KR102120335B1

KR102120335B1 - Recombinant Expression Vectors for Producing Norovirus Vaccine

Info

Publication number: KR102120335B1
Application number: KR1020180145450A
Authority: KR
Inventors: 최덕영
Original assignee: (주)인테라
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-06-09
Also published as: KR20200060644A

Abstract

본 발명은 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 수용성 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 수용성 노로 바이러스 백신 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 노로 바이러스 백신 생산 방법은 대장균에서 효과적으로 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로도 정교한 VLP 생산을 가능하게 함으로써, 저비용 고효율의 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있게 되었다.The present invention relates to a recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine, and more particularly, the present invention relates to a recombinant expression vector for producing a water-soluble norovirus vaccine and a method for producing a water-soluble norovirus vaccine using the same. The recombinant expression vector of the present invention and a method for producing a norovirus vaccine using the same can effectively produce a norovirus VLP vaccine in E. coli as well as enable structurally sophisticated VLP production, thereby producing a low-cost, high-efficiency norovirus VLP vaccine. Became.

Description

Recombinant Expression Vectors for Producing Norovirus Vaccine}

본 발명은 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 노로 바이러스 백신 항원을 수용성으로 생산하고 이를 효율적으로 바이러스 유사입자로의 자가조립을 유도하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 수용성 노로 바이러스 백신 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine, and more particularly, the present invention is a recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine antigen water-soluble and efficiently inducing self-assembly into virus-like particles, and The present invention relates to a method for producing a water-soluble norovirus vaccine.

노로 바이러스(Norovirus)는 전 세계적으로 급성 위장염을 유발하는 주요 병원체 중 하나이며, 매년 20만명의 5세 미만 개발도상국 어린이들이 노로바이러스로 인해 사망한다. 노로바이러스는 주로 대변-구강 경로 (Fecal-oral route) 를 통하여 감염되며 메스꺼움, 구토, 설사, 탈수 등을 유발한다. 칼리시바이러스과(Caliciviridae)에 속하는 노로 바이러스는 막이 없는 바이러스이며 직경은 약 30~40 nm 정도이다. 7.6 kbp 길이의 단일가닥 (+)RNA로 이루어져 있으며 3개의 ORF(open reading frame)를 가지고 있다. 이 중 ORF2에는 노로 바이러스의 형태를 이루는 주요 구조단백질 VP1이 코딩되어 있고, ORF3에는 VP2 단백질이 코딩되어 있으나 구조형성에 직접적으로 관여하지는 않는다. VP1은 전체 59 kDa 크기이며 이합체(dimer)를 이룬다. 이렇게 90개의 이합체가 자가 조립되어(self-assembly) 총 180개의 VP1이 하나의 바이러스 입자(particle)를 형성한다. VP1 단백질은 2개의 도메인(domain)으로 이루어지는데 S 도메인(S domain)이 구조를 이루는데 작용하고 P 도메인(P domain)은 실제적인 면역반응 유발에 관여한다.Norovirus is one of the leading pathogens that causes acute gastroenteritis worldwide, and 200,000 children under 5 years of age die of Norovirus every year. Norovirus is mainly infected through the fecal-oral route and causes nausea, vomiting, diarrhea, and dehydration. Norovirus belonging to the family of Calyciviridae is a membrane-free virus and has a diameter of about 30 to 40 nm. It consists of a single-stranded (+) RNA of 7.6 kbp in length and has three open reading frames (ORFs). Of these, ORF2 encodes the major structural protein VP1 constituting the form of norovirus, and ORF3 encodes the VP2 protein, but does not directly participate in structural formation. VP1 is a total of 59 kDa in size and forms a dimer. In this way, 90 dimers are self-assembly, and a total of 180 VP1s form a single viral particle. The VP1 protein is composed of two domains. The S domain works to form a structure, and the P domain is involved in inducing an actual immune response.

현재까지 노로 바이러스에 대한 세포 배양 방법은 알려진 바 없으며 적절한 동물모델 또한 개발되지 않은 상황이다. 따라서 효과적인 노로 바이러스 백신을 개발하기 위해서는 세포배양에 제한받지 않는 VLP(Virus-Like Particles) 형태의 백신개발이 필수적이다. VLP는 바이러스 구조 단백질을 야생형 바이러스와 겉모습이 유사한 구조를 나타내도록 특이적으로 발현시킨 것으로서 매우 복잡하고 정교한 구조물이다. 야생형 바이러스와 그 구조가 유사하기 때문에 체내에서 높은 면역반응을 유도할 수 있으며 T-세포, B-세포 면역경로를 둘 다 자극할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 형성된 구조물 안에 유전물질이 없으므로 감염능력이 없어 높은 안전성을 가진다는 점과 뛰어난 구조적 안정성을 보인다는 것이 특징이다. 하지만 그 구조가 복잡하여 완전한 VLP를 만드는 것이 매우 어렵다는 단점이 있다.To date, no cell culture method for norovirus has been known, and appropriate animal models have not been developed. Therefore, in order to develop an effective norovirus vaccine, it is necessary to develop a VLP (Virus-Like Particles) vaccine that is not restricted by cell culture. VLP is a very complex and sophisticated structure that specifically expresses a virus-structured protein to have a structure similar in appearance to wild-type virus. Since the structure is similar to that of wild-type virus, it can induce a high immune response in the body and has the advantage of stimulating both T-cell and B-cell immune pathways. In addition, there is no genetic material in the formed structure, and it is characterized by having high safety because it has no infectious ability and excellent structural stability. However, it has a disadvantage in that its structure is complicated and it is very difficult to make a complete VLP.

노로 바이러스 VLP는 주로 배큘로 바이러스-곤충세포에서 생산할 수 있으며, 효모에서도 VLP를 생산할 수 있다고 알려져 있다. 하지만 대장균 에서는 구조단백질 (VP1)을 수용성으로 발현했다는 보고는 있지만 VLP (Virus-Like Particle) 를 형성했다는 보고는 지금까지 된 바가 없다. 대장균에서 유래하는 노로바이러스 VLP가 개발될 수 있다면 노로바이러스에 대한 대부분의 사상자가 개발도상국에서 발생하는 만큼 다른 발현시스템을 이용한 백신에 비해 저가형 백신으로써 인류사회에 큰 공헌을 할 수 있다.It is known that norovirus VLP can be mainly produced from baculovirus-insect cells, and yeast can also produce VLP. However, although it has been reported that E. coli expressed the structural protein (VP1) as water-soluble, there have been no reports of the formation of VLP (Virus-Like Particle). If norovirus VLP derived from E. coli can be developed, as most casualties for norovirus occur in developing countries, it can make a great contribution to human society as a low-cost vaccine compared to vaccines using other expression systems.

본 발명자들은 이전 연구에서 RBD (RNA Binding Domain)를 포함하는 LysRS (Lysyl tRNA synthetase)가 결합파트너로써 다양한 단백질의 단백질 접힘 및 수용성 증가에 관여한다는 것을 밝힌 바 있다. 그러나 LysRS는 약 100kDa이 넘는 거대 단백질일 뿐만 아니라 이량체(dimer)를 이루어야 하는 구조적인 한계성으로 인한 입체적 간섭현상(steric hindrance) 때문에, 재조합 단백질이 원하는 활성 형태를 갖도록 3차원 구조 형성, 이량체 이상의 다량체, 또는 단량체로의 형성을 방해할 수 있다. 이에, LysRS를 대체하기 위한 RNA 결합 도메인으로 RID(RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)가 사용되고 있다. 하지만 RID 자체는 발현 레벨이 매우 낮다는 단점이 있다.In the previous study, the present inventors have revealed that LysRS (Lysyl tRNA synthetase) containing RBD (RNA Binding Domain) is a binding partner involved in protein folding and increased water solubility of various proteins. However, LysRS is not only a large protein of more than about 100 kDa, but also because of the steric hindrance due to the structural limitation of dimer formation, the formation of a three-dimensional structure so that the recombinant protein has a desired active form, a dimer or more It may interfere with the formation of multimers or monomers. Accordingly, RID (RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase) is used as an RNA binding domain to replace LysRS. However, RID itself has the disadvantage that the expression level is very low.

단백질 발현 레벨은 여러가지 요인에 의해 결정될 수 있지만, 단백질의 N-말단 서열, 정확하게는 mRNA 서열이 단백질 발현 레벨에 중요한 것으로 알려져 있다. Protein expression levels can be determined by a number of factors, but it is known that the N-terminal sequence of the protein, or precisely the mRNA sequence, is important for protein expression level.

이에, 본 발명자들은 단백질의 수용성 및 발현 효율에 대하여 연구하던 중 요산산화효소(urate oxidase) 단백질이 대장균에서 비정상적으로 발현이 잘 되는 것을 확인하였고, 요산산화효소의 N-말단 서열이 노로바이러스 VP1 단백질의 발현 수준에 미치는 영향과 RID의 발현에 미치는 영향을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.Thus, the present inventors confirmed that the uric acid oxidase protein is abnormally well expressed in E. coli while studying the protein's water solubility and expression efficiency, and that the N-terminal sequence of uric acid oxidase is Norovirus VP1 protein. It confirmed the effect on the expression level and the effect on the expression of RID was completed the present invention.

본 발명은 원핵세포에서 발현이 잘 되지 않는 노로바이러스 VP1 단백질의 발현 효율을 증진시킬 뿐 아니라 수용성을 높일 수 있는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine capable of enhancing water solubility as well as enhancing the expression efficiency of a norovirus VP1 protein that is poorly expressed in prokaryotic cells.

본 발명은 또한, 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a host cell transformed with a recombinant expression vector for producing norovirus vaccine.

또한, 본 발명은 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a method for producing a norovirus vaccine comprising introducing a recombinant expression vector for production of a norovirus vaccine into a host cell.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 그 일부 서열이 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는데 결정적인 역할을 하며, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 수용성 증진 파트너로 알려진 RID(RNA interacting domain)에도 적용됨을 확인한 후, 노로 바이러스의 VP1 단백질에 적용하여본 결과, VP1 단백질의 발현 효율을 증진시킬 뿐만 아니라 수용성을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The present invention is to solve the above-mentioned problems, a peptide consisting of 7 amino acids derived from uric acid oxidase or a part of the sequence plays a decisive role in enhancing the expression efficiency of the target protein, and 7 derived from uric acid oxidase After confirming that the peptide composed of amino acids is also applied to the RNA interacting domain (RID), which is known as a water-soluble enhancement partner, and then applying it to the VP1 protein of Norovirus, it is confirmed that it not only enhances the expression efficiency of the VP1 protein, but also can increase the water-soluble And completed the present invention.

이에 본 발명은 목적 단백질로 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산 또는 그 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.Therefore, the present invention is a VP1 protein derived from Noro virus as a target protein; And a peptide for enhancing the expression efficiency of a target protein comprising 7 amino acids derived from uric acid oxidase or a partial sequence thereof; and a polynucleotide encoding the present invention.

본 명세서에서 사용된 용어 “요산산화효소(urate oxidase)”(EC 1.7.3.3 (uricase)는 퓨린 분해 기작에 작용하는 효소이다. 우리카아제(uricase)는 요산을 알란토인으로 산화시키는 효소이다. 사람을 포함한 고등 영장류는 우리카아제가 존재하지 않으며, 요산은 퓨린 분해 대사의 최종 물질이다. 이 대사물인 유리산(free acid)과 요산염(urate salt) 모두 물에서 비수용성이므로, 개개인의 차이에 따라 침전되어 통풍을 유발한다. 통풍을 효율적으로 치료하기 위해, 사람에 존재하지 않은 우리카아제 를 직접 사람에게 주사하는 치료법이 실용화되어 있다.The term “urate oxidase” (EC 1.7.3.3 (uricase)) is an enzyme that acts on the mechanism of purine decomposition. Uricase is an enzyme that oxidizes uric acid to allantoin. Higher primates, including uriase, do not have uric acid, and uric acid is the final product of the metabolism of purine.These metabolites, free acid and urate salt, are insoluble in water. Precipitation causes gout In order to treat gout efficiently, a treatment method in which uricase, which is not present in a human, is injected directly into a person has been put into practical use.

본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 노로 바이러스의 VP1 단백질이 이에 해당된다.As used herein, the term "target protein" is a protein that a person skilled in the art intends to produce in large quantities, and refers to a protein capable of being expressed in a host cell by inserting a polynucleotide encoding the protein into a recombinant expression vector, In the present invention, the VP1 protein of Noro virus corresponds to this.

본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드” 또는 “expression enhancer tag(eet)”는 목적 단백질의 N-말단에 융합되어 함께 발현됨으로써 단백질의 발현 효율을 증진시키는 짧은 펩타이드 서열을 의미한다. As used herein, the term “peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein” or “expression enhancer tag (eet)” is a short peptide sequence that enhances the expression efficiency of the protein by being fused and expressed together at the N-terminus of the target protein. Means

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것일 수 있다. In the recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine of the present invention, the peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein may be an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a part of the sequence derived from urate oxidase. have.

또한 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 1의 일부 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.In addition, in the peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein according to the present invention, some of the sequences of SEQ ID NO: 1 may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동 가능하게 연결된 타겟 단백질을 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나 또는 둘 다의 요소를 함유한다.The term "expression vector" as used herein is a linear or circular DNA molecule composed of fragments encoding a target protein operably linked to additional fragments provided for transcription of the expression vector. Such additional fragments include promoter and termination sequence. Expression vectors also include one or more origins of replication, one or more selection markers, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA or contain elements of both.

본 명세서에서 사용된 용어 “작동 가능하게 연결된”은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.As used herein, the term “operably linked” refers to the fragment being arranged such that transcription at the promoter acts to initiate and proceed through the coding sequence to the termination code.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터는 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The recombinant expression vector for producing norovirus vaccine of the present invention may include a polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 1 to enhance the expression efficiency of the target protein.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 서열일 수 있다In a preferred embodiment of the present invention, the polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 1 may be a sequence represented by SEQ ID NO: 3.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 2의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 서열일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 2 may be a sequence represented by SEQ ID NO: 4.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 노로 바이러스 생산용 재조합 발현 벡터는 1~6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;를 추가로 포함할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the recombinant expression vector for producing norovirus includes polynucleotides encoding 1 to 6 histidines; And a polynucleotide encoding a protein cleavage enzyme recognition site.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 1 내지 6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10으로 표시될 수 있다.In the recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine of the present invention, the polynucleotides encoding 1 to 6 histidines may be represented by SEQ ID NO: 10.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 단백질 절단효소는 TEV일 수 있다.In the recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine of the present invention, the protease may be TEV.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 벡터에 있어서, 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11로 표시되는 것일 수 있다.In the vector for producing a norovirus vaccine of the present invention, the polynucleotide encoding the protease recognition site may be represented by SEQ ID NO: 11.

본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. In the expression vector according to the present invention, the expression vector may be a plasmid, viral vector, phage particle or genomic insert. After transformation into the host cell, the expression vector may be cloned or integrated into the host cell genome regardless of the host cell genome.

본 발명은 또한 상기 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다. The present invention also provides the norovirus derived VP1 protein; And it is intended to provide a host cell transformed with an expression vector comprising a peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein.

본 명세서에서 사용된 용어 “형질전환” 또는 “도입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현벡터를 형질전환시키는 방법은 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄)법, 염화칼슘(CaCl₂)법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. As used herein, the term “transformation” or “introduction” means that DNA is introduced into a host so that it can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration completion. Methods for transforming the expression vector according to the present invention include electroporation, calcium phosphate (CaPO ₄ ), calcium chloride (CaCl ₂ ), microinjection, polyethylene glycol (PEG), and DEAE-dex Tran method, cationic liposome method, or lithium acetate-DMSO method, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.In the host cell according to the present invention, the host cell is preferably a host cell having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of the introduced DNA, and all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells can be used. Preferably, the host cell may be E. coli .

본 발명은 또한 발현 효율이 증진된 노로 바이러스 백신 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 노로 바이러스 백신 생산 방법은:The present invention also provides a method for producing a norovirus vaccine with improved expression efficiency. The norovirus vaccine production method is:

(a) 목적 단백질로 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 생산하는 단계;(a) VP1 protein derived from Noro virus as a target protein; And a peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof; producing a recombinant expression vector for production of a norovirus vaccine comprising a polynucleotide encoding;

(b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 생산하는 단계; 및(b) introducing the expression vector into a host cell to produce a transformant; And

(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.(c) culturing the transformant to induce expression of a recombinant fusion protein, and may include the step of obtaining it.

제2구현예에 따르면, According to the second embodiment,

본 발명은 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 서열번호 1 의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드와 상기 펩타이드의 융합파트너로서 RID(RNA interacting domain)을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공하고자 한다.The present invention is a norovirus-derived VP1 protein; And a fusion protein for enhancing the expression efficiency and water solubility of a target protein comprising an RID (RNA interacting domain) as a fusion partner of the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, and the peptide. It is intended to provide a recombinant expression vector for producing norovirus vaccine comprising a.

즉, 본 발명의 발현벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드 및 RID의 융합 단백질일 수 있다.That is, the expression vector of the present invention includes a polynucleotide encoding a target protein and a polynucleotide encoding a fusion protein bound to the 5`-end of the polynucleotide encoding the target protein, wherein the fusion protein is It may be a fusion protein of peptide and RID to enhance expression efficiency.

본 명세서에서 사용된 용어 “융합 단백질(fusion protein)” 또는 “재조합 단백질(recombinant protein)” 은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.As used herein, the term “fusion protein” or “recombinant protein” is a protein in which another protein is linked to the N-terminus or C-terminus of the original target protein sequence or another amino acid sequence is added. Means

본 명세서에서 사용된 용어 “RID”, “RNA interacting domain“, “N terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)”, 또는 “LysRS RNA 결합 도메인(LysRS RNA interacting domain)”는 LysRS의 RNA와 기타 단백질간의 상호작용에 관여하는 고유한 N-말단(N-terminal) 연장부위를 의미한다. As used herein, the terms “RID”, “RNA interacting domain“, “N terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase”, or “LysRS RNA interacting domain” refer to LysRS RNA and other proteins. A unique N-terminal extension that is involved in the interaction of the liver.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 RID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the fusion protein for enhancing the expression efficiency and water solubility of the target protein according to the present invention, the RID may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.

본 발명의 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.The fusion protein of the present invention may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 노로 바이러스 유래 VP1 단백질을 의미한다. In the fusion protein for enhancing the expression efficiency and water solubility of the target protein according to the present invention, the target protein refers to a norovirus-derived VP1 protein.

본 발명은 또한 목적 단백질의 N-말단에 결합하고 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 RID를 포함하는 융합 단백질을 갖는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다. The present invention is also intended to enhance the expression efficiency and water solubility of a target protein having a fusion protein comprising RID as a peptide and a fusion partner thereof, which binds to the N-terminus of the target protein and comprises an amino acid of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof. It is intended to provide a host cell transformed with an expression vector.

본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다. In the host cell according to the present invention, the host cell is preferably a host cell having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of the introduced DNA, and all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells can be used. Preferably, the host cell may be E. coli .

본 발명은 또한 발현 효율 및 수용성이 증진된 노로 바이러스 백신의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 노로 바이러스 백신의 생산 방법은:The present invention also provides a method for producing a norovirus vaccine with improved expression efficiency and water solubility. The production method of the norovirus vaccine is:

(A) 노로 바이러스 유래 VP1 단백질의 N-말단에 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 수용성을 높여 주는 RID를 포함하는 융합 단백질이 결합된 재조합 목적 단백질을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;(A) a peptide comprising a amino acid of SEQ ID NO: 1 or a part of its sequence at the N-terminus of the norovirus-derived VP1 protein, and a recombinant target protein comprising a fusion protein comprising a RID that enhances water solubility as a fusion partner thereof Preparing an expression vector;

(B) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및(B) introducing the expression vector into a host cell; And

(C) 상기 숙주세포로부터 재조합 노로 바이러스 VP1 단백질을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. (C) may include the step of producing a virus VP1 protein with a recombinant furnace from the host cell.

본 발명에 따른 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 수용성 증진 단백질로 잘 알려진 RID에 상기 펩타이드를 결합한 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율뿐만 아니라 수용성을 향상시킴으로써, 재조합 노로 바이러스 VP1 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.The peptide containing 7 amino acids derived from uric acid oxidase according to the present invention can improve the expression efficiency of the target protein, and the fusion protein that binds the peptide to the RID, which is well known as a water-soluble enhancement protein, expresses the target protein. In addition, by improving the water solubility, it can be usefully used for the production of recombinant norovirus VP1 protein.

본 발명의 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 노로 바이러스 백신 생산 방법은 대장균에서 효과적으로 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로도 정교한 VLP 생산을 가능하게 함으로써, 저비용 고효율의 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있게 되었다.The recombinant expression vector of the present invention and a method for producing a norovirus vaccine using the same can effectively produce a norovirus VLP vaccine in E. coli as well as enable structurally sophisticated VLP production, thereby producing a low-cost, high-efficiency norovirus VLP vaccine. Became.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 수용성 노로 바이러스 생산용 재조합 발현 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질의 수용성 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과로 왼쪽 패널은 MSAVKAA-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과이고 오른쪽 패널은 비교예(MSEQ-RID가 재조합 되어 있는 VP1; 69 kDa)의 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질의 수용성 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과로 왼쪽 패널은 MSAVKAA-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과, 가운데 패널은 MSAV-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과, 오른쪽 패널은 대조군(MS-RID)의 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질을 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하고 확인한 크로마토그램 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질을 정제한 후 SDS-PAGE로 확인하였고, 18~20 레인의 분획을 풀링(pooling)한 결과이다.
도 5는 TEV 단백질 절단효소를 이용하여 노로 바이러스 VP1을 절단한 후 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 6은 발현 및 정제를 통해 얻은 단백질이 VP1 서열로 이루어져 있는지 확인하기 위하여 펩타이드 맵핑과 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 분석 결과로서,
도 6a는 트립신 처리 후 분석된 UPLC 피크이고,
도 6b는 트립신 처리 시 나타나는 펩타이드 절편을 LC-MS/MS 로 분석한 결과 당초 예상한 시퀀스와 83.9%의 아미노산 서열이 일치함을 확인한 결과이고,
도 6c는 N-말단 서열이 노로 바이러스 VP1과 일치함을 확인한 결과이고,
도 6d는 C-말단 서열이 노로 바이러스 VP1과 일치함을 확인한 결과이다.
도 7은 TEV 단백질 절단효소로 절단한 후 형성된 VLP를 정제하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램(A) 및 SDS-PAGE(B) 결과이다.
도 8은 정제된 VLP의 전체적인 직경을 확인하기 위하여 DLS(Dynamic Light Scattering)를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성했는지 TEM 전자현미경을 이용하여 확인한 결과이다[A: 전자현미경을 통하여 확인한 대장균 유래 VLP(Virus-like particle), B: 히스티딘, TEV 인식서열을 포함하는 RID tag을 제거하지 않은 재조합 VP1 단백질 (VLP 구조형성에 실패하였음), C: 배큘로바이러스-곤충세포 시스템을 이용하여 생산한 노로바이러스 VLP. D: 야생형 노로바이러스 비리온].1 is a schematic diagram showing the structure of a recombinant expression vector for producing water-soluble norovirus according to an embodiment of the present invention.
Figure 2a is a result of confirming the water-soluble expression of the VP1 protein expressed according to an embodiment of the present invention by SDS-PAGE, the left panel is the expression result of VP1 (70 kDa) recombinant MSAVKAA-RID and the right panel is a comparative example (VSEQ with recombinant MSEQ-RID; 69 kDa).
Figure 2b is a result of confirming the water-soluble expression of the VP1 protein expressed according to an embodiment of the present invention by SDS-PAGE, the left panel is the expression result of VP1 (70 kDa) recombinant MSAVKAA-RID, the middle panel is MSAV- As a result of expression of VP1 (70 kDa) in which the RID was recombined, the right panel is the result of the control (MS-RID).
3 is a chromatogram result obtained by purifying and confirming VP1 protein expressed according to an embodiment of the present invention through nickel affinity chromatography.
Figure 4 shows the results of pooling (pooling) the fractions of lanes 18-20 after purification of the VP1 protein expressed according to one embodiment of the present invention by SDS-PAGE.
5 is a result confirmed by SDS-PAGE after cutting the norovirus VP1 using TEV protein cleavage enzyme.
6 is a peptide mapping and N-terminal and C-terminal amino acid sequence analysis results to confirm that the protein obtained through expression and purification consists of VP1 sequence,
Figure 6a is a UPLC peak analyzed after trypsin treatment,
Figure 6b is a result of analyzing the peptide fragments appearing during trypsin treatment by LC-MS / MS confirming that the originally expected sequence and the amino acid sequence of 83.9% coincide,
6c is a result of confirming that the N-terminal sequence is consistent with Noro virus VP1,
6D is a result confirming that the C-terminal sequence is consistent with Noro virus VP1.
7 is a chromatogram (A) and SDS-PAGE (B) results showing the results of size exclusion chromatography to purify the VLP formed after cleavage with TEV protein cleavage enzyme.
Figure 8 shows the results of the analysis through DLS (Dynamic Light Scattering) to confirm the overall diameter of the purified VLP.
9 is a result of confirming whether the purified VP1 protein formed VLP using a TEM electron microscope [A: Virus-like particle (VLP) derived from E. coli confirmed through an electron microscope, B: RID including a histidine, TEV recognition sequence Recombinant VP1 protein without tag removal (VLP structure formation failed), C: Norovirus VLP produced using baculovirus-insect cell system. D: wild type norovirus virion].

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.

재조합 발현 벡터 제작 및 VP1 단백질 발현Construction of recombinant expression vectors and VP1 protein expression

대장균을 통한 노로 바이러스 VLP 생산에는 Norovirus Hu/GII.4/Hiroshima/55/2005/JPN (NCBI access number: AB504310.1) 유래 VP1 유전자가 이용되었으며, 해당 VP1 유전자는 유전자 합성을 통하여 확보하였다. pGE-LysRS 벡터가 발현벡터로 이용되었으며 위 벡터는 pGEMEX-1(Promega) 벡터를 수정하여 만든 발현 벡터이다. 구체적으로, NdeⅠ과 BamHⅠ 제한효소를 처리하여 절단하였으며 잘려진 발현벡터 내에 MSAVKAA(eet1, 서열번호 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 3) 또는 MSAV(eet2, 서열번호 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 4); 6개의 히스티딘 태그(Histag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 11); G를 제거한 TEV 인식서열 (ENLYFQ)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 12); 및 VP1(서열번호 13)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 14)이 연속적으로 구성되어있는 DNA 절편을 삽입하였다(도 1). 이렇게 완성된 재조합 플라스미드를 대장균 숙주 HMS174(DE3)에 형질전환 하였다. 단백질을 발현하기 위한 최초배양은 50 μg/ml 암피실린이 들어간 15 μg/ml LB 배지에 37℃에서 하루 동안 배양한 후, 같은 농도의 암피실린이 들어간 15 ml의 LB 배지에 전날 배양한 대장균 1 ml을 첨가하여 37℃에서 O.D_600nm가 0.5~0.7에 도달할 때까지 배양하였다. 적정 O.D 값에 도달하였을 때 1 mM IPTG로 과발현을 유도하였으며 IPTG 첨가 후에는 다양한 온도(37℃, 16℃)에서 발현시켰다. 비교예로 이전 연구에 적용된 4개의 아미노산을 포함하는 RID가 접합된 노로바이러스 VP1도 동일한 조건에서 발현시켰으며, 발현된 단백질을 채취하여 SDS-PAGE를 통하여 수용성 여부를 확인하였다.The VP1 gene from Norovirus Hu/GII.4/Hiroshima/55/2005/JPN (NCBI access number: AB504310.1) was used to produce Norovirus VLP through E. coli, and the VP1 gene was obtained through gene synthesis. The pGE-LysRS vector was used as an expression vector, and the above vector is an expression vector created by modifying the pGEMEX-1 (Promega) vector. Specifically, polynucleotides encoding MSAVKAA (eet1, SEQ ID NO: 1) or polynucleotides encoding MSAV (eet2, SEQ ID NO: 2) in the truncated expression vector were cut by treatment with NdeI and BamHI restriction enzymes. Sequence (SEQ ID NO: 4); A polynucleotide sequence encoding six histidine tags (Histag) (SEQ ID NO: 11); A polynucleotide sequence encoding a TEV recognition sequence (ENLYFQ) with G removed (SEQ ID NO: 12); And a DNA fragment in which a polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 14) encoding VP1 (SEQ ID NO: 13) was continuously constructed (FIG. 1). The thus obtained recombinant plasmid was transformed into E. coli host HMS174 (DE3). The initial culture for expressing the protein was incubated in a 15 μg/ml LB medium containing 50 μg/ml ampicillin for one day at 37° C., followed by 1 ml of E. coli cultured in the 15 ml LB medium containing the same concentration of ampicillin the previous day. It was added and cultured at 37°C until OD _600nm reached 0.5-0.7. When the appropriate OD value was reached, overexpression was induced with 1 mM IPTG and expressed at various temperatures (37°C, 16°C) after the addition of IPTG. As a comparative example, the norovirus VP1 conjugated with RID containing 4 amino acids applied in the previous study was also expressed under the same conditions, and the expressed protein was collected to confirm whether it was soluble through SDS-PAGE.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 재조합된 VP1 단백질은 37℃뿐만 아니라 16℃ 에서도 잘 발현됨을 확인하였다. 또한, 비교예 VP1과 발현량을 비교한 결과, 본 발명의 재조합 VP1이 비교예 VP1 보다 발현량이 약 2배 이상으로 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2a). 또한, 노로 VP1 단백질의 크기는 59kDa이고 RID (8kDa)가 포함된 VP1의 크기는 약 70kDa 이었으며 확인 결과 적절한 위치에서 발현되었음을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 2a, it was confirmed that the recombinant VP1 protein is well expressed at 37°C as well as at 16°C. In addition, as a result of comparing the expression level with the comparative example VP1, it was confirmed that the recombinant VP1 of the present invention significantly increased the expression level by about 2 times or more than the comparative example VP1 (FIG. 2A ). In addition, the size of Noro VP1 protein was 59 kDa, and the size of VP1 containing RID (8 kDa) was about 70 kDa, confirming that it was expressed at an appropriate position.

본 발명의 펩타이드 중 일부 서열의 효과Effect of some sequences among the peptides of the present invention

상기 실시예 1에서 확인된 펩타이드(eet1, 서열번호 1)의 일부 서열(eet2, 서열번호 2)을 노로 VP1에 융합하였을 때의 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 VP1 단백질을 발현시켰다. 1mM IPTG 첨가 후 37℃에서 3시간 동안 발현된 단백질을 채취하여 SDS-PAGE를 통하여 수용성 여부를 확인하였다.Expression of the VP1 protein in the same manner as in Example 1 to confirm the effect of fusion of some sequences (eet2, SEQ ID NO: 2) of the peptide (eet1, SEQ ID NO: 1) identified in Example 1 to VP1 with Noro Ordered. After adding 1 mM IPTG, the protein expressed at 37° C. was collected for 3 hours to check whether it was water-soluble through SDS-PAGE.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, MS-RID가 융합된 대조군에서는 VP1 단백질이 발현되지 않았고, VP1에 eet2를 융합시킨 경우는 eet1과 비슷한 발현량을 보이는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 2B, it was confirmed that VP1 protein was not expressed in the control group in which MS-RID was fused, and that eet2 was fused to VP1, and that the expression level was similar to that of eet1.

노로바이러스 VP1 정제Norovirus VP1 purification

수용성이 확인된 단백질들은 니켈(Ni) 친화성 크로마토그래피를 통하여 정제되었다. 위와 동일한 방식의 배양방법을 이용하여 3 ml, 50 ml를 거쳐 최종적으로 500 ml의 대장균을 발현 및 수확한 뒤 정제를 진행하였다. 구체적으로, A 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM 염화나트륨, 5% 글리세롤, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 및 10 mM 이미다졸] 로 먼저 이퀼리브리엄 하였고 이퀼리브리엄 한 Ni-NTA 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 샘플 단백질을 정제하였다. A 버퍼 이후 B 버퍼[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM 염화나트륨, 5% 글리세롤, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 및 300 mM 이미다졸]를 이용해 10~300 mM 범위의 직선형 그래디언트 이미다졸로 단백질을 용출시켰다. SDS-PAGE를 통해 타겟 단백질을 포함하는 분획을 확인한 후 해당 분획을 모아 C 버퍼(저장버퍼) [50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM NaCl, 0.1 % 2-머캡토에탄올]를 이용하여 투석하였다. 최종적으로 정제된 단백질의 농도는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용하여 정량하였다. 정제된 VP1 단백질은 20% 글리세롤(glycerol)을 1:1 비율로 섞은 후 -20℃에서 보관하였다.Proteins that were found to be water soluble were purified by nickel (Ni) affinity chromatography. Using the same culture method as above, after 3 ml and 50 ml, 500 ml of E. coli was finally expressed and harvested, followed by purification. Specifically, it was first equilibrium with A buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM sodium chloride, 5% glycerol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, and 10 mM imidazole], and an equilibrium Ni-NTA column (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) was used to purify sample proteins. A gradient imida in the range of 10-300 mM using A buffer followed by B buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM sodium chloride, 5% glycerol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, and 300 mM imidazole] The protein was eluted with Zolo. After confirming the fraction containing the target protein through SDS-PAGE, collect the fractions and use C buffer (storage buffer) [50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM NaCl, 0.1% 2-mercaptoethanol] Dialysis. The final purified protein concentration was quantified using BSA (Amresco, Solon, OH, USA). The purified VP1 protein was mixed at a 1:1 ratio of 20% glycerol and stored at -20°C.

니켈 친화성 크로마토그래피로 정제된 MSAVKAA-RID-VP1 융합단백질을 확인한 결과 및 SDS-PAGE를 통해 정제 여부를 확인한 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 정제를 성공적으로 진행하였으며, 1차 정제 이후 TEV protease를 통한 MSAVKAA-RID를 포함하는 접합 단백질 (tag) 또한 성공적으로 제거하였다. 이후 2^nd Ni-affinity chromatography를 통하여 TEV, cleaved tag, uncleaved-융합단백질을 분리하고 완전히 정제된 VP1을 획득하였다(도 5). The results of confirming the MSAVKAA-RID-VP1 fusion protein purified by nickel affinity chromatography and the results of confirming purification through SDS-PAGE are shown in FIGS. 3 and 4. Purification was carried out successfully, and after the first purification, the conjugate protein (tag) containing MSAVKAA-RID through TEV protease was also successfully removed. Thereafter, TEV, cleaved tag, and uncleaved-fusion protein were separated through 2 ^nd Ni-affinity chromatography and completely purified VP1 was obtained (FIG. 5).

정제된 VP1의 아미노서열 분석Amino sequence analysis of purified VP1

발현 및 정제 실험을 통해 얻은 단백질이 예상했던 VP1 sequence로 이루어져 있는지 확인하기 위하여 펩타이드 맵핑(Peptide mapping) 및 N-말단 및 C-말단 시퀀싱을 전문분석기관인 ISS (www.isslab.co.kr)에 의뢰하여 진행하였다. 먼저 트립신 처리 시 나타나는 펩타이드 절편을 LC-MS/MS 로 분석한 결과 당초 예상한 시퀀스와 83.9%의 아미노산 서열이 일치함을 확인하였다. N-말단 서열 26mer 와 C-말단 3-mer을 비교한 결과 NoV VP1 과 일치함을 확인하였다(도 6). Peptide mapping and N-terminal and C-terminal sequencing were commissioned to ISS ( www.isslab.co.kr) , a specialized analysis organization, to confirm that the protein obtained through the expression and purification experiments consisted of the expected VP1 sequence. To proceed. First, as a result of analyzing the peptide fragments appearing during trypsin treatment by LC-MS/MS, it was confirmed that the amino acid sequence of 83.9% coincided with the originally expected sequence. As a result of comparing the N-terminal sequence 26mer and the C-terminal 3-mer, it was confirmed that it is consistent with NoV VP1 (FIG. 6 ).

크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography)Size exclusion chromatography

TEV cleavage 후 단백질 절단효소로 절단시킨 VP1 단백질의 이합체가 VLP를 형성하는지 여부를 확인하기 위한 생화학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 4℃에서 Superdex-200 분석 겔-여과 컬럼(analytical gel-filtration column)을 통하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 진행하였다. After TEV cleavage, a biochemical analysis was performed to confirm whether the dimer of the VP1 protein cleaved with a protein cleavage enzyme forms VLP. Specifically, the superdex-200 analytical gel-filtration column at 4°C was performed by size exclusion chromatography through an analytical gel-filtration column.

전날 AcTEV 단백질 절단효소를 이용하여 16℃에서 하루동안 융합 단백질을 절단시켰다. 컬럼에는 버퍼[Ammonium acetate 250 mM (pH 6.0)]로 이퀼리브리엄을 진행하였고, 이퀼리브리엄 종료 후에 융합 파트너 단백질이 절단된 VP1 샘플을 로딩하여 정제하였다. 정제 후 페리틴(440 kDa), 알돌레이즈(158 kDa), 콘알부민(75 kDa), 오발부민(44 kDa), 블루 덱스트란 2000(GE Healthcare)을 이용하여 칼리브레이션을 진행함으로써 크로마토그램(chromatogram) 상에서 피크(peak)로 나타난 단백질의 분자량을 결정하였다.The day before, the fusion protein was cleaved at 16°C for one day using AcTEV protein cleaving enzyme. Equilibrium was carried out with a buffer [Ammonium acetate 250 mM (pH 6.0)] on the column, and after completion of the equilibrium, the fusion partner protein was cut and purified by loading a VP1 sample. After purification, on the chromatogram by performing calibration using ferritin (440 kDa), aldolase (158 kDa), albumin (75 kDa), ovalbumin (44 kDa), and blue dextran 2000 (GE Healthcare). The molecular weight of the protein represented by the peak was determined.

종래 연구 결과에 의하면 노로 바이러스 VLP는 10 MDa 의 분자량을 보이고 우리가 사용한 컬럼의 최대 정제 한계가 800 kDa이므로 VLP를 적절하게 형성하였을 때 Void에서 정제될 것이라고 가정하였다. 크로마토그램을 확인한 결과 Void에서 노로 바이러스 VLP로 보이는 높은 피크를 확인할 수 있었으며(도 7A), 정제하여 수확한 분획들을 SDS-PAGE로 확인해본 결과 크로마토그램의 void에서 나타난 피크가 노로 바이러스 VLP에 해당함을 확인할 수 있었다(도 7B). 또한 TEV 단백질 절단효소에 의해 잘려진 hRBD 또한 크로마토그래피를 통하여 정제되었음을 확인할 수 있었다. According to the results of the previous studies, it was assumed that norovirus VLP has a molecular weight of 10 MDa and the maximum purification limit of our column is 800 kDa, so that VLP will be purified when VLP is properly formed. As a result of confirming the chromatogram, it was possible to confirm a high peak visible from Void as Noro virus VLP (FIG. 7A), and the purified and harvested fractions were checked by SDS-PAGE. As a result, the peak shown in void of the chromatogram corresponds to Noro virus VLP It was confirmed (Fig. 7B). In addition, it was confirmed that hRBD truncated by TEV protein cleavage enzyme was also purified through chromatography.

동적광산란 분석Dynamic light scattering analysis

정제된 바이러스 유사 입자(VLP)의 전체적인 직경을 확인하기 위하여 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)을 통하여 분석하였다.To confirm the overall diameter of the purified virus-like particle (VLP), it was analyzed through dynamic light scattering (DLS).

그 결과 야생형 노로바이러스가 보이는 30~40nm와 비슷한 크기로 나타나는 것을 확인하였다(도 8).As a result, it was confirmed that the wild-type norovirus appeared in a size similar to that of 30-40 nm (FIG. 8).

전자 현미경을 통한 VLP 형성 확인Confirmation of VLP formation through electron microscope

Void에서 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성했는지 확인하기 위하여 전자 현미경으로 관찰하였다. 정제된 노로 바이러스 VLP를 먼저 구리 그리드에 1분 간 올린 뒤 2% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)를 이용하여 15초 간 염색하였다. 전 처리한 샘플을 30분 간 상온에서 건조시킨 뒤 투과 전자 현미경(TEM, Transmission electron microscopy; JEM-1011, JEOL, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 위 실험은 연세대학교 의과대학 의생명연구원 연구지원부에서 수행하였다. The VP1 protein purified from Void was observed with an electron microscope to confirm that VLP was formed. The purified norovirus VLP was first placed on a copper grid for 1 minute and then stained for 15 seconds using 2% uranyl acetate. The pre-treated sample was dried at room temperature for 30 minutes, and then photographed using a transmission electron microscopy (TEM, JEM-1011, JEOL, Japan). The above experiment was conducted by the Research Support Department of the Institute of Biomedical Research, Yonsei University College of Medicine.

그 결과 도 9에 나타난 바와 같이, 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 확인된 VLP의 직경은 34 nm 였으며, 배큘로바이러스-곤충세포 발현시스템을 이용하여 생산한 노로바이러스 VLP와 야생형 노로바이러스의 직경과 비슷하였다. 반면, TEV 단백질 절단효소로 단백질 절단하지 않고 hRBD가 융합되어 있는 VP1은 VLP를 형성하지 못하고 응집되는 것을 확인할 수 있었다(도 9).As a result, as shown in FIG. 9, it was confirmed that the purified VP1 protein forms VLP. The diameter of the identified VLP was 34 nm, and was similar to the diameter of the norovirus VLP and wild-type norovirus produced using the baculovirus-insect cell expression system. On the other hand, it was confirmed that VP1 in which hRBD is fused without protein cleavage with TEV protein cleavage enzyme does not form VLP and aggregates (FIG. 9).

<110> Inthera Inc. <120> Recombinant Expression Vectors for Producing Norovirus Vaccine <130> 1064696 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA protein <400> 1 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV protein <400> 2 Met Ser Ala Val 1 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA DNA <400> 3 atgtccgcag taaaagcagc c 21 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV DNA <400> 4 atgtccgcag ta 12 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ Protein <400> 5 Met Ser Glu Gln His Ala Gln 1 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ DNA <400> 6 atgtctgaac aacacgcaca g 21 <210> 7 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID protein <400> 7 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 <210> 8 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID DNA <400> 8 atggcggccg tgcaggcggc cgaggtgaaa gtggatggca gcgagccgaa actgagcaag 60 aatgagctga agagacgcct gaaagctgag aagaaagtag cagagaagga ggccaaacag 120 aaagagctca gtgagaaaca gctaagccaa gccactgctg ctgccaccaa ccacaccact 180 gataatggtg tgggtcctga ggaagagagc gtg 213 <210> 9 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID protein <400> 9 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 10 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID DNA <400> 10 atgtccgcag taaaagcagc cgcggccgtg caggcggccg aggtgaaagt ggatggcagc 60 gagccgaaac tgagcaagaa tgagctgaag agacgcctga aagctgagaa gaaagtagca 120 gagaaggagg ccaaacagaa agagctcagt gagaaacagc taagccaagc cactgctgct 180 gccaccaacc acaccactga taatggtgtg ggtcctgagg aagagagcgt g 231 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Histidine tag <400> 11 caccatcacc atcaccat 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV <400> 12 gaaaacctgt attttcag 18 <210> 13 <211> 1620 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 <400> 13 Met Glu Thr Leu Tyr Ser Met Glu Thr Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Ser Asn Ala Ser Pro Ala Leu Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ser Glu 20 25 30 Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Leu Ala 35 40 45 Ala Ser Asn Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Gly Leu Ala Val 50 55 60 Ala Leu Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Ala Val Ala Leu Met Glu 65 70 75 80 Thr Ala Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu 85 90 95 Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ile Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu 115 120 125 Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Asn Ala Ser Asn Val Ala Leu Ile Leu Glu 130 135 140 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Thr Arg Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala 145 150 155 160 Ser Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Leu 165 170 175 Ala Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Pro His Glu 180 185 190 Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ala Arg Gly Ala 195 200 205 Ser Asn Ala Leu Ala Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Ile Leu 210 215 220 Glu Leu Glu Ala Thr Arg Pro Ser Glu Arg Ala Leu Ala Pro Arg Ala 225 230 235 240 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ala Ser Pro Leu Glu Ala Ala 245 250 255 Ser Asn Pro Arg Ala Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Glu Arg His Ile 260 265 270 Ser Leu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Arg Gly Met Glu Thr Thr Tyr Arg 275 280 285 Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Gly 290 295 300 Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Asn Val Ala 305 310 315 320 Leu Ile Leu Glu Leu Glu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ser Asn 325 330 335 Ala Leu Ala Pro His Glu Thr His Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Leu 340 345 350 Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Leu 355 360 365 Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Ala Ser Asn Pro His Glu 370 375 380 Pro Arg Ala Thr His Arg Gly Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Ser 385 390 395 400 Glu Arg Pro Arg Ala Ser Glu Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Thr His 405 410 415 Arg Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala His Ile Ser Ile Leu Glu 420 425 430 Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly 435 440 445 Leu Asn Leu Glu Ala Gly Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu Leu Glu 450 455 460 Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ala Ala Ser Pro 465 470 475 480 Val Ala Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Thr 485 490 495 Tyr Arg His Ile Ser Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Gly Leu Asn Ser Glu 500 505 510 Arg Ala Ser Asn Ala Ser Pro Ser Glu Arg Thr His Arg Ile Leu Glu 515 520 525 Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Leu Glu Ala Leu Ala Met Glu Thr Leu 530 535 540 Glu Ala Thr Tyr Arg Thr His Arg Pro Arg Ala Leu Glu Ala Ala Arg 545 550 555 560 Gly Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ala Leu Ala Gly Leu Tyr 565 570 575 Ala Ser Pro Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Thr His Arg Val 580 585 590 Ala Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Val Ala Leu Leu Glu 595 600 605 Ala Thr His Arg Ala Arg Gly Pro Arg Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala 610 615 620 Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Ser Pro Pro His Glu Ile Leu Glu Pro 625 630 635 640 His Glu Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr His 645 650 655 Arg Val Ala Leu Gly Leu Ala Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His Arg 660 665 670 Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Pro His Glu Thr His Arg Val Ala Leu Pro 675 680 685 Arg Ala Val Ala Leu Leu Glu Ala Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu 690 695 700 Ala Gly Leu Ala Met Glu Thr Thr His Arg Ala Ser Asn Ser Glu Arg 705 710 715 720 Ala Arg Gly Pro His Glu Pro Arg Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu 725 730 735 Glu Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Pro His Glu Thr His 740 745 750 Arg Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala 755 760 765 Pro His Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Asn Pro Arg Ala Gly 770 775 780 Leu Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Thr His 785 790 795 800 Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Leu Glu Ala 805 810 815 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu 820 825 830 Glu Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ala Leu Ala Ser Asn Ile Leu 835 840 845 Glu Cys Tyr Ser Thr His Arg Pro His Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr 850 855 860 Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Pro 865 870 875 880 Arg Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Thr Tyr 885 890 895 Arg Ala Arg Gly Met Glu Thr Ala Ser Asn Leu Glu Ala Ala Leu Ala 900 905 910 Ser Glu Arg Gly Leu Asn Ala Ser Asn Thr Arg Pro Ala Ser Asn Ala 915 920 925 Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ala Thr His Arg Gly Leu 930 935 940 Ala Gly Leu Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala 945 950 955 960 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Pro Arg Ala Ala Ser Pro Pro 965 970 975 His Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Leu 980 985 990 Asn Gly Leu Tyr Met Glu Thr Leu Glu Ala Thr His Arg Gly Leu Asn 995 1000 1005 Thr His Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Gly 1010 1015 1020 Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr His Ile 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg 1045 1050 1055 Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Ala Ser Pro Pro 1060 1065 1070 His Glu Thr His Arg Pro Arg Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Leu 1075 1080 1085 Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Pro His Glu Ala Leu Ala 1090 1095 1100 Thr His Arg Ala Ser Pro Thr His Arg Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala 1105 1110 1115 1120 Ser Pro Pro His Glu Gly Leu Ala Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu 1125 1130 1135 Asn Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Pro His Glu Thr His Arg 1140 1145 1150 Pro Arg Ala Val Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ile Leu Glu Gly 1155 1160 1165 Leu Asn Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu 1170 1175 1180 Ala His Ile Ser Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Ala Pro Arg Ala 1185 1190 1195 1200 Gly Leu Asn Gly Leu Asn Thr Arg Pro Val Ala Leu Leu Glu Ala Pro 1205 1210 1215 Arg Ala Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Arg 1220 1225 1230 Gly Thr His Arg Val Ala Leu His Ile Ser Ala Ser Asn Val Ala Leu 1235 1240 1245 His Ile Ser Leu Glu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Ala Leu Ala Val 1250 1255 1260 Ala Leu Ala Leu Ala Pro Arg Ala Thr His Arg Pro His Glu Pro Arg 1265 1270 1275 1280 Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Gly Leu Asn Leu Glu Ala Leu Glu Ala 1285 1290 1295 Pro His Glu Pro His Glu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Thr His Arg Met 1300 1305 1310 Glu Thr Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu 1315 1320 1325 Tyr Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Ala Ser Asn Met Glu Thr Ala Ser Pro 1330 1335 1340 Leu Glu Ala Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Leu Glu Ala Leu Glu Ala Pro 1345 1350 1355 1360 Arg Ala Gly Leu Asn Gly Leu Ala Thr Arg Pro Val Ala Leu Gly Leu 1365 1370 1375 Asn His Ile Ser Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Gly Leu Ala 1380 1385 1390 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ser 1395 1400 1405 Glu Arg Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ala Leu Glu 1410 1415 1420 Ala Ala Arg Gly Pro His Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Pro Arg Ala 1425 1430 1435 1440 Ala Ser Pro Thr His Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Val Ala Leu Leu 1445 1450 1455 Glu Ala Pro His Glu Gly Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Glu 1460 1465 1470 Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg 1475 1480 1485 Val Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala His Ile Ser Thr 1490 1495 1500 His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Asn His Ile Ser Ala Ser Pro Leu Glu 1505 1510 1515 1520 Ala Val Ala Leu Ile Leu Glu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Ala Ser Asn 1525 1530 1535 Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Pro His Glu Ala Arg Gly Pro His Glu Ala 1540 1545 1550 Ser Pro Ser Glu Arg Thr Arg Pro Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu 1555 1560 1565 Asn Pro His Glu Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Ala Ala Leu Ala 1570 1575 1580 Pro Arg Ala Met Glu Thr Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala 1585 1590 1595 1600 Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Leu 1605 1610 1615 Ala Leu Glu Ala 1620 <210> 14 <211> 1620 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 <400> 14 atgaaaatgg cgagcaatga tgcgagcccg agcgatggca gcaccgcgaa tctggtgccg 60 gaagtgaata atgaagtgat ggcgctggaa ccggtggtgg gcgcggcgat tgcggcgccg 120 gtggcgggcc agcagaatgt gattgatccg tggattcgca ataattttgt gcaggcgccg 180 ggcggcgaat ttaccgtgag cccgcgcaat gcgccgggcg aaattctgtg gagcgcgccg 240 ctgggcccgg atctgaatcc gtatctgagc catctggcgc gcatgtataa tggctatgcg 300 ggcggctttg aagtgcaggt gattctggcg ggcaatgcgt ttaccgcggg caaaattatt 360 tttgcggcgg tgccgccgaa ttttccgacc gaaggcctga gcccgagcca ggtgaccatg 420 tttccgcata ttattgtgga tgtgcgccag ctggaaccgg tgctgattcc gctgccggat 480 gtgcgcaata atttttatca ttataatcag agcaatgata gcaccattaa actgattgcg 540 atgctgtata ccccgctgcg cgcgaataat gcgggcgatg atgtgtttac cgtgagctgc 600 cgcgtgctga cccgtccgag cccggatttt gattttattt ttctggtgcc gccgaccgtg 660 gaaagccgta ccaaaccgtt taccgtgccg gtgctgaccg tggaagaaat gaccaatagc 720 cgctttccga ttccgctgga aaaactgttt accggcccga gcagcgcgtt tgtggtgcag 780 ccgcagaatg gccgctgcac caccgatggc gtgctgctgg gcaccaccca gctgagcccg 840 gtgaatattt gcacctttcg tggcgatgtg acccatattc cgggcacccg cacctatcgc 900 atgaatctgg cgagccagaa ttggaataat tatgatccga ccgaagaaat tccggcgccg 960 ctgggcaccc cggattttgt gggcaaaatt cagggcatgc tgacccagac caccaaaggc 1020 gatggcagca cccgtggcca taaagcgacc gtgagcaccg gcagcgtgga ttttaccccg 1080 aaactgggca gcgtgcagtt tgcgaccgat accgataatg attttgaaac cggccagaat 1140 acccgcttta ccccggtggg cgtgattcag gatggcagca gcgcgcatcg caatgaaccg 1200 cagcagtggg tgctgccgga ttatagcggt cgcaccgtgc ataatgtgca tctggcgccg 1260 gcggtggcgc cgacctttcc gggcgaacag ctgctgtttt ttcgcagcac catgccgggc 1320 tgcagcggct atccgaatat ggatctggat tgcctgctgc cgcaggaatg ggtgcagcat 1380 ttttatcagg aagcggcgcc ggcgcagagc gatgtggcgc tgctgcgctt tgtgaatccg 1440 gataccggcc gcgtgctgtt tgaatgcaaa ctgcataaaa ccggctatgt gaccgtggcg 1500 cataccggcc agcatgatct ggtgattccg ccgaatggct attttcgctt tgatagctgg 1560 gtgaatcagt tttataccct ggcgccgatg ggcaatggcg cgggccgccg tcgcgcgctg 1620 1620 <110> Inthera Inc. <120> Recombinant Expression Vectors for Producing Norovirus Vaccine <130> 1064696 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA protein <400> 1 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV protein <400> 2 Met Ser Ala Val One <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA DNA <400> 3 atgtccgcag taaaagcagc c 21 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV DNA <400> 4 atgtccgcag ta 12 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ Protein <400> 5 Met Ser Glu Gln His Ala Gln 1 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ DNA <400> 6 atgtctgaac aacacgcaca g 21 <210> 7 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID protein <400> 7 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 <210> 8 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID DNA <400> 8 atggcggccg tgcaggcggc cgaggtgaaa gtggatggca gcgagccgaa actgagcaag 60 aatgagctga agagacgcct gaaagctgag aagaaagtag cagagaagga ggccaaacag 120 aaagagctca gtgagaaaca gctaagccaa gccactgctg ctgccaccaa ccacaccact 180 gataatggtg tgggtcctga ggaagagagc gtg 213 <210> 9 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID protein <400> 9 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 10 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID DNA <400> 10 atgtccgcag taaaagcagc cgcggccgtg caggcggccg aggtgaaagt ggatggcagc 60 gagccgaaac tgagcaagaa tgagctgaag agacgcctga aagctgagaa gaaagtagca 120 gagaaggagg ccaaacagaa agagctcagt gagaaacagc taagccaagc cactgctgct 180 gccaccaacc acaccactga taatggtgtg ggtcctgagg aagagagcgt g 231 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Histidine tag <400> 11 caccatcacc atcaccat 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV <400> 12 gaaaacctgt attttcag 18 <210> 13 <211> 1620 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 <400> 13 Met Glu Thr Leu Tyr Ser Met Glu Thr Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Ser Asn Ala Ser Pro Ala Leu Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ser Glu 20 25 30 Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Leu Ala 35 40 45 Ala Ser Asn Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Gly Leu Ala Val 50 55 60 Ala Leu Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Ala Val Ala Leu Met Glu 65 70 75 80 Thr Ala Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu 85 90 95 Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ile Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu 115 120 125 Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Asn Ala Ser Asn Val Ala Leu Ile Leu Glu 130 135 140 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Thr Arg Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala 145 150 155 160 Ser Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Leu 165 170 175 Ala Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Pro His Glu 180 185 190 Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ala Arg Gly Ala 195 200 205 Ser Asn Ala Leu Ala Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Ile Leu 210 215 220 Glu Leu Glu Ala Thr Arg Pro Ser Glu Arg Ala Leu Ala Pro Arg Ala 225 230 235 240 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ala Ser Pro Leu Glu Ala Ala 245 250 255 Ser Asn Pro Arg Ala Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Glu Arg His Ile 260 265 270 Ser Leu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Arg Gly Met Glu Thr Thr Tyr Arg 275 280 285 Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Gly 290 295 300 Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Asn Val Ala 305 310 315 320 Leu Ile Leu Glu Leu Glu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ser Asn 325 330 335 Ala Leu Ala Pro His Glu Thr His Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Leu 340 345 350 Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Leu 355 360 365 Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Ala Ser Asn Pro His Glu 370 375 380 Pro Arg Ala Thr His Arg Gly Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Ser 385 390 395 400 Glu Arg Pro Arg Ala Ser Glu Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Thr His 405 410 415 Arg Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala His Ile Ser Ile Leu Glu 420 425 430 Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly 435 440 445 Leu Asn Leu Glu Ala Gly Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu Leu Glu 450 455 460 Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ala Ala Ser Pro 465 470 475 480 Val Ala Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Thr 485 490 495 Tyr Arg His Ile Ser Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Gly Leu Asn Ser Glu 500 505 510 Arg Ala Ser Asn Ala Ser Pro Ser Glu Arg Thr His Arg Ile Leu Glu 515 520 525 Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Leu Glu Ala Leu Ala Met Glu Thr Leu 530 535 540 Glu Ala Thr Tyr Arg Thr His Arg Pro Arg Ala Leu Glu Ala Ala Ala Arg 545 550 555 560 Gly Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ala Leu Ala Gly Leu Tyr 565 570 575 Ala Ser Pro Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Thr His Arg Val 580 585 590 Ala Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Val Ala Leu Seru Glu 595 600 605 Ala Thr His Arg Ala Arg Gly Pro Arg Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala 610 615 620 Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Ser Pro Pro His Glu Ile Leu Glu Pro 625 630 635 640 His Glu Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr His 645 650 655 Arg Val Ala Leu Gly Leu Ala Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His Arg 660 665 670 Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Pro His Glu Thr His Arg Val Ala Leu Pro 675 680 685 Arg Ala Val Ala Leu Leu Glu Ala Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu 690 695 700 Ala Gly Leu Ala Met Glu Thr Thr His Arg Ala Ser Asn Ser Glu Arg 705 710 715 720 Ala Arg Gly Pro His Glu Pro Arg Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu 725 730 735 Glu Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Pro His Glu Thr His 740 745 750 Arg Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala 755 760 765 Pro His Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Asn Pro Arg Ala Gly 770 775 780 Leu Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Thr His 785 790 795 800 Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Leu Glu Ala 805 810 815 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu 820 825 830 Glu Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ala Leu Ala Ser Asn Ile Leu 835 840 845 Glu Cys Tyr Ser Thr His Arg Pro His Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr 850 855 860 Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Pro 865 870 875 880 Arg Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Thr Tyr 885 890 895 Arg Ala Arg Gly Met Glu Thr Ala Ser Asn Leu Glu Ala Ala Leu Ala 900 905 910 Ser Glu Arg Gly Leu Asn Ala Ser Asn Thr Arg Pro Ala Ser Asn Ala 915 920 925 Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ala Thr His Arg Gly Leu 930 935 940 Ala Gly Leu Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala 945 950 955 960 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Pro Arg Ala Ala Ser Pro Pro 965 970 975 His Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Leu 980 985 990 Asn Gly Leu Tyr Met Glu Thr Leu Glu Ala Thr His Arg Gly Leu Asn 995 1000 1005 Thr His Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Gly 1010 1015 1020 Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr His Ile 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg 1045 1050 1055 Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Ala Ser Pro Pro 1060 1065 1070 His Glu Thr His Arg Pro Arg Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Leu 1075 1080 1085 Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Pro His Glu Ala Leu Ala 1090 1095 1100 Thr His Arg Ala Ser Pro Thr His Arg Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala 1105 1110 1115 1120 Ser Pro Pro His Glu Gly Leu Ala Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu 1125 1130 1135 Asn Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Pro His Glu Thr His Arg 1140 1145 1150 Pro Arg Ala Val Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ile Leu Glu Gly 1155 1160 1165 Leu Asn Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu 1170 1175 1180 Ala His Ile Ser Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Ala Pro Arg Ala 1185 1190 1195 1200 Gly Leu Asn Gly Leu Asn Thr Arg Pro Val Ala Leu Leu Glu Ala Pro 1205 1210 1215 Arg Ala Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Arg 1220 1225 1230 Gly Thr His Arg Val Ala Leu His Ile Ser Ala Ser Asn Val Ala Leu 1235 1240 1245 His Ile Ser Leu Glu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Ala Leu Ala Val 1250 1255 1260 Ala Leu Ala Leu Ala Pro Arg Ala Thr His Arg Pro His Glu Pro Arg 1265 1270 1275 1280 Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Gly Leu Asn Leu Glu Ala Leu Glu Ala 1285 1290 1295 Pro His Glu Pro His Glu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Thr His Arg Met 1300 1305 1310 Glu Thr Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu 1315 1320 1325 Tyr Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Ala Ser Asn Met Glu Thr Ala Ser Pro 1330 1335 1340 Leu Glu Ala Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Leu Glu Ala Leu Glu Ala Pro 1345 1350 1355 1360 Arg Ala Gly Leu Asn Gly Leu Ala Thr Arg Pro Val Ala Leu Gly Leu 1365 1370 1375 Asn His Ile Ser Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Gly Leu Ala 1380 1385 1390 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ser 1395 1400 1405 Glu Arg Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ala Leu Glu 1410 1415 1420 Ala Ala Arg Gly Pro His Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Pro Arg Ala 1425 1430 1435 1440 Ala Ser Pro Thr His Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Val Ala Leu Leu 1445 1450 1455 Glu Ala Pro His Glu Gly Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Glu 1460 1465 1470 Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg 1475 1480 1485 Val Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala His Ile Ser Thr 1490 1495 1500 His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Asn His Ile Ser Ala Ser Pro Leu Glu 1505 1510 1515 1520 Ala Val Ala Leu Ile Leu Glu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Ala Ser Asn 1525 1530 1535 Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Pro His Glu Ala Arg Gly Pro His Glu Ala 1540 1545 1550 Ser Pro Ser Glu Arg Thr Arg Pro Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu 1555 1560 1565 Asn Pro His Glu Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Ala Ala Leu Ala 1570 1575 1580 Pro Arg Ala Met Glu Thr Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala 1585 1590 1595 1600 Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Leu 1605 1610 1615 Ala Leu Glu Ala 1620 <210> 14 <211> 1620 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 <400> 14 atgaaaatgg cgagcaatga tgcgagcccg agcgatggca gcaccgcgaa tctggtgccg 60 gaagtgaata atgaagtgat ggcgctggaa ccggtggtgg gcgcggcgat tgcggcgccg 120 gtggcgggcc agcagaatgt gattgatccg tggattcgca ataattttgt gcaggcgccg 180 ggcggcgaat ttaccgtgag cccgcgcaat gcgccgggcg aaattctgtg gagcgcgccg 240 ctgggcccgg atctgaatcc gtatctgagc catctggcgc gcatgtataa tggctatgcg 300 ggcggctttg aagtgcaggt gattctggcg ggcaatgcgt ttaccgcggg caaaattatt 360 tttgcggcgg tgccgccgaa ttttccgacc gaaggcctga gcccgagcca ggtgaccatg 420 tttccgcata ttattgtgga tgtgcgccag ctggaaccgg tgctgattcc gctgccggat 480 gtgcgcaata atttttatca ttataatcag agcaatgata gcaccattaa actgattgcg 540 atgctgtata ccccgctgcg cgcgaataat gcgggcgatg atgtgtttac cgtgagctgc 600 cgcgtgctga cccgtccgag cccggatttt gattttattt ttctggtgcc gccgaccgtg 660 gaaagccgta ccaaaccgtt taccgtgccg gtgctgaccg tggaagaaat gaccaatagc 720 cgctttccga ttccgctgga aaaactgttt accggcccga gcagcgcgtt tgtggtgcag 780 ccgcagaatg gccgctgcac caccgatggc gtgctgctgg gcaccaccca gctgagcccg 840 gtgaatattt gcacctttcg tggcgatgtg acccatattc cgggcacccg cacctatcgc 900 atgaatctgg cgagccagaa ttggaataat tatgatccga ccgaagaaat tccggcgccg 960 ctgggcaccc cggattttgt gggcaaaatt cagggcatgc tgacccagac caccaaaggc 1020 gatggcagca cccgtggcca taaagcgacc gtgagcaccg gcagcgtgga ttttaccccg 1080 aaactgggca gcgtgcagtt tgcgaccgat accgataatg attttgaaac cggccagaat 1140 acccgcttta ccccggtggg cgtgattcag gatggcagca gcgcgcatcg caatgaaccg 1200 cagcagtggg tgctgccgga ttatagcggt cgcaccgtgc ataatgtgca tctggcgccg 1260 gcggtggcgc cgacctttcc gggcgaacag ctgctgtttt ttcgcagcac catgccgggc 1320 tgcagcggct atccgaatat ggatctggat tgcctgctgc cgcaggaatg ggtgcagcat 1380 ttttatcagg aagcggcgcc ggcgcagagc gatgtggcgc tgctgcgctt tgtgaatccg 1440 gataccggcc gcgtgctgtt tgaatgcaaa ctgcataaaa ccggctatgt gaccgtggcg 1500 cataccggcc agcatgatct ggtgattccg ccgaatggct attttcgctt tgatagctgg 1560 gtgaatcagt tttataccct ggcgccgatg ggcaatggcg cgggccgccg tcgcgcgctg 1620 1620

Claims

Target protein; And a peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
The target protein is a VP1 protein derived from Noro virus, a recombinant expression vector for producing Noro virus vaccine.

According to claim 1,
Recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine, characterized in that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is derived from urate oxidase.

delete

A host cell transformed with the expression vector according to claim 1 or 2.

The method of claim 4,
The host cell is transformed host cell, characterized in that E. coli.

(a) Noro virus-derived VP1 protein; And a peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; producing a recombinant expression vector for production of a norovirus vaccine comprising a polynucleotide encoding;
(b) introducing the expression vector into a host cell to produce a transformant; And
(c) A method of producing a norovirus vaccine comprising culturing the transformant to induce expression of a recombinant fusion protein and obtaining it.

The method of claim 6,
The host cell is a method of producing a norovirus vaccine, characterized in that E. coli.

VP1 protein derived from norovirus; And
A fusion protein for enhancing the expression efficiency and water solubility of a target protein comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a peptide comprising a LysRS RNA interacting domain (RID) as a fusion partner;
Recombinant expression vector for producing norovirus vaccine comprising a polynucleotide encoding a.

The method of claim 8,
The RID is an expression vector comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.

The method of claim 8,
The fusion protein is an expression vector comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.

A host cell transformed with the expression vector according to claim 8.

The method of claim 11,
The host cell is a host cell, characterized in that E. coli ( E.coli ).