2 구조는 염기 2와 3 둘 다에 부착된 2'-O-메틸 잔기를 갖는다.
다양한 m7G 캡 유사체가 당해 기술분야에 공지되어 있고, 많은 m7G 캡 유사체가 상업적으로 이용가능하다. 이는 상기 기술된 m7GpppG뿐만 아니라 ARCA 3'-OCH3 및 2'-OCH3 캡 유사체도 포함한다(Jemielity, J. et al., RNA, 9: 1108-1122 (2003)). 본 발명의 구현예들에서 사용하기 위한 추가적인 캡 유사체는 (Grudzien, E. et al., RNA, 10: 1479-1487 (2004)에 기술된) N7-벤질화된 디뉴클레오시드 사인산 유사체, (Grudzien-Nogalska, E., et al., RNA, 13: 1745-1755 (2007)에 기술된) 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 캡 유사체, 및 (본원에 참조로서 포함되는 미국 등록특허 번호 제8,093,367호 및 제8,304,529호에 기술된 비오틴부착(biotinylated) 캡 유사체를 포함하는) 캡 유사체들을 포함한다.
뉴클레오티드 변형
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 MCNA는 비변형 또는 변형 핵산으로서 합성될 수 있다. 전형적으로, 핵산은 안정성을 강화하도록 변형된다. MCNA의 변형은 예를 들어 MCNA의 뉴클레오티드의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 변형 MCNA는 예를 들어, 뼈대(backbone) 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MCNA는 이에 제한되지는 않지만, 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U))을 포함하는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체(변형 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있고, 예를 들어, 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU), 및 1-메틸-유사우리딘, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐(isopentenyl)-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신(inosine), 1-메틸-이노신, 유사우라실(5-우라실), 디하이드로(dihydro)-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카르복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-oxyacetic acid 메틸 ester, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시(methoxy)아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카르보닐(carbonyl)메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세틱산(oxyacetic acid) 메틸 에스터, 우라실-5-옥시아세틱산(v), 1-메틸-유사우라실, 큐에오신(queosine), 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신(wybutoxosine), 및 포스포라미데이트(phosphoramidates), 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 펩타이드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신(deazaguanosine), 5-메틸시토신 및 이노신과 같은 퓨린과 피리미딘의 변형 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서 합성될 수 있다. 이와 같은 유사체의 제조는 미국 등록특허 번호 제4,373,071호, 미국 등록특허 번호 제4,401,796호, 미국 등록특허 번호 제4,415,732호, 미국 등록특허 번호 제4,458,066호, 미국 등록특허 번호 제4,500,707호, 미국 등록특허 번호 제4,668,777호, 미국 등록특허 번호 제4,973,679호, 미국 등록특허 번호 제5,047,524호, 미국 등록특허 번호 제5,132,418호, 미국 등록특허 번호 제5,153,319호, 미국 등록특허 번호 제5,262,530호, 미국 등록특허 번호 제5,700,642호로 부터 당업자에게 공지되어 있고, 이들 개시는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 MCNA는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형 뉴클레오티드는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 상응하는 본래 염기의 1~100%를 치환한다. 일부 구현예에서, 우리딘의 적어도 25%가 2-티오우리딘으로 대체된다. 일부 구현예에서, 100% 시티딘이 5-메틸시티딘으로 대체된다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 리보스 고리 상의 4'-티오 치환으로 더 변형된다. 일부 구현예에서, 본래의 뉴클레오티드는 리보스 고리 상의 4'-티오 치환으로 변형된다.
일부 구현예에서, MCNA는 핵산 뼈대 변형을 함유할 수 있다. 전형적으로, 뼈대 변형은 MCNA에 함유된 뉴클레오티드의 뼈대의 인산이 화학적으로 변형된 변형이다. 예시적인 뼈대 변형은 전형적으로 이에 제한되지 않지만, 메틸포스포네이트, 메틸포스포라미데이트, 포스포라미데이트, 포스포티오에이트(예컨대, 시티딘 5'-O-(1-티오포스페이트)), 보라노포스페이트(boranophosphates), 양하전된 구아니디늄기(guanidinium groups) 등으로 이루어진 군으로부터의 변형을 포함하되, 이는 다른 음이온기, 양이온기, 또는 중성기에 의해 인산디에스테르 결합을 대체하는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, MCNA는 당 변형을 함유할 수 있다. 전형적인 당 변형은 뉴클레오티드의 당의 화학적 변형으로, 이에 제한되지 않지만, 2'-디옥시-2'-플루오로-올리고리보뉴클레오티드(2'-플루오로-2'-디옥시시티딘 5'-삼인산, 2'-플루오로-2'-디옥시우리딘 5'-삼인산), 2'-디옥시-2'-디아민-올리고리보뉴클레오티드(2'-아미노-2'-디옥시시티딘 5'-삼인산, 2'-아미노-2'-디옥시우리딘 5'-삼인산), 2'-O-알킬올리고리보뉴클레오티드, 2'-디옥시-2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드(2'-O-메틸시티딘 5'-삼인산, 2'-메틸우리딘 5'-삼인산), 2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드, 및 이의 이성질체(2'-아라(ara)시티딘 5'-삼인산, 2'-아라우리딘 5'-삼인산), 또는 아지도삼인산(azidotriphosphates)(2'-아지도-2'-디옥시시티딘 5'-삼인산, 2'-아지도-2'-디옥시우리딘 5'-삼인산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 당 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, MCNA는 뉴클레오티드의 염기의 변형(염기 변형들)을 함유할 수 있다. 염기 변형을 함유하는 변형 뉴클레오티드를 또한 염기-변형 뉴클레오티드라 부른다. 이와 같은 염기-변형 뉴클레오티드의 예는 이에 제한되지는 않지만, 2-아미노-6-클로로퓨린(chloropurine) 리보사이드(riboside) 5'-삼인산, 2-아미노아데노신 5'-삼인산, 2-티오시티딘 5'-삼인산, 2-티오우리딘 5'-삼인산, 4-티오우리딘 5'-삼인산, 5-아미노알릴시티딘(aminoallylcytidine) 5'-삼인산, 5-아미노알릴우리딘 5'-삼인산, 5-브로모시티딘(bromocytidine) 5'-삼인산, 5-브로모우리딘(bromouridine) 5'-삼인산, 5-아이오도시티딘(iodocytidine) 5'-삼인산, 5-아이오도우리딘(iodouridine) 5'-삼인산, 5-메틸시티딘 5'-삼인산, 5-메틸우리딘 5'-삼인산, 6-아자시티딘(azacytidine) 5'-삼인산, 6-아자우리딘 5'-삼인산, 6-클로로퓨린 리보사이드 5'-삼인산, 7-데아자아데노신 5'-삼인산, 7-데아자구아노신 5'-삼인산, 8-아자아데노신 5'-삼인산, 8-아지도아데노신 5'-삼인산, 벤즈이미다졸(benzimidazole) 리보사이드 5'-삼인산, N1-메틸아데노신 5'-삼인산, N1-메틸구아노신 5'-삼인산, N6-메틸아데노신 5'-삼인산, O6-메틸구아노신 5'-삼인산, 유사우리딘 5'-삼인산, 퓨로마이신(puromycin) 5'-삼인산 또는 크산토신(xanthosine) 5'-삼인산을 포함한다. 일부 구현예에서, MCNA는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로부터 선택된 변형 염기를 포함한다.
전달 운반체(Delivery Vehicles)
본 발명에 따르면, 본원에 기술된 MCNA는 노출된(naked) 폴리뉴클레오티드로서 전달될 수 있거나 전달 운반체를 통해 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "전달 운반체", "수송(transfer) 운반체", "나노입자(nanoparticle)" 또는 문법적으로 동등한 용어는 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, MCNA는 단일 전달 운반체를 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, MCNA는 하나 이상의 전달 운반체를 통해 각각의 상이한 조성물에 전달될 수 있다. 다양한 구현예에 따르면, 적합한 전달 운반체는 이에 제한되지 않지만, 예컨대 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI), 지질 나노입자 및 리포솜, 나노리포솜, 세라미드(ceramide)-함유 나노리포솜, 프로테오리포솜(proteoliposomes), 천연 및 합성-유래 엑소좀 둘 다, 천연, 합성 및 반-합성 라멜라체(lamellar bodies), 나노미립자(nanoparticulates), 칼슘 포스포실리케이트(phosphor-silicate) 나노미립자, 칼슘 포스페이트 나노미립자, 실리콘 다이옥사이드 나노미립자, 나노결정 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 졸-겔, 나노덴드리머(nanodendrimers), 전분-기반(starch-based) 전달 시스템, 미셀(micelles), 에멀전, 니오좀(niosomes), 다중-도메인-블록 폴리머(비닐 폴리머, 폴리프로필(polypropyl) 아크릴산 폴리머, 다이나믹 다중접합체(dynamic polyconjugates)), 건조 분말 제형, 플라스미드, 바이러스, 칼슘 포스페이트 뉴클레오티드, 압타머(aptamers), 펩타이드 및 기타 벡터형 태그(vectorial tags)와 같은 폴리머계 담체(carriers)를 포함한다.
리포솜 전달 운반체(Liposomal Delivery Vehicles)
일부 구현예에서, 적합한 전달 운반체는 지질 나노입자와 같은 리포솜 전달 운반체이다. 본원에서 사용되는 바, 지질 나노입자와 같은 리포솜 전달 운반체는 보통 하나 이상의 이중층 막에 의해 외부 매질로부터 격리된 내부의 수성(aqua) 공간을 가지는 미세 소낭(microscopic vesicles)으로서 특징지어진다. 리포솜의 이중층 막은 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 유래의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 전형적으로 형성된다(Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). 리포솜의 이중층 막은 또한 양염색성(amphophilic) 폴리머 및 계면활성제(예컨대, 폴리머좀(polymerosomes), 니오좀 등)에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 리포솜 전달 운반체는 전형적으로 원하는 MCNA를 표적 세포 또는 조직으로 수송하는 역할을 한다.
양이온 지질(Cationic Lipids)
일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온 지질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어구 "양이온 지질"은 생리적인 pH(physiological pH)와 같은 선택된 pH에서 순 양전하(net positive charge)를 띄는 임의의 많은 지질 종을 말한다. 몇몇 양이온 지질은 문헌에 개시되어 있고, 그 중 많은 것이 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되기에 특히 적합한 양이온 지질은 국제 특허공개 WO 2010/053572호(및, 특히 단락 [00225]에 기술된 CI 2-200) 및 WO 2012/170930호에 기술된 것들을 포함하고, 둘 다 본원에 참조로서 포함된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예컨대, (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z, 12Z)-옥타데카(octadeca)-9, 12-디엔(dien)-l-일(yl))테트라코사(tetracosa)-15,18-디엔-1-아민(HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-1-일)테트라코사-4,15,18-트리엔(trien)-l-아민(HGT5001), 및 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-1-일)테트라코사-5, 15, 18-트리엔-1-아민(HGT5002)과 같은 2012년 3월 29일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/617,468호(본원에 참조로서 포함됨)에 기술된 이온화(ionizable) 양이온 지질을 포함하는 지질 나노입자를 사용한다.
일부 구현예에서, 제공된 리포솜은 WO 2013/063468호 및 "전령 RNA의 전달용 지질 제형(Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA)"이란 이름으로 본 출원과 같은 날짜에 함께 출원된 미국 가특허 출원에 기술된 양이온 지질을 포함하며, 둘 다 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 양이온 지질은 식 I-c1-a의 화합물:
Figure 112018097889611-pct00074
또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하되,
각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-3 알킬이고;
각각의 q는 독립적으로 2 내지 6이고;
각각의 R'은 독립적으로 수소 또는 C1-3 알킬이며;
각각의 RL은 독립적으로 C8-12 알킬이다.
일부 구현예에서, 각각의 R2는 수소, 메틸 또는 에틸이다. 일부 구현예에서, 각각의 R2는 수소 또는 메틸이다. 일부 구현예에서, 각각의 R2는 수소이다.
일부 구현예에서, 각각의 q는 독립적으로 3 내지 6이다. 일부 구현예에서, 각각의 q는 독립적으로 3 내지 5이다. 일부 구현예에서, 각각의 q는 4이다.
일부 구현예에서, 각각의 R'은 수소, 메틸 또는 에틸이다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 수소 또는 메틸이다. 일부 구현예에서, 각각의 R'은 수소이다.
일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 C8-12 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 n-C8-12 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 C9-11 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 n-C9-11 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 C10 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 n-C10 알킬이다.
일부 구현예에서, 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 메틸이고; 각각의 q는 독립적으로 3 내지 5이며; 각각의 R'은 독립적으로 수소 또는 메틸이고; 각각의 RL은 독립적으로 C8-12 알킬이다.
일부 구현예에서, 각각의 R2는 수소이고; 각각의 q는 독립적으로 3 내지 5이며; 각각의 R'은 수소이고; 각각의 RL은 독립적으로 C8-12 알킬이다.
일부 구현예에서, 각각의 R2는 수소이고; 각각의 q는 4이며; 각각의 R'은 수소이고; 각각의 RL은 독립적으로 C8-12 알킬이다.
일부 구현예에서, 양이온 지질은 화학식 I-g의 화합물:
Figure 112018097889611-pct00075
또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하되, 각각의 RL은 독립적으로 C8-12 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 n-C8-12 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 C9-11 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 n-C9-11 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 독립적으로 C10 알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 RL은 n-C10 알킬이다.
특정한 구현예에서, 제공된 리포솜은 양이온 지질 cKK-E12, 또는 (3,6-비스(bis)(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)피페라진(piperazine)-2,5-디온(dione))을 포함한다. cKK-E12의 구조는 하기에 나타낸다:
Figure 112018097889611-pct00076
추가적인 예시의 양이온 지질은 식 I의 화합물:
Figure 112018097889611-pct00077
및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하되,
　
Figure 112018097889611-pct00078
(예컨대, Fenton, Owen S., et al. "Bioinspired Alkenyl Amino Alcohol Ionizable Lipid Materials for Highly Potent In Vivo mRNA Delivery." Advanced materials (2016)을 참조).
일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온 지질은 N-[l-(2,3-디올레일옥시(dioleyloxy))프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(trimethylammonium) 클로라이드 또는 "DOTMA"일 수 있다(Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); U.S. Pat. No. 4,897,355). 　 DOTMA는 단독으로 제형화될 수 있거나 중성 지질, 디올레오일포스파티딜-에탄올아민(dioleoylphosphatidyl-ethanolamine) 또는 "DOPE" 또는 기타 양이온 또는 비-양이온 지질과 함께 리포솜 수송 운반체 또는 지질 나노입자에 결합될 수 있으며, 이러한 리포솜은 핵산을 표적 세포에 전달하는 것을 강화하는 데 사용될 수 있다. 다른 적합한 양이온 지질은 예를 들어, 5-카르복시스페르밀(spermyl)글리신디옥타데실아미드(dioctadecylamide) 또는 "DOGS", 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민(spermine)-카르복사미도(carboxamido)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄(propanaminium) 또는 "DOSPA"(Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); U.S. Pat. No. 5,171,678; U.S. Pat. No. 5,334,761), l,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 또는 "DODAP", l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 또는 "DOTAP"를 포함한다.
추가적인 예시의 양이온 지질은 또한 l,2-디스테아릴옥시(distearyloxy)-N,N-디메틸-3-아미노프로판, 즉 "DSDMA", 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판, 즉 "DODMA", 1 ,2-디리놀레일옥시(dilinoleyloxy)-N,N-디메틸-3-아미노프로판, 즉 "DLinDMA", l,2-디리놀레닐옥시(dilinolenyloxy)-N,N-디메틸-3-아미노프로판, 즉 "DLenDMA", N-디올레일(dioleyl)-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 즉 "DODAC", N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄암모늄 브로마이드, 즉 "DDAB", N-(l,2-디미리스틸옥시프로프(dimyristyloxyprop)-3-일(yl))-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸(hydroxyethyl) 암모늄 브로마이드, 즉 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔(cholest-5-en)-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-l-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판, 즉 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시(oxapentoxy))-3-디메틸 l-l-(시스,시스-9', l-2'-옥타데카디엔옥시)프로판, 즉 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민, 즉 "DMOBA", 1 ,2-N,N'-디올레일카르바밀(dioleylcarbamyl)-3-디메틸아미노프로판, 즉 "DOcarbDAP", 2,3-디리놀레일옥시-N,N-디메틸프로필아민 즉 "DLinDAP", l,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 즉 "DLincarbDAP", l ,2-디리놀레오일카르바밀(Dilinoleoylcarbamyl)-3-디메틸아미노프로판 즉 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[l,3]-디옥살란(dioxolane) 즉 "DLin- -DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[l,3]-디옥살란 즉 "DLin-K-XTC2-DMA", 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-디엔-1-일)-l ,3-디옥살란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민 (DLin-KC2-DMA)) (WO 2010/042877호; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)을 참조), 또는 이들의 혼합물을 포함한다. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT Publication WO2005/121348A1). 일부 구현예에서, 양이온 지질 중 하나 이상은 이미다졸(imidazole), 디알킬아미노(dialkylamino), 또는 구아니디늄(guanidinium) 모이어티 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온 지질은 XTC(2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥살란), MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타(heptatriaconta)-6,9,28,31-테트라엔(tetraen)-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트), ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐(dienyl))테트라하이드로(tetrahydro)-3aH-사이클로펜타(cyclopenta)[d] [1 ,3]디옥솔(dioxol)-5-아민)), NC98-5(4,7,13-트리스(tris)(3-옥소(oxo)-3-(운데실아미노(undecylamino))프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드), DODAP(1,2-디올레일(dioleyl)-3-디메틸암모늄 프로판), HGT4003(WO 2012/170889호, 이의 교시 전체가 본원에 참조로서 포함됨), ICE(WO 2011/068810호, 이의 교시 전체가 본원에 참조로서 포함됨), HGT5000(미국 가특허 출원 번호 제61/617,468호, 이의 교시 전체가 본원에 참조로서 포함됨) 또는 HGT5001(시스 또는 트랜스)(미국 가특허 출원 번호 제61/617,468호), WO2010/053572호에 개시된 바와 같은 아미노알코올 리피도이드(lipidoids), DOTAP(1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판), DOTMA (1,2-di-O-옥타데세닐(octadecenyl)-3-트리메틸암모늄 프로판), DLinDMA(Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids" J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA(Semple, S.C. et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200(Love, K.T. et al. "Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107, 1864-1869)로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 리포솜 내 양이온 지질의 백분율은 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 또는 70%.초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온 지질(들)은 리포솜의 약 30~50 중량%(예컨대, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, or 약 35~40 중량%)를 이룬다. 일부 구현예에서, 양이온 지질(예컨대, cKK-E12)은 몰비로 리포솜의 약 30%, 약 35%, 약 40 %, 약 45%, 또는 약 50%를 이룬다.
비-양이온/보조 지질(Non-cationic/Helper Lipids)
일부 구현예에서, 제공된 리포솜은 하나이상의 비-양이온("보조") 지질을 함유한다. 본원에서 사용되는 바, 용어구 "비-양이온 지질"은 임의의 중성, 쌍성(zwitterionic) 또는 음이온 지질을 말한다. 본원에서 사용되는 바, 용어구 "음이온 지질"은 생리적인 pH와 같은 선택된 pH에서 순 음전하(net negative charge)를 띠는 임의의 많은 지질 종을 말한다. 비-양이온 지질은 이에 제한되지는 않지만, 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine, POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복시산염(dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxylate, DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine, DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(dimyristoylphosphoethanolamine, DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine, DSPE), 16-O-모노메틸 PE(16-O-monomethyl PE), 16-O-디메틸 PE(16-O-dimethyl PE), 18-1-트랜스 PE(18-1-trans PE), l-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(phosphatidyethanolamine(l-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine, SOPE), 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 이와 같은 비-양이온 지질은 단독으로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 양이온 지질과 같은 다른 부형제와 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, 비-양이온 지질은 리포솜에 존재하는 전체 지질의 약 5% 내지 약 90%, 또는 약 10% 내지 약 70%의 몰비를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-양이온 지질은 중성 지질, 즉 본 조성물이 제형화되고/되거나 투여되는 조건 하에서 순전하(net charge)를 띠지 않는 지질이다. 일부 구현예에서, 리포솜 내 비-양이온 지질의 백분율은 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과 또는 40% 초과일 수 있다.
콜레스테롤-기반 지질(Cholesterol-based Lipids)
일부 구현예에서, 제공된 리포솜은 하나 이상의 콜레스테롤-기반 지질을 포함한다. 예를 들어, 적합한 콜레스테롤-기반 양이온 지질은 예컨대, DC-Choi(N,N-디메틸-N-에틸카르복사미도콜레스테롤), l,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); U.S. Pat. No. 5,744,335) 또는 ICE를 포함한다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤-기반 지질은 리포솜에 존재하는 전체 지질의 약 2% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 몰비를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자에서 콜레스테롤-기반 지질의 백분율은 5%, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과 또는 40% 초과일 수 있다.
페길화 지질(PEGylated Lipids)
일부 구현예에서, 제공된 리포솜은 하나 이상의 페길화 지질을 포함한다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 인지질 및 N-옥타노일-스핑고신-l-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라미드)을 포함하여 유도된 세라미드(PEG-CER)와 같은 유도된 지질의 사용이 또한 일부 구현예에서, 양이온 및 리포솜을 포함하는 다른 지질들 중 하나 이상을 함께 조합하여 본 발명에서 고려된다. 고려된 PEG-변형 지질은 이에 제한되지 않지만, C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 갖는 지질에 공유 결합된 길이 5 kDa까지의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-변형 또는 페길화 지질은 페길화 콜레스테롤 또는 PEG-2K이다. 이와 같은 구성 성분의 첨가는 복합체 뭉침을 예방할 수 있고 또한 순환 수명을 늘리고 표적 세포에 대한 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있거나(Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), 생체내에서 제형으로부터 빠르게 교환하도록 선택될 수 있다(미국 등록특허 번호 제5,885,613호 참조).
일부 구현예에서, 특히 유용한 교환가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예컨대, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다. 본 발명의 PEG-변형 인지질 및 유도된 지질은 리포솜에 존재하는 전체 지질의 약 0% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%의 몰비를 포함할 수 있다.
여러가지 구현예에 따르면, 지질 나노입자뿐만 아니라 서로에 대한 이러한 지질의 상대적인 몰비를 포함하는 양이온 지질, 비-양이온 지질 및/또는 PEG-변형 지질의 선택은 선택된 지질(들)의 특성, 의도된 표적 세포의 성질, 전달되는 MCNA의 특성을 기초로 한다. 추가적인 고려사항은 예를 들어, 알킬 사슬의 포화뿐 아니라 선택된 지질(들)의 크기, 전하, pH, pKa, 융해성(fusogenicity) 및 독성을 포함한다. 따라서 몰비는 적절하게 조정될 수 있다.
리포솜의 형성
본 발명의 조성물에서 사용되기 위한 리포솜 수송 운반체는 당해 기술분야에서 현재 알려져있는 여러가지 기법에 의해 제조될 수 있다. 제공된 조성물에서 사용되기 위한 리포솜은 당해 기술분야에서 현재 알려져있는 여러가지 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 다층 소낭(multilamellar vesicles, MLV)이 예컨대, 선택된 지질을 적합한 용기 또는 베슬(vessel)의 내벽 상에 침전시키고 적절한 용매에 지질을 용해시킨 후 용매를 증발시켜 베슬의 내부 상에 박막을 남기거나 분무 건조시키는 것과 같은 종래의 기법에 따라 제조될 수 있다. 그런 다음 수성 상(aqueous phase)이 소용돌이 운동(vortexing motion)으로 베슬에 첨가될 수 있고 결과적으로 MLV가 형성된다. 그런 다음 단층 소낭(Unilamellar vesicles, ULV)이 다층 소낭의 균질화(homogenization), 초음파처리(sonication) 또는 압출(extrusion)에 의해 형성될 수 있다. 또한, 단층 소낭은 세제 제거 기법에 의해 형성될 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물은 리포솜을 포함하되, 여기서 MCNA는 리포솜의 양 표면 상에 결합되고 동일한 리포솜의 내부에 캡슐화된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 제조하는 동안, 양이온 리포솜은 정전기적 상호작용을 통해 MCNA와 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 제조하는 동안, 양이온 리포솜은 정전기적 상호작용을 통해 MCNA와 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 리포솜 내에 캡슐화된 MCNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 MCNA 종은 동일한 리포솜에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 MCNA 종은 상이한 리포솜에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, MCNA는 그의 지질 조성, 지질 구성 성분의 몰비, 크기, 전하(제타 전위(Zeta potential)), 표적 리간드 및/또는 이들의 조합이 다른 하나 이상의 리포솜에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리포솜은 양이온 지질, 중성 지질, PEG-변형 지질 및/또는 이들의 조합의 상이한 조성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리포솜은 리포솜을 생성하는 데 사용되는 양이온 지질, 중성 지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형 지질의 상이한 몰비를 가질 수 있다.
원하는 MCNA를 리포솜 내에 통합시키는 과정을 종종 "로딩(loading)"이라 부른다. 예시적 방법은 Lasic, et al., FEBS Lett., 312:255-258, 1992에 기재되어 있고, 본원에 참조로서 포함된다. 리포솜-통합 핵산은 리포솜의 내부 공간, 리포솜의 이중층 막 내부에 완전히 또는 부분적으로 위치할 수 있거나 리포솜 막의 외부 표면과 결합할 수 있다. 리포솜 내로 핵산을 통합하는 것을 또한 본원에서 "캡슐화"라고 지칭하며, 여기서 핵산은 리포솜의 내부 공간에 완전히 포함된다. 리포솜과 같은 수송 운반체 내로 MCNA를 통합하는 목적은 종종 핵산을 분해하는 효소 또는 화학물질 및/또는 핵산의 급속한 분비를 야기하는 시스템 또는 수용체를 포함할 수 있는 환경으로부터 핵산을 보호하는 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 적합한 전달 운반체는 내부에 포함된 MCNA의 안정성을 강화시킬 수 있고/있거나 표적 세포 또는 조직으로 MCNA의 전달을 용이하게 할 수 있다.
리포솜 크기
본 발명에 따른 적합한 리포솜은 다양한 크기로 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 리포솜은 이전에 공지된 mRNA 캡슐화 리포솜보다 더 작게 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜의 감소된 크기는 MCNA의 더 나은 전달 효능과 연관된다. 적절한 리포솜 크기의 선택은 표적 세포 또는 조직의 부위 및 리포솜이 만들어지는 적용을 어느 정도 고려할 수 있다.
일부 구현예에서, 리포솜의 적절한 크기는 MCNA에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 전신 분포를 촉진시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 특정 세포 또는 조직에 MCNA의 형질 주입을 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 간세포를 표적하기 위하여, 리포솜의 치수가 간에서 간동양혈관(hepatic sinusoids)의 내벽을 이루는 내피층(endothelial layer)의 구멍보다 더 작도록 리포솜의 크기가 조정될 수 있고; 이러한 경우 리포솜은 쉽게 이와 같은 내피 구멍을 통과하여 표적 간세포에 도달할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 리포솜의 치수가 특정 세포 또는 조직으로의 분포를 제한하거나 분명히 피하기에 충분한 직경이 되도록 리포솜의 크기가 조정될 수 있다. 예를 들어, 리포솜의 치수가 간동양혈관의 내벽을 이루는 내피층의 구멍보다 더 크도록 리포솜의 크기를 조정함으로써 간세포에 리포솜의 분포를 제한할 수 있다.
일부 구현예에서, 리포솜의 크기는 리포솜 입자의 가장 큰 직경의 길이에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 적합한 리포솜은 약 250 nm 이하의 크기(예컨대, 약 225 nm 이하, 200 nm 이하, 175 nm 이하, 150 nm 이하, 125 nm 이하, 100 nm 이하, 75 nm 이하, 또는 50 nm 이하)를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 리포솜은 약 10~250 nm의 범위(예컨대, 약 10~225 nm, 10~200 nm, 10~175 nm, 10~150 nm, 10~125 nm, 10~100 nm, 10~75 nm, 또는 10~50 nm)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 리포솜은 약 10~250 nm의 범위(예컨대, 약 100~225 nm, 100~200 nm, 100~175 nm, 100~150 nm)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 리포솜은 약 10~100 nm의 범위(예컨대, 약 10~90 nm, 10~80 nm, 10~70 nm, 10~60 nm 또는 10~50 nm)의 크기를 갖는다. 특정 구현예에서, 적합한 리포솜은 약 100 nm 미만의 크기를 갖는다.
당해 기술 분야에 알려진 다양한 대안적 방법이 리포솜 집단의 크기 조정을 위해 이용 가능하다. 하나의 이와 같은 크기 조정 방법이 미국 등록특허 번호 제4,737,323호에 기술되어 있고, 본원에 참조로서 포함된다. 배스(bath) 또는 프로브(probe) 초음파처리기에 의해 리포솜 현탁액을 초음파처리함으로써 직경을 약 0.05 미크론 미만의 작은 ULV로 점차 크기를 줄이게 된다. 균질화는 큰 리포솜 단편에서 보다 작은 리포솜으로의 전단 에너지에 의존하는 또 다른 방법이다. 전형적인 균질화 과정은, MLV를 표준 에멀전 균질화기(homogenizer)를 통해 선택된 리포솜 크기가 일반적으로 약 0.1 내지 0.5 미크론인 것이 관찰될 때까지 재순환시킨다. 리포솜의 크기는 본원에 참조로서 포함되는 Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-150 (1981)에 기술된 바와 같이 준 탄성 광 산란(quasi-electric light scattering, QELS)에 의해 결정될 수 있다. 평균 리포솜 직경은 형성된 리포솜의 초음파처리에 의해 줄어들 수 있다. 간헐적인 초음파 처리 사이클은 효율적인 리포솜 합성을 안내하기 위해 QELS 평가와 교대로 할 수 있다.
폴리머
일부 구현예에서, 적합한 전달 운반체는 담체로서 폴리머를 단독으로 또는 본원에 기술된 여러 가지 지질을 포함하여 다른 담체들과 조합하여 사용함으로써 제형화된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 리포솜 전달 운반체는 또한 나노입자를 포함하는 폴리머를 망라한다. 적합한 폴리머는 예를 들어, 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylates), 폴리락타이드(polylactide), 폴리락타이드-폴리글리콜라이드(polyglycolide) 코폴리머, 폴리카프로락톤(polycaprolactones), 덱스트란(dextran), 알부민, 젤라틴, 알지네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린(cyclodextrins), 프로타민(protamine), 페길화 프로타민, PLL, 페길화 PLL 및 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)을 포함할 수 있다. PEI가 존재하는 경우, 예컨대, 25 kDa 분지형 PEI(Sigma #408727)와 같이 10 내지 40 kDa 범위의 분자량의 PEI가 분지될 수 있다.
본 발명에 적합한 리포솜은 본원에 기술된 양이온 지질, 비-양이온 지질, 콜레스테롤 지질, 페길화 지질 및/또는 폴리머 중 임의의 것 하나 이상을 다양한 비율로 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 적합한 리포솜 제형은 cKK-E12, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; 또는 ICE, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K로부터 선택된 조합을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 양이온 지질(예컨대, cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)은 몰비로 리포솜의 약 30~60%(예컨대, 약 30~55%, 약 30~50%, 약 30~45%, 약 30~40%, 약 35~50%, 약 35~45%, 또는 약 35~40%)를 이룬다. 일부 구현예에서, 양이온 지질(예컨대, cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)의 백분율은 몰비로 리포솜의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40 % 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 또는 약 60% 이상이다.
일부 구현예에서, 양이온 지질(들) 대 비-양이온 지질(들) 대 콜레스테롤-기반 지질(들) 대 페길화 지질(들)의 비율은 각각 약 30~60:25~35:20~30:1~15 사이에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온 지질(들) 대 비-양이온 지질(들) 대 콜레스테롤-기반 지질(들) 대 페길화 지질(들)의 비율은 각각 대략 40:30:20:10이다. 일부 구현예에서, 양이온 지질(들) 대 비-양이온 지질(들) 대 콜레스테롤-기반 지질(들) 대 페길화 지질(들)의 비율은 각각 대략 40:30:25:5이다. 일부 구현예에서, 양이온 지질(들) 대 비-양이온 지질(들) 대 콜레스테롤-기반 지질(들) 대 페길화 지질(들)의 비율은 각각 대략 40:32:25:3이다. 일부 구현예에서, 양이온 지질(들) 대 비-양이온 지질(들) 대 콜레스테롤-기반 지질(들) 대 페길화 지질(들)의 비율은 각각 대략 50:25:20:5이다.
약학적 조성물
생체내 MCNA의 발현을 촉진하기 위해서, 리포솜과 같은 전달 운반체는 하나 이상의 추가적인 핵산, 담체, 표적 리간드 또는 안정화 제제의 조합이나 적합한 부형제와 혼합한 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 약물의 제형화 및 투여를 위한 기법은 "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 전달 운반체와 함께 캡슐화되거나 복합체화된 MCNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 운반체는 리포솜, 지질 나노입자, 고형-지질 나노입자, 폴리머, 바이러스, 졸-겔, 및 나노겔로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제공된 리포솜-캡슐화된 또는 리포솜-결합된 MCNA 및 이를 함유하는 조성물은 당업계의 임상의에게 적절하다고 여겨지는 대상의 임상적 상태, 투약 부위 및 방법, 투약 스케줄, 대상의 연령, 성별, 체중 및 다른 요인들을 고려하여, 현재 의학적 관행에 따라 투약 및 투여될 수 있다. 본원의 목적을 위한 "효과적인 양"은 실험적 임상 연구, 약학적, 임상적 및 의학적 기술 분야의 당업자에게 알려진 이러한 적절한 고려사항들에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 투약된 양은 증상의 적어도 어느 정도의 안정, 개선 또는 제거 및 당업자에 의해 질환의 진행, 퇴행 또는 개선의 적절한 측정을 위해 선택되는 기타 표지들을 달성하는 데 효과적이다. 예를 들어, 적합한 양 및 투여 요법은 적어도 일시적인 단백질(예컨대, 효소)의 생산을 야기하는 것이다.
본 발명은 전달의 필요가 있는 대상에게 MCNA를 투여하는 것을 포함하는 생체내 단백질 생산을 위한 MCNA를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, MCNA는 정맥내 전달, 피하 전달, 경구 전달, 진피하 전달, 안구 전달, 기관내 주사 폐 전달(예컨대, 분무), 근육내 전달, 경막내 전달 또는 관절내 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 경로를 통해 투여된다.
적합한 투여 경로는 예를 들어, 경구, 직장, 질, 점막경유, 기관내 또는 흡입을 포함하는 폐, 또는 장 투여; 진피내(intradermal), 피부경유(transdermal, 국소), 근육내, 피하, 골수내 주사뿐 아니라 경막내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 전달을 포함하는 비경구 전달을 포함한다. 특정한 구현예에서, 근육내 투여는 골격근, 평활근 및 심장근으로 이루어진 군으로부터 선택된 근육에 한다. 일부 구현예에서, 투여는 결과적으로 근육 세포에 MCNA의 전달을 가져온다. 일부 구현예에서, 투여는 결과적으로 간세포(즉, 간장 세포)에 MCNA의 전달을 가져온다. 특정한 구현예에서, 근육내 투여는 결과적으로 근육 세포에 MCNA의 전달을 가져온다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 리포솜-캡슐화 MCNA 및 조성물은 예를 들어, 표적 조직으로 직접 약학적 조성물의 주사를 통해, 바람직하게는 지속된 방출 제형으로 전신적인 방법보다는 국소적인 방법으로 투여될 수 있다. 국소적 전달은 표적된 조직에 따라 다양한 방법으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 함유하는 에어로졸은 (비강, 기관, 또는 기관지 전달로) 흡입될 수 있거나; 본 발명의 조성물은 부상, 질환 징후 또는 통증 부위에 주입될 수 있거나, 예를 들어; 조성물은 경구, 기관 또는 식도 적용을 위한 로젠지(lozenge) 목캔디형으로 제공될 수 있거나; 위 또는 장에 투여하기 위한 액형, 정제형 또는 캡슐형으로 공급될 수 있거나, 직장 또는 질 적용을 위한 좌약형으로 공급될 수 있거나; 크림, 점안약 또는 심지어 주사의 사용에 의해 눈에 전달될 수도 있다. 치료적 분자 또는 리간드와 복합체화된 제공된 조성물을 함유하는 제형은 예를 들어, 조성물이 이식 부위에서 주변 세포로 확산될 수 있게 하는 폴리머 또는 다른 구조 또는 물질과 관련하여 심지어 수술적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들은 폴리머 또는 지지체의 사용없이 수술적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 제공된 방법은 본원에 기술된 치료제(예컨대, MCNA)의 치료 유효량의 일회뿐 아니라 다회 투여를 고려한다. 치료제는 대상의 상태의 성질, 중증도 및 정도에 따라 일정한 간격으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료제(예컨대, MCNA)의 치료 유효량을 정기적으로 일정한 간격(예컨대, 일년에 한 번, 6개월에 한 번, 5개월에 한 번, 3개월에 한 번, 격월(2개월에 한 번), 매월(한 달에 한 번), 격주(이 주에 한 번), 한 달에 두 번, 30일에 한 번, 28일에 한 번, 14일에 한 번, 10일에 한 번, 7일에 한 번, 매주, 일 주일에 두 번, 매일 또는 계속)으로 경막내 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 리포솜 및/또는 조성물은 그에 함유된 MCNA의 연장-방출(extended-release)용으로 적합하도록 제형화된다. 이와 같은 연장-방출 조성물은 연장된 투여 간격으로 대상에게 알맞게 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하루에 두 번, 매일 또는 격일로 대상에게 투여된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상에게 일주일에 두 번, 일주일에 한 번, 7일에 한 번, 10일에 한 번, 14일에 한 번, 28일에 한 번, 30일에 한 번, 이 주에 한 번, 삼 주에 한 번, 또는 더욱 바람직하게는 사 주에 한 번, 한 달에 한 번, 한 달에 두 번, 6주에 한 번, 8주에 한 번, 두 달에 한 번, 3개월에 한 번, 4개월에 한 번, 6개월에 한 번, 8개월에 한 번, 9개월에 한 번, 또는 매년마다 투여된다. 또한, 연장된 기간 동안 MCNA를 전달 또는 방출하기 위해 데포(depot) 투여(예컨대, 근육내, 피하, 유리체강내)를 위해 제형화된 조성물 및 리포솜이 고려된다. 바람직하게는, 사용된 연장 방출 수단은 안정성을 강화하기 위해 MCNA에 이루어진 변형으로 결합된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "치료 유효량"은 본 발명의 약학적 조성물에 함유된 치료제의 총량에 따라 대체로 결정된다. 일반적으로, 치료 유효량은 대상에 의미있는 유익을 달성하기에 충분하다(예컨대, 질환 또는 장애를 치료, 조정, 치유, 예방 및/또는 개선하는 것). 예를 들어, 치료 유효량은 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 일반적으로, 치료제가 필요한 대상에 투여된 치료제(예컨대, MCNA)의 양은 대상의 특성에 따라 다를 것이다. 이러한 특성은 대상의 상태, 질환 중증도, 전체적인 건강 상태, 연령, 성별 및 체중을 포함한다. 당업자라면 이러한 요인들과 다른 관련 요인들에 따라 적절한 용량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 또한, 객관적 및 주관적 분석 둘 다는 최적의 용량 범위를 확인하는 데 선택적으로 적용될 수 있다.
치료 유효량은 다회의 단위 용량을 포함할 수 있는 투여요법으로 공통적으로 투여된다. 임의의 특정 치료 단백질의 경우, 치료 유효량(및/또는 효과적인 투여 요법 내에서 적절한 단위 용량)은 예를 들어, 투여 경로 또는 다른 치료제들과의 조합에 따라 다를 수 있다. 또한, 임의의 특정 환자를 위한 특이적 치료 유효량(및/또는 단위 용량)은 치료받는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 약학적 제제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 전체적인 건강 상태, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 적용되는 특이적 융합 단백질의 대사; 치료의 지속기간; 및 의학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 요인 등을 포함하는 다양한 요인들에 따라 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 유효량은 약 0.005 mg/kg 체중 내지 500 mg/kg 체중의 범위, 예컨대, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 400 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 300 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 200 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 90 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 80 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 70 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 60 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 40 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 30 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 25 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 15 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 범위이다.
일부 구현예에서, 치료 유효량은 약 0.1 mg/kg 체중 초과, 약 0.5 mg/kg 체중 초과, 약 1.0 mg/kg 체중 초과, 약 3 mg/kg 체중 초과, 약 5 mg/kg 체중 초과, 약 10 mg/kg 체중 초과, 약 15 mg/kg 체중 초과, 약 20 mg/kg 체중 초과, 약 30 mg/kg 체중 초과, 약 40 mg/kg 체중 초과, 약 50 mg/kg 체중 초과, 약 60 mg/kg 체중 초과, 약 70 mg/kg 체중 초과, 약 80 mg/kg 체중 초과, 약 90 mg/kg 체중 초과, 약 100 mg/kg 체중 초과, 약 150 mg/kg 체중 초과, 약 200 mg/kg 체중 초과, 약 250 mg/kg 체중 초과, 약 300 mg/kg 체중 초과, 약 350 mg/kg 체중 초과, 약 400 mg/kg 체중 초과, 약 450 mg/kg 체중 초과, 약 500 mg/kg 체중 초과이다. 특정한 구현예에서, 치료 유효량은 1.0 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 1.0 mg/kg의 치료 유효량은 근육내 또는 정맥내 투여된다.
또한 본원에 기술된 리포솜 중 하나 이상을 포함하는 동결건조된 약학적 조성물 및 예를 들어 그 교시의 전체가 본원에 참조로서 포함되는, 2011년 6월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/494,882호에 개시된 바와 같이 이러한 조성물의 사용을 위한 관련된 방법이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 동결건조된 약학적 조성물은 투여 전에 재구성될 수 있거나 생체내에서 재구성될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 약학적 조성물은 적절한 투여 제형(예컨대, 원반, 막대 또는 막과 같은 진피내 투여 제형)으로 제형화될 수 있고 투여 제형이 시간이 흐름에 따라 생체내에서 개인의 체액에 의해 다시 수화되도록 투여될 수 있다.
제공된 리포솜 및 조성물은 임의의 원하는 조직에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 리포솜 또는 조성물에 의해 전달된 MCNA는 리포솜 및/또는 조성물이 투여된 조직에서 발현된다. 일부 구현예에서, 제공된 리포솜 또는 조성물에 의해 전달된 MCNA는 리포솜 및/또는 조성물이 투여된 조직과 상이한 조직에서 발현된다. 전달된 MCNA가 전달될 수 있고/있거나 발현될 수 있는 예시적인 조직은 이에 제한되지는 않지만, 간, 신장, 심장, 비장, 혈청, 뇌, 골격근, 림프절, 피부 및/또는 뇌척수액을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 전의 기준 발현 수준과 비교하여 대상으로부터 채취한 생물학적 샘플의 MCNA 발현 수준을 증가시킨다. 전형적으로, 기준 수준은 치료 직전에 측정된다. 생물학적 샘플은 예를 들어 전혈, 혈청, 혈장, 소변 및 조직 샘플(예컨대, 근육, 간, 피부 섬유아세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 직전의 기준 수준과 비교하여 MCNA 발현 수준을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 받지 않은 대상의 MCNA 발현 수준과 비교하여 MCNA 발현 수준을 증가시킨다.
여러 가지 구현예에 따르면, 전달된 MCNA의 발현 시기는 특정한 의학적 필요에 맞추어 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전달된 MCNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현은 제공된 리포솜 및/또는 조성물의 투여 후 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 및/또는 96 시간 후에 탐지가능하다. 일부 구현예에서, 전달된 MCNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현은 투여 후 1 주, 2 주, 및/또는 1개월 후에 탐지가능하다.
실시예
본원에서 기술된 특정 화합물, 조성물 및 방법은 특정 구현예와 관련하여 특이적으로 기술된 한편, 다음의 실시예들은 오직 본 발명의 화합물을 예시하는 데 도움이 되지만 이를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 다량체 코딩 핵산(MCNA)의 예시적 합성
본 실시예는 본 출원에 기술된 MCNA를 합성하는 것과 생체내 치료 단백질을 인코딩하는 MCNA의 효과적인 전달 및 발현에 대한 예시적인 개요를 제공한다.
MCNA의 합성은 상보적인 DNA 스플린트를 사용하여 3'-3' 인산디에스테르 결합을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드에 라이게이션함으로써 시도되었다. 몇몇 상이한 T4 RNA 리가아제를 상보적인 DNA 스플린트를 사용하여 3'-3' 인산디에스테르 결합을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드에 라이게이션하는 능력에 대해 검사하였다. 제1 RNA 리가아제("RNA 리가아제 1")는 단일 RNA 가닥들, 이중 RNA 가닥들 및 단일 가닥 오버행(overhang)을 시행하도록 설계된 이중 RNA 가닥들을 라이게션하는 "단일 가닥" RNA 리가아제였다. 제2 RNA 리가아제("RNA 리가아제 2")는 상보적인 올리고뉴클레오티드에 결합된 RNA에서 틈새(nicks)를 라이게이션하는 "이중 가닥" RNA 리가아제였다. RNA 리가아제 1과 RNA 리가아제 2는 둘 다 라이게이션 반응을 위한 아데닐화를 진행하기 위해 올리고뉴클레오티드 브릿지의 5' 말단의 인산화를 필요로 하였다.
비제한적인 예로서, 적혈구형성인자(EPO) mRNA는 상보적인 DNA 스플린트를 사용하여 3'-3' 인산디에스테르 결합을 포함하는 브릿징 올리고에 라이게이션되었다. 3'-3' 인산디에스테르 결합 및 DNA 스플린트를 포함하는 브릿징 올리고뉴클레오티드의 예는 하기에 기술된다. 본원의 실시예에서 사용된 EPO의 예시적인 서열은 하기에 열거된다.
(5' 및 3' UTR을 포함하는) 적혈구형성인자(EPO) mRNA:
Figure 112018097889611-pct00079
(200 A 폴리(A) 꼬리를 갖는 5' 및 3' UTR을 포함하는) 적혈구형성인자(EPO) mRNA:
Figure 112018097889611-pct00080
(3' UTR에 내부 65A 폴리(A) 영역을 갖는 5' 및 3' UTR을 포함하는) 적혈구형성인자(EPO) mRNA:
Figure 112018097889611-pct00081
(3' UTR에 다수의 짧은 내부 폴리(A) 영역을 갖는 5' 및 3' UTR을 포함하는) 적혈구형성인자(EPO) mRNA:
Figure 112018097889611-pct00082
브릿징 올리고뉴클레오티드 1:
5'-CGA CUC UCG G-3'-PO4-3'-G GCU CUC AGC-5' (서열번호 5)
서열번호 5에 포함된 염기들은 2'-O-메틸 RNA이고 3'-3' 브릿지는 PO4를 포함한다.
브릿징 올리고뉴클레오티드 2:
5'-AAAAAAAAAA-3'-PO 4 -3'-AAAAAAAAAA-5' (서열번호 6)
브릿징 올리고뉴클레오티드 3:
5'-AAA-3'-PO 4 -3'-AAA-5' (서열번호 7)
브릿징 올리고뉴클레오티드 4:
5'-A-3'-PO 4 -3'-A-5' (서열번호 8)
스플린트 올리고뉴클레오티드 1:
5'-CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3' (서열번호 9)
스플린트 올리고뉴클레오티드 2:
5'-CCG AGA GTG ATG CAA CTT AAT TTT ATT AGG-3' (서열번호 10)
스플린트 올리고뉴클레오티드 3:
5'-TTT TTT TTT TAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3' (서열번호 11)
스플린트 올리고뉴클레오티드 4:
5'-CCG AGA GTC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3' (서열번호 12)
스플린트 올리고뉴클레오티드 5:
3'-G GAT TAT TTT AAT TCA ACG TAG TTC GAG CTG AGA GCC-5'-PO4-5'-CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3' (서열번호 13)
스플린트 올리고뉴클레오티드 6:
3'-GGA TTA TTT TAA TTC AAC GTA GTG AGA GCC-5'-PO4-5'-CCG AGA GTG ATG CAA CTT AAT TTT ATT AGG-3' (서열번호 14)
스플린트 올리고뉴클레오티드 7:
3'-G GAT TAT TTT AAT TCA ACG TAG TTC GAT TTT TTT TTT-5'-PO4-5'-TTT TTT TTT TAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3' (서열번호 15)
스플린트 올리고뉴클레오티드 8:
3'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG CTG AGA GCC-5'-PO4-5'-CCG AGA GTC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3' (서열번호 16)
EPO MCNA #1 (폴리 A 꼬리 없음)
MCNA 1(서열번호 17)은 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5' 비번역 영역(UTR)과 3' UTR을 함유하는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 단일 단계에서 (A) T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K, 또는 (B) T4 RNA 리가아제 1, 또는 (C) T4 RNA 리가아제 2 중 하나를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(브릿징 올리고 1(서열번호 5); 5'- CGA CUC UCG G -3'-3'- G GCU CUC AGC -5', 볼드체 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 2'-하이드록시메틸화 RNA(OMeRNA) "브릿징" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 브릿징 올리고 1(스플린트 올리고 1(서열번호 9); 5' CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 대안적으로, MCNA는 스플린트 올리고뉴클레오티드 5(서열번호 13)와 5'-5' 인산디에스테르 결합으로 연결된 2 카피의 올리고 2를 함유하는 회문서열을 사용하여 제조하였다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고 1은 50 μM 브릿징 올리고 1, 1 mM ATP, 1X PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 1은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 3.2 μM 캐핑된 hEPO 전사체, 1.5 μM 브릿징 올리고 1 및 3 μM 스플린트 올리고 1(또는 1.5 uM스플린트 올리고 5)을 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 (A) 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB), 또는 (B) 1x RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1 mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB), 또는 (C) 1X T4RNA 리가아제 2 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 μM ATP pH 7.5, 25 °C) 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 2(NEB)를 포함하여 제조하였다. 각각은 37 °C에서 90분간 반응하였다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 이어서 세포 내에서 잠재적 내인성 RNA 분해효소(RNase) H가 PCNA 1을 절단하는 것을 예방하기 위해 브릿지 올리고뉴클레오티드 잔기를 제거하도록 정제된 MCNA 1 산물의 일부를 DNA 분해효소 I로 처리하였다.
대안적으로, MCNA 1(서열번호 17)은 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5' 비번역 영역(UTR)과 3' UTR을 함유하는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 단일 단계에서 (A) T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K 또는 (B) T4 RNA 리가아제 1 또는 (C) T4 RNA 리가아제 2 중 하나를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(브릿징 올리고 1(서열번호 5); 5'- CGA CUC UCG G -3'-3'- G GCU CUC AGC -5', 볼드체 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 2'-하이드록시메틸화 RNA(OMeRNA) "브릿징" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 브릿징 올리고 1(스플린트 올리고 1(서열번호 9); 5' CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 대안적으로, MCNA는 스플린트 올리고뉴클레오티드 6(서열번호 14)과 5'-5' 인산디에스테르 결합으로 연결된 2 카피의 올리고 2를 함유하는 회문서열을 사용하여 제조하였다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고 1은 50 μM 브릿징 올리고 1, 1 mM ATP, 1X PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 1은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 3.2 μM 캐핑된 hEPO 전사체, 1.5 μM 브릿징 올리고 1 및 3 μM 스플린트 올리고 1(또는 1.5 uM스플린트 올리고 6)을 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 (A) 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB) 또는 (B) 1x RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1 mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB) 또는 (C) 1X T4RNA 리가아제 2 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 μM ATP pH 7.5, 25 °C) 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 2(NEB)를 포함하여 제조하였다. 각각은 37 °C에서 90분간 반응하였다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 이어서 세포 내에서 잠재적 내인성 RNA 분해효소(RNase) H가 PCNA 1을 절단하는 것을 예방하기 위해 브릿지 올리고뉴클레오티드 잔기를 제거하도록 정제된 MCNA 1 산물의 일부를 DNA 분해효소 I로 처리하였다.
MCNA 1(폴리(A) 꼬리 서열 없음):
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU CGACUCUCGG-3'-PO 4 -3'- GGCUCUCAGC UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(서열번호 17)
EPO MCNA #2
MCNA 2(서열번호 18)는 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5' 비번역 영역(UTR)과 3' UTR을 함유하는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 단일 단계에서 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(브릿징 올리고 2(서열번호 6); 5'-AAA AAA AAA A-3'-3'-A AAA AAA AAA-5', 밑줄 친 염기 RNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 RNA "브릿징" 올리고뉴클레오티드와 3' UTR과 브릿징 올리고 2(스플린트 올리고 3(서열번호 11); 5' TTT TTT TTT TAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA).에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 대안적으로, MCNA는 스플린트 올리고뉴클레오티드 7(서열번호 15)과 5'-5' 인산디에스테르 결합으로 연결된 2 카피의 스플린트 올리고 7을 함유하는 회문서열을 사용하여 제조하였다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고 2는 50 μM 올리고 3, 1 mM ATP, 1X PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 2는 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 3.2 μM 캐핑된 hEPO 전사체, 1.5 μM 브릿징 올리고 2 및 3 μM 스플린트 올리고 3(또는 1.5 uM스플린트 올리고 7)을 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB)을 포함하여 제조하였고, 37 °C에서 90분간 반응하였다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
EPO PCNA #2(10A-10A 브릿지):
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU AAAAAAAAAA- 3'-PO 4 -3' - AAAAAAAAAA UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(서열번호 18)
EPO MCNA #3
MCNA 3(서열번호 19)은 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR을 함유하고 두 UTR 모두 hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 구성체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 추가로 처리되어 약 200 A의 폴리(A) 꼬리 길이로 통합되었다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 단일 단계에서 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(브릿징 올리고 1(서열번호 5); 5'- CGA CUC UCG G -3'-3'- G GCU CUC AGC -5', 볼드체 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 OMeRNA "브릿지" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 브릿징 올리고 1(스플린트 올리고 4(서열번호 12); 5' CCG AGA GTC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 대안적으로, MCNA는 스플린트 올리고뉴클레오티드 8(서열번호 16)과 5'-5' 인산디에스테르 결합으로 연결된 2 카피의 스플린트 올리고 4를 함유하는 회문서열을 사용하여 제조될 수 있었다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고 1은 50 μM 올리고 1, 1 mM ATP, 1X PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 1은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 3.2 μM 캐핑된 hEPO 전사체, 1.5 μM 브릿징 올리고 1 및 3 μM 스플린트 올리고 4를 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB)을 포함하여 제조하였고, 37 °C에서 90분간 반응하였다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
EPO PCNA #3(200A 폴리(A) 꼬리 포함):
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- CGACUCUCGG - 3'-PO 4 -3' - GGCUCUCAGC - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(서열번호 19)
EPO MCNA #4
MCNA 4(서열번호 20)는 3'-3' 인산디에스테르 결합에 의해 연결된 2개의 A를 포함하는 단일 디뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트-비의존성 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR을 함유하고 두 UTR이 모두 hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 구성체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 추가로 처리되어 약 200 A의 폴리(A) 꼬리 길이로 통합되었다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 2 단계를 통해 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 A의 또 다른 삼량체(timeric) 반복(브릿징 올리고 3(서열번호 7); 5'-AAA-3'-3'-AAA-5', 밑줄친 염기 RNA)에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 A의 삼량체 반복을 포함하는 RNA 브릿지 올리고뉴클레오티드에 라이게이션되었다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고 3은 50 μM 올리고 7, 1 mM ATP, 1x PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 3은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 2.4 μM의 캐핑되고 꼬리 있는 hEPO 전사체, 50 μM 브릿징 올리고 3을 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 변성되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB)을 포함하여 제조하였고, 37 °C에서 90분간 반응하였다. 그런 다음 부분 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 부분 라이게이션 반응물 및 첨가된 캐핑되고 꼬리 있는 hEPO 전사체의 1:1 몰비를 사용하여 라이게이션 반응을 반복하였고, 이전과 같이 정제하였다.
EPO PCNA #4(3A-3A 브릿지를 갖는 200A 폴리(A) 꼬리 포함):
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- AAA- 3'-PO 4 -3' -AAA- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(서열번호 20)
EPO MCNA #5
MCNA 5(서열번호 21)는 3'-3' 인산디에스테르 결합에 의해 연결된 2개의 A를 포함하는 단일 디뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트-비의존성 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR을 함유하고, 두 UTR 모두 hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 구성체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 추가로 처리되어 약 200 A의 폴리(A) 꼬리 길이로 통합되었다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 2 단계를 통해 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 또 다른 A(브릿징 올리고 4(서열번호 8); 5'-A-3'-3'-A-5', 밑줄친 염기 RNA)에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 A를 포함하는 RNA "브릿징" 디뉴클레오티드에 라이게이션되었다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고 4는 50 μM 브릿징 올리고 4, 1 mM ATP, 1x PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 4는 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 2.4 μM 캐핑되고 꼬리 있는 hEPO 전사체 및 50 μM 브릿징 올리고 4를 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 변성되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB)을 포함하여 제조하였고, 37 °C에서 90분간 반응하였다. 그런 다음 부분 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 부분 라이게이션 반응물 및 첨가된 캐핑되고 꼬리 있는 hEPO 전사체의 1:1 몰비를 사용하여 라이게이션 반응을 반복하였고, 이전과 같이 정제하였다.
EPO PCNA #5(1A-1A 브릿지를 갖는 200A 폴리(A) 꼬리 포함):
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- A- 3'-PO 4 -3' -A- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(서열번호 21)
EPO PCNA #6
PCNA 6(서열번호 22)은 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, 65개의 연속 A의 내부 섹션을 포함하는 3' UTR, 5' 비번역 영역(UTR)을 함유하고 두 UTR 모두 hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 단일 단계에서 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(브릿징 올리고 1(서열번호 5); 5'-CGA CUC UCG G-3'-3'-G GCU CUC AGC-5', 밑줄친 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 OMeRNA "브릿징" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 브릿징 올리고 1(스플린트 올리고 1(서열번호 9); 5' CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 브릿징 올리고 1은 50 μM 브릿징 올리고 1, 1 mM ATP, 1x PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화된다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 1은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 3.2 μM 캐핑된 hEPO 전사체, 1.5 μM 브릿징 올리고 1 및 3 μM 스플린트 올리고 1을 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화된다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB)을 포함하여 제조되고, 37 °C에서 90분간 반응한다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제한다.
EPO PCNA #6(내부 65A 폴리(A) 영역 포함):
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU CGACUCUCGG- 3'-PO 4 -3' - GGCUCUCAGC UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(서열번호 22)
EPO PCNA #7
PCNA 7(서열번호 23)은 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 인간 적혈구형성인자(hEPO) 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조된다. 요약하면, 5' 비번역 영역(UTR), 15 A의 3개의 스트레치(stretch) 및 16 A의 1개의 스트레치를 포함하는 3' UTR을 함유하고 두 UTR 모두 hEPO를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제된다. 그런 다음 이 hEPO 전사체는 단일 단계에서 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(브릿징 올리고 1(서열번호 5); 5'-CGA CUC UCG G-3'-3'-G GCU CUC AGC-5', 밑줄친 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 OMeRNA "브릿지" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 브릿징 올리고 1(스플린트 올리고 1(서열번호 9); 5' CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션된다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 올리고 1은 50 μM 브릿징 올리고 1, 1 mM ATP, 1x PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화된다. 그런 다음 인산화된 브릿징 올리고 1은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 3.2 μM 캐핑된 hEPO 전사체, 1.5 μM 브릿징 올리고 1 및 3 μM 스플린트 올리고 1을 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화된다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 1 U/μL T4 RNA 리가아제 1(NEB)을 포함하여 제조되고, 37 °C에서 90분간 반응한다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 정제한다.
EPO PCNA #7(다수의 짧은 내부 폴리(A) 영역 포함):
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAAAAAAAAAAAAAAAUCCCUGUGACCCCUCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAAAAAAAAAAAAAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU CGACUCUCGG- 3'-PO 4 -3' -GGCUCUCAGC UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGAAAAAAAAAAAAAAACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAAAAAAAAAAAAAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGAAAAAAAAAAAAAAAACCCCUCCCCAGUGUCCCUAAAAAAAAAAAAAAACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(서열번호 23)
도 5는 겔 전기영동을 통해 검출된 MCNA의 결과를 나타낸다. 1-15 레인에 MCNA 런(run)은 EPO mRNA 대 브릿징 올리고뉴클레오티드 대 DNA 스플린트(서열번호 9)를 2:1:2의 몰비로 포함하는 라이게이션 반응의 결과물이었다. EPO mRNA와 RNA 리가아제의 몰량(molar amount)은 하기 표에 포함된다:
Figure 112018097889611-pct00083
도 5는 RNA 리가아제 1이 시험된 조건 하에서 EPO RNA를 포함하는 MCNA의 생산에서 RNA 리가아제 2보다 우수한 것을 보여준다. 또한, 반응 조건에 10% PEG를 첨가하면 라이게이션을 강화시켰다.
도 6은 겔 전기영동을 통해 검출된 MCNA를 나타낸다. 레인 1은 캐핑된 EPO mRNA(폴리(A) 꼬리 없음)를 나타낸다. 레인 2는 반응하지 않은/부분적으로 반응한 EPO RNA 산물(DNA분해효소 미처리)과 혼합된 전장(full length) MCNA 라이게이션 산물의 MCNA 혼합물을 나타낸다. 레인 3은 반응하지 않은/부분적으로 반응한 EPO RNA 산물(DNA분해효소 처리)과 혼합된 전장 MCNA 라이게이션 산물의 MCNA 혼합물을 나타낸다.
도 8은 겔 전기영동을 통해 검출된 MCNA를 나타낸다. 레인 1은 RNA 사이징(sizing) 사다리를 나타낸다. 레인 2는 반응하지 않은/부분적으로 반응한 EPO RNA 산물과 혼합된 전장 MCNA 라이게이션 산물의 MCNA 혼합물을 나타낸다. 레인 3은 정제된 반응하지 않은/부분적으로 반응한 EPO RNA 산물을 나타낸다. 레인 4는 정제된 EPO MCNA 라이게이션 산물을 나타낸다.
MCNA-OTC 제조
인간 오르니틴 트랜스카바밀라제(hOTC) RNA(서열번호 24)를 포함하는 MCNA-OTC는 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 hOTC 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, hOTC를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5' 비번역 영역(UTR)과 3' UTR을 함유하는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 그런 다음 이 hOTC 전사체는 단일 단계에서 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(올리고 1(브릿지)(서열번호 5); 5'- CGA CUC UCG G -3'-3'- G GCU CUC AGC -5', 볼드체 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 2'-하이드록시메틸화 RNA(OMeRNA) "브릿지" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 올리고 1(올리고 2(스플린트)(서열번호 9); 5' CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 올리고 1은 50 μM 올리고 1, 1 mM ATP, 1X PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 올리고 1(브릿지)은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 3.3 μM 캐핑된 hOTC 전사체, 1.5 μM 올리고 1 및 3.3 μM 올리고 2를 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 0.33 U/μL T4 RNA 리가아제 1을 포함하여 제조하였다. 각각은 37 °C에서 60분간 반응하였다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 DNA분해효소 I과 반응시키고 이어서 RNeasy Maxi Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 반응 생성물은 TBE/아가로스(agarose) 겔 전기영동을 사용하여 라이게이션 효율을 측정하였다. 동정된 MCNA-OTC 산물은 Lipofectamine으로 평형화시켰고 접착성 HEK293 세포에 형질주입하였다. 그런 다음 미분획된 세포 용해물을 오르니틴과 카바모일 인산(carbamoyl phosphate)으로부터의 시트룰린 생산에 대한 분석을 하였다(도 10).
MCNA-OTC
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGCUGUUCAACCUUCGGAUCUUGCUGAACAACGCUGCGUUCCGGAAUGGUCACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGCUCCAGAACAAGGUGCAGCUCAAGGGGAGGGACCUCCUCACCCUGAAAAACUUCACCGGAGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCAGCCGACCUCAAAUUCCGGAUCAAGCAGAAGGGCGAAUACCUUCCUUUGCUGCAGGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGCAGCACUCGCACUAGACUGUCAACUGAAACCGGCUUCGCGCUGCUGGGAGGACACCCCUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUGGGUGUGAACGAAUCCCUCACCGACACAGCGCGGGUGCUGUCGUCCAUGGCAGACGCGGUCCUCGCCCGCGUGUACAAGCAGUCUGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCCUCCAUUCCUAUCAUUAAUGGAUUGUCCGACCUCUACCAUCCCAUCCAGAUUCUGGCCGAUUAUCUGACUCUGCAAGAACAUUACAGCUCCCUGAAGGGGCUUACCCUUUCGUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUUCUGCACAGCAUUAUGAUGAGCGCUGCCAAGUUUGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACCCCGAAGGGAUACGAGCCAGACGCCUCCGUGACGAAGCUGGCUGAGCAGUACGCCAAGGAGAACGGCACUAAGCUGCUGCUCACCAACGACCCUCUCGAAGCCGCCCACGGUGGCAACGUGCUGAUCACCGAUACCUGGAUCUCCAUGGGACAGGAGGAGGAAAAGAAGAAGCGCCUGCAAGCAUUUCAGGGGUACCAGGUGACUAUGAAAACCGCCAAGGUCGCCGCCUCGGACUGGACCUUCUUGCACUGUCUGCCCAGAAAGCCCGAAGAGGUGGACGACGAGGUGUUCUACAGCCCGCGGUCGCUGGUCUUUCCGGAGGCCGAAAACAGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUGCUGACCGAUUACUCCCCGCAGCUGCAGAAACCAAAGUUCUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU CGACUCUCGG-3'-PO 4 -3'- GGCUCUCAGC UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUCUUGAAACCAAAGACGUCGACGCCCCUCAUUAGCCAGUCGUCCCUGUGGUAGUGCCGGUACUAUCAGGUGAAGGACAAAAGCCGGAGGCCUUUCUGGUCGCUGGCGCCCGACAUCUUGUGGAGCAGCAGGUGGAGAAGCCCGAAAGACCCGUCUGUCACGUUCUUCCAGGUCAGGCUCCGCCGCUGGAACCGCCAAAAGUAUCAGUGGACCAUGGGGACUUUACGAACGUCCGCGAAGAAGAAAAGGAGGAGGACAGGGUACCUCUAGGUCCAUAGCCACUAGUCGUGCAACGGUGGCACCCGCCGAAGCUCUCCCAGCAACCACUCGUCGUCGAAUCACGGCAAGAGGAACCGCAUGACGAGUCGGUCGAAGCAGUGCCUCCGCAGACCGAGCAUAGGGAAGCCCCAGCGACGAACCUCCACGUAAGGUUUGAACCGUCGCGAGUAGUAUUACGACACGUCUUACAACAACGGCAGCGGCUAGGUGCUUUCCCAUUCGGGGAAGUCCCUCGACAUUACAAGAACGUCUCAGUCUAUUAGCCGGUCUUAGACCUACCCUACCAUCUCCAGCCUGUUAGGUAAUUACUAUCCUUACCUCCGAAGGAACCGGUCUCACAGGUCUAGUCUGACGAACAUGUGCGCCCGCUCCUGGCGCAGACGGUACCUGCUGUCGUGGGCGCGACACAGCCACUCCCUAAGCAAGUGUGGGUCUACCUAUAGAACCCACCAGUCCUUCGUCCCCACAGGAGGGUCGUCGCGCUUCGGCCAAAGUCAACUGUCAGAUCACGCUCACGACGCGAAGAGCUUCUAGUAGGGGUCCCUGAAAGGGACGUCGUUUCCUUCCAUAAGCGGGAAGACGAACUAGGCCUUAAACUCCAGCCGACUGUCGGUGUCGUACAUGAACUAGAGAAGAGGCCACUUCAAAAAGUCCCACUCCUCCAGGGAGGGGAACUCGACGUGGAACAAGACCUCGCCGACCGGCGUAGACUUCAAGGCCUGGUACUUCAACACUGGUAAGGCCUUGCGUCGCAACAAGUCGUUCUAGGCUUCCAACUUGUCGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(볼드체 염기는 OMeRNA이다.)(서열번호 24)
MCNA-PAH 제조
인간 페닐알라닌 수산화효소(hPAH) RNA(서열번호 25)를 포함하는 MCNA-PAH는 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 hPAH 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, hPAH를 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5' 비번역 영역(UTR)과 3' UTR을 함유하는 5'-캡 RNA는 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 그런 다음 이 hPAH 전사체는 단일 단계에서 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(올리고 1(브릿지)(서열번호 5); 5'- CGA CUC UCG G -3'-3'- G GCU CUC AGC -5', 볼드체 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 2'-하이드록시메틸화 RNA(OMeRNA) "브릿지" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 올리고 1(올리고 2(스플린트)(서열번호 9); 5' CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 올리고 1은 50 μM 올리고 1, 1 mM ATP, 1X PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 올리고 1(브릿지)은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 2.7 μM 캐핑된 hPAH 전사체, 1.2 μM 올리고 1 및 2.7 μM 올리고 2를 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 0.33 U/μL T4 RNA 리가아제 1을 포함하여 제조하였다. 각각은 37 °C에서 60분간 반응하였다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 DNA분해효소 I과 반응시키고 이어서 RNeasy Maxi Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 반응 생성물은 TBE/아가로스 겔 전기영동을 사용하여 라이게이션 효율을 측정하였다. 동정된 MCNA-PAH 산물은 Lipofectamine으로 평형화시켰고 접착성 HEK293 세포에 형질주입하였다. 그런 다음 미분획된 세포 용해물을 PAH-특이 ELISA를 사용하여 PAH 단백질 발현에 대한 분석을 하였다(도 11).
MCNA-PAH
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCCCAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU CGACUCUCGG-3'-PO 4 -3'- GGCUCUCAGC UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAAUGAACUAGAAGACGUCCCGCGACGUGUCCUACGGCUAGAGCGACAACUACGACAGCCGGUCCUAGAAGUCGACGACCCACAACAGGUCGUGGAGCUACGCGACCCACAUCCCCAGCAUCGCGUGCGACUUCCCCGCCCCCUACCACCGCCGCUUCAACGCGUGGAAGAGGAACCGCAGCAACUUCGAGAGCCGGUGCAUCAUGUCCCCGACCUUGAGCCAGUGCCACAUCAAGACCUACCGCCAGAAGAGGUCGAGGUCCCCGUCGUCGAACCCGAAGAGCGAGUCCGUCAUGACGUCGAGCGGCUUCGACGAGUCGUCCGGCCGCGGCAUCCGGAACUACGACAGCGGGACGAACGUGUCCGGCUUGAGGUGCCACUUGGUCAUCUACCACCGGUCGAAGAGCUACAUGAGCAGCCCCCGCGGGUCCGACCGGUCCGGCUAGAGGACCGACUUGACCCGCUUCGACGCCAGCGACUUGUCCCCGUGCACCGGGUCGUCGAGCACCGUCUACAGCCCGAGCCCCCACAUGUACCCGAACGACGGCACCGCCUACAUGACCCACGUCACCUUGUGCGCCUUCCGGUCCGGCGGGUCCUUCAGCGCCGACGAGUCGUCCGGCCGGUGCCCCGCGUCCGCCUUCGGCCACGUCCAGACGUCCUUGACCGAGUGCAGGAGGUCGACCCCCUACAACAGGAGCACCUUCGGCGUCAUGAAGAGGUCGUCCCCCUUCUACACCAACAUGAGCAUCGUCCGCACCCAGAACAUGUCCGAGAAGUCCCAGAACUUGUGCCACGGGGUCCAGAAGAAGAGGAGGAGGUACAUGAGGUGCGCCCCCUACCCGACCGGCACCGCCAUCAACAUCCGCUACAGCCGCUUGACGAACGCCGCCCGCGCCAUGUGCCCCAGGAACUUCGGCCCCACCAGCCGCAGGUCGAGCCGCGGCAUCGAGUCCUAGACCAACCGCUUCGCCAGGUCGAGGACCUACCACGCCCCCUUGGUCCCGUGCCACAGGAAGAAGAACAGCGCCGAGUCGAGCACGUGCCACCGCGGCUACAGCACCGCGUCCUAGAACUACUACAACCAGUCCCGCCCGUCCGACGCGAACAGGUCCACCCACUUCUUGAGCAUGAGCAGGAAGAAGUCCGCCGACCCCGCCGAGAGCUACACCCAGUCCAAGUGCAGCAAGAGGAGCUUGUCCGCGUCGUGGAACCGGUCCCGCGGGUGGAGGAGGAAGUCCGACUUCUAGUCCGACUACCGCGGCAAGACCAACGUCAACAGGAGCUACAUCGACCAGAGGACCGGCUUCAGCGAGUCGAACGCCGGGUCCGGCCCCAAGAGGUCGUGCCGCCACGAGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(볼드체 염기는 OMeRNA이다)(서열번호 25)
MCNA-CFTR 제조
인간 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절인자(hCFTR) RNA(서열번호 26)를 포함하는 MCNA-CFTR은 서열 내에 연결 3'-3' 인산디에스테르 결합과 2개의 5' 말단을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 hCFTR 단백질을 인코딩하는 RNA 2 카피의 3' 말단의 스플린트 라이게이션에 의해 제조하였다. 요약하면, hCFTR을 인코딩하는 RNA 서열 측부에 배열되는 5' 비번역 영역(UTR)과 3' UTR을 함유하는 5'-캡 RNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사되었고, 효소적으로 캐핑되어 5'-Cap 1 구조를 함유하고 정제되었다. 그런 다음 이 hCFTR 전사체는 단일 단계에서 T4 RNA 리가아제 1 + PEG 8K를 사용하여 제10 뉴클레오티드(nt)와 제11 뉴클레오티드(올리고 1(브릿지)(서열번호 5); 5'- CGA CUC UCG G -3'-3'- G GCU CUC AGC -5', 볼드체 염기 OMeRNA) 사이에 3'-3' 인산디에스테르 결합을 갖는 20개의 nt 회문서열을 함유하는 2'-하이드록시메틸화 RNA(OMeRNA) "브릿지" 올리고뉴클레오티드 및 3' UTR과 올리고 1(올리고 2(스플린트)(서열번호 9); 5' CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'; 모든 염기 DNA)에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 "스플린트"에 라이게이션되었다. 라이게이션을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 올리고 1은 50 μM 올리고 1, 1 mM ATP, 1X PNK 완충액(NEB; 70 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT pH 7.6, 25 °C) 및 0.5 U/μL T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소(NEB)를 포함하여 37 °C에서 1 시간 동안 반응하여 5'-말단이 인산화되었다. 그런 다음 인산화된 올리고 1(브릿지)은 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염되었고, 0.92 μM 캐핑된 hCFTR 전사체, 0.42 μM 올리고 1 및 0.92 μM 올리고 2를 포함하여 75 °C까지 5분간 가열한 후 점차적으로 실온으로 5분 넘게 냉각하는 반응에서 전사체 및 스플린트에 혼성화되었다. 이어서 RNA 라이게이션 반응물은 50% 희석된 혼성화 반응물 및 1X RNA 리가아제 완충액(NEB; 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7.5, 25 °C), 1mM ATP, 10% PEG 및 0.33 U/μL T4 RNA 리가아제 1을 포함하여 제조하였다. 각각은 37 °C에서 60분간 반응하였다. 그런 다음 완료된 라이게이션 반응물을 DNA분해효소 I과 반응시키고 이어서 RNeasy Maxi Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 반응 생성물은 TBE/아가로스 겔 전기영동을 사용하여 라이게이션 효율을 측정하였다. 동정된 MCNA-CFTR 산물은 Lipofectamine으로 평형화시켰고 접착성 HEK293 세포에 형질주입하였다. 그런 다음 미분획된 세포 용해물을 CFTR-특이 웨스턴 블롯팅을 사용하여 CFTR 단백질 발현에 대한 분석을 하였다(도 12).
MCNA-CFTR
5'-GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGCAACGCUCUCCUCUUGAAAAGGCCUCGGUGGUGUCCAAGCUCUUCUUCUCGUGGACUAGACCCAUCCUGAGAAAGGGGUACAGACAGCGCUUGGAGCUGUCCGAUAUCUAUCAAAUCCCUUCCGUGGACUCCGCGGACAACCUGUCCGAGAAGCUCGAGAGAGAAUGGGACAGAGAACUCGCCUCAAAGAAGAACCCGAAGCUGAUUAAUGCGCUUAGGCGGUGCUUUUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGCAUCUUCCUCUACCUGGGAGAGGUCACCAAGGCCGUGCAGCCCCUGUUGCUGGGACGGAUUAUUGCCUCCUACGACCCCGACAACAAGGAAGAAAGAAGCAUCGCUAUCUACUUGGGCAUCGGUCUGUGCCUGCUUUUCAUCGUCCGGACCCUCUUGUUGCAUCCUGCUAUUUUCGGCCUGCAUCACAUUGGCAUGCAGAUGAGAAUUGCCAUGUUUUCCCUGAUCUACAAGAAAACUCUGAAGCUCUCGAGCCGCGUGCUUGACAAGAUUUCCAUCGGCCAGCUCGUGUCCCUGCUCUCCAACAAUCUGAACAAGUUCGACGAGGGCCUCGCCCUGGCCCACUUCGUGUGGAUCGCCCCUCUGCAAGUGGCGCUUCUGAUGGGCCUGAUCUGGGAGCUGCUGCAAGCCUCGGCAUUCUGUGGGCUUGGAUUCCUGAUCGUGCUGGCACUGUUCCAGGCCGGACUGGGGCGGAUGAUGAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGAAAGAUUUCCGAACGGCUGGUGAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCAGUGAAGGCCUACUGCUGGGAAGAGGCCAUGGAAAAGAUGAUUGAAAACCUCCGGCAAACCGAGCUGAAGCUGACCCGCAAGGCCGCUUACGUGCGCUAUUUCAACUCGUCCGCUUUCUUCUUCUCCGGGUUCUUCGUGGUGUUUCUCUCCGUGCUCCCCUACGCCCUGAUUAAGGGAAUCAUCCUCAGGAAGAUCUUCACCACCAUUUCCUUCUGUAUCGUGCUCCGCAUGGCCGUGACCCGGCAGUUCCCAUGGGCCGUGCAGACUUGGUACGACUCCCUGGGAGCCAUUAACAAGAUCCAGGACUUCCUUCAAAAGCAGGAGUACAAGACCCUCGAGUACAACCUGACUACUACCGAGGUCGUGAUGGAAAACGUCACCGCCUUUUGGGAGGAGGGAUUUGGCGAACUGUUCGAGAAGGCCAAGCAGAACAACAACAACCGCAAGACCUCGAACGGUGACGACUCCCUCUUCUUUUCAAACUUCAGCCUGCUCGGGACGCCCGUGCUGAAGGACAUUAACUUCAAGAUCGAAAGAGGACAGCUCCUGGCGGUGGCCGGAUCGACCGGAGCCGGAAAGACUUCCCUGCUGAUGGUGAUCAUGGGAGAGCUUGAACCUAGCGAGGGAAAGAUCAAGCACUCCGGCCGCAUCAGCUUCUGUAGCCAGUUUUCCUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAGGAAAACAUCAUCUUCGGCGUGUCCUACGAUGAAUACCGCUACCGGUCCGUGAUCAAAGCCUGCCAGCUGGAAGAGGAUAUUUCAAAGUUCGCGGAGAAAGAUAACAUCGUGCUGGGCGAAGGGGGUAUUACCUUGUCGGGGGGCCAGCGGGCUAGAAUCUCGCUGGCCAGAGCCGUGUAUAAGGACGCCGACCUGUAUCUCCUGGACUCCCCCUUCGGAUACCUGGACGUCCUGACCGAAAAGGAGAUCUUCGAAUCGUGCGUGUGCAAGCUGAUGGCUAACAAGACUCGCAUCCUCGUGACCUCCAAAAUGGAGCACCUGAAGAAGGCAGACAAGAUUCUGAUUCUGCAUGAGGGGUCCUCCUACUUUUACGGCACCUUCUCGGAGUUGCAGAACUUGCAGCCCGACUUCUCAUCGAAGCUGAUGGGUUGCGACAGCUUCGACCAGUUCUCCGCCGAAAGAAGGAACUCGAUCCUGACGGAAACCUUGCACCGCUUCUCUUUGGAAGGCGACGCCCCUGUGUCAUGGACCGAGACUAAGAAGCAGAGCUUCAAGCAGACCGGGGAAUUCGGCGAAAAGAGGAAGAACAGCAUCUUGAACCCCAUUAACUCCAUCCGCAAGUUCUCAAUCGUGCAAAAGACGCCACUGCAGAUGAACGGCAUUGAGGAGGACUCCGACGAACCCCUUGAGAGGCGCCUGUCCCUGGUGCCGGACAGCGAGCAGGGAGAAGCCAUCCUGCCUCGGAUUUCCGUGAUCUCCACUGGUCCGACGCUCCAAGCCCGGCGGCGGCAGUCCGUGCUGAACCUGAUGACCCACAGCGUGAACCAGGGCCAAAACAUUCACCGCAAGACUACCGCAUCCACCCGGAAAGUGUCCCUGGCACCUCAAGCGAAUCUUACCGAGCUCGACAUCUACUCCCGGAGACUGUCGCAGGAAACCGGGCUCGAAAUUUCCGAAGAAAUCAACGAGGAGGAUCUGAAAGAGUGCUUCUUCGACGAUAUGGAGUCGAUACCCGCCGUGACGACUUGGAACACUUAUCUGCGGUACAUCACUGUGCACAAGUCAUUGAUCUUCGUGCUGAUUUGGUGCCUGGUGAUUUUCCUGGCCGAGGUCGCGGCCUCACUGGUGGUGCUCUGGCUGUUGGGAAACACGCCUCUGCAAGACAAGGGAAACUCCACGCACUCGAGAAACAACAGCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCCACCUCCUCUUAUUACGUGUUCUACAUCUACGUCGGAGUGGCGGAUACCCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCAGAGGACUGCCGCUGGUCCACACCUUGAUCACCGUCAGCAAGAUUCUUCACCACAAGAUGUUGCAUAGCGUGCUGCAGGCCCCCAUGUCCACCCUCAACACUCUGAAGGCCGGAGGCAUUCUGAACAGAUUCUCCAAGGACAUCGCUAUCCUGGACGAUCUCCUGCCGCUUACCAUCUUUGACUUCAUCCAGCUGCUGCUGAUCGUGAUUGGAGCAAUCGCAGUGGUGGCGGUGCUGCAGCCUUACAUUUUCGUGGCCACUGUGCCGGUCAUUGUGGCGUUCAUCAUGCUGCGGGCCUACUUCCUCCAAACCAGCCAGCAGCUGAAGCAACUGGAAUCCGAGGGACGAUCCCCCAUCUUCACUCACCUUGUGACGUCGUUGAAGGGACUGUGGACCCUCCGGGCUUUCGGACGGCAGCCCUACUUCGAAACCCUCUUCCACAAGGCCCUGAACCUCCACACCGCCAAUUGGUUCCUGUACCUGUCCACCCUGCGGUGGUUCCAGAUGCGCAUCGAGAUGAUUUUCGUCAUCUUCUUCAUCGCGGUCACAUUCAUCAGCAUCCUGACUACCGGAGAGGGAGAGGGACGGGUCGGAAUAAUCCUGACCCUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACCCUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUCGACGUGGACAGCCUGAUGCGAAGCGUCAGCCGCGUGUUCAAGUUCAUCGACAUGCCUACUGAGGGAAAACCCACUAAGUCCACUAAGCCCUACAAAAAUGGCCAGCUGAGCAAGGUCAUGAUCAUCGAAAACUCCCACGUGAAGAAGGACGAUAUUUGGCCCUCCGGAGGUCAAAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCAAAGUACACCGAGGGAGGAAACGCCAUUCUCGAAAACAUCAGCUUCUCCAUUUCGCCGGGACAGCGGGUCGGCCUUCUCGGGCGGACCGGUUCCGGGAAGUCAACUCUGCUGUCGGCUUUCCUCCGGCUGCUGAAUACCGAGGGGGAAAUCCAAAUUGACGGCGUGUCUUGGGAUUCCAUUACUCUGCAGCAGUGGCGGAAGGCCUUCGGCGUGAUCCCCCAGAAGGUGUUCAUCUUCUCGGGUACCUUCCGGAAGAACCUGGAUCCUUACGAGCAGUGGAGCGACCAAGAAAUCUGGAAGGUCGCCGACGAGGUCGGCCUGCGCUCCGUGAUUGAACAAUUUCCUGGAAAGCUGGACUUCGUGCUCGUCGACGGGGGAUGUGUCCUGUCGCACGGACAUAAGCAGCUCAUGUGCCUCGCACGGUCCGUGCUCUCCAAGGCCAAGAUUCUGCUGCUGGACGAACCUUCGGCCCACCUGGAUCCGGUCACCUACCAGAUCAUCAGGAGGACCCUGAAGCAGGCCUUUGCCGAUUGCACCGUGAUUCUCUGCGAGCACCGCAUCGAGGCCAUGCUGGAGUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAGGAGAACAAGGUCCGCCAAUACGACUCCAUUCAAAAGCUCCUCAACGAGCGGUCGCUGUUCAGACAAGCUAUUUCACCGUCCGAUAGAGUGAAGCUCUUCCCGCAUCGGAACAGCUCAAAGUGCAAAUCGAAGCCGCAGAUCGCAGCCUUGAAGGAAGAGACUGAGGAAGAGGUGCAGGACACCCGGCUUUAACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU 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염기는 OMeRNA이다.)(서열번호 26)
실시예 2. MCNA로 예시적 단백질 생산
본 실시예는 브릿징 올리고뉴클레오티드에 3' 말단에 의해 연결된 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 생산을 보여준다.
인간 적혈구생성인자(hEPO) mRNA를 포함하는 MCNA는 상기에 기술된 바와 같이 합성되었고 HEK293T 세포(샘플당 1 마이크로그램 RNA 형질주입)에 형질주입하는 데 사용되었다. 도 7은 세포가 a) 폴리A 꼬리가 결핍된 hEPO를 인코딩하는 mRNA 또는 b) hEPO mRNA를 포함하는 MCNA 또는 c) DNA 분해효소로 처리된 hEPO mRNA를 포함하는 MCNA 중 어느 하나로 형질주입되었을 때 HEK293T 세포로부터 분비된 hEPO 단백질의 양을 비교하는 실험의 결과를 나타낸다. 세포가 hEPO mRNA를 포함하는 MCNA 또는 hEPO mRNA를 포함하는 DNA 분해효소 처리된 MCNA로 형질주입됐을 때 꼬리가 없는 hEPO mRNA와 비교하여 단백질 생산이 명백하게 증가되었다.
도 9는 세포가 a) 폴리A 꼬리가 결핍된 hEPO를 인코딩하는 mRNA 또는 b) 반응하지 않은/부분적으로 반응한 EPO RNA를 갖는 hEPO mRNA를 포함하는 MCNA의 비정제 혼합물 또는 c) 정제된 반응하지 않은/부분적으로 반응한 EPO RNA 또는 d) 정제된 EPO MCNA 중 어느 하나로 형질주입되었을 때 HEK293T 세포로부터 분비된 hEPO 단백질의 양을 비교하는 실험의 결과를 나타낸다. 모든 샘플은 총 250 나노그램 RNA로 형질주입되었다. 세포가 정제된 EPO MCNA로 형질주입됐을 때 혼합물 또는 반응하지 않은 hEPO RNA와 비교하여 단백질 생산이 명백하게 증가되었다. 도 10은 세포가 a) 폴리A 꼬리가 결핍된 hOTC(hOTC 단량체)를 인코딩하는 mRNA 또는 b) hOTC mRNA를 포함하는 MCNA 중 어느 하나로 형질주입되었을 때 HEK293T 세포내에서 인간 OTC 단백질 활성의 양을 비교하는 실험(시트룰린 생산에 의해 측정)의 결과를 나타낸다. 세포가 hOTC를 포함하는 MCNA로 형질주입됐을 때 hOTC 단량체와 비교하여 유일하게 검출가능하게 단백질이 생산되었다.
도 11은 세포가 a) 폴리A 꼬리가 결핍된 hPAH(hPAH 단량체)를 인코딩하는 mRNA 또는 b) hPAH mRNA를 포함하는 MCNA 중 어느 하나로 형질주입되었을 때 HEK293T 세포내에서 생산된 인간 PAH 단백질의 양을 비교하는 실험의 결과를 나타낸다. 세포가 hPAH를 포함하는 MCNA로 형질주입됐을 때 hPAH 단량체와 비교하여 상당히 더 많은 단백질이 생산되었다.
도 12는 세포가 a) 폴리A 꼬리가 결핍된 hCFTR(hCFTR 단량체)을 인코딩하는 mRNA 또는 b) hCFTR mRNA를 포함하는 MCNA 중 어느 하나로 형질주입되었을 때 HEK293T 세포내에서 생산된 인간 CFTR 단백질의 양을 비교하는 실험의 결과를 나타낸다. 세포가 hCFTR을 포함하는 MCNA로 형질주입됐을 때 hCFTR 단량체와 비교하여 유일하게 검출가능하게 단백질이 생산되었다.\
실시예 3. MCNA로 예시적인 생체내 단백질 생산
본 실시예는 브릿징 올리고뉴클레오티드에 3' 말단에 의해 연결된 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 생체내 생산을 보여준다.
인간 오르니틴 카바모일전이효소(hOTC) mRNA를 포함하는 MCNA는 상기에 기술된바와 같이 합성되었다. spf ash 마우스를 지질 나노입자에 캡슐화된 hOTC MCNA로 정맥 주사 처리하였다. 투여후 24시간 또는 7일 둘 중 하나에 동물을 희생시키고 간을 분리하였다. 간 샘플에서 시트룰린 생산을 측정하였고, 투여후 7일차의 hOTC 단백질활성의 레벨을 투여후 24시간의 hOTC 단백질 활성의 레벨과 비교하여 확인하였다(도 13). 두 시간 지점에서 모두 hOTC 단백질 활성이 대조군 spf ash 마우스의 간에서보다 훨씬 컸다. 또한, 투여후 1일차 및 8일차 모두에서 웨스턴 블롯을 통해 실질적인 hOTC 단백질이 검출되었지만 오직 hOTC MCNA LNP로 처리된 spf ash 마우스에서만 검출되었고, hOTC 단량체 LNP로 처리된 마우스에서는 검출되지 않았고(도 14), 이는 관찰된 활성 데이터와 일치한다. 비교해보면, spf ash 마우스를 hOTC mRNA로 정맥 주사 처리한 경우, hOTC 단백질 활성의 레벨이 투여후 24시간일 때 투여후 7일차일 때보다 더 높았다(도 15). 도 16에 명확히 도시한 바와 같이, 투여후 7일차의 hOTC 단백질 활성을 24시간 후의 활성 레벨의 백분율로서 계산한 경우, hOTC mRNA(24시간 활성의 38%) 보다 hOTC MCNA(24시간 활성의 109%)의 경우 보다 지속된 생체내 활성이 관찰된다.
또 다른 연구에서, 인간 페닐알라닌 수산화효소(hPAH)를 포함하는 MCNA는 상기 기술된 바와 같이 합성되었다. PAH 넉아웃(KO) 마우스를 지질 나노입자로 캡슐화된 hPAH MCNA 또는 hPAH 단량체(5' 캡은 있지만 폴리A 꼬리가 없는 hPAH mRNA)중 하나로 정맥 주사 처리하였다. 투여후 24시간에 동물을 희생시키고 간을 분리하였다. hPAH 단량체로 처리한 마우스의 간에서보다 hPAH MCNA로 처리한 마우스의 간에서 27배보다 많은 hPAH 단백질이 검출되었다(도 17).
또한, hPAH MCNA LNP로 PAH 넉아웃(KO) 마우스를 처리한 후 효능이 입증되었다. 특히, hPAH MCNA로 처리한 후 24시간에 혈청 페닐알라닌 레벨이 상당히 감소한 반면, hPAH 단량체 LNP로 처리한 후 24시간에는 혈청 페닐알라닌의 감소가 보이지 않았다(도 18).
또 다른 연구에서, 인간 적혈구형성인자(hEPO)를 포함하는 MCNA는 상기에 기술된 바와 같이 합성되었다. 야생형 마우스를 지질 나노입자로 캡슐화된 hEPO MCNA 또는 hEPO 단량체(5' 캡은 있지만 폴리A 꼬리가 없는 hEPO mRNA)중 하나로 정맥 주사 처리하였다. 투여후 24시간에 동물로부터 혈청 샘플을 채취하였다. hEPO 단량체로 처리한 마우스의 혈청에서보다 hEPO MCNA로 처리한 마우스의 혈청에서 480배보다 많은 hEPO 단백질이 검출되었다(도 19).
또 다른 연구에서, 인간 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절인자(hCFTR)를 포함하는 MCNA는 상기에 기술된 바와 같이 합성되었다. CFTR KO 마우스는 지질 나노입자에 캡슐화된 hCFTR MCNA의 에어로졸화를 통해 처리되었다. 투여후 24시간 또는 7일 둘 중 하나에 동물을 희생시키고 폐를 분리하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, 투여후 24시간 및 7일차(갈색 염색) 둘 다에서 기관지 상피 기도(bronchial epithelial airways)(윗줄)뿐 아니라 폐포 영역(alveolar regions)(아랫줄) 모두에서 MCNA-유래 hCFTR 단백질이 검출되었다.
균등물
당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에 기재된 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> RANA THERAPEUTICS, INC. <120> MULTIMERIC CODING NUCLEIC ACID AND USES THEREOF <130> MRT-1237WO <150> 62/320,073 <151> 2016-04-08 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 827 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized nucleotide <400> 1 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180 ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240 gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300 cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360 auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420 uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480 cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540 cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600 cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660 auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720 gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780 ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcu 827 <210> 2 <211> 1027 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized nucleotide <400> 2 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180 ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240 gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300 cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360 auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420 uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480 cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540 cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600 cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660 auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720 gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780 ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcuaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaa 1027 <210> 3 <211> 891 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized nucleotide <400> 3 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180 ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240 gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300 cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360 auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420 uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480 cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540 cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600 cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660 auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720 gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780 ccagugccca ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaagcc uuguccuaau aaaauuaagu ugcaucaagc u 891 <210> 4 <211> 883 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized nucleotide <400> 4 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg 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auugaaacca cagacccugu cacuauaaga guaaguucga 1740 cgucacaagu cgugucgggc agcacuauaa gagccggagg aaccggaggu ucuccaugga 1800 gagguccuga gccgacagug ucuacuccgc accaccccgc ggguccugac ccuccggguc 1860 ucccucgcug ucgucccugu ccucuucggu gucgguccgu ccuguaagca cgugggggua 1920 gcacaguucc ugccacucag ugagaaccgu gccccuuagg cgcaagguua cguggcaagg 1980 gccggcgccu ccgaccuagc cagggccaca gaagauaccu ccaguuuugu cgcaccuacc 2040 gcagaggucc gcuagacagg 2060 <210> 21 <211> 2056 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1028)..(1029) <223> 3'-3' bridge between nucleotides at positions 1028 and 1029 comprises PO4 <400> 21 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180 ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240 gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa 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gaccagagga ccggcuucag cgagucgaac gccggguccg 3060 gccccaagag gucgugccgc cacgaguagc acaguuccug ccacucagug agaaccgugc 3120 cccuuaggcg caagguuacg uggcaagggc cggcgccucc gaccuagcca gggccacaga 3180 agauaccucc aguuuugucg caccuaccgc agagguccgc uagacagg 3228 <210> 26 <211> 9396 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4698)..(4699) <223> 3'-3' bridge between nucleotides at positions 4698 and 14699 comprises PO4 <400> 26 ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60 cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120 gacucaccgu ccuugacacg augcaacgcu cuccucuuga aaaggccucg guggugucca 180 agcucuucuu cucguggacu agacccaucc ugagaaaggg guacagacag cgcuuggagc 240 uguccgauau cuaucaaauc ccuuccgugg acuccgcgga caaccugucc gagaagcucg 300 agagagaaug ggacagagaa cucgccucaa agaagaaccc gaagcugauu aaugcgcuua 360 ggcggugcuu uuucuggcgg uucauguucu acggcaucuu ccucuaccug ggagagguca 420 ccaaggccgu gcagccccug uugcugggac ggauuauugc cuccuacgac cccgacaaca 480 aggaagaaag aagcaucgcu aucuacuugg gcaucggucu gugccugcuu uucaucgucc 540 ggacccucuu guugcauccu gcuauuuucg gccugcauca cauuggcaug cagaugagaa 600 uugccauguu uucccugauc uacaagaaaa cucugaagcu cucgagccgc gugcuugaca 660 agauuuccau cggccagcuc gugucccugc ucuccaacaa ucugaacaag uucgacgagg 720 gccucgcccu ggcccacuuc guguggaucg ccccucugca aguggcgcuu cugaugggcc 780 ugaucuggga gcugcugcaa gccucggcau ucugugggcu uggauuccug aucgugcugg 840 cacuguucca ggccggacug gggcggauga ugaugaagua cagggaccag agagccggaa 900 agauuuccga acggcuggug aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucagugaagg 960 ccuacugcug ggaagaggcc auggaaaaga ugauugaaaa ccuccggcaa accgagcuga 1020 agcugacccg caaggccgcu uacgugcgcu auuucaacuc guccgcuuuc uucuucuccg 1080 gguucuucgu gguguuucuc uccgugcucc ccuacgcccu gauuaaggga aucauccuca 1140 ggaagaucuu caccaccauu uccuucugua ucgugcuccg cauggccgug acccggcagu 1200 ucccaugggc cgugcagacu ugguacgacu cccugggagc cauuaacaag auccaggacu 1260 uccuucaaaa gcaggaguac aagacccucg aguacaaccu gacuacuacc gaggucguga 1320 uggaaaacgu caccgccuuu ugggaggagg gauuuggcga acuguucgag aaggccaagc 1380 agaacaacaa caaccgcaag accucgaacg gugacgacuc ccucuucuuu ucaaacuuca 1440 gccugcucgg gacgcccgug cugaaggaca uuaacuucaa gaucgaaaga ggacagcucc 1500 uggcgguggc cggaucgacc ggagccggaa agacuucccu gcugauggug aucaugggag 1560 agcuugaacc uagcgaggga aagaucaagc acuccggccg caucagcuuc uguagccagu 1620 uuuccuggau caugcccgga accauuaagg aaaacaucau cuucggcgug uccuacgaug 1680 aauaccgcua ccgguccgug aucaaagccu gccagcugga agaggauauu ucaaaguucg 1740 cggagaaaga uaacaucgug cugggcgaag gggguauuac cuugucgggg ggccagcggg 1800 cuagaaucuc gcuggccaga gccguguaua aggacgccga ccuguaucuc cuggacuccc 1860 ccuucggaua ccuggacguc cugaccgaaa aggagaucuu cgaaucgugc gugugcaagc 1920 ugauggcuaa caagacucgc auccucguga ccuccaaaau ggagcaccug aagaaggcag 1980 acaagauucu gauucugcau gagggguccu ccuacuuuua cggcaccuuc ucggaguugc 2040 agaacuugca gcccgacuuc ucaucgaagc ugauggguug cgacagcuuc gaccaguucu 2100 ccgccgaaag aaggaacucg auccugacgg aaaccuugca ccgcuucucu uuggaaggcg 2160 acgccccugu gucauggacc gagacuaaga agcagagcuu caagcagacc ggggaauucg 2220 gcgaaaagag gaagaacagc aucuugaacc ccauuaacuc cauccgcaag uucucaaucg 2280 ugcaaaagac gccacugcag augaacggca uugaggagga cuccgacgaa ccccuugaga 2340 ggcgccuguc ccuggugccg gacagcgagc agggagaagc cauccugccu cggauuuccg 2400 ugaucuccac ugguccgacg cuccaagccc ggcggcggca guccgugcug aaccugauga 2460 cccacagcgu gaaccagggc caaaacauuc accgcaagac uaccgcaucc acccggaaag 2520 ugucccuggc accucaagcg aaucuuaccg agcucgacau cuacucccgg agacugucgc 2580 aggaaaccgg gcucgaaauu uccgaagaaa ucaacgagga ggaucugaaa gagugcuucu 2640 ucgacgauau ggagucgaua cccgccguga cgacuuggaa cacuuaucug cgguacauca 2700 cugugcacaa gucauugauc uucgugcuga uuuggugccu ggugauuuuc cuggccgagg 2760 ucgcggccuc acugguggug cucuggcugu ugggaaacac gccucugcaa gacaagggaa 2820 acuccacgca cucgagaaac aacagcuaug ccgugauuau cacuuccacc uccucuuauu 2880 acguguucua caucuacguc ggaguggcgg auacccugcu cgcgaugggu uucuucagag 2940 gacugccgcu gguccacacc uugaucaccg ucagcaagau ucuucaccac aagauguugc 3000 auagcgugcu gcaggccccc auguccaccc ucaacacucu gaaggccgga ggcauucuga 3060 acagauucuc caaggacauc gcuauccugg acgaucuccu gccgcuuacc aucuuugacu 3120 ucauccagcu gcugcugauc gugauuggag caaucgcagu gguggcggug cugcagccuu 3180 acauuuucgu ggccacugug ccggucauug uggcguucau caugcugcgg gccuacuucc 3240 uccaaaccag ccagcagcug aagcaacugg aauccgaggg acgauccccc aucuucacuc 3300 accuugugac gucguugaag ggacugugga cccuccgggc uuucggacgg cagcccuacu 3360 ucgaaacccu cuuccacaag gcccugaacc uccacaccgc caauugguuc cuguaccugu 3420 ccacccugcg gugguuccag augcgcaucg agaugauuuu cgucaucuuc uucaucgcgg 3480 ucacauucau cagcauccug acuaccggag agggagaggg acgggucgga auaauccuga 3540 cccucgccau gaacauuaug agcacccugc agugggcagu gaacagcucg aucgacgugg 3600 acagccugau gcgaagcguc agccgcgugu ucaaguucau cgacaugccu acugagggaa 3660 aacccacuaa guccacuaag cccuacaaaa auggccagcu gagcaagguc augaucaucg 3720 aaaacuccca cgugaagaag gacgauauuu ggcccuccgg aggucaaaug accgugaagg 3780 accugaccgc aaaguacacc gagggaggaa acgccauucu cgaaaacauc agcuucucca 3840 uuucgccggg acagcggguc ggccuucucg ggcggaccgg uuccgggaag ucaacucugc 3900 ugucggcuuu ccuccggcug cugaauaccg agggggaaau ccaaauugac ggcgugucuu 3960 gggauuccau uacucugcag caguggcgga aggccuucgg cgugaucccc cagaaggugu 4020 ucaucuucuc ggguaccuuc cggaagaacc uggauccuua cgagcagugg agcgaccaag 4080 aaaucuggaa ggucgccgac gaggucggcc ugcgcuccgu gauugaacaa uuuccuggaa 4140 agcuggacuu cgugcucguc gacgggggau guguccuguc gcacggacau aagcagcuca 4200 ugugccucgc acgguccgug cucuccaagg ccaagauucu gcugcuggac gaaccuucgg 4260 cccaccugga uccggucacc uaccagauca ucaggaggac ccugaagcag gccuuugccg 4320 auugcaccgu gauucucugc gagcaccgca ucgaggccau gcuggagugc cagcaguucc 4380 uggucaucga ggagaacaag guccgccaau acgacuccau ucaaaagcuc cucaacgagc 4440 ggucgcuguu cagacaagcu auuucaccgu ccgauagagu gaagcucuuc ccgcaucgga 4500 acagcucaaa gugcaaaucg aagccgcaga ucgcagccuu gaaggaagag acugaggaag 4560 aggugcagga cacccggcuu uaacgggugg caucccugug accccucccc agugccucuc 4620 cuggcccugg aaguugccac uccagugccc accagccuug uccuaauaaa auuaaguugc 4680 aucaagcucg acucucgggg cucucagcuc gaacuacguu gaauuaaaau aauccuguuc 4740 cgaccacccg ugaccucacc guugaagguc ccgguccucu ccgugacccc uccccagugu 4800 cccuacggug ggcaauuucg gcccacagga cguggagaag gagucagaga aggaaguucc 4860 gacgcuagac gccgaagcua aacgugaaac ucgacaaggc uacgcccuuc ucgaagugag 4920 auagccugcc acuuuaucga acagacuugu cgcuggcgag caacuccucg aaaacuuacc 4980 ucagcauaac cgccuggaac aagaggagcu acugguccuu gacgaccgug aggucguacc 5040 ggagcuacgc cacgagcguc ucuuagugcc acguuagccg uuuccggacg aagucccagg 5100 aggacuacua gaccauccac uggccuaggu ccacccggcu uccaagcagg ucgucgucuu 5160 agaaccggaa ccucucgugc cuggcacgcu ccguguacuc gacgaauaca ggcacgcugu 5220 ccuguguagg gggcagcugc ucgugcuuca ggucgaaagg uccuuuaaca aguuagugcc 5280 ucgcguccgg cuggagcagc cgcuggaagg ucuaaagaac cagcgaggug acgagcauuc 5340 cuagguccaa gaaggccuuc caugggcucu ucuacuugug gaagaccccc uagugcggcu 5400 uccggaaggc ggugacgacg ucucauuacc uuaggguucu gugcggcagu uaaaccuaaa 5460 gggggagcca uaagucgucg gccuccuuuc ggcugucguc ucaacugaag ggccuuggcc 5520 aggcgggcuc uuccggcugg gcgacagggc cgcuuuaccu cuucgacuac aaaagcucuu 5580 accgcaaagg agggagccac augaaacgcc aguccaggaa gugccaguaa acuggaggcc 5640 ucccgguuua uagcaggaag aagugcaccc ucaaaagcua cuaguacugg aacgagucga 5700 ccgguaaaaa caucccgaau caccugaauc acccaaaagg gagucauccg uacagcuacu 5760 ugaacuugug cgccgacugc gaagcguagu ccgacaggug cagcuagcuc gacaagugac 5820 gggugacguc ccacgaguau uacaaguacc gcucccaguc cuaauaaggc ugggcaggga 5880 gagggagagg ccaucagucc uacgacuacu uacacuggcg cuacuucuuc uacugcuuuu 5940 aguagagcua cgcguagacc uugguggcgu cccaccuguc cauguccuug guuaaccgcc 6000 acaccuccaa gucccggaac accuucuccc aaagcuucau cccgacggca ggcuuucggg 6060 ccucccaggu gucagggaag uugcugcagu guuccacuca cuucuacccc cuagcaggga 6120 gccuaagguc aacgaagucg acgaccgacc aaaccuccuu cauccgggcg ucguacuacu 6180 ugcgguguua cuggccgugu caccggugcu uuuacauucc gacgucgugg cgguggugac 6240 gcuaacgagg uuagugcuag ucgucgucga ccuacuucag uuucuaccau ucgccguccu 6300 cuagcagguc cuaucgcuac aggaaccucu uagacaaguc uuacggaggc cggaagucuc 6360 acaacuccca ccuguacccc cggacgucgu gcgauacguu guagaacacc acuucuuaga 6420 acgacugcca cuaguuccac accuggucgc cgucaggaga cuucuuuggg uagcgcucgu 6480 cccauaggcg gugaggcugc aucuacaucu ugugcauuau ucuccuccac cuucacuauu 6540 agugccguau cgacaacaaa gagcucacgc accucaaagg gaacagaacg ucuccgcaca 6600 aaggguuguc ggucucgugg uggucacucc ggcgcuggag ccgguccuuu uagugguccg 6660 ugguuuaguc gugcuucuag uuacugaaca cgugucacua cauggcgucu auucacaagg 6720 uucagcagug ccgcccauag cugagguaua gcagcuucuu cgugagaaag ucuaggagga 6780 gcaacuaaag aagccuuuaa agcucgggcc aaaggacgcu gucagaggcc cucaucuaca 6840 gcucgagcca uucuaagcga acuccacggu cccugugaaa ggcccaccua cgccaucaga 6900 acgccacuua caaaaccggg accaagugcg acacccagua guccaagucg ugccugacgg 6960 cggcggcccg aaccucgcag ccuggucacc ucuagugccu uuaggcuccg uccuaccgaa 7020 gagggacgag cgacaggccg uggucccugu ccgcggagag uuccccaagc agccucagga 7080 ggaguuacgg caaguagacg ucaccgcaga aaacgugcua acucuugaac gccuaccuca 7140 auuaccccaa guucuacgac aagaaggaga aaagcggcuu aaggggccag acgaacuucg 7200 agacgaagaa ucagagccag guacuguguc cccgcagcgg aagguuucuc uucgccacgu 7260 uccaaaggca guccuagcuc aaggaagaaa gccgccucuu gaccagcuuc gacagcguug 7320 gguagucgaa gcuacucuuc agcccgacgu ucaagacguu gaggcucuuc cacggcauuu 7380 ucauccuccu ggggaguacg ucuuagucuu agaacagacg gaagaagucc acgagguaaa 7440 accuccagug cuccuacgcu cagaacaauc gguagucgaa cgugugcgug cuaagcuucu 7500 agaggaaaag ccaguccugc agguccauag gcuucccccu cagguccucu auguccagcc 7560 gcaggaauau gugccgagac cggucgcucu aagaucgggc gaccgggggg cuguuccauu 7620 augggggaag cgggucgugc uacaauagaa agaggcgcuu gaaacuuuau aggagaaggu 7680 cgaccguccg aaacuagugc cuggccaucg ccauaaguag cauccugugc ggcuucuacu 7740 acaaaaggaa uuaccaaggc ccguacuagg uccuuuugac cgaugucuuc gacuacgccg 7800 gccucacgaa cuagaaaggg agcgauccaa guucgagagg guacuagugg uagucguccc 7860 uucagaaagg ccgaggccag cuaggccggu ggcgguccuc gacaggagaa agcuagaacu 7920 ucaauuacag gaagucgugc ccgcagggcu cguccgacuu caaacuuuuc uucucccuca 7980 gcaguggcaa gcuccagaac gccaacaaca acaagacgaa ccggaagagc uugucaagcg 8040 guuuagggag gaggguuuuc cgccacugca aaagguagug cuggagccau caucagucca 8100 acaugagcuc ccagaacaug aggacgaaaa cuuccuucag gaccuagaac aauuaccgag 8160 ggucccucag caugguucag acgugccggg uacccuugac ggcccagugc cgguacgccu 8220 cgugcuaugu cuuccuuuac caccacuucu agaaggacuc cuacuaaggg aauuaguccc 8280 gcauccccuc gugccucucu uuguggugcu ucuugggccu cuucuucuuu cgccugcuca 8340 acuuuaucgc gugcauucgc cggaacgccc agucgaaguc gagccaaacg gccuccaaaa 8400 guuaguagaa aagguaccgg agaagggucg ucauccggaa gugacugacc uacaaaagcu 8460 aguaaaggcu ucacuagugg ucggcaagcc uuuagaaagg ccgagagacc agggacauga 8520 aguaguagua ggcgggguca ggccggaccu ugucacgguc gugcuagucc uuagguucgg 8580 gugucuuacg gcuccgaacg ucgucgaggg ucuaguccgg guagucuucg cggugaacgu 8640 cuccccgcua ggugugcuuc acccgguccc gcuccgggag cagcuugaac aagucuaaca 8700 accucucguc ccugugcucg accggcuacc uuuagaacag uucgugcgcc gagcucucga 8760 agucucaaaa gaacaucuag ucccuuuugu accguuaaga guagacguac gguuacacua 8820 cguccggcuu uuaucguccu acguuguucu cccaggccug cuacuuuucg uccgugucug 8880 gcuacggguu caucuaucgc uacgaagaaa gaaggaacaa cagccccagc auccuccguu 8940 auuaggcagg gucguugucc ccgacgugcc ggaaccacug gagagggucc aucuccuucu 9000 acggcaucuu guacuuggcg gucuuuuucg uggcggauuc gcguaauuag ucgaagccca 9060 agaagaaacu ccgcucaaga gacaggguaa gagagagcuc gaagagccug uccaacaggc 9120 gccucaggug ccuucccuaa acuaucuaua gccugucgag guucgcgaca gacaugggga 9180 aagaguccua cccagaucag gugcucuucu ucucgaaccu gugguggcuc cggaaaaguu 9240 cuccucucgc aacguagcac aguuccugcc acucagugag aaccgugccc cuuaggcgca 9300 agguuacgug gcaagggccg gcgccuccga ccuagccagg gccacagaag auaccuccag 9360 uuuugucgca ccuaccgcag agguccgcua gacagg 9396

Claims (47)

  1. 다량체 코딩 핵산(multimeric coding nucleic acid, MCNA) 화합물이 2개 이상의 5' 말단을 포함하도록 3'-3' 반전 인산디에스테르 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 브릿지를 통해 3' 말단에 연결된 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 목적 단백질을 인코딩하는 합성 폴리리보뉴클레오티드인 다량체 코딩 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 동일한 단백질을 인코딩하는, 다량체 코딩 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드 각각은 별개의 단백질을 인코딩하는, 다량체 코딩 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 3개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 4개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 5개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인코딩 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상은 5' 비번역 영역(5' UTR) 또는 3' 비번역 영역(3' UTR), 또는 둘 다를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인코딩 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상은 3' UTR을 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 상기 3' UTR은 5~2,000개의 뉴클레오티드 길이인, 다량체 코딩 핵산.
  11. 제9항에 있어서, 상기 3' UTR은 사이에 스페이서(spacer)가 있는 복수의 다중-A 단편을 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 다중-A 단편 각각은 8~50개의 연속 아데노신을 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  13. 제11항에 있어서, 상기 복수의 다중-A 단편은 1~100개의 범위인, 다량체 코딩 핵산.
  14. 제11항에 있어서, 상기 스페이서는 5~100의 다양한 길이를 갖는, 다량체 코딩 핵산.
  15. 제11항에 있어서, 상기 스페이서는 DNA, RNA, 또는 변형 염기, 또는 이들의 조합을 포함하며,
    변형 염기는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로부터 선택되는, 다량체 코딩 핵산.
  16. 제9항에 있어서, 상기 3' UTR은 유사매듭구조를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  17. 제9항에 있어서, 상기 3' UTR은 폴리아데닐화(poly-A) 꼬리가 뒤따르지 않는, 다량체 코딩 핵산.
  18. 제1항에 있어서, 상기 인코딩 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상은 폴리-A 꼬리를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리-A 꼬리는 25~5,000개의 뉴클레오티드 길이인, 다량체 코딩 핵산.
  20. 제9항에 있어서, 상기 3' UTR은 폴리-A 결합 단백질(PABP)에 결합하는, 다량체 코딩 핵산.
  21. 제9항에 있어서, 상기 3' UTR은 "키싱 루프(kissing loop)" 서열 모티프를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  22. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 브릿지를 포함하는 상기 뉴클레오티드는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다량체 코딩 핵산.
  23. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 브릿지는 활성 부분(active moiety)에 대한 적어도 하나의 공유결합을 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 상기 활성 부분은 표적 그룹, 펩타이드, 대조 작용제, 소분자, 단백질, DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합인, 다량체 코딩 핵산.
  25. 제1항에 있어서, 3'-3' 반전 결합에 근접한 뉴클레오티드는 하나 이상의 트리안테너리(tri-antennary) GalNac 표적 제제로 기능화되는, 다량체 코딩 핵산.
  26. 제1항에 있어서, 상기 인코딩 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함하며,
    변형 뉴클레오티드는 2'-OMe-A, 2'-OMe-G, 2'-OMe-C, 2'-OMe-U, 2'-F-A, 2'-F-G, 2'-F-C, 2'-F-U, LNA-A, LNA-G, LNA-C, LNA-U, N6-메틸-아데노신, 2-티오우리딘(2sU), 5-메틸-시티딘(5mC), 유사우리딘(ΨU) 및 1-메틸-유사우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다량체 코딩 핵산.
  27. 제26항에 있어서, 상기 변형 뉴클레오티드는 상응하는 본래(native) 염기의 1~100%를 치환하는, 다량체 코딩 핵산.
  28. 제27항에 있어서, 우리딘의 적어도 25%가 2-티오우리딘으로 대체되는, 다량체 코딩 핵산.
  29. 제27항에 있어서, 시티딘의 100%가 5-메틸시티딘으로 대체되는, 다량체 코딩 핵산.
  30. 제26항에 있어서, 상기 변형 뉴클레오티드는 리보스 고리 상의 4'-티오 치환으로 더 변형되는, 다량체 코딩 핵산.
  31. 제1항에 있어서, 상기 본래의 뉴클레오티드는 리보스 고리 상의 4'-티오 치환으로 변형되는, 다량체 코딩 핵산.
  32. 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 치료 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  33. 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 효소, 수용체, 리간드, 항체의 경사슬 또는 중사슬, 뉴클레아제, 및/또는 DNA-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  34. 제33항에 있어서, 상기 2개 이상의 인코딩 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 다량체 코딩 핵산.
  35. 전달 운반체로 캡슐화되거나 복합체화된 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 다량체 코딩 핵산을 포함하는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 전달 운반체는 리포솜, 지질 나노입자, 고형-지질 나노입자, 폴리머, 바이러스, 졸-겔, 및 나노겔로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  37. 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 다량체 코딩 핵산을 포함하는, 조성물.
  38. 제37항에 있어서, MCNA는 전달 운반체로 캡슐화되거나 복합체화된, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 전달 운반체는 리포솜, 지질 나노입자, 고형-지질 나노입자, 폴리머, 바이러스, 졸-겔, 및 나노겔로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  40. 제37항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 전달, 피하(subcutaneous) 전달, 경구 전달, 진피하(subdermal) 전달, 안구 전달, 기관내 주사 폐 전달(예컨대, 분무), 근육내 전달, 경막내(intrathecal) 전달 또는 관절내 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 경로를 통한 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
  41. 제37항에 있어서, 상기 다량체 코딩 핵산은 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절인자(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, hCFTR) mRNA를 인코딩하는 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  42. 제37항에 있어서, 상기 다량체 코딩 핵산은 인간 페닐알라닌 수산화효소(human phenylalanine hydroxylase, hPAH) mRNA를 인코딩하는 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  43. 제 37항에 있어서, 상기 다량체 코딩 핵산은 인간 오르니틴 트랜스카바밀라제(human Ornithine transcarbamylase, hOTC) mRNA를 인코딩하는 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
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