Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR102232348B1 - 글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도 - Google Patents

글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102232348B1
KR102232348B1 KR1020167008817A KR20167008817A KR102232348B1 KR 102232348 B1 KR102232348 B1 KR 102232348B1 KR 1020167008817 A KR1020167008817 A KR 1020167008817A KR 20167008817 A KR20167008817 A KR 20167008817A KR 102232348 B1 KR102232348 B1 KR 102232348B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
glycosylation
endo
containing molecule
hexnac
Prior art date
Application number
KR1020167008817A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160048213A (ko
Inventor
니코 캘러워트
프란시스 산텐스
Original Assignee
브이아이비 브이지더블유
유니버시테이트 젠트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 브이아이비 브이지더블유, 유니버시테이트 젠트 filed Critical 브이아이비 브이지더블유
Publication of KR20160048213A publication Critical patent/KR20160048213A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102232348B1 publication Critical patent/KR102232348B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 당-조작 분야, 보다 상세하게는 항체와 같은 Fc 함유 분자의 당-조작 분야에 관한 것이다. 특이적인 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자는 각각의 항원에 대한 결합 친화성을 변경시키지 않으면서, 상당히 더 긴 생체내 순환 반감기를 가지는 것으로 나타난다. 이는 치료 효능에 영향을 미치지 않으면서, 이러한 분자가 투여될 필요가 있는 빈도를 줄이는 치료학적 암시(therapeutic implication)를 가진다. 또한, 요망되는 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 분자를 생산할 수 있는 세포가 제공된다.

Description

글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도{CELLS PRODUCING FC CONTAINING MOLECULES HAVING ALTERED GLYCOSYLATION PATTERNS AND METHODS AND USE THEREOF}
본 발명은 당-조작 분야, 보다 상세하게는 항체와 같은 Fc 함유 분자의 당-조작 분야에 관한 것이다. 특이적인 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자는 각각의 항원에 대한 결합 친화성을 변경시키지 않으면서, 상당히 더 긴 생체내 순환 반감기를 가지는 것으로 나타난다. 이는 치료 효능에 영향을 미치지 않으면서도, 이러한 분자가 투여되어야 하는 빈도를 줄이는 치료학적 암시(therapeutic implication)를 가진다. 또한, 요망되는 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 분자를 생산할 수 있는 세포가 제공된다.
항체, 특히 IgG 항체는 지난 20년 동안 개발된 가장 성공적인 치료제들(예, 몇 가지만 말하자면 베바시주맙(bevacizumab), 리툭시맙(rituximab), 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 세툭시맙(cetuximab)) 중 일부의 기초이다. 이러한 성공은 적어도 부분적으로 이들이 고도로 특이적이며, 장기간의 혈청-반감기를 가지며, 비교적 일상적으로 생산될 수 있어서, 면역치료법에 대한 이상적인 약물이 되게 한다는 사실에 기인한다. 항체 분자(또는 면역글로불린, Ig)의 기본 구조는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드로 구성된다. 이들 사슬은 "Y"-형 구조를 형성하는 이황화 결합에 의해 연결된다. 인간 면역글로불린은 중쇄에 따라 5가지 부류(IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM)로 분류될 수 있다. IgG 항체 및 IgA 항체는 각각 4가지 하위부류(IgG1 내지 IgG4) 및 2가지 하위부류(IgA1 내지 IgA2)로 더 분류된다. 특정 항원의 인지는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 및 하나의 불변 영역을 포함하는 항원-결합 단편(Fab)에 의해 매개된다. 효과기 기능은, 중쇄 불변 영역의 다른 2개 도메인(CH2 및 CH3)에 상응하는 단편 결정화 영역(fragment crystallizable region; Fc)이 Fc 수용체(FcR)와 같은 효과기 단백질에 결합함으로써 개시된다. 따라서, Fab 단편은 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역으로 구성되는 한편, Fc 단편은 중쇄의 불변 영역으로만 구성된다. 이러한 Fc 도메인은, 단백질이 엔도솜에서 분해되지 않도록 하는 신생아의 Fc 수용체(FcRn)에 pH-의존적인 결합을 하므로, 항체의 혈청 반감기를 연장한다.
가장 생물학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드는 신장 청소율이 빨라 매우 짧은 혈청 반감기를 가지며, 이는 표적 조직에서의 이들의 노출을 제한할 뿐만 아니라 결과적으로 이들의 약리학적 효과를 제한하기 때문에, 항체의 긴 혈청 반감기를 고려하여, Fc-융합 단백질의 작제는 치료 단백질의 반감기를 연장하는 방식으로 수행되었다. Fc 융합 전략 또한, 상당한 성공을 충족시켰다: 시판되는 Fc 융합 단백질은 예를 들어, 에타네르셉트(etanercept), 알레파셉트(alefacept), 아바타셉트(abatacept), 릴로나셉트(rilonacept), 로미플로스팀(romiplostim), 벨라타셉트(belatacept) 및 아플리베르셉트(aflibercept)를 포함한다. 부가적인 이점으로서, Fc-융합 단백질의 Fc 부분은 보다 용이한 발현 및 단백질 A-친화성 정제를 가능하게 하며, 이는 항체 및 Fc-융합 치료제의 개발에 있어서 실질적인 이점을 부여한다.
항체 조작 접근법은, 예를 들어, 리간드 또는 Fc 수용체에 대한 치료 항체들의 결합 특성을 변경시키거나 이들의 반감기를 더 연장함으로써, 이들 치료 항체의 임상적 성공을 더욱 발전시키는 데 사용되어 왔다. 이를 달성하기 위한 전형적인 접근법으로는, 돌연변이의 도입 또는 항체의 글리코실화의 변경을 포함한다. Fc 사슬에 돌연변이를 도입하는 것은, 더 이상 천연 서열과는 작동하지 않게 되는 내재적인 단점을 가진다. 치료 단백질의 글리코실화가 일반적으로 순환 반감기를 연장하는 것으로 허용된다는 것과는 대조적으로, 글리코실화가 순환되는 면역글로불린의 제거율에 미치는 효과에 관한 연구들은 상충되는 결과를 낳았으며(문헌[Millward et al., 2008]), 대부분의 연구들은 Fc 모이어티의 글리칸 구조 차이가 청소(clearance)에 영향을 미치지 않는 것으로 결론내린다(문헌[Chen et al., 2009]).
항체 사슬의 번역-후 개질 동안, 소포체 및 골지체 내의 효소는 항체의 폴리펩타이드 백본에 탄수화물 사슬을 부착시킬 수 있다. 단일 N-연결 글리칸은 모든 IgG 하위부류의 Fc 부분의 위치 297(Kabat 넘버링)의 아스파라긴에 존재한다. IgG 항체 중 약 20%는 분자의 어느 위치에나 글리칸을 함유한다(문헌[Jefferis, 2005]). 대부분의 재조합 항체 약물은 단일 Fc 글리코실화 부위만을 함유하도록 조작되거나 선별되어 왔다.
항체 사슬이 올바르게 접혀서 연관되는 경우, 위치 297의 올리고당류는 CH2 도메인에 의해 밀봉된 내부 공간 내에 격리되며, 항체의 올리고당류와 아미노산 사이의 비-공유 상호작용이 광범위하게 존재하며, 이는 형태에 상호 영향을 미친다.
보존된 Asn-297 부위에서 발견되는 올리고당류는 전형적으로, 푸코실화된 바이안테너리(biantennary) 복합체 유형이다. 그러나, 항체 분자들 중에는, 탄수화물 모이어티의 변경된 분지화, 사슬 길이 및/또는 변경된 수로 인해, 탄수화물 구조(글리코형)에 있어서 상당한 불균일성(heterogeneity)이 존재할 수 있다. 사실상, 부착된 N-연결 올리고당류의 구조는 가공 정도에 따라 상당히 다양하며, 고-만노스뿐만 아니라 이등분화 GIcNAc 및 코어 푸코스 잔기를 포함하거나 포함하지 않는 복잡한 바이안테너리 올리고당류를 포함할 수 있다(문헌[Wright and Morrison, 1997]). 전형적으로, 주어진 글리코실화 부위에 부착된 코어 올리고당류 구조의 불균질한 가공이 존재하며, 그 결과, 심지어 모노클로날 항체조차 다수의 글리코형으로 존재하게 된다. 더욱이, 항체 글리코실화의 주된 차이는 항체-생산 세포주들 간에 발생하며, 심지어 상이한 배양 조건 하에서 생장된 주어진 세포주에서도 미세한 차이가 관찰된다.
사실상, 포유류 N-글리칸 생합성(도 1a, 상부)에서 각각의 단계는 100% 미만으로 효율적이며, 일부 효소는 기질에 대해 서로 경쟁하여, 많은 상이한 글리코형들이 형성된다. 불균질한 글리코실화는 치료 단백질 생산 시, 문제점을 제시한다. 예를 들어, 글리칸이 약물동력학 및 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있으나(문헌[Ferrara et al., 2006; Elliott et al., 2004]); N-글리칸은 종종 단백질 접힘(folding)에도 중요하므로, 이러한 난관들은 N-글리코실화 부위를 완전히 제거하거나 소포체 전에 또는 소포체에서 글리코실화를 방해하는 것으로는 극복될 수 없다.
글리코형의 차이는 효과기 기능을 상이하게 하거나 일관적이지 않게 할 수 있으며, 이는 항체를 치료학적으로 사용하거나 조절적인 측면에서 규정하는 것을 어렵게 할 수 있다. 또한, 인간에서 보편적으로 생합성되지 않는 글리코형은 알레르기원성일 뿐만 아니라 면역원성이고, 연결된 항체의 혈장내에서의 청소(plasmatic clearance)를 가속화할 수 있다. 위치 297에서 Fc 모이어티의 탈글리코실화는 Fc 함유 분자의 효과기 기능을 감소시키거나 없애거나, 안정성을 저하할 수 있다(문헌[Krapp et al., 2003; Yamaguchi et al., 2006; Barb et al., 2011; Buck et al., 2013]).
보다 긴 순환 반감기와 같은 개선된 특성을 가지면서도 불균질한 글리코실화 또는 저하된 항원 결합과 같은 단점은 가지지 않는 Fc 함유 분자를 수득하는 것이 유리할 것이다.
본 발명의 목적은, 연장된 순환 반감기를 가진 항체 및 Fc 융합 단백질의 생산 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한, 정상 포유류 세포에서 수득되는 것보다 훨씬 덜 불균질한 글리코실화 프로파일을 가진 항체 및 Fc 융합 단백질의 생산 방법을 제공하는 것이다.
매우 특이적인 단순 글리칸을 가진 당단백질을 수득하기 위해 당-조작된 동물 세포주를 구축하는 경우, 놀랍게도, 이 세포주에서 생산되는 Fc 함유 분자는 생체내에서 훨씬 더 긴 순환 시간을 가지는 것으로 발견되었다. 그렇지 않다면, 항체는 비-당-조작된 세포에서 생산되는 것과 동일하기 때문에, 차이는 순전히 특이적인 글리코실화 패턴으로 인한 것이다.
이에, 제1 측면에서, 하기를 함유하는 세포가 제공된다:
엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열;
Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열.
특히, 세포는 고등 진핵 세포인 것으로 예상된다. 추가적인 특정 실시 형태에 따르면, 고등 진핵 세포는 척추동물 세포, 특히 포유류 세포이다. 예로는, CHO 세포 또는 HEK293 세포(예를 들어, HEK293S 세포)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 형태에 따르면, Fc 함유 분자의 Fc 부분은 IgG-유형 분자의 Fc이다.
특정 실시 형태에 따르면, MGAT1 유전자에 의해 인코딩되는 글리코실트랜스퍼라제 GnTI은 세포에서 불활성화된다.
특정 실시 형태에 따르면, 엔도글루코사미니다제 효소의 발현은 골지체로 표적화된다. 이는, 예를 들어 엔도글루코사미니다제를 골지 위치화 신호에 작동적으로 연결함으로써, 달성될 수 있다.
특정 실시 형태에 따르면, 엔도글루코사미니다제 효소는 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제(E.C. 3.2.1.96)이다. 예를 들어, 엔도 T, 엔도 H, 엔도 S, ENGase와 같은 이러한 상이한 효소가 존재한다. 특히 예상되는 효소는 엔도 T이다.
추가적인 측면에 따르면, 이들 세포에서 Fc 함유 분자를 생산함으로써 수득가능한 Fc 함유 분자, 즉, 하기의 존재를 특징으로 하는 고등 진핵 세포에서 생산되는 Fc 함유 분자가 제공된다:
엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열;
Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열.
이들 세포에서 Fc 함유 분자의 생산은 특이적인 글리코실화 패턴을 갖는 분자를 제공할 것이다. 이에, Fc 부분 상에서의 글리코실화가 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc로부터 선택되는 글리칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, Fc 함유 분자가 제공된다. 매우 구체적인 실시 형태에 따르면, 글리칸은 삼당류 구조 및 이당류 구조로부터 선택된다(즉, 단일 GlcNAc와 같은 단일 HexNAc가 존재하는 구조가 아님).
가장 상세하게는, Fc 부분 상에서의 글리코실화는 Fc 부분의 잔기 N297 상에서의 글리코실화이다. 이는, IgG-유사 분자의 Fc 모이어티 내의 보존된 잔기이다.
단일 글리코실화 부위를 가진 Fc 분자가 전형적으로 하나의 글리칸 사슬만 가지기 때문에, Fc 부분의 글리코실화(예, N297 상에서의 글리코실화)가 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 복수의 동일한 Fc 함유 분자가 제공된다. 특정 실시 형태에 따르면, 복수의 Fc 함유 분자들 중 적어도 하나는 삼당류 구조 및 이당류 구조로부터 선택되는 글리칸을 가진다. 즉, 복수의 Fc 함유 분자들 중 적어도 하나는 단당류 구조 HexNAc가 아닌 글리칸을 가진다.
추가적인 특정 실시 형태에 따르면, Fc 함유 분자 상의 글리칸 또는 복수의 Fc 함유 분자들 상의 글리칸은 삼당류 구조 Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc, 이당류 구조 Gal-β-1,4-GlcNAc 및 단당류 구조 GlcNAc로부터 선택된다.
특정 실시 형태에 따르면, 특이적인 글리코실화를 가진 Fc 함유 분자는 항체, 특히 IgG이다.
추가적인 측면에 따르면, 본원에 기술된 Fc 함유 분자는 약제로서 사용하기 위해 제공된다. 예를 들어, Fc 함유 분자는 정맥내 면역글로불린치료법에 사용하기 위해 제공될 수 있다. 이는 다시, 본원에 기술된 세포에 의해 생산되는 Fc 함유 분자를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 정맥내 면역글로불린치료법으로 대상체를 치료하는 방법이 제공되는 것과 같다. 또는 다른 예로, Fc 함유 분자(또는 복수의 Fc 함유 분자들)를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, Fc 부분 상에서의 글리코실화가 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc로부터 선택되는 글리칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 정맥내 면역글로불린치료법으로 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
다른 추가적인 측면에 따르면, 하기의 단계들을 포함하는, 고등 진핵 세포에서 잔기 N297 상에 특이적인 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자를 생산하는 방법이 제공된다:
엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열(이때, 엔도글루코사미니다제는 골지 위치화 신호에 작동적으로 연결됨) 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열을 포함하는 고등 진핵 세포를, 엔도글루코사미니다제 효소 및 Fc 함유 분자를 발현시키기에 적합한 조건에서 제공하는 단계; 및
Fc 함유 분자가 엔도글루코사미니다제와 세포내 접촉된 후에, Fc 함유 분자를 회수하는 단계.
특정 실시 형태에 따르면, 생산되는 Fc 함유 분자는 분비된다.
특이적인 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자는 보다 긴 순환 반감기를 가지는 것이 특히 유리하다. 즉, 이들은 변경된 글리코실화 패턴을 가지지 않는 Fc 함유 분자보다 더 오래 순환에 머물러 있거나, 덜 효율적으로 제거되거나, 더 오랫동안 일정한 역치 농도를 유지한다. 이는 사실상 놀라운데, 왜냐하면 일반적으로 복잡한 글리코실화가 순환 반감기를 연장하는 데 유익할 것으로 가정되기 때문이다. 더욱이, Fc 함유 분자(예를 들어, 항체)는 보다 오래 순환에 머물러 있을 뿐만 아니라, 이들 항체가 이들의 리간드에 대해 갖는 친화성이, 변경된 글리코실화 패턴에 의해 영향을 받지 않는다.
따라서, 본원에 기술된 바와 같은 변경된 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자가 제공되며, 이는 항원 결합 활성을 유지하면서도 비-개질된 글리코형과 비교하여 증가된 생체내 순환 시간을 가진다. 이들 실시 형태에서, Fc 함유 분자는 항원에 결합하는 Fc 함유 분자이다. 예를 들어, Fc 함유 분자는 항체일 수 있지만, Fc 모이어티가 결합 모이어티(예를 들어, 나노바디(nanobody), Fab, F(ab')2)에 융합된 키메라형 Fc 융합 단백질일 수도 있다.
이에, 하기의 단계들을 포함하는, 항원 결합을 변경시키지 않으면서, Fc 함유 분자를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 Fc 함유 분자의 순환 시간을 증가시키는 방법이 제공된다:
본원에 기술된 바와 같은 Fc 함유 분자를 제공하는 단계;
Fc 함유 분자를 대상체에게 투여하는 단계.
도 1. 글리코삭제 전략 및 세포주 특징화 .
당 잔기: 청색 사각형: N-아세틸글루코사민, 녹색 원: 만노스, 황색 원: 갈락토스, 보라색 다이아몬드: 시알산.
도 1a: 온전한 글리코실화 머시너리(machinery)(상부)를 가진 포유류 세포에서, 골지체로 들어가는 올리고만노스 글리칸은 부류 I 만노시다제(ManI)에 의해 Man5GlcNAc2 형태로 더 트리밍된다. 이들은 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 1(GnTI)에 의해 α-1,3-만노스 상에서 β-1,2-N-아세틸글루코사민으로 개질 시, 하이브리드 또는 복합체 유형 N-글리칸으로 변한다. 다수의 글리코실하이드롤라제 및 글리코실트랜스퍼라제는 많은 생합성 단계들을 통해 복합체 유형 N-글리칸으로 더 모델링되어(WT 글리코실화, 상부의 검은색 화살표), 실질적으로 불균일성이 초래된다. 293SGnTI-/- 세포주에서, 글리칸은 올리고만노스 유형으로 변한다. 이들 N-글리칸은 글리코삭제 세포에서 골지-표적의 엔도 T에 의해 가수분해되어, 단일 N-아세틸글루코사민 잔기(글리코삭제 글리코조작, 하부(bottom))가 생산된다. 단일 GlcNAc 스텀프(stump)는 골지체에서 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제(GalT 및 SiaT)에 의해 연신될 수 있다. pHopt, 최적 pH. 도 1b: 엔도 T에 의한 세포 표면 당단백질의 완전(full) 탈글리코실화는 ConA 리간드의 부재를 초래하여 세포가 conA에 대해 내성이 되게 할 것이기 때문에, 콘카나발린 A 선별 전략은 요망되는 글리칸 표현형을 직접 선별한다. 부모 GnTI-/- 세포는 conA로 처리 시 사멸한다. 도 1c: 293SGnTI-/- 세포 및 293S글리코삭제 세포에 대한 성장 곡선을 24 시간마다 측정하였다. 오차 막대는 각각의 3회 중복측정에 대한 SD를 나타낸다(표 4). 두 선 모두 유사한 성장 카이네틱스(growth kinetics)를 보여준다. 도 1d: 293S글리코삭제 세포 대 293SGnTI(-) 세포에 있어서, 7,344개 유전자의 평균(n=3) 유전자 발현 값의 산점도(scatterplot). 상관 계수는 0.9865이다. 유의미하게 상이하게 발현된 유전자들(표준 오차가 단순 베이지안 모델(Bayesian model)에 따라 유전자들에 대해 온건화됨(moderated), 온건화된 t-테스트; P < 0.01)은 이들의 명칭에 따라 표지된다. 표시된 척도에서 8 미만의 마이크로어레이 신호 강도는 신뢰할 만한 검출을 하기에는 너무 낮았다.
도 2. 분비되는 엔도 T (s-엔도 T)와 비교하여, 2가지 상이한 trans 골지 표 적화 도메인( GM 2 S -엔도 T 및 ST-엔도 T)의 평가.
이 실험에서, 본 발명자들은 2가지 trans 골지 표적화 서열들 중 어느 것이 293SGnTI-/- 세포 내에서 이들 서열과 엔도 T 촉매적 도메인의 융합을 유지하는 데 가장 효과적인지 평가하였다. 비교를 위해, 본 발명자들은 또한, 분비되는 버전의 엔도 T(즉, 분비 서열을 가지나 골지 표적화 서열은 가지지 않음)를 분석하였다. SDS-PAGE의 웨스턴 블롯은 세포 용해물 단백질을 분리하였으며, 세포 배양 배지에 존재하는 단백질은 폴리클로날　항-엔도 T 항혈청 또는 모노클로날 항-c-Myc 에피토프 항체를 사용하여 발색되었다. c-Myc 에피토프는 상이한 단백질 작제물들에 C-말단적으로 융합되며, 따라서 이의 존재 또는 부재는 단백질의 C-말단 가공에 영향을 줄 수 있다. 이들 결과로부터, 이러한 작제물은 세포내 엔도 T 형태와 세포외 엔도 T 형태를 분비되는 버전의 단백질로서 동일하게 분포시키기 때문에 GM2S-유래의 서열은 엔도 T를 세포내에 유지시키는 데 비효과적인 것임이 명백하다. GM2 서열은 효율적으로 절단되는 것으로 보인다. 대조적으로, ST-유래의 서열은 엔도 T를 세포내에 효과적으로 유지시키며, 50 kDa에서의 주요 밴드는 ST-엔도 T 융합 단백질의 예상된 분자 질량과 일치한다. 일부 미미한 분비가 여전히, 2가지의 C-말단적으로 단백분해된 형태로 발생한다. ST6GalI 도메인은 올리고머화하는 것으로 알려져 있기 때문에1, 100 kDa에서 관찰될 수 있는 약한 세포내 밴드는 아마도 ST-엔도 T 이량체를 나타낸다.
도 3. 엔도 T 융합 작제물의 일시적인 형질감염에 의한 생체내 탈-N- 글리코 실화.
엔도 T 융합 단백질에 의한 탈-N-글리코실화를 평가하기 위해, 융합 작제물을, Flt3 수용체 세포외 도메인(Flt3ECD, 패널 A)을 안정하고 유도적으로 발현하는 293SGnTI-/- 세포 또는 5-하이드록시-트립타민 수용체 1D(5HT1D, 패널 B)를 안정하고 유도적으로 발현하는 293SGnTI-/- 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 샘플을 면역블로팅에 의해 분석하여, C-말단 HIS-태그(패널 A) 또는 C-말단 Rho1D4 태그(패널 B)를 검출하였다. 두 패널 모두의 숫자는 1 = 빈(empty) 플라스미드, 2 = s-엔도 T 플라스미드, 3 = GM2S-엔도 T 플라스미드, 4 = ST-엔도 T 플라스미드로 형질감염시킨 세포로부터의 샘플을 나타낸다. 패널 A에서 문자 a 및 b는 형질감염/유도 후 48시간 및 72시간째의 샘플/상층액을 나타낸다. + 기호는 정제된 Flt3ECD를 양성 대조군으로서 가리킨다. 이들 블롯으로부터, Flt3ECD 및 5HT1D 샘플 둘 다 엔도 T 작제물(2, 3, 4) 중 임의의 작제물을 사용한 형질감염 시 분자량 감소를 보여주지만, 빈 플라스미드(1)를 사용한 형질감염 시에는 분자량 감소를 나타내지 않으며, 이는, 엔도 T 융합 작제물에 의한 탈-N-글리코실화를 가리키는 것이 명백하다. 명백하게, 엔도 T는 공동-발현된 당단백질이 세포내에서 유지되든지(ST-엔도 T) 또는 그렇지 않든 간에(s-엔도 T 및 GM2S-엔도 T), 해당 당단백질을 탈글리코실화시킬 수 있다.
도 4. 2개의 ST-엔도 T 를 과발현하는 클론 및 부모 293SGnTI -/- 세포주에 대한 ConA 민감성 분석법 2 .
본 발명자들은 렉틴 민감성 분석법을 수행하여, 293SGnTI-/- 세포 및 2개의 엔도 T를 과발현하는 클론의 ConA 민감성을 확인하였다. 두 클론 모두 부모 세포주(293SGnTI-/-:　2 ㎍/mL)보다 ConA에 대해 훨씬 더 내성이었다. 그러나, 제1 클론은 제2 클론(18 ㎍/mL)보다 ConA에 대해 더 내성(22 ㎍/mL 초과)이었으며, 따라서, 추가적인 작업에 제2 클론을 선별하였다. 이는 293S글리코삭제로 지정되었다. ConA에 내성인 293S글리코삭제 세포주의 안정성을 20개 스플릿(#+8 vs. #+28)에서 시험하였다. 내성/민감성은 안정하며 20 ㎍/mL 초과인 것으로 확인되었다(데이터는 도시되지 않음). 약 20 ㎍/mL보다 높은 농도는 응집물이 형성되기 시작하였기 때문에, 시험될 수 없었다.
도 5. PCR 및 웨스턴 블롯에 의한 엔도 T의 입증.
도 5a: 293S글리코삭제 세포 게놈 DNA(gDNA)에서 ST-엔도 T 코딩 서열의 존재의 PCR 입증. 모세관 전기영동에 의한 PCR 생산물의 분석은 293S글리코삭제 gDNA를 주형으로서(화살표) 포함하는, 예상된 길이(346 bp)의 특이적인 PCR 생산물의 존재를 나타낸다. 이 앰플리콘은 PCR 반응용 주형으로서 293SGnTI-/- gDNA를 사용해서는 생산되지 않는다. 도 5b: 엔도 T 촉매적 도메인(폴리클로날 토끼 항-엔도 T)의 존재를 검출하기 위해, 293SGnTI-/- 세포 및 293S글리코삭제 세포로부터의 샘플을 면역블로팅에 의해 분석하였다. 293S글리코삭제 세포 용해물 내의 주요 밴드는 단량체성 ST-엔도 T의 예상된 분자량(49.8 kDa)에서 진행된다. 293S글리코삭제 세포 용해물에서 약 100 kDa 및 200 kDa에서의 밴드는 아마도 올리고머이며, 한편, 이보다 낮은 분자량에서의 밴드는 아마도 분해 생산물을 나타낸다. 올리고머는 또한, ST-엔도 T 작제물을 사용한 일시적인 형질감염 실험에서도 관찰된다(도 2). 이들 밴드에 대한 신호는 293SGnTI-/- 용해물에서는 검출될 수 없다.
도 6. S-계통 세포주의 비교적인 발현 산점도 .
값은 백그라운드 보정 및 노이즈 제거 후 확인된 바와 같은 발현된 유전자의 log2 신호 강도의 평균을 나타낸다. 패널 A: 293SGnTI-/- 대 293S. 상관 계수는 0.947이다. 7256개의 발현된 유전자로부터, 68개 유전자는 이들의 발현이 293S 세포주와 비교하여 293SGnTI-/- 세포주에서 적어도 2배 이상 변하였으므로, 통계학적으로 상이하게 발현(p<0.01)된 것으로 확인되었다. 패널 B: 293S글리코삭제 대 293S. 상관 계수는 0.938이다. 7473개의 발현된 유전자로부터, 70개 유전자는 이들의 발현이 293S 세포주와 비교하여 293S글리코삭제 세포주에서 적어도 2배 이상 변하였으므로, 통계학적으로 상이하게 발현(p<0.01)된 것으로 확인되었다. 이들 유전자 중에서, 45개(-/+ 65%)는 유도된 세포주 대 부모 293S 세포 모두에 대해 동일하다.
도 7. 글리코삭제 글리칸 특징화 .
(a) 293S, 293SGnTI(-) 및 293S글리코삭제 세포로부터의 GM-CSF 샘플의 SDS-PAGE. 각각의 샘플을 PNGase F, 시알리다제 또는 둘 다로 처리하고, SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 다음, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다. kDa, 킬로달톤. (b) GM-CSF 샘플의 MALDI-타임-오브-플라이트-MS 스펙트럼. 피크들을 이들의 질량/전하 비(m/z) 값으로 표지한다. 293SGnTI(-) GM-CSF의 스펙트럼은 N37을 함유하는 당펩타이드 상에서 Man5GlcNAc2(좌측) 및 푸코실화된 Man5GlcNAc2(우측)의 존재를 보여준다. 이들 글리코형은 글리코삭제 GM-CSF에는 존재하지 않는다. HexNAc, Hex-HexNAc 및 Neu5Ac-Hex-HexNAc-개질된 당펩타이드에 상응하는 m/z 값에서 새로운 피크가 검출된다. α-2,3-시알리다제를 사용한 엑소글리코시다제-분해된 글리코삭제 GM-CSF N-글리칸의 스펙트럼 또는 시알리다제 및 β-1,4-갈락토시다제 둘 다를 사용한 브로드(broad) 스펙트럼이 나타나 있다. 이들 스펙트럼은, 글리코삭제 GM-CSF N37 상의 N-글리칸이 Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc 및 Gal-β-1,4-GlcNAc임을 보여준다. (c) 293S, 293S글리코삭제 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli: 이. 콜라이) 세포에 의해 생산되는 GM-CSF의 서모플루오르 분석법(ThermoFluor assay). 본 발명자들은 모든 GM-CSF 글리코형들에 대한 유사한 평균(n=3) 용융 곡선(Tm은 약 60℃임)을 관찰하였다. (d) TF1 적백혈병 세포-증식 분석법에서 측정되는 바와 같은 293S-생산되는 GM-CSF 및 293S글리코삭제-생산되는 GM-CSF의 생물활성(n = 3). 에스케리키아 콜라이-생산되는 GM-CSF는 비글리코실화된 대조군 샘플로서 기능한다. 오차 막대, s.d.(표 5). (e) 글리코삭제 GM-CSF로 면역화된 토끼 혈청에서 항-글리칸 항체 역가(titer)에 대한 ELISA 분석. 글리코삭제 글리칸으로부터 시알산 및 갈락토스 단당류를 제거하는 것은 혈청의 항체 인지를 감소시키지 않는다(표 6). (f) (e)에 기술된 바와 같은 이중 중복 실험.
도 8. GM- CSF 당펩타이드의 MALDI - TOF -MS.
두 세포주 모두에서 Asn 27을 포함하는 당펩타이드는 GnTI-/- GM-CSF에서 Man5GlcNAc2-Asn(m/z = 1931.6) 및 푸코실화된 Man5GlcNAc2-Asn(m/z = 2077.7)의 존재를 보여준다(패널 A). 이들 글리코형은 글리코삭제 GM-CSF에 존재하지 않는다(패널 B). m/z = 918.5, 1080.5 및 1371.6에서의 피크는 글리코삭제 GM-CSF에서 검출되며, 이는 각각 HexNAc-Asn, Hex-HexNAc-Asn 및 Sia-Hex-HexNAc-Asn을 나타낸다. α-2,3-시알리다제(패널 C) 또는 브로드 스펙트럼 아쓰로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens) 시알리다제 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) β-1,4-갈락토시다제(패널 D)를 사용한 엑소글리코시다제-분해된 글리코삭제 GMCSF N-글리칸의 분석이 도시되어 있다. 스펙트럼은, 글리코삭제 GM-CSF 상의 N-글리칸이 Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc-Asn 및 Gal-β-1,4-GlcNAc-Asn임을 예시한다.
도 9. 293S 세포에서 생산되는 GM- CSF의 DSA -FACE 분석.
패널 a: 덱스트란 래더 참조(ladder reference). 패널 b: 함축된 구조를 가진 293S 세포에서 생산되는, 비처리된 GM-CSF의 DSA-FACE 프로파일. 293S 세포에서 생산되는 GM-CSF의 글리코실화는, 갈락토실화가 없는 다이안테너리, 트라이안테너리 및 테트라안테너리 푸코실화된 복합체 유형 N-글리칸으로 주로 구성된 불균질한 혼합물을 제공한다. 보다 낮은 전기영동적 이동성에서, 일부 갈락토실화된 구조가 관찰된다. 패널 c: 갈락토실화된 구조는 갈락토시다제 분해 시 스펙트럼으로부터 사라진다. 패널 d: 가장 높은 전기영동적 이동성에서 2개의 미미한 함축된 피크들은 만노시다제 분해 후 훨씬 더 높은 전기영동적 이동성을 가진 단일 피크로 수렴된다. 만노시다제 분해 후, 추가적인 주요 변화는 발생하지 않으며, 이는 말단 만노스 잔기가 거의 노출되지 않음을 가리킨다. 패널 e: 헥소사미니다제 처리 시 대부분의 함축된 피크들은 높은 전기영동적 이동성을 가진 2개의 피크로 시프트된다. 미미한 피크는 비-푸코실화된 코어 N-글리칸을 나타내며, 주요 피크는 푸코실화된 트라이만노실 코어 N-글리칸을 나타낸다. 패널 f: 본 발명자들은 대부분의 N-글리칸에 대한 코어 푸코실화를 관찰한다. 이는 글리칸의 푸코시다제 처리 후, 관찰된 피크들 중 많은 피크들이 보다 높은 전기영동적 이동성으로 시프트된 것에 의해 예시된다. 패널 g: 본 발명자들은 브로드-스펙트럼 시알리다제의 처리 시 글리칸 프로파일에서 임의의 주요 변화를 관찰하지 않았으며, 이는 293S 세포에서 생산되는 GM-CSF의 글리칸에 시알릴화가 존재하지 않음을 제시한다.
도 10. 293S 글리코삭제 세포 및 293S 세포에서 생산되는 hGM - CSF의 MALDI -TOF-MS 분석.
패널 1: 293S-생산되는 hGM-CSF. 많은 관찰된 불균일성은 대체로, 293S N-글리코실화의 가변성으로 인한 것이다. 패널 2: hGM-CSF 시알리다제 분해는 불균일성을 약간 감소시킨다. 패널 3: PNGase F를 사용하여 분해된 hGM-CSF는 크게 감소된 불균일성을 가지며, 이는 N-글리코실화가 분자량 불균일성의 주요 소스임을 나타낸다. 패널 4: 293S글리코삭제-생산되는 hGM-CSF는 크게 감소된 불균일성을 가진다. 패널 5: 293S글리코삭제-생산되는 hGM-CSF 상에서의 시알리다제 분해는 완전히 탈-N-글리코실화된 293S-생산되는 단백질과 유사하게 낮은 복합성 패턴을 나타낸다.
도 11. 293SGnTI -/- 세포 및 293S 글리코삭제 세포에서 생산되는 5HT1DR의 면역블로팅.
막 단백질 추출물에 PNGase F를 처리하면, 예상되는 바와 같이, 293SGnTI-/- 세포(1)에서 안정하게 생산되는 5HT1DR의 분자량(MW)이 크게 시프트함을 보여주었다. 이와는 대조적으로, 293S글리코삭제 세포(2)에서 생산되는 수용체는 PNGase F 처리 시 분자량을 시프트시키지 않았으며, 293SGnTI-/- 세포로부터의 탈글리코실화된(PNGase F 처리된) 수용체와 대략 동일한 분자량에서 진행되었다. 이는 293S 글리코삭제 세포에서 5HT1DR N-글리칸의 완전 제거와 일치한다.
도 12. 293S 세포 또는 293S 글리코삭제 세포에서 생산되는 항-CD20의 면역 블롯 분석.
동일한 방법을 사용한 일시적인 형질감염 시, 293S 야생형 세포 및 293S글리코삭제 세포의 배양 배지를 동일한 부피로 면역블로팅에 의해 분석하였다. 결과적으로, 블롯은 배양 배지 내 항-CD20 모노클로날 항체의 단백질 발현 수준을 보여준다. 재조합 단백질의 수율은 두 세포주 모두에서 유사하며, 이는 WT 293S 전구체로부터 글리코삭제 293 세포를 유도하는 데 사용되는 유전자 조정이 세포의 단백질 분비 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않음을 가리킨다.
도 13. 293S 세포에서 생산되는 항-CD20의 DSA -FACE 분석.
패널 a: 덱스트란 래더 참조(ladder reference). 패널 b: 함축된 구조를 가진 293S 세포에서 생산되는 비처리된 항-CD20의 DSA-FACE 프로파일. 293S 세포에서 생산되는 항-CD20의 글리코실화는 갈락토실화가 있거나 없는 코어-푸코실화된 다이안테너리 N-글리칸을 제공한다. 패널 c: 본 발명자들은 브로드-스펙트럼 시알리다제로 처리 시, 글리칸 프로파일의 임의의 주요 변화를 관찰하지 않았으며, 이는 293S 세포에서 생산되는 항-CD20의 글리칸에서 시알릴화의 부재를 제시한다. 패널 d: 갈락토실화된 구조는 갈락토시다제 분해 시 스펙트럼으로부터 사라진다. 단일 피크는 남아 있으며, 이는 비-갈락토실화된 코어-푸코실화된 다이안테너리 N-글리칸을 나타낸다. 패널 e: 본 발명자들은 모든 검출된 N-글리칸에 대해 코어 푸코실화를 관찰한다. 이는 글리칸의 푸코시다제 처리 후, 관찰된 피크의 보다 높은 전기영동적 이동성으로의 시프트에 의해 예시된다.
도 14. 글리코삭제 항-CD20의 기능적 특징화 및 면역학적 특징화 .
(a) 293S글리코삭제(Gl.Del) 세포 및 293S 세포로부터의 항-CD20의 SDS-PAGE. 좌측에서, "PNGase"는 PNGase 효소 밴드를 가리킨다. HC, 항체 중쇄; LC, 항체 경쇄; kDa, 킬로달톤. (b) 글리코삭제 항-CD20 당펩타이드의 SRM 방식에서 LC-MS/MS. 피크 표지는 LC 용출 시간(분)을 나타낸다. 삼당류, 이당류- 및 단당류-개질된 당펩타이드는 각각 적색, 청색 및 황색으로 도시되어 있다. 시알리다제 및 β-1,4-갈락토시다제를 사용한 엑소글리코시다제 분해물은 GM-CSF에서 관찰된 바와 동일한 글리칸을 예시한다. (c) 유세포분석에 의해 평가되는 바와 같은 항-CD20에 의한 CD20-결합(표 7). (d) 비처리된 항-CD20 또는 PNGase F-분해된 293S 및 293S글리코삭제 항-CD20에 대한 서모플루오르 분석법에서 확인되는 바와 같은 평균 용융 곡선(n = 3). (e) 항-CD20 Fc의 효과기 기능을 평가하기 위한 경쟁적 ELISA(상부의 3개) 및 ADCC 분석법(하부). 코팅된 항-Fc 항체와의 경쟁을 비교하는 293S 및 293S글리코삭제 항-CD20의 농도 시리즈. 오차 막대(ELISA), s.e.m.(n = 3). 오차 막대(ADCC), s.d., n = 3(표 8). (f) 293S글리코삭제 항-CD20으로 면역화된 토끼 혈청의 항-글리칸 항체 ELISA 분석. 글리코삭제 GM-CSF로 면역화된 토끼의 혈청에서 항체에 의한 항-CD20 인지의 분석. 항-CD20 샘플을 시알리다제, 시알리다제와 갈락토시다제로 처리하거나 효소로 처리하지 않았다. 오차 막대, s.d., n = 3(표 9). (g) 293S 또는 293S글리코삭제 항-CD20의 정맥내 주사 후, 시간 경과에 따라 측정된 항-CD20의 혈중 농도. 오차 막대, s.e.m., n = 4. 이 그래프에서 수치 데이터는 표 10에 있다.
도 15. 293S(좌측) 및 293S글리코삭제 (우측) 세포에서 생산되는 항-CD20 hIgG1의 LC-MS 분석.
열 A: 단일 N글리코실화 부위를 가진, 감소된 중쇄에 대한 디콘볼류션된(deconvoluted) ESI 스펙트럼. 293S-생산되는 항-CD20의 경우, 전형적인 코어-푸코실화된 아갈락토-, 모노- 및 바이갈락토실화된 바이안테너리 글리칸은 주된 화학종이며, 한편, 소량의 Man5Gn2 N-글리칸 또한 검출된다. 시알릴화는 거의 검출불가능하다. 293S글리코삭제 항-CD20의 경우, HexNAc-Asn, Hex-HexNAc-Asn 및 NeuNAc-Hex-HexNAc-Asn은 스펙트럼을 지배하는 한편, Man5Gn2가 소량 형성되기도 한다. 중요하게는, 비-N-글리코실화 관련 불균일성은 검출되지 않으며, 이는 HEK293 세포의 글리코삭제 조작이 다른 번역후 개질 경로의 예상치 못한 유도를 초래하지 않음을 뒷받침한다. 열 B: 경쇄는 N-글리코실화 부위를 가지지 않기 때문에, 글리코삭제 조작에 의해 영향을 받지 않았다. 열 C: 온전한, 비-감소된 항체에 대한 디콘볼류션된 질량 스펙트럼. 모든 화학종들은 두 중쇄 모두에 글리코형의 조합적 시리즈로서 해석될 수 있다. 두 항체 모두에서, S-S 가교의 수는 감소된 사슬과 조립된 항체 간의 질량차를 기준으로 12 내지 13으로서 계산된다.
도 16. 항-CD20의 크기 배제 크로마토그래피.
293S 항-CD20(청색 선) 및 293S글리코삭제 항-CD20(적색 선)의 크기 배제 크로마토그래피. 단량체성 피크만 검출되며, 이는 두 글리코형 모두에서 응집이 없음을 가리킨다.
도 17. 마우스에서 항-CD20 약물동력학 .
또한, 주요 텍스트의 보다 조기 시점에서의 후-주사(post-injection)를 포함하는 도 14에 도시된 실험과는 독립적인 실험실에서 실험을 반복한다. 혈액 내 피크 농도에 도달하기 전에 항-CD20은 덜 제거되며, 따라서 순환 수준이 증가된다. 후속적인 느린 청소율(주사 후 1 시간 초과)은 도 14에 보고된 실험에서 관찰된 바와 같이, 두 글리코형 모두에 대해 유사하다.
도 18. 글리코삭제에 의해 생산되는 에타네르셉트 Fc -사슬 글리칸 분석.
1회 진행 시 나타난 데이터는 3회 진행의 대표값이다.
정의
본 발명은 특정 실시 형태에 대해 그리고 소정의 도면을 참조로 기술될 것이지만, 본 발명은 이로 한정되는 것은 아니며 청구범위에 의해서만 한정된다. 청구범위에서 임의의 참조 기호는 그 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 기술되는 도면은 단지 도식적이며, 비-한정적이다. 도면에서, 요소들 중 일부의 크기는 과장될 수 있으며, 예시적인 목적을 위해 척도대로 도시되지는 않는다. 용어 "포함하는"이 본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 사용되는 경우, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 단수형로 지칭되는 경우, 이는 구체적으로 다르게 언급되지 않는 한, 복수형을 포함한다.
더욱이, 상세한 설명 및 청구범위에서 용어 제1, 제2, 제3 등은 유사 요소들을 구별하는 데 사용되며, 필수적으로 순차적인 순서 또는 연대적 순서를 기술하기 위한 것은 아니다. 그런 식으로 사용되는 용어들은 적절한 환경 하에 상호호환적이며, 본원에 기술되는 본 발명의 실시 형태는 본원에 기술 또는 예시되는 다른 순서로 작동될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
하기 용어 또는 정의는 오로지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공될 뿐이다. 본원에서 상세하게는 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 용어들은 본 발명의 분야의 당업자가 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 실행자들은 특히, 기술의 정의 및 용어에 대한 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)]를 참조한다. 본원에 제공되는 정의는 당업자에 의해 이해되는 것보다 좁은 범위를 가지는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "고등 진핵 세포"는 단세포 유기체 유래의 세포가 아닌 진핵 세포를 지칭한다. 즉, 고등 진핵 세포는 다세포 진핵 생물 유래의(또는 세포 배양물의 경우 배양물 유래의) 세포이다. 전형적으로, 고등 진핵 세포는 진균류 세포가 아닐 것이다. 보다 더 전형적으로, 고등 진핵 세포는 식물 세포 또는 진균류 세포가 아닐 것이다. 구체적으로, 용어는 동물 세포(또는 전형적으로 곤충 세포주 또는 포유류 세포주와 같은 세포주)를 지칭한다. 보다 구체적으로, 용어는 척추동물 세포, 보다 더 구체적으로 포유류 세포를 지칭한다. 본원에 기술되는 바와 같은 고등 진핵 세포는 전형적으로 세포 배양물(예를 들어, HEK 세포주 또는 CHO 세포주와 같은 세포주)의 일부일 것이며, 그렇더라도 이것이 항상 엄격하게 요구되는 것은 아니다(예를 들어, 식물 세포의 경우, 식물 자체가 단백질 생산에 사용될 수 있음).
본원에 사용되는 바와 같이, "엔도글루코사미니다제" 또는 "엔도글루코사미니다제 효소"는, 당단백질 또는 당지질의 올리고당류 내 비-종결적 β-연결된 N-아세틸글루코사민 잔기의 아노머적 탄소와 아글리콘(aglycon) 사이의 결합을 가수분해함으로써, 당단백질, 당지질 또는 당 중합체로부터 단당류 또는 올리고당류를 방출시키는 효소를 지칭한다. 엔도글루코사미니다제는 글리코시다제의 하위세트이며, 다른 효소적 활성(예, 글리코실트랜스퍼라제 활성)을 가질 수 있거나 가질 수 없다. 특정 부류의 엔도글루코사미니다제는 국제 생화학 분자생물학 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology; IUBMB) 명명법에서 EC 3.2.1.96으로서 표시된 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 또는 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제에 의해 형성된다. 이러한 특정 부류의 효소는 -[Man(GlcNAc)2]Asn- 구조를 함유하는 고-만노스 당펩타이드 및 당단백질에서, N,N'-다이아세틸키토비오실 단위의 내부가수분해(endohydrolysis)를 촉진할 수 있다. N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc) 잔기 하나가 단백질에 부착된 채로 남게 되며; 나머지 올리고당류는 온전한 상태로 방출된다. 따라서, 그 결과는 단일 GlcNAc-개질된 당단백질이다. 특히, 잔여 GlcNAc 잔기는 비개질된 채로 있을 수 있거나 가수분해된 결합 위치가 아닌 위치에서 다른 당 잔기들에 의해 여전히 개질될 수 있으며, 예를 들어, GlcNAc 잔기는 위치 3 또는 위치 6 상에 푸코스를 가질 수 있다. 그렇지만, 개질된 GlcNAc 잔기를 가진 당단백질은, GlcNAc 잔기의 위치 4에 제2 당 잔기가 없으므로(즉, 전형적인 당 사슬이 없음), 여전히 단일 GlcNAc-개질된 단백질로 지칭될 것이다. 엑소글리코시다제와 비교하여 엔도글루코사미니다제의 특이적인 이점은, N-연결된 글리칸과 O-연결된 글리칸을 구별할 수 있게 하고 글리칸 부류들을 구별할 수 있게 한다는 점이다. 엔도글루코사미니다제의 비-한정적인 목록이 본 출원에 제공된다.
본 출원에 사용되는 바와 같이, "Fc 함유 분자"는 Fc 영역을 함유하는 단백질 또는 융합 단백질을 지칭한다. Fc 영역(단편 결정화 영역)은, Fc 수용체로 명명되는 세포 표면 수용체 및 보체계의 일부 단백질과 상호작용하는 면역글로불린의 꼬리(tail) 영역이다. 특히 예상되는 실시 형태에 따르면, Fc 함유 분자에서 Fc 영역은 면역글로불린 G(IgG) 동형(isotype) 유래의 Fc 영역이다. 이는 IgG 하위부류(인간에서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 중 임의의 부류일 수 있다. IgA 동형 및 IgD 동형과 마찬가지로 IgG의 경우, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄들의 제2 불변 영역 및 제3 불변 영역으로부터 유래되는 2개의 동일한 단백질 단편들로 구성된다. IgG의 Fc 영역은 N297(Asn-297 또는 아스파라긴 297)로 표시되는 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 가진다. 본원에 사용되는 바와 같이, "Fc 함유 분자"는, 자연적으로 Fc 영역을 가지는 단백질(예를 들어, 면역글로불린), 또는 융합 단백질이나 분자 둘 다를 포함하며, 이때, Fc 영역은 단백질, 펩타이드 또는 다른 분자(특히, 결합 모이어티)에 융합된다. Fc 융합 단백질의 예는 예를 들어, 문헌[Huang, 2009]에 기술된 것들이다(그러나, 이로 한정되는 것은 아님). 특히, 그와 같이 Fc 분자는 또한 Fc 함유 분자이다. 특정 부류의 Fc 함유 분자는 항원에 결합할 수 있는 Fc 함유 분자이다. 예는 항체 또는 융합 단백질이며, 이때, Fc 영역은 결합 모이어티(예를 들어, 나노바디, Fab 영역, F(ab')2 영역)에 연결된다.
전형적으로, Fc 함유 분자의 Fc 부분은 인간 서열 또는 인간화된 서열일 것이며, 이는 Fc 영역의 아미노산 서열이 인간 Fc 서열과 적어도 95% 일치하거나, 특히 인간 Fc 서열과 적어도 99% 일치하거나, 가장 상세하게는 인간 Fc 서열과 100% 일치한다는 것을 의미한다. 그러나, 본 발명은 인간 서열에 한정되지 않는다. 예를 들어, Fc 영역은 마우스, 낙타과(camelid), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 개, 소, 기니아 피그, 양, 염소, 말, 래트, 토끼, 고양이 또는 임의의 다른 포유류들의 것일 수 있다. Fc 영역은 비-포유류 동물(예를 들어, 닭)로부터 유래된 것일 수도 있다. 이러한 경우, 당업자는, N-글리코실화 부위가 종들에 걸쳐 보존되는 한편, 정확한 위치는 상이할 수 있으며 항상 N297인 것은 아님을 이해할 것이다. 단순한 서열 정렬을 이용하여, 필요하다면 올바른 잔기가 확인될 수 있다.
"골지 위치화 신호"는 골지체에 컨쥬게이트되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 위치화 방향을 안내하는 분자, 전형적으로 펩타이드이다. 따라서, 위치화는 또한, 골지체에서의 체류를 수반한다. 전형적으로, 이들 위치화(또는 체류) 서열은, 기능적으로 성숙한 단백질로서 활성인 경우, 골지체에 위치되는 (예비)단백질 유래의 펩타이드 서열이다.
본원에 언급되는 글리칸 및 단당류는 종종 이들의 인지된 약어로 표시된다: 예를 들어, β-D-글루코스: Glc, β-D-만노스: Man, β-D-갈락토스: Gal, β-D-N-아세틸글루코사민: GlcNAc, β-D-N-아세틸갈락토사민: GalNAc, 시알산(Sia)으로도 알려져 있는 α-N-아세틸뉴라민산: NeuNAc, α-L-푸코스: Fuc, 및 헥소스: Hex.
본 발명은, Fc 함유 분자가 추가적인 용도, 예를 들어 치료 용도에 보다 알맞으며 보다 용이하게 생물제작되도록 변경된 글리코실화 패턴, 특히 보다 균질한 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자를 생산하는 고등 진핵 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
제1 측면에 따르면, 이는 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열을 가진 고등 진핵 세포, 특히 동물 세포를 제공함으로써 달성된다.
특정 실시 형태에 따르면, 고등 진핵 세포는 복합체 유형 당을 합성하는 데 있어서 결함이 있도록 당-조작된다(하이브리드 유형 글리칸을 합성하는 데 있어서 결함이 있도록 조작될 수 있거나 조작되지 않을 수 있음). 보다 상세하게, 고등 진핵 세포는 단지 고-만노스 N-글리칸을 생산할 수 있는 고등 진핵 세포이다. 이는 예를 들어, 세포를 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 1 활성이 결핍되도록 만듦으로써 달성될 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, MGAT1 유전자(유전자 ID: 인간에서 4245)에 의해 인코딩되는 글리코실트랜스퍼라제 GnTI은 세포에서 불활성화된다.
이에, 부가적으로는 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열을 가진 것을 특징으로 하며, 복합체 유형 N-글리칸 또는 하이브리드 유형 N-글리칸을 합성할 수 없는 고등 진핵 세포가 제공된다. 예를 들어, 부가적으로는 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 1 활성이 결핍된 고등 진핵 세포가 제공된다.
고등 진핵 세포는 임의의 고등 진핵 유기체일 수 있으나, 특정 실시 형태에서, 포유류 세포가 예상된다. 사용되는 세포의 성질은 전형적으로, 요망되는 글리코실화 특성 및/또는 당단백질의 생산 용이성과 비용에 따라 다를 것이다. 포유류 세포는 예를 들어, 면역원성으로 인한 문제를 피하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 생산을 위한 고등 진핵 세포주는 당업계에 잘 알려져 있으며, 글리코실화 경로가 개질된 세포주를 포함한다. 후속적인 단리 및/또는 정제용 단백질의 배양, 발현 및 생산에 적합한 동물 숙주 세포 또는 포유류 숙주 세포의 비-제한적인 예로는, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 예컨대 CHO-K1(ATCC CCL-61), DG44(문헌[Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556]; 및 문헌[Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909]), CHO-K1 Tet-On 세포주(Clontech), ECACC 85050302로 지정된 CHO(CAMR, 영국 윌트셔 솔즈베리), CHO 클론 13(GEIMG, 이탈리아 제노바(Genova, IT)), CHO 클론 B(GEIMG, 이탈리아 제노바), ECACC 93061607로 지정된 CHO-K1/SF(CAMR, 영국 윌트셔 솔즈베리), ECACC 92052129로 지정된 RR-CHOK1(CAMR, 영국 윌트셔 솔즈베리), 다이하이드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포(CHO/-DHFR, 문헌[Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216]) 및 dp12.CHO 세포(미국 특허 제5,721,121호); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 293 세포 또는 293T 세포, 현탁 배양으로 성장시키기 위해 서브클로닝한 293 세포, 문헌[Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 어린 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL-10); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 문헌[Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251]); 인간 경부암종 세포(HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL-75); 인간 간암종 세포(HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포(문헌[Mather, 1982, Annals NYAcad. Sci., 383:44-68]); MCR 5 세포; FS4 세포를 포함한다. 특정 실시 형태에 따르면, 세포는 CHO 세포, Hek293 세포 또는 COS 세포로부터 선택되는 포유류 세포이다. 추가적인 특정 실시 형태에 따르면, 포유류 세포는 CHO 세포 및 Hek293 세포로부터 선택된다.
특히, 고등 진핵 세포에 의해 생산되는 엔도글루코사미니다제 효소는 세포에서 생산되는 Fc 함유 분자에 작용할 것이며, N-글리코실화를 없앨 것으로 예상된다. 특정 실시 형태에 따르면, 제1 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩되는 엔도글루코사미니다제 효소는 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제이며, 즉, 이는 IUBMB 명명법에서 E.C. 3.2.1.96의 활성을 가지며, 이것이 단백질 상에 하나의 GlcNAc 잔기를 남겨두면서 당 사슬을 제거할 수 있음을 내포한다(중요하게는, 이는 또한, 보편적인 코어 오당류인 Man3GlcNAc2에 작용함). 다른 실시 형태에 따르면, 제1 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩되는 엔도글루코사미니다제는 상이한 유형의 글리코실화 구조들에 대해 상이한 친화성을 가진다. 후자의 전형적인 예는 하이브리드 유형 당 및/또는 고-만노스 당은 가수분해할 수 있지만 복합체 유형 글리칸은 절단하지 못하는 엔도글루코사미니다제이다. 추가적인 특정 실시 형태에 따르면, 엔도글루코사미니다제는 상이한 유형의 글리코실화 구조들에 대해 상이한 친화성을 가진 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제이다. 다른 추가적인 특정 실시 형태에 따르면, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 하이브리드 유형 당 및/또는 고-만노스 당은 절단할 수 있지만, 복합체 유형 글리칸은 절단하지 못한다. 보다 더 구체적인 실시 형태에 따르면, 엔도글루코사미니다제는 엔도 H 또는 엔도 T이다. 가장 구체적인 실시 형태에 따르면, 엔도글루코사미니다제는 엔도 T이다.
엔도글루코사미니다제가 Fc-함유 단백질의 당 사슬을 효과적으로 제거하는 것을 보장하기 위해, 엔도글루코사미니다제는 세포 내에 잔존할 뿐만 아니라 완전히 활성인 것으로 예상된다. 이의 활성은 요망되는 가수분해가 발생하도록 보장하기 위해 시공간적으로 조절되어야 한다. 따라서, 특정 실시 형태에 따르면, 엔도글루코사미니다제 효소의 발현은 골지체로 표적화된다. 이는 엔도글루코사미니다제를 골지 위치화 신호에 작동적으로 연결함으로써 달성될 수 있다. 이러한 신호는 엔도글루코사미니다제를 골지체로 향하게 하며, 이때, 이 효소가 유지된다. 단백질의 글리코실화가 수행되는 세포내 위치인 골지체는 ER 다음에 존재하기 때문에, 이 세포소기관을 표적으로 하는 것은, 엔도글루코사미니다제가 당단백질의 글리코실화를 변경하기 위해 올바른 세포내 위치에 있도록 보장한다.
고등 진핵 세포가 복잡한 글리코실화에 필요한 추가적인 효소를 가지며 이 효소 또한 골지체 분비 경로에 존재하기 때문에, 이는 특히, 추가적인 글리코실화를 조절하는 데 유익하다. 사실상, 엔도글루코사미니다제들은 이들 효소가 Fc 함유 분자에 대해 협조적으로 작동하는 방식으로, 표적화될 수 있다. 고등 진핵 세포에서, ER 및 골지체의 루미날 표면은, 당단백질이 ER로부터 골지체 네트워크를 통해 배지 내로 이동(proceed)됨에 따라, 이들 당단백질이 순차적으로 가공될 수 있게 하는 촉매적 표면을 제공한다. 당단백질(예컨대, Fc 함유 분자)이 ER로부터 분비 경로를 통해 이동됨에 따라, 이 당단백질은 상이한 만노시다제와 글리코실트랜스퍼라제에 순차적으로 노출된다. 일부 N-글리코실화 효소는 이전의 효소에 의해 생산되는 특정 기질에 따라 다르기 때문에 몇몇 가공 단계들은 이전의 반응들에 의존한다. 따라서, N-글리코실화 효소, 특히 엔도글루코사미니다제와 같은 외인성 효소는 특이적인 N-글리칸 구조가 합성될 수 있게 하는 예정된 순서로 배열되어야 한다.
그러나, 본원에 기술되는 세포는 특히, 올바른 글리코실화 패턴을 갖는 요망되는 Fc 함유 분자를 생산하는 데 유용한 한편, 당업자는 시험관내에서 (예를 들어, 생산되는(선택적으로 탈글리코실화되는) 단백질에서의 효소적 커플링에 의해) 요망되는 당 프로파일의 전부 또는 일부를 합성적으로 생산 및 부가할 수 있음을 염두에 두어야 한다.
분비 경로의 순차적인 가공 환경을 구축하는 것은 N-글리코실화 효소의 적절한 위치화를 필요로 한다. 분비되는 단백질이 분비 경로(ER로부터 골지체의 시스면, 중간면 구획 및 트랜스면 구획을 거쳐 배지 내로)를 통해 수송될 수 있는 메커니즘은 심도있는 연구 주제가 되어 왔으며, 한편 각각의 구획은 체류하는(예, N-글리코실화) 효소의 특정 세트를 유지한다. 단백질을 분비 경로의 다양한 구획들에 위치시키는 2가지 잘-구축된 메커니즘은 회수(retrieval) 및 체류이다(문헌[van Vliet et al., PBMB 1 2003; Teasdale et al., 27 1996]).
회수는 단백질이 다른 단백질과의 상호작용을 통해 소정의 세포소기관에 위치화되는 과정이다. 몇몇 ER-잔류 단백질은 컨센서스(consensus) 서열 KDEL(서열번호 23)(또는 효모에서는 HDEL(서열번호 24))을 가진 카르복시-종결 테트라펩타이드를 함유하며, 이 서열은 ER로의 효율적인 위치화에 필요한 것으로 나타나 있다.
몇몇 ER-잔류 효소 및 골지체-체류 효소는 유형 II 막 단백질이다. 이들 단백질은 아미노 말단의 짧은 세포질 꼬리, 소수성 막관통 도메인, 루미날 줄기(stem) 및 C-말단 촉매적 도메인을 포함하는 보편적인 도메인 구조를 가진다. 삭제 연구뿐만 아니라 비-골지체-체류 단백질에의 융합을 통해 N-말단, 특히 막관통 영역이 많은 유형 II 막 단백질들의 표적화 정보를 함유하고 있는 것으로 확인하였다. N-말단 도메인이 표적화에 관여함이 분명하긴 하지만, 이들의 표적화 능력이 상이한 종들 사이에서 전이가능한(transferable) 범위는 아직 완전히 분명하지 않다. 그렇지만, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 ER 및 골지체에 자연적으로 위치화되는 단백질과 연관된 펩타이드를 인코딩하는 알려진 유형 II 막 단백질 도메인의 유전적 라이브러리 디자인과 같은 상당한 진전들이 이루어져 왔으며(문헌[Choi et al., 5022 2003; Hamilton et al.; Science 1244]), 이는 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 Sec12(ER 위치화), MNN2(골지체 위치화) 및 MNN9(골지체 위치화) 유래의 리더(leader) 서열의 적합성을 확인시켜 준다. WO02/000879의 표 5에 열거된 서열은 ER 위치화를 위한 HDEL 및 Mnsl 유래의 리더 서열, Och1 및 Mnt1(골지체-시스면 위치화), Mnn2(골지체-중간면 위치화), Mnn1(골지체-트랜스면 위치화), α-2,6-시알릴트랜스퍼라제(트랜스 골지체 네트워크) 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 I(골지체 위치화) 유래의 리더 서열을 포함한다.
따라서, 위치화 신호는 당업계에 잘 알려져 있으며 신호의 기능을 위해 ER 또는 골지체에 정상적으로 위치하는 단백질로부터 유래될 수 있다. 더욱이, 하나의 유기체 유래의 위치화 서열은 다른 유기체들에서도 작동할 수 있다. 예를 들어, 래트의 트랜스 골지체에 위치하는 것으로 알려진 효소인 래트 유래의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 막 스패닝(spanning) 영역은 효모의 골지체에서 리포터 유전자(인버타제(invertase))도 위치시키는 것으로 나타났다(문헌[Schwientek, et al., 1995]). Schwientek와 동료들은 또한, 효모의 만노실트랜스퍼라제(Mnt1)의 28개 아미노산, N-말단 세포질 꼬리를 함유하는 영역, 막관통 영역 및 줄기 영역의 8개 아미노산을 인간 GalT의 촉매적 도메인에 융합하는 것이 활성 GalT의 골지체 위치화에 충분하다고 보여준 바 있다(문헌[Schwientek et al. 1995 J. Biol. Chem. 270 (10): 5483-5489]). 다른 충분히-입증된 모티프(motif)는 ER에서의 체류를 위한 KDEL 및 HDEL 모티프이다. 특정 실시 형태에 따르면, ER 위치화 신호 또는 골지 위치화 신호는 기능적으로 활성일 때, 그 자체가 ER 또는 골지체에 위치화되는 단백질로부터 유래된다. 이러한 단백질의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애 다이펩티딜 아미노펩티다제 A(Ste13p), 인간 β-갈락토사이드-α-2,6-시알릴트랜스퍼라제(ST6GalI) 및 인간 강글리오사이드-GM2-신타제(synthase)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 추가적인 실시 형태에 따르면, 위치화 서열은 하기 단백질들 중 하나로부터 유래된다: Ste13p, GL2-신타제, 강글리오사이드-GM2-신타제 및 α-2,6-글리코실트랜스퍼라제, 특히 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제, 가장 상세하게는 β-갈락토사이드-α-2,6-시알릴트랜스퍼라제.
중요하게는, 골지체는 균질한 영역을 단지 하나만 포함하는 것이 아니라, 5개의 기능적 영역을 가진다: 시스-골지체 네트워크, 시스-골지체, 중간-골지체, 트랜스-골지체 및 트랜스-골지체 네트워크. 소포체로부터 나오는 소낭은 (소낭-세관 클러스터(vesicular-tubular cluster)를 통해) 시스-골지체 네트워크와 융합하고, 후속적으로 시스터나 무더기를 통해 이동하여 골지체를 트랜스-골지체 네트워크로 만들고, 이때 이들은 포장된 다음, 필요한 도착지(destination)로 수송된다. 각각의 영역은, 예를 들어 내용물이 체류하도록 결정된 장소에 따라, 이들 내용물을 선별적으로 개질시키는 상이한 효소를 함유한다. 따라서, 세포 내에서 엔도글루코사미니다제의 정확한 표적화에 따라, 글리코실화 경로는 상이한 방식들로 변경될 수 있다.
엔도글루코사미니다제는 나중에 골지체에서 표적화되어, 비정상적으로 글리코실화된 단백질을 "생체내에서 제거"하는 한편, 특히 예상되는 변경은 골지체 글리코실화 경로의 보다 조기 단계에서 엔도글루코사미니다제를 표적화하는 것이며, 하나 이상의 글리코실트랜스퍼라제(외인성 글리코실트랜스퍼라제 또한 예상되기는 하지만, 전형적으로 고등 진핵 세포의 경우 내인성 글리코실트랜스퍼라제)는 더 다운스트림에서 활성적이다. 이러한 방식에서 (예를 들어, 단일 GlcNAc-개질된 Fc 함유 분자의) 일정한 글리코집단(glycopopulation)은 글리코실트랜스퍼라제에 대한 기질로서 제시된다. 이로써, 글리코실화된 Fc 함유 분자의 균일한 집단이 생기게 된다. 이러한 균일한 글리코집단은 특히, 비-자연 발생적인 글리코형의 균일한 집단일 수 있으며, 전형적인 엔도글루코사미니다제 또한, 천연 글리코구조에 전형적인 Man3GlcNAc2 코어 구조를 제거할 것임에 주목한다. 그러나, 이러한 구조는 종종 식물, 효모 또는 곤충 세포에서 생산되는 특이적인 글리칸보다 포유류에서 면역원성이 더 낮다. 실시예 부문에 나타난 바와 같이, 특히 예상되는 표적화는 골지체에서의 표적화로서, 예를 들어, 엔도글루코사미니다제를 트랜스-골지체에 표적화함으로써 내인성 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제가 단백질에 순차적으로 작동하게 된다. 이들 효소의 순차적인 작동은 생산되는 Fc 함유 분자 상에 삼당류 구조를 제공하며: GlcNAc는 글리코실화된 아스파라긴 잔기에 가장 근접하게 되고, Gal 모이어티에 커플링되며, NeuNAc(시알산) 모이어티에서 종결된다.
본원에 기술된 세포에 의해 생산되는 Fc 함유 분자는 전형적으로, 쉽게 회수되어야 한다. 이는 특히, Fc 함유 분자의 분비에 의해 달성될 것이다. 이는 자발적으로 일어나거나, 분비 신호의 첨가에 의해 일어날 수 있다. 분비 신호의 성질은 전형적으로, 분비되는 단백질이 아니라 사용되는 고등 진핵 세포의 유형에 따라 다를 것이다. 분비 신호가, 사용되는 세포 유형에서 이 신호가 기능적인 한(즉, 신호가 융합되는 단백질 또는 펩타이드의 세포외 환경에의 분비를 유발하는 한), 이러한 특색은 본 발명에 중요하지 않다. 따라서, 다른 유기체로부터 유래되는 분비 신호는, 사용되는 고등 진핵 세포에서 이들 신호가 분비를 유발하는 한 사용될 수 있다. 분비 신호는 당업계에 잘 알려져 있으며, 분비되는 단백질(전형적으로, 단백질의 N-말단)로부터 유래될 수 있거나, 합성에 의해 생산될 수 있다(예, 문헌[Tan et al., Protein engineering 2002, vol. 15, no4, pp. 337-345]). 다른 예로, 이들은 컴퓨터적 방법을 사용하여 게놈 서열로부터 유래될 수 있다(문헌[Klee et al., BMC Bioinformatics 2005, 6:256]). 또한, 박테리아의 분비 신호가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 신호 펩타이드의 추가적인 예는 WO2002/048187(진핵 세포), Schaaf 등(문헌[BMC Biotechnol. 2005; 5: 30])(이끼(moss) 세포), EP549062에 기술되어 있다.
생산되는 Fc 함유 분자의 글리코실화 상태는 사용되는 세포 시스템(예를 들어, 어떤 효소가 거기에 존재하는지) 및 엔도글루코사미니다제의 특이성 둘 다에 따라 다를 것이다. 더욱이, 이들 효소가 작용하는 시간 및 장소(예를 들어, 어떤 효소가 ER → 골지체 경로에서 처음 작용하는지) 또한 중요하다. 이들 세포에서 생산되는 Fc 함유 분자는 생산 후에, 예를 들어 글리코실트랜스퍼라제를 사용한 처리에 의해 추가로 개질되어 요망되는 글리칸 모이어티를 가진 단백질이 수득될 수 있다. 그러나, 특히 특이적인 글리칸 모이어티를 가진 Fc 함유 분자, 즉, GlcNAc-Gal-NeuNAc 삼당류 구조(Fc 함유 분자의 아스파라긴 잔기, 특히 IgG Fc 함유 분자의 N297 잔기에 결합된 GlcNAc)를 가진 Fc 함유 분자를 생산할 수 있는 세포를 사용하는 것이 예상된다. 전형적으로, 이는, 외인성 Fc 함유 분자 상에서 복합체 당을 합성하는 능력을 (예를 들어, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 1 활성을 없앰으로써) 없애고, 외인성 엔도글루코사미니다제를 이것이 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제 이전에 작용하는 골지체 네트워크로 표적화함으로써 달성된다. 이는 이러한 특이적인 당 프로파일을 가진 Fc 함유 분자가 유익한 특성을 가지기 때문에, 생산 후 추가적인 글리코실트랜스퍼라제 처리의 필요성을 없앤다: 본원에서 이러한 특이적인 당 구조를 가진 분자는 비-면역원성이며, 생체내에서 긴 순환 반감기를 가지는 것으로 나타나 있다. 이는 한편으로는, 단순한 글리코실화 경로에 의해 글리칸 프로파일에서 불균일성이 훨씬 감소된 단백질 풀을 제공한다.
따라서, 본원에 기술되는 고등 진핵 세포는 특히 Fc 함유 분자의 생산에 잘 맞춰진다. 이들 세포에서 생산되는 Fc 함유 분자는 본 발명의 범위에 속하는 것으로 예상된다.
따라서, 특정 실시 형태에 따르면, 고등 진핵 세포에서 생산함으로써 수득가능한 Fc 함유 분자가 제공되며, 이 세포는 하기를 포함한다:
엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열;
Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열.
추가적인 특정 실시 형태에 따르면, 엔도글루코사미니다제 효소는 (예를 들어, 이 효소를 골지 위치화 신호에 작동적으로 연결시킴으로써) 골지체로 표적화된다. 다른 비-배제적인 실시 형태에 따르면, 고등 진핵 세포는 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제의 발현을 유지하는 한편 복합체 유형 글리코실화는 할 수 없도록 당-조작된다. 특정 실시 형태에 따르면, 복합체 유형 글리코실화를 할 수 없게 하는 당-조작은 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 1의 저해 또는 녹다운을 수반한다.
이들 세포에서 생산함으로써 수득가능한 Fc 함유 분자는 엔도글루코사미니다제 없이 (복잡한 글리코실화 능력을 가진) 고등 진핵 세포에서 생산되는 것과 비교하여 보다 균질한 글리칸 프로파일을 가진 Fc 함유 분자이다. 그러나, 가장 흔하게는, 불완전하게 글리코실화된 Fc 함유 분자 또한 생산될 것이기 때문에 모든 분자들이 정확하게 동일한 삼당류 당 사슬을 가지지는 않을 것이다. 이들 형태는 단일 GlcNAc 모이어티 또는 이당류 Gal-GlcNAc(GlcNAc가 Fc 영역의 아스파라긴에 연결됨)를 가진다. 그러나, 본원에 기술된 삼당류, 이당류 또는 단당류 구조를 가진 동일한 Fc 함유 분자의 이러한 집단 또한 유익한 효과를 보여준다. 따라서, 이들 세포에서 생산함으로써 수득가능한 복수의 Fc 함유 분자들이 또한 예상된다.
이들 분자의 유익한 특성은 본원에 기술된 세포에서 생산되는 분자들로 한정되지 않는다. 실시예 부문에 나타난 바와 같이, 특성들(특히, 보다 긴 순환 반감기)은 순전히 특이적인 글리코실화 패턴에 의해 판명된다. 즉, 시험관내에서 (예를 들어, 엔도글루코사미니다제 및/또는 글리코실트랜스퍼라제의 처리에 의해) Fc 함유 분자 상에서 부분적으로 또는 전체적으로 합성되는 동일한 글리코실화 구조를 가진 Fc 함유 분자는 본원에 기술된 세포에서 완전히 생산되는 것과 동일한 특성을 가질 것이다.
따라서, 본 발명은 Fc 부분에서 아스파라긴의 글리코실화가 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc(각각은 아스파라긴에 연결된 HexNAc를 가짐)로부터 선택되는 글리칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, Fc 함유 분자를 제공한다. 보다 상세하게는, 글리코실화는 삼당류 구조 및 이당류 구조로부터 선택될 것이다. 가장 상세하게는, 글리코실화는 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc일 것이다.
3가지 상이한 글리코실화 패턴들을 가진 이들 Fc 함유 분자의 풀 또한 시험관내에서 유익한 특성을 나타내기 때문에, Fc 부분에서 아스파라긴의 글리코실화가 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc(각각은 아스파라긴에 연결된 HexNAc를 가짐)로부터 선택되는 글리칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 복수의 동일한 Fc 함유 분자들이 제공된다. 특히, 복수의 Fc 함유 분자들의 적어도 일부는 삼당류 구조 및 이당류 구조로부터 선택되는 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 가장 상세하게는, 복수의 Fc 함유 분자들의 적어도 일부는 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc인 글리코실화를 가질 것이다.
특히 예상되는 HexNAc 모이어티는 GlcNAc 모이어티이다. 특히 예상되는 Hex 모이어티는 Gal 모이어티이다. 따라서, 특히 상기 이당류 및 삼당류에서 Hex-HexNAc 모이어티는 Gal-GlcNAc 모이어티이다. 가장 상세하게는 삼당류 Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc 및 상응하는 이당류 Gal-β-1,4-GlcNAc가 예상된다.
특히 예상되는 Fc 함유 분자는 면역글로불린G(IgG) 유래의 Fc를 함유하는 분자이다. IgG Fc 함유 분자들은 모두 인간 IgG에서 N297로서 표시된 하나의 보존된 아스파라긴 글리코실화 부위를 가진다. 따라서, 본원에 기술된 IgG Fc 함유 분자는 해당 N297 잔기 상에서 특이적인 글리코실화 패턴을 특징으로 한다.
대부분의 (치료용) 항체는 Fab 영역에 글리코실화 부위를 가지지 않는다. 마찬가지로, 대부분의 Fc 융합 단백질 또한 추가적인 글리코실화 부위를 가지지 않는다. 특히, Fc 영역의 글리코실화가 Fc 함유 분자에 존재하는 유일한 글리코실화인 것으로 예상된다. 가장 상세하게는, IgG Fc 함유 분자의 N297 상의 글리코실화가 Fc 함유 분자에 존재하는 유일한 글리코실화인 것으로 예상된다. 이는, (Fc 부분의) 글리코실화의 개질이 비-Fc 부분의 상호작용(예를 들어, 항원과 Fab 영역의 결합)을 방해하지 않음을 보장할 것이다.
특정 실시 형태에 따르면, Fc 함유 분자는 항원에 결합하는 항체 또는 Fc 융합 단백질이다. 추가적인 특정 실시 형태에 따르면, Fc 함유 분자는 항체, 가장 상세하게는 IgG이다. 이는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 하나일 수 있지만; IgG1 항체 및 IgG2 항체가 가장 일반적이다.
존재하는 Fc 함유 분자의 특이적인 글리코실화에 관해 논의하는 경우, 이들 3개의 당 분자는 Fc 함유 분자 상에 존재하는 유일한 당 분자임을 실현하는 것이 중요하다. 즉, 이들 Fc 함유 분자는 코어 Man3GlcNAc2 모이어티를 가지지 않는다. 이는 선행 기술과의 중요한 차이이다. 사실상, Gal-Sial 구조의 안정성 또한 연구되었으나, 코어 Man3GlcNAc2 모이어티에 부착된 경우만 분기화된(bifurcated) 글리칸(즉, 2개의 Gal-Sial 안테나가 존재함)으로서 연구되었다. 더욱이, 코어 Man3GlcNAc2에 고정된 이들 구조는 반감기를 연장하는 것으로 보고된 바가 없지만, 이와는 대조적으로 이들은 프로테아제에 더 민감하다(문헌[Raju et al., Biotechnol Prog. 2007; 23(4):964-71)]). 이는 본 발명의 비-분기화된 삼당류 구조에서 관찰된 놀라운 효과를 더욱 강조한다.
Fc 함유 분자가 치료제로서 가장 빈번하게 사용되고, 본원에 제시되는 특이적인 글리코실화를 가진 Fc 함유 분자가 항원 특이성이 변경되지 않은 채 더 긴 반감기를 가진다는 것을 고려하면(즉, 항원에 결합하는 Fc 함유 분자, 예컨대 모든 항체들 및 대부분의 Fc 융합 단백질에 대해), 본 발명의 분자가 의약에 사용하기에 잘 적합화된다.
이에, 본원에 기술된 바와 같이 고등 진핵 세포에서 생산함으로써 수득 가능한 Fc 함유 분자는 약제로서 사용하기 위해 제공된다. 또한, Fc 부분에서 아스파라긴의 글리코실화를 가지는 것을 특징으로 하는 Fc 함유 분자는 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc(각각은 아스파라긴에 연결된 HexNAc를 가짐)로부터 선택되는 글리칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하며, 본원에 기술된 바와 같이 약제로서 사용하기 위해 제공된다.
이들 분자는 당업자가 통상 Fc 함유 분자, 특히 항원에 결합하는 Fc 함유 분자를 사용할 임의의 장애에 사용될 수 있다. 이들이 항원에 대한 결합 친화성을 이들의 비-글리코실화 개질된 대응물과 동일한 수준으로 가지기 때문에, 이들은 동일한 이용가능성을 가진다. 특히, Fcγ 수용체에의 결합이 특이적인 글리코실화 패턴에 의해 감소되기 때문에, 이들은 Fcγ 수용체의 결합이 중요한 질병을 치료하는 데 덜 적합할 수 있다(예를 들어, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)은 Fcγ 수용체에 의해 매개되는 것으로 생각되며, 따라서 본 발명의 분자는 이러한 반응을 유도하는 데 덜 적합화되는 경향이 있음). 한편, 이들은 Fcγ 수용체 결합이 중요하지 않거나 심지어 바람직하지 않는 질병을 치료하는 데 더 적합할 수 있다. 사실상, 세포-표면 분자, 특히 면역 세포 상의 분자를 표적으로 하는 항체의 경우, 효과기 기능을 없애는 것이 필요하다. Fcγ 수용체 결합이 없어지는 것은, 예를 들어, 인간 혈소판 동종항원-1a에 대한 태아-모체간 동종면역법의 치료(문헌[Armour et al., Eur J Immunol. 1999; 29(8):2613-24]; 문헌[Ghevaert et al., J Clin Invest. 2008;118(8):2929-38]), 자가면역 질병 또는 이식 거부 치료(문헌[Reddy et al., J Immunol. 2000; 164(4):1925-33]), 장기간 작용하는 에리트로포이에틴 Fc 융합 단백질의 생산(문헌[Yang et al., Arch Pharm Res. 2012; 35(5):757-9])에 유용한 것으로 판명되었으며, 본 발명의 분자는 특히 이들 장애의 치료를 위해 잘 적합화되는 것으로 예상된다. 즉, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 Fc 함유 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이들 대상체에서 이들 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
Fc 함유 분자는 또한 특히 Fc 함유 분자의 순환 반감기가 보다 긴 것이 바람직한 장애, 즉, Fc 함유 분자의 반복된 투여가 치료법으로서 사용되는 임의의 장애에 적합화된다. 이러한 치료법의 하나의 특정한 예는 항체 생산 능력이 감소 또는 상실된 면역 결핍 환자를 위한 IVIG: 정맥내 면역글로불린, 혈장 단백질 교체 치료법(IgG)이다. 이 치료법은 면역 결핍증, 후천적 불응 면역 질환, 자가면역 질병, 염증성 질병 및 급성 감염에 사용된다.
따라서, 본원에 기술된 Fc 함유 분자(특히, 본원에 기술된 바와 같은 IgG 분자)는 정맥내 면역글로불린치료법에 사용하기 위해 제공된다. 이는 즉, 본원에 기술된 바와 같은 Fc 함유 분자(IgG 분자)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 정맥내 면역글로불린치료법이 필요한 대상체를 치료하는 방법에 상응한다.
특히, Fc 함유 분자의 반감기를 연장하는 표준 방식은 FcRn 수용체에 대한 Fc 함유 분자의 친화성을 증가시키는 것이다(예를 들어, Xencor 사에 의한 Xtend 기술). Fc 함유 분자의 반감기를 연장하는 본 발명의 방식은 FcRn 결합과는 무관하기 때문에, 기술은 반감기를 더욱 더 증가시키는 것과 양립하는 경향이 있다.
본원에 기술된 진핵 세포는 특히, 당단백질 생산에 잘 적합화된다. 특정 실시 형태에 따르면, 당단백질은 특이적인 글리코형, 특히 삼당류 Neu5Ac-Hex-HexNAc-개질된 당단백질에 대해 농화(enriched)된다. 따라서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 고등 진핵 세포에서 Fc 함유 분자의 아스파라긴 잔기 상에 특이적인 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자를 생산하는 방법을 제공한다:
엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열(이때, 엔도글루코사미니다제는 골지 위치화 신호에 작동적으로 연결됨) 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열을 포함하는 고등 진핵 세포를, 엔도글루코사미니다제 효소 및 Fc 함유 분자를 발현시키기에 적합한 조건에서 제공하는 단계; 및
Fc 함유 분자가 엔도글루코사미니다제와 세포내 접촉된 후에, Fc 함유 분자를 회수하는 단계.
세포 및 Fc 함유 분자에 대한 동일한 고려사항들이 상기 기술된 바와 같이 적용된다. 특정 측면에 따르면, 단일 GlcNAc 잔기로 개질되며, 엔도글루코사미니다제와 접촉된 후 수득되는 단백질은 유일한 중간산물이다. 이러한 측면에 따른 방법은 적어도 하나의 부가적인 트랜스글리코실화 단계를 포함할 것이다. 이러한 트랜스글리코실화는 (첨가되는 효소를 통해, 또는 세포에 의해서도 생산되는 효소를 통해서) 세포외에서 수행될 수 있긴 하지만, 특히, 트랜스글리코실화는 고등 진핵 세포에 의해 발현되는 글리코실트랜스퍼라제에 의해 세포내에서 수행되는 것으로 예상된다. 이들 실시 형태에 따르면, 당단백질의 최종 회수 전에, 본 방법은 효소가 세포내에서 엔도글루코사미니다제와 접촉된 후에 이 효소를 하나 이상의 글리코실트랜스퍼라제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 당업자는 엔도글루코사미니다제 효소와 하나 이상의 글리코실트랜스퍼라제 효소 둘 다 (ER 또는) 골지체로 표적화되는 경우, 엔도글루코사미니다제 활성 후에 글리코실트랜스퍼라제 활성이 발생하도록 하는 것임을 이해할 것이다. 전형적으로, 이는 단백질이 ER → 골지체 경로를 따르는 고정된 순서가 있기 때문에, 효소 둘 다를 ER 또는 골지체의 상이한 구획들로 표적화함으로써 보장될 수 있다. 효소 둘 다 동일한 구획으로 표적화되는 경우, 또는 두 활성 다 동일한 효소에 의해 수행되는 경우, 트랜스글리코실화 단계 후의 단백질이 더 이상 엔도글루코사미니다제 효소에 대한 기질로서 인지되지 않음이 전형적으로 보장될 것이다. 따라서, 시간상에서의 효소적 활성의 분리는 또한 효소의 공간적 분리 및/또는 상이한 기질 특이성 및/또는 불활성화를 포함할 수 있다.
글리코실트랜스퍼라제는 외인성 서열에 의해 인코딩될 수 있거나, 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열을 가진 세포에서 내인성인 효소일 수 있다.
특히, Fc 함유 분자가 분비되어, 용이한 회수를 가능하게 하는 것으로 예상된다.
본원에 기술된 Fc 함유 분자의 특정 부류는 항원에 결합하는 Fc 함유 분자(전형적으로 항체, 또는 Fc 영역이 결합 모이어티에 융합된 Fc 융합 단백질)이다. 이들 분자는 항원 결합 활성을 유지하며 비-개질된 글리코형과 비교하여 생체내에서 증가된 순환 시간을 가진다.
이에, 추가적인 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 항원 결합을 변경시키지 않으면서, Fc 함유 분자를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 항원에 결합하는 Fc 함유 분자의 순환 시간을 증가시키는 방법을 제공한다:
특이적인 삼당류 Neu5Ac-Hex-HexNAc-개질된 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자를 제공하는 단계;
Fc 함유 분자를 대상체에게 투여하는 단계.
특정 실시 형태, 특정 배치뿐만 아니라 물질 및/또는 분자가 본 발명에 따른 세포 및 방법에 대해 본원에서 논의된 바 있긴 하지만, 형태 및 세부사항에 대한 다양한 변화 또는 개질들이 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 하기 실시예는 특정 실시 형태를 더 잘 예시하고자 제공되며, 이들은 본 출원을 한정하려는 것으로 여겨져서는 안 된다. 본 출원은 청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예
실시예 1. 변경된 글리코실화를 가진 안정한 세포 주의 발생.
포유류 세포에서 생산되는 당단백질은 종종 복합체-유형 N-글리칸 합성의 많은 생합성 단계들의 결과로 불균일하다(도 1a). 각각의 단계는 100%보다 낮게 효율적이며, 일부 효소들은 기질에 대해 서로 경쟁하므로 많은 상이한 글리코형들이 생기게 된다. 치료용 당단백질의 불균일성은 다운스트림 가공 및 공정의 재현성에 부정적인 영향을 미치며, 글리칸이 청소율 및 생물학적 활성에 영향을 미치기 때문에1,2 효능을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 글리칸의 시알산 함량은 종종 약물동력학3을 결정한다. 글리칸 불균일성 문제를 해결하는 데 있어서, N-글리칸이 종종 단백질 접힘에 중요하며 단순히 N-글리코실화 부위 돌연변이를 통해서는 제거될 수 없는 것으로 여겨져야 한다. 본원에서, 본 발명자들은 최소-크기의 시알화된 삼당류 N-글리칸을 가진 단백질을 생산하기 위해 골지체 N-글리코실화 경로를 단축시키는 포유류 세포 글리코조작 기술을 도입한다(도 1a).
293SGnTI-/- 세포4는 Man5GlcNAc2 N-글리칸으로 개질된 당단백질을 생산한다. 몇몇 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제5는 단일 아스파라긴-연결된 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기가 잔류하는 경우, 이러한 글리칸을 가수분해하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은, 엔도 T의 최적 pH가 6.0인 이점을 가지기 때문에, 포유류 세포 분비 시스템에서의 발현의 경우 이러한 글리코사이드 하이드롤라제 패밀리 18개의 진핵-기원의 대표로서 엔도 T6를 선택하였다. 이는 포유류 트랜스면-골지체7에서의 pH에 근접하지만, ER의 pH(pH 7.2)와 충분히 차이가 있으므로, 단백질 접힘 및 품질 조절에 있어서 N-글리칸의 ER-기능을 실질적으로 방해하지 않는다. 본 발명자들은 조기에 293SGnTI-/- 세포에서 엔도 T의 일시적인 골지체-표적화된 발현이 당단백질의 생체내 탈-N-글리코실화를 초래함을 보여주었다(예를 들어, EP2331701의 실시예 6 및 실시예 7).
골지체에서의 엔도 T 가수분해는 접힘 후, 당단백질 상에 단일 GlcNAc N-글리칸 "스텀프"를 생산할 것이다. 본 발명자들은, 이러한 골지체에서 생산된 단일 GlcNAc 잔기가 분비 전에 세포의 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제에 의해 인지될 것이라고 예측하였다. 그런 다음, 이는 N-글리칸 및 O-글리칸에서 보편적인 요소인 가장 단순한 시알화된 유형 II 말단을 합성할 것이다. 이러한 3-단계 경로는 다수-단계의 본래의 N-글리코실화 경로보다 훨씬 더 짧으며, 불균일성을 크게 감소시키고 N-글리칸 특징화를 더 용이하게 해야 한다. 상기 기술된 글리코조작 전략인 "글리코삭제"는 도 1a에 예시되어 있다.
293SGnTI-/- 세포의 트랜스면 골지체로 엔도 T를 표적화하기 위해, 본 발명자들은 엔도 T-코딩 서열을, 2개의 인간 효소로부터의 이의 예측된 신호 서열 없이 골지체에 통상적으로 존재하는 골지 표적화 도메인으로 융합하였다(도 2). 엔도 T 촉매적 도메인이 인간 β-갈락토사이드-α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1(ST6GAL1)8(본원에서 ST-엔도 T 융합 단백질로도 지칭됨)의 표적화 도메인에 융합되었을 때, 이는 세포에서 온전하게 유지되었다. 293SGnTI(-) 세포에서 ST-엔도 T의 일시적인 발현은 안정하게 발현되고 분비된 Flt3 수용체 세포외 도메인9 및 인간 5-하이드록시트립타민 1D(5HT1D) 수용체의 생체내 탈글리코실화를 초래하였다(도 3).
ST-엔도 T 융합 단백질을 안정하게 발현하는 293SGnTI(-)-유래의 세포주를 구축하기 위해, 본 발명자들은 콘카나발린 A(ConA)를 사용하여 요망되는 글리칸 표현형을 가진 세포를 선별하였다. ConA는 올리고만노스 및 하이브리드-유형 N-글리칸에 결합하는 사량체형 세포독성 렉틴이다. 엔도 T에 의한 세포 표면 당단백질의 완전한 탈글리코실화는 ConA 리간드를 없앨 것이며, 따라서, 세포는 이러한 렉틴에 대해 내성이 생길 것이다(도 1b). 형질감염 후 4주째에, 본 발명자들은 ConA에 내성인 클론을 수득하였다(부모 293SGnTI(-) 세포 모두를 사멸시킨 최저 농도에서). 2개의 클론을 왕성한 성장에 대해 선별하고, ConA 렉틴 민감성 분석법10으로 처리하였으며, 최고 ConA 내성을 가진 것을 293S글리코삭제(도 4)로 명명하였다. ST-엔도 T의 게놈 통합 및 발현을 각각 PCR 및 면역블로팅에 의해 입증하였다(도 5). 293S글리코삭제 및 293SGnTI(-) 세포는 유사한 형태를 가지며, 이들의 성장 속도는 구별 불가능하다(도 1c). 그러나, 본 발명자들은 293S글리코삭제 세포가 293SGnTI(-) 세포보다 덜 흡착적이며; 이는 생물약제학적 생산에 사용되는 바와 같이, 현탁액 배양에 바람직한 특색임을 주목하였다.
본 발명자들은 엑손 마이크로어레이를 사용하여 293SGnTI(-) 및 293S글리코삭제 세포의 전사체(transcriptome)를 프로파일링하고, 검출가능한 발현을 가졌던 7,344개 유전자 중 단 3개만이 2가지 세포주들 사이에서 2배 초과로 차별적으로 발현(P < 0.01)되었음을 확인하였다(도 1d). 293SGnTI(-) 세포주 및 293S 부모 세포주의 비교는 특정 경로에 대한 명백한 농화(enrichment) 없이, 약 70개의 유전자의 차별적인 전사를 보여주었다(도 6). 본 발명자들은 293SGnTI(-) 세포주에서 실질적인 게놈 재배열을 관찰하였으며(비공개된 관찰), 이는 이들 차이를 설명할 수 있다. 따라서, 글리코삭제 조작은 실질적으로 세포의 전사 프로파일을 변경하지 않는다. 293S글리코삭제 세포에서 접히지 않은 단백질 반응11의 전사 시그너처의 부재는 글리코삭제 전략이 소포체에서의 품질 조절에 있어서 N-글리칸의 역할을 주목할만하게 방해하지 않음을 나타낸다.
실시예 2. 글리코삭제 세포주는 단백질 기능에 영향을 미치지 않으면서, N-글리칸의 불균일성 및 길이가 감소된 당단백질의 발현에 적합하다.
본 발명자들은, 안정한 글리코삭제 조작이 일시적으로 과발현되어 분비되는 사이토카인(인간 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자, hGM-CSF13), 안정하게 과발현되는 GPCR, 5HT1DR12(실시예 3), 일시적으로 과발현되는 모노클로날 항체(항-CD20, 오비누투주맙(obinutuzumab))14(실시예 4) 및 일시적으로 과발현되는 Fc-함유 융합 단백질(항-TNF, 에타네르셉트)(실시예 5)에 미치는 효과를 평가하였다.
더욱이, GM-CSF를 293S, 293SGnTI-/- 및 293S글리코삭제 세포에서 일시적으로 발현시키고 배양 배지로부터 정제하였다. 293S 세포 또는 293SGnTI-/- 세포에서 생산되는 GM-CSF는 3개의 주요 글리코형(0개, 1개 또는 2개의 N-글리코실화 부위의 점유에 상응함)15에 상응하며, 이는 아스파라긴 측쇄와, 적어도 키토비오스(chitobiose) 코어를 함유하는 N-글리칸 사이의 N-글리코시드 결합을 절단하는 펩타이드-N-글리코시다제 F(PNGase F)의 처리에 의해 보다 낮은 분자량(MW)을 가진 단백질 형태로 변환된다(도 7a). 남아 있는 불균일성은 시알리다제 분해 시 부분적으로 사라짐으로 표시되는 O-글리코실화15로 인한 것이다. 대조적으로, 본 발명자들은 293S글리코삭제 세포로부터 정제된 GM-CSF에 대해 보다 낮은 MW 범위를 관찰하였다(도 7a). 글리코삭제 GM-CSF의 PNGase F 처리는 관찰된 패턴에서 임의의 변화를 유발하지 않았으며, 이는 N-글리칸을 함유하는 키토비오스-코어의 부재를 나타낸다. 시알리다제로 처리하면, 글리코삭제 GM-CSF의 MW를 시프트시켰으며, 293S 세포 또는 293SGnTI-/- 세포 유래의 GM-CSF의 경우보다 더욱 그러하였으며, 이는 다른 형태들보다 글리코삭제 GM-CSF 상에 더 많은 시알산 잔기가 존재함을 가리킨다(도 7a). 이러한 결론은 또한, 하기 기술된 글리칸 분석법에 의해 뒷받침되었다(도 7b 및 도 8과 도 9). PNGase F 및 시알리다제를 사용한 분해 후, 3개 세포주 모두로부터의 GM-CSF는 구별 불가능한 이동성을 가진 단일 밴드로서 관찰되었으며(이들 겔은 작은 글리코삭제 N-글리칸 스텀프를 가지도록 개질된 것들로부터 비-글리코실화된 단백질을 분해하지 않음을 주목해야 한다), 이는 293S, 293SGnTI(-) 및 293S글리코삭제 세포 간의 GM-CSF 차이가 글리코실화 차이로 인한 것이었으며; 이는 온전한 단백질의 질량 분광 분석에 의해 확인되었음을 뒷받침한다(도 10).
293S글리코삭제 및 293SGnTI(-) 세포 유래의 GM-CSF 상에서 N-글리칸을 더 특징화하기 위해, 본 발명자들은 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization; MALDI)-질량 분광법에 의해 샘플을 분석하였다(도 7b 및 도 8). 모세관 전기영동에 의한 293S GM-CSF 글리칸의 분석(도 9)은 다수의 가지를 가진 복합체-유형 글리칸의 전형적인 불균질한 혼합물을 나타내었다. 시알릴화 수준은 낮았으며, 이는 아마도 단백질 생산 동안 세포가 혈청-무함유 배지에 신속하게 이송되어서일 것이다. 293SGnTI(-) GM-CSF의 N37을 함유하는 당펩타이드는 Man5GlcNAc2(Fuc) N-글리코실화된 펩타이드로서 검출되었으며(도 7b, 상부), 이는 이전의 발견들과 일치한다4 ,16. 이들 이온은 293S글리코삭제 세포에서 생산되는 GM-CSF의 스펙트럼에는 존재하지 않으며, 이때 본 발명자들은 3가지 새로운 당펩타이드 덩어리를 검출하였다. 이들 덩어리는 N-아세틸헥소사민(HexNAc) 당펩타이드, Hex-HexNAc 당펩타이드 및 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac)-Hex-HexNAc 당펩타이드(도 7b)와 일치한다. N27을 함유하는 당펩타이드에 대해서도 유사한 관찰을 하였다(도 8).
글리코삭제 GM-CSF 당펩타이드 상에서의 헥소스 및 Neu5Ac 단위의 아이덴터티 및 연결을 확인하기 위해, 본 발명자들은 α-2,3- / α-2,6- / α-2,8-시알리다제 및 β-1,4-갈락토시다제를 사용한 엑소글리코시다제 분해를 수행하였다(도 7b). 이로써, 본 발명자들은 이당류 개질된 펩타이드 및 삼당류 개질된 펩타이드가 각각 Gal-β-1,4-GlcNAc 및 Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc임을 구축할 수 있었다. 글리코삭제 세포에서 생산되는 단백질 상에서의 이들 글리칸(단지 단일 GlcNAc 엔도 T 분해 생산물이 아님)의 존재는, 골지체에서 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제가 엔도 T에 의해 생산되는 GlcNAc 스텀프에 작용함을 보여준다. 이는 GM-CSF의 엔도 T 탈글리코실화가 세포내에서 수행되어야 하며, 분비 후에 수행되어서는 안 됨을 확인시켜 준다. 시알리다제 처리 전 및 처리 후, 단백질 스펙트럼의 상대적인 피크 강도의 정량화는 글리코삭제 세포 유래의 GM-CSF의 글리칸 중 약 75%가 시알화되었음을 가리켰다.
그런 다음 본 발명자들은 글리코삭제 글리칸의 변경이 GM-CSF의 특성에 미치는 영향을 조사하였다. 서모플루오르 분석법17은 에스케리키아 콜라(비-글리코실화, Tm = 58.9 ± 0.6℃), 293S 세포(복합체 유형 N-글리코실화, Tm = 61.2 ± 3.2℃) 및 293S글리코삭제 세포(Tm = 61.5 ± 0.2℃) 유래의 GM-CSF의 용융점은 유의미하게 상이하지 않았다는 것을 보여주었다(Kruskal-Wallis 시험, n = 4, P > 0.05; 평균 ± s.d.)(도 7c). 더욱이, TF1 인간 적백혈병 세포-증식 분석법18(도 7d)에서, 293S 및 293S글리코삭제 세포 유래의 GM-CSF의 생물활성은 매우 유사하였다.
글리코삭제 글리칸이 GM-CSF의 항원성에 기여하는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 토끼를 293S글리코삭제 세포 유래의 GM-CSF로 면역화하였다. 분해되지 않은 293S글리코삭제 GM-CSF, 시알리다제-처리된 293S글리코삭제 GM-CSF 또는 시알리다제-처리되고 갈락토시다제-처리된 293S글리코삭제 GM-CSF에의 혈청 항체 결합을 ELISA에 의해 확인하였다. 글리코삭제 글리칸 구조가 제거된 GM-CSF 및 글리코삭제 글리칸이 존재하는 GM-CSF는 동일하게 양호한 것으로 인지되었으며, 이는 글리코삭제 글리칸이 토끼에서 GM-CSF 상에 새로운 면역원성 에피토프를 형성하지 않았음을 가리킨다(도 7e 및 도 7f).
실시예 3. 글리코삭제 세포주는 N- 글리칸의 불균일성 및 길이가 감소된 당단백질의 안정한 발현에 적합하다.
글리코삭제가 안정한 형질감염-기재의 단백질 생산과 양립 가능하며, 글리코삭제가 막 단백질을 가공할 수 있는지 확인하기 위해, 안정한 글리코삭제 조작 다음에 GPCR, 5HT1DR12가 안정하게 과발현된 안정한 세포주를 생산시켰다. 막 단백질 추출물을 PNGase F로 처리하는 것은 293SGnTI-/- 세포에서 안정하게 과생산되는 5HT1DR의 분자량(MW)을 크게 이동시킴을 보여주었다. 이와는 대조적으로, PNGase F로 처리되거나 처리되지 않든 간에 293S글리코삭제 세포에서 생산되는 수용체는 293SGnTI-/- 세포 유래의 PNGase F-처리된 수용체와 대략 동일한 MW를 가졌다. 본 발명자들은 293S글리코삭제 세포에서, ST-엔도 T가 5HT1DR N-글리칸을 완전히 가수분해시킨 것으로 결론 내렸다(도 11).
실시예 4. 글리코삭제 세포주에 의해 생산되는 항체는 이들의 리간드에 대해 동일한 친화성을 가지나, 생체내에서 더 긴 순환 시간을 가진다.
글리코삭제 기술의 범위를 더 알아보기 위해, 모노클로날 항-CD20 항체 오비누투주맙(obinutuzumab)(GA101)14을 293S 세포 및 293S글리코삭제 세포에서 일시적으로 발현시키고, 세포 배양 배지로부터 정제하였다. 세포주는 항체를 유사한 양으로 생산하였다(도 12). 293S에 의해 생산되는 항-CD20은 이의 유일한 Fc-연결된 N-글리코실화 부위(중쇄 Cγ2-도메인에서 N297) 상에 IgGs19의 전형적인 코어-푸코실화된 바이안테너리 N-글리칸을 가진다(도 13). 예상되는 바와 같이, PNGase F를 사용한 처리는 MW를 감소시켰다(도 14a). 대조적으로, 293S글리코삭제 세포에서 생산되는 항체의 중쇄는 293S 세포 유래의 PNGase F-처리된 항체의 중쇄와 대략 동일한 MW를 가졌으며, MW는 PNGase F 처리에 의해 더 감소되지는 않았다(도 14a). 이러한 결과는 엔도 T에 의해 절단된 이러한 IgG 상의 N-글리칸과 일치한다. 따라서, 글리코삭제 세포 또한 hIgG Fc-연결된 N-글리칸을 가공한다.
293S글리코삭제 항-CD20 상에서 글리칸의 특징을 더 알아보기 위해 N-글리코실화 부위를 함유하는 트립틱(tryptic) IgG 펩타이드의 상이한 글리코형들을 선별된 반응 모니터링(SRM) 방식에서 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 질량 분광법(LC-MS/MS)을 사용하여 정량화하였다(도 14b). 더욱이, 본 발명자들은 감소를 통한 사슬의 해리를 수반하는 온전한 항체 및 수반하지 않는 온전한 항체의 LC-MS 분석을 수행하였다(도 15). LC-MS/MS 분석은 본 발명자들이 GM-CSF에 대해서도 관찰하였기 때문에 글리코삭제 단백질이 HexNAc, Gal-HexNAc 및 Neu5Ac-Gal-HexNAc N-글리칸에 의해 개질되었음을 보여주었다. 본 발명자들은, 시알리다제 처리 전 및 후의 샘플의 상대적인 당펩타이드 피크 면적의 정량화를 통해, 항-CD20의 19%가 시알화된 삼당류를 가지며 72%가 Gal-GlcNAc 이당류를 가지고, 나머지는 GlcNAc-개질된 펩타이드임을 구축할 수 있었다. SRM-방식의 LC-MS/MS 펩타이드 분석에서, 293SGnTI(-) IgG에 지배적인 Hex5-HexNAc2 당펩타이드는 293S글리코삭제 IgG의 검출 하한 미만으로 존재하였다. 온전한 단백질 LC-MS 분석은 293S-생산 항체 및 293S글리코삭제-생산 항체 둘 다에서, Hex5-HexNAc2 글리코형이 매우 작은 분획으로 잔류함을 보여주었다. 두 조제물 모두에서 Hex5HexNAc2의 양은 두 항체의 1:1 혼합물에서 DNA-시퀀서 탄수화물 전기영동에 의해 총 글리칸 풀의 2.5%에서 정량화하였다(데이터는 도시되지 않음).
또한, CD20+ 세포에의 결합에 대한 유세포 분석은 글리코삭제 항-CD20 항원 결합이 293S 항-CD20의 항원 결합과 일치함을 보여주었으며(도 14c), 이는 항원-결합 배수가 영향을 받지 않음을 나타낸다.
N-글리칸이 Cγ2 도메인에서 폴드 패킹 접촉(fold packing contact)의 일부를 구성하기 때문에, 이들 글리칸의 크기 감소는 Tm의 저하를 초래하는 것으로 예상된다. 이에, Cγ2에 대한 Tm은 복합체-유형 N-글리코실화된 293S 항-CD20의 경우 약 64℃이며 293S글리코삭제 항-CD20의 경우 57℃이고 이는 PNGase F-분해된 293S 항-CD20에 대한 Tm과 유사하다(도 14d). 본 발명자들은, 293S 세포 또는 293S글리코삭제 세포에 의해 발현된 항-CD20의 응집에 대한 증거를 겔 여과 크로마토그래피에 의해 확인 시 발견하지 못하였다(도 16).
중쇄 N297에 대한 글리코실화는 Fc-γ 수용체(FcγR)에 대한 항체의 결합 친화성에 주요 영향을 미치며20, 따라서, 본 발명자들은 293S 항-CD20 및 293S글리코삭제 항-CD20의 상이한 인간 FcγR에의 결합을 평가하였다. 표면 플라즈몬 공명 실험(표 1)은, 인간 및 마우스 신생아의 FcR(FcRn)이 항-CD20 글리코형 둘 다에 대해 유사한 친화성을 가짐을 보여주었다. 이는, FcRn 결합 부위가 Cγ2 N-글리칸 부위 부근에 위치하지 않기 때문에 예상된다(문헌[Roopenian et al., 2007]). 본 발명자들은 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 경쟁 ELISA를 설정하였으며, 이 실험에서 항-CD20 항체는 용액 내에서 FcγR 결합을 위해 미리 코팅된 IgG와 경쟁한다. 3가지 모두에서, 본 발명자들은 293S 항-CD20과 비교하여 293S글리코삭제 항-CD20에 의한 결합 경쟁에 있어서 10배 초과의 배수 감소를 검출하였다(도 14e). 생물층 간섭법(biolayer interferometry)(표 1)에 의해 평가되는 바와 같이 FcRIIIa 결합 친화성은 293S 항-CD20보다 293S글리코삭제 항-CD20에 대해서 5.8배 더 낮았다. 유사하게는, 자연 살해(NK) 세포를 효과기로서 사용하는 항체-의존적 세포-세포독성(ADCC) 분석법에서(도 14e), 본 발명자들은 293S글리코삭제 항-CD20을 이용한 특이적 용해의 최대 유효 농도의 절반(EC50)이 293S 항-CD20보다 6.6배 더 높음을 확인하였다. 종합적으로, 인간 IgG1 Fc의 글리코삭제 글리코실화는 FcγR에의 결합을 감소시키며; 중성화 항체 생산의 맥락에서, 이는 안전성을 향상시키는 데 바람직할 것이다(문헌[Lux et al., 2013]).
Figure 112016032135533-pct00001
글리코삭제 글리칸이 IgG에 대해 면역원성인지 평가하기 위해, 본 발명자들은 GM-CSF에 대한 것과 유사한 면역화 실험을 수행하였으며(도 14f), 글리코삭제 글리칸이 항-CD20 분자의 항원성에 실질적으로 기여하지 않는 것으로 결론내렸다.
주목할만하게는, 마우스에서의 약물동력학 분석은 초기의 신속한 청소 기간(주사 후 1 시간)이 글리코삭제 항-CD20을 순환으로부터 실질적으로 덜 제거하며, 이는 장기 순환 수준을 2배로 하였음을 보여주었다. 두 글리코 모두 이들의 유사한 FcRn 친화성으로부터 예상된 바와 같이, 나중에 동일한(느린) 속도에서 제거되었다(도 14g 및 도 17). 따라서, 초기의 보다 높은 수준으로 인해, 글리코삭제 항체의 농도를 필요한 치료적 역치 농도 미만으로 낮추는 데는 10 일 내지 12 일 더 걸릴 것이다. 이는 상당히 더 높은 수준의 글리코삭제 항-CD20이 훨씬 더 연장된 기간 동안 생체내에서 잔류하였음을 의미한다. 가능한 메커니즘은 보다 높은 시알릴화가 간 및 대식세포 렉틴 수용체에의 결합 감소를 통해 청소율을 낮추는 것이다. 잠재적으로, 글리코삭제 IgG의 시알릴화 수준은 더 증가될 수 있으며, 이러한 관찰은 글리코삭제 IgG가 혈액 중에서 긴 순환 기간을 종종 필요로 하는 중성화 치료용 IgG에 대한 투약 빈도를 낮출 수 있음을 제안한다.
실시예 5. 글리코삭제 세포주에 의해 생산되는 키메라형 Fc 함유 분자 또한 보다 균질한 글리코실화 패턴을 가진다.
다음, 본 발명자들은, IgG1 항체의 불변 말단에 융합된 인간 유형 2 TNF 수용체로 이루어진 재조합 융합 단백질인 에타네르셉트를 글리코삭제 세포에서 일시적으로 발현시키고 정제하였다. 실시예 2 및 실시예 4에서 시험된 단백질과 유사하게, LC-MS 분석은 글리코삭제 단백질의 Fc 부분이 HexNAc, Gal-HexNAc 및 Neu5Ac-Gal-HexNAc N-글리칸으로 개질되었음을 보여주었다(도 18). (이는 Fc 사슬 유래의 EQQYNSTYR 펩타이드(서열번호 1)를 사용하여 평가하였다).
후속적인 시알리다제 및 갈락토시다제 분해물은 이들 당 그룹의 아이덴터티(identity)를 추가로 확인시켜 주었다(도 18). 시알리다제 및 갈락토시다제로 처리하기 전 및 처리한 후의 샘플의 상대적인 당펩타이드 피크 영역의 정량화를 통해, 본 발명자들은 이들 세포에서 생산되는 에타네르셉트의 25%가 시알화된 삼당류를 가진 Fc 사슬을 가지며 68%가 Gal-GlcNAc 이당류를 가지며, 나머지가 GlcNAc-개질된 펩타이드를 가짐을 구축할 수 있었다(표 2). 이들 백분율은 항-CD20 항체에 대해 관찰된 것과 양호하게 일치하며, 이는 세포에서 Fc 사슬의 글리코실화가 꽤 일정함을 가리킨다.
Figure 112016032135533-pct00002
결론
결론적으로, 본 연구는 포유류 세포-기재의 당단백질 생산에서 N-글리코실화 불균일성의 문제를 해결하기 위한 전략으로서 글리코삭제 글리코조작 전략을 도입한다. 글리코삭제는 선택적이지만 특히 예상되는, 단일 글리코실트랜스퍼라제(MGAT1 유전자에 의해 인코딩되는 GnTI)의 불활성화 및 탈글리코실화 효소의 과발현과 후속해서 렉틴 선별을 수반한다. 글리코삭제 세포는 Gal-GlcNAc 이당류 또는 이의 α-2,3-시알화된 삼당류 유도체 및 단당류 중간산물의 일부를 가진 단백질을 생산한다. 이는 야생형 포유류 세포에 의해 생산되는 여러 가지 글리칸 구조들과 대조적이다. 글리코삭제 전략은 N-글리칸의 접힘-증가 기능을 유지하는 것과 포유류 골지체의 N-글리칸 가공을 통해 도입되는 광범위한 불균일성 간의 균형을 해결한다. 생물약제학적 생산에서 N-글리칸 복합성이 감소되는 이점 외에도, 시험관내에서 생산되는 유사하며 짧고 단순한 N-글리칸의 치료적 이익의 예들이 보고되어 있다21-23. 더욱이, 본 발명자들은 치료적 목적이 부가적인 효과기 기능을 필요로 하지 않으면서 항원 중성화인 경우, 글리코삭제 조작이 항체의 특징을 바람직하게 변경시킴을 보여주었다. 따라서, 글리코삭제는 생물약제학적 산업에서 흥미로운 영역인 "바이오베터(biobetter)"를 유도할 수 있었다28. 본 전략은 특히, 단지 보존된 N297 잔기의 글리코실화를 변경함으로써 순환 반감기를 연장하기 때문에, Fc 함유 분자의 발현에 잘 적합화되는 것으로 보인다. 이는 치료용 IgG 주사의 경우 중요한 치료적 이점을 가지며, 이러한 이점은 리간드에 대해 동일한 친화성을 가지기 때문에 동일한 효능을 유지하면서도 훨씬 더 낮은 빈도로(예를 들어, 절반의 빈도로) 수행될 수 있다는 것이다.
물질 및 방법
일반적인 세포 배양 및 형질감염.
본 발명자들은 10% FBS, 292 ㎍/mL L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(모두 Sigma-Aldrich)을 포함하는 DMEM/F12(Gibco) 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 습윤한 인큐베이터에서 293SGnTI(-) 세포를 유지시켰다.
소규모 형질감염의 경우, 형질감염시키기 48 시간 전에 세포를 웰 당 약 150,000개 세포의 비율로 6-웰 플레이트에 평판배양하였다. 이들 세포를, TransIT-293 형질감염 시약(Mirus Bio LLC)을 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 형질감염시켰다. 일시적인 형질감염 또는 대규모 형질감염의 경우, 세포를 인산칼슘 형질감염 방법을 사용하여 형질감염시켰다. Raji 세포를 RPMI 1640 + 10% FBS + 2 mM L-글루타민에서 배양하였다.
모든 세포주들을 Plasmotest 키트(InvivoGen)를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대해 정기적으로 시험하였다.
일시적인 엔도 T 발현.
엔도 T 융합 작제물(pCAGGS-GM2S-엔도 T 및 pCAGGS-ST-엔도 T) 및 분비되는 엔도 T 작제물(pCAGGS-s-엔도 T)을 상기 기술된 바와 같이 293SGnTI(-) 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 상층액 및 세포 용해물 샘플을 분석하여 표적화 도메인 성능을 평가하였다(도 2).
엔도 T-융합의 일시적인 형질감염에 의한 생체내 탈-N- 글리코실화 .
엔도 T에 의한 탈-N-글리코실화는 모든 엔도 T 작제물들을 293SGnTI(-) 세포에 안정적으로 형질감염시키고 Flt3 수용체 세포외 도메인을 유도적으로 발현시킴으로써 평가하였다(도 3).
안정한 ST-엔도 T 발현을 위한 플라스미드( pcDNA3 . 1(-)Zeo -ST-엔도 T)의 작제 .
본 발명자들은 ST-엔도 T PCR 단편을 pCR®II-TOPO® 플라스미드(Life Technologies) 내로 클로닝하였다. 본 발명자들은 생산되는 Topo-ST-엔도 T 플라스미드(역 보체 삽입(reverse complement insertion))를 XhoI 및 KpnI을 사용하여 분해하고, 삽입물을 정제하였다. pcDNA3.1/zeo(-) 플라스미드를 XhoI 및 PvuI을 사용하여 1회 분해하고, PvuI 및 KpnI을 사용하여 1회 분해한 다음, 본 발명자들은 각각 1.5 kb 단편 및 3.6 kb 단편을 정제하였다. 벡터 단편 및 ST-엔도 T 단편을 사용한 후속적인 3-점 연결(three-point ligation)에 의해 pcDNA3.1/zeo-ST-엔도 T 플라스미드가 생산되었다.
Figure 112016032135533-pct00003
Figure 112016032135533-pct00004
안정한 세포주 생산.
본 발명자들은 소규모 형질감염에서 293SGnTI(-) 세포를 pcDNA3.1(-)Zeo-ST-엔도 T를 사용하여 형질감염시켰다. 본 발명자들은 형질감염 후 48 시간째에 15 ㎍/mL ConA를 사용한 선별을 개시하였다. 14 일 후, 세포에 트립신을 처리하고 10 ㎍/mL ConA를 함유하는 조건화된 배지(2 일간 배양되고 멸균 여과된 후 50%(v/v) 신선한 DMEM/F12와 혼합된 293SGnTI(-) 배양물의 배지)에 재평판배양하였다. 14 일 후, 5개의 크고 양호하게 분리된 콜로니들을 골라서 10 ㎍/mL ConA의 존재 하에 증식시켰다. 2개의 가장 신속하게 성장하는 클론들을 추가로 분석하였다.
293SGnTI (-) 및 293S글리코삭제 성장 곡선.
70 내지 80%로 풍부하게 배양된 세포를 우선 ㎖ 당 약 60,000개 세포로 희석시키고, 다시 계수한 다음(0시간째 시점), 6웰 플레이트(웰 당 180,000개 세포)로 옮겼다. 각각의 시점에서, 3개의 웰에서 배지를 위아래로 피펫팅함으로써 세포를 탈착시키고, 트립판 블루 배제 및 혈구계수기를 사용하여 각각의 웰에서 살아 있는 세포를 계수하였다. 도 1c에 도시된 결과는 2회의 중복된 실험들 중 1회를 나타낸 것이다.
유전자-발현 분석.
GeneChip 인간 Exon 1.0 ST Arrays(Affymetrix) 상에서의 분석을 위한 RNA 단리 및 샘플 제조는 하기와 같이 수행하였다.
총 RNA를, RNeasy Midi 키트(Qiagen)를 사용하여 제조업체의 지시사항에 따라 2개 세포주의 3회 중복 배양물로부터 추출하였다. RNA 품질은 RNA 6000 Pico 칩(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)을 사용하여 2100 Bioanalyzer에서 평가하였다. 모든 샘플들의 RNA 온전성 수(RNA Integrity Number)(RIN)는 9.5 이상이었다. 총 RNA 샘플(RNA 샘플 제조에 관해서는 온라인 방법을 참조함)를 박테리아의 폴리-A RNA 양성 대조군(Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)으로 스파이킹(spiking)한 후, 모든 샘플을 역전사시키고, 이중-가닥 cDNA로 변환시킨 후, 시험관내에서 전사시키고, Ambion WT 발현 키트를 사용하여 증폭시켰다. 수득된 단일-가닥 cDNA를 WT Terminal Labeling 키트(Affymetrix)를 사용하여 제조업체의 지시사항에 따라 단편화시킨 후, 비오티닐화시켰다. 생산되는 샘플을 하이브리드화 대조군(Affymetrix)과 혼합하고, GeneChip 인간 Exon 1.0 ST Arrays(Affymetrix) 상에서 하이브리드화하였다. 어레이를 GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix)에서 염색 및 세정한 다음, GeneChip Scanner 3000(Affymetrix)을 사용하여 원(raw) 프로브 신호 강도를 스캐닝하였다. 엑손 어레이 데이터는 MIAME에 순응하며, 등록 번호 E-MEXP-3516 하에 ArrayExpress 데이터베이스(www.ebi.ac.uk/arrayexpress)로부터 입수 가능하다.
본 발명자들은 상기 부분적으로 기술된 바와 같이, 엑손 어레이 데이터의 품질 조절 및 차별적인 발현 분석에 대해 R 통계학적 소프트웨어 패키지(www.r-project.org)와 Affymetrix Power Tools(APT; Affymetrix)의 조합을 사용하였다7. 간략하게는, 엑손-수준 및 유전자-수준 강도 추정치는 APT를 가진 Robust Multi-array Average(RMA) 알고리즘을 사용하여 백그라운드 보정, 정상화 및 프로브 요약(probe summarization)에 의해 생산하였다. 정상화 전 및 후에 데이터의 품질 조절을 상자와 같은 다양한 플롯 및 밀도 플롯의 생산을 통해 R에서 수행하였다. 발현이 두 세포주 모두에서 검출되지 않은 유전자는 추가적인 분석으로부터 배제하였다. 본 발명자들은 유전자의 엑손의 1/2 초과가 해당 세포주의 3개의 생물학적 복제물 중 적어도 2개에서 백그라운드(p<0.05)보다 높게 검출된 경우, 이 유전자가 검출되는 것으로 여겼다. 발현이 두 세포주 모두에서 추정된 노이즈 수준보다 낮은 유전자 또한 추가적인 분석으로부터 배제하였다. 노이즈 수준 역치는 Y-염색체 상의 유전자 중 95% 초과의 발현의 "검출"을 없앴고, 293개 계통(여성 배아로부터 유래되었음)으로부터 부재이며 따라서 적절한 내부 음성 대조군으로서 작용하는 신호 강도 수준(3개의 복제물에 대해 평균을 낸 APT 출력 강도)에서 설정하였다.
차별적인 유전자 발현 분석을 R Bioconductor package Limma8에서 시행된 선형 모델 피트를 사용하여 수행하였으며, 이는 단지 코어 프로브세트만 고려한다. Benjamini-Hochberg(BH) 방법을 다수의 시험들의 보정에 적용하였다.
GM- CSF 생산 및 정제.
일시적인 GM-CSF 발현을 위한 플라스미드(pORF-hGM-CSF-6xHis)를 293SGnTI(-) 세포주 및 293S글리코삭제 세포주 둘 다에 일시적으로 형질감염시켰다. 분비된 GM-CSF를 배지로부터 정제하였다.
pORF - hGM - CSF - 6xHis 플라스미드의 작제 .
6개의 His 잔기가 C-말단에 태깅된 인간 GM-CSF의 부분적인 CDS를 pORF-hGM-CSF 플라스미드(Invivogen, 미국 캘리포니아주) 유래의 프라이머 PR18 및 PR19를 사용하여 증폭시켰다. 본 발명자들은 PCR 단편 및 pORF-hGM-CSF 플라스미드를 ApaI 및 EcoRI을 사용하여 분해시키고 2개 단편 모두를 연결하여, pORF-hGM-CSF-6xHis 플라스미드를 생산하였다.
인간 GM- CSF 정제.
293SGnTI-/- 세포 및 293S글리코삭제 세포를 pORF-hGM-CSF-6xHis 플라스미드를 사용하여 일시적으로 형질감염시켰다(일시적인 형질감염에 관해서는 온라인 방법을 참조함). 형질감염 후 4 일째에, 발현된 단백질을 함유하는 배지 50 ㎖을 배양하고, 3 kDa MWCO 막을 사용하여 완충액 A(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl 및 20 mM 이미다졸 pH 7.5)에 대해 투석하였다. 투석물을 Ni2 + 이온으로 충전된 1 mL His-Trap HP 컬럼(GE healthcare UK Ltd, 영국 버킹엄셔) 상에 로딩하였다. 그런 다음, 컬럼을 A280을 기준선까지 다시 낮출 때까지 완충액 A를 사용하여 세정하였다. 10 컬럼 부피의 6% 완충액 B(20 mM NaH2PO4 pH 7.50 + 20 mM NaCl + 0.5 M 이미다졸)를 사용하여 컬럼을 세정한 후, 결합된 단백질을 100% 완충액 B를 사용하여 용출하고 1 mL 분획으로 수집하였다. 수집된 분획에서 GM-CSF의 존재는 트리신 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 입증하였다9. 본 발명자들은 블랭크(blank)로서 완충액 B와 비교하여, GM-CSF를 함유하는 분획의 A280 흡광도를 기준으로 단백질 농도를 측정하였다. 농도는 프로트파람 툴(protparam tool)(http://web.expasy.org/protparam) 10에 의해 계산된 바와 같이, 이황화 연결에서 모든 시스테인 잔기들로 이론학적 흡수 계수(13980 M- 1 cm- 1)를 사용하여 계산하였다.
항-CD20 생산 및 정제.
항-CD20을 상기 기술된 바와 같이 293S 세포주 및 293S글리코삭제 세포주 둘 다에서 일시적으로 발현시키고, 하기와 같이 정제하였다: 293S 세포 및 293S글리코삭제 세포를 항-CD20을 함유하는 벡터를 사용하여 일시적으로 형질감염(일시적인 형질감염에 관해서는 온라인 방법을 참조함)시킨 후 4 일째에 발현된 단백질을 함유하는 배지를 수집하고, 친화성 컬럼 5 mL HiTrap MabSelect SuRe(GE healthcare UK Ltd, 영국 버킹엄셔) 상에 로딩하였다. 그런 다음, 컬럼을 A280이 기준선으로 다시 낮아질 때까지 PBS로 세정하였다. 결합된 단백질을 50 mM 글리신 pH 3.5를 사용하여 용출시키고, 1 mL 분획으로 수집하였다. 수집된 분획에서 항-CD20의 존재를 트리신 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 입증하였다. 본 발명자들은 항-CD20을 함유하는 풀링된 분획 상의 완충액 교환을 pH 6.0의 25 mM 히스티딘 및 125 mM NaCl 완충액으로 교환하는 것을 수행하였다. 정제된 샘플 내에서의 항체 농도를 Synergy MX 분광광도계(Biotek, 미국 버몬트주)를 사용하여 측정하였다. 본 발명자들은 정제된 항체의 A280 흡광도를 기준으로 단백질 농도를 측정하였다. 농도는 이론학적 흡광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 계산하였다.
5HT1D 수용체 발현 및 샘플 제조.
안정한 5HT1DR을 발현하는 세포주의 생산, 5HT1D 샘플 제조 및 분석에 대한 상세한 방법은 하기와 같다.
pT - REx - 5HT1DRho 및 pT - REx - 5HT1DRho - IRESdsRed2 플라스미드의 작제 .
pT-REx-DEST30 플라스미드(Invitrogen)를 dam/dcm 메틸화 결핍 에스케리키아 콜라이 염색에서 증폭시키고, BclI 및 XbaI을 사용하여 분해하였다. dsDNA 삽입물은 올리고 PR11 및 PR12를 어닐링함으로써 제작하였다. 후속해서 dsDNA 삽입물을 XbaI/BclI로 분해된 pT-REx-DEST30 단편에 연결하면, pT-REx-MCS 플라스미드가 생산되었다.
본 발명자들은 프라이머 PR13 및 PR14를 사용하여 인간 태아의 뇌 cDNA 라이브러리로부터 5-하이드록시 트립타민 1D 수용체(NM_00864)에 대한 CDS를 증폭시키고, 이를 pCR®II-TOPO® 플라스미드(Invitrogen) 내로 클로닝하여, Topo-5HT1D 플라스미드를 생산하였다. Rho1D4-태깅된 5HT1DR 단편을 프라이머 PR 13 및 PR15를 가진 Topo-5HT1D 플라스미드로부터 증폭시켰다. 본 발명자들은 PCR 단편을 SalI로 분해하고, pT-REx-MCS 플라스미드를 PmeI 및 SalI로 분해시킨 후, 탈인산화시켰다. 본 발명자들은 이들 단편을 연결하여 pT-REx-5HT1DRho 플라스미드를 생산하였다.
본 발명자들은 프라이머 PR16 및 PR17을 가진 pLV-tTR/KRAB-Red 플라스미드(VIB-UGhent의 Peter Vandenabeele 교수의 친절한 기증)로부터의 IRESdsRed2 단편을 증폭시켰다. pT-REx-5HT1DRho 플라스미드를 PmeI을 사용하여 분해시키고, 클론EZ(GenScript USA Inc., 미국 뉴저지주) 반응에서 IRESdsRed2 단편과 함께 사용하였다. 이로써 pT-REx-5HT1DRho-IRESdsRed2 플라스미드가 생산되었다.
293SGnTI -/- 클론 및 293S글리코삭제 클론을 발현하는 5HT1DR .
본 발명자들은 293SGnTI-/- 세포를 pT-RExL-5HT1DRho-IRESdsRed2 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고, 293S글리코삭제 세포를 pTRExL-5HT1DRho 또는 pT-RExL-5HT1DRho-IRESdsRed2를 사용하여 형질감염시킴으로써, 5HT1D 수용체를 안정하고 유도적으로 발현하는 세포주를 생산하였다. 선별은 600 ㎍/mL(293SGnTI-/- 세포) 및 150 ㎍/mL G418(293S글리코삭제 세포)에서 G418(Sigma-Aldrich)을 사용하여 수행하였다. 그런 다음, 본 발명자들은 G418 내성 세포를 조건화된 배지에서 제한적인 희석 클로닝으로 처리하였다. 본 발명자들은 2 ㎍/mL 테트라사이클린 및 1 mM 발프로에이트(valproate)(Sigma-Aldrich)를 사용하여 5HT1D 수용체의 발현을 유도하였다. 본 발명자들은 유도 후 2 일 내지 3 일 후, 적색 형광을 최고 강도로 나타내는 293SGnTI-/- 5HT1DR 클론을 형광 현미경에 의해 선별하였다.
293S글리코삭제 클론에서 5HT1DR 발현에 대한 ELISA 분석.
5HT1DR-발현 293S글리코삭제 클론의 ELISA 분석에서, 본 발명자들은 2 ㎍/mL 테트라사이클린 및 1 mM 발프로에이트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 2 일 내지 3 일 동안 유도시킨 후, 24-웰 플레이트로부터 세포를 수집하였다. 본 발명자들은 세포를 회전 침강시키고 상층액을 폐기하였다. 세포를 얼음 상에서 20 분 동안 인큐베이션시킴으로써 RIPA 완충액 + 프로테아제 저해제를 사용하여 용해시켰다. 본 발명자들은 샘플을 12,000 rpm에서 10 분 동안 회전 침강시킴으로써 찌꺼기를 제거하였다. 본 발명자들은 비신코닌산(bicinchoninic acid)(BCA) 분석법(Pierce Biotechnology Inc., 미국 일리노이주 록포드)에서 제조업체의 지시사항에 따라 단백질을 측정하였다. 각각의 샘플, 피치아 파스토리스에서 생산되는 5HT1DR의 양성 대조군 샘플 및 293S글리코삭제 음성 대조군 샘플 15 ㎍을 4℃에서 맥시소브(maxisorb) 플레이트 상에 밤새 코팅시켰다. 본 발명자들은 플레이트를 물로 3회 세정 완충액(PBS + 0.1% Tween-80)으로 1회 세정하였다. 차단 완충액(PBS + 1% 밀크 파우더)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 세정 후, 샘플 완충액(PBS + 0.05% Tween + 0.5% 밀크 파우더)에 1/100으로 희석시킨 항-rho1D4 항체(브리티쉬 컬럼비아 대학교, 캐나다 밴쿠버)를 첨가하고, 샘플을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세정한 다음, HRP 이차 항체에 커플링되고 샘플 완충액에서 1/5000으로 희석시킨 항-마우스 IgG(GE Healthcare Biosciences, 미국 펜실베니아주 피츠버그)를 샘플에 첨가하였다. 마지막으로, 플레이트를 다시 세정하고 샘플을 BD OptEIATM TMB 기질 시약 세트(BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 제조업체의 지시사항에 따라 분석하였다.
5HT1D 수용체 발현 및 샘플 제조.
본 발명자들은 5HT1D 수용체를 안정하고 유도적으로 발현하는 293SGnTI-/- 세포주 및 293S글리코삭제 세포주를 생산하였다. 5HT1DR 발현 작제물의 생산 및 안정한 5HT1DR-발현 클론의 후속적인 생산에 대한 상세한 방법들은 보조 노트 1에 기술되어 있다. 각각의 세포주의 선별된 5HT1DR-발현 클론을 2 ㎍/mL 테트라사이클린 및 1 mM 발프로에이트를 사용하여 유도하였다. 유도 후 3 일째에, 세포를 수집하였다. 세포 펠렛을 20 mM Tris-HCl pH 8.0 + 1 mM EDTA + 완전 EDTA-무함유 프로테아제 저해제(Roche, 독일 만하임) 5 mL에 재현탁시켰다. 각각의 샘플 1.25 mL를 얼음 상에서 VCX500 소니케이터(Sonics & Materials Inc., 미국 코네티컷주 뉴타운)를 사용하여 소니케이션(15 사이클, 각각의 사이클: 1 초간 온(on) 및 5 초간 오프(off), 20% 진폭)하였다. 본 발명자들은 용해물을 즉시 13,000 rpm 및 4℃에서 10 분 동안 원심분리하고, 펠렛을 상기 기술된 완충액 + 0.35 mM NaCl 및 0.5% n-도데실-β-D-말토사이드에 용해시켰다. 샘플을 즉시 13,000 rpm, 4℃에서 10 분 동안 다시 원심분리함으로써 찌꺼기를 제거하였다.
5HT1D 수용체 상에서 PNGase F 민감성 N-글리칸의 존재를 평가하기 위해, 1% Igepal CA-630 및 200 U의 PNGase F(기업 내에서 생산됨)가 보조되거나 효소를 포함하지 않는 샘플 분취물 50 ㎕를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 샘플을 1/250으로 희석시킨 마우스 항-rho1D4 일차 항체(브리티쉬 컬럼비아 대학교, 캐나다 밴쿠버)를 사용한 면역블로팅에 의해 분석하였다.
시알리다제 , 갈락토시다제 및 PNGase F 분해물 및 SDS-PAGE.
본 발명자들은 40 mM의 β-머캅토에탄올 및 0.5% SDS를 함유하는 50 mM의 인산염 완충액(pH 7.0)에 당단백질을 희석시켰다. 샘플을 98℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 냉각 후, 1% Igepal CA630 및 적절한 효소를 첨가하였다: 100 U의 PNGase F(기업 내에서 생산됨), 200 mU의 아쓰로박터 우레아파시엔스 시알리다제(기업 내에서 생산됨), 2 mU의 스트렙토코커스 뉴모니애 β-1,4-갈락토시다제(Prozyme) 또는 조합. 샘플을 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 다음날 트리신 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다.
서모플루오르 ( thermofluor ) 분석법.
서모플루오르 분석법을 Ericsson 등17에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게는, 정제된 단백질을 완충액(GM-CSF의 경우 PBS 및 항-CD20의 경우 His 완충액(25 mM 히스티딘, 125 mM NaCl, pH 6.00)) 및 20x 농축된 Sypro 오렌지 염료(DMSO에서 5000x 용액, life technologies, 영국 페이즐리)를 함유하는 용액 내에서 적절한 분석법 부피(10 ㎕ 내지 20 ㎕)로 희석시켰다. 각각의 실험을 기술적인 3회 중복으로 진행시켰으며, 시험 단백질을 포함하지 않는 3회 중복 블랭크 측정을 포함하였다. 온도 경사율이 0.01℃/s인 25℃부터 95℃의 온도의 함수에 대한 형광을 348-웰 Lightcycler 480(Roche, 스위스 바젤)에서 기록하였다.
임의의 계산 및 통계학적 분석 전에, 명료한 기술적 문제를 가진 데이터세트(비정상적으로 높은 초기 형광, 척도외(off scale) 형광)를 완전히 생략하였다. 용융점을 각각의 실험에서 3회 중복의 평균화된 데이터포인트에 맞춰진 Boltzmann S자형 곡선의 V50 값으로서 계산하였다. 곡선 맞춤 절차의 경우, 최대 형광을 넘어서는 데이터포인트는 생략하였다. 1개 초과의 용융점을 단일 실험으로부터 계산한 경우, 해당 용융점 바로 아래 및 바로 위의 온도에서 최소 형광값 및 최대 형광값을 포함하는 데이터포인트의 적절한 하위세트를 사용하였다. 그래프를 만들기 위해, 원 데이터세트를 평균화하고, 블랭크(평균화됨)를 보정한 다음, 정상화하였다(최소값 = 0%, 최대값 = 100%).
GM-CSF 샘플의 경우, 평균 Tm을 독립적인 실험 세트로부터 계산하였다(에스케리키아 콜라이: n=4, 293S: n= 3, 293S글리코삭제: n=3). 본 발명자들은, 평균 Tm이 Kruskal-Wallis 일원(one-way) ANOVA(P=0.05) 및 다수의 비교를 위한 Dunn 시험(α=0.05)에 의해 통계학적으로 유의미하게 상이한지 시험하였다.
MALDI 당펩타이드 분석.
상이한 세포주의 GM-CSF(20 ㎕ 내에 단백질 1 ㎍ 내지 4 ㎍)를 3x 트리신 겔 로딩 완충액(1.5 M Tris-HCl, pH 8.45, 35% 글리세롤, 10% SDS, 0.01% 쿠마시 및 30 mM DTT) 10 ㎕에 보충하였으며, 98℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 500 mM 요오도아세타미드 스톡 3 ㎕를 첨가하고, 샘플을 암실에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 본 발명자들은 12% 트리신 SDS-PAGE 겔 상에서 샘플을 분리하고, 밴드를 절단하였다.
겔-내 트립틱 분해에 대한 상세한 방법은 하기와 같다. 겔 조각을 50% 아세토니트릴(ACN)로 3회 세정하고, 100% ACN으로 건조한 다음, 100 mM NH4HCO3에서 재팽윤(reswell)시켰다. 겔 조각들을 스피드백(speedvac)에서 추가로 건조하였다. 트립신(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨) 750 ng을 첨가하고, 겔 조각을 5 분 동안 재팽윤시켰다. 100 mM NH4HCO3을 첨가하여, 모든 겔 조각들을 커버하고, 바이얼을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ㎕ 100 mM NH4HCO3을 각각의 바이얼에 첨가하고, 샘플을 쉐이커 상에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕ 100% ACN을 첨가하고, 바이얼을 쉐이커 상에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 신선한 바이얼에서 수집하였다. 50% ACN 중 50 ㎕ 5% 포름산을 첨가하고, 바이얼을 쉐이커 상에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 수집하였다. 5% 포름산 단계를 1회 반복하였다. 상층액을 샘플 당 풀링하고, 스피드백에서 건조한 다음, 20 ㎕ 50 mM 인산염 완충액, pH 7.0 및 1 mM Pefabloc(Sigma-Aldrich)을 사용하여 재구성하였다.
본 발명자들은 효소를 포함하지 않는 트립틱 펩타이드, 또는 50 mU의 α-2,3-시알리다제(Takara Bio Inc.)나 200 mU 아쓰로박터 우레아파시엔스 시알리다제 및 2 mU의 스트렙토코커스 뉴모니애 β-1,4-갈락토시다제(Prozyme)를 포함하는 트립틱 펩타이드로 처리하였다. 모든 분해물들을 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 스피드백에서 건조한 다음, 10 ㎕의 0.2% 트라이플루오로아세트산(TFA)(Sigma-Aldrich)을 사용하여 재구성하고, C18 ZipTip 피펫 팁(Millipore)을 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 세정하였다. 샘플을 양성 이온 방식에서 4800 MALDI TOF/TOF Analyzer(Applied Biosystems) 상에서, 0.1% TFA를 함유하는 포화된 50% 아세토니트릴에서 6-아자-2-티오티민(ATT) 매트릭스를 사용하여 분석하였다. 보고된 m/z 값을 기술적 최적화의 몇몇 반복 시 관찰하였으며, 완전히 최적화된 실험의 결과가 나타나 있다.
LC-MS/MS 당펩타이드 분석.
본 발명자들은 20 ㎕의 50 mM 인산염 완충액, pH 7.0에 9 ㎍ 항-CD20을 희석시켰다. 효소를 첨가하지 않거나, 100 mU의 아쓰로박터 우레아파시엔스 시알리다제(기업 내에서 생산됨) 또는 2 mU의 β-1,4-갈락토시다제(스트렙토코커스 뉴모니애) 및 100 mU의 시알리다제를 첨가하였으며, 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 2 M 우레아, 10 mM DTT, 50 mM 중탄산암모늄 완충액에서 60℃에서 30 분 동안 변성시켰다. 요오도아세타미드를 20 mM의 농도로 첨가하고, 샘플을 암실에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 샘플을 1/50(w/w) 트립신(Promega)으로 분해하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
샘플을 U3000-RSLC 시스템(Thermo) 상에서 분 당 300 nL의 유속으로 Acclaim PepMap 100 분석 컬럼(L x ID 15 cm x 75 ㎛, C18, 3 ㎛, 100 Å)(Thermo) 상에 직접 로딩하였다. 이동상은 H2O 중 0.1% HCOOH(용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% HCOOH(ACN)(용매 B)에 있었다. 샘플을 2%에서 40% 용매 B 범위까지 30분 구배로 분리하고, 용출성 펩타이드를 NanoSpray II ESI 소스(AB Sciex)를 가진 4000 QTRAP 질량 분광계(AB Sciex) 내로 직접 분무하였다. 선별된-반응-모니터링(SRM) 방법을 사용하여, 글리코실화된 펩타이드 EEQYNSTYR을 표적화하고, 이때 3중 4중극(quadrupole)은 하기 SRM 전이 목록을 통해 체류 시간 250 ms로 순환시켰다: Pep-GlcNAc: 696.8 (2+) / 526.3 (+) 및 696.8 (2+) / 1189.5 (+) (DP 81.9 V, CE 39.8 eV), Pep-GlcNAc-Gal: 777.8 (2+) / 526.3 (+) 및 777.8 (2+) / 1,189.5 (+) (DP 87.8 V, CE 43.9 eV), Pep-GlcNAc-Gal-Sial: 923.4 (2+) / 526.3 (+) 및 923.4 (2+) / 1,189.5 (+) (DP 98.4 V, CE 51.2 eV). 526.3-Da 단편 이온(y4-ion, STYR)을 정량제로 사용하였으며, 1,189.5-Da 단편 이온(당-개질 기의 손실)을 정성제로 사용하였다. 데이터의 분석 및 가공은 스카이라인(Skyline)을 사용하여 수행하였다25. 이 실험을 2회 수행하였다. 실험 중 1회는 기술적 이중으로서 수행하였으며, 나머지 1회는 기술적 삼중으로서 수행하였다.
시알화된 글리칸 및 갈락토실화된 글리칸의 비율.
시알화된 글리코삭제 글리칸의 백분율을 계산하기 위해, 본 발명자들은 분해되지 않은 Gal-GlcNAc-N(m/z = 3622.3) 및 GlcNAc-N(m/z = 3460.2) 당펩타이드(AGalGlcNAcUndig 및 AGlcNAcUndig) 및 α-2,3-시알리다제 분해된(AGalGlcNAcDig 및 AGlcNAcDig) 글리코삭제 GM-CSF 샘플에 대한 MALDI MS 스펙트럼으로부터의 피크 하 면적을 추출하였다. 시알화된 글리칸의 백분율을 하기 식에 나타낸 바와 같이 계산하였다. Gal-GlcNAc-N 피크 면적을 우선 두 스펙트럼 모두에서 GlcNAc-N 피크 영역으로 정상화하였다. 분해되지 않은 샘플로부터의 Gal-GlcNAc-N 피크에 대한 결과적인 값을 시알리다제-분해된 샘플로부터의 Gal-GlcNAc-N 피크 값으로부터 제하였다. 그런 다음, 이 차이를 분해된 샘플에서의 GlcNAc 및 GalGlcNAc 피크의 총합된 정상화된 피크 면적(N27 또는 N37을 포함하는 당펩타이드의 총 정상화된 피크 면적)으로 나누었다.
Figure 112016032135533-pct00005
갈락토실화된 (이당류) 글리코삭제 글리칸의 백분율을 계산하기 위해, 동일한 데이터세트를 이용하였다. 갈락토실화된 글리칸의 백분율을 하기 식에 나타낸 바와 같이 계산하였다. Gal-GlcNAc-N에 대한 피크 면적을 다시 시알리다제-분해된 샘플 및 분해되지 않은 샘플 둘 다에서 우선 정상화하였다. 그런 다음, 분해되지 않은 Gal-GlcNAc-N 피크에 대한 정상화된 피크 면적을 분해된 샘플에서의 GlcNAc-N 및 Gal-GlcNAc-N 피크의 총합된 정상화된 피크 면적(N27 또는 N37을 포함하는 당펩타이드의 총 정상화된 피크 면적)으로 나누었다.
Figure 112016032135533-pct00006
GM- CSF 생물활성 실험 및 TF1 증식 분석법.
TF1 세포(ATCC n° CRL-2003)를 RPMI 1640, 10% (v/v) FBS, 2 mM의 L-Gln 및 2 ng/mL의 재조합 인간 GM-CSF에서 37℃, 5% CO2에서 유지시켰다. 분석법을 시작하기 전에, 세포를 사이토카인을 포함하지 않는 배지로 3회 세정하였다. 후속해서, 세포를 사이토카인을 포함하지 않는 배지에 다시 놔둔 다음(㎖ 당 200,000개 세포) 37℃에서 2 시간 동안 놔두었다.
분석법의 개시 시, 세포를 96-웰 플레이트에서 평판배양하고(웰 당 배지 100 ㎕ 중 20,000개 세포), 상이한 글리코형의 GM-CSF의 단계 희석액(54 ng/mL 내지 8 pg/mL)을 첨가하였다. 세포를 48 시간, 72 시간 및 96 시간 동안 인큐베이션한 후, 기술된 바와 같이28, MTT 분석법(3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드)을 수행하였다. 간략하게는, 20 ㎕의 MTT(5 mg/mL 스톡)를 웰 당 첨가하고, 인큐베이션하였다. 37℃에서 4시간 후, 정지 용액(0.01 M HCl 중 10% SDS) 80 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 더 인큐베이션하였다. 마지막으로, 광학 밀도를 595 nm에서 측정하였다. 도 2d에 도시된 데이터포인트는 3개의 기술적 복제물의 값을 의미한다. 오차 막대는 s.d.이다. GM-CSF 글리코형들 사이의 보고된 차이는 이들 실험의 기술적 최적화의 몇몇 반복에서 관찰되었다. 완전히 최적화된 생물활성 실험의 결과가 나타나 있다.
토끼 면역화.
13주령 내지 16주령의 뉴질랜드 화이트 수컷 또는 암컷 토끼(각각의 항원에 대해 2마리의 토끼, 결과는 도 7 및 도 14에 도시된 단지 1마리의 토끼로부터 얻은 것임)에게 293S GM-CSF, 글리코삭제 GM-CSF, 293S 항-CD20 또는 글리코삭제 항-CD20을 주사하였다. 500 ㎕의 항원 용액 중 50 ㎍의 항원(0.9% NaCl 용액에서 500 ㎕까지 희석시킨 50 ㎍의 단백질) + 500 ㎕의 완전 프로인트 아쥬반트를 0 일, 14 일, 28 일 및 56 일째에 피하 주사하였다. 토끼에서 0 일(예비면역 채혈), 38 일, 66 일 및 80 일째(최종 채혈)에 채혈하였다. 면역화를 CER 그룹에 의해 수행하였으며, CER 그룹의 윤리 위원회에 의해 승인을 받았다.
글리코삭제 단백질을 이용한 혈청 ELSIA .
글리코시다제 분해를 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. Maxisorp 마이크로타이터 플레이트의 웰을 50 ㎕의 코팅 완충액(0.05 M Na2CO3, 0.05 M NaHCO3, pH 9.6) 중 0.25 ㎍/mL의 GM-CSF 또는 0.15 ㎍/mL의 항-CD20으로 코팅하고(밤새, 4℃), PBS + 0.1% Tween으로 3회 세정하였으며, 250 mM 글리신을 포함하는 PBS 중 1% BSA로 실온에서 2 시간 동안 차단하였다. 차단 완충액을 제거하고, 플레이트를 밤새 건조하였다.
검출 항체(항-GM-CSF 토끼 혈청, 최종 채혈; 항-(항-CD20) 토끼 혈청, 최종 채혈)를 PBS + 0.1% Tween20 + 0.1% 염소 혈청에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 세정 완충액으로 4회 세정한 후, PBS + 1% BSA 중 당나귀 항-토끼 HRP(1:2,000)(cat no. NA934, GE Healthcare)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
본 발명자들은 플레이트를 다시 세정 완충액으로 3회 세정하였으며, 이때, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, BD OptEIA) 기질(웰 당 100 ㎕)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 50 ㎕의 정지 용액(2 N H2SO4)을 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
GM-CSF를 이용한 ELISA를 2개의 생물학적 복제물(면역화된 2마리의 토끼; 도 7e, 도 7f)을 사용하여 1회 수행하였다. 항-CD20을 이용한 ELISA를 2개의 생물학적 복제물(면역화된 2마리의 토끼)을 사용하여 1회 수행한 다음, 생물학적 복제물 중 하나는 3개의 기술적 복제물을 사용하여 반복하였다. 후자의 실험 결과를 도 14f에 도시한다. 이 도면에서 도시된 데이터포인트는 3개의 기술적 복제물로부터의 값을 의미한다. 오차 막대는 s.d.이다.
항-CD20에 의한 CD20 결합.
Raji 세포 상의 Fc 수용체를 항-CD32 항체 IV.3(ref. 29)(기업에서 생산됨) 및 AT10(cat no. MCA1075, AbD Serotec)을 10 ㎍/mL에서 차단하였고, 세포와 함께 얼음 상에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 세포를 96-웰 플레이트(웰 당 105개 세포)로 평판배양하고, 293S 항-CD20 또는 293S글리코삭제 항-CD20을 10 ㎍/mL부터 시작하여 희석 단계물에 첨가하였다. 세포를 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBS + 2% BSA로 2회 세정하였다. 항-CD20을 검출하기 위해, DyLight 649에 컨쥬게이트된 항-F(Ab)2 이차 항체(cat no. 109-496-097, Jackson laboratories)를 1:200의 희석비로 첨가하였다. 세포를 다시 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고, PBS + 2% BSA로 2회 세정하였다. 세포를 고정하기 위해, 150 ㎕의 고정제(CellFIX, Becton Dickinson)를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이차 항체를 유세포분석(FACSCalibur, Becton Dickinson)을 통해 검출하였다. 도 3c에 도시된 데이터포인트는 3개의 기술적 복제물로부터의 평균값을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.이다. 이 실험을 2회 수행하였다.
FcγR 표면 플라즈몬 공명 실험.
Biacore 2000 SPR 바이오센서(GE Healthcare)를 사용하여, FcRn과 상이한 항-CD20 글리코형의 상호작용을 분석하였다. 모든 실험을 25℃에서 수행하였다. CM5 칩을 EDC(1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카르보다이이미드) 및 NHS(N-하이드록시숙신이미드)의 용액으로 7 분 동안 가교에 대해 10 ㎕/분의 유속으로 활성화시켰다. 다음, 10 mM 아세트산염 완충액, pH 5.0 중 10 ㎍/mL의 스트렙타비딘(Roche)을 동일한 유속으로 7 분 동안 부동화시켜, 1,180 내지 1,280 공명 단위(RU) 범위의 밀도를 수득하였다. 부동화 후, 칩을 1 M의 에탄올아민을 7 분 동안 주사하여 차단하였다. 부동화를 완료하기 위해, 칩을 20 ㎕의 40 mM NaOH, 1 M NaCl 완충액으로 3회 세정하였다.
hFcRn을 스트렙타비딘 센서 표면 상에 부동화하기 위해, pH를 HBS-EP 완충액, pH 8.0(GE Healthcare)을 사용하여 프라이밍함으로써 pH 8.0으로 만들었다. 비오티닐화된 hFcRn(NovImmune에서 생산됨)30을 HBS-EP 완충액에서 희석시키고, 칩 상에 부동화하였다. 그런 다음, 시스템을 pH 6.0에서 HBS-EP 완충액으로 프라이밍하였다.
IgG를 67 nM 내지 2 nM 범위의 상이한 농도에서 주사하고, HBS-EP 완충액, pH 6.0에서 희석시켰다. 각각의 주사를 이중 중복으로 30 ㎕/분의 유속에서 매번 3 분 동안 수행하였다. 해리를 12 분 동안 모니터링하였다. HBS-EP 완충액, pH 8.0을 재생에 사용하였다. 결과를 2중 참조하고, Langmuir 1:1 피팅 모델(BIAeval 소프트웨어 버전 4.1)을 사용하여 분석하였다.
경쟁 ELISA.
Maxisorp 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 50 ㎕의 PBS 중 코팅 항체(FcγRI ELISA의 경우 8 ㎍/mL의 항-유전자형(anti-idiotype) 항체; FcγRIIa 및 FcγRIIb의 경우 각각 16 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 HZ 15C1, 인간화된 항-TLR4 IgG1(NovImmune))로 밤새 코팅한 다음, 세정 완충액(PBS + 0.05% Tween)을 사용하여 5회 세정하고, 웰 당 PBS 중 3% BSA 250 ㎕로 37℃에서 1 시간 동안 차단하였다. 차단 후, 플레이트를 세정 완충액으로 5회 세정하였다.
50 ㎕의 항-CD20을, 50 ㎕의 His-태깅된 FcγR(FcγRI, 0.030 ㎍/mL; FcγRIIaR, 0.056 ㎍/mL; FcγRIIb, 1 ㎍/mL(R&D Systems))을 포함하는 희석 완충액(PBS + 1% BSA)에서 단계 희석물에 든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하고, 세정 완충액으로 5회 세정하였다. HRP-표지된 항-His 항체(cat no. 34660, Qiagen)를 희석 완충액에서 1:2,000의 희석비로 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정 완충액으로 5회 세정한 후, 50 ㎕의 TMB 슈퍼-슬로우(super-slow)(Diarect) 기질을 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 암실에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 50 ㎕의 정지 용액(2 N H2SO4)을 첨가하였다. 450 nm에서의 흡광도를 Synergy HT 플레이트 판독기(Biotek)를 사용하여 측정하였다.
도 14e(상부의 3개 패널)에 도시된 데이터포인트는 3개의 기술적 복제물의 평균값을 나타낸다. 오차 막대는 s.e.m.이다. 293S-생산된 항체와 293S글리코삭제-생산된 항체 사이의 보고된 차이는 이들 실험의 기술적 최적화의 몇몇 반복에서 관찰되었으며, 완전히 최적화된 ELISA의 결과가 도시되어 있다.
생물층 간섭법 분석법.
정제된 IgG의 FcγRIIIa에의 실시간 결합을 Octet RED96 시스템(Fortebio, 미국 캘리포니아주 멘로 파크) 상에서의 생물층 간섭법(BLI)을 사용하여 평가하였다. 분석법을 1 mM 인산염, 15 mM NaCl, 0.002% (vol/vol) Tween 20, 0.005% (wt/vol) 나트륨 아자이드, 0.1 mg/mL (wt/vol) BSA, pH 7.4을 함유하는 카이네틱스 완충액에서 30℃의 온도에서 수행하였다. 헥사히스티딘 태그로 태깅된 FcγRIIIaV(R&D Systems, 미국 미네소타주)를 카이네틱스 완충액 내에서 1.5 ㎍/mL의 농도로 만들었다. 수용체는 항-펜타-His 바이오센서(Fortebio, 미국 캘리포니아주 멘로 파크) 상에서 10 분 동안 포착하였다. 리간드 밀도는 0.5 nm였다. 기준선 신호는 카이네틱스 완충액에서 2 분 동안 인큐베이션한 후, 안정화되었다.
제1 결합 분석법을 카이네틱스 완충액 중 50 ㎍/mL의 단일 농도에서 IgG를 사용하여 수행하였다. 결합 및 해리를 5 분 동안 모니터링하였다. 센서를 10 mM 글리신 pH 3.0 완충액과 함께 20 초 동안 인큐베이션하고, 카이네틱스 완충액에서 20 초 동안 인큐베이션함으로써 재생을 수행하였다. 이들 인큐베이션을 2회 반복하여 완전한 재생을 달성하였다.
카이네틱스 실험의 경우, FcγRIIIaV-코팅된 바이오센서를 333 nM 내지 19.3 nM 범위의 농도에서 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 카이네틱스 완충액 내에서 2 분간의 기준선 상황 후, 5 분간의 결합 기가 이어졌으며, 이후 15 분간의 해리 기가 이어졌다. 재생을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 친화성을 정상 상태의 모델을 사용하여 평형 상태에서 확인하였다. 모든 분석들을 ForteBio Data 분석 소프트웨어(Fortebio, 미국 캘리포니아주 멘로 파크)를 사용하여 수행하였다.
ADCC 분석법.
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 Ficoll 튜브(Vacutainer 튜브 CPT, Becton Dickinson)에서 원심분리한 후, 신선한 혈액으로부터 단리하였다. 자연 살해(NK) 세포를 음성 NK 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 PBMC 풀로부터 단리하였다. 이들 세포를 성장 배지(RPMI 1640 + 10% FBS + 2 mM 글루타민) + 10 ng/mL IL-2에서 밤새 활성화시켰다.
Raji 세포를 웰 당 20,000개 세포로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 항-CD20 항체의 25 ㎕ 샘플을 5 ㎍/mL에서 시작하는 1:5 희석 시리즈(ADCC 배지: RPMI 1640 + 1% BSA + 2 mM 글루타민 + 25 ㎍/mL 겐타마이신에서)에 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. NK 세포를 Raji 세포에 1:5(Raji/NK)의 비율로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 각각의 웰에 대해 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 수준을 측정함으로써 특정 용해를 확인하였다(세포독성 검출 키트 플러스(Cytotoxicity Detection Kit PLUS), Roche).
도 14e(하부)에서 데이터포인트는 3개의 기술적 복제물로부터의 평균값을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.이다. 보고된 프로파일은 이들 실험의 기술적 최적화의 몇몇 반복에서 관찰되었으며, 완전히 최적화된 실험의 결과가 도시되어 있다.
약물동력학 .
암컷의 8-주령 C57BL/6J 마우스(Charles River) 36마리로 구성된 2개의 그룹을 무작위로 할당하여, 18.5 ㎍(체중 1 kg 당 1 mg)의 293S 항-CD20 또는 293S글리코삭제 항-CD20을 정맥내 주사하였다. 각각의 시점(1 시간, 24 시간, 48 시간, 4 일, 7 일, 10 일, 14 일, 21 일 및 28 일)에서, 치료군 당 4마리의 마우스를 최종 채혈을 위해 안락사시키고, 항-CD20의 농도를 FastELYSA 인간 IgG 키트(RD-Biotech)를 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 확인하였다. 도 14g에 도시된 데이터포인트는 각각의 시점에 대한 평균값(4마리)이다. 오차 막대는 s.e.m.이다. 이 실험을 주사 후 보다 이른 시점에서 채혈과 함께 반복하였다(도 17 참조). 실질적인 이유로, 실험자들은 마우스의 치료군 할당에 대해 블라인드(blind)가 아니었다. 이 실험은 겐트 대학교(벨기에) 및 제네바의 칸토널 수의 센터(Cantonal Veterinary Office)(스위스)의 윤리 위원회로부터 승인을 받았다.
pCAGGS -s-엔도 T, pCAGGS - GM 2 S -엔도 T 및 pCAGGS -ST-엔도 T의 작제 .
신호 서열을 포함하지 않는 엔도 T 코딩 서열3을 완전 크기의 엔도 T 코딩 서열, PCR 프라이머 PR1 및 PR4(ST-엔도 T의 경우), PR2 및 PR4(GM2S-엔도 T의 경우) 또는 PR3 및 PR4("엔도 T"의 경우)를 함유하는 pUC19 클로닝 벡터로부터 증폭시켰다. 모든 프라이머 서열은 보조 노트 2에 제공된다. ST6GalI4(ST-엔도 T의 경우) 및 B4GALNTI5(GM2S-엔도 T의 경우)의 N-말단 부분에 대한 코딩 서열을 각각 프라이머 PR5, PR6 및 PR7, PR8을 사용하여 인간 간암종 G2 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다. 신호 서열을 포함하지 않는 ST-엔도 T, GM2S-엔도 T 및 엔도 T를 생산하기 위한 융합 PCR 반응을 각각 PR5 및 PR4, PR7 및 PR4 및 PR3 및 PR4를 사용하여 설정하였다. XhoI 및 Bsu36I을 사용한 융합 PCR 생산물 ST-엔도 T, GM2S-엔도 T 및 엔도 T의 후속적인 분해, 및 XhoI 및 Bsu36I에 의해 분해되고 탈인산화된 pCAGGS 플라스미드 내로의 연결에 의해, pCAGGS-ST-엔도 T 및 pCAGGS-GM2S-엔도 T 플라스미드가 생산되었다. s-엔도 T 작제물에 대한 dsDNA 신호 서열은 올리고뉴클레오타이드 PR9 및 PR10을 어닐링함으로써 생산하였다. pCAGGS-엔도 T 플라스미드를 XhoI 및 KpnI을 사용하여 분해하였다. 어댑터의 플라스미드 내로의 후속적인 연결에 의해, pCAGGS-s-엔도 T 플라스미드가 생산되었다.
형질감염 및 샘플 제조.
세포를 기술된 바와 같이 형질감염시켰다(온라인 방법을 참조함). pCAGGS-s-엔도 T, pCAGGS-GM2S-엔도 T 또는 pCAGGS-ST-엔도 T를 사용한 형질감염 후 3일째에, 세포 및 상층액을 수집하였다. 세포 용해물의 경우, 세포를 1000 rpm에서 원심분리에 의해 수집하고, PBS로 1회 세정하였다. 약 1x106개의 세포를 500 ㎕ RIPA 완충액(150 mM 염화나트륨, 1.0% Igepal CA-630, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트 및 50 mM Tris, pH 8.0)과 함께 4℃에서 회전 플랫폼 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음, 불용성 물질을 폐기함으로써, 세포 용해물을 생산하였다. 20 ㎕ 샘플에 5 ㎕ 5x SDS-PAGE 로딩 완충액(새로 첨가된 8.3% SDS, 41.7% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀 블루, 208 mM Tris-HCl, pH 6.8 및 65 mM 다이티오트레이톨)을 보충하고, 10 분 동안 끓였다.
세포 배양 상층액의 500 ㎕ 샘플은 마이크로원심분리기에서 14,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리에 의해 투명하게 하고, 2부피의 냉각된 아세톤을 첨가함으로써 아세톤 침강시키고, 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 침강된 샘플을 마이크로원심분리기에서 14,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고, 상층액을 폐기하였다. 80 ㎕의 초순수한 물 및 20 ㎕ 5x SDS-PAGE 로딩 완충액을 첨가함으로써 펠렛을 용해시키고, 끓여서 단백질 펠렛을 재용해시키고 변성시켰다.
면역블로팅 .
세포 용해물 또는 상층액 샘플의 25 ㎕ 분취물을 엔도 T 융합 단백질의 존재에 대해 면역블로팅에 의해 분석하였다. 간접 검출을 엔도 T 효소(CER groupe, Departement Sante, 벨기에 마를로이)에 대한 통상 생산된 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 수행하였다. 항원은 피키아 파스토리스에서 생산되는 엔도 T였으며, 이를 본 발명자들의 실험실에서 정제하였다. 최종적인 항원 조제물은 인산염 완충 식염수 중 1 mg/mL 항원이었다. 이차 항체는 IRDye 680 염소 항-토끼 IgG(LI-COR Biosciences, 미국 네브래스카주 링컨)였다. C-말단 가공을 평가하기 위해, 동일한 블롯을 myc 태그(Life Technologies, 영국 페이즐리)에 대한 마우스 일차 항체 및 IRDye 800 염소 항-마우스 IgG 이차 항체(LI-COR Biosciences, 미국 네브래스카주 링컨)로 프로빙하였다.
엔도 T 융합 단백질에 의한 생체내 탈-N-글리코실화를 평가하기 위해, 융합 작제물을, 펜타-His 태그(세포는 겐트 대학교의 의사 S. Savvides 교수로부터 친절하게 제공받음)로 C-말단에서 태깅된 Flt3 수용체 세포외 도메인(Flt3ECD)을 안정하고 유도적으로 발현하는 293SGnTI-/- 세포, 또는 Rho1D4 태그로 C-말단에서 태깅된 5-하이드록시트립타민 수용체 1D(5HT1D)를 안정하고 유도적으로 발현하는 293SGnTI-/- 세포로 일시적으로 형질감염시켰다(형질감염에 대해서는 온라인 방법을 참조함)(안정한 5HT1D 세포주 단리에 대해서는 이의 보조적인 도 5의 방법을 참조함). 생산된 세포주를 엔도 T 융합 작제물 또는 빈(empty) 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고, 2 ㎍/mL 조직 배양 등급의 테트라사이클린 및 5 mM 나트륨 부티레이트(둘 다 Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스)를 사용하여 유도하였다. 상층액(Flt3ECD 생산용)을 형질감염/유도 후 48 시간 및 72 시간째에 수집하거나, 세포(5HT1D 생산용)를 형질감염/유도 후 72 시간째에 수집하였다.
Flt3ECD의 경우, 세포 상층액의 20 ㎕ 분취물을 SDS-PAGE 상에서 진행시키고, Flt3의 가공을 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 일차 항체는 마우스 항-펜타 히스 태그(Qiagen, 독일 힐덴)였으며, 이차 항체는 항-마우스 IgG-커플링된 HRP(GE Healthcare Biosciences, 미국 펜실베니아주 피츠버그)였다.
5HT1D의 경우, 세포를 1000 rpm에서 원심분리에 의해 수집하고, PBS로 1회 세정하였다. 약 1x106개 세포를 500 ㎕ RIPA 완충액과 함께 4℃에서 회전 플랫폼 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서, 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음, 불용성 물질을 폐기함으로써, 세포 용해물을 생산하였다. 20 ㎕ 샘플에 5 ㎕ 5x SDS-PAGE 로딩 완충액을 보충하고 10 분 동안 끓인 다음, 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 웨스턴 블롯 분석을 일차 마우스 항-Rho1D4 항체(브리티쉬 컬럼비아 대학교) 및 이차 항-마우스 IgG-커플링된 HRP를 사용하여 수행하였다.
엔도 T-발현 클론 및 293SGnTI-/- 세포 둘 다의 조기 스플릿(split)(#+8)을 증가하는 ConA 농도: 0 ㎍/mL 내지 22 ㎍/mL의 존재 하에 웰 당 30,000개 세포로 24-웰 플레이트에 평판배양하였다. ConA를 스플리팅 시 즉시 첨가하였다. ConA를 함유하지 않는 웰 내의 세포가 풍부할 정도로 성장된 경우, 종점을 현미경적으로 확인하였다. ConA의 농도가 성장을 웰의 10% 이하의 풍부도로 감소시키기 때문에, 종점을 위상차 현미경을 통해 규정하였다. 엔도 T 발현의 장기 안정성의 평가에 있어서, 후기 스플릿 세포(#+28)를 조기 스플릿 세포(#+8)와 비교하였다.
엔도 T CDS 입증.
CDS의 존재를 입증하기 위해, 게놈 DNA를 Gentra Puregene 코어 키트 A(Qiagen, 독일 힐덴)를 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여, 293S글리코삭제 세포주 및 293SGnTI-/- 세포주 둘 다의 약 1x106개 세포로부터 생산하였다. 터치다운 PCR 반응을 각각의 50 ㎕ 반응물 및 프라이머 PR11 및 PR12에 대해 약 10 ng의 게놈 DNA를 적용하는 Phusion® High-Fidelity DNA 중합효소(New England Biolabs, 미국 메사추세츠주 입스위치)를 사용하여 수행하였다. PCR 주기는 프라이머 어닐링 온도를 매 2 주기마다 1℃씩 67℃에서 64℃로 낮추고, 64℃에서 30 주기 동안 유지시키는 터치다운 프로토콜이었다(총 36 주기에 달함). PCR 생산물을 DNA-500 시약 키트(Shimadzu Corporation, 일본 교토)를 제조업체의 지시사항에 따라 적용하는 Shimadzu MultiNA 마이크로칩 DNA/RNA 전기영동 시스템으로 분석하였다.
엔도 T 융합 단백질 입증.
ST-엔도 T 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다. 방법은 이차 항체가 IRDye 800 염소 항-토끼 IgG 항체(LI-COR Biosciences, 미국 네브래스카주 링컨)인 점을 제외하고는, 보조적인 도 1에 기술된 것과 동일하였다.
293S GM- CSF의 DSA -FACE 분석.
N-연결된 올리고당류를 96-웰 플레이트 막 플레이트의 웰에서 PVDF 막으로 블로팅 시 정제된 단백질로부터 생산하고, 이전에 기술된 바와 같이 ABI 3130 모세관 DNA 시퀀서를 사용하여 레이저-유도 형광 검출(CE-LIF)을 수반하는 모세관 전기영동에 의해 분석하였다6.
Figure 112016032135533-pct00007
Figure 112016032135533-pct00008
Figure 112016032135533-pct00009
Figure 112016032135533-pct00010
Figure 112016032135533-pct00011
Figure 112016032135533-pct00012
Figure 112016032135533-pct00013
Figure 112016032135533-pct00014
참조
알파벳 참조:
Barb AW, Prestegard JH. NMR analysis demonstrates immunoglobulin G N-glycans are accessible and dynamic. Nat Chem Biol. 2011; 7(3):147-53.
Buck PM, Kumar S, Singh SK. Consequences of glycan truncation on Fc structural integrity. MAbs. 2013; 5(6):904-16.
Chen X, Liu YD, Flynn GC. The effect of Fc glycan forms on human IgG2 antibody clearance in humans. Glycobiology. 2009; 19(3):240-9.
Elliott, S. et al. Control of rHuEPO biological activity: The role of carbohydrate. Experimental Hematology 32, 1146-1155 (2004).
Ferrara, C. et al. Modulation of therapeutic antibody effector functions by glycosylation engineering: Influence of Golgi enzyme localization domain and co-expression of heterologous β1, 4-N-acetylglucosaminyltransferase III and Golgi α-mannosidase II. Biotechnology and Bioengineering 93, 851-861 (2006).
Huang C. Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY technology. Curr Opin Biotechnol. 2009; 20(6):692-9.
Jefferis R. Glycosylation of natural and recombinant antibody molecules. Adv Exp Med Biol. 2005; 564:143-8.
Krapp S, Mimura Y, Jefferis R, Huber R, Sondermann P. Structural analysis of human IgG-Fc glycoforms reveals a correlation between glycosylation and structural integrity. J Mol Biol. 2003; 325(5):979-89.
Lux, A., Yu, X., Scanlan, C.N. & Nimmerjahn, F. Impact of immune complex size and glycosylation on IgG binding to human FcγRs. J. Immunol. 190, 4315-4323 (2013).
Millward TA, Heitzmann M, Bill K, Laengle U, Schumacher P, Forrer K. Effect of constant and variable domain glycosylation on pharmacokinetics of therapeutic antibodies in mice. Biologicals 2008; 36(1):41-7.
Roopenian, D.C. & Akilesh, S. FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age. Nat. Rev. Immunol. 7, 715-725 (2007).
Wright A, Morrison SL. Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering. Trends Biotechnol. 1997; 15(1):26-32.
Yamaguchi Y, Nishimura M, Nagano M, Yagi H, Sasakawa H, Uchida K, Shitara K, Kato K. Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy. Biochim Biophys Acta. 2006; 1760(4):693-700.
넘버링된 참조
1. Ferrara, C. et al. Modulation of therapeutic antibody effector functions by glycosylation engineering: Influence of Golgi enzyme localization domain and co-expression of heterologous β1, 4-N-acetylglucosaminyltransferase III and Golgi α-mannosidase II. Biotechnology and Bioengineering 93, 851-861 (2006).
2. Li, H. & d' Anjou, M. Pharmacological significance of glycosylation in therapeutic proteins. Current Opinion in Biotechnology 20, 678-684 (2009).
3. Elliott, S. et al. Control of rHuEPO biological activity: The role of carbohydrate. Experimental Hematology 32, 1146-1155 (2004).
4. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R. & Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: High-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. PNAS 99, 13419-13424 (2002).
5. Robbins, P. W. et al. Primary structure of the Streptomyces enzyme endo-beta-N-acetylglucosaminidase H. J. Biol . Chem . 259, 7577-7583 (1984).
6. Stals, I. et al. Identification of a gene coding for a deglycosylating enzyme in Hypocrea jecorina. FEMS Microbiol . Lett . 303, 9-17 (2010).
7. Paroutis, P., Touret, N. & Grinstein, S. The pH of the Secretory Pathway: Measurement, Determinants, and Regulation. Physiology 19, 207-215 (2004).
8. Grundmann, U., Nerlich, C., Rein, T. & Zettlmeissl, G. Complete cDNA sequence encoding human beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase. Nucleic Acids Res 18, 667 (1990).
9. Verstraete, K. et al. Structural insights into the extracellular assembly of the hematopoietic Flt3 signaling complex. Blood 118, 60-68 (2011).
10. Stanley, P. Chinese hamster ovary cell mutants with multiple glycosylation defects for production of glycoproteins with minimal carbohydrate heterogeneity. Mol. Cell. Biol. 9, 377-383 (1989).
11. Lee, A. S. Coordinated regulation of a set of genes by glucose and calcium ionophores in mammalian cells. Trends in Biochemical Sciences 12, 20-23 (1987).
12. Hamblin, M. W. & Metcalf, M. A. Primary structure and functional characterization of a human 5-HT1D-type serotonin receptor. Mol Pharmacol 40, 143-148 (1991).
13. Lee, F. et al. Isolation of cDNA for a human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by functional expression in mammalian cells. PNAS 82, 4360-4364 (1985).
14. Moessner, E. et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood 115, 4393-4402 (2010).
15. Forno, G. et al. N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line. Eur . J. Biochem . 271, 907-919 (2004).
16. Crispin, M. et al. Inhibition of hybrid- and complex-type glycosylation reveals the presence of the GlcNAc transferase I-independent fucosylation pathway. Glycobiology 16, 748-756 (2006).
17. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N. & Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
18. Kitamura, T. et al. Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J. Cell. Physiol. 140, 323-334 (1989).
19. Nallet, S. et al. Glycan variability on a recombinant IgG antibody transiently produced in HEK-293E cells. New Biotechnology 29, 471-476 (2012).
20. Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery 8, 226-234 (2009).
21. Tradtrantip, L., Ratelade, J., Zhang, H. & Verkman, A. S. Enzymatic deglycosylation converts pathogenic neuromyelitis optica anti-aquaporin-4 immunoglobulin G into therapeutic antibody. Annals of Neurology 73, 77-85 (2013).
22. Nandakumar, K. S. et al. Dominant suppression of inflammation by glycan-hydrolyzed IgG. PNAS (2013). doi:10.1073/pnas.1301480110
23. Allhorn, M. & Collin, M. Sugar-free Antibodies―The Bacterial Solution to Autoimmunity? Annals of the New York Academy of Sciences 1173, 664-669 (2009).
24. Graham, F. L. & van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467 (1973).
25. MacLean, B. et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26, 966-968 (2010).
26. Tada, H., Shiho, O., Kuroshima, K., Koyama, M. & Tsukamoto, K. An improved colorimetric assay for interleukin 2. J. Immunol . Methods 93, 157-165 (1986).
27. Magistrelli, G. et al. Robust recombinant FcRn production in mammalian cells enabling oriented immobilization for IgG binding studies. J. Immunol. Methods 375, 20-29 (2012).
28. Anonymous. Biosimilar, biobetter and next generation therapeutic antibodies. MAbs 3, 107-110 (2011).
방법 부문에 대한 부가적인 참조
1. Fenteany, F. H. & Colley, K. J. Multiple signals are required for alpha2,6-sialyltransferase (ST6Gal I) oligomerization and Golgi localization. J. Biol. Chem. 280, 5423-5429 (2005).
2. Stanley, P. Chinese hamster ovary cell mutants with multiple glycosylation defects for production of glycoproteins with minimal carbohydrate heterogeneity. Mol. Cell. Biol. 9, 377-383 (1989).
3. Stals, I. et al. Identification of a gene coding for a deglycosylating enzyme in Hypocrea jecorina. FEMS Microbiol . Lett . 303, 9-17 (2010).
4. Grundmann, U., Nerlich, C., Rein, T. & Zettlmeissl, G. Complete cDNA sequence encoding human beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase. Nucleic Acids Res 18, 667 (1990).
5. Nagata, Y. et al. Expression cloning of beta 1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase cDNAs that determine the expression of GM2 and GD2 gangliosides. J. Biol. Chem. 267, 12082-12089 (1992).
6. Laroy, W., Contreras, R. & Callewaert, N. Glycome mapping on DNA sequencing equipment. Nat Protoc 1, 397-405 (2006).
7. Lockstone, H. E. Exon array data analysis using Affymetrix power tools and R statistical software. Brief. Bioinformatics 12, 634-644 (2011).
8. Smyth, G. K. Linear Models and Empirical Bayes Methods for Assessing Differential Expression in Microarray Experiments. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, (2004).
9. Schaegger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc 1, 16-22 (2006).
10. Gasteiger, E. et al. in The Proteomics Protocols Handbook (Walker, J. M.) 571-607 (Humana Press, 2005).
SEQUENCE LISTING <110> VIB VZW UNIVERSITEIT GENT <120> CELLS PRODUCING FC CONTAINING MOLECULES HAVING ALTERED GLYCOSYLATION PATTERNS AND METHODS AND USE THEREOF <130> NC/GLDEL/469 <140> PCT/EP2014/068946 <141> 2014-09-05 <150> EP 13183124.0 <151> 2013-09-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide from fc chain <400> 1 Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 aacaaggacg tacccgttaa agaactgca 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgcgagcacc gtacccgtta aagaactgca 30 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 ctcgagatgg tacccgttaa agaactcnag ttgagagc 38 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcacctgagg ttacagatct tcttcagaaa taagcttttg ttcagcgtta accatagcgt 60 agtagttgat gg 72 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gcactcgaga tgattcacac caacctgaag a 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttaacgggta cgtccttgtt ccacacctg 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcactcgaga tgtggctggg ccgccggg 28 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ttaacgggta cggtgctcgc gtacaggagc c 31 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tcgagatgaa gactatcatt gctttgagct acattttctg tctggtttgg gcccaagacg 60 tac 63 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gtcttgggcc caaaccagac agaaaatgta gctcaaagca atgatagtct tcatc 55 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gtgctgctcc tggttctttc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tcagccatag aaccgaaacc 20 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ctagaattcg cgatatcccg ggcccagcgc tgcggccgct cgagctagcg tttaaact 58 <210> 15 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gatcagttta aacgctagct cgagcggccg cagcgctggg cccgggatat cgcgaatt 58 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gcagtcgacc atgtccccac tgaaccagtc agc 33 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gcagcggccg cggaggcctt ccggaaaggg ac 32 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 aaacttaggc gggagccacc tggctggtct cagtactggc cttccggaaa gggac 55 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 ctcccgccta agtttaaacg tttaacccgg gtaaattccg c 41 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gattatgatc agtttaaaca ctagtaaatt ctagagtcgc ggc 43 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 ctcaagggcc ccttgacc 18 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 cgagcagaat tcaatggtga tgatggtgat gctcctggac tggctcccag 50 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Carboxy-terminal tetrapeptide <400> 23 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Carboxy-terminal tetrapeptide <400> 24 His Asp Glu Leu 1

Claims (15)

  1. 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열; 및
    Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열
    을 포함하는 고등 진핵 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    엔도글루코사미니다제 효소의 발현이 골지체를 표적으로 하는, 고등 진핵 세포.
  3. 제1항에 있어서,
    엔도글루코사미니다제 효소가 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제(E.C. 3.2.1.96)인, 고등 진핵 세포.
  4. 제3항에 있어서,
    엔도글루코사미니다제 효소가 엔도 T(Endo T)인, 고등 진핵 세포.
  5. 제1항에 있어서,
    포유류 세포인, 고등 진핵 세포.
  6. 서로 동일한 복수의 Fc 함유 분자로서,
    Fc 함유 분자의 Fc 부분의 N297 상에서의 글리코실화가 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어지고,
    복수의 Fc 함유 분자의 하나 이상이 단당류 구조 HexNAc가 아닌 글리칸을 갖고,
    엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열, 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열의 존재를 특징으로 하는 고등 진핵 세포에서의 생산에 의해 수득가능한 것을 특징으로 하는, 복수의 Fc 함유 분자.
  7. 서로 동일한 복수의 Fc 함유 분자로서,
    Fc 함유 분자의 Fc 부분의 N297 상에서의 글리코실화가 삼당류 구조 Neu5Ac-Hex-HexNAc, 이당류 구조 Hex-HexNAc 및 단당류 구조 HexNAc로부터 선택되는 하나 이상의 글리칸으로 이루어지고,
    복수의 Fc 함유 분자의 하나 이상이 단당류 구조 HexNAc가 아닌 글리칸을 갖는 것을 특징으로 하는, 복수의 Fc 함유 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    삼당류 구조가 Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc이고, 이당류 구조가 Gal-β-1,4-GlcNAc이고, 단당류 구조가 GlcNAc인, 복수의 Fc 함유 분자.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체인, 복수의 Fc 함유 분자.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한, 복수의 Fc 함유 분자.
  11. 제9항에 있어서,
    정맥내 면역글로불린 치료법에 사용하기 위한, 복수의 Fc 함유 분자.
  12. 엔도글루코사미니다제가 골지 위치화 신호에 작동 가능하게 연결된 엔도글루코사미니다제 효소를 인코딩하는 제1 외인성 핵산 서열, 및 Fc 함유 분자를 인코딩하는 제2 외인성 핵산 서열을 포함하는 고등 진핵 세포를, 엔도글루코사미니다제 효소 및 Fc 함유 분자를 발현시키기는 조건에서 제공하는 단계; 및
    Fc 함유 분자가 엔도글루코사미니다제와 세포내 접촉된 후에, Fc 함유 분자를 회수하는 단계
    를 포함하는, 고등 진핵 세포에서 잔기 N297 상에 특이적인 글리코실화 패턴을 갖는 Fc 함유 분자를 생산하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    Fc 함유 분자가 분비되는, 방법.
  14. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 Fc 함유 분자를 제공하는 단계; 및
    Fc 함유 분자를 인간이 아닌 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 항원 결합을 변경시키지 않으면서, Fc 함유 분자를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 Fc 함유 분자의 순환 시간을 증가시키는 방법.
  15. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 활성을 보유하고, 비-개질된 글리코형(glycoform)과 비교하여, 증가된 생체내 순환 시간을 갖는, 복수의 Fc 함유 분자.
KR1020167008817A 2013-09-05 2014-09-05 글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도 KR102232348B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13183124.0 2013-09-05
EP13183124 2013-09-05
PCT/EP2014/068946 WO2015032899A1 (en) 2013-09-05 2014-09-05 Cells producing fc containing molecules having altered glycosylation patterns and methods and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160048213A KR20160048213A (ko) 2016-05-03
KR102232348B1 true KR102232348B1 (ko) 2021-03-29

Family

ID=49165526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167008817A KR102232348B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-05 글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10202590B2 (ko)
EP (1) EP3041949B1 (ko)
JP (1) JP6553042B2 (ko)
KR (1) KR102232348B1 (ko)
AU (1) AU2014317092B2 (ko)
CA (1) CA2922888C (ko)
DK (1) DK3041949T3 (ko)
WO (1) WO2015032899A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102232348B1 (ko) 2013-09-05 2021-03-29 브이아이비 브이지더블유 글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도
TWI654202B (zh) 2014-05-27 2019-03-21 中央研究院 增進抗體功效之通用糖型之組合物及方法
JP2017518989A (ja) 2014-05-27 2017-07-13 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ 抗ｃｄ２０糖操作抗体群およびその使用
CA2991368C (en) 2015-07-09 2023-05-23 Vib Vzw Cells producing glycoproteins having altered n- and o-glycosylation patterns and methods and use thereof
JOP20190100A1 (ar) * 2016-11-19 2019-05-01 Potenza Therapeutics Inc بروتينات ربط مولد ضد مضاد لـ gitr وطرق استخدامها
CN108204958A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 伊缪泰普有限公司 结合测定
WO2018126092A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Development Center For Biotechnology Processes for preparing glycoprotein-drug conjugates
JP2020519261A (ja) 2017-05-11 2020-07-02 ブイアイビー ブイゼットダブリュＶｉｂ Ｖｚｗ 可変免疫グロブリンドメインのグリコシル化
US20200255878A1 (en) * 2017-09-14 2020-08-13 Vib Vzw Genetically engineered eukaryotic cells producing lacnac-glycoproteins
GB201714765D0 (en) * 2017-09-14 2017-11-01 Vib Vzw Means and methods for the production of glycoproteins comprising homogeneous sialylated carbonhydrates
GB201901608D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Vib Vzw Vaccine adjuvant conjugates
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
US20240150494A1 (en) * 2021-03-12 2024-05-09 The Rockefeller University Glycoform specific nanobodies and methods of use

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010015722A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Vib Vzw Cells producing glycoproteins having altered glycosylation patterns and methods and use thereof
WO2013120066A1 (en) * 2012-02-10 2013-08-15 University Of Maryland, Baltimore Chemoenzymatic glycoengineering of antibodies and fc fragments thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0549062B1 (en) 1991-12-23 1999-03-17 Gist-Brocades N.V. A eukaryotic expression system
US5721121A (en) 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
PT1522590E (pt) 2000-06-28 2009-10-26 Glycofi Inc Métodos para a produção de glicoproteínas modificadas
DE10062302A1 (de) 2000-12-14 2002-07-11 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Sekretionssignalpeptide, deren DNA-Sequenzen, damit herstellbare Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen und deren Verwendung zur biotechnologischen Herstellung von Proteinen
CN101680014B (zh) * 2007-04-03 2018-09-28 奥克西雷恩英国有限公司 分子的糖基化
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
KR102232348B1 (ko) 2013-09-05 2021-03-29 브이아이비 브이지더블유 글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010015722A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Vib Vzw Cells producing glycoproteins having altered glycosylation patterns and methods and use thereof
US20110191913A1 (en) 2008-08-08 2011-08-04 Vib Vzw Cells producing glycoproteins having altered glycosylation patterns and method and use thereof
WO2013120066A1 (en) * 2012-02-10 2013-08-15 University Of Maryland, Baltimore Chemoenzymatic glycoengineering of antibodies and fc fragments thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Develop Systems for Manufacturing 100,000,000 Doses of an Emergency Pharmaceutical (e.g. Vaccine or Monoclonal Antibody) Within 2 Months of Product Identification. 2006, Genencor Inter*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015032899A1 (en) 2015-03-12
EP3041949B1 (en) 2021-04-28
US20160200825A1 (en) 2016-07-14
US20190024066A1 (en) 2019-01-24
JP2016533757A (ja) 2016-11-04
US10202590B2 (en) 2019-02-12
CA2922888A1 (en) 2015-03-12
JP6553042B2 (ja) 2019-07-31
AU2014317092A1 (en) 2016-03-24
CA2922888C (en) 2023-04-11
US11421209B2 (en) 2022-08-23
KR20160048213A (ko) 2016-05-03
EP3041949A1 (en) 2016-07-13
DK3041949T3 (da) 2021-07-26
AU2014317092B2 (en) 2018-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102232348B1 (ko) 글리코실화 패턴이 변경된 Fc 함유 분자를 생산하는 세포 및 이의 방법 및 용도
Li et al. Crystallizable fragment glycoengineering for therapeutic antibodies development
AU2006283560B2 (en) Proteolysis resistant antibody preparations
US8642292B2 (en) Process for producing molecules containing specialized glycan structures
Vattepu et al. Sialylation as an important regulator of antibody function
US20090004179A1 (en) Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
KR101965585B1 (ko) 항체 글리코실화 변이체
DK2205258T3 (en) Method and structural conformations of antibody preparations with increased resistance to proteases
CN110088291A (zh) 用于体外糖工程化抗体的方法
CN110100007A (zh) 用于体外糖工程化抗体的酶的再使用
CN110088292A (zh) 用于体外糖工程化抗体的方法
EP3019601B1 (en) Methods for producing sialylated therapeutic proteins
WO2012105699A1 (ja) 補体依存性生物活性の高い抗体の産生法
CALLEWAERT et al. Patent 2922888 Summary
Meuris et al. GlycoDelete technology: simplifying mammalian cell N-glycosylation for recombinant protein expression
Pawlicki Use of homogeneous glycoproteins to investigate the regulatory role of N-linked glycosylation on the immunoglobulin G/FcγRIIIa interaction through biophysical studies

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant