KR102214014B1 - 구골나무 잎 추출물을 포함하는 항산화용 또는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따라 구골나무 잎 추출물과 이를 포함하는 항산화 조성물 및 암의 예방, 개선, 치료를 위한 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다. 상기 항암용 조성물은 화학 치료가 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없을 뿐만 아니라, 효과적인 표적화 항암치료 용도로 사용될 수 있다.

Description

구골나무 잎 추출물을 포함하는 항산화용 또는 항암용 조성물{Antioxidant or anticancer composition comprising extract of Osmanthus heterophylla leaf}

본 발명은 항산화, 항암 효과를 나타내는 구골나무 잎 추출물과 이를 포함하는 항산화 조성물 및 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

산화 스트레스(oxidative stress)는 과다하게 집적된 자유 라디칼 또는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성과 소거의 균형이 무너져 축적된 자유 라디칼 등에 세포가 노출된 상황이다. 산화 스트레스(oxidative stress)는 비선택적으로 세포 구성물질을 공격하여 혈관의 확장과 수축의 조화를 깨뜨리고 생체막의 과산화지질을 증가시키며, 조직세포에 산화적 손상을 주어 암, 노화, 퇴행성 신경질환, 심혈관 질환 등 여러 질병의 발생에 기여한다. 항산화 물질은 자유라디칼을 소거하여, 표적의 산화적 손상을 지연시키거나 방지 또는 제거함으로써 세포 손상 및 세포 사멸을 억제하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 맥락에서, 풍부한 항산화 식품 섭취는 산화스트레스와 관련된 질환 발생을 억제할 수 있기에 항산화 물질이 풍부한 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근 발병률이 상승하고 있는 두경부암은 입술, 구강, 코, 하인두, 후두, 갑상선과 경부의 연부조직 등 얼굴과 목의 거의 모든 부위에 발생하는 암을 말하며 비교적 발병률이 높은 암에 해당한다. 이는 환경학적, 영양학적, 및 병리학적 등 다양한 요인에 의하여 발병하는 것으로 알려져 있고, 주로 음주와 흡연, 식습관, 인간유두종바이러스(human papilloma virus, HPV)가 위험인자로 알려져 있다. 두경부암 중 구강암이 발병하면 궤양, 소괴, 균열, 적색반, 과립양상 등 매우 다양한 임상 증상이 발견된다. 구강암은 육안으로 쉽게 판별이 가능하여 조기발견이 가능함에도 불구하고 5년 생존율이 30%에 불과하며, 하인두에 발생할 경우 2차암의 병변도 빈발하여 더욱 예후가 좋지 않다.

구강암의 치료에는 수술적 치료, 방사선 요법 및 화학 요법 등의 비수술적 치료가 수행되고 있으나, 모든 치료 요법에 색소침착, 건조성 또는 습윤성 피부박리 및 모세 혈관 확장증과 구역, 구토, 구내염, 설사 및 골수기능장애 등의 부작용이 따라 효율적인 치료방법을 개발할 필요성이 있었다.

따라서, 암치료 방법 중 하나로 널리 쓰이는 화학 요법은 화학 약물의 발전에도 불구하고, 정상적인 조직에 대한 독성 및 부작용, 약물 저항성이 임상 적용에 주요 장애물로 남아있었다. 이러한 문제점 개선을 위해 부작용이 적고 효과가 뛰어난 항암제의 대안으로 항균 활성을 갖는 화합물을 가지고 있고, 합성 항생제보다 부작용이 적어 약용 식물이 주목받고 있다. 식물 추출물은 생물학적 활성을 갖는 페놀 유도체를 함유하고 있으며, 페놀 유도체는 항균 및 항산화 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 페놀 유도체 중 폴리페놀에 대해서 항암, 항간독성, 항염증, 항궤양, 항바이러스, 항알레르기 및 혈관 확장 등 생리 및 약리학적 작용이 알려져 있고, 폴리페놀은 항산화제로서 산화성 손상으로부터 세포를 보호함으로써 산화 스트레스와 연관된 다양한 질환의 위험을 줄일 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 종래 발견된 식물의 항암 활성 등은 합성 약물에 비해 낮은 수준에 불과하여 환자들은 부작용이 적고 안전한 사용이 가능한 항암제를 필요로 한다.

구골나무는 물푸레나무과(Oleaceae) 목서속(Osmanthus)에 속하는 식물로, 학명은 Osmanthus heterophyllus (G. Don) P. S. Green, 이명은 Ilex heterophylla G. Don인 상록성 떨기나무이다. 화랑가시나무로도 불린다. 줄기는 가지가 많이 갈라지고 연한 회갈색을 띤다. 잎은 마주나며, 난형으로 길이 3-7cm, 폭 2-3cm, 두껍고 광택이 난다. 잎 가장자리는 밋밋하나 어린 가지의 잎은 가장자리에 날카로운 가시가 있는 이 모양의 돌기가 있다. 우리나라 남부지방에 관상용으로 식재하며, 대만(타이완), 일본(남부) 등이 원산지로 알려져 있다.

종래 한의학에서는 구골나무의 가지, 잎 또는 나무껍질을 이용하여 간과 신장기능 활성, 종기, 백일해에 효과를 보이는 약재로 사용하여 생약으로 처방하고 있으나, 이러한 처방 또한 구골의 외형상의 형태 감별 방법 및 한방 의학적 약효와 탕액의 제조방법에 관한 간단한 언급에 불과하여 구골나무의 유효 활성 성분에 관하여서는 전혀 개시되어 있지 않았다.

또한, 구골은 산지 및 채취 시기별로 지표 성분의 함량 편차가 크게 나타나기 때문에 추출물의 규격화가 어렵고 재현성이 부족하여 상품화가 곤란하다는 사실도 해결하여야 할 문제점으로 남아있다.

관련 기술로, 등록특허 제10-0779026호는 구골 나무 자체의 추출물을 카페인을 지표성분으로 염증성 질환 치료 및 예방에 사용하였으나, 구골나무 잎 추출물의 항암효과에 대해서는 전혀 연구된 바가 없었다.

등록특허 제10-0779026호(2007.11.19)

본 발명의 목적은 안전한 천연물질이며, 산화스트레스를 억제하는 항산화 조성물과, 암세포의 세포자멸(apoptosis)을 유도함으로써, 악성종양이나 암, 특히 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 구골나무(Osmanthus heterophyllus) 잎에서 추출한 구골나무 잎 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 구골나무 잎 추출물은 베르바스코시드(Verbascoside)를 지표성분으로 포함하는 것일 수 있다.

베르바스코시드는 카페오일 페닐에타노이드 글리코시드(caffeoyl phenylethanoid glycoside)로, 이당체의 람노오스 부분에서 페닐프로파노이드 카페익산 및 페닐에타노이드 히드록시티고솔이 각각 에스테르 및 에테르 결합을 형성한다. 즉 β-(3′,4′-dihydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-β-D-(4-O-caffeoyl)-glucopyranoside이다. 베르바스코시드는 포도상구균에 항균 활성을 갖고, 소염 특성을 가지며, 단백질 키나제 C의 억제를 할 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 베르바스코시드의 농도는 15μM 내지 90μM, 바람직하게는 45μM 내지 80μM 일 수 있다. 베르바스코시드 함량이 15μM 미만일 경우 암세포 사멸 효과가 미미하며, 베르바스코시드 함량이 90μM 초과일 경우 정상 세포 성장을 저해할 수 있어 효과적인 항암 표적화 치료제로 사용이 불가하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 구골나무 잎 추출 용매는 물, 클로로포름, 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 증류수, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄올, 프레탄올(Prethanol), 프레탄올 A(Prethanol A), 발효 주정, 합성 주정일 수 있다. 추출 용매가 주정일 경우 용매의 농도는 30~60%인 주정일 수 있다. 주정 농도가 30% 미만일 경우 항산화능이 현저하게 감소하는 단점이 있고, 60% 초과일 경우 생산 장비 손상의 우려가 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 구골나무 잎 추출 조건은 50 내지 85℃의 온도에서, 20분 내지 1시간 동안, 1회 또는 2회 반복 추출하는 것일 수 있다.

상기 구골나무 잎 추출물의 추출온도는 50 내지 85℃이며, 바람직하게는 60 내지 80℃이다. 50℃ 미만에서는 구골나무 잎의 페놀류를 추출 가능한 온도에 도달하지 않아, 유효성분 추출이 제대로 되지 않고, 85℃ 초과시에는 추출된 페놀류의 휘발이 일어나 단위 추출물 당 유효성분 함량이 낮아지며 성분 변화가 발생한다. 추출 시간이 상기 범위를 벗어날 경우 유효성분 추출이 제대로 되지 않을 수 있다.추출 횟수는 1 내지 2회 실시하는데, 3회 이상 반복 추출시 유효성분의 파괴 등이 발생하여 총 verbascoside 함량이 감소한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 구골나무 잎 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 구골나무 잎 추출물의 농도를 60 내지 500㎍/ml으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 구골나무 잎 추출물 농도가 60㎍/ml 미만일 경우 항암 조성물로서 사용하기에 암세포 성장 억제 효과가 충분하게 나타나지 않고, 500㎍/ml 초과일 경우에는 정상 세포 증식 억제 효과가 나타날 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 구강암, 자궁암, 대장암, 유방암, 폐암, 피부암, 위암 및 간암 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물이 적용될 수 있는 구체적인 질환으로는 예를 들어, 구강암, 자궁암, 대장암, 유방암, 폐암, 피부암, 위암 및 간암 등과 같은 각종 암을 들 수 있으며, 바람직하게는 구강암이다. 상기 구강암은 구강 편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암 또는 선암일 수 있다.

또한, 상기 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 주사제, 경구제 또는 국소투여제로 제형화하여 사용할 수 있다.

이를 위해, 상기 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.

이러한 의약물로 제조 시에는 생약추출물 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(dilute)등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로 제조가 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 구골 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 구골 추출물은 체중 1 kg 당 0.1 ∼ 10 mg 정도를 투여하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 구골나무(Osmanthus heterophyllus) 잎 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 구골나무 잎 추출물은, 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량이 비교예의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량에 비해 매우 높다. 폴리페놀과 플라보노이드는 하나 이상의 하이드록실 그룹을 갖는 방향족 고리를 가지고 있으며, 하이드록실기는 좋은 전자 공여체이기에 항산화 작용에 직접 기여할 수 있어, 본 발명의 매우 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에 의해 본원 발명의 발풀고사리 조성물은 산화 스트레스를 감소시켜 항산화용 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 구골나무 잎 추출물을 포함하는 항산화용 조성물은 상기 구골나무 잎 추출물의 농도는 200 내지 1000 ㎍/ml로 하는 것일 수 있다. 바람직하게는 250 내지 1000 ㎍/ml일 수 있고, 더 바람직하게는 500 내지 1000㎍/ml일 수 있다. 구골나무 잎 추출물의 농도가 200㎍/ml 미만일 경우 라디칼 제거가 충분하게 일어나지 않을 수 있고, 1000㎍/ml초과일 경우 그 이하인 추출물과 항산화 효과가 거의 유사하여 조성물의 생산성이 감소한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 구골나무 잎 추출물을 포함하는 항산화용 조성물은 항산화용 화장료 조성물 또는 항산화용 식품 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 구골나무 잎 추출물은 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를 포함하고 있어 항산화 작용을 하므로 본원 발명의 항산화 조성물을 건강기능식품의 형태로 제공할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 항산화용 식품 조성물은 활성산소로 인해 발생하는 질환의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다. 상기 식품에 포함되는 상기 식품 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 10g, 바람직하게는 2 내지 7g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 식품은 식품 조성물로서 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 다양한 비타민, 미네랄, 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 당해 업계에 통상적으로 사용되는 방부제, 살균제, 산화방지제, 착색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.

본 발명에 의해 제조된 구골나무 잎 추출물은 냉면, 국수, 라면 등과 같은 면류와 퓨레, 푸딩 등 제과제빵, 음료류, 장류, 향료 등에 다양한 목적으로 응용할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 활성산소로 인해 발생하는 질환을 예방 또는 개선시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수, 묵 등을 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제공될 수 있으며, 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조절제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 구골나무 잎 추출물을 포함하는 항산화용 조성물은 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를 포함하고 있어 높은 활성 라디칼 제거 효과를 나타내고 산화 스트레스를 감소시킨다.

본 발명에 따른 구골나무 잎 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 기존의 항암치료 요법의 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없을 뿐 아니라, 효과적인 표적화 항암치료 용도로 사용될 수 있고, 특히 구강암 등에 효과적일 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1 조성물과 BHA(대조군)를 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타난다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 조성물과 BHA(대조군)를 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타난다.
도 3은 본 발명의 실시예 1의 조성물을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 1의 조성물을 농도별로 처리한 구강암세포, 정상세포에 대한 세포 독성 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 1의 조성물을 농도별로 처리한 구강암세포(FaDu)에서 효소 발현 정도를 Western blot으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 지표 물질인 베르바스코시드 농도에 따른 구강암세포, 정상세포에 대한 세포 독성 실험결과이다.

이하, 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하고자 하는 바, 다음 실시예 등에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1. 구골나무 잎 추출물의 제조]

실험에 사용한 구골나무(Osmanthus heterophylla) 잎은 음건하여 Dionex™ ASE™ 350 Accelerated Solvent Extractor를 이용하여 온도는 70℃, 가열시간 5분, 반응시간 15분, 1순환 조건으로 50% 주정(50% prethanol)을 이용하여 추출하였다. 추출물은 원심분리기를 이용하여 원심분리하여 부유물을 침전시킨 후 상층액을 0.45 um 주사기 필터를 이용하여 여과 후 농축하였다.

[실험예 1. DPPH 라디칼 소거능 측정]

실시예1 및 비교예 1~4 추출물의 DPPH(2,2-diphenyl-1-prcryhydrazyl) 라디칼 소거능은 Xie et al (2008)의 방법을 변형하하여 측정하였다. 1000, 500, 250, 125, 100㎍/ml로 희석된 시료를 96-well plate에 40 μL씩 분주하였다. 에탄올에 녹인 0.1 mM DPPH solution 160 μL를 시료와 섞어 25 ℃ 암실에서 30 분 동안 방치 후, Biochrom Asys UVM 340 (Cambridge, England)을 사용하여 517 nm에서 측정하였다. 양성 대조군으로는 BHA를 사용하였고, 농도 범위는 sample과 동일하게 하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 하기 계산식 1과 같이 계산되었다. 대조군은 샘플 대신 추출 용매를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 수행하였으며, 시험은 3 회 반복하였다.

[계산식 1]

1. 추출 용매에 따른 DPPH 라디칼 소거능

1000ug/ml 구골나무 잎 추출물에서 추출 용매 농도에 따른 DPPH

추출 용매(주정)	100%	70%	50%	30%	0%
DPPH (%)	17.94±2.00	52.63±0.13	49.85±1.07	33.48±1.74	21.43±0.13

구골나무 잎을 용매별(물, 30%주정, 50%주정, 70%주정, 100%주정)으로 추출할 경우 DPPH 라디칼 소거능이 용매 농도에 따라 증가하다가 오히려 100%주정 추출물에서 감소하는 것을 확인하였다. 70% 주정 추출물에서 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높았으나, 생산 시 450bar 이상의 과도한 압력을 요구하고, 장비 피복 손상의 문제 등이 발생하여 제품화에 어려움이 있다는 점이 실험을 통해 확인되었다.

2. 50% 주정 구골나무 추출물 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 도식화하여 도 1에 나타내었다.

본 실험에서는 추출물의 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하며, 100 ㎍/ml에서 38.67%를 나타내었고, 125, 250, 500, 1000 ㎍/ml에서 각각 43.98%, 49.65%, 54.60%, 59.92%로 활성을 보여 체내 산화 스트레스를 줄이며 항산화 작용을 하는 결과를 나타내었다.

[실험예2. ABTS 라디칼 소거능 측정]

ABTS(2,2 -azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 라디칼 소거능은 Re et al (2009) 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 증류수에 용해한 7 mM의 ABTS와 potassium persulfate 2.45 mM을 1:1로 혼합하고 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.4)을 혼합하여 16-24시간 동안 암소에서 냉장 보관하였다. 실험에 사용하기 직전 흡광도값이 0.90±0.02이 되도록 증류수로 희석하였다. 96-well plate에 희석된 용액 190 μL와 1000, 500, 250, 125, 100㎍/ml로 희석된 시료를 10μL씩 분주하였다. 암실에서 10분 동안 방치 후 Biochrom Asys UVM 340 (Cambridge, England)을 사용하여 734 nm에서 측정하였다. 양성 대조군으로는 BHA를 사용하였고, 농도 범위는 sample과 동일하게 하였다. ABTS 라디칼소거 활성은 하기 계산식 2와 같이 계산되었다. 대조군은 샘플 대신 추출 용매를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 수행하였으며, 시험은 3 회 반복하였다.

[계산식 2]

실험예 2의 ABTS 라디칼 소거 활성을 도식화하여 도 2에 나타내었다.

본 실험에서는 구골나무 잎 추출물의 농도가 증가할수록 ABTS 라디칼 소거 활성이 증가하며, 구골나무잎 50% 주정추출물을 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 100 ㎍/ml에서 1.86%를 나타내었고, 125, 250, 500, 1000㎍/ml에서 각각 4.04%, 10.82%, 25.36%, 38.09%로 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 체내 산화 스트레스를 줄이며 항산화 작용을 하는 결과를 나타내었다.

[실험예 3. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정]

본 실험예의 실험방법은 다음과 같다.

(1) 총 폴리페놀 함량은 Attardet al (2003)의 방법을 변형하여 측정하였다. Folin-Ciocalteureagen가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다. 분석할 시료를 96-well plate에 100 μL씩 분주하였다. 50배 희석한 2N Folin-Ciocalteureagen를 100 μL를 넣고 1% sodium carbonate 100 μL를 첨가하여 혼합한 후, 실온에서 40분간 반응시킨 뒤 Biochrom AsysUVM 340 (Cambridge, England)을 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, gallic acid를 이용하여 표준 검량 곡선을 작성하였다. 즉, gallic acid을 증류수에 녹여 최종 농도가 0, 5, 10, 20, 40 ㎍/ml 용액이 되도록 제조한 후 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 계산하였다. 50% 주정으로 추출한 구골나무잎의 총 폴리페놀 함량은 g당 mg gallic acid로 나타내었다.

(2) 총 플라보노이드 함량은 Moreno et al (2000)의 방법을 변형하여 측정하였다. 분석할 시료를 96-well plate에 20 μL씩 분주 후 10% aluminum nitrate 5 μL와 1 M potassium acetate 5 μL 및 ethanol 270 μL를 가하여 25°C에서 40분간 반응시킨 후 Biochrom Asys UVM 340 (Cambridge, England)을 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 표준 곡선은 quercetin (Sigma-Aldrich)을 이용하여 최종농도가 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/ml가 되도록 취하여 위와 동일한 방법으로 측정한 검량선으로 50% 주정으로 추출한 구골나무잎의 총 플라보노이드함량을 구하였다.

상기 실험의 결과로서, 실시예 1의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드는 41.49±0.08mg GAE/g와 5.81±0.24mg QE/g 함유하고 있었고 이를 표 2에 나타내었다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

추출물	총 폴리페놀 (mg GAE/g 건조 추출물)	총 플라보노이드 (mg QE/g 건조 추출물)
구골나무 잎 50% 주정 추출물	41.49±0.08	5.81±0.24

각 값은 3회 독립 실험 측정의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.

페놀 화합물은 하나 이상의 하이드록실 그룹을 갖는 방향족 고리를 가지고 있으며, 하이드록실기는 좋은 전자 공여체이기에 항산화 작용에 직접 기여할 수 있다는 사실을 고려하였을 때, 본 발명의 구골나무 추출물에는 총 폴리페놀과 총 플라보노이드가 고함량 포함되어 있으므로 뛰어난 항산화 효능을 나타낼 것이 예상가능하다.

[실험예 4. HPLC를 이용한 폴리페놀 분석]

추출물에 포함된 폴리페놀을 정량분석하기 위하여 표준물질로 베르바스코시드(verbascoside) 6.25, 12.5, 25, 50ppm을 사용하였다. 시료는 구골나무 잎 50% EtOH 추출물, 농도 0.1mg/ml이다.

칼럼은 Agilient Eclipse plus C18 4.6×250mm, 5um을 사용하였고, 이동상은 물에 0.1% 아세트산 (용매 A)와 메탄올(용매 B)를 사용하였고, 온도는 40℃, UV detector의 파장은 254 nm, 유량은 1.0 mL/min로 하여 분석하였다. 폴리페놀의 결정을 위한 구체적인 HPLC의 작동 조건을 표 3에 정리하였다.

폴리페놀의 결정을 위한 HPLC 분석 조건

조건
칼럼	Agilient Eclipse plus C18 4.6×250mm, 5um
칼럼 오븐 온도	40℃
유량	1.0 mL/min
검출기	UV 254 nm
이동상 시간 테이블	시간	A(H2O)% 0.1% 아세트산	B(MeOH)%
	0	85	15
	3	60	40
	10	50	50
	15	20	80
	20	85	15

본 실험의 HPLC 결과를 도 3에 나타내었고, HPLC 결과로부터 검출된 베르바스코시드 함량 분석을 진행하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. 이때, 베르바스코시드를 이용하여 표준 검량 곡선을 작성하였다. 즉, 베르바스코시드을 증류수에 녹여 최종 농도가 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/ml 용액이 되도록 제조한 후 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 계산하였다

Verbascoside 함량 분석 결과

흡광도(y)					베르바코시드 함량(x*)
1회	2회	3회	평균	표준 편차	ug/ml	표준 편차
101.417096	102.61534	102.23981	102	1	11.28	0.06

*x(ug/ml)=(y+2.0195)/9.2275

분석 결과, 0.1mg/ml의 구골나무 50% 주정 추출물에서는 평균 11.28ug/ml의 베르바스코시드 함량이 검출되었고, 표준편차는 0.06ug/ml이다. 이는 구골나무 추출물의 핵심성분이 베르바스코시드이며, 베르바스코시드에 의한 세포 자살 유도 및 전이 억제 작용을 통해 선택적 항암 효과가 나타날 수 있음을 시사한다.

베르바스코시드 농도에 따른 세포 독성 실험결과를 도 6에 나타내었다.

구강암세포인 FaDu세포에 verbascoside를 농도-의존적으로 처리하여 24시간 후 세포독성을 확인한 결과 10μM 이상에서 암세포를 억제하고, 50μM 이상의 농도에서는 80% 이상의 암세포를 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 정상세포인 293T세포에서는 90μM 이하에서는 세포독성이 거의 없으나, 100 μM에서는 약 50%의 세포 사멸율을 나타내었다. 따라서, 구골나무 잎 50% 주정 추출물의 주요 성분인 verbascoside가 구강암에 표적화 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

[실험예 5. 정상 세포와 인간 유래 암세포 성장 억제에 대한 세포독성 실험]

실험방법은 하기와 같다.

1. 세포배양

본 연구에 사용된 사람 배아 신장 세포주 293T와 사람 구강암 세포주 YD-10B는 RPMI1640 배지에 10% 소태아혈청과 1% 페니실린 /스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고 37 ℃, 5% CO2 조건의 가습 인큐베이터에서 배양하였다.

2. 세포독성 측정

48 well plate에 well당 사람 하인두편평암세포 Fadu(KCLB NO, 30043) 또는 정상세포 293T를 8X10⁴를 넣고 배양조건(Minimum essential medium, 37℃, CO2 배양기)에서 배양한 다음 날 구골나무 잎 50% 주정 추출물을 다양한 농도로 각각 첨가하고 배양하였다. 24시간 후에 각 well에 50mg/mL MTT 시약을 50ul씩 넣어주고 4시간 반응시킨 후 배양액을 제거하였다. 각 well에 DMSO를 300ul씩 넣어주고 formazan을 녹인 후 96 well에 200ul씩 각각 옮기고 microplate reader기를 이용하여 570nm에서 측정하였다.

실험 결과는 다음과 같다.

3. 정상세포에 대한 독성

구골나무 잎 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 인간 배아 신장 세포인 293T에서 MTT 분석을 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 그래프에서 나타나는 바와 같이 200㎍/mL의 농도까지 세포 증식을 전혀 저해하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

이는 정상 세포에 대한 독성을 전혀 나타내지 않는다는 점에서 종래의 화학적 항암 치료제와 달리 정상적인 조직에 대한 독성 및 부작용을 나타내지 않은 것을 알 수 있었다.

이러한 점을 고려하여 암세포 성장 억제 실험을 위한 농도 범위로는 세포에 독성이 없는 200 ㎍/mL의 농도까지 세포에 처리하여 실험을 수행하였다.

4. 인간 유래 암세포 성장 억제

인간 유래 구강암 세포(FaDu)를 이용하여 구골나무 잎 추출물이 암세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT분석을 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. MTT 분석을 수행한 결과 구강암 세포인 FaDu에서 100 ㎍/mL 농도에서 성장이 약 50 %로 억제되고, 150 ㎍/mL이상의 농도에서는 암세포의 약 85%가 사멸되는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 6. Arthur image-based cytometric assay]

6 well plate에 사람 하인두편평암세포 Fadu(KCLB NO, 30043)를 넣고 배양조건(Minimum essential medium, 37℃, CO2 배양기)에서 배양한 다음 날 구골나무 잎50% 주정추출물을 0, 0.2 mg/ml 농도로 각각 첨가하고 배양하였다. 24시간 후에 각 well을 PBS로 씻어주고 trypsin을 처리하여 세포을 모은 다음 annexin V/PI로 15분간 염색하였다. 준비된 샘플을 Arthur image-based cytometer를 이용하여 분석하였다. 분석한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

구골나무 잎 50% 주정 추출물을 처리한 군에서 처리하지 않은 대조군에 비해 죽어가는 세포(apoptotic)가 증가하는 것을 Arthur image-based cytometer를 이용한 분석을 통해 확인할 수 있었다. 이 결과는 세포 생존능 확인 실험인 MTT assay의 결과와 일치한다.

[실험예 7. Western blot analysis]

100 cm 세포 배양 접시에 1.6 × 10⁶개의 FaDu세포를 접종하여 배양한 후, 다음 날 0.1, 0.15와 0.2 mg/mL의 구골나무 잎 50% 주정 추출물을 처리하여 24시간 동안 반응시킨 뒤, 부유세포 및 배양 접시에 붙어있는 세포를 모두 수확하였다. 수확한 세포에서 total protein을 분리하기 위해 RIPA buffer를 이용하여 얼음 위에서 30분간 반응 후, 13,000 × g에서 15분간 원심 분리하였다. 상등액을 취하여 얻은 total protein은 Pierce TMBCA Protein Assay Kit을 이용하여 정량하였다. 40 ㎍ 단백질을 5X sample buffer와 혼합하여 100℃에서 5분간 변성시킨 뒤, 목적으로 하는 단백질의 사이즈에 맞게 8%에서 15% SDS polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동한 후, PVDF membrane으로 이동시켰다. Membrane은 5% blocking solution (5% skim milk in TBS containing 0.1% Tween-20)에서 1시간 동안 상온에서 blocking하고, 일차 항체인 total과 cleaved Caspase-9, Caspase-8, total과 cleaved Caspase-3, total과 cleaved PARP는 1:1,000으로 희석하고, β-actin은 1:5000 으로 희석하여 4℃에서 overnight 반응하였다. 이후, 1x TBST로 5분씩 네 번 세척한 다음, horseradish peroxidase가 접합된 이차 항체로(1:5,000) 2시간 반응 한 다음 1X TBST로 5분씩 네 번 세척하였다. 결과 분석은 ECL kit를 이용하여 Fusion solo imaging system을 통해 protein band를 가시화하였다.

western blot analysis 결과를 도 5에 나타내었다.

구골나무 잎 50% 주정 추출물의 농도가 증가할수록 Caspase가 활성화되어 Caspase 8 및 Caspase 9의 발현이 감소하면서 활성화 형태인 C-Caspase 9의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Caspase 8 과 9에 의해 활성화되는 Caspase-3는 자체의 발현이 감소할 때 활성화된 C-caspase-3가 증가하여 세포 자살을 유도하고, 또한 C-caspase-3가 C-PARP 발현이 높아지게 하여 DNA repair를 억제하여 구골나무 잎 50% 주정추출물의 항암 기전 중 하나로서 세포 자살을 유도한다는 것을 알 수 있다.

Claims (10)

1. 구골나무(Osmanthus heterophyllus) 잎 추출물을 포함하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 구골나무 잎 추출물은 베르바스코시드를 지표성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 구골나무 잎 추출물을 포함하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 베르바스코시드의 농도는 15μM 내지 90μM인 것을 특징으로 하는 구골나무 잎 추출물을 포함하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 구골나무 잎 추출 용매는 에탄올, 프레탄올, 프레탄올 A, 발효 주정, 합성 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고,
   상기 추출 용매의 농도는 30~60%(v/v)인 것을 특징으로 하는 구골나무 잎 추출물을 포함하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 구골나무 잎 추출 조건은 50 내지 85℃의 온도에서, 20분 내지 1시간 동안, 1회 또는 2회 반복 추출하는 것을 특징으로 하는 구골나무 잎 추출물을 포함하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 구골나무 잎 추출물의 농도는 60 내지 500㎍/ml인 것을 특징으로 하는 구골나무 잎 추출물을 포함하는 구강암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
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