KR102136450B1

KR102136450B1 - 당뇨병성 피부 궤양 치료를 위한 다능성 줄기 세포

Info

Publication number: KR102136450B1
Application number: KR1020177006143A
Authority: KR
Inventors: 고타로 요시무라; 가호리 기노시타; 마리 데자와
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠; 고쿠리츠다이가쿠호진 도호쿠다이가쿠
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2020-07-21
Also published as: US20190192574A1; JP2016056109A; CA2959957C; KR20170055477A; PL3189844T3; AU2015310286B2; ES2846795T3; US20170258844A1; AU2015310286A1; PT3189844T; HUE052584T2; JP6452107B2; EP3189844B1; US11000552B2; SG11201701788YA; CN107073041A; WO2016035419A1; DK3189844T3; CA2959957A1; EP3189844A4

Abstract

재생 의료에 있어서, 다능성 줄기 세포 (Muse 세포) 를 사용한 새로운 의료 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포를 함유하는, 피부 궤양을 치료하기 위한 세포 제제를 제공한다. 본 발명의 세포 제제는, 상기 질환의 대상에 대하여, Muse 세포를 피부 궤양 환부에 투여함으로써, Muse 세포가 피부를 구성하는 세포로 분화된다는 피부 조직 재생 메커니즘에 기초한다.

Description

당뇨병성 피부 궤양 치료를 위한 다능성 줄기 세포{PLURIPOTENT STEM CELL FOR TREATING DIABETIC SKIN ULCER}

본 발명은, 재생 의료에 있어서의 세포 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 당뇨병에서 기인한 피부 궤양을 포함하는 피부 궤양에 있어서의 피부 조직의 수복 및 재생에 유효한 다능성 줄기 세포를 함유하는 세포 제제, 그리고 그 다능성 줄기 세포를 사용한 피부 궤양의 치료법에 관한 것이다.

당뇨병은, 지속적인 고혈당 상태를 수반하는 질환이며, 다종 다양한 환경 인자와 유전적 인자가 작용한 결과 발생하는 것으로 일컬어지고 있다. 혈당의 주요한 조절 인자는 인슐린이며, 고혈당은 인슐린 결핍, 또는 그 작용을 저해하는 여러 인자 (예를 들어, 유전적 소인, 운동 부족, 비만, 스트레스 등) 가 과잉이 되어 발생하는 것이 알려져 있다. 당뇨병은, 주로 자기 면역 질환 등에 의한 췌장 인슐린 분비 기능의 저하에 의해 발생하는 Ⅰ 형 당뇨병, 및 지속적인 고인슐린 분비에 수반되는 췌장 피폐에 의한 췌장 인슐린 분비 기능의 저하나 인슐린 저항성이 원인인 2 형 당뇨병으로 분류된다. 일본에서는, 당뇨병은 현대의 국민병으로써, 당뇨병 환자의 95 ％ 이상 (예비군을 포함시키면 2,000 만명을 초과하는 것으로 예측되고 있다) 은 인슐린 비의존성 당뇨병이라고 일컬어지고 있으며, 생활 양식의 변화에 수반하여, 환자수의 증가가 문제가 되고 있다. 세계 레벨에서는, 약 2 억명으로 추정되고 (비특허문헌 1), 세계의 당뇨병 치료약의 시장은, 2006 년에는 약 1 조엔의 규모이다. 이것은, 시장 및 인구 모두 거의 제 1 위이다.

심장 질환, 신부전 및 실명 등의 많은 중증의 합병증은, 당뇨병에 수반하여 개인에게 영향을 미치지만, 다리부 합병증은 최대의 피해를 가져온다. 하지의 전체 절단의 40 ∼ 70 ％ 는 진성 당뇨병에 관계되고, 실제로 모든 당뇨병 관련의 하지 절단의 85 ％ 는 다리부 궤양에 이어서 일어난다. 진성 당뇨병을 앓고 있는 환자에게서는, 장기의 합병증에 수반하여, 다리부의 궤양 등의 만성 피부 궤양을 발증할 위험도가 증가한다. 궤양화는, 허혈 및/또는 신경 장애의 결과로서 일어난다. 국소적인 조직의 허혈은, 당뇨병성 궤양에 대한 주요한 발증 원인이다. 대혈관 질환과 동일하게, 당뇨병을 갖는 환자는, 아테롬성 동맥 경화나 소혈관 질환으로 불리는 미소 순환 제어 기구의 손상 과정에 있어서의 비전도성의 동맥에 관련된 피부 관류 (灌流) 에 대한 추가적인 위협에 노출된다. 정상적인 상황하에서는, 혈류는 상해에 반응하여 치유를 촉진시키기 위해 증가한다. 그러나, 소혈관 질환 (및 허혈) 이 존재하는 경우, 이 반응은 유의하게 둔해져, 저유량 중의 미소 순환에 있어서의 혈전증의 경향과 함께, 궤양의 병인론에 있어서 아마 중요할 것으로 생각된다. 한편, 신경 장애는, 그 대증요법 또는 신경 기능의 진행성 감퇴의 예방 중 어느 것에 대하여, 충분히 확립된 요법이 없으며, 진성 당뇨병의 주요한 합병증이 되고 있다. 특히, 말초 신경 장해의 영향은 복잡하다. 당뇨병에 있어서의 신경의 손상으로 유도하는 기구는, 아직 해결되지 않았지만, 유전자적 소인, 대사 및 혈관 이상, 그리고 관계하는 증식 인자의 섭동 결여 등, 다원적인 것이라고 일컬어지고 있다.

상기와 같은 난치성 질환에 대하여, 다능성 세포를 이용한 재생 의료가 주목받고 있다. 이와 같은 세포로서 지방 조직 유래 간질 세포 (ASC) 가 알려져 있으며, 지방 세포나 혈관뿐만 아니라 다양한 계통으로의 분화능을 갖는 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 2 ∼ 4). 이 ASC 를 사용한 예로는, 당뇨병 마우스를 제조하여, 허혈성 창상의 치유를 시도한 보고가 있다 (비특허문헌 5). 또, 말초 동맥 장해를 갖는 환자의 하지에 있어서의 당뇨병성 궤양의 임상적 치료에 지방 조직 유래 재생 세포를 응용한 예도 보고되어 있다 (비특허문헌 6). 그러나, 창상 부위가 완치되는 데에는 이르지 않았다.

또, 성체로부터 얻어지는 분화능을 갖는 세포로서, 예를 들어, 뼈, 연골, 지방 세포, 신경 세포, 골격근 등으로의 분화능을 갖는 간엽계 (間葉系) 세포 획분 (MSC) (비특허문헌 7 및 8) 이 알려져 있지만, 이것은 다양한 세포를 포함하는 세포군으로서, 그 분화능의 실체가 밝혀지지 않았고, 치료 효과에 편차가 컸다. 또, 성체 유래의 다능성 줄기 세포로서 iPS 세포 (특허문헌 1 등) 가 보고되어 있지만, iPS 세포의 수립에는, 간엽계 세포인 피부 선유아 세포 획분에 특정 유전자나 특정 화합물을 체세포에 도입한다는 매우 복잡한 조작을 필요로 하는 것에 추가하여, iPS 세포가 높은 종양 형성 능력을 갖는 점에서, 임상 응용으로의 매우 높은 장애가 존재하고 있다.

본 발명자들 중 한 사람인 데자와의 연구에 의해, 간엽계 세포 획분에 존재하고, SSEA-3 (Stage-Specific Embryonic Antigen-3) 을 표면 항원으로서 발현하고 있는 다능성 줄기 세포 (Multilineage-differentiating Stress Enduring cells ; Muse 세포) 가 간엽계 세포 획분이 갖는 다능성을 담당하고 있고, 조직 재생을 목표로 한 질환 치료에 응용할 수 있을 가능성이 있는 것이 밝혀졌다 (특허문헌 2 ; 비특허문헌 9 ∼ 12). 그러나, 피부 궤양의 예방 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여, 기대되는 치료 효과가 얻어지는 것을 밝힌 예는 없다.

일본 특허공보 제4183742호 국제공개 제2011/007900호

Stumvoll. M., et al., Lancet, Vol.365, p.1333-1346 (2005) Rehman, J., et al., Circulation, Vol.109, p.1292-1298 (2004) Planat-Benard, V., et al., Circulation, Vol.109, p.656-663 (2004) Miranvile, A., et al., Circulation, Vol.110, p.349-355 (2004) Kim, E. K., et al., Plast. Reconstr. Surg., Vol.128, p.387-394 (2011) Marino, G., et al., J. Surg. Res., Vol.185, p.36-44 (2013) Dezawa, M., et al., J. Clin. Invest., Vol.113, p.1701-1710 (2004) Dezawa, M., et al., Science, Vol.309, p.314-317 (2005) Li, S., et al., Cancer Gene Therapy, Vol.12, p.600-607 (2005) Kuroda, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.107, p.8639-8643 (2010) Wakao, S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.108, p.9875-9880 (2011) Kuroda, Y., et al., Nat. Protoco., Vol.8, p.1391-1415 (2013)

본 발명은, 재생 의료에 있어서, 다능성 줄기 세포 (Muse 세포) 를 사용한 새로운 의료 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, Muse 세포를 함유하는, 피부 궤양의 예방 및/또는 치료를 위한 세포 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 당뇨병성 피부 궤양 마우스에 대하여, Muse 세포를 피부 궤양 환부에 투여함으로써, Muse 세포가 피부 조직을 재건 및 수복하여, 궤양의 치유를 가져오는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하와 같다.

[1] 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포를 함유하는, 피부 궤양을 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제.

[2] 외부 스트레스 자극에 의해 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포가, 농축된 세포 획분을 함유하는 상기 [1] 에 기재된 세포 제제.

[3] 상기 피부 궤양이, 당뇨병성 피부 궤양, 욕창성 궤양, 정맥 울혈 궤양, 동맥성 궤양, 방사선 궤양, 괴사성 근막염, 및 제 3 도 열상으로 이루어지는 군에서 선택되는 상기 [1] 및 [2] 에 기재된 세포 제제.

[4] 상기 다능성 줄기 세포가, CD105 양성인 상기 [1] ∼ [3] 에 기재된 세포 제제.

[5] 상기 다능성 줄기 세포가, CD117 음성 및 CD146 음성인 상기 [1] ∼ [4] 에 기재된 세포 제제.

[6] 상기 다능성 줄기 세포가, CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 상기 [1] ∼ [5] 에 기재된 세포 제제.

[7] 상기 다능성 줄기 세포가, CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 상기 [1] ∼ [6] 에 기재된 세포 제제.

[8] 상기 다능성 줄기 세포가, 이하의 성질 전부를 갖는 다능성 줄기 세포인 상기 [1] ∼ [7] 에 기재된 세포 제제 :

(ⅰ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다 ;

(ⅱ) 3 배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화되는 능력을 갖는다 ;

(ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다 ; 및

(ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다.

[9] 상기 다능성 줄기 세포가, 표피 각화 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 주피 세포, 지방 세포, 지방 전구 세포, 피부 선유아 세포, 및 신경초 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 세포로 분화되는 능력을 갖는 상기 [1] ∼ [8] 에 기재된 세포 제제.

본 발명은, 피부 궤양을 앓고 있는 대상에 대하여, Muse 세포를 피부 궤양 환부에 투여함으로써, 그 환부에서 Muse 세포가 피부 조직을 구성하는 세포로 분화한다는 피부 조직 재생 메커니즘에 의해, 피부 궤양의 진전을 억제하고, 피부 조직을 수복시킬 수 있다.

도 1A 에 대해, 일반적으로 마우스에게 있어서는 원래 창상 치유 능력이 높아, 빠르게 창상 치유하기 때문에, 약제의 창상 치유 효과를 평가할 때에 차이가 명확해지기 어렵다. 그 때문에 창상 치유가 잘 진전되지 않는 것이 특징인 당뇨병을 갖는 면역 부전 마우스를 창상 치유 효과의 평가에 사용하였다. Ⅰ 형 당뇨병을 유도하기 위해, 24 시간 절식시킨 5 주령의 수컷 SCID 마우스에게 스트렙토조토신 (STZ) 을 복강 내 주사하였다. STZ 투여 (150 ㎎/㎏) 로부터 3 일 후에 고혈당 (혈중 글루코오스 ＞ 300 ㎎/㎗) 을 조사하였다. 고혈당이 관찰되지 않은 경우, STZ 투여 (150 ㎎/㎏) 를 다시 실시하였다. 피부 결손을 9 주령의 DM-SCID 마우스의 등부에 제조하였다. 도 1B 는 전형적인 혈당치의 변화를 나타낸다. 대부분의 마우스는, 1 회 또는 2 회의 STZ 주사에 의해 고혈당이 되었다.
도 2 에 대해, MSC 는 창상 치유에 있어서의 염증기 및 세포 증식기에 필요하다고 여겨지는 증식 인자를 분비하는 것이 알려져 있다. 그래서, 저산소 (1 ％ O₂) 또는 정상 산소 (6 ％ O₂) 조건에서 48 시간 배양한 Muse 세포 획분 및 간엽계 세포 획분 (MSC) 중의 증식 인자 생산의 상대치를 ELISA 로 측정하였다. 측정된 사이토카인 (증식 인자) 은, HGF, SDF-1, PDGF-BB, VEGF, EGF, TGF-β, NGF-β, SCF, bFGF, 및 TNF-α 였다. Y 축은 450 ㎚ 에서의 흡광도를 나타낸다. 값은 평균 ± SD (n ＝ 3) 이다. * : P ＜ 0.05.
도 3 에 대해, 피부 결손 (직경 6 ㎜) 의 창상 치유를 14 일까지 순차적으로 평가하였다. 창상 영역을 촬영하고, 원래의 창상의 크기에 대한 창상 영역의 비율 (％) 을, 디지털 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. SCID 마우스에게서는, 원래 야생형 마우스 (WT) 와 비교하여 약간 느린 창상 치유가 관찰되었지만, STZ 유도에 의한 DM-SCID 마우스에게 있어서의 창상 치유는 SCID 마우스보다 저해되었다. 창상 폐쇄는, Muse 세포 집단으로 처리된 DM-SCID 마우스에게서는, 미처리 DM-SCID 마우스보다 유의하게 빠르고, 또, MSC 로 처리된 DM-SCID 마우스와 비교하여 양호한 창상 치유를 나타냈다. * P ＜ 0.05
도 4 는 Muse 세포 또는 MSC 로 처리한 DM-SCID 의 창상에 있어서의 인간 골지 복합체의 면역 조직학적 해석의 결과를 나타낸다. 인간 골지 복합체 양성 세포 (이식 Muse 세포에 필적한다) 가 14 일 후에 Muse 세포 및 MSC 로 처리한 쌍방의 창상 영역의 표피 및 상층에서 관찰되었다. 그러나, 인간 골지 복합체 양성 세포는, 어느 군에 있어서도 주위의 창상이 없는 영역에서는 검출되지 않았다. Muse 세포 처리 시료에서는, MSC 처리 시료보다 높은 빈도로 이식 인간 세포가 검출되었다.
도 5 에 대해, 이식된 Muse 세포를 특징짓기 위해, 인간 골지 복합체 및 분화 마커 (PECAM-1) 의 이중 면역 조직 화학적 염색을 실시하였다. 인간 골지 복합체를 발현하는 몇 개의 세포는, PECAM-1 에 양성이었기 때문에, 진피 내의 혈관 내피 세포로의 분화가 시사된다.

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포 (Muse 세포) 를 함유하는, 피부 궤양을 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.

1. 적용 질환

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포 (Muse 세포) 를 함유하는 세포 제제를 사용하여, 피부 궤양의 예방 및/또는 치료를 목표로 한다. 여기서,「피부 궤양」이란, 통상적으로는 염증에 의한 조직 표면의 결손 (진피 또는 피하 조직의 노출) 이 원인인 피부 상의 상해를 의미한다. 본 발명의 세포 제제에 의해 예방 및/또는 치료 가능한 피부 궤양에는, 한정되지 않지만, 당뇨병성 피부 궤양, 욕창성 궤양, 정맥 울혈 궤양, 동맥성 궤양, 방사선 궤양, 괴사성 근막염, 제 3 도 열상 등이 포함된다. 「당뇨병성 피부 궤양」이란, 고혈당에 의한 혈관 내피 세포의 손상에서 기인한 매우 난치성의 피부 궤양으로서, 예를 들어, 당뇨병성 족부 궤양, 당뇨병성 하퇴부 궤양이 예시된다. 「욕창」이란, 피부의 영역에 장기간에 걸쳐진 압이 원인이 된 만성 궤양을 의미한다. 이런 종류의 창상은 종종 베드소어로도 불린다. 「정맥 울혈 궤양」은, 결함 정맥으로부터의 혈액 또는 다른 액체의 울혈에 의해 일어난다. 「동맥성 궤양」이란, 혈류가 나쁜 동맥 주위의 영역에 있어서의 괴사 피부를 의미한다. 「방사선 궤양」이란, 방사선 조사를 받은 피부에 발생하는 궤양을 가리킨다. 「괴사성 근막염」이란, 천층근막 (淺層筋膜) 을 세균 감염의 주자리로 하여 급속히 괴사가 확대되는 연부 조직 감염증을 가리킨다. 또,「제 3 도 열상」이란, 진피 전체층, 피하 조직에까지 미치는 화상을 의미한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 세포 제제는, 특히 당뇨병성 피부 궤양의 예방 및/또는 치료에 유효하다.

2. 세포 제제

(1) 다능성 줄기 세포 (Muse 세포)

본 발명의 세포 제제에 사용되는 다능성 줄기 세포는, 본 발명자들 중 한 사람인 데자와가, 인간 생체 내에 그 존재를 알아내어,「Muse (Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포」로 명명한 세포이다. Muse 세포는, 골수액, 지방 조직 (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Vol.23, p.717-728 (2014)) 이나 진피 결합 조직 등의 피부 조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합 조직에도 산재한다. 또, 이 세포는, 다능성 줄기 세포와 간엽계 줄기 세포의 양방의 성질을 갖는 세포이며, 예를 들어, 각각의 세포 표면 마커인「SSEA-3 (Stage-specific embryonic antigen-3)」과「CD105」의 더블 양성으로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 예를 들어, 이것들의 항원 마커를 지표로 하여 생체 조직으로부터 분리할 수 있다. 또, 저산소, 또는 트립신이나 디즈파아제 등의 프로테아제에 의한 장시간의 스트레스에 의해 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 농축시킬 수 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법, 및 특징 등의 상세한 내용은, 국제공개 제WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또, Wakao 등 (2011, 상기 서술) 에 의해 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계 세포를 배양하고, 그것을 Muse 세포의 모집단으로서 사용하는 경우, SSEA-3 양성 세포의 전부가 CD105 양성 세포인 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 있어서의 세포 제제에 있어서는, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 줄기 세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우에는, 간단히 SSEA-3 을 항원 마커로 하여 Muse 세포를 정제하여, 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, 피부 궤양을 치료하기 위한 세포 제제에 있어서 사용될 수 있는, SSEA-3 을 항원 마커로 하여, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 조직으로부터 분리된 다능성 줄기 세포 (Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 간단히「SSEA-3 양성 세포」로 기재하는 경우가 있다.

간단하게는, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 세포 표면 마커인 SSEA-3 에 대한 항체를 단독으로 사용하여, 또는 SSEA-3 및 CD105 에 대한 각각의 항체를 양방 사용하여, 생체 조직 (예를 들어, 간엽계 조직) 으로부터 분리할 수 있다. 여기서,「생체」란, 포유 동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는, 수정란이나 포배기보다 발생 단계가 전인 배 (胚) 는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생 단계의 배는 포함된다. 포유 동물에는, 한정되지 않지만, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트 등 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는, 생체의 조직으로부터 직접 마커를 갖고 분리되는 점에서, 배성 줄기 세포 (ES 세포) 나 iPS 세포와 명확하게 구별된다. 또,「간엽계 조직」이란, 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수, 제대, 제대혈 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는, 골수나 피부, 지방 조직으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또, 상기 분리 수단을 사용하여, 선유아 세포나 골수 간엽계 줄기 세포 등의 배양 간엽계 세포로부터 Muse 세포를 분리해도 된다. 또한, 본 발명의 세포 제제에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는, 세포 이식을 받는 레시피엔트(수령자)에 대하여 자가여도 되고, 또는 타가여도 된다.

상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은, 예를 들어, SSEA-3 양성, 및 SSEA-3 과 CD105 의 이중 양성을 지표로 하여 생체 조직으로부터 분리할 수 있는데, 인간 성인 피부에는, 다양한 타입의 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 그러나, Muse 세포는, 이들 세포와 동일하지는 않다. 이와 같은 줄기 세포 및 전구 세포에는, 피부 유래 전구 세포 (SKP), 신경 능선 줄기 세포 (NCSC), 멜라노블라스트 (MB), 혈관 주위 세포 (PC), 내피 전구 세포 (EP), 지방 유래 줄기 세포 (ADSC) 를 들 수 있다. 이들 세포에 고유한 마커의「비발현」을 지표로 하여 Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는, CD34 (EP 및 ADSC 의 마커), CD117 (c-kit) (MB 의 마커), CD146 (PC 및 ADSC 의 마커), CD271 (NGFR) (NCSC 의 마커), NG2 (PC 의 마커), vWF 인자 (폰빌레브란트 인자) (EP 의 마커), Sox10 (NCSC 의 마커), Snai1 (SKP 의 마커), Slug (SKP 의 마커), Tyrp1 (MB 의 마커), 및 Dct (MB 의 마커) 로 이루어지는 군에서 선택되는 11 개의 마커 중 적어도 1 개, 예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 또는 11 개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146 의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 또한, CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271 의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 또한, 상기 11 개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.

또, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 상기 특징을 갖는 Muse 세포는, 이하 :

(ⅰ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다 ;

(ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다 ; 및

(ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다

로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 성질을 가져도 된다. 본 발명의 일 국면에서는, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는, 상기 성질을 전부 갖는다. 여기서, 상기 (ⅰ) 에 대해,「텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다」란, 예를 들어, TRAPEZE XL telomerase detection kit (Millipore 사) 를 사용하여 텔로머라아제 활성을 검출한 경우, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머라아제 활성이「낮다」란, 예를 들어, 체세포인 인간 선유아 세포와 동일한 정도의 텔로머라아제 활성을 갖고 있거나, 또는 Hela 세포에 비해 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머라아제 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 상기 (ⅱ) 에 대해, Muse 세포는, in vitro 및 in vivo 에 있어서, 3 배엽 (내배엽계, 중배엽계, 및 외배엽계) 으로 분화되는 능력을 갖고, 예를 들어, in vitro 에서 유도 배양함으로써, 간 세포, 신경 세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 골세포, 지방 세포 등으로 분화될 수 있다. 또, in vivo 에서 정소에 이식한 경우에도 3 배엽으로 분화되는 능력을 나타내는 경우가 있다. 또한, 정맥 주사에 의해 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기 (심장, 피부, 척수, 간, 근육 등) 에 유주 및 생착되어, 조직에 따른 세포로 분화되는 능력을 갖는다. 상기 (ⅲ) 에 대해, Muse 세포는, 부유 배양에서는 증식 속도 약 1.3 일로 증식하지만, 부유 배양에서는 1 세포로부터 증식되고, 배양체 (胚樣體) 형 세포 덩어리를 제조하여 14 일간 정도에서 증식이 멈춘다는 성질을 갖는데, 이들 배양체형 세포 덩어리를 접착 배양에 가져가면, 다시 세포 증식이 개시되고, 세포 덩어리로부터 증식된 세포가 퍼져간다. 또한 정소에 이식한 경우, 적어도 반년간은 암화 (癌化) 되지 않는다는 성질을 갖는다. 또, 상기 (ⅳ) 에 대해, Muse 세포는, 셀프 리뉴얼 (자기 복제) 능을 갖는다. 여기서,「셀프 리뉴얼」이란, 1 개의 Muse 세포로부터 부유 배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체형 세포 덩어리에 포함되는 세포에서 3 배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있음과 동시에, 배양체형 세포 덩어리의 세포를 다시 1 세포로 부유 배양에 가져감으로써, 다음 세대의 배양체형 세포 덩어리를 형성시키고, 거기에서 다시 3 배엽성의 분화와 부유 배양에서의 배양체형 세포 덩어리를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프 리뉴얼은 1 회 또는 복수 회의 사이클을 반복하면 된다.

(2) 세포 제제의 조제 및 사용

본 발명의 세포 제제는, 한정되지 않지만, 상기 (1) 에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 생리 식염수나 적절한 완충액 (예를 들어, 인산 완충 생리 식염수) 에 현탁시킴으로써 얻어진다. 이 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리된 Muse 세포수가 적은 경우에는, 세포 이식 전에 세포를 배양하여, 소정의 세포 농도가 얻어질 때까지 증식시켜도 된다. 또한, 이미 보고되어 있는 바와 같이 (국제공개 제WO2011/007900호), Muse 세포는 종양화되지 않기 때문에, 생체 조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 채 포함되어 있어도 암화의 가능성이 낮아 안전하다. 또, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상적인 증식 배지 (예를 들어, 10 ％ 송아지 혈청을 함유하는 α-최소 필수 배지 (α-MEM)) 에 있어서 실시할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 국제공개 제WO2011/007900호를 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물 (예를 들어, 항생 물질, 혈청) 등을 선택하고, 소정 농도의 Muse 세포를 함유하는 용액을 조제할 수 있다. 인간 대상에게 본 발명의 세포 제제를 투여하는 경우에는, 인간의 장골로부터 수 ㎖ 정도의 골수액을 채취하고, 예를 들어, 골수액으로부터의 접착 세포로서 골수 간엽계 줄기 세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포를 분리할 수 있는 세포량에 도달할 때까지 증식시킨 후, Muse 세포를 SSEA-3 의 항원 마커를 지표로 하여 분리하고, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다. 또는, 저산소나 프로테아제 등의 스트레스에 의해 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 농축시켜 세포 제제로서 조제할 수 있다. 혹은, 예를 들어, Muse 세포를 SSEA-3 의 항원 마커를 지표로 하여 분리 후, 유효한 치료량에 도달할 때까지 세포를 배양하여 증식시킨 후, 자가의 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다.

또, Muse 세포의 세포 제제로의 사용에 있어서는, 그 세포를 보호하기 위해 디메틸술폭사이드 (DMSO) 나 혈청 알부민 등을, 세균의 혼입 및 증식을 방지하기 위해 항생 물질 등을 세포 제제에 함유시켜도 된다. 또한, 제제상 허용되는 다른 성분 (예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등) 이나 간엽계 줄기 세포에 포함되는 Muse 세포 이외의 세포 또는 성분을 세포 제제에 함유시켜도 된다. 당업자는, 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포 제제에 첨가할 수 있다. 이와 같이, Muse 세포는 각종 첨가물을 함유하는 의약 조성물로서 사용할 수도 있다.

상기에서 조제되는 세포 제제 중에 함유하는 Muse 세포수는, 피부 궤양의 치료에 있어서 원하는 효과 (예를 들어, 피부 조직의 재구축 등) 가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 사용하는 세포의 상태 등을 고려하여, 적절히 조정할 수 있다. 후술하는 실시예 3 ∼ 5 에 있어서는, 스트렙토조토신 (STZ) 투여에 의해 제조된 면역 부전 당뇨병 마우스 모델에 대하여, Muse 세포 이식에 의한 각종 효과를 검토하였다. 약 20 ∼ 30 g 의 SCID 마우스에 대하여, SSEA3 양성 세포를 1.0 × 10⁵ 세포/마리로 환부에 투여함으로써, 매우 우수한 효과가 얻어졌다. 이 결과로부터 포유 동물 1 개체당 3.3 ∼ 5 × 10⁶ 세포/㎏ 을 체중 환산한 세포량을 투여함으로써 우수한 효과가 얻어지는 것이 기대된다. 또한, 대상으로 하는 개체는 마우스, 인간을 포함하지만, 이것에 한정되지 않는다. 또, 본 발명의 세포 제제는, 원하는 치료 효과가 얻어질 때까지 복수 회 (예를 들어, 2 ∼ 10 회) 적절히 간격 (예를 들어, 1 일에 2 회, 1 일에 1 회, 1 주일에 2 회, 1 주일에 1 회, 2 주일에 1 회, 1 개월에 1 회, 2 개월에 1 회, 3 개월에 1 회, 6 개월에 1 회) 을 두고 환부 또는 정맥 내에 투여되어도 된다. 따라서, 대상의 상태에 따라 다르기도 하지만, 치료상 유효량으로는, 예를 들어, 1 개체당 1 × 10³ 세포 ∼ 1 × 10⁷ 세포로 1 ∼ 10 회의 투여량이 바람직하다. 1 개체에 있어서의 투여 총량으로는, 한정되지 않지만, 1 × 10³ 세포 ∼ 1 × 10⁸ 세포, 1 × 10⁴ 세포 ∼ 5 × 10⁷ 세포, 2 × 10⁴ 세포 ∼ 2 × 10⁷ 세포, 5 × 10⁴ 세포 ∼ 5 × 10⁶ 세포, 1 × 10⁵ 세포 ∼ 1 × 10⁶ 세포 등을 들 수 있다.

3. 마우스 당뇨병성 피부 궤양 모델의 제조와 Muse 세포에 의한 치료 효과

본 명세서에 있어서는, 본 발명의 세포 제제에 의한 피부 궤양의 치료 효과를 검토하기 위해, 마우스 당뇨병성 피부 궤양 모델을 구축하여 사용할 수 있다. 그 모델로서 사용되는 마우스에는, 한정되지 않지만, 일반적으로, SCID 마우스, Balb/c 마우스를 들 수 있다. 당뇨병성 피부 궤양 모델은, 이들 마우스에게 스트렙토조토신 (STZ) 을 복강 내 투여함으로써 제조될 수 있다. STZ 는, 글루코오스의 유도체로서, 췌장의 β 세포에 손상을 주어, 동물에게 당뇨병을 발증시키기 위해 사용되고 있다. 본 발명에 의하면, STZ 의 투약량은, 1 회당 바람직하게는 150 ㎎/㎏ 이며, 복수 회 투약되어도 된다.

본 발명의 세포 제제는 인간 유래의 Muse 세포이기 때문에, 그 제제가 투여되는 마우스와는 이종의 관계에 있다. 통상적으로 모델 동물에 있어서 이종의 세포 등이 투여되는 실험에서는, 이종 세포의 생체 내에서 거절 반응을 억제하기 위해, 이종 세포의 투여 전 또는 동시에 면역 억제제 (시클로스포린 등) 가 투여된다. 지금까지 본 발명자들은, Muse 세포의 모집단인 간엽계 세포가 원래 강한 면역 억제를 갖고, Muse 세포도 동일한 작용을 갖는 것을 알아냈다. 따라서, 본 발명에 있어서는, SCID 마우스 이외에서, 면역 억제제를 사용하고 있지 않은 마우스 모델에게 있어서 면역 억제제를 사용하지 않아도 된다.

본 발명의 실시형태에서는, 본 발명의 세포 제제는, 환자의 피부 궤양을 치료하여, 정상적인 피부를 재구축할 수 있다. 여기서,「정상적인 피부를 재구축한다」란, 피부 궤양을 갖는 환부가 창상 치유되어, 완치된 상태를 의미한다. 재구축된 피부의 상태는, 표면이 전부 상피 각화 세포로 피복된 상태로서, 상피화가 완료되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 상피하에 충분한 두께를 갖는 진피가 구축되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 보다 바람직하게는, 추가로 땀샘 및/또는 모낭 등의 피부 부속기가 재생되어 있는 상태이다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, Muse 세포를 저산소 상태 (예를 들어, 산소 농도 1 ％) 에 있어서 배양함으로써, Muse 세포로부터 각종 사이토카인을 분비시킬 수 있다 (실시예 3 참조). 따라서, 본 발명에 의하면, 적어도 VEGF, EGF, PDGF-BB, NGF-β, SCF, TNF-α, bFGF, 및 TGF-β 중 어느 1 개의 사이토카인의 생산능을 높이는 방법이 제공된다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 인간 Muse 세포의 조제

(1) 인간 조직의 샘플링 및 세포 단리

토쿄 대학 의학계 연구과의 윤리 위원회의 승인을 얻어, 사전동의 (informed consent) 를 얻은 5 명의 여성 비비만 환자 (연령 ＝ 26.6 ± 8.7, BMI ＝ 21.5 ± 2.0) 의 복부 및/또는 허벅지로부터 지방 흡인 수술에 의해 지방 흡인물을 입수하였다. 지방 유래 줄기 세포/간질 세포 (ASC) 를 포함하는 간질 혈관 획분 (SVF) 은, 이미 서술한 바와 같이 (Yoshimura K, et al., J. Cell Physiol., Vol.208, p.64-76 (2006) 참조), 흡인된 지방으로부터 단리하였다. 간결하게는, 흡인 지방 조직을 PBS 로 세정하고, 셰이커 상, 37 ℃ 에서 30 분간, 0.075 ％ 의 콜라게나아제를 함유하는 PBS 중에서 소화시켰다. 성숙 지방 세포 및 결합 조직을 원심 분리에 의해 펠릿으로부터 분리하였다. 세포 펠릿을 재현탁하고, 100 ㎛, 70 ㎛, 및 40 ㎛ 의 메시로 여과하고, 용혈하였다. 지방 유래 간질/줄기 세포를 함유하는 (ASC) 세포 펠릿 (SVF 에 상당) 을, 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS) 을 보충한 둘베코 개변 이글 배지 (DMEM ; Nissui, Tokyo, Japan) 를 포함하는 디시에서 배양하였다. 배양으로부터 약 2 주일 후, 증식된 hASC 를 동 배지를 사용하여 계대 배양하였다. 2 대째의 계대 배양 hASC 를 2 mM 의 EDTA 를 함유하는 0.25 ％ 트립신을 사용하여, 37 ℃ 에서 5 분간에 걸쳐 회수하여, Muse 세포의 단리에 사용하였다.

(2) Muse 세포의 단리

SSEA-3 양성의 Muse 세포를 회수하기 위해, 자기 활성형 세포 소팅 장치 (magnetic-activated cell sorting (MACS)) (autoMACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 를 사용하였다. Muse 세포는 그 표면에 SSEA-3 을 발현하므로, 피코에리트린 (PE) (1 : 3 희석, Miltenyi Biotec) 및 항 PE 마이크로 비즈 (1 : 2 희석, Miltenyi Biotec) 와 결합된 항 SSEA-3 항체를 Muse 세포의 MACS 분리에 사용하였다. 마이크로 비즈로 표지한 표적 세포를, 자기장 내에서 트랩하고, 그 후 양성 획분으로서 회수하였다. 자기 칼럼에 결합되지 않았던 세포 용액은, 음성 획분으로서 회수하였다. Muse 세포를 보다 양호하게 정제하기 위해, 매우 느린 속도로 세포 용액을 2 회 자기 칼럼에 넣는 MACS 프로그램을 사용하였다. 얻어진 양성 세포 획분을 Muse 세포 집단으로 하고, 한편, 음성 세포 획분을 간엽계 세포 획분 (MSC) 으로 하여, 이하의 실시예에 있어서 사용하였다.

실시예 2 : 면역 부전 당뇨병 마우스 모델의 제조

5 주령의 수컷 중증 복합 면역 부전 (SCID) 마우스 (C. B17/Icr-scid, scid/scid) 를 CLEA Japan, Inc. (Tokyo, Japan) 로부터 구입하였다. 모든 동물 실험은, 토쿄 대학의 시설 내 동물 관리 사용 위원회로부터의 승인을 얻어 실시하였다. SCID 마우스를 24 시간 절식시킨 후, 새로 조제한 스트렙토조토신 (STZ ; 150 ㎎/㎏, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 을 함유하는 시트르산 완충 식염수 (pH 4.5) 를 복강 내에 주사하였다. 혈중 글루코오스 레벨을, STZ 주사 후 3 일째에 글루코미터 및 시험편 (Glucose Pilot, Aventir Biotech LLC, Carlsbad, CA) 을 사용하여 측정하였다. 혈중 글루코오스 레벨이 300 ㎎/㎗ 초과하면, 마우스는 당뇨병 (DM) 을 갖는 것으로 하였다. 고혈당 (＞ 300 ㎎/㎗) 을 나타내지 않았던 마우스에는, 2 회째의 STZ 주사 (150 ㎎/㎏) 를 실시하고, 그 3 일 후에 혈중 글루코오스 레벨을 모니터하였다 (도 1A).

피부 창상의 치유를 평가하기 위해, 피부 결손을 이미 서술한 바와 같이 (Galiano, R. D., et al., Wound Repair Regen., Vol.12, p.485-492 (2004) ; Tepper, O. M., Diabetes, Vol.10, 2337/db09-0185 참조), 마우스의 등부에 제조하였다. 간결하게 말하면, 마우스를 개개에 펜토바르비탈 (65 ㎎/㎏) 의 복강 내 주사에 의해 마취시켰다. 전기 트리머 및 탈모 크림을 사용하여 제모한 후, 소독한 원형의 생검 펀치 (Kai Industries Co., Tokyo, Japan) 를 사용하여, 피근층을 관통하는 2 개의 전층 (全層) 피부 창상 (직경 6 ㎜) 을 마우스의 등에 제조하였다. 창상의 수축을 피하기 위해, 도너츠 형상의 실리콘 스프린트 (내경 및 외경은 각 9 및 15 ㎜ ; 1.0 ㎜ 의 두께의 실리콘 러버 시트, Kyowa Industries, Saitama, Japan) 를 대고, 6-0 나일론의 봉합사를 사용하여 고정시켰다 (도 1A). 밀봉 붕대 (Perme-roll, Nitto Medical, Osaka, Japan) 를 창상의 건조 및 딱지 형성을 방지하기 위해 사용하였다.

5 개의 실험군 : 야생형 마우스, 비 DM-SCID 마우스, DM 유도 SCID 마우스, Muse 세포 집단으로 처리한 DM 유도 SCID 마우스, 및 간엽계 세포 획분 (MSC) 으로 처리한 DM 유도 SCID 마우스를 준비하였다. 각 군 6 마리의 마우스를 사용하였다. Muse 세포 (1.0 × 10⁵ 세포/마우스) 를 0.1 ㎖ 의 가교 히알루론산 (Restylane, Q-MED, Uppsala, Sweden) 과 혼합한 후, 창상 주변의 피하에 주사하였다. 거시적으로, 창상 폐쇄까지의 시간 (완전한 상피 재생까지의 일수) 을 조사하였다. 창상은, 통상적인 디지털 카메라 (IXY Digital 90, Canon, Tokyo, Japan) 를 사용하여, 0, 3, 7, 10, 및 14 일째에 순차적으로 촬영하였다. 사진을 화상 해석 소프트웨어 (Photoshop CS6, Adobe Systems, San Jose, CA) 를 사용하여 평가하여 창상 면적을 측정하였다.

실시예 3 : 사이토카인 생산 어세이 (ELISA 법)

MSC 는, 창상 치유에 있어서의 염증기 및 세포 증식기에 필요하게 되는 증식 인자 (예를 들어, PDGF, bFGF, TGF-β, EGF 등) 를 분비하는 것이 알려져 있다 (Maxson, S., et al., Stem Cells Transl. Med., Vol.1, p.142-149 (2012)). 그래서, 인비트로에 있어서, 저산소 조건하 및 정상 산소 조건하에서, Muse 세포 집단 및 MSC 를 배양하고, 배양액 중에 분비되는 사이토카인에 대해 검토하였다. 실험을 이하와 같이 실시하였다. 4.0 × 10⁵ 개의 Muse 세포 집단 및 MSC 를 60 ㎜ 디시에 파종하고, 혈청 불함유의 DMEM 중에서, 저산소 (1 ％ O₂) 또는 정상 산소 (6 ％ O₂) 조건에 있어서 배양하였다. 48 시간 후, 배양 배지를 회수하고, 0.22 ㎛ 필터 (Millex-GV filter, Millipore, Billerica, MA) 를 사용하여 여과하였다. 간 세포 증식 인자 (HGF) 및 간질 세포 유래 인자 1 (SDF-1) (양자 모두 R ＆ D Systems, Minneapolis, MN) 에 대해서는 ELISA 키트, 그리고 혈관 내피 증식 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-BB), 신경 성장 인자-β (NGF-β), 줄기 세포 인자 (SCF), 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 염기성 선유아 세포 성장 인자 (bFGF), 및 형질 전환 증식 인자-β (TGF-β) (Signosis ＃EA-1101, Santa Clara, CA) 에 대해서는 사이토카인 어레이 키트를 사용하여, 분비된 사이토카인량을 비교 검토하였다. 흡광도를, 분광 광도법에 의해 무한 마이크로 플레이트 리더 (M1000, Tecan Group, Mannedorf, Switzerland) 를 사용하여 450 ㎚ 에서 측정하였다.

Muse 세포 집단 및 MSC 를 정상 산소 (6 ％ O₂) 또는 저산소 (1 ％ O₂) 조건에 있어서 접착 배양하고, 48 시간 후의 배양 배지 중의 사이토카인의 농도를 비교한 결과를 도 2 에 나타낸다. Muse 세포 집단은, 동일한 산소압에서 배양한 MSC 에 비해, 보다 많은 양의 EGF, PDGF-BB, NGF-β, SCF, TNF-α, bFGF, 및 TGF-β 를 방출하였다. 또한, VEGF, EGF, PDGF-BB, NGF-β, SCF, TNF-α, bFGF, 및 TGF-β 의 농도는, 특히 Muse 세포 집단에 있어서, 정상 산소 조건에 비해 저산소 조건하의 쪽이 높았다.

실시예 4 : DM-SCID 마우스에게 있어서의 창상 치유

스트렙토조토신 (STZ) 은, 췌장 β 세포를 손상시켜, Ⅰ 형 DM 을 유도하였지만, STZ 의 투여 용량 및 방법이 지금까지의 보고 (Schmidt, R. E., et al., Am. J. Pathol., Vol.163, p.2077-2091 (2003) ; Lee, R. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.103, p.17438-17443 (2006) ; Schmidt, R. E., et al., Exp. Neurol., Vol.209, p.161-170 (2008) 참조) 와 상이하였다. 200 ㎎/㎏ 의 STZ 를 투여하면, SCID 마우스는, 중증의 체중 감소 및 대사 이상에 의해 투여의 1 주일 이내에 사망하는 경우가 많았다. 그러나, 절식으로부터 24 시간 후의 SCID 마우스에게 150 ㎎/㎏ 의 STZ 를 주사하면, 비교적 일관적으로 고혈당을 유도할 수 있고, DM 상태 (＞ 300 ㎎/㎗ 인 혈중 글루코오스) 가 30 일을 초과하여 계속되었다 (도 1B). 1 회 (29 마리 중 9 마리의 마우스 ; 31.0 ％) 또는 2 회 (29 마리 중 13 마리의 마우스 ; 44.8 ％) 의 STZ 주사에 의한 조제에 성공한 DM 유도 SCID 마우스 (DM-SCID) 를, 최종 STZ 주사로부터 30 일간 창상 치유 실험에 사용하였다.

야생형 (WT) 마우스 (n ＝ 6) 또는 비 DM-SCID 마우스 (n ＝ 6) 와 비교한 경우, DM-SCID 마우스에게서는, 창상 치유가 유의하게 지연되었다 (도 3). WT 및 비 DM-SCID 마우스는, 7 일째에 각각 56.9 ± 12.0 ％ 및 67.5 ± 6.5 ％ 의 창상 사이즈를 나타냈지만, 한편, DM-SCID 마우스 (n ＝ 6) 는, 95.4 ± 3.1 ％ 의 창상 사이즈를 나타냈다 (WT vs. DM-SCID ; P ＜ 0.0001). 또, 14 일째에도, DM-SCID 마우스는 WT 또는 비 DM-SCID 마우스보다 큰 창상 사이즈를 나타냈다. 따라서, DM-SCID 마우스는, 창상 치유 장해를 갖는 면역 부전의 동물 모델인 것이 확인되었다.

DM-SCID 마우스에게 있어서의 피부 창상은, Muse 세포 집단 또는 MSC 를 피하 주사함으로써 처리하였다. Muse 세포로 처리한 DM-SCID 마우스 (n ＝ 6) 는, MSC 로 처리한 DM-SCID 마우스 (n ＝ 6) 보다 우수한 창상 치유를 나타냈다. 7 일째에는, Muse 세포 및 MSC 로 처리한 DM-SCID 마우스의 창상 사이즈는 각각 51.05 ± 7.2 ％ 및 74.0 ± 6.6 ％ 였다 (P ＜ 0.0001). 14 일째에는, Muse 세포로 처리한 DM-SCID 마우스에게서는 완전히 창상이 치유되었지만, MSC 로 처리한 DM-SCID 마우스의 창상 사이즈는 30.3 ± 6.7 ％ 였다 (P ＝ 0.0235). Muse 세포로 처리한 DM-SCID 마우스에게서는, 창상 치유가 촉진되어, WT 군의 것에 필적하는 것 같았다.

실시예 5 : 조직학적 분석

마우스 피부 시료는, OCT 화합물 (Sakura Finetek, Tokyo, Japan) 에 포매하고, 액체 질소 중에서 동결시키고, 절편화할 때까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 동결 절편 (8 ㎛) 을 슬라이드 상에 두고, 20 분간 실온에서 건조시키고, 1 분간 4 ％ 파라포름알데히드 (PBS 중) 로 고정시키고, PBS 로 5 분간 세정하였다. 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신 (H ＆ E) 으로 염색하여, 면역 조직 화학 분석용으로 처리하였다.

면역 조직 화학 분석을, 이미 서술한 바와 같이 (Kuroda, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.107, p.8639-8643 (2010) 참조) 실시하였다. 서양 와사비 퍼옥시다아제 (HRP) 반응을 통하여 인간 골지 단백질을 검출하기 위해, 절편을 0.3 ％ 과산화수소를 함유하는 메탄올로 30 분간 처리하여, 내인성 퍼옥시다아제 활성을 불활성화하고, 토끼 항 인간 58K 골지 단백질 (1 : 100 희석, Abcam, Cambridge, UK) 및 당나귀 항 토끼 IgG-HRP (1 : 500 희석, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 로 순차적으로 인큐베이트하였다. 인간 58K 골지 단백질의 발현은, 3,3'-디아미노벤지딘테트라하이드로클로라이드 (DAB) 를 사용한 퍼옥시다아제 반응에 의해 가시화하였다. 공초점 레이저 현미경 관찰용으로, 동결 절편을 이하의 1 차 항체와 함께 인큐베이트하였다 : 마우스 항 인간 미토콘드리아 (1 : 100 희석, Abcam), 토끼 항 인간 58K 골지 단백질, 토끼 항 인간-CK14 (1 : 200 희석, Abcam) 또는 염소 항 인간 혈소판 내피 세포 결합 분자-1 (PECAM-1 ; 1 : 50 희석, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). 다음으로, 절편을 이하의 2 차 항체와 함께 인큐베이트하였다 : 당나귀 항 마우스 IgG-Alexa488, 당나귀 항 토끼 IgG-Alexa680, 또는 토끼 항 염소 IgG-Alexa488 (전부 1 : 500 희석, Invitrogen, Carlsbad, CA). 핵은 DAPI 로 대비 염색하고, 공초점 현미경 (C1si Nikon, Nikon, Tokyo, Japan) 을 사용하여 검사하였다.

인간 골지 복합체의 면역 조직학적 해석에 의해, 14 일째에는, Muse 세포 집단 및 MSC 로 처리한 각각의 시료에 있어서, 창상 영역의 표피 및 진피 상층에서 이식 세포가 검출되는 것이 나타났다. 그러나, 인간 골지 복합체 ＋ 세포는, 주위의 창상이 없는 영역에서는 관찰되지 않았다 (도 4). 또, 주입 히알루론산의 침착은 피하층에서 검출되었다. 또한, 진피 내의 몇 개의 인간 골지 복합체 ＋ 세포는, h-PECAM-1 에도 양성이었다 (도 5). 이들 데이터는, 이식 Muse 세포는 표피 및 진피 중 어느 것에 있어서도 생존하고, 표피 각화 세포 및 혈관 내피 세포로 분화될 수 있는 것을 시사하고 있다.

산업상 이용가능성

본 발명의 세포 제제는, 당뇨병성 피부 궤양 마우스 모델의 피부 궤양 환부에 투여함으로써, 피부 조직을 재건 및 수복시킬 수 있어, 당뇨병성 피부 궤양의 치료에 응용할 수 있다.

본 명세서에 인용하는 모든 간행물 및 특허문헌은, 참조에 의해 전체적으로 본 명세서 중에 원용된다. 또한, 예시를 목적으로 하여, 본 발명의 특정 실시형태를 본 명세서에 있어서 설명하였지만, 본 발명의 정신 및 범위에서 일탈하지 않고, 다양한 개변이 실시되는 경우가 있는 것은, 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.

Claims

생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포를 함유하는, 당뇨병성 피부 궤양을 예방, 치료, 또는 예방 및 치료하기 위한 세포 제제로서,
여기서, 상기 다능성 줄기 세포는, 이하:
(ⅰ) CD105 양성;
(ⅱ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다;
(ⅲ) 3 배엽 중 어느 배엽으로 분화되는 능력을 갖는다;
(ⅳ) 종양성 증식을 나타내지 않는다; 및
(ⅴ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다
의 전부의 성질을 갖는, 상기 세포 제제.
제 1 항에 있어서,
외부 스트레스 자극에 의해 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포가 농축된 세포 획분을 함유하는 세포 제제.
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제 1 항에 있어서,
상기 다능성 줄기 세포가, CD117 음성 및 CD146 음성인 세포 제제.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 줄기 세포가, CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 세포 제제.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 줄기 세포가, CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 세포 제제.
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제 1 항, 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 줄기 세포가, 표피 각화 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 주피 세포, 지방 세포, 지방 전구 세포, 피부 선유아 세포, 및 신경초 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포 제제.