KR102251193B1 - 과산화칼슘을 이용한 카테콜아민 코팅 방법 및 이를 이용한 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법 - Google Patents

Abstract

과산화칼슘을 이용한 카테콜아민 코팅 방법 및 이를 이용한 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 과산화칼슘(CaO₂)이 첨가된 카테콜아민 용액에 코팅하고자 하는 기재를 침지시키는 단계를 포함하는 카테콜아민 코팅 방법 및 상기 방법에 의하여 카테콜아민이 코팅된 기재를 아민-반응성 PEG(mPEG) 용액에 침지시키는 단계를 포함하는 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 산소 공급 시약으로서 과산화칼슘을 이용한 생체 적합 물질의 표면 개질 기술을 개발하였다. 상기 과산화칼슘을 통한 산소 공급은 DA(dopamine hydrochloride) 산화를 촉진하여 신속하게 아민이 풍부한 기질을 생성하였으며, 간단한 침지 공정으로 저-결합 배양 플레이트를 제조할 수 있었으며, 상기 저-결합 배양 플레이트에서 배양된 세포는 다른 배양 플레이트에 비하여 보다 크고 컴팩트한 세포 스페로이드를 형성하였다.

Description

과산화칼슘을 이용한 카테콜아민 코팅 방법 및 이를 이용한 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법{METHOD FOR COATING CATECHOLAMINE USING CALCIUM PEROXIDE AND METHOD FOR MANUFACTURING THE LOWBINDING CULTURE PLATE USING THE SAME}

과산화칼슘을 이용한 카테콜아민 코팅 방법 및 이를 이용한 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 과산화칼슘(CaO₂)이 첨가된 카테콜아민 용액에 코팅하고자 하는 기재를 침지시키는 단계를 포함하는 카테콜아민 코팅 방법 및 상기 방법에 의하여 카테콜아민이 코팅된 기재를 아민-반응성 PEG(mPEG) 용액에 침지시키는 단계를 포함하는 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법에 관한 것이다.

생체 재료의 표면 개질은 기질과 살아있는 세포 또는 조직 사이의 상호 작용을 조절하는 데 중요하다. 표면 구조, 조성, 형태, 거칠기 및 기능적 부분과 같은 표면 물리/화학적 특성을 조절하기 표면 개질 기술은 물질의 표면 활성을 생체 활성 또는 생체 독성으로 제어하는데 매우 중요하다. 지금까지 생체 재료나 생체 고분자의 표면 특성을 조절하기 위해 물리적 흡착 및 화학적 결합과 같은 다양한 표면 개질 기술이 개발되었다. 수많은 전략이 활용되었지만, 다양한 기질에 대한 코팅 효능을 향상시키기 위해 진보된 표면 변형 도구를 개발하는 것은 여전히 해결 되어야할 과제로 남아있다.

최근 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, DOPA)과 그 유도체를 이용한 생체 재료 표면의 화학적 변형은 간단한 코팅 절차, 다양한 생체 재료 기질에 대한 강한 접착력 및 표면에 공유 결합을 통한 장기 안정성으로 인해 광범위하게 연구되었다. 많은 연구자들이 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-변형된 표면(표면 PEGylation), 양성 이온 고정화 및 생체 활성 분자(예를 들어 세포 접착 리간드 및 헤파린)의 접합을 통해 이러한 접착제 분자를 생체 활성 또는 불활성 표면을 제조하는데 성공적으로 활용해왔다. 생물 유래 카테콜 분자를 이용한 표면 개질 방법은 생체 재료의 기능성 표면을 만드는데 널리 이용되어 왔지만, 이들은 카테콜 분자의 산화 과정 동안 산소가 부족하기 때문에 긴 반응 시간과 같은 한계를 나타낸다. 카테콜 분자는 산화 카테콜과 표면 사이의 배위 결합을 통해 기질 상에 고정될 수 있음이 증명되었다. 반응 동안, 카테콜 분자는 산소를 소모하여 퀴논을 형성한다. 따라서 본 발명자는 카테콜 분자의 코팅 효능을 향상시키기 위해 접합 반응(conjugative reaction) 동안에 산소 공급이 카테콜 분자의 산화 속도를 증가시킬 수 있다고 가정했다.

대한민국 등록특허 제10-1340022호

본 발명자는 과산화칼슘(Calcium peroxide, CP) 매개 산소 생성을 통한 쉬운 표면 개질 방법을 보고한다. 본 발명자는 CP-매개 산소 공급이 카테콜 분자의 산화 속도를 증가시켜서 카테콜아민이 코팅된 기질을 빠르게 생성한다는 것을 증명한다. 고급 도구(advanced tool)를 활용하여 본 발명자는 3차원 세포 구상체(cell spheroid) 형성을 위한 간단한 침지 절차에 의해 저-결합 배양 플레이트를 형성하도록 페길화된(PEGylated) 세포 배양 플레이트를 제조한다. 본 발명의 CP-매개 표면 기능화 도구는 광범위한 생물 의학 응용 분야를 위한 훌륭한 도구일 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하고자, 본 발명은 과산화칼슘(CP)이 첨가된 카테콜아민 용액에 코팅하고자 하는 기재를 침지시키는 단계를 포함하는 카테콜아민 코팅 방법을 제공한다. 상기 카테콜아민은 신경세포에서 분비되어 신경전달물질로 작용하는 생리활성 물질로 카테콜(catechol)에서 유래된 모노아민 계열 신경전달물질 또는 호르몬을 총칭해서 일컫는 말이다. 생체내 카테콜아민에는 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine)이 있다.

상기 과산화칼슘은 카테콜아민 용액 대비 0.25 내지 1 wt%이며, 침지 시간은 10 내지 30분인 것을 특징으로 한다. 상기 과산화칼슘의 양 및 침지 시간이 증가할수록 카테콜아민의 코팅량이 증가하며, 가장 바람직한 과산화칼슘의 양은 0.5 내지 0.75 wt%이다. 특히, 높은 과산화칼슘 농도(1 wt%)는 코팅시 표면의 분자 산화와 용액의 분자 산화 사이의 경쟁적인 반응으로 인해 낮은 카테콜아민 밀도를 유도하였다.

상기 기재는 폴리머 기재이며, ABS(아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌), COC/COP(시클로올레핀 공중합체 및 중합체), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌), PP(폴리프로필렌), PVC(폴리비닐클로라이드), PA(폴리아미드), PE(폴리에틸렌), PET(폴리에틸렌테레프탈레이트), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), POM(폴리옥시메틸렌), TPE(열가소성 엘라스토머), TPU(열가소성 폴리우레탄), PI(폴리이미드), PEEK(폴리에테르에테르케톤), PLA(폴리락트산), PMP(폴리메틸펜텐) 및 그의 유도체 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 용매는 Tris-HCl이며, pH가 7.5 내지 8.5, 바람직하게는 pH가 8이다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 방법에 의하여 카테콜아민이 코팅된 기재를 아민-반응성 PEG(mPEG) 용액에 침지시키는 단계를 포함하는 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법을 제공한다.

저-결합 세포 배양 플레이트는 초저속 결합 표면(Ultralow binding surface)을 갖는 플레이트로 줄기세포 또는 성체 세포, 배아체 및 종양구의 3D 스페로이드(spheroid) 형성을 가능하게 하는 고효율 약물 스크리닝 응용에 광범위하게 사용된다.

상기 아민-반응성 PEG(mPEG)는 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG 숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA), mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트(mPEG-SMB), mPEG-숙신이미딜 카르보네이트(mPEG-SC), mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 및 mPEG-p-니트로페닐 카르보네이트(mPEG-NPC) 중 어느 하나이며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 실시 예에서 상기 제조방법에 의하여 제조된 저-결합 세포 배양 플레이트를 제공하며, 상기 저-결합 세포 배양 플레이트를 이용하여 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 상기 저-결합 세포 배양 플레이트를 이용하여 배양된 세포는 세포는 3차원 세포 스페로이드를 형성한다.

본 발명에서는 산소 공급 시약으로서 과산화칼슘을 이용한 생체 적합 물질의 표면 개질 기술을 개발하였다. 상기 과산화칼슘을 통한 산소 공급은 DA(dopamine hydrochloride) 산화를 촉진하여 신속하게 아민이 풍부한 기질을 생성하였으며, 간단한 침지 공정으로 저-결합 배양 플레이트를 제조할 수 있었으며, 상기 저-결합 배양 플레이트에서 배양된 세포는 다른 배양 플레이트에 비하여 보다 크고 컴팩트한 세포 스페로이드를 형성하였다.

도 1은 (a) DA 및 (b) CP 농도에 따른 수성 매체에서의 DO 수준을 시간의 함수로 나타낸 그래프이다; (c)는 CP 농도에 따른 DA의 산화 동역학을 나타내는 그래프이고, (d)는 CP 농도에 따른 DA 용액의 이미지이다.
도 2는 서로 다른 CP 농도와 고정 시간을 갖는 DA-TCPS의 고정화된 DA의 양을 (a) SEM 분석 및 (b) BCA 분석을 사용하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 3은 다양한 양의 mPEG-NPC를 사용한 mPEG-TCPS의 형태 및 mPEG 밀도를 (a) SEM 분석 및 (b) BCA 분석을 사용하여 정량화한 결과이다.
도 4의 (a)는 mPEG-TCPS에서 배양한 HDF의 광학 현미경 및 DAPI 영상 이미지이고, (b)는 mPEG-TCPS에서 배양한 HDF의 분리 정량 결과를 나타낸 그래프이고, (c)는 mPEG 고정 U 바닥 플레이트에서 배양된 다양한 세포 유형 및 세포 농도(HDF 및 HT1080)의 세포 스페로이드의 광학 이미지이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

1. 실험방법

1) 재료

SPL Life Science(경기도 포천)에서 조직 배양 폴리스티렌(TCPS, 48 및 96-well plate)과 폴리스티렌(PS) 필름(두께 0.3mm)을 공급받았다. 과산화칼슘(CaO₂, CP), 폴리(에틸렌글리콜)메틸에테르(mPEG, 5.0K), 도파민 하이드로클로라이드(DA), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP), 4-니트로페닐 클로로포르메이트(NPC), 디클로로메탄(MC, 무수) 및 디메틸 술폭시드(DMSO, 무수)를 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 트리에틸아민(TEA)은 Kanto Chemical Co.(Chou-ku, Tokyo)로부터 공급되었다. 에틸에테르(Ethyl ether)는 Samchun Pure Chemical(서울 강남)에서 구입하였다. Dulbecco의 인산 완충 식염수(DPBS)는 Gibco(Grand Island, NY)에 의해 공급되었다. Tris-HCl(1M, pH 8.0)은 Invitrogen(Grand Island, NY)에서 구입하였다. 시험관 내 세포 배양을 위해 인간 피부 섬유아세포(HDF)를 Lonza(Walkersville, MD)에서 구입하고 인간 섬유 육종(HT1080) 세포를 한국 세포주 은행(종로, 서울)에서 공급받았다. Gibco(Grand Island, NY)에서 고-포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 신생 송아지 혈청(NBCS), 페니실린-스트렙토마이신 및 0.25% 트립신-EDTA를 얻었다.

2) 용존 산소량(DO) 측정

용존 산소(DO) 수치는 비침습적 산소 센서(PreSens, Regensburg, Germany)를 사용하여 측정하였다. 수성 매질에서 DO 수준을 모니터링하기 위해, 진공 그리스(grease)를 사용하여 비침투성 패치를 10 mL 바이얼의 하단에 부착했다. 다양한 CP 농도(Tris-HCl pH 8.0에서 0-0.1 wt%)를 갖는 DH 용액(4 mL)을 패치의 상부에 첨가하고 DO 수준을 최대 4시간 동안 모니터링 하였다. 각 지점 간의 시간 간격은 1분이었다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다.

3) CP 농도에 따른 도파민 산화 측정

DA의 o-quinone로의 분자 전환을 결정하기 위해 본 발명자는 자외선-가시광선(UV/Vis) 분광법을 사용하여 CP 매개 산화 반응을 통해 DA의 산화 속도를 측정했다. UV/Vis 측정을 위해 CP 용액(최종 농도, Tris-HCl pH 8.0에서 0-1.0 wt%)을 함유한 100 μL의 DA 용액(최종 농도, 2 mg/mL를 Tris-HCl pH 8.0으로 용해)을 96-웰 플레이트의 웰에서 제조하였다. 분자 전환은 UV/Vis 분광기를 사용하여 파장 390nm에서 30분 동안 5분 간격으로 모니터링 하였다.

4) CP-매개 산화 반응을 통한 DA-고정화 TCPS(DA-TCPS)의 제조

DA를 TCPS에 고정시키기 위해 펀치(직경 7mm)를 사용하여 PS 기판을 준비하고 커버 필름을 박리하였다. 박리 후, 상기 기판을 상이한 농도의 CP(Tris-HCl 8.0에서 0-1 wt%)를 포함한 DA 용액(2mg/mL)에 혼합하였다. 고정화 반응은 30분간 수행하였다. 기능화된 기질을 DPBS로 세척하고 사용하기 전에 25℃의 데시케이터에 보관하였다. 샘플 코드와 자세한 코팅 절차는 표 1에 나와 있다.

[표 1]

5) DA-TCPS의 표면 특성

DA-TCPS의 표면 형태를 관찰하기 위해 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM; JSM 7800F, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하였다. FE-SEM 분석을 위해, 건조된 DA-TCPS 샘플을 금으로 스퍼터-코팅하고 표면 형태를 관찰하였다. DA의 표면 밀도를 결정하기 위해 제조업체의 지침에 따라 마이크로 bicinchoninic acid assay(BCA) 분석을 수행했다. 간단히 말하면, 48-well plate의 well에서 DA-TCPS를 300 μL의 BCA 시약(시약 A:B = 50:1의 비율)과 반응시켰다. 30분 후 반응 액 100 μL를 96-well plate에 넣고 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. DA 농도의 정량적인 값은 표준 곡선의 방정식을 사용하여 결정하였고, TCPS상의 DA 밀도는 DA 농도를 기판의 총 표면적으로 나누어 계산하였다.

6) 저 결합 세포 배양 플레이트의 제조

저-결합 세포 배양 플레이트를 제조하기 위해 이전의 보고에 따라 아민 반응성 mPEG(mPEG-NPC)를 합성했다. 간단히, mPEG 5.0K(2.0 g, 0.4 mmol)를 질소(N₂) 분위기 하에서 25℃에서 MC(40 mL)에 용해시켰다. mPEG 용액을 디클로로메탄에 용해된 DMAP(97.74 g, 0.8 mmol) 및 TEA(80.95 g, 0.8 mmol)의 용액과 혼합하였다. 혼합물을 15분 동안 교반하였다. mPEG에서 말단 히드록실기를 활성화시킨 후, MC(30 mL)에 용해된 NPC 용액(161.25 mg, 0.8 mmol)을 활성화된 mPEG 용액에 서서히 적가하였다. 상기 접합 반응은 N₂ 대기하에 4℃에서 24시간 동안 수행되었다(몰비= mPEG:DMAP:TEA:NPC=1:2:2:2). 기능화된 용액을 회전 증발기(Rotavapor R-215, BUCHI, Seoul, Korea)를 사용하여 40℃에서 증발시켰다. 농축 중합체 용액을 냉 에틸 에테르 중에 침전시키고 이를 여과하고 진공하에 건조시켜 mPEG-NPC의 중합체 분말을 수득하였다. 중합체는 사용 전에 데시케이터에 보관하였다.

mPEG-접합 TCPS(mPEG-TCPS) 표면을 제조하기 위해, mPEG-NPC 용액(무수 DMSO 중 0-200 mg/mL)에 DA-TCPS 기판을 병합시키고, 25℃에서 60분 동안 접합 반응을 수행하였다. PEGylated 기질은 탈이온수를 사용하여 세척하고 사용하기 전에 25℃의 데시케이터에 보관했다. 샘플 코드와 자세한 코팅 절차는 [표 1]에 나와 있다.

7) 기능화된 기판 상의 형태 및 mPEG 밀도

FE-SEM(JSM 7800F, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 mPEG-TCPS의 표면 형태를 특성화하였다. FE-SEM 분석을 위해, 건조된 mPEG-TCPS 샘플을 금으로 스퍼터-코팅하고 표면 형태를 관찰하였다. mPEG의 표면 밀도는 전술한 마이크로 BCA 분석에 의해 분석되었다. DA-TCPS에서 mPEG 밀도는 DA-TCPS에서 mPEG-TCPS로 감산(subtraction)하여 계산하였다.

8) 시험관 내 세포 배양

시험관 내 세포 연구를 위해, 기능화된 기판을 깨끗한 벤치에서 15분 동안 UV 조사에 의해 멸균시켰다. 모든 용액은 멸균 DPBS를 사용하여 준비하고 주사기 필터(기공 크기 0.2 μm)를 사용하여 필터링했다. 세포를 37℃ 5% CO₂에서 배양하고 배지를 2일마다 교체하였다. 세포가 80-90 %의 컨플루언시(confluency)에 도달했을 때, 그들은 0.25% trypsin-EDTA로 옮겨지고 재보충되었다.

세포 부착 연구를 위해, 96-웰 플레이트(SPL Life Sciences, Korea)에서 HDF(5.0 Х 10³ 세포/웰)를 배양하고 mPEG(최종 농도, 무수 DMSO에 용해된 0-200 mg/mL)에 200 μL의 고-포도당 DMEM(10% NBCS, 1% P/S)로 고정하였다. 계대 배양 24시간 후, 배지를 교체하여 웰로부터 부착되지 않은 세포를 제거하고 Nikon Eclipse TS100 광학 현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 세포 형태를 관찰하였다. 정량 분석을 위해 DAPI 염색을 수행하여 핵을 개별적으로 시각화했다.

3차원 세포 spheroids을 만들기 위해, HDFs 및 HT1080 세포는 200 μL의 고-포도당 DMEM(10% NBCS, 1% P/S)을 갖는 U 바닥 플레이트(변형된 mPEG)상의 세포 농도(웰당 0.5-2.0 Х 10³ 세포)로 배양되었다. 배양 24시간 후, 세포 형태는 Nikon Eclipse TS100 광학 현미경(니콘, 일본)을 사용하여 관찰되었다.

2. 결과

1) 과산화칼슘(CP)-매개 산소 공급을 통한 촉진된 dopamine hydrochloride 산화

홍합에서 영감을 얻은 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride; DA)는 간단한 준비 절차와 다양한 생체 재료 표면에 대한 강한 접착력으로 인해 표면 코팅 또는 고정 재료로 널리 사용되었다. 도파민 하이드로클로라이드 분자의 이러한 고유한 특성과 함께, 그들은 다양한 종류의 생체 적합 물질 표면을 기능화하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 분자 메커니즘을 완전히 이해하지는 못했지만, 도파민 하이드로클로라이드가 산소 소모로 인해 o-퀴논(즉, 도파퀴논)으로 산화되어 PDA(polydopamine)가 형성되고, 이는 공유 결합을 통해 표면에 고정될 수 있음이 증명되었다. 따라서, 과산화칼슘-매개 산소 공급은 바이오 폴리머 기질상의 도파민 하이드로클로라이드의 코팅 효능(예를 들어, 코팅 절차 및 감소된 반응 시간)을 가능하게 할 수 있다고 가정했다(반응식 1).

[반응식 1]

먼저 다양한 농도의 도파민 하이드로클로라이드로 산소 소비 동력학을 검사했다. 도파민 하이드로클로라이드 용액에서 DO 수준을 결정하기 위해 이전에 보고한 바와 같이 비침습적 산소 센서를 사용하여 산소 장력(oxygen tension)을 모니터링했다. 본 발명자는 1시간 후에 도파민 하이드로클로라이드 용액의 DO 수준이 산소 분압(pO₂)의 10% 미만에 도달했으며, 도파민 하이드로클로라이드 농도가 높을수록 산소 소비가 빨라짐을 발견했다.

예를 들어, 도파민 하이드로클로라이드가 없는 경우(0 mg/mL) DO 수준은 측정 후 1시간 이후에 20-25% pO₂ 범위였지만, 용액(0.5, 1.0 및 2.0 mg/mL)의 산소 장력은 동일한 시점에서 더 낮은 값을 나타냈다(DA 0.5 mg/mL, 6.25% pO2; DA 1.0 mg/mL, 4.89% pO2; DA 2.0 mg/mL, 1.65% pO2)(도 1a). 이 결과는 도파민 하이드로클로라이드 용액이 폴리도파민(PDA) 형성 중에 산소를 소비함으로써 용액에서 심각한 산소 결핍을 유도함을 입증한다. 산소의 부족은 도파민 하이드로클로라이드의 느린 산화를 야기하며 이는 도파민 하이드로클로라이드 코팅 시스템의 한계일 수 있다(예를 들어, 긴 반응 시간 및 불충분한 DA 코팅 효능).

도파민 하이드로클로라이드 코팅 효능을 향상시키기 위해 본 발명자는 코팅 과정에 과산화칼슘-매개 산소 공급 시스템을 도입했다. 과산화칼슘은 수성(aqueous) 매질에서 산소와 과산화수소로 분해되는 유기 과산화물이며, 다양한 생물 의학 응용을 위한 산소 발생 물질로 널리 사용된다. 서로 다른 농도의 과산화칼슘(Tris-HCl pH8.0에서 0-1 wt%)을 포함하는 도파민 하이드로클로라이드로 용액의 DO 수준에 측정하기 위해 비침습적 산소 센서를 사용하여 용액의 산소 장력을 모니터링했다.

흥미롭게도, 본 발명자는 DO 용액에 과산화칼슘를 첨가함으로써 DO 수준이 유의하게 증가하고, 과산화칼슘 함량이 증가함에 따라 매체의 산소 장력이 높아짐을 발견했다(DO at 1 h: D2C0, 1.65% pO2; D2C0.25, 1.06% pO2; D2C0.5, 1.64% pO2; D2C0.75, 81.4% pO2; D2C1.0, 111.42% pO2). 이러한 결과는 과산화칼슘의 도입이 도파민 하이드로클로라이드 용액에서 DO 수준을 증가시키고, 산소 공급을 통한 향상된 코팅 효율을 위해 도파민 하이드로클로라이드 산화를 촉진할 수 있음을 시사한다.

본 발명자는 과산화칼슘-매개 산소 공급이 도파퀴논으로의 도파민 하이드로클로라이드 산화를 촉진시킬 수 있는지 추측했다. 도파민 하이드로클로라이드 산화 동역학에 과산화칼슘 농도의 영향을 평가하기 위해 UV/Vis 분광계를 사용하여 도파퀴논에 대한 도파민 하이드로클로라이드의 분자 전환을 측정했다. 산화된 도파퀴논을 검출하기 위해 390 nm 파장에서 도파민 하이드로클로라이드 용액의 흡광도를 측정했다.

도 1c에 도시된 바와 같이, 과산화칼슘 농도가 증가함에 따라 0.0012에서 0.0042(D2C0, 0.0012; D2C0.25, 0.0023; D2C0.5, 0.0023; D2C0.75, 0.0028; D2C1, 0.0042)로 흡광도의 기울기는 증가하였으며, 이는 도파민 하이드로클로라이드의 산화 동력학이 과산화칼슘-매개 산소 생성을 통해 산소를 공급함으로써 촉진되었다는 것을 증명한다. 또한, 본 발명자는 도파퀴논(갈색)에 대한 도파민 하이드로클로라이드(투명) 산화 정도를 나타내는 산화 중 용액의 색상 변화를 관찰했다(도 1d). 본 발명자는 UV/Vis 측정의 결과에서 비슷한 경향을 관찰했다.

본 발명자는 도파퀴논 분자로 도파민 하이드로클로라이드가 산화하는 동안 분자 산화를 필수 산화 기질로 공급하기 위해 산소 생성 물질로서 과산화칼슘을 이용했다. 본 발명자는 과산화칼슘-매개 산소 공급이 홍합에 영감을 받은 생체 분자의 코팅 효능을 향상시킬 수 있는 도파민 하이드로클로라이드의 산화 동력학을 촉진한다는 것을 입증했다.

2) 과산화칼슘-매개 산소 공급을 통한 도파민 하이드로클로라이드의 코팅 효능 향상.

본 발명자는 기판에서 도파민 하이드로클로라이드의 코팅 효능에 대한 산소 공급의 효과를 조사했다. PS(polystyrene) 표면에 도파민 하이드로클로라이드를 고정시키기 위해, 기질을 도파민 하이드로클로라이드 용액에 담그고, 이어서 상이한 농도의 과산화칼슘 현탁액(0-1 중량%)을 첨가하였다. 상기 산화 반응은 25℃에서 최대 30분 동안 수행되었다. 고정된 도파민 하이드로클로라이드를 BCA분석에 의해 정량화하였다. 과산화칼슘을 사용하여 산소를 공급함으로써 코팅 효능이 향상됨을 발견했다. 30분 이후에 2 mg/mL DA(D2C0)로 처리한 PS 표면의 도파민 하이드로클로라이드 밀도는 11.69 ± 0.89 nmol/cm²이었고, 2 mg/mL DA와 0.5 wt% CP(D2C0.5)처리한 표면의 도파민 하이드로클로라이드 밀도는 31.55 ± 2.63 nmol/cm²이었다(도 2a). 특히, 높은 과산화칼슘 농도(1 wt%)는 코팅시 표면의 분자 산화와 용액의 분자 산화 사이의 경쟁적인 반응으로 인해 낮은 도파민 하이드로클로라이드 밀도를 유도한다는 것을 발견했다. 이 결과를 바탕으로 향후 연구를 위해 과산화칼슘 농도를 최적화했다.

또한, 본 발명자는 반응 시간과 과산화칼슘 농도를 기반으로 PS 기판의 표면 형태를 관찰했다. BCA 분석의 결과와 유사하게, 0.5 wt% 과산화칼슘(D2C0.5)으로 처리된 기판은 더 많은 백색점을 나타내어, 대조군(D2C0 및 D2C1)과 비교하여 표면상에 PDA 형성을 나타내었다(도 2b). DA가 표면에 빠르게 코팅되면 백색점들이 형성된다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명자는 과산화칼슘-매개 산소 공급이 PDA를 형성하기 위해 도파민 하이드로클로라이드 산화를 촉진하고, PS 기판상에 DA의 코팅 효능을 개선함을 보여 주었다. 기판 상의 도파민 하이드로클로라이드 밀도는 11.69 ± 0.89에서 31.55 ± 2.63 nmol/cm² 범위의 과산화칼슘 농도를 변화시킴으로써 조절할 수 있다. 결과를 바탕으로 본 발명자는 추가 시험관 내 연구를 위해 코팅 조건(D2C0.5)을 최적화했다.

3) 저-결합 세포 배양 플레이트를 만들기 위한 표면 페길화(PEGylation).

초저속 결합 표면(Ultralow binding surface)은 줄기세포 또는 성체 세포, 배아체 및 종양구의 3D 스페로이드(spheroid) 형성을 가능하게 하는 고효율 스크리닝 스페로이드 응용에 광범위하게 사용되었다. 이러한 비부착성(nonadherent) 기질은 진보된 치료 도구 개발을 위한 기본적인 세포 생물학을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. 친수성 하이드로겔을 도입하거나 이온 밸런스를 조절하는 것과 같이 다양한 전략이 저-결합 표면(low-binding surface)을 생성하기 위해 개발되었지만, 용이하고 개선된 코팅 효율(예를 들어, 간단한 절차, 신속한 화학 결합 및 장기 안정성)을 가진 진보된 표면 개질 도구를 개발하는 것은 여전히 도전적이다.

따라서, 본 발명자는 아민-반응성 PEG 접합체를 사용하여 저-결합 세포 배양 플레이트를 제조하기 위해 과산화칼슘-매개 표면 개질 기술을 이용했다.

본 발명자는 표면 수화(hydration)(예를 들어 저-파울링(fouling)또는 비파울링 표면)를 통해 생체 불활성 기질을 만드는데 광범위하게 사용되는 대표적인 친수성 및 생체 불활성(bioinert) 중합체인 PEG를 선택했다. 본 발명자는 세포 배양용 폴리스티렌(tissue culture polystyrene, TCPS)에서 과산화칼슘-매개 DA 고정화로부터 유래된 아민이 풍부한 기질이 다른 첨가제 없이 간단한 침지 절차에 의해 아민-반응성 PEG(mPEG-NPC)와 반응하여 저-결합 세포 배양 플레이트용 페길화된 TCPS(PEG-TCPS)를 형성한다고 가정하였다.

본 발명자는 이전의 연구(반응식 2a)에서 도시된 것처럼 mPEG에 NPC(4-Nitrophenyl chloroformate)를 결합시켜 mPEG-NPC를 합성하였다.

[반응식 2]

아민-풍부 TCPS를 mPEG-NPC 용액에 1시간 동안 담가 mPEG-TCPS를 제조했다(반응식 2b). 본 발명자는 PEG 모이어티(moieties)를 DA-TCPS에 접합시킨 후 표면 형태를 관찰했다. 본 발명자는 표면 거칠기가 PEG 모이어티를 표면에 접합시킴으로써 감소되었음을 관찰했다(도 3a). 이것은 기질에 중합체를 도입함으로써 야기되는 것으로, 이는 이전 보고와 일치한다.

본 발명자는 BCA 분석에 의해 TCPS 기판 상의 mPEG 분자의 밀도를 결정했다. 　본 발명자는 mPEG-NPC의 공급량을 증가시키면 PEG 모이어티의 표면 밀도가 18.5에서 23.2 nmol/cm²로 증가한다는 것을 발견했다(도 3b). 이러한 결과는 mPEG-TCPS가 성공적으로 제조되었으며, 아민 반응성 PEG 분자의 공급량을 변화시킴으로써 표면상의 페길화 정도가 조절될 수 있음을 보여 주었다.

본 발명자는 다음으로 세포 부착에 대한 TCPS로의 페길화의 효과를 조사했다. 따라서 본 발명자는 다른 유형의 기질에 HDF(human dermal fibroblast)를 배양하고 WST-1 분석법으로 세포 밀도를 평가했다. 본 발명자는 무처리 TCPS에 비해 mPEG-TCPS에서 세포 밀도가 감소된 제한된 세포 부착을 관찰했다(도 4a 및 b). 또한 증가된 PEG 밀도는 더 낮은 세포 결합 기질을 형성한다는 것을 발견하였다(TCPS, 267 cells/well; DCP10, 152 cells/well; DCP100, 26 cells/well; DCP200, 14 cells/well). 최적의 조건(DCP200)를 활용하여 본 발명자는 3D 스페로이드 형성을 위한 저-결합 세포 배양 플레이트를 제조하였다.

본 발명자는 둥근 바닥 TCPS에 과산화칼슘-매개 페길화 방법을 적용하여 3D 세포 스페로이드를 제조하였다. 본 발명자는 서로 다른 유형의 배양 플레이트(무처리, TCPS, PEGylated, DCP200)에서 세포(HDF 및 HT1080)를 배양했다. 모델 세포로 HDF(성체 세포)와 HT1018(섬유 육종)을 선택했다. 흥미롭게도, 페길화된 플레이트 상에서 배양된 세포는 둥근 세포 스페로이드를 나타내었고, 보다 높은 세포 농도는 미처리된 배양 플레이트를 사용하는 것에 비해 보다 크고 컴팩트한 세포 스페로이드를 형성하였다. 이러한 결과는 본 발명 과산화칼슘-매개 표면 페길화 도구가 고급 치료제 개발을 위한 기본 세포 생물학 연구에 사용될 수 있는 3차원 세포 스페로이드를 형성하는데 유용하다는 것을 제안한다.

3. 결론

본 발명에서는 산소 공급 시약으로서 과산화칼슘을 이용한 생체 적합 물질의 표면 개질 기술을 개발하였다. 본 발명자는 과산화칼슘-매개 산소 공급이 카테콜아민(도파민 하이드로클로라이드)의 산화를 촉진하여 신속하게 아민이 풍부한 기질을 생성한다는 것을 입증했다. 본 발명자는 과산화칼슘-매개 표면 변형 도구를 이용하여 3D 세포 스페로이드(spheroid) 형성을 위한 간단한 침지 공정으로 저-결합 배양 플레이트를 만들기 위해 페길화된(PEGylated) 세포 배양 플레이트를 제조하였다. 우리가 아는 한, 이 방법은 표면 개질 기술의 새로운 유형이다. 본 발명자의 산소 매개 표면 고정화 도구는 기본 세포 생물학, 생체 재료 공학 및 바이오 센서를 포함한 광범위한 생물 의학 응용 분야를 위한 첨단 플랫폼으로서의 높은 가능성을 보여주었다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (12)

1. 과산화칼슘(CaO₂)이 첨가된 카테콜아민 용액에 코팅하고자 하는 기재를 침지시키는 단계를 포함하는 카테콜아민 코팅 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 과산화칼슘은 카테콜아민 용액 대비 0.25 내지 1 wt%인 것을 특징으로 하는 카테콜아민 코팅 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 기재의 침지 시간은 10 내지 30분인 것을 특징으로 하는 카테콜아민 코팅 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 기재는 폴리머 기재인 것을 특징으로 하는 카테콜아민 코팅 방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 폴리머 기재는 ABS(아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌), COC/COP(시클로올레핀 공중합체 및 중합체), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PC(폴리카보네이트), PS(폴리스티렌), PP(폴리프로필렌), PVC(폴리비닐클로라이드), PA(폴리아미드), PE(폴리에틸렌), PET(폴리에틸렌테레프탈레이트), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), POM(폴리옥시메틸렌), TPE(열가소성 엘라스토머), TPU(열가소성 폴리우레탄), PI(폴리이미드), PEEK(폴리에테르에테르케톤), PLA(폴리락트산), PMP(폴리메틸펜텐) 및 그의 유도체 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 카테콜아민 코팅 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 용액의 용매는 Tris-HCl인 것을 특징으로 하는 카테콜아민 코팅 방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 Tris-HCl는 pH가 7.5 내지 8.5인 것을 특징으로 하는 카테콜아민 코팅 방법.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 카테콜아민이 코팅된 기재를 아민-반응성 PEG(mPEG) 용액에 침지시키는 단계를 포함하는 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 아민-반응성 PEG(mPEG)는 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG 숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA), mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB), mPEG-숙신이미딜 카르보네이트(mPEG-SC), mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 및 mPEG-p-니트로페닐 카르보네이트(mPEG-NPC) 중에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 저-결합 세포 배양 플레이트 제조방법.
   
10. 제8항에 따른 방법에 의하여 제조된 저-결합 세포 배양 플레이트.
    
11. 제10항의 저-결합 세포 배양 플레이트를 이용하여 세포를 배양하는 방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 3차원 세포 스페로이드를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
    

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