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KR102318480B1 - 항체 융합 단백질의 제조 방법 - Google Patents

항체 융합 단백질의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

[과제] 항체를 리소좀 효소와 융합시킨 융합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것. [해결 수단] 항체와 인간 리소좀 효소를 융합시킨 융합 단백질의 제조 방법으로서, (a) 해당 융합 단백질을 산생하는 포유동물 세포를 무혈청 배지 중에서 배양하여 해당 융합 단백질을 배양액 중에 분비시키는 스텝과, (b) 해당 배양액으로부터 해당 포유동물 세포를 제거하는 것에 의해 배양 상청을 회수하는 스텝과, (c) 해당 배양 상청으로부터, 해당 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피를 이용하여, 해당 융합 단백질을 정제하는 스텝을 포함하여 이루어지는 것인, 제조 방법.

Description

항체 융합 단백질의 제조 방법
본 발명은, 항체를 리소좀 효소와 융합시킨 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이고, 예를 들어, 해당 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입한 숙주 세포를 배양하는 것에 의해 얻어지는 재조합 융합 단백질을, 의약으로서 이용할 수 있는 순도까지 정제하는 방법에 관한 것이다.
현재, 재조합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 많은 의약이 시판되고 있다. 이와 같은 재조합 단백질은, 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입한 숙주 세포를 배양하는 것에 의해, 배양 상청 중에 얻어진 것이다. 배양 상청 중에 얻어진 재조합 단백질은, 그대로는 협잡물을 포함하므로 의약으로서 사용할 수 없다. 의약으로서 사용하기 위해서는, 배양 상청 중에 포함되는 재조합 단백질을 정제할 필요가 있다.
포유동물 세포를 숙주 세포로서 이용하고, 이 숙주 세포를 배양하여 배양 상청 중에 얻어진 재조합 단백질을, 의약으로서 사용할 수 있는 레벨까지 정제하는 방법이 보고되어 있다. 예를 들어, 적아구 전구 세포에 작용하여 적혈구로 분화시켜 적혈구의 산생(産生)을 촉진하는 당단백질인 인간 에리트로포이에틴(hEPO)을, 숙주 세포로서 CHO 세포를 이용하여 재조합 단백질로서 발현시키고, 이것을 배양 상청으로부터 색소 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 각종 크로마토그래피를 이용하여 의약에 사용할 수 있을 때까지 정제하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1). 또한 예를 들어, 난소에서의 에스트로겐의 생산 및 분비를 촉진하는 활성을 갖는 성선 자극 호르몬의 일종인 인간 난포 자극 호르몬(hFSH)을, 숙주 세포로서 CHO 세포를 이용하여 재조합 단백질로서 발현시키고, 이것을 배양 상청으로부터 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 각종 크로마토그래피를 이용하여 의약에 사용할 수 있을 때까지 정제하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 2). 또한 예를 들어, 헤파란황산이나 데르마탄황산과 같은 글리코사미노글리칸(GAG) 분자 내에 존재하는 황산 에스터 결합을 가수분해하는 활성을 갖는 라이소좀 효소의 일종인 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)를, 숙주 세포로서 CHO 세포를 이용하여 재조합 단백질로서 발현시키고, 이것을 배양 상청으로부터 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 각종 크로마토그래피를 이용하여 의약에 사용할 수 있을 때까지 정제하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 3). 또한 예를 들어, 당지질 및 당단백질의 말단 α-갈락토실 결합을 가수분해하는 활성을 갖는 라이소좀 효소의 일종인 인간 α-갈락토시다제 A(hα-Gal A)를, 숙주 세포로서 CHO 세포를 이용하여 재조합 단백질로서 발현시키고, 이것을 배양 상청으로부터 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 각종 크로마토그래피를 이용하여 의약에 사용할 수 있을 때까지 정제하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 4, 특허문헌 5). 더욱이 예를 들어, DNA를 염기 서열 비특이적으로 분해하는 활성을 갖는 인간 DNaseI를, 숙주 세포로서 CHO 세포를 이용하여 재조합 단백질로서 발현시키고, 이것을 배양 상청으로부터 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 색소 리간드 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 각종 크로마토그래피를 이용하여 의약에 사용할 수 있을 때까지 정제하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 6).
이와 같이, 의약으로서 사용할 수 있는 재조합 단백질을 취득하기 위해서, 각각의 재조합 단백질에 대해, 독자적인 정제 방법이 개발되고 있다.
일본 특허공표 2010-511378호 공보 일본 특허공개 2009-273427호 공보 일본 특허공표 2014-508506호 공보 국제 공개 제2014/017088호 국제 공개 제2016/117341호 국제 공개 제2016/067944호
본 발명의 목적은, 항체와 다른 단백질을 융합시킨 융합 단백질을, 재조합 단백질로서 발현시키고, 이것을 의약으로서 시장에 유통시키는 것이 가능한 순도까지 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 향한 연구에 있어서, 본 발명자들은, 예의 검토를 거듭한 결과, 항트랜스페린 수용체 항체와 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)를 융합시킨 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포를 무혈청 배지 중에서 배양하는 것에 의해, 배양액 중에서 얻어지는 융합 단백질을, 융합 단백질에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피의 조합에 의해 정제하는 것에 의해, 높은 순도로 효율적으로 정제할 수 있음을 발견했다. 본 발명은, 이들 지견에 기초하여 더욱 검토를 더하여 완성시킨 것이다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
1. 항체와 인간 리소좀 효소를 융합시킨 융합 단백질의 제조 방법으로서,
(a) 해당 융합 단백질을 산생하는 포유동물 세포를 무혈청 배지 중에서 배양하여 해당 융합 단백질을 배양액 중에 분비시키는 스텝과,
(b) 해당 배양액으로부터 해당 포유동물 세포를 제거하는 것에 의해 배양 상청을 회수하는 스텝과,
(c) 해당 배양 상청으로부터, 해당 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피를 이용하여, 해당 융합 단백질을 정제하는 스텝
을 포함하여 이루어지는 것인, 제조 방법.
2. 해당 스텝(c)에 있어서, 해당 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피를, 이 순서로 이용하여 이루어지는 것인, 상기 1에 기재된 제조 방법.
3. 해당 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질이, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 A/G, 해당 항체의 항원, 해당 항체를 항원으로서 인식하는 항체, 및 해당 리소좀 효소의 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 또는 2에 기재된 제조 방법.
4. 인산기에 친화성을 갖는 해당 재료가, 플루오로아파타이트 또는 하이드록시아파타이트의 어느 하나인, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
5. 인산기에 친화성을 갖는 해당 재료가, 하이드록시아파타이트인, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
6. 해당 인간 리소좀 효소와 융합시킨 해당 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
7. 해당 인간 리소좀 효소와 융합시킨 해당 항체가, 인간화 항체인, 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
8. 해당 인간 리소좀 효소와 융합시킨 해당 항체가, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자를 항원으로 하는 것인, 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
9. 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 해당 분자가, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8, 모노카복실산 트랜스포터 및 Fc 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 8에 기재된 제조 방법.
10. 해당 혈관 내피 세포가 뇌혈관 내피 세포인, 상기 8에 기재된 제조 방법.
11. 해당 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자가, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 및 모노카복실산 트랜스포터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 10에 기재된 제조 방법.
12. 해당 혈관 내피 세포가, 인간의 혈관 내피 세포인, 상기 8 내지 11 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
13. 해당 항체가, 항인간 트랜스페린 수용체 항체인, 상기 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
14. 해당 융합 단백질이, 해당 항체와 해당 인간 리소좀 효소를, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 하이알루론산, 비오틴-스트렙트아비딘, 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커를 개재하여 결합시킨 것인, 상기 1 내지 13 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
15. 해당 융합 단백질이, 해당 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 펩타이드 결합에 의해 직접 또는 링커 서열을 개재하여, 해당 인간 리소좀 효소를 결합시킨 것인, 상기 1 내지 13 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
16. 해당 융합 단백질이, 해당 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 펩타이드 결합에 의해 직접 또는 링커 서열을 개재하여, 해당 인간 리소좀 효소를 결합시킨 것인, 상기 1 내지 13 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
17. 해당 링커 서열이, 1∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 상기 15 또는 16에 기재된 제조 방법.
18. 해당 링커 서열이, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열(Gly-Ser), 아미노산 서열(Gly-Gly-Ser), 서열 번호 1의 아미노산 서열, 서열 번호 2의 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 상기 17에 기재된 제조 방법.
19. 해당 링커 서열이, 아미노산 서열(Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 17 또는 18에 기재된 제조 방법.
20. 해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제(인간 I2S)인, 상기 1 내지 19 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
21. 해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법.
22. 해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법.
23. 해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법.
24. 해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법.
25. 해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열에 1∼5개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법.
26. 해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법.
27. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:
(a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것;
(b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것; 및
(c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것.
28. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:
(a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것;
(b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것; 및
(c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것.
29. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:
(a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것;
(b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것; 및
(c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것.
30. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:
(a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것;
(b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것; 및
(c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것.
31. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:
(a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것;
(b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것; 및
(c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것.
32. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제(인간 I2S)이며, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법:
(a) 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 5로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는 융합 단백질;
(b) 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 5로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는 융합 단백질; 및
(c) 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 5로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는 융합 단백질.
33. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제이며, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 20에 기재된 제조 방법:
(a) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질;
(b) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질; 및
(c) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질.
본 발명에 의하면, 중추 신경 장애를 수반하는 리소좀병의 치료제로서 임상적으로 이용할 수 있는 순도까지 정제된, 항트랜스페린 수용체 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 제공할 수 있다. 특히, 중추 신경 장애를 수반하는 헌터 증후군의 치료제로서 임상적으로 이용할 수 있는 순도까지 정제된, 항트랜스페린 수용체 항체와 인간 I2S의 융합 단백질을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 6에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품의 SE-HPLC의 차트를 나타내는 도면. 세로축은 215nm에서의 흡광도, 가로축은 유지 시간(분)을 나타낸다. (A)는 I2S-항hTfR 항체 3의 단량체에서 유래하는 피크, (B)는 I2S-항hTfR 항체 3의 중합체에서 유래하는 피크를 각각 나타낸다.
도 2는 실시예 12에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품의 SE-HPLC의 차트를 나타내는 도면. 세로축은 215nm에서의 흡광도, 가로축은 유지 시간(분)을 나타낸다. (A)는 I2S-항hTfR 항체 3의 단량체에서 유래하는 피크, (B)는 I2S-항hTfR 항체 3의 중합체에서 유래하는 피크를 각각 나타낸다.
본 발명은, 항트랜스페린 수용체 항체(항TfR 항체)와 인간 리소좀 효소를 결합시킨 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 여기에서, 리소좀 효소와 결합시키는 항체는, 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것인 한, 항체의 동물종 등에 특별히 제한은 없지만, 특히 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 예를 들어, 항체는, 인간 이외의 포유동물의 항체여도 되고, 또한 인간 항체와 인간 이외의 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체여도 된다.
인간 항체는, 그 전체가 인간 유래의 유전자로 코딩되는 항체를 말한다. 단, 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 원래의 인간의 유전자에 변이를 가한 유전자로 코딩되는 항체도, 인간 항체이다. 또한, 인간 항체를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 하나의 인간 항체의 일부를, 다른 인간 항체의 일부로 치환한 항체도, 인간 항체이다. 인간 항체는, 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 면역글로불린 중쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 어느 하나의 인간 항체의 CDR을, 그 외의 인간 항체의 CDR로 치환하는 것에 의해, 인간 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 인간 항체이다.
본 발명에 있어서, 원래의 인간 항체의 유전자를 개변하는 것에 의해, 원래의 항체의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 인간 항체라고 한다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개이고, 보다 바람직하게는 1∼10개이며, 더욱 바람직하게는 1∼5개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼3개이다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개이고, 보다 바람직하게는 1∼10개이며, 더욱 바람직하게는 1∼5개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 아미노산을 부가시키는 경우, 원래의 항체의 아미노산 서열 중 또는 N말단측 혹은 C말단측에, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼3개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 원래의 항체의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내며, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타내는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서 「인간 유래의 유전자」라고 할 때는, 인간 유래의 원래의 유전자에 더하여, 인간 유래의 원래의 유전자에 개변을 가하는 것에 의해 얻어지는 유전자도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「인간화 항체」란 말은, 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열이 인간 이외의 포유동물 유래이며, 그 이외의 영역이 인간 유래인 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화 항체로서, 인간 항체를 구성하는 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유동물의 CDR에 의해 치환하는 것에 의해 제작된 항체를 들 수 있다. 인간 항체의 적절한 위치에 이식되는 CDR의 유래가 되는 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이고, 보다 바람직하게는 마우스 및 래트이며, 예를 들어 마우스이다.
본 발명에 있어서, 항체가 인간 항체 또는 인간화 항체인 경우에 대해, 이하 상술한다. 인간 항체 및 인간화 항체의 경쇄에는, λ쇄와 κ쇄가 있다. 항체를 구성하는 경쇄는, λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 된다. 또한, 인간 항체 및 인간화 항체의 중쇄에는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄가 있고, 각각, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 대응하고 있다. 항체를 구성하는 중쇄는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 γ쇄이다. 더욱이, 항체의 중쇄의 γ쇄에는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄가 있고, 각각, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대응하고 있다. 항체를 구성하는 중쇄가 γ쇄인 경우, 그 γ쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체이며, 또한 IgG인 경우, 그 항체의 경쇄는 λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 되고, 그 항체의 중쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 예를 들어, 바람직한 항체의 하나의 태양으로서, 경쇄가 λ쇄이며 중쇄가 γ1쇄인 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「키메라 항체」란 말은, 2개 이상의 상이한 종에서 유래하는, 2개 이상의 상이한 항체의 단편이 연결되어 이루어지는 항체를 말한다.
인간 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체란, 인간 항체의 일부가 인간 이외의 포유동물의 항체의 일부에 의해 치환된 항체이다. 항체는, 이하에 설명하는 Fc 영역, Fab 영역 및 힌지부로 이루어진다. 이와 같은 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 하나에서 유래한다. 반대로, Fc 영역이 다른 포유동물에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 것에서 유래해도 된다.
또한, 항체는, 가변 영역과 정상 영역으로 이루어진다고 할 수도 있다. 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이며, 보다 바람직하게는 마우스이다.
인간 항체와 마우스 항체의 키메라 항체는, 특히, 「인간/마우스 키메라 항체」라고 한다. 인간/마우스 키메라 항체에는, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 마우스 항체에서 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 마우스 항체의 어느 하나에서 유래한다. 인간/마우스 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 마우스 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다.
항체는, 본래, 2개의 면역글로불린 경쇄와 2개의 면역글로불린 중쇄의 합계 4개의 폴리펩타이드쇄로 이루어지는 기본 구조를 갖는다. 단, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는, 이 기본 구조를 갖는 것에 더하여,
(1) 1개의 면역글로불린 경쇄와 1개의 면역글로불린 중쇄의 합계 2개의 폴리펩타이드쇄로 이루어지는 것이나, 이하에 상술하듯이,
(2) 면역글로불린 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체, 및
(3) 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체도 포함된다. 또한,
(4) 본래의 의미에서의 항체의 기본 구조로부터 Fc 영역이 결실된 것인 Fab 영역으로 이루어지는 것 및 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어지는 것(Fab, F(ab') 및 F(ab')2를 포함한다)도, 본 발명에 있어서의 「항체」에 포함된다. 더욱이, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커 서열을 개재하여 결합시켜 1본쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「1본쇄 항체」라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 또한, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질도, 본 발명에 있어서의 「1본쇄 항체」이다. 예를 들어, 상기 (2) 및 (3)에 나타나는 것은 1본쇄 항체에 포함된다. 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을 개재하여 면역글로불린 경쇄가 결합한 1본쇄 항체에 있어서는, 통상, 면역글로불린 중쇄는, Fc 영역이 결실되어 있다. 면역글로불린 경쇄의 가변 영역은, 항체의 항원 특이성에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 3개 갖고 있다. 마찬가지로, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역도, CDR을 3개 갖고 있다. 이들 CDR은, 항체의 항원 특이성을 결정하는 주된 영역이다. 따라서, 1본쇄 항체에는, 면역글로불린 중쇄의 3개의 CDR의 모두와 면역글로불린 경쇄의 3개의 CDR의 모두가 포함되는 것이 바람직하다. 단, 항체의 항원 특이적인 친화성이 유지되는 한, CDR의 1개 또는 복수개를 결실시킨 1본쇄 항체로 할 수도 있다.
1본쇄 항체에 있어서, 면역글로불린의 경쇄와 중쇄 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 2∼50개, 보다 바람직하게는 8∼50개, 더욱 바람직하게는 10∼30개, 더욱 보다 바람직하게는 12∼18개 또는 15∼25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩타이드쇄이다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 양 쇄가 연결되는 항hTfR 항체가 hTfR에 대한 친화성을 유지하는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신만 또는 글리신과 세린으로 구성되는 것이고, 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 1), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 2), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 3), 또는 이들 아미노산 서열이 2∼10회, 혹은 2∼5회 반복된 서열을 갖는 것이다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전체 영역으로 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, 링커 서열을 개재하여 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 ScFV로 하는 경우, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 1)의 3개가 연속한 것에 상당하는 합계 15개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열이 적합하게 이용된다.
본 발명에 있어서, 항체가 특이적으로 인식하는 항원으로서는, 예를 들어, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)이다. 이러한 표면 항원으로서는, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F 등의 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 등의 모노카복실산 트랜스포터, Fc 수용체를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 항원은, 바람직하게는 인간 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 이들 분자(표면 항원)이다.
상기의 표면 항원 중에서도, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F 등의 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 등의 모노카복실산 트랜스포터는, 혈액뇌 관문(Blood Brain Barrier)을 형성하는 뇌모세혈관 내피 세포(뇌혈관 내피 세포)의 표면에 존재하는 것이다. 이들 항원을 인식할 수 있는 항체는, 항원을 개재하여 뇌모세혈관 내피 세포에 결합할 수 있다. 그리고 뇌모세혈관 내피 세포에 결합한 항체는, 혈액뇌 관문을 통과하여 중추 신경계에 도달할 수 있다. 따라서, 목적하는 단백질을, 이와 같은 항체와 결합시키는 것에 의해, 중추 신경계까지 도달시킬 수 있다. 목적하는 단백질로서는, 중추 신경계에서 약효를 발휘해야 할 기능을 갖는 단백질을 들 수 있다. 예를 들어, 중추 신경 장애를 수반하는 리소좀병 환자에 있어서 결손되어 있거나 또는 기능 부전인 리소좀 효소를, 목적하는 단백질로서 들 수 있다. 이러한 리소좀 효소는, 그대로는 중추 신경계에 도달할 수 없어, 환자의 중추 신경 장애에 대해서 약효를 나타내는 경우가 없지만, 이들 항체와 결합시키는 것에 의해 혈액뇌 관문을 통과할 수 있게 되므로, 리소좀병 환자에 있어서 보이는 중추 신경 장애를 개선할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 트랜스페린 수용체」 또는 「hTfR」이란 말은, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 막단백질을 말한다. 본 발명의 항hTfR 항체는, 그의 일 실시태양에 있어서, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열 중 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의 부분(hTfR의 세포외 영역)에 대해서 특이적으로 결합하는 것이지만, 이것으로 한정되지 않는다.
항체의 제작 방법을 hTfR에 대한 항체를 예로 들어 이하에 설명한다. hTfR에 대한 항체의 제작 방법으로서는, hTfR 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입한 세포를 이용하여, 재조합 인간 트랜스페린 수용체(rhTfR)를 제작하고, 이 rhTfR을 이용하여 마우스 등의 동물을 이용하여 면역하여 얻는 방법이 일반적이다. 면역 후의 동물로부터 hTfR에 대한 항체 산생 세포를 취출하고, 이것과 미엘로마 세포를 유합시키는 것에 의해, hTfR에 대한 항체 산생능을 갖는 하이브리도마 세포를 제작할 수 있다.
또한, 마우스 등의 동물로부터 얻은 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 rhTfR로 면역하는 것에 의해서도 hTfR에 대한 항체를 산생하는 세포를 취득할 수 있다. 체외 면역법에 의해 면역하는 경우, 그 면역계 세포가 유래하는 동물종에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트, 개, 고양이, 말 및 인간을 포함하는 영장류이고, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트 및 인간이며, 더욱 바람직하게는 마우스 및 인간이다. 마우스의 면역계 세포로서는, 예를 들어, 마우스의 비장으로부터 조제한 비세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포로서는, 인간의 말초혈, 골수, 비장 등으로부터 조제한 세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 면역했을 경우, hTfR에 대한 인간 항체를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체와 결합시켜야 할 인간 리소좀 효소에 특별히 한정은 없지만, α-L-이두로니다제, 이두론산-2-설파타제, 글루코세레브로시다제, β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, α-만노시다제, β-만노시다제, 갈락토실세라미다제, 사포신 C, 아릴설파타제 A, α-L-푸코시다제, 아스파틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제, α-갈락토시다제 A, β-글루쿠로니다제, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoAα-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-황산설파타제, 산성 세라미다제, 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 아스파틸글루코사미니다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스터라제-1(PPT-1), 트라이펩티딜펩티다제-1(TPP-1), 하이알루로니다제-1, CLN1, 및 CLN2 등의 리소좀 효소를 들 수 있다.
항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)를 특이적으로 인식하는 것인 경우, 항체와 결합시킨 인간 리소좀 효소는 각각, α-L-이두로니다제는 헐러 증후군 또는 헐러-샤이에 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 이두론산-2-설파타제는 헌터 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 글루코세레브로시다제는 고셔병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-갈락토시다제는 GM1-강글리오시도시스 1∼3형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, GM2 활성화 단백질은 GM2-강글리오시도시스 AB이형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 A는 샌드호프병 및 테이삭스병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 B는 샌드호프병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제는 I-세포병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-만노시다제는 α-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-만노시다제는 β-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 갈락토실세라미다제는 크라베병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 사포신 C는 고셔병양(樣) 축적증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아릴설파타제 A는 이염성 백질 변성증(이염성 백질 디스트로피)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-L-푸코시다제는 푸코시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파틸글루코사미니다제는 아스파틸글루코사민뇨증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-N-아세틸갈락토사미니다제는 쉰들러병 및 가와사키병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 스핑고미엘리나제는 니만-피크병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-갈락토시다제 A는 파브리병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-글루쿠로니다제는 슬라이 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoAα-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제 및 N-아세틸글루코사민-6-황산설파타제는 산필리포 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 세라미다제는 파버병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아밀로-1,6-글루코시다제는 코리병(포르브스-코리병)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 시알리다제는 시알리다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파틸글루코사미니다제는 아스파틸글루코사민뇨증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 팔미토일 단백질 싸이오에스터라제-1(PPT-1)은, 신경 세로이드 리포푸신증 또는 Santavuori-Haltia병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 트라이펩티딜펩티다제-1(TPP-1)은, 신경 세로이드 리포푸신증 또는 Jansky-Bielschowsky병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 하이알루로니다제-1은 하이알루로니다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, CLN1 및 CLN2는 바텐병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다.
항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)를 특이적으로 인식하는 것인 경우에, 항체와 결합시켜야 할 리소좀 효소로서 적합한 것으로서, 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)를 들 수 있다. I2S는, 헤파란황산이나 데르마탄황산과 같은 글리코사미노글리칸(GAG) 분자 내에 존재하는 황산 에스터 결합을 가수분해하는 활성을 갖는 라이소좀 효소의 일종이다. 헌터 증후군은 이 효소가 선천적으로 결실되는 유전자 질환이다. 헌터 증후군의 환자는, 헤파란황산, 데르마탄황산이 조직 내에 축적되는 결과, 각막 혼탁, 정신 발달 지체 등의 제 증상을 나타낸다. 단, 경증의 경우는 정신 발달 지연은 관찰되지 않는 경우도 있다. 당해 항체와 hI2S의 융합 단백질은, BBB를 통과하는 것에 의해 뇌조직 내에 축적된 GAG를 분해할 수 있으므로, 정신 발달 지체를 나타내는 헌터 증후군의 환자에게 투여하는 것에 의해, 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 I2S」 또는 「hI2S」라는 말은, 특히 야생형의 hI2S와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 말한다. 야생형의 hI2S는, 서열 번호 5로 나타나는 525개의 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 단, 이것에 한정되지 않고, I2S 활성을 갖는 것인 한, 야생형의 hI2S의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hI2S에 포함된다. hI2S의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hI2S의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hI2S에 아미노산을 부가시키는 경우, hI2S의 아미노산 서열 중 또는 N말단측 혹은 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hI2S의 아미노산 서열은, 원래의 hI2S의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내며, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 본 발명에 있어서, hI2S가 I2S 활성을 갖는다고 할 때는, hI2S를 항체와 융합시켜 융합 단백질로 했을 때에, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하며, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항체와 융합시킨 hI2S가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다. 항체는, 예를 들어 항hTfR 항체이다.
본 발명에 있어서 「융합 단백질」이라고 할 때는, 항체와 인간 리소좀 효소를, 비펩타이드 링커 혹은 펩타이드 링커를 개재하여, 또는 직접 결합시킨 물질을 말한다. 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 방법은, 이하에 상술한다.
항체와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 방법으로서는, 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커를 개재하여 결합시키는 방법이 있다. 비펩타이드 링커로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 하이알루론산, 또는 이들의 유도체, 혹은 이들을 조합한 것을 이용할 수 있다. 펩타이드 링커는, 펩타이드 결합한 1∼50개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드쇄 혹은 그의 유도체이며, 그 N말단과 C말단이, 각각 항체 또는 인간 리소좀 효소의 어느 하나와 공유 결합을 형성하는 것에 의해, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 것이다.
비펩타이드 링커로서 비오틴-스트렙트아비딘을 이용하는 경우, 항체가 비오틴을 결합시킨 것이고, 인간 리소좀 효소가 스트렙트아비딘을 결합시킨 것이고, 이 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합을 개재하여, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시켜도 되고, 반대로, 항체가 스트렙트아비딘을 결합시킨 것이고, 인간 리소좀 효소가 비오틴을 결합시킨 것이고, 이 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합을 개재하여, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시켜도 된다.
비펩타이드 링커로서 PEG를 이용하여 본 발명의 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시킨 것은, 특히, 항체-PEG-인간 리소좀 효소라고 한다. 항체-PEG-인간 리소좀 효소는, 항체와 PEG를 결합시켜 항체-PEG를 제작하고, 그 다음에 항체-PEG와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 또는, 항체-PEG-인간 리소좀 효소는, 인간 리소좀 효소와 PEG를 결합시켜 인간 리소좀 효소-PEG를 제작하고, 그 다음에 인간 리소좀 효소-PEG와 항체를 결합시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다. PEG를 항체 및 인간 리소좀 효소와 결합시킬 때에는, 카보네이트, 카보닐이미다졸, 카복실산의 활성 에스터, 아즈락톤, 환상 이미드싸이온, 아이소사이아네이트, 아이소싸이오사이아네이트, 이미데이트, 또는 알데하이드 등의 작용기로 수식된 PEG가 이용된다. 이들 PEG에 도입된 작용기가, 주로 항체 및 인간 리소좀 효소 분자 내의 아미노기와 반응하는 것에 의해, PEG와 항체 및 인간 리소좀 효소가 공유결합한다. 이 때 이용되는 PEG의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량(MW)은, 바람직하게는 MW=300∼60000이고, 보다 바람직하게는 MW=500∼20000이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG는, 비펩타이드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체-PEG는, 항체와 알데하이드기를 작용기로서 갖는 폴리에틸렌 글리콜(ALD-PEG-ALD)을, 해당 항체에 대한 ALD-PEG-ALD의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시키는 것에 의해 얻어진다. 그 다음에, 항체-PEG를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, 인간 리소좀 효소와 반응시키는 것에 의해, 항체-PEG-인간 리소좀 효소가 얻어진다. 반대로, 먼저 인간 리소좀 효소와 ALD-PEG-ALD를 결합시켜 인간 리소좀 효소-PEG를 제작하고, 그 다음에 인간 리소좀 효소-PEG와 항체를 결합시키는 것에 의해서도, 항체-PEG-인간 리소좀 효소를 얻을 수 있다.
항체와 인간 리소좀 효소는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 링커 서열을 개재하여 또는 직접, 각각 인간 리소좀 효소의 N말단 또는 C말단을 펩타이드 결합에 의해 결합시킬 수도 있다. 이와 같이 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시켜 이루어지는 융합 단백질은, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 cDNA의 3'말단측 또는 5'말단측에, 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 끼워서, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 cDNA가 인프레임으로 배치된 DNA 단편을, 포유동물 세포, 효모 등의 진핵생물용의 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해, 얻을 수 있다. 이 포유동물 세포에는, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 DNA 단편을 중쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항체의 경쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도, 동일한 호스트 세포에 도입되고, 또한, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 DNA 단편을 경쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항체의 중쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도, 동일한 호스트 세포에 도입된다. 항체가 1본쇄 항체인 경우, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시킨 융합 단백질은, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 cDNA의 5'말단측 또는 3'말단측에, 직접, 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 끼워서, 1본쇄 항체를 코딩하는 cDNA를 연결한 DNA 단편을, 포유동물 세포, 효모 등의 진핵생물용의 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 이들 세포 중에서 발현시키는 것에 의해, 얻을 수 있다.
항체의 경쇄의 C말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 경쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 경쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재하여 결합해도 된다.
항체의 중쇄의 C말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 중쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 중쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재하여 결합해도 된다.
항체의 경쇄의 N말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 경쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 경쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재하여 결합해도 된다.
항체의 중쇄의 N말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 중쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 중쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재하여 결합해도 된다.
이 때 항체와 인간 리소좀 효소 사이에 링커 서열을 배치하는 경우, 그 서열은, 바람직하게는 1∼50개, 보다 바람직하게는 1∼17개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼5개의 아미노산으로 구성되는 것이지만, 항체에 결합시켜야 할 인간 리소좀 효소에 따라, 링커 서열을 구성하는 아미노산의 개수는, 1개, 2개, 3개, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개 등으로 적절히 조정할 수 있다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 연결된 항체가 hTfR과의 친화성을 유지하고, 또한 당해 링커 서열에 의해 연결된 인간 리소좀 효소가, 생리적 조건하에서 당해 단백질의 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로 구성되는 것이고, 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 1), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 2), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 3), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연속하여 이루어지는 1∼50개의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 갖는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser을 갖는 것은 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
한편, 본 발명에 있어서, 1개의 펩타이드쇄에 복수의 링커 서열이 포함되는 경우, 편의상, 각 링커 서열은 N말단측으로부터 순차로, 제 1 링커 서열, 제 2 링커 서열과 같이 명명한다.
항체가 인간화 항체이며 또한 항인간 트랜스페린 수용체 항체인 경우의, 항체의 바람직한 형태로서, 이하의 (x)∼(z)를 들 수 있다. 즉,
(x) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것;
(y) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것;
(z) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것의 어느 하나이다.
한편, 여기에서, (x), (y) 및 (z)는, 실시예 중에 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 1, 인간화 항hTfR 항체 번호 2, 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3에 각각 상당한다.
단, 항체가 인간화 항체이며 또한 항인간 트랜스페린 수용체 항체인 경우의, 항체의 바람직한 형태는, 상기의 (x)∼(z)에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 해당 항체의 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 또한, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 해당 항체의 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 또한, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 해당 항체의 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다.
또한, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다. 또한, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열에 1∼5개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열에 1∼5개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다. 더욱이, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다.
상기의 항체의 바람직한 형태의 (x)에 있어서, 서열 번호 6으로 나타나는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이며, 서열 번호 7로 나타나는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 또한, 상기의 항체의 바람직한 형태의 (y)에 있어서, 서열 번호 8로 나타나는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이며, 서열 번호 9로 나타나는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 또한, 상기의 항체의 바람직한 형태의 (z)에 있어서, 서열 번호 10으로 나타나는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 19로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이며, 서열 번호 11로 나타나는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 20으로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 이들 항체의 바람직한 형태의 (x)∼(z)에 있어서, 중쇄 또는/및 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중에의 치환, 결실 또는 부가는, 특히, 이들 가변 영역에 도입된다.
한편, 본 발명에 있어서, 원래의 단백질(항체를 포함한다)의 아미노산 서열과 변이를 가한 단백질의 아미노산 서열의 상동성은, 주지의 상동성 계산 알고리즘을 이용하여 용이하게 산출할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 알고리즘으로서, BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)), Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981)) 등이 있다.
항체가 인간화 항인간 트랜스페린 수용체 항체이며, 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제(인간 I2S)인 경우의, 융합 단백질의 바람직한 형태로서, 이하의 (a)∼(c)의 것을 들 수 있다. 즉,
(a) 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 5로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는, 융합 단백질;
(b) 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 5로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는, 융합 단백질;
(c) 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 5로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는, 융합 단백질.
또한, 항체가 인간화 항인간 트랜스페린 수용체 항체이며, 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제(인간 I2S)인 경우의, 융합 단백질의 바람직한 형태로서, 이하의 (a)∼(c)의 것을 들 수 있다. 즉,
(a) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질;
(b) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질;
(c) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질.
본 발명에 있어서, 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질은, 당해 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 발현 또는 강발현하는 것에 의해, 당해 융합 단백질을 산생하도록 인위적인 조작을 가한, 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해 산생시킬 수 있다. 이 때 융합 단백질을 산생하는 포유동물 세포 내에서 강발현시키는 해당 유전자는, 해당 유전자가 짜넣어진 발현 벡터로 형질 전환시키는 것에 의해 해당 포유동물 세포에 도입하는 것이 일반적이다. 또한, 이 때 이용되는 포유동물 세포에 대해 특별히 한정은 없지만, 인간, 마우스, 차이니즈 햄스터 유래의 세포가 바람직하고, 특히 차이니즈 햄스터 난소 세포 유래의 CHO 세포가 바람직하다. 본 발명에 있어서, 융합 단백질이라고 할 때는, 특히, 이와 같은 융합 단백질을 산생하는 포유동물 세포를 배양했을 때에, 배지 중에 분비되는 재조합 융합 단백질을 말한다.
항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질은, 항체와 인간 리소좀 효소를 각각 산생시킨 후, 이들을 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커로 결합시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다. 이 때, 항체와 인간 리소좀 효소는, 이들을 코딩하는 유전자가 발현 또는 강발현하는 것에 의해, 이들을 산생하도록 인위적인 조작을 가한, 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해 재조합 단백질로서 산생시킬 수 있다.
융합 단백질, 항체 또는 인간 리소좀 효소를 코딩하는 유전자를 짜넣어 발현시키기 위해서 이용하는 발현 벡터는, 포유동물 세포 내에 도입시켰을 때에, 해당 유전자를 발현시키는 것이면 특별히 한정 없이 이용할 수 있다. 발현 벡터에 짜넣어진 해당 유전자는, 포유동물 세포 내에서 유전자의 전사의 빈도를 조절할 수 있는 DNA 서열(유전자 발현 제어 부위)의 하류에 배치된다. 본 발명에 있어서 이용할 수 있는 유전자 발현 제어 부위로서는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터 등을 들 수 있다.
이와 같은 발현 벡터가 도입된 포유동물 세포는, 발현 벡터에 짜넣어진 원하는 단백질을 발현하게 되지만, 그 발현량은 개개의 세포에 따라 상이하며 균일하지는 않다. 따라서, 재조합 단백질을 효율적으로 생산하기 위해서는, 발현 벡터가 도입된 포유동물 세포로부터, 원하는 단백질의 발현 레벨이 높은 세포를 선택하는 스텝이 필요하다. 이 선택 스텝을 행하기 위해서, 발현 벡터에는 선택 마커로서 작용하는 유전자가 짜넣어져 있다.
선택 마커로서 가장 일반적인 것은 퓨로마이신, 네오마이신 등의 약제를 분해하는 효소(약제 내성 마커)이다. 포유동물 세포는 일정 농도 이상의 상기 약제의 존재하에서 사멸한다. 그러나, 발현 벡터가 도입된 포유동물 세포는, 발현 벡터에 짜넣어진 약제 내성 마커에 의해 상기 약제를 분해하여, 이것을 무독화 또는 약독화할 수 있으므로, 상기 약제 존재하에서도 생존 가능해진다. 선택 마커로서 약제 내성 마커가 짜넣어진 발현 벡터를 포유동물 세포에 도입하고, 그 약제 내성 마커에 대응하는 약제를 함유하는 선택 배지 중에서, 그 약제의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 약제 존재하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, 약제 내성 마커와 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 짜넣어진 원하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량도 증가하므로, 결과적으로 원하는 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
또한, 선택 마커로서, 글루타민 합성 효소(GS)를 이용할 수도 있다. 글루타민 합성 효소는, 글루타민산과 암모니아로부터 글루타민을 합성하는 효소이다. 포유동물 세포를, 글루타민 합성 효소의 저해제, 예를 들어 메티오닌설폭시민(MSX)을 함유하고, 또한 글루타민을 함유하지 않는 선택 배지 중에서 배양하면, 세포는 사멸한다. 그러나, 선택 마커로서 글루타민 합성 효소가 짜넣어진 발현 벡터를 포유동물 세포에 도입하면, 해당 세포에서는, 글루타민 합성 효소의 발현 레벨이 상승하게 되므로, 보다 고농도의 MSX 존재하에서도 증식 가능해진다. 이 때, MSX의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 MSX 존재하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, 글루타민 합성 효소와 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 짜넣어진 원하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량도 증가하므로, 결과적으로 원하는 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
또한, 선택 마커로서, 다이하이드로엽산리덕타제(DHFR)를 이용할 수도 있다. DHFR를 선택 마커로서 이용하는 경우, 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포는, 메토트렉세이트, 아미노프테린 등의 DHFR 저해제를 함유하는 선택 배지 중에서 배양된다. DHFR 저해제의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 DHFR 저해제 존재하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, DHFR과 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 짜넣어진 원하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량도 증가하므로, 결과적으로 원하는 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
원하는 단백질을 코딩하는 유전자의 하류측에 내부 리보솜 결합 부위(IRES: internal ribosome entry site)를 개재하여, 선택 마커로서 글루타민 합성 효소(GS)를 배치시킨 발현 벡터가 알려져 있다(국제 특허 공보 WO2012/063799, WO2013/161958). 이들 문헌에 기재된 발현 벡터는, 본 발명의 제조 방법에 특히 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 유전자 발현 제어 부위, 및 그 하류에 해당 단백질을 코딩하는 유전자, 더욱 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 더욱 하류에 글루타민 합성 효소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 또한 해당 유전자 발현 제어 부위의 또는 해당 유전자 발현 제어 부위와는 별도의 유전자 발현 제어 부위의 하류에 다이하이드로엽산리덕타제 유전자 또는 약제 내성 유전자를 추가로 포함하여 이루어지는, 발현 벡터는, 본 발명의 제조 방법에 적합하게 사용할 수 있다. 이 발현 벡터에 있어서, 유전자 발현 제어 부위 또는 별도의 유전자 발현 제어 부위로서는, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파 프로모터(hEF-1α 프로모터), 인간 유비퀴틴 C 프로모터가 적합하게 이용되지만, hEF-1α 프로모터가 특히 적합하다.
또한, 내부 리보솜 결합 부위로서는, 피코르나바이러스과의 바이러스, 구제역 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 코로나 바이러스, 소 장내 바이러스, 사일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B형 바이러스, 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 유전자, 초파리 안테나페디아 유전자, 초파리 울트라비토락스 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스 또는 유전자의 5' 비번역 영역에서 유래하는 것이 적합하게 이용되지만, 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위가 특히 적합하다. 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위를 이용하는 경우, 야생형의 것 이외에, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중의 일부가 파괴된 것도 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 이 발현 벡터에 있어서, 적합하게 이용되는 약제 내성 유전자는, 바람직하게는 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 유전자이며, 보다 바람직하게는 퓨로마이신 내성 유전자이다.
또한, 예를 들어, 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, hEF-1α 프로모터, 그 하류에 해당 단백질을 코딩하는 유전자, 더욱 하류에 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 및 더욱 하류에 글루타민 합성 효소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 또한 별도의 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 다이하이드로엽산리덕타제 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터이며, 해당 내부 리보솜 결합 부위가, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중의 일부가 파괴된 것인 발현 벡터는, 본 발명의 제조 방법에 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 발현 벡터로서, WO2013/161958에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
또한, 예를 들어, 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, hEF-1α 프로모터, 그 하류에 해당 단백질을 코딩하는 유전자, 더욱 하류에 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 및 더욱 하류에 글루타민 합성 효소를 코딩하는 유전자를 포함하고, 또한 별도의 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 약제 내성 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터이며, 해당 내부 리보솜 결합 부위가, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중의 일부가 파괴된 것인 발현 벡터는, 본 발명의 제조 방법에 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 발현 벡터로서, WO2012/063799에 기재된 pE-mIRES-GS-puro 및 WO2013/161958에 기재된 pE-mIRES-GS-mNeo를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 융합 단백질, 항체 또는 인간 리소좀 효소를 코딩하는 유전자가 짜넣어진 발현 벡터가 도입된 포유동물 세포는, 융합 단백질, 항체 또는 인간 리소좀 효소의 발현 레벨이 높은 세포를 선택하기 위해서, 선택 배지 중에서 선택 배양된다.
선택 배양에 있어서, DHFR을 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 DHFR 저해제의 농도를 단계적으로 상승시킨다. 그 최대 농도는, DHFR 저해제가 메토트렉세이트인 경우, 바람직하게는 0.25∼5μM이고, 보다 바람직하게는 0.5∼1.5μM이며, 더욱 바람직하게는 약 1.0μM이다.
GS를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 GS 저해제의 농도를 단계적으로 상승시킨다. 그 최대 농도는, GS 저해제가 MSX인 경우, 바람직하게는 100∼1000μM이고, 보다 바람직하게는 200∼500μM이며, 더욱 바람직하게는 약 300μM이다. 또한 이 때, 일반적으로 글루타민을 함유하지 않는 배지가 선택 배지로서 이용된다.
퓨로마이신을 분해하는 효소를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 퓨로마이신의 최대 농도는, 바람직하게는 3∼30μg/mL이고, 보다 바람직하게는 5∼20μg/mL이며, 더욱 바람직하게는 약 10μg/mL이다.
네오마이신을 분해하는 효소를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 G418의 최대 농도는, 바람직하게는 0.1mg∼2mg/mL이고, 보다 바람직하게는 0.5∼1.5mg/mL이며, 더욱 바람직하게는 약 1mg/mL이다.
또한, 포유동물 세포의 배양을 위한 배지로서는, 선택 배양에서 이용하는 배지, 후술하는 융합 단백질, 항체 또는 인간 리소좀 효소를 산생시키기 위해서 이용하는 배지(재조합 단백질 산생용 배지) 모두, 포유동물 세포를 배양하여 증식시킬 수 있는 것이면, 특별히 한정 없이 이용할 수 있지만, 바람직하게는 무혈청 배지가 이용된다.
선택 배양에 의해 선택된 융합 단백질, 항체 또는 인간 리소좀 효소의 발현 레벨이 높은 세포는, 이들의 산생 세포로서, 이들의 생산에 이용된다. 융합 단백질, 항체 또는 인간 리소좀 효소의 생산은, 이들의 산생 세포를 재조합 단백질 산생용 배지 중에서 배양하는 것에 의해 행해진다. 이 배양을 생산 배양이라고 한다.
본 발명에 있어서, 재조합 단백질 산생용 배지로서 이용되는 무혈청 배지로서는, 예를 들어, 아미노산을 3∼700mg/L, 비타민류를 0.001∼50mg/L, 단당류를 0.3∼10g/L, 무기염을 0.1∼10000mg/L, 미량 원소를 0.001∼0.1mg/L, 뉴클레오티드를 0.1∼50mg/L, 지방산을 0.001∼10mg/L, 비오틴을 0.01∼1mg/L, 하이드로코르티손을 0.1∼20μg/L, 인슐린을 0.1∼20mg/L, 비타민 B12를 0.1∼10mg/L, 푸트레신을 0.01∼1mg/L, 피루브산 나트륨을 10∼500mg/L, 및 수용성 철 화합물을 함유하는 배지가 적합하게 이용된다. 소망에 따라, 티미딘, 하이포잔틴, 관용의 pH 지시약 및 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
또한 재조합 단백질 산생용 배지로서 이용되는 무혈청 배지로서, DMEM/F12 배지(DMEM와 F12의 혼합 배지)를 기본 배지로서 이용해도 되고, 이들 각 배지는 당업자에게 주지이다. 더욱이 또한, 무혈청 배지로서, 탄산수소 나트륨, L-글루타민, D-글루코스, 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 다이아미노뷰테인, 하이드로코르티손, 황산 철(II), 아스파라긴, 아스파라긴산, 세린 및 폴리바이닐 알코올을 포함하는 것인, DMEM(HG) HAM 개량형(R5) 배지를 사용해도 된다. 더욱이 시판되는 무혈청 배지, 예를 들어, CD OptiCHOTM 배지, CHO-S-SFM II 배지 또는 CD CHO 배지(Thermo Fisher Scientific사), EX-CELLTM302 배지 또는 EX-CELLTM325-PF 배지(SAFC Biosciences사) 등을 기본 배지로서 사용할 수도 있다. 예를 들어, 16μmol/L 티미딘, 100μmol/L 하이포잔틴, 및 4 mmol/L L-알라닐 L-글루타민을 포함하는 무혈청 배지인 EX-CELLTM Advanced CHO Fed-batch 배지(SAFC Biosciences사)는, 융합 단백질 산생 세포의 배양에 적합하게 이용할 수 있다.
융합 단백질, 항체 또는 인간 리소좀 효소의 산생 세포의 생산 배양은, 이들 산생 세포의 재조합 단백질 산생용 배지 중에 있어서의 밀도를, 바람직하게는 0.2X105∼5X105개/mL, 보다 바람직하게는 1X105∼4X105개/mL, 더욱 바람직하게는 약 2X105개/mL로 조정하여 개시된다.
생산 배양은, 세포의 생존율(%)을 경시적으로 관찰하면서 행하고, 생산 배양 기간 중의 세포의 생존율이, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상으로 유지되도록 하여 행해진다.
또한, 생산 배양 기간 중, 배양 온도는, 바람직하게는 33.5∼37.5℃로 유지되고, 생산 배지 중의 용존 산소 포화도는, 바람직하게는 38∼42%, 보다 바람직하게는 약 40%로 유지된다. 여기에서, 용존 산소 포화도란, 산소의 포화 용해량을 100%로 했을 때의, 동 조건하에서의 산소의 용해량을 말한다.
또한, 생산 배양 기간 중, 생산 배지는 임펠러(날개차)로 교반된다. 이 때의 임펠러의 회전 속도는, 바람직하게는 50∼100회전/분이고, 보다 바람직하게는 60∼95회전/분, 예를 들어 70회전/분, 90회전/분 등으로 조정되지만, 임펠러의 형상 등에 따라 그 회전 속도는 적절히 변경된다.
생산 배양에 있어서의 적합한 배양 조건의 초기 조건으로서, 예를 들어, 생산 배양의 개시 시에 있어서의 산생 세포의 재조합 단백질 산생용 배지 중에 있어서의 밀도가 2X105개/mL이고, 생산 배양 기간 중의 배양 온도가 34∼37℃이며, 생산 배지 중의 용존 산소 포화도가 40%이고, 또한 배지가 약 89회전/분의 속도로 회전하는 임펠러로 교반되는 것을 들 수 있다.
생산 배양의 종료 후에 배지를 회수하고, 회수한 배지를 원심분리하는 것에 의해 또는 막 여과하는 것에 의해, 세포 등을 제거하여 배양 상청을 얻을 수 있다. 이 배양 상청 중에 포함되는 목적하는 융합 단백질은, 각종 크로마토그래피를 이용한 공정에 의해 정제된다. 정제 프로세스는, 실온 또는 저온 환경에서 행할 수 있지만, 바람직하게는 저온 환경에서 행해지고, 특히 1∼10℃의 온도에서 행해지는 것이 바람직하다.
이하, 배양 상청 중에 포함되는 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 정제 방법에 대해 상술한다.
정제 공정의 1 스텝은, 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피이다. 이 때 이용되는 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 A/G, 융합 단백질을 구성하는 항체를 항원으로서 인식하는 항체, 융합 단백질을 구성하는 항체가 항원으로서 인식하는 물질, 또는 항인간 리소좀 효소 항체이며, 보다 바람직하게는 프로테인 A이다. 이들을 조합하여 이용할 수도 있다. 배양 상청을 부하하는 것에 의해, 배양 상청 중에 포함되는 융합 단백질을 컬럼에 결합시키고, 컬럼을 세정한 후에, 융합 단백질을 컬럼으로부터 용출시킨다. 이렇게 하여 협잡물의 대부분을 제거할 수 있다. 융합 단백질을 구성하는 항체가 인간 IgG인 경우, 융합 단백질을 구성하는 항체를 항원으로서 인식하는 항체는, 항인간 IgG 항체이다.
상기의 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질 중에서, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 A/G, 융합 단백질을 구성하는 항체를 항원으로서 인식하는 항체는, 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질이라고 할 수도 있고, 또한, 항체에 친화성을 갖는 물질이라고 할 수도 있다.
프로테인 A는, 황색 포도상구균의 세포벽에 존재하는 분자량 약 42kD의 단백질이다. 프로테인 A는, IgG1, IgG2 및 IgG4 타입의 인간 항체(또는 인간화 항체)의 Fc 영역에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 프로테인 A는, VH3 서브패밀리에 속하는 IgG의 Fab 영역에도 결합할 수 있다. 따라서, 정제해야 할 융합 단백질의 일부를 구성하는 항체가, Fc 영역을 갖는 것이고, 또한, IgG1, IgG2 및 IgG4 타입의 인간 항체(또는 인간화 항체)인 경우에, 프로테인 A가 이용된다. 또한, 정제해야 할 융합 단백질의 일부를 구성하는 항체가, VH3 서브패밀리에 속하는 인간 항체(또는 인간화 항체)의 Fab, F(ab'), 또는 F(ab')2인 경우에도, 프로테인 A를 이용할 수 있다.
여기에서 이용되는 프로테인 A는, 항체에 대한 원하는 친화성을 갖는 것인 한, 야생형의 프로테인 A로 한정되는 것은 아니고, 야생형의 프로테인 A의 아미노산 서열의 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실, 부가시킨 변이형 프로테인 A여도 된다. 더욱이, 항체에 대한 원하는 친화성을 갖는 것인 한, 야생형 또는 변이형 프로테인 A의 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 펩타이드여도 된다. 이러한 부분 서열은, 항체와 결합하는 영역을 포함하는 것이다.
프로테인 G는, 연쇄구균의 균체 성분의 일종인 단백질이며, 분자량이 약 65kD(G148 프로테인 G)인 것과 약 58kD(C40 프로테인 G)인 것이 특히 알려져 있다. 프로테인 G는, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 타입의 인간 항체(또는 인간화 항체)에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 정제해야 할 융합 단백질의 일부를 구성하는 항체가, 프로테인 A에 결합하지 않는 IgG3 타입의 것인 경우에는, 프로테인 G를 이용하는 것에 의해 융합 단백질을 정제할 수 있다.
여기에서 이용되는 프로테인 G는, 항체에 대한 원하는 친화성을 갖는 것인 한, 야생형의 프로테인 G로 한정되는 것은 아니고, 야생형의 프로테인 G의 아미노산 서열의 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실, 부가시킨 변이형 프로테인 G여도 된다. 더욱이, 항체에 대한 원하는 친화성을 갖는 것인 한, 야생형 또는 변이형 프로테인 A의 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 펩타이드여도 된다. 이러한 부분 서열은, 항체와 결합하는 영역을 포함하는 것이다. 야생형의 프로테인 G는, 알부민 결합 영역을 갖고 있지만, 이러한 영역을 결실시킨 변이형 프로테인 G는, 본 발명에 있어서 특히 적합하게 사용할 수 있다.
프로테인 L은, Peptostreptococcus magnus의 균체 성분의 일종인 단백질이다. 프로테인 L은, 인간 항체(또는 인간화 항체)의 경쇄의 κ쇄 중에서, κI, κIII 및 κIV 서브타입에 속하는 것과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 프로테인 L은, 정제해야 할 융합 단백질의 일부를 구성하는 항체가, 이들 서브타입에 속하는 경쇄를 갖는 것인 경우에는, 항체가 Fab 또는 ScFv여도 이용할 수 있다.
여기에서 이용되는 프로테인 L은, 항체에 대한 원하는 친화성을 갖는 것인 한, 야생형의 프로테인 L로 한정되는 것은 아니고, 야생형의 프로테인 L의 아미노산 서열의 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실, 부가시킨 변이형 프로테인 L이어도 된다. 더욱이, 항체에 대한 원하는 친화성을 갖는 것인 한, 야생형 또는 변이형 프로테인 L의 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 펩타이드여도 된다. 이러한 부분 서열은, 항체와 결합하는 영역을 포함하는 것이다.
프로테인 A/G는, 4개의 프로테인 A의 Fc결합 영역과 2개의 프로테인 G의 Fc결합 영역을 결합시킨 인공적인 단백질이다. 프로테인 A/G는, 프로테인 G 및 프로테인 A의 양자의 성질을 겸비한 것이고, 프로테인 A로 정제 가능한 항체와 프로테인 G로 정제 가능한 항체의 모두를 정제할 수 있다.
융합 단백질의 일부를 구성하는 항체를 항원으로서 인식하는 항체는, 융합 단백질의 일부를 구성하는 항체가 인간 IgG인 경우, 이 인간 IgG를 특이적으로 결합하는 항인간 IgG 항체이다. 이러한 항인간 IgG 항체는, 융합 단백질 또는 그 일부를 구성하는 항체를 항원으로서 이용하여 동물을 면역하는 것에 의해, 모노클로날 항체로서 또는 폴리클로날 항체로서 제작할 수 있다.
융합 단백질의 일부를 구성하는 항체가 항원으로서 인식하는 물질은, 항체가, 항트랜스페린 수용체(TfR) 항체, 항인슐린 수용체 항체, 항렙틴 수용체 항체, 항리포단백질 수용체 항체, 항IGF 수용체 항체, 항OATP-F 항체, 항유기 음이온 트랜스포터 항체, 항MCT-8 항체, 항모노카복실산 트랜스포터 항체 및 Fc 수용체 항체인 경우, 각각 TfR, 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8, 및 Fc 수용체의 세포외 영역이다.
정제 공정의 다른 1 스텝은, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피이다. 이 때 이용되는 인산기에 친화성을 갖는 고정상에 특별히 한정은 없지만, 하이드록시아파타이트 및 플루오로아파타이트가 바람직하고, 특히 하이드록시아파타이트가 바람직하다. 당해 컬럼 크로마토그래피에 부하되는 융합 단백질을 포함하는 용액은, 부하되기 전에, 그 pH가 6.8∼7.8로 조정되는 것이 바람직하다.
상기의 정제 공정의 다른 1 스텝에 있어서, 융합 단백질은, 염 및 인산을 포함하는 중성 부근의 pH의 완충액으로 평형화시켜 둔 고정상에 결합된다. 이 때에 이용되는 완충액은, 바람직하게는 MES 완충액이며, 그 pH는 6.8∼7.8인 것이 바람직하다. 또한, 완충액에 포함되는 염에 특별한 한정은 없지만, 염화 나트륨이 바람직하고, 그 농도는 바람직하게는 70∼230mM이며, 보다 바람직하게는 160∼220mM이다. 또한, 완충액에 포함되는 인산의 농도는, 바람직하게는 0.2∼4.0mM이며, 보다 바람직하게는 1∼2.5mM이다.
융합 단백질을 결합시킨 컬럼을 세정한 후, 융합 단백질을, 염을 포함하는 중성 부근의 pH의 완충액으로 컬럼으로부터 용출시키고, 융합 단백질을 함유하는 획분을 회수한다. 이 때에 이용되는 완충액은, 바람직하게는 인산 완충액이며, 그 pH는 6.8∼7.8인 것이 바람직하다. 또한, 완충액에 포함되는 인산의 농도는, 바람직하게는 10∼50mM이며, 보다 바람직하게는 20∼40mM이다. 또한, 완충액에 포함되는 염에 특별한 한정은 없지만, 염화 나트륨이 바람직하고, 그 농도는 바람직하게는 70∼230mM이며, 보다 바람직하게는 160∼220mM이다. 또한, 완충액에 포함되는 인산의 농도는, 바람직하게는 0.2∼4.0mM이다.
정제 공정의 추가의 다른 1 스텝인, 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제 공정은, 엔도토톡신 등의 저분자의 불순물, 융합 단백질의 다량체, 분해물 등을 제거하기 위한 것이고, 이것에 의해, 실질적으로 순수한 융합 단백질이 얻어진다.
융합 단백질의 정제 공정에 있어서, 배양 상청으로부터 가져 오게 될 우려가 있는 바이러스를 불활화하는 공정을 추가시킬 수도 있다. 이 바이러스 불활화 공정은, 정제 공정의 제 1 스텝의 전에 실시해도 되고, 정제 공정의 각 스텝의 사이에 실시해도 되고, 정제 공정의 종료 후에 실시해도 된다. 예를 들어, 정제 공정이, 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피(정제 공정의 제 1 스텝), 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피(정제 공정의 제 2 스텝), 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피(정제 공정의 제 3 스텝)를, 이 순서로 행하는 것인 경우, 바이러스 불활화 공정은, 정제 공정의 제 1 스텝의 전에, 또는 정제 공정의 제 1 스텝과 제 2 스텝의 사이에 실시되는 것이 바람직하다.
바이러스 불활화 공정은, 융합 단백질을 포함하는 용액에 비이온성 계면활성제를 첨가하고, 20∼60℃에서 2∼6시간, 교반하는 것에 의해 행해진다. 이 때 이용되는 비이온성 계면활성제의 적합한 것으로서, 폴리소베이트 20, 80, 및 트라이n-뷰틸인산, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
바이러스 불활화 공정은, 바이러스 제거막을 이용하여 행할 수도 있다. 공경이 35nm, 20nm인 바이러스 제거막에, 융합 단백질을 포함하는 용액을 통과시키는 것에 의해, 용액 중에 포함되는 바이러스를 제거할 수 있다.
본 발명의 제조 방법을 이용하여 얻어지는 융합 단백질의 정제품은, 그대로 의약으로서 이용할 수 있는 순도의 것이다. 융합 단백질의 정제품에 포함되는 숙주 세포 유래 단백질(HCP)의 농도는, 바람직하게는 300ppm 미만이고, 보다 바람직하게는 100ppm 미만이며, 예를 들어 60ppm 미만이다. 또한, 융합 단백질의 정제품에 포함되는, 융합 단백질 전체에서 차지하는 중합체의 비율은, 바람직하게는 1% 미만이다.
본 발명의 제조 방법을 이용하여 얻어지는 융합 단백질의 정제품은, 의약으로서 공급하는 경우, 적당한 부형제를 포함하는 수성 액제 또는 동결건조 제제로서 공급할 수 있다. 수성 액제로 하는 경우, 바이알에 충전한 형태로 해도 되고, 주사기에 미리 충전한 것인 프리필드형의 제제로서 공급할 수도 있다. 동결건조 제제의 경우, 사용 전에 수성 매질에 용해하여 사용한다.
융합 단백질의 정제품은, 의약으로서 인간에 투여할 때는, 주사제로서, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 동맥내, 또는 병소내에 투여할 수 있지만, 정맥내 투여가 바람직하다.
또한, 융합 단백질의 정제품은, 인간에 투여했을 때에 BBB를 통과할 수 있으므로, 중추 신경 장애를 수반하는 각종 질환의 치료제로서 이용할 수 있다. 융합 단백질을 투여하는 것에 의해, 중추 신경 장애를 예방하거나, 관해(寬解)하거나, 또는 그 진행을 지연시킬 수 있다.
이하, 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질(인간화 항hTfR 항체-I2S)에 대한 정제 방법을 상술한다. 한편, 이 융합 단백질의 일부를 구성하는 항체는, IgG1 타입의 것이다.
정제 공정의 제 1 스텝은 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피이다. 이 때 이용되는 항체에 친화성을 갖는 물질에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 A/G, 항인간 IgG1 항체, 항체의 항원인 hTfR, 또는 항인간 I2S 항체이며, 보다 바람직하게는 프로테인 A이다. 해당 물질이 hTfR인 경우에 있어서는, 그 세포외 영역이다.
제 1 스텝에 있어서, 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질로서 프로테인 A를 이용하는 경우, 융합 단백질을 포함하는 배양 상청은, 미리 염을 포함하는 중성 부근의 완충액으로 평형화시켜 둔 컬럼에 결합시킨다. 이 때에 이용되는 완충액은, 바람직하게는 트로메타몰 완충액이고, 그 pH는 바람직하게는 6.5∼7.5이며, 보다 바람직하게는 약 7.0이다. 또한, 완충액에 포함되는 염에 특별한 한정은 없지만, 염화 나트륨이 바람직하고, 그 농도는 바람직하게는 60∼180mM이며, 보다 바람직하게는 100∼150mM이고, 더욱 바람직하게는 약 140mM이다.
융합 단백질을 결합시킨 컬럼을 세정한 후, 융합 단백질을, 염을 포함하는 산성의 완충액으로 용출시켜, 융합 단백질을 함유하는 획분을 회수한다. 이 때에 이용되는 완충액은, 바람직하게는 글리신 완충액이고, 그 pH는 바람직하게는 3.2∼3.8이며, 보다 바람직하게는 3.5이다. 또한, 완충액에 포함되는 염에 특별한 한정은 없지만, 염화 나트륨이 바람직하고, 그 농도는 바람직하게는 60∼180mM이며, 보다 바람직하게는 100∼150mM이고, 더욱 바람직하게는 약 140mM이다. 회수한 융합 단백질을 함유하는 용액의 pH는, 신속하게 중성 부근이 되도록 조정된다.
정제 공정의 제 2 스텝은 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피이다. 이 때 이용되는 인산기에 친화성을 갖는 고정상에 특별히 한정은 없지만, 하이드록시아파타이트 및 플루오로아파타이트가 바람직하고, 특히 하이드록시아파타이트가 바람직하다.
정제 공정의 제 2 스텝에 있어서, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 하이드록시아파타이트를 이용하는 경우, 융합 단백질은, 염 및 인산을 포함하는 중성 부근의 pH의 완충액으로 평형화시켜 둔 고정상에 결합된다. 이 때에 이용되는 완충액은, 바람직하게는 MES 완충액이고, 그 pH는 바람직하게는 6.8∼7.8이며, 보다 바람직하게는 pH 7.3이다. 또한, 완충액에 포함되는 염에 특별한 한정은 없지만, 염화 나트륨이 바람직하고, 그 농도는 바람직하게는 150∼230mM이며, 보다 바람직하게는 215mM이다. 또한, 완충액에 포함되는 인산의 농도는, 바람직하게는 1.0∼4.0mM이며, 보다 바람직하게는 2.0mM이다.
융합 단백질을 결합시킨 컬럼을 세정한 후, 융합 단백질을, 염을 포함하는 중성 부근의 pH의 완충액으로 컬럼으로부터 용출시켜, 융합 단백질을 함유하는 획분을 회수한다. 이 때에 이용되는 완충액은, 바람직하게는 인산 완충액이고, 그 pH는 바람직하게는 6.8∼7.8이며, 보다 바람직하게는 pH 7.3이다. 또한, 완충액에 포함되는 인산의 농도는, 바람직하게는 30∼50mM이고, 보다 바람직하게는 약 35mM이다. 또한, 완충액에 포함되는 염에 특별한 한정은 없지만, 염화 나트륨이 바람직하고, 그 농도는 바람직하게는 150∼230mM이며, 보다 바람직하게는 215mM이다.
정제 공정의 제 3 스텝은, 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피이다. 이 스텝은, 엔도토톡신 등의 저분자의 불순물, 융합 단백질의 다량체, 분해물 등을 제거하기 위한 것이고, 이것에 의해, 실질적으로 순수한 융합 단백질이 얻어진다.
인간화 항hTfR 항체-I2S의 정제 공정에 있어서, 배양 상청으로부터 가져 오게 될 우려가 있는 바이러스를 불활화하는 공정을 추가시킬 수도 있다. 이 바이러스 불활화 공정은, 정제 공정의 제 1 스텝의 전에 실시해도 되고, 정제 공정의 각 스텝의 사이에 실시해도 되고, 정제 공정의 종료 후에 실시해도 되지만, 예를 들어, 정제 공정의 제 1 스텝의 전에, 또는 정제 공정의 제 1 스텝과 제 2 스텝의 사이에 실시된다.
바이러스 불활화 공정은, 인간화 항hTfR 항체-I2S를 포함하는 용액에 비이온성 계면활성제를 첨가하고, 20∼60℃에서 2∼6시간, 교반하는 것에 의해 행해진다. 이 때 이용되는 비이온성 계면활성제의 적합한 것으로서, 폴리소베이트 20, 80, 및 트라이n-뷰틸 인산, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
바이러스 불활화 공정은, 바이러스 제거막을 이용하여 행할 수도 있다. 공경이 35nm, 20nm인 바이러스 제거막에, 인간화 항hTfR 항체-I2S를 포함하는 용액을 통과시키는 것에 의해, 용액 중에 포함되는 바이러스를 제거할 수 있다.
본 발명의 제조 방법을 이용하여 얻어지는 인간화 항hTfR 항체-I2S의 정제품은, 그대로 의약으로서 이용할 수 있는 순도의 것이다. 인간화 항hTfR 항체-I2S의 정제품에 포함되는 숙주 세포 유래 단백질(HCP)의 농도는, 100ppm 미만이고, 예를 들어, 60ppm 미만, 40ppm 미만 등이다. 또한, 인간화 항hTfR 항체-I2S의 정제품에 포함되는, 인간화 항hTfR 항체-I2S 전체에서 차지하는 중합체의 비율은, 1% 미만이고, 예를 들어, 0.8% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만 등이다.
본 발명의 제조 방법을 이용하여 얻어지는 인간화 항hTfR 항체-I2S의 정제품은, 의약으로서 공급하는 경우, 적당한 부형제를 포함하는 수성 액제 또는 동결건조 제제로서 공급할 수 있다. 수성 액제로 하는 경우, 바이알에 충전한 형태로 해도 되고, 주사기에 미리 충전한 것인 프리필드형의 제제로서 공급할 수도 있다. 동결건조 제제의 경우, 사용 전에 수성 매질에 용해하여 사용한다.
인간화 항hTfR 항체-I2S의 정제품은, 의약으로서 인간에 투여할 때는, 주사제로서, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 동맥내, 또는 병소내에 투여할 수 있다. 예를 들어, 당해 정제품은, 링겔에 의해 정맥내 투여할 수 있다.
또한, 인간화 항hTfR 항체-I2S의 정제품은, 헌터 증후군, 특히 중추 신경 장애를 수반하는 헌터 증후군의 치료제로서 이용할 수 있다. 헌터 증후군의 환자에게 투여된 인간화 항hTfR 항체-I2S는, 환자의 장기에 축적된 글리코사미노글리칸(GAG)을 분해하고, 더욱이 BBB를 통과하여 뇌조직 내에 축적된 GAG도 분해할 수 있으므로, 헌터 증후군의 중추 신경 장애를 예방하거나, 관해하거나, 또는 그 진행을 지연시킬 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예로 한정되는 것은 의도하지 않는다.
〔실시예 1〕 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질 발현용 벡터의 구축
인간화 항hTfR 항체-hI2S 융합 단백질 발현용 벡터는, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어지는 인간화 항hTfR 항체 번호 1, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어지는 인간화 항hTfR 항체 번호 2, 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어지는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 3종류의 인간화 항hTfR 항체(번호 1∼3)를 코딩하는 유전자를 이용하여 구축했다.
pEF/myc/nuc 벡터(Invitrogen사)를, KpnI와 NcoI로 소화하여, EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 절출하고, 이것을 T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화 처리했다. pCI-neo 벡터(Invitrogen사)를, BglII 및 EcoRI로 소화하여, CMV의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화 처리했다. 이것에, 상기의 EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축했다. pE-neo 벡터를, SfiI 및 BstXI로 소화하여, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1kbp의 영역을 절제했다. pcDNA3.1/Hygro(+) 벡터(Invitrogen사)를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi5'(서열 번호 27) 및 프라이머 Hyg-BstX3'(서열 번호 28)를 이용하여, PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭했다. 증폭한 하이그로마이신 유전자를, SfiI 및 BstXI로 소화하여, 상기의 네오마이신 내성 유전자를 절제한 pE-neo 벡터에 삽입하여, pE-hygr 벡터를 구축했다. pE-hygr 벡터의 구축법은, 특허문헌(일본 특허공개 2009-273427)에도 개시되어 있다.
서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 전체 길이를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 21)을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 짜넣었다. 얻어진 벡터를 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC1)로 했다.
서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 전체 길이를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 22)을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 짜넣었다. 얻어진 벡터를, 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC2)로 했다.
서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 전체 길이를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 23)을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 짜넣었다. 얻어진 벡터를, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC3)로 했다.
서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 C말단측에, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 24로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-1)를 구축했다.
서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 C말단측에, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 25로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-2)를 구축했다.
서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 C말단측에(Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 26으로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-3)를 구축했다.
〔실시예 2-1〕 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주의 제작
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection로부터 입수)를, 하기의 방법에 의해, GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 실시예 1에서 구축한 pE-hygr(LC1)와 pE-neo(HC-I2S-1)의 조합, 실시예 1에서 구축한 pE-hygr(LC2)와 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합, 및 실시예 1에서 구축한 pE-hygr(LC3)와 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합으로, 각각 형질 전환했다.
세포의 형질 전환은 대체로 이하의 방법으로 행했다. 5X105개의 CHO-K1 세포를 CD OptiCHOTM 배지(Thermo Fisher Scientific사)를 첨가한 3.5cm 배양 디쉬에 파종하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, 세포를 5X106 세포/mL의 밀도가 되도록 Opti-MEM TMI 배지(Thermo Fisher Scientific사)로 현탁시켰다. 100μL의 세포 현탁액을 채취하고, 이것에 CD OptiCHOTM 배지로 100μg/mL에 희석한 pE-hygr(LC1) 및 pE-neo(HC-I2S-1) 핵외 유전자 DNA 용액을 5μL씩 첨가했다. GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 전기영동을 실시하여, 세포에 핵외 유전자를 도입했다. 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포를, 0.5mg/mL의 하이그로마이신 및 0.8mg/mL의 G418을 첨가한 CD OptiCHOTM 배지로 선택 배양했다. pE-hygr(LC2)와 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합, 및 pE-hygr(LC3)와 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합에 대해서도, 마찬가지의 방법에 의해 세포를 형질 전환했다.
그 다음에, 한계 희석법에 의해, 1웰당 1개 이하의 세포가 파종되도록, 96웰 플레이트 상에 선택 배양으로 선택된 세포를 파종하고, 각 세포가 단클론 콜로니를 형성하도록 약 10일간 배양했다. 단클론 콜로니가 형성된 웰의 배양 상청을 채취하고, 인간화 항체 함량을 ELISA법으로 조사하여 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를 선택했다.
이 때의 ELISA법은 대체로 이하의 방법으로 실시했다. 96웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc사)의 각 웰에, 염소 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을 0.05M 탄산수소염 완충액(pH 9.6)으로 4μg/mL로 희석한 것을 100μL씩 가하고, 실온에서 적어도 1시간 정치하여 항체를 플레이트에 흡착시켰다. 그 다음에, 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4)에 0.05% Tween20을 첨가한 것(PBS-T)으로 각 웰을 3회 세정 후, Starting Block(PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific사)를 각 웰에 200μL씩 가하고 플레이트를 실온에서 30분 정치했다. 그 다음에, 각 웰을 PBS-T로 3회 세정한 후, 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4)에 0.5% BSA 및 0.05% Tween20을 첨가한 것(PBS-BT)으로 적당한 농도로 희석한 배양 상청 또는 인간 IgG 표준품을, 각 웰에 100μL씩 가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. 그 다음에, 플레이트를 PBS-T로 3회 세정한 후, PBS-BT로 희석한 HRP 표지 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을, 각 웰에 100μL씩 가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, 0.4mg/mL o-페닐렌다이아민을 포함하는 인산-시트르산 완충액(pH 5.0)을 100μL씩 각 웰에 가하고, 실온에서 8∼20분간 정치했다. 그 다음에, 1mol/L 황산을 100μL씩 각 웰에 가하여 반응을 정지시키고, 96웰 플레이트 리더를 이용하여, 각 웰에 대해 490nm에서의 흡광도를 측정했다. 높은 측정치를 나타낸 웰에 대응하는 세포를, hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주로서 선택했다.
pE-hygr(LC1)와 pE-neo(HC-I2S-1)의 조합으로 형질 전환시켜 얻어진 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 1로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 1로 했다.
pE-hygr(LC2)과 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합으로 형질 전환시켜 얻어진 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 2로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 2로 했다.
pE-hygr(LC3)과 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합으로 형질 전환시켜 얻어진 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 3으로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 3으로 했다.
〔실시예 3〕 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주의 제작
실시예 2에서 얻은 hI2S-항hTfR 항체 발현주 1∼3을, 10mg/L 인슐린, 40mg/mL 티미딘, 및 10%(v/v) DMSO를 함유하는 CD OptiCHOTM 배지에 현탁시키고 나서 클라이오튜브에 분주하고, 종(種)세포로서 액체 질소 중에서 보존했다.
〔실시예 4〕 hI2S-항hTfR 항체 발현주의 배양
I2S-항hTfR 항체를, 이하의 방법으로 제조했다. 실시예 2-1에서 얻은 hI2S-항hTfR 항체 발현주 3을, 세포 밀도가 약 2X105개/mL가 되도록, 4mM L-알라닐-L-글루타민, 100μmol/L 하이포잔틴 및 16μmol/L 티미딘을 함유하는, 약 200L의 무혈청 배지(EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium, Sigma Aldrich사)에 현탁시켰다. 이 세포 현탁액의 140L를 배양조로 옮겼다. 배지를 임펠러로 89rpm의 속도로 교반하고, 배지의 용존 산소 포화도를 약 40%로 유지하고, 34∼37℃의 온도 범위에서, 약 11일간 세포를 배양했다. 배양 기간 중, 세포수, 세포의 생존율, 배지의 글루코스 농도 및 락트산 농도를 감시했다. 배지의 글루코스 농도가 15mmol/L 미만이 되었을 경우에는, 즉시 글루코스 농도가 37.89mmol/L가 되도록, 글루코스 용액을 배지에 첨가했다. 배양 종료 후에 배지를 회수했다. 회수한 배지를, Millistak+HC Pod Filter grade D0HC(Merck사)로 여과하고, 추가로 Millistak+ HCgrade X0HC(Merck사)로 여과하여, I2S-항hTfR 항체 3을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 이 배양 상청을, PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(공경: 30kDa, 막 면적: 1.14m2, Merck사)을 이용하여 한외 여과하여, 액량이 약 17분의 1이 될 때까지 농축했다. 그 다음에, 이 농축액을 Opticap XL600(0.22μm, Merck사)을 이용하여 여과했다. 얻어진 액을 농축 배양 상청으로 했다.
〔실시예 5〕 바이러스의 불활화
실시예 4에서 얻은 농축 배양 상청에, 트라이n-뷰틸 인산(TNBP) 및 폴리소베이트 80을, 종(終)농도가 각각 0.3%(v/v) 및 1%(w/v)가 되도록 첨가하고, 실온에서 4시간 온화하게 교반했다. 이 조작은 배양 상청 중에 혼입되는 바이러스를 불활화시키기 위한 것이다. 단, 생물 유래의 성분을 포함하지 않는 무혈청 배지를 이용하여 세포를 하는 한, 배양 상청 중에 인체에 유해한 바이러스가 혼입될 가능성은 거의 없다.
〔실시예 6〕 hI2S-항hTfR 항체의 정제
바이러스 불활화 후의 농축 배양 상청을, 0.5배용(容)의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 첨가한 후에, Millipak-200 Filter Unit(공경: 0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 이 여과 후의 용액을, 컬럼 체적의 4배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 평형화한, 프로테인 A 어피니티 컬럼인 MabSelect SuRe LX 컬럼(컬럼 체적: 약 3.2L, 베드 높이: 약 20cm, GE Healthcare사)에, 200cm/hr의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항hTfR 항체 3을 프로테인 A에 흡착시켰다.
그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 500mM NaCl 및 450mM 아르기닌을 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에 컬럼 체적의 2.5배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 더욱 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 140mM NaCl을 함유하는 100mM 글리신 완충액(pH 3.5)으로, 프로테인 A에 흡착된 I2S-항hTfR 항체 3을 용출시켰다. 용출액은, 미리 1M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)을 넣어 둔 용기에 받아, 즉시 중화시켰다.
상기의 프로테인 A 어피니티 컬럼으로부터의 용출액에, 200mM 인산 완충액(pH 7.0)과, 4M NaCl 및 2mM 인산 완충액을 함유하는 10mM MES 완충액(pH 7.3)과, 1M Tris-HCl 완충액(pH 8.0)을 순차 첨가하여, 용출액에 포함되는 인산 나트륨 및 NaCl의 농도를, 각각 2mM 및 215mM로 조정함과 함께, 용출액의 pH를 7.3으로 조정했다. 그 다음에, 이 용출액을, Opticap XL600(공경: 0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 이 여과 후의 용액을, 컬럼 체적의 4배용의 215mM NaCl 및 2mM 인산 나트륨을 함유하는 10mM MES 완충액(pH 7.3)으로 평형화한, 하이드록시아파타이트 컬럼인 CHT TypeII 40μm 컬럼(컬럼 체적: 약 3.2L, 베드 높이: 약 20cm, Bio-Rad사)에, 200cm/hr의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항hTfR 항체 3을 하이드록시아파타이트에 흡착시켰다.
그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 215mM NaCl을 함유하는 35mM 인산 완충액(pH 7.3)으로, 하이드록시아파타이트에 흡착한 I2S-항hTfR 항체 3을 용출시켰다. 한편, 하이드록시아파타이트 컬럼에서의 정제는, 프로테인 A 어피니티 컬럼으로부터의 용출액을 반량씩 이용하여, 2회로 나누어 실시했다.
상기의 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출액에, 묽은 염산을 가하여 pH를 6.5로 조정했다. 그 다음에, PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(공경: 30kDa, 막 면적: 1.14m2, Merck사)을 이용하여 한외 여과하여, 용액 중의 I2S-항hTfR 항체 3의 농도가 약 2mg/mL가 될 때까지 농축했다. 그 다음에, 이 농축액을 Opticap XL600(0.22μm, Merck사)을 이용하여 여과했다.
상기의 농축액을, 컬럼 체적의 5배용의 0.8mg/mL NaCl 및 75mg/mL 수크로스를 함유하는 20mM 인산 완충액(pH 6.5)으로 평형화한, 사이즈 배제 컬럼인 Superdex 200 컬럼(컬럼 체적: 약 12.6L, 베드 높이: 40cm, GE Healthcare사)에, 19cm/hr의 일정 유속으로 부하하고, 추가로, 동 완충액을 동일 유속으로 공급했다. 이 때, 사이즈 배제 컬럼으로부터의 용출액의 유로에, 용출액의 흡광도를 연속적으로 측정하기 위한 흡광 광도계를 배치하여, 280nm의 흡광도를 모니터하고, 280nm에서 흡수 피크를 나타낸 획분을, I2S-항hTfR 항체 3을 포함하는 획분으로서 회수하여, 이것을 I2S-항hTfR 항체 정제품으로 했다. 한편, 사이즈 배제 컬럼에서의 정제는, 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출액을 반량씩 이용하여, 2회로 나누어 실시했다.
〔실시예 7〕 정제 각 스텝에 있어서의 I2S-항hTfR 항체의 회수율의 측정
정제 각 스텝에 있어서의 I2S-항hTfR 항체 3의 부하량 및 용출액 중에 회수된 양을 실시예 2에 기재된 ELISA법을 이용하여 측정했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 당초, 배양 상청 중에 포함된 36.7g의 I2S-항hTfR 항체 3의 약 76.5%에 상당하는, 30.6g의 I2S-항hTfR 항체 3이, 정제품으로서 회수되었다. 이들 결과는, 상기 실시예에 기재된 정제법이, I2S-항hTfR 항체 3의 정제 방법으로서 매우 효율이 높은 것임을 나타내는 것이다. 한편, 표 1에 있어서, 공정 회수율(%)은, 각 정제 스텝에 있어서의 부하한 rhI2S량에 대한 회수된 rhI2S량의 비율을 의미하고, 총 회수율(%)은, 정제 공정에 제공한 rhI2S량의 초기량에 대한 각 정제 스텝에서 회수된 rhI2S량의 비율을 의미한다.
Figure 112019028328568-pct00001
〔실시예 8〕 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석(HCP의 정량)
I2S-항hTfR 항체 정제품에 포함되는 숙주 세포 유래 단백질(HCP)의 양을 ELISA법에 의해 정량했다. 우선, 96웰 플레이트(Nunc사)의 각 웰에 항CHO 세포 유래 단백질 항체를 100μL 첨가하고, 하룻밤 정치하여 항체를 흡착시켰다. 각 웰을 3회 세정한 후, 각 웰에 카제인을 포함하는 블로킹 용액을 200μL 첨가하고, 25℃에서 60분간 진탕했다. 각 웰을 3회 세정한 후, 각 웰에 I2S-항hTfR 항체 정제품을 포함하는 용액(샘플 용액) 또는 HCP 표준 용액을 각각 100μL 첨가하고, 25℃에서 2시간 진탕했다. 각 웰을 3회 세정한 후, 각 웰에 비오틴화 항CHO 세포 유래 단백질 항체를 100μL 첨가하고, 25℃에서 60분간 진탕했다. 각 웰을 3회 세정한 후, HRP-conjugated streptavidin(Jackson Immuno Research Laboratories사)을 100μL 첨가하고, 25℃에서 60분간 진탕했다. 각 웰을 3회 세정한 후, 각 웰에 TMB 기질 용액을 100μL 첨가하고, 25℃에서 진탕하여 발색시켰다. TMB 기질 용액에는, TMB microwell peroxidase substrate system(KPL사)의 TMB peroxidase substrate와 Peroxidase substrate solution B를 등량 혼합한 것을 이용했다. 발색 후, 각 웰에 1mol/L 황산을 100μL 첨가하여 효소 반응을 정지시키고, 각 웰의 450nm에 있어서의 흡광도를 96웰용 플레이트 리더로 측정했다. HCP 표준 용액의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 샘플 용액의 값을 내삽하여 I2S-항hTfR 항체 정제품에 포함되는 HCP를 정량했다. 이렇게 하여 구한 HCP의 정량치와, 실시예 2에 기재된 ELISA법을 이용하여 측정한 I2S-항hTfR 항체 정제품의 정량치로부터, I2S-항hTfR 항체 정제품에 포함되는 HCP를 정량했다. 그 결과, I2S-항hTfR 항체 정제품에 포함되는 HCP의 양은, 약 35ppm(즉, 1mg의 I2S-항hTfR 항체 정제품 중에 약 35ng의 HCP)임을 알 수 있었다.
〔실시예 9〕 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석(SE-HPLC 분석)
TSKgel UltraSW Aggregate 컬럼(내경 7.8mm X 높이 30cm, 도소사)을 LC-20A 시스템, SPD-20AV의 UV/VIS 검출기(시마즈제작소사)에 세팅했다. 컬럼을 5% 프로판올과 20mM NaCl을 포함하는 200mM 인산 완충액(pH 6.5)으로 평형화했다. 이 컬럼에, 실시예 6에서 얻은 I2S-항hTfR 항체 정제품을 1mg/mL의 농도로 함유하는 10μL의 용액을, 0.5mL/분의 일정 유속으로 부하하고, 추가로 동 완충액을 동일 유속으로 공급했다. 215nm에 있어서의 흡광도를 측정하여 작성한 용출 프로파일을 도 1에 나타낸다. 얻어진 프로파일은, 거의 I2S-항hTfR 항체 3에서 유래하는 단일한 피크만을 나타냈다. 단, 주 피크(도면 중 피크 A)보다도 전에 검출되는 I2S-항hTfR 항체 3의 중합체에서 유래하는 피크(도면 중 피크 B)가 확인되었다. 피크 전체의 면적과 피크 B의 면적의 비율로부터, I2S-항hTfR 항체 3 전체에서 차지하는 중합체의 비율은, 약 0.49%로 계산되었다.
〔실시예 10〕 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석(정리)
이상의 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석 결과는, 실시예 6에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품이, HCP를 포함하는 협잡물을 거의 포함하지 않는 것임, 및 중합체의 존재 비율이 극히 낮음을 나타내는 것이다. 즉, I2S-항hTfR 항체 정제품은, 의약, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 동맥내, 또는 병소내 투여제로서 그대로 사용할 수 있는 품질의 것이라고 말할 수 있다.
〔실시예 11〕 hI2S-항hTfR 항체 발현주의 배양(별법)
실시예 3에서 얻은 hI2S-항hTfR 항체 발현주 3의 종세포를, 37℃ 수욕 중에서 융해했다. 세포를, 4mM L-알라닐-L-글루타민, 100μmol/L 하이포잔틴, 16μmol/L 티미딘, 및 500μg/mL 하이그로마이신 B, 및 10μg/mL 퓨로마이신을 함유하는, 무혈청 배지(EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium, Sigma Aldrich사)에, 4X105개/mL의 밀도로 현탁시키고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 3일간, 진탕 배양했다. 세포수가 적어도 5X1011개로 증식할 때까지, 이 배양을 반복했다.
그 다음에, 세포를, 세포 밀도가 약 2X105개/mL가 되도록, 4mM L-알라닐-L-글루타민, 100μmol/L 하이포잔틴, 및 16μmol/L 티미딘 함유하는 무혈청 배지(EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium, Sigma Aldrich사)에 현탁시켰다. 이 세포 현탁액의 약 1400L를 배양조로 옮기고, 임펠러로 80rpm의 속도로 교반하고, 배지의 pH를 6.9로, 및 용존 산소 포화도를 약 40%로 유지하고, 배양 온도를 34∼37℃의 범위로 조절하면서, 약 11일간 세포를 배양했다. 또한, 35g/L 글루코스를 포함하는 EX-CELL Advanced CHO Feed1을, 3일째부터 10일째까지 매일 70L씩 가했다. 샘플링은, 배양 중에 매일 실시되고, 세포수, 생존율, 글루코스 농도, 락트산 농도가 측정되었다. anti-hTfRAb-I2S 발현량은 5일째부터 11일째까지 측정되었다. 글루코스 농도가 15mmol/L 미만이 되었을 경우에는, 즉시 37.89mmol/L의 농도가 되도록 글루코스를 첨가했다.
배양 종료 후에 배지를 회수했다. 회수한 배지를, Millistak+HC Pod Filter grade D0HC(Merck사)로 여과하고, 추가로 Millistak+ HCgrade X0HC(Merck사)로 여과하여, I2S-항hTfR 항체 3을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 이 배양 상청을, PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(공경: 30kDa, 막 면적: 9.12m2, Merck사)을 이용하여 한외 여과하여, 액량이 약 13분의 1이 될 때까지 농축했다. 그 다음에, 이 농축액을 Opticap XL600(0.22μm, Merck사)을 이용하여 여과했다. 얻어진 액을 농축 배양 상청으로 했다.
〔실시예 12〕 hI2S-항hTfR 항체의 정제(별법)
실시예 11에서 얻은 농축 배양 상청의 1/3액량을, 컬럼 체적의 4배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 평형화한, 프로테인 A 어피니티 컬럼인 MabSelect SuRe LX 컬럼(컬럼 체적: 약 9.8L, 베드 높이: 약 20cm, GE Healthcare사)에, 200cm/hr의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항hTfR 항체 3을 프로테인 A에 흡착시켰다.
그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 500mM NaCl 및 450mM 아르기닌을 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 2.5배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 140mM NaCl을 포함하는 100mM 글리신 완충액(pH 3.5)으로, 프로테인 A에 흡착된 I2S-항hTfR 항체 3을 용출시켰다. 용출액은 100mM MES 완충액(pH 7.0)이 들어간 용기로 받아, 즉시 중화시켰다.
상기의 프로테인 A 어피니티 컬럼으로부터의 용출액에, 종농도가 1%(w/v)가 되도록 폴리소베이트 80을 가하고, 실온에서 3시간 이상 온화하게 교반했다. 이 공정은, 용출액에 혼입되어 있을 우려가 있는 바이러스를 불활화하기 위한 것이다.
상기의 바이러스 불활화 후의 용액에, 200mM 인산 완충액(pH 7.0)과, 4M NaCl 및 2mM 인산 완충액을 함유하는 10mM MES 완충액(pH 7.3)과, 1M Tris-HCl 완충액(pH 8.8)을 순차 첨가하여, 용출액에 포함되는 인산 나트륨 및 NaCl의 농도를, 각각 2mM 및 215mM로 조정함과 함께, 용출액의 pH를 7.3으로 조정했다. 그 다음에, 이 용출액을, OPTICAP SHC XL3(0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 이 여과 후의 용액을, 컬럼 체적의 4배용의 215mM NaCl 및 2mM 인산 완충액을 함유하는 10mM MES 완충액(pH 7.3)으로 평형화한, 하이드록시아파타이트 컬럼인 CHT TypeII 40μm 컬럼(컬럼 체적: 약 19.2L, 베드 높이: 약 20cm, Bio-Rad사)에, 200cm/hr의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항hTfR 항체 3을 하이드록시아파타이트에 흡착시켰다.
그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 215mM NaCl을 함유하는 35mM 인산 완충액(pH 7.3)으로, 하이드록시아파타이트에 흡착한 I2S-항hTfR 항체 3을 용출시켰다.
상기의 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출액에, 묽은 염산을 가하여 pH를 6.5로 조정했다. 그 다음에, PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(공경: 30kDa, 막 면적: 2.85m2, Merck사)을 이용하여 한외 여과하여, 용액 중의 I2S-항hTfR 항체 3의 농도가 약 20mg/mL가 될 때까지 농축했다. 그 다음에, 이 농축액을 OPTICAP SHC XL3(0.22μm, Merck사)을 이용하여 여과했다.
상기의 농축액을, 컬럼 체적의 5배용의 0.8mg/mL NaCl 및 75mg/mL 수크로스를 함유하는 20mM 인산 완충액(pH 6.5)으로 평형화해 둔 사이즈 배제 컬럼인 Superdex 200 컬럼(컬럼 체적: 약 38.5L, 베드 높이: 40cm, GE Healthcare사)에 24cm/hr 이하의 유속으로 부하하고, 추가로, 동 완충액을 동일 유속으로 공급했다. 이 때, 사이즈 배제 컬럼으로부터의 용출액의 유로에, 용출액의 흡광도를 연속적으로 측정하기 위한 흡광 광도계를 배치하여, 280nm의 흡광도를 모니터하고, 280nm에서 흡수 피크를 나타낸 획분을, I2S-항hTfR 항체 3을 포함하는 획분으로서 회수했다. 회수한 용액을, 플라노바 20N(사이즈: 0.3m2, 아사히화성메디컬사) 및 Millipak-100 Filter Unit(공경: 0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 여과 후의 용액을, I2S-항hTfR 항체 정제품으로 했다.
〔실시예 13〕 정제 각 스텝(별법)에 있어서의 I2S-항hTfR 항체의 회수율의 측정
정제 각 스텝(별법)에 있어서의 I2S-항hTfR 항체 3의 부하량 및 용출액 중에 회수된 양을 실시예 2에 기재된 ELISA법 또는 흡광도 측정에 의해 측정했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 당초, 배양 상청 중에 포함된 96.8g의 I2S-항hTfR 항체 3의 약 82%에 상당하는, 68.8g의 I2S-항hTfR 항체 3이, 정제품으로서 회수되었다. 이들 결과는, 상기 실시예 12에 기재된 정제법(별법)이, I2S-항hTfR 항체의 정제 방법으로서 매우 효율이 높은 것임을 나타내는 것이다. 한편, 표 3에 있어서의 공정 회수율(%) 및 총 회수율(%)의 의미는, 표 1에서 이용한 것과 동일하다.
Figure 112019028328568-pct00002
〔실시예 14〕 별법에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석(HCP의 정량)
실시예 12에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품에 대해, 실시예 8에 기재된 방법에 의해 HCP의 정량을 행했다. 그 결과, I2S-항hTfR 항체 정제품에 포함되는 HCP의 양은, 약 20ppm(즉, 1mg의 I2S-항hTfR 항체 정제품 중에 약 20ng의 HCP)임을 알 수 있었다.
〔실시예 13〕 별법에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석(SE-HPLC 분석)
실시예 12에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품에 대해, 실시예 9에 기재된 방법에 의해 SE-HPLC 분석을 행했다. 그 분석 결과를 도 2에 나타낸다. 얻어진 프로파일은, 거의 I2S-항hTfR 항체 3에서 유래하는 단일한 피크만을 나타냈다. 단, 주 피크(도면 중 피크 A)보다도 전에 검출되는 I2S-항hTfR 항체 3의 중합체에서 유래하는 피크(도면 중 피크 B)가 확인되었다. 피크 전체의 면적과 피크 B의 면적의 비율로부터, I2S-항hTfR 항체 3 전체에서 차지하는 중합체의 비율은, 약 0.37%로 계산되었다.
〔실시예 10〕 별법에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석(정리)
이상의 I2S-항hTfR 항체 정제품의 분석 결과는, 실시예 12에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품이, HCP를 포함하는 협잡물을 거의 포함하지 않는 것임, 및 중합체의 존재 비율이 극히 낮음을 나타내는 것이다. 즉, 별법에서 얻어진 I2S-항hTfR 항체 정제품은, 의약, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 동맥내, 또는 병소내 투여제로서 그대로 사용할 수 있는 품질의 것이라고 말할 수 있다.
본 발명에 의하면, 예를 들어, 의약으로서 그대로 이용할 수 있는 순도까지 정제된, 항체와 다른 단백질을 융합시킨 융합 단백질을 제공할 수 있다.
서열 번호 1: 링커의 아미노산 서열의 예 1
서열 번호 2: 링커의 아미노산 서열의 예 2
서열 번호 3: 링커의 아미노산 서열의 예 3
서열 번호 6: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 7: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 8: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 9: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 10: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 11: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 12: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 13: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 14: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 15: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 16: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 17: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 18: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 19: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 20: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 21: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 22: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 23: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 24: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 25: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 26: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 27: 프라이머 Hyg-Sfi5', 합성 서열
서열 번호 28: 프라이머 Hyg-BstX3', 합성 서열
SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Method for Production of Antigen Fusion Proteins <130> 1211JP <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 1 <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 2 <400> 2 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 3 <400> 3 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu 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7 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.1 <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 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of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 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heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 and hI2S <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Gly Ser Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val 450 455 460 Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly 465 470 475 480 Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser 485 490 495 Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser 500 505 510 Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr 515 520 525 Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile 530 535 540 Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys 545 550 555 560 Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr 565 570 575 Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn 580 585 590 Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu 595 600 605 Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro 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Val Glu Leu Val Ser Leu Phe 820 825 830 Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro 835 840 845 Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu 850 855 860 Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly 865 870 875 880 Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp 885 890 895 Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile 900 905 910 Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val 915 920 925 Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala 930 935 940 Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met 945 950 955 960 Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 965 970 975 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.1 <400> 15 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.1 <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.2 <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.2 <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 115 120 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding amino acid sequence of the light-chain of humanized anti-hTfR antibody No.1, synthetic sequence <400> 21 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcca ggtcacacag tcaccaagtt ttctgagcgc aagcgtgggc 120 gacagggtca ctatcacatg caaggcaagc caggacgtga actccgcagt ggcctggttc 180 cagcagaagc cagggaaagc acccaagctg ctgatctatt ggacctctac aaggcacacc 240 ggtgtcccag atcggttctc aggttccggc agcggaacag tgtatactct gaccatttcc 300 agcctgcagc ctgaagactt cgctacttac tattgccagc agcattactc caccccaaga 360 acatttggcg gagggactaa agtggagatc aagaggaccg tggccgctcc ctccgtcttc 420 atttttcccc ctagcgacga acagctgaag agtggcacag cctcagtggt ctgtctgctg 480 aacaatttct accctaggga ggctaaagtg cagtggaagg tcgataacgc actgcagtct 540 ggaaatagtc aggagtcagt gacagaacag gactccaaag atagcactta ttctctgtct 600 agtacactga ctctgagcaa ggccgattac gaaaagcaca aagtgtatgc ttgcgaagtc 660 acccatcagg ggctgtcatc accagtcacc aagtcattca atagaggcga gtgctaagcg 720 gccgc 725 <210> 22 <211> 725 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding amino acid sequence of the light-chain of humanized anti-hTfR antibody No.2, synthetic sequence <400> 22 Ala Cys Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala 1 5 10 15 Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr 20 25 30 Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly 35 40 45 Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly 50 55 60 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Thr 65 70 75 80 Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Cys 85 90 95 Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr 115 120 125 Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala 130 135 140 Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Ala 145 150 155 160 Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly 165 170 175 Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala 180 185 190 Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys 195 200 205 Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Cys 210 215 220 Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala 225 230 235 240 Gly Gly Cys Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Ala Gly Gly Thr 245 250 255 Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys 260 265 270 Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr 275 280 285 Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Cys 290 295 300 Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys 305 310 315 320 Cys Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys 325 330 335 Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Thr Cys Ala Thr 340 345 350 Gly Gly Cys Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly 355 360 365 Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly 370 375 380 Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly 385 390 395 400 Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Thr Gly Thr 405 410 415 Cys Thr Thr Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr 420 425 430 Thr Cys Ala Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala 435 440 445 Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys 450 455 460 Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly 465 470 475 480 Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Ala Cys 485 490 495 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala 500 505 510 Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys 515 520 525 Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala 530 535 540 Ala Thr Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Thr 545 550 555 560 Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Thr 565 570 575 Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr 580 585 590 Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr 595 600 605 Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys 610 615 620 Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala 625 630 635 640 Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr Thr Gly Cys Gly Ala 645 650 655 Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly 660 665 670 Cys Thr Gly Thr Cys Thr Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala 675 680 685 Cys Thr Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Gly 690 695 700 Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Gly Cys Gly 705 710 715 720 Gly Cys Cys Gly Cys 725 <210> 23 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding amino acid sequence of the light-chain of humanized anti-hTfR antibody No.3, synthetic sequence <400> 23 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120 cagcctgcca gcatcagctg cagaagctct cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 24 <211> 3002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding amino acid sequence of fusion protein of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.1 and hI2S, synthetic sequence <400> 24 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaagtgca gctggtcgaa tcaggggggg ggctggtgca gcctggaggc 120 agcctgagac tgtcctgcgc cgcttctggc ttgaccttta gcaactacgg gatgtcctgg 180 gtgcggcagg ctcctggcaa gggactggag ttggtggcca acatcaatac caacggcgga 240 agtacatact atcccgattc agtgaagggc cggttcacca tcagcaggga caacgccaag 300 aacagcctgt atctgcagat gaactctctg agggccgagg atacagccgt gtactattgc 360 actaacaacc ggtacgacga ggactattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtctagc 420 gcctctacca agggcccaag cgtgtttcct ctggctccat cctctaaatc cacctctggc 480 ggcacagccg ctctgggctg tctggtgaag gattacttcc cagagcccgt gacagtgtct 540 tggaacagcg gcgccctgac ctccggcgtg cacacatttc ctgctgtgct gcagagctcc 600 ggcctgtaca gcctgtctag cgtggtgacc gtgccatcct ctagcctggg cacccagaca 660 tatatctgca acgtgaatca caagcccagc aatacaaagg tggataagaa ggtggagcca 720 aagtcctgtg acaagaccca cacatgcccc ccttgtcctg ctccagagct gctgggagga 780 ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagccc aaggataccc tgatgatctc tcggacccca 840 gaggtgacat gcgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 900 tatgtggacg gcgtggaggt gcacaatgct aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 960 tccacctata gagtggtgtc tgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 1020 gagtataagt gcaaggtgtc caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctct 1080 aaggccaagg gccagcccag agagcctcag gtgtacacac tgcctccatc ccgggatgag 1140 ctgaccaaga accaggtgtc tctgacatgt ctggtcaagg gcttctatcc ctctgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tggccagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1260 ctggattccg acggctcttt ctttctgtat agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1320 cagcagggca acgtgttcag ctgttccgtg atgcacgaag ctctgcataa tcactatact 1380 cagaaatccc tgtcactgtc acctggtaaa ggatcttccg aaacgcaggc caactcgacc 1440 acagatgctc tgaacgttct tctcatcatc gtggatgacc tgcgcccctc cctgggctgt 1500 tatggggata agctggtgag gtccccaaat attgaccaac tggcatccca cagcctcctc 1560 ttccagaatg cctttgcgca gcaagcagtg tgcgccccga gccgcgtttc tttcctcact 1620 ggcaggagac ctgacaccac ccgcctgtac gacttcaact cctactggag ggtgcacgct 1680 ggaaacttct ccaccatccc ccagtacttc aaggagaatg gctatgtgac catgtcggtg 1740 ggaaaagtct ttcaccctgg gatatcttct aaccataccg atgattctcc gtatagctgg 1800 tcttttccac cttatcatcc ttcctctgag aagtatgaaa acactaagac atgtcgaggg 1860 ccagatggag aactccatgc caacctgctt tgccctgtgg atgtgctgga tgttcccgag 1920 ggcaccttgc ctgacaaaca gagcactgag caagccatac agttgttgga aaagatgaaa 1980 acgtcagcca gtcctttctt cctggccgtt gggtatcata agccacacat ccccttcaga 2040 taccccaagg aatttcagaa gttgtatccc ttggagaaca tcaccctggc ccccgatccc 2100 gaggtccctg atggcctacc ccctgtggcc tacaacccct ggatggacat caggcaacgg 2160 gaagacgtcc aagccttaaa catcagtgtg ccgtatggtc caattcctgt ggactttcag 2220 cggaaaatcc gccagagcta ctttgcctct gtgtcatatt tggatacaca ggtcggccgc 2280 ctcttgagtg ctttggacga tcttcagctg gccaacagca ccatcattgc atttacctcg 2340 gatcatgggt gggctctagg tgaacatgga gaatgggcca aatacagcaa ttttgatgtt 2400 gctacccatg ttcccctgat attctatgtt cctggaagga cggcttcact tccggaggca 2460 ggcgagaagc ttttccctta cctcgaccct tttgattccg cctcacagtt gatggagcca 2520 ggcaggcaat ccatggacct tgtggaactt gtgtctcttt ttcccacgct ggctggactt 2580 gcaggactgc aggttccacc tcgctgcccc gttccttcat ttcacgttga gctgtgcaga 2640 gaaggcaaga accttctgaa gcattttcga ttccgtgact tggaagaaga tccgtacctc 2700 cctggtaatc cccgtgaact gattgcctat agccagtatc cccggccttc agacatccct 2760 cagtggaatt ctgacaagcc gagtttaaaa gatataaaga tcatgggcta ttccatacgc 2820 accatagact ataggtatac tgtgtgggtt ggcttcaatc ctgatgaatt tctagctaac 2880 ttttctgaca tccatgcagg ggaactgtat tttgtggatt ctgacccatt gcaggatcac 2940 aatatgtata atgattccca aggtggagac cttttccagt tgttgatgcc ttaagcggcc 3000 gc 3002 <210> 25 <211> 3023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding amino acid sequence of fusion protein of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.2 and hI2S, synthetic sequence <400> 25 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gccaggtgca gctggtccag tcaggagccg aagtgaaaaa gcccggagcc 120 tcagtcaaag tgtcttgtaa agcatcaggt tatacattta cagactacgt catgcactgg 180 gtgaggcagg cacctggaca gggtctggaa tggatcggcg tgatctccac ttactatggc 240 catggaagct acaaccagag attcaagggc agggcgacaa tgactgtaga caaatcaatt 300 tccactgctt atatggagct ggtaaggctg cggtccgacg ataccgctgt gtactattgc 360 gtacgaggag gatacggctc cagctctctg gctggtaatt tcgatgtgtg ggggcagggt 420 accacagtca ccgtgagttc agcaagcaca aagggcccat ctgtgtttcc actggccccc 480 tccagcaaaa gcacctctgg gggtacagcc gctctgggat gtctggtgaa ggattatttc 540 ccagagccag tcaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga catctggagt ccacactttt 600 ccagctgtgc tgcagtctag tgggctgtac tccctgtcat ccgtggtcac tgtccccagc 660 tctagtctgg gtacccagac atatatctgc aacgtgaatc acaagccatc taataccaaa 720 gtcgacaaga aagtggaacc caagtcctgt gataaaactc atacctgccc cccttgtcct 780 gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaagacacc 840 ctgatgatta gccgaactcc cgaagtcacc tgcgtggtcg tggacgtgtc tcacgaggac 900 cctgaagtca agtttaactg gtacgtggat ggcgtcgagg tgcataatgc taagacaaaa 960 ccccgagagg aacagtacaa cagtacatat cgtgtcgtgt cagtgctgac cgtcctgcat 1020 caggactggc tgaacgggaa ggaatataag tgcaaagtgt ccaataaggc actgcccgcc 1080 cctatcgaga aaaccattag caaggccaaa ggacagccta gggaaccaca ggtgtacaca 1140 ctgcctccat cccgggacga gctgactaag aaccaggtca gcctgacctg tctggtgaaa 1200 ggcttctatc cttcagatat cgctgtggag tgggaaagta atggacagcc agagaacaat 1260 tacaagacta ccccccctgt gctggactct gatgggagtt tctttctgta ttctaagctg 1320 accgtggata aaagtcggtg gcagcagggt aatgtcttta gttgttcagt gatgcacgaa 1380 gcactgcaca accactacac ccagaaatca ctgtcactgt caccagggaa aggatcttcc 1440 gaaacgcagg ccaactcgac cacagatgct ctgaacgttc ttctcatcat cgtggatgac 1500 ctgcgcccct ccctgggctg ttatggggat aagctggtga ggtccccaaa tattgaccaa 1560 ctggcatccc acagcctcct cttccagaat gcctttgcgc agcaagcagt gtgcgccccg 1620 agccgcgttt ctttcctcac tggcaggaga cctgacacca cccgcctgta cgacttcaac 1680 tcctactgga gggtgcacgc tggaaacttc tccaccatcc cccagtactt caaggagaat 1740 ggctatgtga ccatgtcggt gggaaaagtc tttcaccctg ggatatcttc taaccatacc 1800 gatgattctc cgtatagctg gtcttttcca ccttatcatc cttcctctga gaagtatgaa 1860 aacactaaga catgtcgagg gccagatgga gaactccatg ccaacctgct ttgccctgtg 1920 gatgtgctgg atgttcccga gggcaccttg cctgacaaac agagcactga gcaagccata 1980 cagttgttgg aaaagatgaa aacgtcagcc agtcctttct tcctggccgt tgggtatcat 2040 aagccacaca tccccttcag ataccccaag gaatttcaga agttgtatcc cttggagaac 2100 atcaccctgg cccccgatcc cgaggtccct gatggcctac cccctgtggc ctacaacccc 2160 tggatggaca tcaggcaacg ggaagacgtc caagccttaa acatcagtgt gccgtatggt 2220 ccaattcctg tggactttca gcggaaaatc cgccagagct actttgcctc tgtgtcatat 2280 ttggatacac aggtcggccg cctcttgagt gctttggacg atcttcagct ggccaacagc 2340 accatcattg catttacctc ggatcatggg tgggctctag gtgaacatgg agaatgggcc 2400 aaatacagca attttgatgt tgctacccat gttcccctga tattctatgt tcctggaagg 2460 acggcttcac ttccggaggc aggcgagaag cttttccctt acctcgaccc ttttgattcc 2520 gcctcacagt tgatggagcc aggcaggcaa tccatggacc ttgtggaact tgtgtctctt 2580 tttcccacgc tggctggact tgcaggactg caggttccac ctcgctgccc cgttccttca 2640 tttcacgttg agctgtgcag agaaggcaag aaccttctga agcattttcg attccgtgac 2700 ttggaagaag atccgtacct ccctggtaat ccccgtgaac tgattgccta tagccagtat 2760 ccccggcctt cagacatccc tcagtggaat tctgacaagc cgagtttaaa agatataaag 2820 atcatgggct attccatacg caccatagac tataggtata ctgtgtgggt tggcttcaat 2880 cctgatgaat ttctagctaa cttttctgac atccatgcag gggaactgta ttttgtggat 2940 tctgacccat tgcaggatca caatatgtat aatgattccc aaggtggaga ccttttccag 3000 ttgttgatgc cttaagcggc cgc 3023 <210> 26 <211> 3011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding amino acid sequence of fusion protein of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 and hI2S, synthetic sequence <400> 26 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat cttccgaaac gcaggccaac 1440 tcgaccacag atgctctgaa cgttcttctc atcatcgtgg atgacctgcg cccctccctg 1500 ggctgttatg gggataagct ggtgaggtcc ccaaatattg accaactggc atcccacagc 1560 ctcctcttcc agaatgcctt tgcgcagcaa gcagtgtgcg ccccgagccg cgtttctttc 1620 ctcactggca ggagacctga caccacccgc ctgtacgact tcaactccta ctggagggtg 1680 cacgctggaa acttctccac catcccccag tacttcaagg agaatggcta tgtgaccatg 1740 tcggtgggaa aagtctttca ccctgggata tcttctaacc ataccgatga ttctccgtat 1800 agctggtctt ttccacctta tcatccttcc tctgagaagt atgaaaacac taagacatgt 1860 cgagggccag atggagaact ccatgccaac ctgctttgcc ctgtggatgt gctggatgtt 1920 cccgagggca ccttgcctga caaacagagc actgagcaag ccatacagtt gttggaaaag 1980 atgaaaacgt cagccagtcc tttcttcctg gccgttgggt atcataagcc acacatcccc 2040 ttcagatacc ccaaggaatt tcagaagttg tatcccttgg agaacatcac cctggccccc 2100 gatcccgagg tccctgatgg cctaccccct gtggcctaca acccctggat ggacatcagg 2160 caacgggaag acgtccaagc cttaaacatc agtgtgccgt atggtccaat tcctgtggac 2220 tttcagcgga aaatccgcca gagctacttt gcctctgtgt catatttgga tacacaggtc 2280 ggccgcctct tgagtgcttt ggacgatctt cagctggcca acagcaccat cattgcattt 2340 acctcggatc atgggtgggc tctaggtgaa catggagaat gggccaaata cagcaatttt 2400 gatgttgcta cccatgttcc cctgatattc tatgttcctg gaaggacggc ttcacttccg 2460 gaggcaggcg agaagctttt cccttacctc gacccttttg attccgcctc acagttgatg 2520 gagccaggca ggcaatccat ggaccttgtg gaacttgtgt ctctttttcc cacgctggct 2580 ggacttgcag gactgcaggt tccacctcgc tgccccgttc cttcatttca cgttgagctg 2640 tgcagagaag gcaagaacct tctgaagcat tttcgattcc gtgacttgga agaagatccg 2700 tacctccctg gtaatccccg tgaactgatt gcctatagcc agtatccccg gccttcagac 2760 atccctcagt ggaattctga caagccgagt ttaaaagata taaagatcat gggctattcc 2820 atacgcacca tagactatag gtatactgtg tgggttggct tcaatcctga tgaatttcta 2880 gctaactttt ctgacatcca tgcaggggaa ctgtattttg tggattctga cccattgcag 2940 gatcacaata tgtataatga ttcccaaggt ggagaccttt tccagttgtt gatgccttaa 3000 taagcggccg c 3011 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-Sfi5', synthetic sequence <400> 27 gaggccgcct cggcctctga 20 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-BstX3', synthetic sequence <400> 28 aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29

Claims (33)

  1. 항체와 인간 리소좀 효소를 융합시킨 융합 단백질의 제조 방법으로서,
    (a) 해당 융합 단백질을 산생하는 포유동물 세포를 무혈청 배지 중에서 배양하여 해당 융합 단백질을 배양액 중에 분비시키는 스텝과,
    (b) 해당 배양액으로부터 해당 포유동물 세포를 제거하는 것에 의해 배양 상청을 회수하는 스텝과,
    (c) 해당 배양 상청으로부터, 해당 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피를 이용하여, 해당 융합 단백질을 정제하는 스텝
    을 포함하여 이루어지는 것인, 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    해당 스텝(c)에 있어서, 해당 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질을 결합시킨 재료를 고상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 인산기에 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 이용한 컬럼 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피를, 이 순서로 이용하여 이루어지는 것인, 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 융합 단백질에 친화성을 갖는 물질이, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 A/G, 해당 항체의 항원, 해당 항체를 항원으로서 인식하는 항체, 및 해당 리소좀 효소의 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    인산기에 친화성을 갖는 해당 재료가, 플루오로아파타이트 또는 하이드록시아파타이트의 어느 하나인, 제조 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    인산기에 친화성을 갖는 해당 재료가, 하이드록시아파타이트인, 제조 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 인간 리소좀 효소와 융합시킨 해당 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 제조 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 인간 리소좀 효소와 융합시킨 해당 항체가, 인간화 항체인, 제조 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 인간 리소좀 효소와 융합시킨 해당 항체가, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자를 항원으로 하는 것인, 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 해당 분자가, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8, 모노카복실산 트랜스포터, 및 Fc 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    해당 혈관 내피 세포가 뇌혈관 내피 세포인, 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    해당 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자가, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8, 및 모노카복실산 트랜스포터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    해당 혈관 내피 세포가, 인간의 혈관 내피 세포인, 제조 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 항체가, 항인간 트랜스페린 수용체 항체인, 제조 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 융합 단백질이, 해당 항체와 해당 인간 리소좀 효소를, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 하이알루론산, 비오틴-스트렙트아비딘, 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커를 개재하여 결합시킨 것인, 제조 방법.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 융합 단백질이, 해당 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 펩타이드 결합에 의해 직접 또는 링커 서열을 개재하여, 해당 인간 리소좀 효소를 결합시킨 것인, 제조 방법.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 융합 단백질이, 해당 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 펩타이드 결합에 의해 직접 또는 링커 서열을 개재하여, 해당 인간 리소좀 효소를 결합시킨 것인, 제조 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    해당 링커 서열이, 1∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    해당 링커 서열이, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열(Gly-Ser), 아미노산 서열(Gly-Gly-Ser), 서열 번호 1의 아미노산 서열, 서열 번호 2의 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 제조 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    해당 링커 서열이, 아미노산 서열(Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 제조 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제(인간 I2S)인, 제조 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 제조 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 제조 방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 제조 방법.
  24. 제 20 항에 있어서,
    해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 제조 방법.
  25. 제 20 항에 있어서,
    해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열에 1∼5개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 제조 방법.
  26. 제 20 항에 있어서,
    해당 인간 I2S가, 서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 I2S로서의 활성을 갖는 것인, 제조 방법.
  27. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법:
    (a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것;
    (b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것; 및
    (c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것.
  28. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법:
    (a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것;
    (b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것; 및
    (c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것.
  29. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법:
    (a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것;
    (b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것; 및
    (c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것.
  30. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법:
    (a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것;
    (b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것; 및
    (c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열에 1∼10개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것.
  31. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이며, 해당 인간화 항hTfR 항체가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법:
    (a) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것;
    (b) 경쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것; 및
    (c) 경쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖고, 중쇄가 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열에 1∼3개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킨 아미노산 서열을 갖는 것.
  32. ◈청구항 32은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제 20 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제이며, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법:
    (a) 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 1로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는 융합 단백질;
    (b) 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 1로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는 융합 단백질; 및
    (c) 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 서열 번호 1로 나타나는 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열(Gly-Ser)을 개재하여 결합한 것으로 이루어지는 융합 단백질.
  33. 제 20 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제(인간 I2S)이며, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법:
    (a) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질;
    (b) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질; 및
    (c) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합 단백질.
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