KR102357260B1 - 마이크로rna를 이용한 당뇨병성 신경병증의 예측 및 진단 방법 및 이를 위한 키트 - Google Patents

Abstract

당뇨병성 신경병증의 지표가 될 수 있는 마이크로RNA를 이용하여 당뇨병성 신경병증을 진단하거나 예측하는 방법과 이를 위한 키트가 제공된다. 당뇨병성 신경병증의 예측 또는 진단용 조성물은 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커 측정용 시약을 포함한다.

Description

마이크로RNA를 이용한 당뇨병성 신경병증의 예측 및 진단 방법 및 이를 위한 키트{METHOD FOR DIAGNOSIS AND PREDICT OF DIABETIC NEUROPATHY USING MICRO-RNA AND KIT THEREFOR}

본 발명은 당뇨병성 신경병증을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단 키트에 대한 것이다. 상세하게는 당뇨병성 신경병증의 지표가 될 수 있는 마이크로RNA를 이용하여 당뇨병성 신경병증을 진단하거나 예측하는 방법과 이를 위한 키트에 대한 것이다. 더 상세하게는, 서로 상반된 양상의 발현수준을 보이는 마이크로RNA들을 이용하여 당뇨병성 신경병증 진단의 정확도를 높일 수 있는 방법 및 키트에 대한 것이다.

제1형 당뇨병(type 1 diabetes mellitus) 및 제2형 당뇨병(type 2 diabetes mellitus)의 흔한 미세혈관 합병증인 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy)은 당뇨병 환자에서 말초신경 기능 장애의 징후 및/또는 증상의 존재로 정의된다. 인구 및 임상 기반 연구는 20년간 제1형 당뇨병이 지속된 후에 당뇨병성 신경병증의 유병률이 20%이고 10년간의 제2형 당뇨병에서는 약 10% 내지 15%가 50%까지 증가함을 시사한다. 이러한 연구에도 불구하고, 서로 밀접하게 연관된 수많은 원인 메커니즘과 명확한 진단법 확립의 어려움 때문에 당뇨병성 신경병증의 병리 생리학은 명확하게 정의되지 않았다.

당뇨병성 신경병증의 진단 접근법은 복잡하고 아직까지 표준화되지 않았으며 결과의 감도 및 특이성을 증가시키기 위해 일반적으로 다양한 정성적 및 정량적 방법들의 조합으로 구성되어 왔다.

특히 종래의 방법으로는 명백한 임상 증상, 무증상 질환 과정을 가진 환자 또는 당뇨병성 신경병증 발달 후보를 확인하기 이전의 초기 이상에 대한 효과적인 선별이 불가능하였다. 당뇨병성 신경병증에 대한 신뢰성 있는 진단 방법이 결여된 것만큼이나 종래 사용되던 치료 요법에 대해서는 복잡성도 존재하였다. 당뇨병성 신경병증 발달에 대한 인과적 치료가 부재할 경우, 종래의 치료법은 종종 혈당 조절과 통증 관리의 조합으로 구성되었다.

이러한 문제점을 해결하고자 본 발명자는 당뇨병성 신경병증에 연관된 마이크로 RNA(micro-RNA 또는 miRNA, 이하, 'miRNA'로 약칭함)를 이용하는 방안에 주목하였다.

miRNA는 수 내지 수십개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 비번역 RNA로, 전사단계에서 RNA 침묵(RNA silencing), 그리고 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 이러한 miRNA의 기능은 mRNA 내의 상보서열과의 염기쌍의 형성을 통해 수행되는 것으로 알려져 있다(Bartel, D.P., Cell, 136(2): 215-233, 2009).

miRNA는 최초에 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 발견된 이후, 동물, 식물 및 바이러스에 유전자 발현의 조절기구로 활용되고 있음이 알려지면서 다양한 종류의 miRNA들이 속속 보고되고 있고, miRNA 유전자의 돌연변이 등에 기인하는 기능의 부조화에 의해 암 등 특정 질병이 발생할 수 있음이 알려지고 있다(Pontual et al., Nat. Genet., 43(10): 1026-1030, 2011; Lu et al., Nature 435(9): 834-838, 2005).

Bartel, D.P., Cell, 136(2): 215-233, 2009 Pontual et al., Nat. Genet., 43(10): 1026-1030, 2011; Lu et al., Nature 435(9): 834-838, 2005

앞서 설명한 것과 같이 당뇨병성 신경병증의 효과적인 치료를 위해서는 정확하고 신속한 진단이 필요하다. 이러한 문제를 해결하고자 당뇨병성 신경병증과 연관된 마이크로RNA를 이용한 진단 방법을 제시한다.

즉, 이에 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 당뇨병성 신경병증 하에서 고발현(over-expression) 또는 저발현(under-expression)되는 miRNA의 발현수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 당뇨병성 신경병증을 간단하게 진단하는 방법 또는 발현을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 당뇨병성 신경병증 하에서 서로 다른 양상의 발현수준을 보이는 miRNA들을 조합하여 발현수준을 측정함으로써 진단의 정확도를 높이는 것이다.

또한 이를 위한 당뇨병성 신경병증의 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 이를 위한 당뇨병성 신경병증을 진단하거나 예측할 수 있는 바이오 마커를 제공하는 것이다.

또, 이러한 바이오 마커를 이용한 당뇨병성 신경병증의 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 어느 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨병성 신경병증의 예측 또는 진단용 조성물은 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커 측정용 시약을 포함한다.

상기 시약은 상기 각 바이오마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편을 포함하는 것일 수 있다.

상기 핵산 서열 또는 핵산 서열의 단편은 상기 각 마커를 특이적 결합할 수 있는 프라미어, 또는 프로브, 또는 프라이머 및 프로브일 수 있다.

상기 시약은 상기 각 바이오 마커의 역전사 중합효소연쇄반응, 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 라이게이션 기반 중합효소 연쇄반응, 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약일 수 있다.

상기 다른 어느 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨병성 신경병증 마커를 검출하는 방법은, 당뇨병성 신경병증 진단 또는 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 당뇨병성 신경병증이 의심되는 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현량을 측정하는 단계; 상기 측정 결과를 대조군의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 발현량에 변화가 있는 경우, 이를 당뇨병성 신경병증으로 판정하는 단계를 포함한다.

상기 검출은 교잡 또는 핵산 증폭 방법에 의한 것일 수 있다.

상기 교잡은 마이크로어레이 분석, 상기 핵산 증폭은 역전사 효소 중합연쇄반응법일 수 있다.

또, 상기 생물학적 시료는 당뇨병성 신경병증 환자의 전혈, 혈장 또는 혈청일 수 있다.

상기 방법은 상기 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485 마커 발현량의 평균값을 사용하는 것일 수 있다.

상기 또 다른 어느 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨병성 신경병증의 예측 또는 진단용 바이오 마커는 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커 측정용 시약을 포함한다.

기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 당뇨병성 신경병증 하에서 특정 발현 양상을 보이는 miRNA들의 발현수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 당뇨병성 신경병증을 간단하게 진단할 수 있다.

또한, 당뇨병성 신경병증 하에서 서로 다른 양상의 발현수준을 보이는 miRNA들을 조합하여 발현수준을 측정함으로써 진단의 정확도를 높일 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 정상군과 당뇨병성 신경병증군에서 miRNA 바이오 마커 발굴을 위한 차세대 유전체 분석법을 이용하여 두개의 군 간의 heat map 분석 결과이다.
도 2는 정상군과 당뇨병성 신경병증군에서 발현의 차이를 나타낸 3개의 miRNA를 실시간 RT-PCR로 분석한 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

즉, 본 발명이 제시하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '진단'이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 즉, 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 질환의 치료 후 재발 여부 또는 테라메트릭스(therametrics), 예컨대 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 객체의 상태를 모니터링하는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 진단은 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy)의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 뿐만 아니라, 당뇨병성 신경병증의 발병 가능성을 확인하는 것으로도 해석될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '진단 대상'이란, 해당 적응증을 진단하기 위한 환자, 개체, 또는 이들에게서 분리한 혈액, 체액, 분비물, 조직, 시료 등의 검체 내지는 생물학적 샘플을 의미한다. 본 발명의 miRNA는 환자 또는 개체의 혈액, 체액, 조직, 신경세포나 신경조직 등을 채취하여 검출함으로써 그 발현수준을 측정할 수 있다.

생물학적 샘플은 당뇨병성 신경병증이 예상되는 시험자들로부터 채집된다. 또한, 획득한 데이터를 확증하기 위해 대비 샘플을 이미 질병 상태를 알고 있는 시험자들로부터 채집할 수 있다.

상기 생물학적 샘플은 생물 유래의 장기, 조직, 세포 또는 체액을 의미한다. 생물학적 시료의 예로는 조직 절편, 전혈, 혈장, 혈청, 소변 또는 혈액 유래의 백혈구, 적혈구, 또는 혈소판, 또는 조직 또는 세포 배양물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 하나 이상의 시료가 혼합되어 사용될 수도 있다.

생물학적 샘플은 당뇨병성 신경병증을 가지고 있거나 또는 당뇨병성 신경병증이 의심되는 신체로부터 통상의 시료 수득 방법에 의해 대상체로부터 직접 수득한 것이거나, 또는 종전에 분리되어 보관된 것일 수 있다. 또한 상기샘플은 필요 시, 획득한 액체로부터 정제 후 생물학 샘플로 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명 중 핵산 마커의 표현 수준은 대상에서 파생된 생물학적 샘플 중 확정된다.

본 발명의 체외 방법 중 검측에 사용된 샘플은 일반적으로 임상적으로 수용 가능한 방식으로 채집하여야 하며, 바람직하게는 핵산 (특히 RNA) 또는 단백질 방식으로 보존된다. 분석 대기 샘플은 일반적으로 혈액에서 채취된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '정상 대조군'이란, 해당 적응증을 가지고 있지 않은 환자, 개체, 또는 이들에게서 분리한 혈액, 체액, 분비물, 시료 등으로서, 해당 적응증에 관련된 miRNA이 정상 수준으로 발현되어 진단 대상의 miRNA 발현수준을 평가하기 위한 기준이 될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '바이오 마커' 또는 '진단 마커(diagnosis marker)'란 당뇨병성 신경병증이 발생한 조직 또는 세포를 정상 세포 또는 적절한 당뇨병성 신경병증 치료를 받은 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체 (대조군)에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 비코딩 핵산을 포함한다.

본원에 따른 바이오 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개의 조합으로 사용될 수 있으며, 기존의 마커 및/또는 진단 방법 등과 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 'miRNA (micro-RNA)', 또는 'miR', 또는 'miRNA', 또는 '마이크로 RNA', 또는 '마이크로알엔에이'란, 표적 RNA의 분해 (degradation)을 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다.

일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.

본 기술분야의 당업자라면 상기 miRNA와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 유지되는 서열을 갖도록 변형된 miRNA도 본 발명의 miRNA와 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '핵산'은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '프라이머'란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본원에서 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 (교잡) 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 본원에 따른 마이크로알엔에이의 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 마이크로알엔에이의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '프로브'란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명은 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy)의 예측 및 정확한 조기진단을 가능하게 하는 바이오 마커로 사용될 수 있는 miRNA와 같은 비코딩 RNA 마커의 발견에 근거한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 검출용 시약을 포함하는 당뇨병성 신경병증 예측 및 진단용 조성물에 관한 것이다.

당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485의 조합이 사용된다.

본원에 따른 일 구현예에서는 전혈, 혈청 또는 혈장과 같은 혈액시료가 사용된다.

일 구현예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 당뇨병성 신경병증이 발생한 또는 발생이 의심되는 또는 발생가능성이 있는 대상체에서 수득한 조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다. 본원에서 대상체는 질환에 걸린 것으로 의심되는 포유류, 질환에 걸린 후 치료가 되었으나 재발이 의심되는 포유류, 특히 인간을 포함한다.

본원에 따른 조성물은 생물학적 시료에서 상기 하나 이상의 miRNA의 발현량을 검출하고, 이를 대조군 또는 참조군과 비교하여, 그 발현량의 증가, 변화 정도에 따라 당뇨병성 신경병증을 진단 또는 예측할 수 있다.

따라서, 본원에 따른 조성물은 다음과 같은 방법을 사용하여 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 측정/검출 할 수 있으며, 따라서, 이러한 방법에 사용되는 시약을 포함할 수 있다.

본원에 따른 miRNA의 측정은 목적하는 miRNA의 정성, 정량 및 반정량 검출 방법을 포함한다. 핵산 검출과 관련된 임의의 공지된 방법 예를 들면 후술하는 핵산 교잡 및/또는 중합 및/또는 증폭 방법 및/또는 교잡기반 라이게이션 방법이 사용될 수 있다. 본원에 따른 바이오마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 miRNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

핵산 교잡은 핵산 바이오칩 어레이 (마이크로에레이) 또는 인시츄 교잡을 이용하여 수행될 수 있다. miRNA 마이크로어레이 기술은 동시에 다수의 miRNA의 분석을 가능하게 한다. 본원에 따른 miRNA에 상보적인 뉴클레오타이드는 코팅된 캐리어에 스폿팅되거나 또는 인시츄 합성 방법으로 캐리어에 스폿팅 될 수 있다. 일 구현예에서 생물학적 시료로부터 분리된 miRNA는 상기 캐리어 상의 상보적인 서열과의 교잡 후에 효소반응에 의해 검출되는 표지 (예를 들면 바이오틴, 형광염료)의 혼입에 의해 검출될 수 있다. 다른 구현예에서, 생물학적 시료에서 분리된 miRNA는 형광물질로 표지되어, 상응하는 서열과 결합하고, 그 결과 방출된 형광신호는 특정 miRNA의 존재를 나타낸다. 마이크로어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다.

본원에 따른 miRNA의 검출에는 핵산 중합 또는 증폭 방법이 또한 사용될 수 있으며, 특히 미량으로 존재하는 miRNA 검출에 적합하다. 공지된 다양한 핵산 증폭 또는 합성 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 역전사 반응, 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 실시간 RT-PCR, PCR, 실시간 PCR, 정량 RT-PCR, 정량 PCR, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Base Amplification), LCR (Ligase Chain Reaction), 다중 연결 프로브 증폭 (Multiple ligatable probe amplification), Invader기술 (Third Wave), SDA(Strand Displacement Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification), 및 Eberwine RNA 증폭 등을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서는 역전사 반응 후에 실시간 정량 PCR 방법이 사용되며 이는 예를 들면 Chen et al., Nucleic Acids Research, 33(20):e170, 2005를 참조하여 수행될 수 있다. RT-PCR은 검체의 RNA를 특히 miRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6) 에 기재되어 있다.

전형적인 PCR 방법은 특정 표적 서열의 증폭을 위해, 주형의 변성, 포워드 및 리버스 프라이머가 표적 서열에 결합하는 어닐링 및 열안정 중합효소에 의한 신장의 단계로 구성되는 3 단계가 여러 주기 예를 들면 통상 20회 이상이 수행된다. 대안적으로 어닐링 및 신장은 동일한 단계에서 수행되기도 한다. 성숙한 miRNA는 단일가닥이기 때문에, PCR 전에 역전사 반응이 먼저 수행될 수 있다. 역전사 반응에는 프라이머와 역전사 효소의 사용을 필요로 한다. PCR 및 정량 PCR에서는 포워드 및 리버스의 한 세트의 프라이머가 사용된다.

프라이머의 길이는 교잡온도, 표적서열의 구성, 표적 서열의 복잡성 등과 같은 다양한 요소에 따라 결정된다. 일 구현예에서는 프라이머의 길이는 약 10 내지 35 뉴클레오타이드, 예를 들면 15, 20, 25, 30 또는 35 뉴클레오타이드이다. 포워드 프라이머는 바이오마커 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하며, 5'쪽에 비상보적 서열을 추가로 포함할 수 있다. 리버스 프라이머의 서열은 바이오마커의 서열과는 독립적일 수 있으며, 다수의 miRNA 바이오마 커가 한 종류의 리버스 프라이머로 증폭될 수 있거나, 또는 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서는 다중 정량 PCR, 다중 정량 RT-PCR 방법을 사용하여 두 개 이상의 miRNA가 하나의 반응으로 증폭된다. 이 경우 한쌍 이상의 프라이머 및/또는 프로브가 사용되며, 예를 들면 각 쌍의 프라이머는 각각 특이적 miRNA를 특이적으로 증폭하며, 프로브는 증폭된 각 miRNA를 구분하는데 사용되어 다중 증폭을 가능하게 한다.

역전사 정량 PCR에서 역전사 및 PCR이 함께 수행될 수 있으며, 이 경우 반응물은 역전사효소 및 열안정중합효소를 모두 포함하며, 화학적 또는 열적 방법으로 열안정중합효소의 활성을 조절하는"hot start"반응 방법 (예를 들면 미국 특허 5,411,876, 5,550,044 등 참조)이 사용될 수 있다.

증폭된 산물은 주형으로 사용한 분자와 상응하는 서열을 가지며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서 예를 들면 젤 전기영동, 실시간 PCR 분석, SSCP (single strand conformational polymorphism), RFLP(restriction fragment length polymorphism), CZE(capillary zone electrophoresis), WAVE (HPLC-based nucleic acid analyzing technology), 마이크로칩을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또한 교잡에 기반한 라이게이션 기술이 miRNA의 정량 분석에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 OLA (oligonucleotide ligation) 및 예를 들면 미국공개공보 2006-0078894에 기재된 HARP-유사 프로브를 사용한 방법과 같은 표적 핵산 서열에 결합한 검출가능한 프로브를 결합하지 않은 프로브로부터 분리해내는 방법 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

라이게이션을 이용한 다른 기술은 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)(Schouten et al., Nucleic Acids Research 30:e57 (2002))을 들 수 있다. 상기 기술은 한 쌍의 프르브가 표적서열에 나란히 결합한 경우에만 라이게이션이 일어나는 방식으로 결합하며, 라이게이션된 프로브는 PCR에 의해 증폭될 수 있도록 프라이머 결합부위를 포함한다.

상술한 바와 같은 교잡, 증폭 및/또는 교잡 기반 라이게이션 반응 후의 miRNA는 예를 들면 표적의 염색 또는 표지, 프라이머 또는 프로브의 염색 또는 표지를 통해 교잡 또는 증폭된 miRNA 산물을 검출할 수 있다. 검출에는 당업계의 공지의 기술이 사용될 있으며, 당업자라면 검출의 민감도 및/또는 표적의 양을 고려하여 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다. 검출 방법의 민감도 및/또는 표적의 양에 따라 검출 전에 증폭이 필요하지 않을 수도 있다.

또한 miRNA는 직접적 또는 간접적 방법에 의해 검출될 수 있다. 직접적 방법에서 miRNA는 이에 결합된 검출가능한 표지로 표지되고 이어 비드와 같은 고상지지체에 연결된 프로브에 결합된 후 표지된 miRNA를 스크리닝하여 검출된다. 대안적으로 직접 검출에 표지된 프로브가 사용될 수 있으며, miRNA와 특이적 결합 후 표지된 프로브의 스크리닝을 통해 검출된다. 일 구현예에서는 증폭된 miRNA는 목적하는 핵산을 캡쳐할 수 있는 프로브와 컨쥬게이션된 비드를 이용하여 검출된다. 다른 구현예에서 프로브는 형광물질로 표지될 수 있다.

검출을 위한 표지자 (label)는 이로 제한하는 것은 아니나, 광방출, 광산란, 광흡수 물질과 같은 검출가능한 형광, 화학발광 또는 생발광 신호를 생성 또는 소거할 수 있는 화합물을 포함하며, 예를 들면 Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press 1997을 참조할 수 있다. 형광 물질은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니다 플루오레신 (예를 들면 미국특허 6,020,481), 로다민 (예를 들면 미국 특허 6,191,278), 벤조페녹사진 (예를 들면 미국특허 6,140,500), 공여체와 수용체를 포함하는 에너지 전이 형광 염료 (예를 들면 미국특허 5,945,526) 및 사이아나인 (예를 들면 WO1997-45539), 리사민, 파이코에리쓰린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5,Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPYR6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, 6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetramethylrhodamine, 및/또는 Texas Red는 물론 기타 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 형광 모이어티를 포함한다. 형광염료는 6-carboxyfluorescein; 2',4',1,4,-tetrachlorofluorescein; 및 2',4',5',7',1,4-hexachlorofluorescein를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 형광 표지로 SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein ("FAM"), TET, ROX, VICTM, 또는 JOE가 사용된다. 일 구현예에서는 리포터 형광물질과 소거형광물질의 두 개의 형광물질로 표지된 프로브가 사용되며, 이 경우 형광물질은 구분이 가능한 파장이 스펙트럼을 방출하는 형광물질이 사용된다. 또한 표지자는 핵산의 결합을 향상, 안정화 또는 핵산의 결합에 영향을 미칠 [0047] 수 있는 화합물 예를 들면 에씨디움 브로마이드 및 SYBR-Green을 포함하는 인터칼레이터, 마이너그루브 결합체 및 가교가능한 작용기가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, Blackburn et al., eds. "DNA and RNA Structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)을 참조할 수 있다.

따라서 본원에 따른 조성물은 상술한 방법 중 어느 하나 이상의 방법에 사용되는 시약을 포함할 수 있다.

일 구현예에서는 상기 miRNA 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에 필요한 시약을 포함하여, 예를 들면 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍을 포함한다. "프라이머" 또는 "프로브"는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기시약은 증폭된 산물의 검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 miRNA 검출을 위해 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다.

다른 구현예에서, 검출시약은 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다.

본원에 따른 바이오마커 또는 이를 포함하는 조성물은 당뇨병성 신경병증의 진단, 예측 및/또는 예후 측정에 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 맥락에서 본원의 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 또는 방법에 관한 것이다.

상기 키트에 포함될 수 있는 시약 및 이를 이용한 검출은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현에서, 본원의 키트는 핵산 증폭에 사용되며, 특히 RT-PCR을 이용한 증폭에 사용된다. 이 경우 키트는 RT-PCR의 반응에 필요한 완충액, 역전사 효소, Taq 폴리머라제 및 MgCl2를 포함한다. 당업계에 공지된 다양한 완충액이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Tris-HCl, pH 9.0 완충액이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 역전사 효소 및 Taq 폴리머라제는 시중에서 구입할 수 있으며, 예를 들면 폴리머라제로 hot start 반응이 가능한 AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, USA)와 같은 것을 사용할 수 있으며, 적절한 농도 예를 들면 1.5mM 내지 2.5mM의 MgCl2가 포함될 수 있다.

본원에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군으로는 miRNA를 포함하지 않는 시료, 양상대조군은 검출대상 miRNA 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

이런 측면에서 본원은 또한 당뇨병성 신경병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 당뇨병성 신경병증이 의심되는 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현량을 측정하는 단계; 상기 측정 결과를 대조군의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 발현량에 변화가 있는 경우, 이를 당뇨병성 신경병증으로 판정하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신경병증 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본원의 방법에 사용되는 시약 등은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 대조군은 당뇨병성 신경병증의 예측 또는 조기 진단을 위해, 당뇨병 환자의 시료가 사용될 수 있다.

본 방법은 특정 기간 동안 예를 들어 1년에 걸쳐 수차례 또는 매 1년에 한 번씩 수행될 수 있으며, 발현 패턴의 변화 추이 모니터링에 사용될 수 있다. 마커의 종류에 따라 발현의 증가 또는 감소를 당뇨병성 신경병증 상태와 연관 지을 수 있다. 동일 대상체에 대한 종전의 검사수치 또는 대조군의 수치와 비교하여, 당뇨병성 신경병증의 발병, 진행, 악화 등의 판단에 사용될 수 있다. 시간의 경과에 따른 당뇨병성 신경병증 마커의 변화를 근거로 당뇨병성 신경병증의 진행 또는 발병을 막기 위한 예방적 조치를 취할 수 있다. 또한 당뇨병성 신경병증의 확진을 위해, 바이오 마커는 보조 수단으로 사용될 수 있으며, 다른 진단 방법 예를 들면 조직검사, 초음파, 컴퓨터단층촬영 (computerized axial tomography (CT scan)) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging (MRI)) 검사와 함께 사용될 수 있다. 이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시 적인 것일 뿐 어떤 식으로 든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다.

이하에서는 본 발명의 실시예들을 구체적인 실험예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 실험대상 검체의 수집 및 miRNA 추출

본 실험의 대상자는 임상연구윤리위원회(IRB)의 승인을 받아 충북대학교병원 및 계명대학교동산병원에서 정상인군과 당뇨병성 신경병증으로 진단받은 환자 각각 3명 (총 6명)의 혈청 샘플을 인체자원은행을 통해 수득하였다.

이어 수득한 혈청에서 Qiagen RNA extraction Kit를 제조자의 방법대로 사용하여 총 RNA를 분리하였으며, 분리된 총 RNA의 질은 Agilent 2100 Bioanalyzer를 제조자의 방법대로 사용하여 확인하였다.

실시예 2 차세대 유전체 분석을 이용한 miRNA 바이오 마커 선별

실시예 1에서 분리한 총 RNA로부터 SMARTer smRNA seq kit for Illumina(Takara)를 이용하여 바이티닐화된 cDNA를 합성하였다. 이어 상기 cDNA를 제조자의 표준 방법에 따라 Affymetrix GeneChip^® miRNA 4.0에 교잡하였다. 교잡 후 형광광도의 측정 및 분석은 Genechip operating software(Affymetrix)을 제조자의 방법대로 이용하여 수행하였다. 총 6658개의 인간 miRNA를 각각 3건의 정상인과 당뇨병성 신경병증에서 비교 분석하여, 도 1에 나타난 바와 같이 당뇨병성 신경병증과 연관성이 있는 miRNA에 대한 heat map (황색: 2배이상 과발현된 miRNAs, 청색: 2배이상 저발현된 miRNAs)를 나타낸다.

그 결과 당뇨병성 신경병증과 정상군 사이에서 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485가 두 그룹에서 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다. 통계분석은 Student's t-test를 이용하여 수행되었으며, 통계적 유의성은 <0.05이다.

실시예 3 임상시료에서 선별된 miRNA의 실시간 정량 PCR 분석

실시예 2에서 선별된 정상군과 당뇨병성 신경병증 환자군에서 발현의 차이를 나타낸 3개의 miRNA(miR-122, miR-199b, 및 miR-8485)에 대하여 프라이머와 형광 프로브(SYBR GreenI)를 제조자의 방법대로 사용하여 200명의 혈청에서 RT-PCR을 이용한 miRNA 분석을 실시하였다.

구체적으로 Bio-rad사의 CFX-96을 이용하여 실시하였다. 구체적으로 10 ng RNA 샘플, 10 pM stem-loop RT primer, 10X RT buffer, 5 U/uL poly A polymerase, 2 mM of each dNTP, 200 U/uL M-MLV, 10mM ATP 그리고 5 U/uL RNase Inhibitor (enzynomics, Korea)를 이용한 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. 이어서 cDNA는 각각의 miRNA 프라이머 및 SYBR greenI을 사용하여 95도 5분 동안 변성하고. 95도에서 10초, 60도에서 40초로 40사이클을 돌려 증폭하고 Bio-Rad CFX-Dx 3.1로 신호는 실시간으로 수집하여 분석하였다.

그리고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485의 발현령의 차이가 정상군과 당뇨병성 신경병증군과의 사이에 유의한 연관성이 있는 것으로 나타났으며, 이는 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485이 당뇨병성 신경병증의 예측 및 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 나타낸다.

이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다.

따라서 본 발명의 범위는 이상에서 예시된 기술 사상의 변경물, 균등물 내지는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

1. miR-122, miR-199b, 및 miR-8485을 포함하는 바이오마커 측정용 시약을 포함하는 당뇨병성 신경병증 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 시약은 상기 각 바이오마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편을 포함하는 것인, 당뇨병성 신경병증 진단용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 핵산 서열 또는 핵산 서열의 단편은 상기 각 마커를 특이적 결합할 수 있는 프라미어, 또는 프로브, 또는 프라이머 및 프로브인, 당뇨병성 신경병증 진단용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 시약은 상기 각 바이오 마커의 역전사 중합효소연쇄반응, 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 라이게이션 기반 중합효소 연쇄반응, 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 당뇨병성 신경병증 진단용 조성물.
5. 당뇨병성 신경병증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
   당뇨병성 신경병증이 의심되는 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;
   상기 시료에서 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485 각각의 마커의 발현량을 측정하는 단계;
   상기 측정 결과를 대조군의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
   상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 발현량에 변화가 있는 경우, 이를 당뇨병성 신경병증으로 판정하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신경병증 마커를 검출하는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 검출은 교잡 또는 핵산 증폭 방법에 의한 것인, 방법.
7. miR-122를 포함하고, miR-199b 및 miR-8485 중 하나 이상을 더 포함하는 당뇨병성 신경병증 진단용 조성물.
8. 제5항에 있어서,
   상기 시료는 당뇨병성 신경병증 환자의 전혈, 혈장 또는 혈청인, 방법.
9. 제5항에 있어서,
   상기 방법은 상기 miR-122, miR-199b, 및 miR-8485의 각 마커 발현량의 평균값을 사용하는 것인, 방법.
10. miR-122, miR-199b, 및 miR-8485를 포함하는 당뇨병성 신경병증 진단용 조성물.

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