KR102202554B1 - 삼백초잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물 및 고두밥 발효물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연물 유래 물질로 이루어진 화장료 조성물로, 구제척으로는 삼백초잎, 포도씨, 마치현 추출물 및 고두밥 발효물을 복합물로 함유하여 부작용이 없으면서도 피부 미백 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공한다.

Description

삼백초잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물 및 고두밥 발효물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 {Skin whitening cosmetic composition with the extract of Saururus chinensis leaf, the extract of Grape seed, the extract of Portulaca oleracea and rice fermented product}

본 발명은 삼백초잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물 및 고두밥 발효물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품 분야에서 동아시아 여성들 특히 한국, 일본, 중국의 여성들에게 가장 관심이 큰 분야중 하나는 피부 미백이다. 피부 미백과 관련하여 가장 중요한 요소는 피부 멜라닌 색소이다. 멜라닌(melanin)은 동물, 식물, 미생물 등에서 발견되는 검은 색소로 생육이나 발달에 필수적이지 않지만 특정 환경에 대한 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질이다. 동물에서의 멜라닌은 피부병과 악성 멜라노마(melanoma)와 관계가 있으며, 티로시나제(tyrosinase)에 의해 타이로신(tyrosine)으로부터 생산되는 도파 멜라닌(DOPA melanin) 외에 DHN 멜라닌, GDHB 멜라닌, 카테콜 멜라닌(catechol melanin) 등이 보고되어 있다[Bell, A. A. and Weeler M. H., Ann. Rev. Phytophathol. 24, 411, 1986].

멜라닌이 과잉생산되면 이를 피부 밖으로 계속적으로 내보내면서 국소 부위에서 기미가 생성되거나, 피부가 검어지게 된다. 따라서 피부에 멜라닌이 과도하게 침착되는 것을 방지하고, 피부 내 색소함량을 줄이기 위한 다양한 미백방법이 주목 받고 있다. 주요 방법으로는 자외선 차단, 멜라닌 색소를 신속하게 표백(bleaching) 시키는 방법, 생합성 된 멜라닌이 멜라노좀에 실려 각질형성세포로 전단되는 단계를 차단하는 방법, 멜라닌 생합성의 속도결정 단계인 티로시나제 활성을 억제하는 방법, 멜라닌형성세포의 세포막으로부터 티로시나제 활성 및 생합성 촉징을 유도하는 신호전달을 차단하는 방법, 멜라닌 생성 세포에 특이적으로 독성을 나타내는 물질을 투여하는 방법 등이 있다[Son KH, Heo MY. Int J Cosmeti Sci. 35: 9-18. 2013].

현재까지 멜라닌 합성의 중요한 인자로 알려져 있는 티로시나제를 억제하는 대포적인 물질로는 알부틴(arbutin), 코직산(kojic acid), 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 C(vitamin C) 등이 있으며, 특히 알부틴은 티로시나아제 활성 억제 기능과 더불어 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA) polymerase 활성으로 인한 멜라노좀 생성 억제 효과도 가지고 있다고 알려져 있다. 하지만 이들 물질들의 안정성 및 안전성에 대한 문제점, 그리고 부작용에 대한 논란은 계속되고 있다.

따라서, 기존에 알려진 멜라닌 생성을 억제하는 소재들이 가지고 있는 문제점들을 극복하고 보다 안전하고 우수한 효과를 갖는 소재를 탐색하기 위하여 천연물 유래 소재들에 대한 연구가 대두되고 있는 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0048408호(2018.05.10.공개)에는 쉰다리 전통 발효 기술에 의해 피부 미백 효능이 증진된 삼백초를 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 그 제조방법이 개시되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1744579호(2017.06.01.등록)에는 수련, 캐모마일꽃, 모링가 및 마치현의 혼합 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물이 개시되어 있다.

본 발명은 천연물 유래의 소재를 활용하여, 피부미백능이 우수한 화장료 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 삼백초(Saururus chinensis) 잎, 포도씨(Grape seed), 마치현(Portulaca oleracea) 혼합물의 혼합 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합물은, 바람직하게 삼백초 잎 1 중량부에 대하여, 포도씨 2 내지 3 중량부, 마치현 6 내지 7 중량부로 혼합되는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합 추출물과 발효물은, 바람직하게 건조 중량 기준으로 혼합 추출물 70~95 중량부에 발효물 5~30 중량부로 혼합되는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 삼백초(Saururus chinensis) 잎 추출물, 포도씨(Grape seed) 추출물, 마치현(Portulaca oleracea) 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물은, 바람직하게 건조 중량 기준으로 삼백초잎 추출물 1 중량부에 대하여, 포도씨 추출물 2 내지 3 중량부, 마치현 추출물 6 내지 7 중량부로 피부 미백용 화장료 조성물에 혼합되는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물 및 발효물은, 바람직하게 상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물을 합친 것 70~95 중량부에 발효물 5~30 중량부의 비율로 혼합되는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 추출물은, 바람직하게 추출용매로 에탄올 수용액을 사용하여 추출한 것이 좋다.

한편, 본 발명의 미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 발효물은, 바람직하게 발효 후, 여과를 거쳐 수득한 여과액인 것이 좋다.

삼백초잎 및 포도씨의 경우 우수한 미백 효능을 보이는 소재임에도 불구하고, 세포 독성으로 말미암아 그 사용이 제한적인 문제점이 있었다. 하지만, 본 발명에서는 이들 성분에 마치현 추출물 및 고두밥 발효물을 첨가함으로써 세포독성이 줄어듦을 확인할 수 있었고, 이를 통해 부작용이 없으면서도 미백 효과를 나타내는 본 발명의 삼백초잎, 포도씨, 마치현 추출물 및 고두밥 발효물을 복합물로 함유하는 화장료 조성물로 개발할 수 있었다.

도 1은 삼백초 잎 및 포도씨의 멜라노마 세포(B16-F1)를 이용한 독성테스트 결과 그래프이다.
도 2는 제조예 1 내지 9의 멜라노마 세포(B16-F1)를 이용한 독성테스트 결과 그래프이다.
도 3은 제조예 10 내지 15의 멜라노마 세포(B16-F1)를 이용한 독성테스트 결과 그래프이다.
도 4는 멜라노마 세포(B16-F1)를 이용한 멜라닌 생합성 억제 효과 실험 결과 그래프이다.
도 5는 멜라노제네시스 관련 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현량 조사 실험 결과 그래프이다.
도 6은 멜라노좀 수송 관련 Rab27a, MyosinVa, Melanophilin mRNA 발현량 조사 실험 결과 그래프이다.

본 발명은 삼백초(Saururus chinensis) 잎, 포도씨(Grape seed), 마치현(Portulaca oleracea) 혼합물의 혼합 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 삼백초(Saururus chinensis) 잎 추출물, 포도씨(Grape seed) 추출물, 마치현(Portulaca oleracea) 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

삼백초(Saururus chinensis)는 제주도와 지리산 일부 지역에서 나는 다년생 초본으로, 습기가 많은 계곡의 바람이 잘 통하고 공중습도가 높으며 반그늘인 곳에서 자란다. 한방 문헌에 따르면 삼백초는 각종 성인병 치료에 효능이 있다고 기록되어 있다. 삼백초는 탄닌 등이 피를 맑게 하고 모세혈관을 강화시키며 피의 흐름을 원활하게 해주어 노화방지에 우수한 효과가 있다고 알려져 있다.

포도씨(Grape seed)는 폴리페놀이 많아 항산화 효능이 우수하다. 대표적으로 프로안토시아닌은 심혈관계질환 예방 효과, 노인성치매예방 효과, 항당뇨 효과, 대장암 예방 효과 등이 있으며, 강력한 항산화 작용으로 면역력을 높일 수 있다. 또한 레스베라트롤은 포도가 곰팡이로부터 자신을 보호하기 위해 생성하는 물질로, 강력한 항산화작용을 하여 세포의 손상과 노화를 막는 역할을 한다. 레스베라트롤은 포도의 알갱이, 포도 껍질, 포도씨 순으로 많이 함유되어 있으며, 혈중 콜레스테롤 저하에 도움을 주기도 한다.

마치현(Portulaca oleracea)은 쇠비름, 장명채, 과자엽채, 오행초라고도 한다. 전국 각지에 야생하며, 전세계에 분포한다. 뿌리는 흰색이고 줄기는 붉은빛이 도는 갈색으로 많은 가지가 비스듬히 옆으로 퍼져 자란다. 마치현은 해열, 해독, 지혈효과가 있으며 항균효과도 보고된바 있다.

쌀(rice)은 벼과에 속하는 식물인 벼의 열매 껍질을 벗긴 알맹이이다. 고두밥은 아주 되게 지어 고들고들하게 지은 된밥을 말하며, 쌀을 잘 씻어 하룻밤 정도 충분히 불리고, 1~2시간 정도 물기를 빼고 찜통이나 시루에서 증기로 쪄 내어 제조한다. 본 발명에서는 이와 같이 제조한 고두밥에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 사용한다.

본 발명은 상기와 같은 효능이 있는 생약재를 이용하여, 피부 미백용 화장료 조성물을 개발하고자 하였는데, 하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 삼백초잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물 및 고두밥 누룩 발효물의 복합물을 포함하는 본 발명의 조성물은 우수한 피부 미백 효능을 나태는 것으로 것으로 확인되었다.

본 발명에서는 삼백초잎, 포도씨, 마치현을 혼합한 후, 여기에 추출용매를 첨가한 후, 추출하여 사용할 수 있다. 다만, 또 다른 실시예로, 삼백초잎, 포도씨, 마치현 각각에 추출용매를 첨가하여 각각 추출한 삼백초잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물을 혼합하여 사용할 수도 있다. 추출시 추출용매로는 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 용매를 각각 단독 또는 이들을 2종 이상 혼합한 혼합용매를 이용할 수 있다. 다만, 바람직하게는 에탄올 수용액을 사용하여 추출한 것을 사용하는 것이 좋은데, 더욱 바람직하게는 50% 에탄올 수용액을 사용하는 것이 좋다. 추출 용매 외에 기타 추출 방법은 당업계에 널리 알려진 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 발효물은 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 의미하는데, 바람직하게는 여과하여 걸리진 여과액을 사용하는 것이 좋다. 고두밥은 쌀알을 불린 후 증기처리하여 제조할 수 있으며, 고두밥과 누룩을 혼합하여 고두밥 발효물을 제조할 수 있다. 이 때, 여과는 당업계에 널리 알려진 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 삼백초(Saururus chinensis) 잎, 포도씨(Grape seed), 마치현(Portulaca oleracea) 혼합물의 혼합 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현은 바람직하게 삼백초잎 1 중량부에 대하여, 포도씨 2 내지 3 중량부, 마치현 6 내지 7 중량부로 혼합되는 것이 좋다. 또한, 상기 혼합 추출물과 발효물은 바람직하게 건조 중량 기준으로, 혼합 추출물 70~95 중량부에 발효물 5~30 중량부로 혼합되는 것이 좋다. 또한, 상기 혼합 추출물과 발효물을 포함하는 복합물은 건조 중량 기준으로 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 20 중량%로 함유하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예인 삼백초(Saururus chinensis) 잎 추출물, 포도씨(Grape seed) 추출물, 마치현(Portulaca oleracea) 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물은, 바람직하게 건조 중량 기준으로 삼백초 잎 추출물 1 중량부에 대하여, 포도씨 추출물 2 내지 3 중량부, 마치현 추출물 6 내지 7 중량부로 피부 미백용 화장료 조성물에 혼합되는 것이 좋다. 또한, 상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물 및 발효물은 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물을 합친 것 70~95 중량부에 발효물 5~30 중량부의 비율로 혼합되는 것이 좋다. 또한, 상기 혼합 추출물과 발효물을 포함하는 복합물은 건조 중량 기준으로 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 20 중량%로 함유하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실라카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일례로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소리비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형 또는 비누일 경우에는, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 일례로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 젤이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 하기 제조예, 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 제조예, 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.

[실험예 1 : 멜라노마 세포(B16-F1)를 이용한 세포 독성 평가]

삼백초잎 및 포도씨의 독성을 측정하기 위해서 상업적으로 구입한 마우스의 멜라노마(B16-F1) 세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다. 6 well plate에 10% 소혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지와 멜라노마(B16-F1) 세포를 1×10⁵세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃ 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 이때, 실험에 사용할 시료는 삼백초잎 및 포도씨 각각에 50%(v/v) 에탄올을 원료의 6배 가량 첨가하여 상온에서 3일간 추출한 후, 추출물을 0.45㎛로 여과한 뒤 감압 농축한 것을 사용하였다.

24시간 후 시료(삼백초잎 50% 에탄올 추출물 및 포도씨의 50% 에탄올 추출물)를 α-Melanocyte stimulate hormone(α-MSH)과 10% 소혈청이 포함된 새로운 DMEM 배지에 농도 별로 희석하여 72시간 동안 배양한다. 72시간 배양 후 배지 모두 제거하고, 2.5mg/㎖의 MTT 가용액을 10배 희석시킨 배지로 교체하여 4시간 배양기에서 배양한다. 4시간 후 상등액을 제거하고, 2㎖ DMSO(dimethhyl sulfoxide) 용액을 첨가하여 생성된 MTT formazan 결정체를 570nm에서 흡광을 측정하였다.

대조군(Control)은 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 처리한 것을 사용하였으며, α-MSH 처리군은 α-MSH와 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 함께 처리한 것을 사용하였다. 양성대조군으로는 Arbutin(SK Bioland)을 사용하였다. 독성 테스트 결과는 아래 표 1과 도 1에 나타내었다.

Sample	Conc.(㎍/㎖)	Cell viability (%)
Control		97.21
α-MSH 처리군		100.00
α-MSH + 삼백초잎 추출물	0.1	96.52
	0.25	93.83
	0.5	74.12
	1	67.62
	2.5	58.53
	5	52.83
	10	48.99
α-MSH + 포도씨 추출물	1	91.55
	10	85.39
	25	77.76
	50	57.54
	100	44.82
	250	40.12
α-MSH + Arbutin	100	88.17

상기 실험에 따라 멜라노마에서의 세포독성을 확인한 바, 삼백초잎 추출물은 0.5 ㎍/㎖, 포도씨 추출물은 25 ㎍/㎖ 농도에서부터 세포 독성을 보였다.

[실험예 2: 세포독성 완화를 위한 혼합 추출물의 제조]

본 실험예에서는 삼백초 잎과 포도씨의 세포 독성을 완화하기 위한 물질로 마치현을 선별하여 삼백초 및 포도씨의 세포 독성을 완화하고자 하였다. 삼백초 잎, 포도씨, 마치현을 하기 표 2의 배합비(중량비)로 총 100g 혼합한 후, 50%(v/v) 에탄올 600g을 넣고 상온에서 3일간 추출한 후 0.45㎛로 여과하고, 여과액을 감압 농축한 후 진공 건조한 파우더를 제조하였다.

	삼백초잎	포도씨	마치현
제조예 1	5	3	2
제조예 2	3	2	1
제조예 3	2	1	1
제조예 4	1	2	2
제조예 5	1	2	1
제조예 6	1	4	5
제조예 7	1	3	6
제조예 8	1	2	7
제조예 9	1	1	1

획득한 파우더의 독성을 측정하기 위하여 상업적으로 구입한 마우스의 멜라노마(B16-F1) 세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다. 6 well plate에 10% 소혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지와 멜라노마(B16-F1) 세포를 1×10⁵세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

24시간 후 시료를 α-Melanocyte stimulate hormone(α-MSH)과 10% 소혈청이 포함된 새로운 DMEM 배지에 농도 별로 희석하여 72시간 동안 배양한다. 72시간 배양 후 배지 모두 제거하고, 2.5mg/㎖의 MTT 가용액을 10배 희석시킨 배지로 교체하여 4시간 배양기에서 배양한다. 4시간 후 상등액을 제거하고, 2㎖ DMSO(dimethhyl sulfoxide) 용액을 첨가하여 생성된 MTT formazan 결정체를 570nm에서 흡광을 측정하였다.

대조군(Control)은 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 처리한 것을 사용하였으며, α-MSH 처리군은 α-MSH와 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 함께 처리한 것을 사용하였다. 양성대조군으로는 Arbutin(SK Bioland)을 사용하였다. 독성 테스트 결과는 아래 표 3 및 도 2에 나타내었다.

Sample	Conc.(㎍/㎖)	Cell viability (%)
Control		98.17
α-MSH 처리군		100.00
제조예 1	50	46.76
	100	38.93
제조예 2	50	44.7
	100	34.79
제조예 3	50	45.27
	100	35.46
제조예 4	50	67.62
	100	55.02
제조예 5	50	63.51
	100	52.41
제조예 6	50	82.69
	100	78.15
제조예 7	50	85.12
	100	83.48
제조예 8	50	97.21
	100	96.84
제조예 9	50	56.11
	100	47.52
α-MSH + Arbutin	100	88.14

실험 결과, 마치현 혼합 추출물의 첨가에 의해 세포 독성이 완화된 것으로 나타났고, 특히 제조예 7 및 제조예 8에서 세포 독성 완효 효과가 가장 우수하게 나타났다.

[실험예 3: 삼백초 잎, 포도씨, 마치현 추출물 및 고두밥 발효 여과물의 복합물 제조]

본 실험예에서는 상기에서 제조한 삼백초 잎, 포도씨, 마치현 혼합 추출물 중 세포 독성 평가 결과가 우수했던 제조예 7 및 8에 고두밥 발효 여과물을 첨가하여 독성 완화 효과를 확인하고자 하였다.

잘 불린 쌀알에 3배수 정제수를 넣고 3시간 불린 후 150℃ 스팀으로 30분간 처리하여 고두밥을 제조하였다. 고두밥을 식힌 후, 고두밥과 누룩((주)송학곡자, 소율곡)을 1:1비율로 혼합한 후 1시간 이상 방치하였다. 이후 혼합물 중량의 3배수에 해당하는 정제수를 넣고 40℃에서 1일간 숙성한 뒤 90℃로 승온한 후 1시간 가온 및 멸균한다. 제조과정 종료 후 0.45μm로 여과한 액을 감압농축하여 고두밥 발효 여과물을 제조하였다. 상기 제조예 7 및 제조예 8의 혼합 추출물 파우더와 고두밥 발효 여과물 파우더를 아래 표 4와 같이 배합하였다.

구분	제조예 7	고두밥 발효 여과물
제조예 10	95	5
제조예 11	90	10
제조예 12	70	30
구분	제조예 8	고두밥 발효 여과물
제조예 13	95	5
제조예 14	90	10
제조예 15	70	30

상기 제조예 10 내지 15의 세포독성을 측정하기 위해서 상업적으로 구입한 마우스의 멜라노마(B16-F1) 세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다. 6 well plate에 10% 소혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지와 멜라노마(B16-F1) 세포를 1×10⁵세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

24시간 후 시료를 α-Melanocyte stimulate hormone(α-MSH)과 10% 소혈청이 포함된 새로운 DMEM 배지에 농도 별로 희석하여 72시간 동안 배양한다. 72시간 배양 후 배지 모두 제거하고, 2.5mg/㎖의 MTT 가용액을 10배 희석시킨 배지로 교체하여 4시간 배양기에서 배양한다. 4시간 후 상등액을 제거하고, 2㎖ DMSO(dimethhyl sulfoxide) 용액을 첨가하여 생성된 MTT formazan 결정체를 570nm에서 흡광을 측정하였다.

대조군(Control)은 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 처리한 것을 사용하였으며, α-MSH 처리군은 α-MSH와 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 함께 처리한 것을 사용하였다. 양성대조군으로는 Arbutin(SK Bioland)을 사용하였다. 독성 테스트 결과는 아래 표 5 및 도 3에 나타내었다.

Sample	Conc.(㎍/㎖)	Cell viability (%)
Control		98.47
α-MSH 처리군		100.00
제조예 10	50	98.78
	100	97.77
제조예 11	50	90.11
	100	89.17
제조예 12	50	89.12
	100	87.02
제조예 13	50	99.78
	100	98.62
제조예 14	50	90.18
	100	89.94
제조예 15	50	91.31
	100	89.64
α-MSH + Arbutin	100	89.41

도 3에서 보듯이, 삼백초 잎, 포도씨, 마치현 혼합 추출물에 고두밥 발효 여과물을 첨가할 경우 세포 독성이 완화되는 것을 확인하였다. 특히, 제조예 10 및 제조예 13에서 세포 독성이 가장 우수하게 완화된 것으로 나타났다.

[실험예 4 : 멜라노마(B16-F1) 세포를 이용한 멜라닌 생합성 억제 효과 측정]

본 실험에서는 상기 실시예에서 세포 독성이 가장 우수하게 완화된 것으로 확인된 제조예 10 및 제조예 13의 미백효능을 측정하고자 하였다.

상업적으로 구입한 마우스의 멜라노마(B16-F1) 세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다. 6 well plate에 10% 소혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지와 멜라노마(B16-F1) 세포를 1×10⁵세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

24시간 후 시료를 α-Melanocyte stimulate hormone(α-MSH)과 10% 소혈청이 포함된 새로운 DMEM 배지에 농도 별로 희석하여 72시간 동안 배양한다. 72시간 배양 후 배지 모두 제거한 세포를 PBS(phosphate buffer, saline) 2㎖로 세척하고 1N NaOH 0.5㎖을 처리하여 세포를 1.5㎖ tube로 수거하여 세포 내 멜라닌을 얻었다. 수거한 세포를 96 well plate에 옮긴 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 일정 단백질당 멜라닌양을 구하였다.

양성 대조군으로는 Arbutin(SK Bioland)을 사용하였다. 멜라닌 생합성 저해 테스트 결과는 아래 표 6 및 도 4에 나타내었다.

Sample	Conc.(㎍/㎖)	Melanin formation per cell (%)
Control		33.91
α-MSH 처리군		100.00
α-MSH + 제조예 10	5	85.46
	10	82.85
	25	80.74
	50	79.89
	100	75.31
α-MSH + 제조예 13	5	83.31
	10	80.96
	25	77.05
	50	66.81
	100	56.56
α-MSH + Arbutin	100	52.10

상기 표 6 및 도 3에서 보듯이, 본 발명의 제조예 10 및 제조예 13 복합물은 단위 세포당 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다.

[실험예 5 : 멜라노제네시스 관련 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현량 조사]

본 실험에서는 상기 실험예 4에서 멜라닌 생성 억제 효과가 우수했던 제조예 13 복합물의 멜라노제네시스 관련 미백 효과를 측정하고자 하였다.

상업적으로 구입한 마우스의 멜라노마(B16-F1) 세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다. 6 well plate에 10% 소혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지와 멜라노마(B16-F1) 세포를 2×10⁵세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

24시간 후 시료를 α-Melanocyte stimulate hormone(α-MSH)과 10% 소혈청이 포함된 새로운 DMEM 배지에 농도 별로 희석하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후 배지 모두 제거한 세포를 PBS(phosphate buffer, saline) 2㎖로 세척하고 세포를 TRIzol(invitrogen, USA)로 모아 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Qubit fluoremeter with RNA BR Assay kit 를 이용하여 정량한 뒤 cDNA (complementary DNA)를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA합성은 cDNA 합성 Kit (High Capacity RNA to-cDNA Kit, Applied Biosystems, USA)를 사용하였고 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. Real-Time PCR: 7500 Fast with Power SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. PCR에 사용된 Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2와 GAPDH primer는 코스모진텍사 (Korea)에서 합성하여 사용하였으며 primer sequence는 아래 표 7에 나타내었다.

Primer	Sense	Antisense
Tyrosinase	5'TATAAACTCAGTGTTTCCCTTTATCACAA-3'	5'-TCTATGATGACATGAAGTGGCAAA-3'
TRP-1	5'-GTTCAATGGCCAGGTCAGGA-3'	5'-CAACGCAGCCACTACAGCA-3'
TRP-2	5'-TGG CTC ACT CCT TCC TGA ATG-3'	5'-CAA ACA CAG GGT CGT TGG CT-3'
GAPDH	5'-GGCATCTTGGGCTACACTGAG-3'	5'-GGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'

대조군(Control)은 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 처리한 것을 사용하였으며, α-MSH 처리군은 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 함께 처리한 것을 사용하였다. 양성 대조군으로는 Arbutin(SK Bioland)을 사용하였다. 실험결과는 아래 표 8 및 도 5에 나타내었다.

Sample Name	Conc. (㎍/㎖)	Tyrosinase expression rate(%)	Stdev.	TRP-1 expression rate(%)	Stdev.	TRP-2 expression rate(%)	Stdev.
Control		64.34	0.52	64.34	4.45	81.74	0.82
α-MSH 처리군		100.00	0.00	100.00	0.00	100.00	0.00
α-MSH + 제조예 13	25	89.48	0.49	85.88	1.69	82.79	2.02
	50	86.53	0.29	82.77	1.75	80.90	0.69
	100	73.99	1.40	67.06	0.21	64.30	0.42
α-MSH + Arbutin	100	75.85	1.54	78.44	1.76	75.92	2.69

상기 표 8 및 도 5에서 보듯이, 제조예 13 처리 시 α-MSH 인해 증가된 Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 유전자 발현을 농도 의존적으로 현저하게 억제하는 것을 확인하였으며, 유전자 각각의 100 ㎍/㎖의 농도에서 양성 대조군으로 사용한 Arbutin 보다 멜라닌 생성 저해 효과가 더 뛰어난 것으로 확인되었다.

[실험예 6 : 멜라노좀 수송 관련 Rab27a, MyosinVa, Melanophilin mRNA 발현량 조사]

본 실험에서는 상기 제조예 13 복합물의 멜라노좀 수송 관련 미백효과를 확인하고자 하였다.

상업적으로 구입한 마우스의 멜라노마(B16-F1) 세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다. 6 well plate에 10% 소혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지와 멜라노마(B16-F1) 세포를 1.5×10⁵세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

24시간 후 시료를 α-Melanocyte stimulate hormone(α-MSH)과 10% 소혈청이 포함된 새로운 DMEM 배지에 농도 별로 희석하여 18시간 동안 배양한다. 18시간 배양 후 배지 모두 제거한 세포를 PBS(phosphate buffer, saline) 2㎖로 세척하고 세포를 TRIzol(invitrogen, USA)로 모아 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Qubit fluoremeter with RNA BR Assay kit 를 이용하여 정량한 뒤 cDNA (complementary DNA)를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA합성은 cDNA 합성 Kit (High Capacity RNA to-cDNA Kit, Applied Biosystems, USA)를 사용하였고 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. Real-Time PCR: 7500 Fast with Power SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. PCR에 사용된 Rab27a, MyosinVa 및 Melanophilin과 GAPDH primer는 코스모진텍사 (Korea)에서 합성하여 사용하였으며 primer sequence는 아래 표 9에 나타내었다.

Primer	Sense	Antisense
Rab27a	5'-ATGTCGGATGGAGATTACGA-3'	5'-CCATAACTGCAGGTGGATTC-3'
MyosinVa	5'-AGTGCAGCAGCTAAGAGCAT-3'	5'-ATTCTTGCACGTTTGCTTTC-3'
Melanophilin	5'-AGCCCCTCAACAGCAAAAA-3'	5'-TTCCTCAAAGTCCACATCTCG-3'
GAPDH	5'-GGCATCTTGGGCTACACTGAG-3'	5'-GGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'

대조군(Control)은 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 처리한 것을 사용하였으며, α-MSH 처리군은 용해 용매로 사용된 DMSO(dimethhyl sulfoxide)를 함께 처리한 것을 사용하였다. 실험결과는 아래 표 10 및 도 6에 나타내었다.

Sample Name	Conc. (㎍/㎖)	Rab27a expression rate(%)	Stdev.	MyosinVa expression rate(%)	Stdev.	Melanophilin expression rate(%)	Stdev.
Control		52.11	3.09	55.40	2.37	79.20	00.83
α-MSH 처리군		100.00	0.00	100.00	0.00	100.00	0.00
α-MSH + 제조예 13	25	92.12	2.95	90.37	0.52	85.22	3.44
	50	86.69	3.15	83.33	2.27	83.54	6.93
	100	78.72	2.43	72.87	2.35	71.66	4.85

상기 표 10 및 도 6에서 보듯이, 제조예 13 처리 시 α-MSH 인해 증가된 Rab27a, MyosinVa 및 Melanophilin의 유전자 발현을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다.

[실시예 1 : 유연 화장수]

성분	함량(중량%)
제조예 13	2
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
REG 1500	1.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐 히아루로네이트	5.0
에탄올	10.0
옥틸도데세스-16	0.2
폴리솔베이트 20	0.2
유니사이드-유 13	0.01
향	미량
증류수	잔량
합계	100

[실시예 2 : 영양 크림]

성분	함량(중량%)
제조예 13	2
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.5
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.0
알란폴리솔베이트 60	1.5
솔비타스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테레이트	5.0
스쿠알란	5.0
광물유	35.0
디메치콘	0.5
하이드록시에틸세룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올아민	0.7
향유니사이드-유13	0.02
향	미량
증류수	잔량
합계	100

[실시예 3 : 마사지크림]

성분	함량(중량%)
제조예 13	2
프로필렌글리콜	6
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	3.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향	미량
증류수	잔량
합계	100

[실시예 4 : 팩]

성분	함량(중량%)
제조예 13	2
글리세린	7.0
1,3-부틸렌 글리콜	3.0
스쿠알렌	3.0
디메치콘	3.0
소듐히아루로네이트	0.1
글리신	2.0
폴리아크릴아마이드	5.0
항산4화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
방부제	미량
증류수	잔량
합계	100

Claims (8)

1. 삼백초(Saururus chinensis) 잎, 포도씨(Grape seed), 마치현(Portulaca oleracea) 혼합물의 혼합 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하며,
   상기 혼합물은,
   삼백초 잎 1 중량부에 대하여, 포도씨 2 내지 3 중량부, 마치현 6 내지 7 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 혼합 추출물과 발효물은,
   건조 중량 기준으로, 혼합 추출물 70~95 중량부에 발효물 5~30 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
4. 삼백초(Saururus chinensis) 잎 추출물, 포도씨(Grape seed) 추출물, 마치현(Portulaca oleracea) 추출물 및 고두밥(rice)에 누룩을 접종하여 발효시킨 발효물을 포함하며,
   상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물은,
   건조 중량 기준으로, 삼백초잎 추출물 1 중량부에 대하여, 포도씨 추출물 2 내지 3 중량부, 마치현 추출물 6 내지 7 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
5. 삭제
6. 제4항에 있어서,
   상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물 및 발효물은,
   상기 삼백초 잎 추출물, 포도씨 추출물, 마치현 추출물을 합친 것 70~95 중량부에 발효물 5~30 중량부의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
7. 제1항 또는 제4항에 있어서,
   상기 추출물은,
   추출용매로 에탄올 수용액을 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
8. 제1항 또는 제4항에 있어서,
   상기 발효물은,
   발효 후, 여과를 거쳐 수득한 여과액인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   

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